Les Bactéries Pour Les Technologies de L'environnement

C
O L L E C T I O N
DIRIGE PAR JEAN BORNAREL
R E N O B L E
C I E N C E S
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES
LES BACTRIES POUR LES TECHNOLOGIES DE L'ENVIRONNEMENT
Jean PELMONT
Grenoble Sciences
Grenoble Sciences poursuit un triple objectif : raliser des ouvrages correspondant un projet clairement dfini, sans contrainte de mode ou de programme, garantir les qualits scientifique et pdagogique des ouvrages retenus, proposer des ouvrages un prix accessible au public le plus large possible. Chaque projet est slectionn au niveau de Grenoble Sciences avec le concours de referees anonymes. Puis les auteurs travaillent pendant une anne (en moyenne) avec les membres dun comit de lecture interactif, dont les noms apparaissent au dbut de louvrage. Celui-ci est ensuite publi chez lditeur le plus adapt. (Contact : Tl. : (33)4 76 51 46 95 - E-mail : Grenoble.Sciences@ujf-grenoble.fr) Deux collections existent chez EDP Sciences : la Collection Grenoble Sciences, connue pour son originalit de projets et sa qualit Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques, collection prsentant des thmes de recherche dactualit, traits par des scientifiques de premier plan issus de disciplines diffrentes. Directeur scientifique de Grenoble Sciences Jean BORNAREL, Professeur l'Universit Joseph Fourier, Grenoble 1
Comit de lecture pour "Biodgradations et mtabolismes

Paulette VIGNAIS, Directrice de recherche CNRS au CEA de Grenoble Pierre CAUMETTE, Professeur l'Universit de Pau et des Pays de l'Adour Yves JOUANNEAU, Directeur de recherche CNRS au CEA de Grenoble Philippe NORMAND, Professeur l'Universit Claude Bernard de Lyon
Grenoble Sciences est soutenu par le Ministre de l'ducation nationale le Ministre de la Recherche et la Rgion Rhne-Alpes Grenoble Sciences est rattach lUniversit Joseph Fourier de Grenoble
Ralisation et mise en pages : Centre technique Grenoble Sciences Illustration de couverture : Alice GIRAUD
ISBN 2-86883-745-X EDP Sciences, 2005
LES BACTRIES POUR LES TECHNOLOGIES DE L'ENVIRONNEMENT
Jean PELMONT
C
17, avenue du Hoggar Parc dActivit de Courtabuf, BP 112 91944 Les Ulis Cedex A, France
Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences

Collection Grenoble Sciences
Chimie. Le minimum savoir (J. Le Coarer) Electrochimie des solides (C. Dportes et al.) Thermodynamique chimique (M. Oturan & M. Robert) Chimie organomtallique (D. Astruc) De l'atome la raction chimique (sous la direction de R. Barlet) Introduction la mcanique statistique (E. Belorizky & W. Gorecki) Mcanique statistique. Exercices et problmes corrigs (E. Belorizky & W. Gorecki) La cavitation. Mcanismes physiques et aspects industriels (J.P. Franc et al.) La turbulence (M. Lesieur) Magntisme : I Fondements, II Matriaux et applications (sous la direction dE. du Trmolet de Lacheisserie) Du Soleil la Terre. Aronomie et mtorologie de lespace (J. Lilensten & P.L. Blelly) Sous les feux du Soleil. Vers une mtorologie de lespace (J. Lilensten & J. Bornarel) Mcanique. De la formulation lagrangienne au chaos hamiltonien (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) Problmes corrigs de mcanique et rsums de cours. De Lagrange Hamilton (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) La mcanique quantique. Problmes rsolus, T. 1 et 2 (V.M. Galitsky, B.M. Karnakov & V.I. Kogan) Analyse statistique des donnes exprimentales (K. Protassov) Description de la symtrie. Des groupes de symtrie aux structures fractales (J. Sivardire) Symtrie et proprits physiques. Du principe de Curie aux brisures de symtrie (J. Sivardire) Exercices corrigs d'analyse, T. 1 et 2 (D. Alibert) Introduction aux varits diffrentielles (J. Lafontaine) Analyse numrique et quations diffrentielles (J.P. Demailly) Mathmatiques pour les sciences de la vie, de la nature et de la sant (F. & J.P. Bertrandias) Approximation hilbertienne. Splines, ondelettes, fractales (M. Attia & J. Gaches) Mathmatiques pour ltudiant scientifique, T. 1 et 2 (Ph.J. Haug) Bactries et environnement. Adaptations physiologiques (J. Pelmont) Enzymes. Catalyseurs du monde vivant (J. Pelmont) La plonge sous-marine l'air. L'adaptation de l'organisme et ses limites (Ph. Foster) Endocrinologie et communications cellulaires (S. Idelman & J. Verdetti) Elments de biologie l'usage d'autres disciplines (P. Tracqui & J. Demongeot) Bionergtique (B. Gurin) Cintique enzymatique (A. Cornish-Bowden, M. Jamin & V. Saks) L'Asie, source de sciences et de techniques (M. Soutif) La biologie, des origines nos jours (P. Vignais) Naissance de la physique. De la Sicile la Chine (M. Soutif) Le rgime omga 3. Le programme alimentaire pour sauver notre sant (A. Simopoulos, J. Robinson, M. de Lorgeril & P. Salen) Gestes et mouvements justes. Guide de l'ergomotricit pour tous (M. Gendrier) Listening Comprehension for Scientific English (J. Upjohn) Speaking Skills in Scientific English (J. Upjohn, M.H. Fries & D. Amadis) Minimum Competence in Scientific English (S. Blattes, V. Jans & J. Upjohn)
Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques

Radiopharmaceutiques. Chimie des radiotraceurs et applications biologiques (sous la direction de M. Comet & M. Vidal) Turbulence et dterminisme (sous la direction de M. Lesieur) Mthodes et techniques de la chimie organique (sous la direction de D. Astruc) L'nergie de demain. Techniques - Environnement - Economie (sous la direction de J.L. Bobin, E. Huffer & H. Nifenecker)
AVERTISSEMENT
Cet ouvrage sadresse aux chercheurs, ingnieurs et tudiants intresss par le rle des bactries dans la dfense de lenvironnement et le mcanisme biochimique des biodgradations de substances polluantes varies. Pour tenter de prsenter un aperu du problme partir de la masse norme des informations sur le sujet, souvent disperses parmi les sources nombreuses parpilles dans les publications scientifiques, il a fallu sappuyer sur les notions fondamentales en biochimie mtabolique, en enzymologie et en microbiologie. Il n'tait pas question de faire double emploi avec les traits gnraux qui sont souvent excellents et bien adapts la formation scientifique. Il convenait donc de rester dans un cadre modeste en renonant toute tentative de raliser un essai encyclopdique, qui de toute faon aurait t hors de porte de lauteur. La difficult est vite apparue de trouver les limites entre les donnes de base et les rappels jugs indispensables. Aussi a t-on ajout la fin des quatorze chapitres un glossaire assez volumineux pour accompagner les rubriques traites, en rappelant les dfinitions et proprits essentielles. On peut estimer nanmoins que cet ouvrage ne conviendra quaux tudiants ayant lexprience dau moins trois annes de cursus universitaire avec un bagage de biochimie et de microbiologie. Par contre les connaissances de chimie requises restent simples et le programme du Premier Cycle suffira gnralement. Le but est de crer un outil utile pour les diffrents spcialistes intresss par la dfense de lenvironnement et les biodgradations, afin de leur permettre de se documenter rapidement sur des sujets qui sortent un peu de leur domaine habituel. Lidal serait videmment dapporter des ides qui pourraient enrichir leur travail. On a donc pris soin dapporter une bibliographie assez abondante, arrte sauf quelques exceptions la fin 2002, et il a fallu naturellement effectuer des choix assez arbitraires. La facilit daccs Internet et aux grandes bases de donnes fait que les informations peuvent tre rapidement collectes ou retrouves, notamment par Medline. On a donc privilgi les rfrences trouves dans les journaux dont on peut se procurer en un temps trs court le contenu des articles en ligne. Il a paru inutile dintroduire des adresses de sites Internet, parfois volatiles, que chacun peut se procurer en toute libert avec les moteurs de recherche du type Google. Lintervention des bactries dans les biodgradations a t privilgie, parce quelle est en gnral la fois essentielle et bien documente. Ce choix comporte une part darbitraire, puisque les champignons, levures et autres ensembles dacteurs apportent leur part. Il y a donc t fait parfois allusion dans plusieurs rubriques o cela tait indispensable.
