TEORIA DE ESPECTROMETRA DE MASAS Y ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES

Presentado por: IPB. Jack Andrs Rincn Prez

Presentado a: Ph.D. Vctor Ruiz

INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTLA GUTIRREZ MAESTRA EN CIENCIAS EN INGENIERA BIOQUMICA Tuxtla Gutirrez, 11 de noviembre de 2013

TECNICA DE ESPECTROMETRA DE MASAS MATRIZ ASISTIDA POR LSER DE DESORCIN/IONIZACIN (MALDI1)

Es una tcnica relativamente nueva, pionera por (Chaurand, Schwartz et al. 2002, Harkewicz and Dennis 2011) en la pasada dcada, es la formacin de imgenes de espectrometra masas (IMS), los cuales proporciona mapas de intensidad de iones espacialmente resuelta correspondiente a la relacin masa-carga de especies moleculares intactas en lugares especficos en una muestra de tejido preparada. Un modo ms comn de IMS emplea un lser ultravioleta (UV) para formacin de iones a partir de molculas contenidas en muestras de tejidos que es esta cubierta con un matriz de absorcin UV y esta es conocida como matriz asistida por lser de desorcin/ionizacin (MALDI) (Harkewicz and Dennis 2011).

Brevemente, MALDI-IMS implica la preparacin una porcin delgada de muestra de tejidos (10-m de espesor) es montada sobre una pequea placa y luego cubierta con una pelcula de compuestos de matriz de absorcin de UV, tal como cido dihidroxibenzoico. El cual dispara un pequeo punto de laser UV dentro de la matriz y la muestra de tejidos genera un plasma de energa, resultando en la formacin de iones biomoleculares positivos y negativos de los tejidos los cuales son expulsados de la superficie del objetivo y emparejado directamente dentro de la entrada de un espectrmetro de masas. MALDI es una tcnica de ionizacin suave, dejando la molcula entera y no fragmentada en el proceso de ionizacin. Una relacin de masa / carga en el espectro se registra para cada cuadrcula X / Y coordinada en el objetivo el lser MALDI es centrado (Harkewicz and Dennis 2011). El objetivo preparado se coloca encima de una fase mecnica, la cual es programada para ser movida gradualmente tal que una serie de relacin masa/carga en el espectro sea registrada para toda la muestra de tejido. El software es luego utilizado para generar la formacin de imgenes del espectro y la relacin masa/carga como una funcin de la ubicacin de la cuadrilla X/Y para toda la muestra de tejidos. Mientras los datos son registrados para todas las relaciones masa-carga los valores especficos entre el rango
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por sus siglas en ingls matrix assisted laser desorption ionization (MALDI)

escaneado, el software permite la visualizacin de valores designados (extrados) lo que permite la formacin de imgenes y comparar especies de lpidos especficos. Recientemente la tecnologa MALDI-IMS lser permite tener una resolucin lateral en el orden de 25-100 m (Harkewicz and Dennis 2011).

1.1

ESPECTROMETRA DE MASAS MATRIZ ASISTIDA POR LSER DE DESORCIN/IONIZACIN ACOPLADA A TIEMPO DE VUELO (MALDITOF2)

A lo largo de la dcada pasada se ha empezado a utilizar y a estudiar muchas tcnicas para la identificacin de lpidos, utilizando adaptando tcnicas que se utilizaban para identificar genes y protenas, para la tcnica de MALDI-TOF podemos ver como describe la tcnica la Universidad de alicante, servicios tcnicos de investigacin disponible en: http://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-de-genomica-yproteomica/espectrometria-de-masas-maldi-tof.html

Fundamentos La ionizacin MALDI (desorcin/ionizacin mediante lser asistida por Matriz), acoplada a un analizador TOF (tiempo de vuelo), es una tcnica de ionizacin suave utilizada en espectrometra de masas que permite el anlisis de biomolculas (biopolmeros como protenas, pptidos y azcares) y molculas orgnicas grandes (como polmeros, dendrmeros y otras macromolculas) que tienden a hacerse frgiles y fragmentarse cuando son ionizadas por mtodos ms convencionales.

En esta tcnica la muestra se mezcla con la matriz en exceso sobre una superficie de metal de tal forma que ambas cocristalizan cuando se evapora el solvente. Esta preparacin es sometida a pulsos cortos de lser en alto
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por sus siglas en ingls matrix assisted laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF)

vaco lo que provoca que la absorcin de energa por parte de la matriz sea convertida en energa de excitacin y en transferencia de H+ a la muestra (ionizacin) dando lugar, normalmente, a especies monocargadas que son analizadas mediante TOF. Este analizador permite la determinacin de la masa en una regin de alto vaco mediante una medida muy precisa del perodo de tiempo desde la aceleracin de los iones en la fuente hasta que impactan con el detector.

Aplicaciones Determinacin del peso molecular de la protena intacta. Obtencin del mapa peptdico (PMF) e identificacin de protenas de muestras biolgicas (clnicas, alimentos, cultivos microbianos, plantas, etc.) utilizando MASCOT, como algoritmo de bsqueda. Identificacin de polipptidos. Anlisis de macromolculas, polmeros, drogas y metabolitos.

