APLICACIONES CLNICAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Dra. Adelaida Vargas Durand

Servicio de Inmunologa y Bioqumica Hosp. Nac. Edgardo Rebagliati M.

Qu es la citometra de flujo?
Amplificacin digitalizacin Lser Representacin y Anlisis

FSC/SSC

Permite identificar clulas, contarlas y caracterizarlas

Columna de muestra

Flujo

Liquido envolvente Camara de flujo

Nucleo de flujo de muestr

Rayo laser

Subsistemas trabajando integrados

Flow Chamber

Filters Color Detectors

Sample

SSC
Laser

FSC Light Detectors

Identificacin de marcadores celulares con anticuerpos

Clulas

Anlisis en el Citmetro
Incubar
Clulas marcadas

Anticuerpos

PROBLEMAS CLNICOS ABORDABLES MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO

Para la toma de decisiones diagnsticas y teraputicas :
. El diagnostico de leucemias y linfomas. . El seguimiento de marcadores pronsticos como las cuentas de linfocitos CD4. . La determinacin de la eficacia de tratamientos antitumorales e inmunosupresores.

4. Estudio de inmunodeficiencias congnitas y adquiridas. 5. Monitorizacin del efecto de terapia inmunosupresora en pacientes trasplantados. 6. Estudio de la ploidia y proliferacin celular. 7. Cuantificacin de concentraciones de molculas solubles. 8. Purificacin de clulas antgeno-especficas.

9. Leucocitos residuales en hemoderivados

Fuentes biolgicas
Mdula sea Sangre perifrica Lquidos corporales (cavidades, lavados) Tejidos slidos (piel, ganglios linfticos, bazo, otros). Productos de Afresis, muestras procesdas para obtener C.P.H.

COMPARTIMENTOS CELULARES
MEMBRANA CELULAR :
>CDs

CITOPLASMA : MPO,
CD79a, Ig, CD22, CD3

NCLEO : TdT

Procesamiento
Recepcin: datos clnicos y dx. presuntivo Lisado glbulos rojos no nucleados (muestras hematolgicas) Lavado y filtrado (muestras no hematolgicas) Aplicacin de Ac : paneles (fases) Adquisicin y almacenamiento de datos Anlisis e interpretacin Informe

Medida de fluorescencia en clulas individuales por citometra de flujo

Propiedades
Es especfica de color
Es cuantitativa con un amplio rango de medida

Ventajas
Permite estudio multiparamtrico simultneo
Altsima sensibilidad

Alta velocidad

Mide en cantidades elevadas de clulas Obtener conclusiones estadsticamente fidedignas objetivas y reproducibles

Recuento de poblaciones celulares

Recuento de poblaciones celulares

Determinacin del nmero absoluto de clulas

 Clulas pequeas y de complejidad interna reducida (patrn FSC/SSC) : -Linfocitos B -Linfocitos T - CD4+ - CD8+ - CD4+/CD8+ -Clulas NK -Clulas inmaduras -Serie Eritrocitaria/Cls. no vlidas

Anlisis de antgenos celulares

4,29 % 5,36 % 8,40 % 4,71 % 0,0 % 0,36 % 0,0 % 76,89 %

Red Events Green Events Blue Events Yellow Events Violet Events Cyan Events White Events Unclassified Events

Secuencia lgica de seleccin de la poblacin a estudiar

Cuantificacin del nmero de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV

CD4 T cells

CD 8 T Cells

Seguimiento de HIV recuento de linfocitos CD4

MONITORIZACION POR CITOMETRIA FLUJO PACIENTES TRASPLANTADOS APLICACIN: DIFERENCIACION ENTRE INFECCION VIRAL AGUDA Y RECHAZO DE TRASPLANTE MEDIANTE MONITORIZACION DE LINFOCITOS EN SANGRE PERIFERICA

INFECCION VIRAL AGUDA: Disminucin de la relacin CD4/CD8 Incremento de clulas CD8+, HLADR+, CD57+ RECHAZO A INJERTO: Incremento de clulas T IL-2R+ Incremento de Clulas T CD4+, CD45 Ra-

MONITORIZACION POR CITOMETRIA FLUJO ENFERMEDADES AUTOINMUNES

APLICACIN: Esclerosis Mltiple, A.R., L.E.S., Cirrosis Biliar primaria, Artritis Psoriasica, Enf. De Graves.
MEDIANTE MONITORIZACION DE LINFOCITOS EN SANGRE PERIFERICA