INTRODUCTION
LES DONNES DU PROBLME
Comment les bactries liminent-elles les dchets de l'activit humaine ? Le thme de ce livre est la biochimie du nettoyage de l'environnement qu'elles effectuent. Le problme est replac dans le cadre des grands cycles naturels. Ils nous aident mieux comprendre comment les procds mis en jeu dans le recyclage des substances naturelles ont t adapts et mis au service de l'limination des composs artificiels, c'est--dire la bioremdiation. L'accumulation de rejets de toutes sortes dans l'environnement est devenue un sujet de proccupation majeure depuis plusieurs dcennies. Elle a donn lieu une forte prise de conscience dans les pays dvelopps qui en sont les premiers responsables. La course pourrait sembler perdue d'avance au vu de la formidable progression des activits industrielles, de la consommation et du dveloppement de l'agriculture intensive. La pollution va des emballages aux produits chimiques utiliss comme pesticides et herbicides, en passant par les nitrates, les hydrocarbures et les mtaux lourds. Les micro-organismes contribuent largement les dtruire ou les neutraliser malgr leurs limites. Tous les tres vivants participent des degrs divers au recyclage des matires organiques et minrales de l'environnement. Par leur aptitude coloniser tous les milieux, les micro-organismes viennent au premier rang. Bactries, champignons, microalgues et protistes forment une gigantesque usine chimique plantaire dont les produits se propagent tout au long des chanes nutritionnelles. Un premier choix a t de ne considrer majoritairement que les bactries, ou plus exactement les procaryotes en gnral, c'est--dire les protobactries ou bactries au sens strict, les cyanobactries et les archaebactries. Pourquoi cette limitation ? Les procaryotes sont presque toujours en premire ligne. Ce sont les organismes les plus simples dont on connat plutt bien la machinerie mtabolique et assez souvent la gntique. Les mcanismes rgulateurs sont moins complexes que chez les eucaryotes mais peuvent mettre en jeu un bouleversement de l'expression de nombreux gnes qui n'est pas sans rappeler les diffrenciations cellulaires des organismes plus volus. La prsence des procaryotes est universelle et leur participation aux grands cycles naturels est essentielle. Parmi les bactries du sol se trouvent les actinomyctes aux potentialits particulirement riches et complexes qui excellent en mme temps dans l'art de faire des antibiotiques. L'extrme versatilit de tous ces organismes et leur facult d'adaptation en font des acteurs trs actifs dans la lutte contre les pollutions. Ce livre en est une premire approche.