1.2

TECNICA DE ESPECTROMETRA DE MASAS DE ALTA RESOLUCION

Esta tcnica tambin est siendo estudiada grandemente gracias a sus ventajas sobre otras y podemos ver como describe de una manera muy entendible la tcnica la Universidad de alicante, servicios tcnicos de investigacin disponible en:

http://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-de-espectrometria-demasas/espectrometria-de-masas-de-alta-resolucion.html

Fundamentos Cuando una molcula se somete a ionizacin por impacto electrnico en un espectrmetro de masas el proceso primario consiste en la abstraccin de un electrn para dar un catin-radical. Este catin-radical se trata del in

molecular y tendr mayor o menor tendencia a fragmentar en funcin de su estabilidad. Los iones moleculares muy estables tendrn poca tendencia a fragmentar y sern muy abundantes. Al in ms abundante del espectro se le denomina pico base. Los fragmentos ms abundantes de un espectro de masas nos dan una informacin valiossima sobre la estructura de la molcula.

Aplicaciones Determinacin de masas exactas de compuestos orgnicos voltiles. Determinacin de policloro-dibenzo-p-dioxinas (PCDDs), policlorodibenzofuranos (PCDFs), polibromo-dibenzo-p-dioxinas (PBdds), polibromodibenzofuranos (PBDFs) as como policlorobifenilos (PCBs) y policloronaftalenos (PCNs) en emisiones procedentes principalmente de fuentes industriales as como de alimentos (leche, carne...) y en animales (gallinas, peces...)

Adems esta tcnica nos permite tener una mayor resolucin a la hora de observar los espectros y poder identificar ms claramente la masa/carga de la muestra que sea introducida en el equipo uno de los equipos ms utilizados es el SYNAPT, buscando informacin sobre este equipo, se encontr varias caractersticas por qu se debe utilizar esta tcnica con este equipo, en la pgina web de la corporacin Waters en la cual se puede descargar un folleto sobre el equipo SYNAPT G2-Si del cual se tom cierta informacin y est disponible en: http://www.waters.com/waters/es_ES/MALDI-SYNAPT-G2-Si-HighDefinition-Mass-Spectrometry/nav.htm?cid=134740682

MS/MS MALDI de masa exacta y alto rendimiento El sistema de espectrometra de masas MALDI SYNAPT G2-Si MS permite obtener resultados ptimos para la adquisicin de imgenes, la caracterizacin de materiales qumicos, y las aplicaciones protemicas y farmacuticas. El MALDI SYNAPT G2-Si est equipado con un lser de

estado slido con una frecuencia de repeticin de 2,5 KHz para maximizar la velocidad del anlisis. Se puede seleccionar el tamao de punto del lser para optimizar la sensibilidad y la velocidad del anlisis, o para maximizar la resolucin espacial en estudios de imaging.

Debido a la geometra ortogonal del analizador Tof, la fuente est desacoplada del anlisis de masas. Por lo tanto, y a diferencia de los instrumentos axiales MALDI-Tof o Tof/Tof, esto garantiza una alta resolucin y masa exacta tanto en modo MS como MS/MS para un amplio intervalo de masas. Adems, el sistema SYNAPT es adecuado para muestras no conductoras, como los cortes de tejido insertados en parafina y montados en portaobjetos de vidrio.

CAPACIDAD DE PICOS Gracias a la combinacin de las separaciones por movilidad inica de alta eficiencia con un analizador de tiempo de vuelo de alta resolucin, el SYNAPT G2-Si aumenta notablemente la capacidad de picos y el contenido de informacin en comparacin con los que se obtienen con la mxima resolucin cromatogrfica o de masas por si sola.

SEPARACIN POR MOVILIDAD INICA La separacin ortogonal que permite la separacin por IM de alta eficacia incrementa de forma espectacular el nmero de componentes detectables e identificables en mezclas complejas, gracias a la rpida separacin de molculas con la misma relacin masa/carga, sin dejar de ofrecer mediciones relacionadas con su conformacin en fase gaseosa.

ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES APC

El ACP al ser una tcnica muy larga se describir brevemente a consideracin propia lo ms importante, esta tcnica es muy utilizada cuando se tiene datos con muchas variables y se quiere reducir a un menor nmero perdiendo la menor cantidad de informacin posible Segn

(Gonzlez, Solano et al. 2008) reporta que segn (Pea 2002) y (Dallas 2000) existen diversas definiciones acerca de las tcnicas de anlisis de datos multivariados, pero los dos coinciden en a conceptualizarla como una herramienta que tiene como objetivo principal resumir grandes cantidades de datos por medio de pocos parmetros (simplificacin), adems busca encontrar relaciones entre: Variables de respuesta Unidades experimentales Variables de respuesta y unidades experimentales

Adems (Gonzlez, Solano et al. 2008) reporta que segn (Prez Lpez 2004), se puede observar que cuando existen muchas variables es posible que parte importante de la informacin sea redundante, en cuyo caso es necesario eliminar el exceso y dejar slo variables que tengan representatividad dentro del conjunto. Esto se consigue con la aplicacin de las tcnicas multivariantes de reduccin de la dimensin: anlisis de componentes principales, factorial, correspondencias, escalamiento ptimo, homogeneidades, anlisis conjunto.