DISMINUCION DE CELULAS NK ACTIVACION DE LINFOCITOS T y B (HLA DR, IL2-R en Clulas T, CD23, CDw78 en Clulas B) CAMBIO EN FENOTIPO LINFOCITOS CD4 (CD45 RA+ CD45 RA-)

Otras aplicaciones clnicas del inmunofenotipo de superficie

Identificacin de pacientes spticos con alto riesgo de mortalidad : Niveles aumentados de CD69 y CD62L. Actividad de la enfermedad y prediccin de la eficacia teraputica en pacientes con LES

Porcentaje y cifras de linfocitos T CD69+ en pacientes con sepsis de alto riesgo

300
vs p<0.05

CONTROLES SEPSIS NO SOBREVIVEN SEPSIS SOBREVIVEN IAM NO SOBREVIVEN IAM SOBREVIVEN

40

CONTROLES SEPSIS NO SOBREVIVEN SEPSIS SOBREVIVEN IAM NO SOBREVIVEN IAM SOBREVIVEN

CD3+CD69+ (N/l)

250

200

vs vs

p<0.05 p<0.05

CD3+CD69+ (%)

30
vs vs p<0.05 p<0.05

*
150
p<0.05

100

* *

20
p<0.05

* *

50

10
p<0.05

0 T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CONTROL

SEPSIS

IAM

0 T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CONTROL

SEPSIS

IAM

Porcentaje y cifras de linfocitos B CD23+ en pacientes con sepsis de alto riesgo

CONTROLES
CONTROLES SEPSIS NO SOBREVIVEN SEPSIS SOBREVIVEN IAM NO SOBREVIVEN IAM SOBREVIVEN

120

400

SEPSIS NO SOBREVIVEN SEPSIS SOBREVIVEN IAM NO SOBREVIVEN IAM SOBREVIVEN

100

CD19+CD23+ (N/ l)

vs

p<0.05

CD19+CD23+ (%)

300

80

p<0.05

* *

60

200

*
40

100

p<0.05

20

* *
0

0 T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

T=0

T=0

T=3

T=7 T=14 T=28

T=0

T=1 T=28

CONTROL

SEPSIS

IAM

CONTROL

SEPSIS

IAM

PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
CONTROL
R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

0.1%

0.22%

R1

PACIENTE SHOCK SEPTICO

R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

0.3%

33.8%

R1

PE

CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD FAGOCTICA

PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD FAGOCTICA

100 % DE FAGOCITOSIS 80 60 40 20 0 0 3 5 TIEMPO (min) 10

MACRFAGO / GRANULOCITO

10 min,

0 oC
2.5 min, 37oC

+
E. Coli FITC

5 min, 37oC
10 min, 37oC

27

ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DE LOS LOS GRANULOCITOS GRANULOCITOS (CD15+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCK SEPTICO Control
R1=Granulocitos Control negativo (R1)
0.84%
R1

E. Coli Positivo (R1)

9 5 .4 5 %

Paciente con Shock Sptico

0. 73 %
R1

57%

28

LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO PRESENTAN UNA ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DISMINUIDA Control
R1=Monocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)

2 .2 5 %

8 1 .2 8%

R1

Paciente con Shock Sptico

1.30%
3 6 .7 4 %

R1

29

ESTUDIO DEL CICLO CELULAR

. Estudio de la cantidad de DNA en clulas

individuales
. Historial de divisiones de clulas marcadas

Ciclo celular

RESULTADO DE LA MEDIDA DE DNA EN POBLACIONES DE CLULAS

G0/G1 S G2/M
M1 M2 M3

2n

4n

Aneuploidas en clulas tumorales

Hiperplasia y lesin celular

APLICACIN DE LA CITOMETRA DE FLUJO EN LA DETERMINACION DE CLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS OBTENIDAS DE DIFERENTES FUENTES :

TERAPIA CON CELULAS MADRE SANGRE DE CORDN UMBILICAL

La terapia celular con clulas madre es uno de los campos de la medicina que ms expectativas ha producido por las infinitas posibilidades teraputicas.

Una clula madre, troncal o progenitora, es aquella que es capaz de dividirse y diferenciarse en distintos tipos de clulas especializadas, no slo morfolgicamente sino tambin en forma funcional.