Depuis les annes 1960 a paru une abondante littrature scientifique sur les biodgradations lorsque les chercheurs, au dpart incrdules, se sont aperus que de nombreux produits organiques jugs toxiques ou rbarbatifs comme le benzne, les phnols, le ptrole brut et autres, taient effectivement dgrads activement par les bactries, parfois avec la collaboration d'autres organismes dont les levures. Les rsultats ne sont accessibles en gnral que dans des revues disperses et spcialises. Une pollution peut avoir des causes naturelles comme artificielles. Pour lutter contre ses effets pervers, il est bon de connatre les mcanismes de son limination qui peut s'oprer parfois spontanment par oxydation l'air, hydrolyse ou destruction photochimique. La microflore de l'environnement s'est habitue traiter les polluants naturels par des facteurs enzymatiques appropris slectionns au cours des priodes gologiques. La vgtation est une des premires responsables de l'mission d'une immense varit de substances, des terpnes, flavonodes, alcalodes et autres composs qui sont des dchets ou des agents de dfense contre les autres organismes. L'industrie humaine n'a fait que compliquer les choses en introduisant des molcules qui n'existaient pas auparavant dans la nature. On dsigne ces composs artificiels sous le vocable de xnobiotiques. Il peut arriver qu'un xnobiotique ne soit qu'un "analogue" qui ne diffre d'un compos naturel que par un dtail de sa formule chimique le rendant acceptable par les enzymes des micro-organismes. Le xnobiotique devenu biodgradable est trait comme un substrat naturel et son limination est possible si les ractions du mtabolisme en acceptent tous les intermdiaires. Dans les cas les plus favorables, la substance trangre est minralise, c'est--dire transforme en gaz carbonique, ammoniac et eau. Un cas de figure trs important est celui du comtabolisme. L'agent microbien dgrade effectivement le xnobiotique, mais ne peut pas l'utiliser seul pour sa croissance. Les transformations ont alors lieu paralllement celles des substrats normaux en utilisant les mmes outils. Dans bien des cas, le comtabolisme peut avoir un caractre fortuit. Il est videmment intressant dans la mesure o il permet d'liminer des produits gnants. Des complications naissent quand un xnobiotique a une action toxique sur la microflore et les plantes. Sa destruction, partielle ou non, est alors une raction de dfense, une dtoxification du poison. La gamme des situations rencontres est vaste, et nous en trouverons de nombreux exemples. Dans un cadre gnral, un substrat donn se trouve en prsence, non pas d'une entit biologique unique, mais de populations mixtes de bactries ou d'autres espces. Tous ces organismes apportent leurs propres potentialits. Les premires transformations sont catalyses par une espce donne et les produits forms sont reus par d'autres qui prennent le relais. Des changes ont lieu, minralisation et dtoxification sont ventuellement simultanes. C'est la situation la plus commune dans l'environnement mais aussi la plus difficile dmler sur le plan exprimental puisqu'il n'est pas simple de reproduire artificiellement et de faon stable la cohabitation des diffrents acteurs. Il existe dans la littrature scientifique un grand nombre d'articles faisant tat de la disparition de tel ou tel contaminant dans un milieu naturel, interprt comme l'activit d'une association microbienne (un "consortium" dans les articles anglosaxons). Ces recherches sont intressantes et rassurent sur la nature de tel ou tel produit, mais n'apportent pas
INTRODUCTION
toujours d'information prcise sur les mcanismes impliqus. De plus la principale qualit d'un rsultat scientifique est d'tre reproductible par d'autres. En gnral les descriptions faites sur le terrain ne sont jamais reproduites en l'tat, puisqu'il s'agit de milieux complexes variables dans le temps et l'espace. Reconnatre le caractre biodgradable d'un produit est nanmoins essentiel. Son valuation par diffrentes mthodes standards, comme la BOD* 1, est recherche par les industriels dsireux de se mettre en conformit avec la lgislation. La disparition de certains polluants est conditionne par leur solubilit, leur caractre volatil (mission dans l'atmosphre et destruction photochimique), ou leur adsorption sur les particules du sol (humus et argiles). Un produit fortement adsorb reste plus longtemps dans le sol alors qu'un produit trs soluble est entran