Las tcnicas multivariadas ms utilizadas en el anlisis de datos son: anlisis de componentes principales; anlisis factorial; anlisis de clasificacin entre los que se encuentran: discriminante, regresin logstica y clster; anlisis multivariado de la varianza, y anlisis de variables cannicas.

Segn (Gonzlez, Solano et al. 2008) concluyen que anlisis de componentes principales APC es una tcnica estadstica de anlisis multivariado que permite seccionar la informacin contenida en un conjunto de p variables de inters en m nuevas variables independientes. Cada una explica una parte especfica de la informacin y mediante combinacin lineal de las variables originales otorgan la posibilidad de resumir la informacin, total en pocas componentes que reducen la dimensin del problema.

Por otra parte Terrdez Gurrea describe de una manera muy compresible las fases de APC en Anlisis de componentes principales en la pgina web de la Universitat Oberta de Catalunya disponible en: http://www.uoc.edu/in3/e-

math/docs/Componentes_principales.pdf

Fases de un anlisis de componentes principales Anlisis de la matriz de correlaciones Un anlisis de componentes principales tiene sentido si existen altas correlaciones entre las variables, ya que esto es indicativo de que existe informacin redundante y, por tanto, pocos factores explicarn gran parte de la variabilidad total.

Seleccin de los factores La eleccin de los factores se realiza de tal forma que el primero recoja la mayor proporcin posible de la variabilidad original; el segundo factor debe recoger la mxima variabilidad posible no recogida por el primero, y as sucesivamente. Del total de factores se elegirn aqullos que recojan el

porcentaje de variabilidad que se considere suficiente. A stos se les denominar componentes principales.

Anlisis de la matriz factorial Una vez seleccionados los componentes principales, se representan en forma de matriz. Cada elemento de sta representa los coeficientes factoriales de las variables (las correlaciones entre las variables y los componentes principales). La matriz tendr tantas columnas como componentes principales y tantas filas como variables.

Interpretacin de los factores

Para que un factor sea fcilmente interpretable debe tener las siguientes caractersticas, que son difciles de conseguir: Los coeficientes factoriales deben ser prximos a 1. Una variable debe tener coeficientes elevados slo con un factor. No deben existir factores con coeficientes similares.

Clculo de las puntuaciones factoriales

Son las puntuaciones que tienen los componentes principales para cada caso, que nos permitirn su representacin grfica. Se calculan mediante la expresin:

Los a son los coeficientes y los Z son los valores estandarizados que tienen las variables en cada uno de los sujetos de la muestra.

Por otra parte segn (Gonzlez, Solano et al. 2008) el ACP es una tcnica descriptiva; sin embargo, no niega la posibilidad de que tambin pueda ser utilizado con fines de inferencia. Por otra parte, las aplicaciones del ACP son numerosas y entre ellas se pueden citar la clasificacin de individuos, la comparacin de poblaciones, la estratificacin multivariada, entre otras. En el ACP se maneja un nmero p ( p 2 ) de variables numricas. Si cada variable se representa sobre un eje, se necesitara un sistema de coordenadas rectangulares con p ejes perpendiculares entre s para ubicar las coordenadas de los puntos y poderlos dibujar. Cuando p 4, para el ser humano es imposible hacer la representacin grfica. En estos casos el ACP permite buscar un nuevo sistema de coordenadas con origen en el centro de gravedad de la nube de puntos, de tal manera que el primer eje del nuevo sistema F1 recoja la mayor cantidad posible de variacin; el segundo eje F2, la mayor cantidad posible entre la variacin restante; el tercer eje F3 la mayor cantidad posible entre la variacin que queda despus de las dos anteriores y as sucesivamente.

REFERENCIAS

Chaurand, P., et al. (2002). "Imaging mass spectrometry: a new tool to investigate the spatial organization of peptides and proteins in mammalian tissue sections." Current opinion in chemical biology 6(5): 676-681. Dallas, E. J. (2000). "Mtodos multivariados aplicados al anlisis de datos." Mxico: Thomson: 93-396. Gonzlez, . L., et al. (2008). "Anlisis multivariado aplicando componentes principales al caso de los desplazados." Ingeniera y Desarrollo(023): 119-142. Harkewicz, R. and E. A. Dennis (2011). "Applications of mass spectrometry to lipids and membranes." Annual review of biochemistry 80: 301. Pea, D. (2002). Anlisis de datos multivariantes, McGraw-Hill Interamericana de Espaa S.L. Prez Lpez, C. (2004). "Tcnicas de anlisis multivariante de datos." Aplicaciones con SPSS, Madrid, Universidad Complutense de Madrid.