Clulas Madre

Potencialidad
Zigoto Mrula Blastocisto Cuerpos embrioides

Clulas madre totipotenciales

Clulas madre multipotenciales

Clulas madre pluripotenciales

Clulas madre somticas

Ectodermo
Neuroesferas
Neuronas,glias

Clulas madre germinales

Endodermo
Hgado
Cl.ovales Hepatocitos

Mesodermo
Mdula sea
HSC Neutrf.,plaq.,erit. MSC

Piel
Epid.,dermis

Gastrointestinal
Cond.pancreticos

Msculo
Cl.satlite Mioblastos Miofibras

Condrob.,Osteob Adipocitos

Trasplante de clulas progenitoras CD 34+ Establecimiento del momento ptimo de recoleccin: Leucocitos>1000/L y CD34+ entre 40-50/L
Correlacin entre el nmero de clulas CD34+ en el producto de la afresis y la recuperacin de los pacientes trasplantados.

Clulas progenitoras de la Sangre de Cordn Umbilical

Una de las fuentes ms prometedoras de clulas pluripotenciales Puede extraerse en el momento del nacimiento sin afectar al neonato ni a la madre.

Clulas progenitoras de la Sangre de Cordn Umbilical

Potencial hematopoytico: responsabilidad en la reconstruccin hematolgica de sujetos sometidos a tratamientos mieloablativos.

CD34

Progenitor cell CD8

CD38

Thy

Procesamiento de la sangre de cordn umbilical

Reduccin del volumen

Fraccionamiento

Congelacin de muestra

Identificacin, y ubicacin de las muestras por cdigo de barras

Determinacin de CD34+,CD45+, Viabilidad por FACS

DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOLGICAS

Sntomas y signos

Laboratorio

Morfologa + citoqumica

Citogentica Inmunofenotipo

Biologa molecular/FISH

1) DISCRIMINACIN POR FSC-SSC

Granulocitos

Linfocitos
R1

Monocitos

Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de la heterogeneidad celular

Granulocitos CD15+

Monocitos CD14+

Linfocitos
CD3+ T2ab T1gd CD4+ CD8+ CD56+ CD19+ CD5+ CD5-

0 FS C-Hei gh t -> 4C 51 44 00 1

25 6

51 2

76 8

10 24

Maduracin de neutrfilos

CD16-PE CD11b-FITC

ANTGENOS Y LINAJES
LINAJE T Y NK TCR ab/gd CD3 (Sm,Cy) LINAJE B MIELOIDE INMADUREZ CD79a , MPO CD33, TdT, CD34, Ig M, CD22 CD13 CD117, Ig D, Ig A, Lisozima Ig G, k, l

CD1a, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8,

CD10, CD19 CD14, CD15, CD38 CD20, CD11c CD16, HLA-DR CD25, FMC7 CD64,CD11b CD103 CD56, CD57 Gly-A, CD71, CD16 CD41a ,CD61

CARACTERIZACIN INMUNOFENOTPICA DE LAS CLULAS

EN QU DIFIEREN LAS ANORMALES ?

Reflejan desarreglos de expresin proteica con fenotipos aberrantes con o sin anomalas genticas asociadas

Fenotipos aberrantes
Intensidad fluorescente anormal por Ac Ausencia o sobreexpresin de Ac Expresin asincrnica madurativa Maduracin/compartimento biolgico Curva de maduracin anormal Expresin antignica de varios linajes

Clasificacin de las leucemias: OMS

LMA con anormalidades citogenticas recurrentes LMA con t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO) LMA con inv(16)(p13;q22) o t(16;16) (p13;q22) LPA: LMA con t(15;17)(q22;q12)(PML/RARa) y variantes LMA con anormalidades del 11q23(MLL) LMA con displasia multilinaje LMA y SMD relacionados a terapia

LMA con t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO)

LPA con t(15;17)(q22;q12) (PML/RARa)

LMA sin maduracin (M1)

Monoblastos

Lymphoblastos

TWO LEUKEMIC POPULATIONS

B-negative, CD64+ CD14+/-CD33+ (MONOCYTIC LEUKEMIA)

CD19+CD22+ CD10-CD15+ (B-lineage ALL) MLL associated

APLICACIONES DE LA C.F. PARA LINFOMA/LEUCEMIA CRONICA

Contribuciones al diagnstico
Demostracin de poblacin monoclonal B Demonstracin de expresin antignica anormal en malignidades de clulas T .

Contribuciones a la classificacin
Descripcin detallada del IFTP Definicin de las caractersticas FSC/SSC Estudio de la proliferacin

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA

Clulas anormales no estn en el hueco blstico

Linfocitos anmalos

Tumor Normal

CLL

En un fondo de cls. Normales B

CASO
Hombre de 59 aos con anemia y trombocitopenia

CLL

Hairy cell

GRACIAS