rapidement vers la nappe phratique et les cours d'eau. Ce n'est pas forcment avantageux. Un lessivage trop rapide ne laisse pas le temps aux microorganismes du sol de s'adapter et d'entamer le nettoyage, et le produit polluant ira contaminer les rivires. La tendance plus ou moins importante s'adsorber est mesure par le coefficient Koc*. Elle est rgle entre autres par la nature des molcules, leur caractre plus ou moins hydrophobe et leur ionisation. La rcalcitrance intgrale de certains polluants qui rsistent toute attaque microbienne est videmment la situation la plus nfaste et ncessite le recours, quand on le peut, l'incinration ou au recyclage. Il s'agit principalement de certaines matires plastiques, de goudrons, de noyaux chimiques d'une stabilit exceptionnelle et d'lments minraux tels que les mtaux : cadmium, zinc, mercure et autres. La pollution par les hydrocarbures est l'ordre du jour. La biodgradation de bon nombre de ces composs est connue, parfois rapide et a fait l'objet d'une exprimentation trs vaste. Malheureusement certains hydrocarbures, polycycliques ou haute masse molculaire, sont de vritables dangers. Tout le monde pense videmment aux bitumes lourds de l'Erika ou du Prestige. La lenteur de leur limination naturelle est telle que leur prsence, longtemps aprs les rcentes mares noires, constitue la calamit que l'on sait. Les mtaux offrent un cadre part. Lorsqu'ils sont prsents sous forme d'oxydes, d'hydroxydes, de sulfures ou de combinaisons organiques, les mtaux peuvent tre solubiliss et entrans par les eaux avant d'tre dilus dans l'environnement. La gestion des concentrations mtalliques est un problme pineux en biologie. Un chapitre montrant comment les bactries traitent ce problme a t inclu dans ce livre, car la pollution mtallique est loin d'tre absente des problmes contemporains. Enfin il convient de mentionner la participation des plantes dans tout ceci. Elles ne sont pas le sujet de ce livre, mais leur prsence ne saurait tre ignore car leurs racines attirent dans ce qu'on appelle la rhizosphre des bactries et des champignons avec lesquels elles collaborent activement. En outre la majorit des plantes hbergent dans leurs racines des champignons formant les mycorhizes, qui prsentent eux-mmes des interactions avec les bactries. Limiter le sujet aux bactries, quelques exceptions prs, est donc une premire simplification qui ne doit pas faire oublier que lenvironnement est un tout faisant participer un grand nombre dorganismes diffrents. 1 - Les mots reprs par * sont dfinis dans le glossaire situ la fin de l'ouvrage.
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L'PURATION
La lgislation actuelle oblige toutes les communes se raccorder une station d'puration. Certaines industries ont leur propre installation. Lpuration biologique permet de dbarrasser l'eau de ses principales impurets. Son vocation trs succincte ici ne sert qu' nous mettre dans le bain du sujet. La mthode la plus ancienne est le lagunage, qui utilise des plans d'eau o s'effectuent les processus naturels de dgradation et de recyclage des polluants grce au dveloppement de bactries, de levures, de protozoaires et d'algues. Il s'tablit une chane alimentaire naturelle oxygne en surface. On utilise au besoin la capacit d'auto-puration des terres cultives. La mthode a l'inconvnient d'occuper des surfaces assez vastes et sa capacit de traitement est devenue trop faible pour les grandes agglomrations. Les stations d'puration fonctionnent sur un principe similaire mais avec une plus grande efficacit. Les eaux uses sont dcantes puis brasses et ares en prsence des micro-organismes qui s'agglomrent en boues et granules destins sdimenter, tandis que les eaux clarifies sont peu peu dbarrasses de leurs matires organiques dissoutes. La prsence de l'oxygne est essentielle et garantit les biodgradations les plus rapides. Selon la technologie utilise, ces cultures bactriennes peuvent tre libres (boues actives) ou fixes (lits bactriens et biofilms). L'emploi des boues actives est le plus classique. Les microorganismes se dveloppent et se rassemblent en flocons ou "flocs", maintenus en suspension par brassage accompagn d'une aration. Une dcantation limine les boues, dont une partie est rinjecte en amont, le restant tant limin, opration qui demande souvent des solutions techniques dlicates. Il existe maintenant une varit de techniques et le schma symbolise le principe de base.
eau use dcanteur primaire aration des boues actives eau traite dcanteur secondaire
sable particules boues en excs dchets
La demande en eau recycle de haute qualit a stimul les progrs techniques. Une conomie des volumes traits est recherche dans les villes par la sparation des eaux uses et pluviales. La charge minrale et organique d'une eau est estime par la MES ou teneur en matires en suspension, et par la DBO5* qui permet d'estimer la teneur en matire organique. La MES d'une eau urbaine ne dpasse gure 200-300 mg . L1, et la DBO5 varie de 100 400 mg . L1. Ces valeurs peuvent tre fortement augmentes, de 10 50 fois la sortie de certaines industries alimentaires (brasseries, conserveries, fromageries, abattoirs). Deux autres paramtres sont la DCO (demande chimique en oxygne) et le COT (carbone
INTRODUCTION
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organique total). Des mesures rapides et automatises permettent ainsi d'valuer la pollution. Il est gnralement intressant de pouvoir estimer la nature prcise des polluants prsents comme les pesticides ou les hydrocarbures. Les techniques analytiques modernes y parviennent. Parmi celles-ci figurent des enzymes immobilises dans des lectrodes polarographiques. Diverses socits se sont spcialises dans la production de biocapteurs. La conception des biocapteurs s'est diversifie et perfectionne depuis une vingtaine d'annes. La dtection automatique d'une pollution permet de dclencher un systme d'alerte et de commander le rglage des installations. Divers procds ont t mis au point pour traiter certains effluents en anarobiose, comme le procd UASB*. Des efforts mens en vue de diminuer les cots d'investissement et d'entretien ont conduit de nombreuses amliorations dans la filtration, l'immobilisation des bactries et l'vacuation des boues. La conduite d'une station d'puration sur le principe de base voqu prcdemment connat plusieurs catgories de problmes, dont le rejet des boues ou la qualit des microbes purateurs. La nature de ces micro-organismes est cruciale. On trouve gnralement des Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Flavobacterium et autres espces dont le nom reviendra frquemment dans le courant de ce livre comme acteurs des biodgradations. L'arrive des polluants slectionne des espces comptentes qui se dveloppent plus vite que d'autres et sont capables d'changer de l'information gntique sous forme de plasmides. On s'efforcera sans doute dans l'avenir d'introduire des bactries gntiquement modifies spcialises dans le traitement de certaines pollutions. Toutes ces recherches reposent la base sur des tudes exprimentales utilisant les mthodes de culture afin d'tudier les proprits physiologiques des germes. Les mthodologies sont bien dcrites dans les manuels de microbiologie pratique. Cela va du plus simple par des cultures axniques discontinues (en batch) aux cultures continues en chmostat* ou en turbidostat*. Ces techniques ont t largement perfectionnes et automatises. Malheureusement elles ne rendent encore compte qu'imparfaitement des conditions naturelles o de nombreuses espces de micro-organismes sont en association et en comptition. L'tude des cultures mixtes stables se heurte de grandes difficults mais devrait concentrer les efforts de recherche l'avenir.
CHAPITRE 1 LA COLLECTE DE L'NERGIE

Ce premier chapitre a pour objet de dresser un rappel des mcanismes nergtiques fondamentaux situs la base des cycles naturels et de toute biodgradation. Que l'nergie soit tire des oxydations ou de la lumire, elle apparat invariablement sous forme d'un potentiel lectrochimique membranaire ou de composs nergtiques comme l'ATP. 1.1 - Respirations et fermentations 1.2 - Le rle des fermentations 1.3 - ATPases, ATP synthases 1.4 - Cytochromes 1.5 - Complexes de type bc1 1.6 - Oxydases respiratoires terminales 1.7 - Phototrophie non-oxygnique 1.8 - Les cyanobactries 15 20 26 30 34 38 46 56
1 LA COLLECTE DE L'NERGIE
1.1 - RESPIRATIONS ET FERMENTATIONS
Toute cellule dispose invariablement de deux rservoirs d'nergie de base, reprsents par un potentiel membranaire et un stock de composs nergtiques comme l'ATP. Le potentiel est aliment par le passage de protons prfrentiellement dans un seul sens, avec pour rsultat une dissymtrie de pH et de charges des deux cts de la membrane, avec un excdent de protons et de charges positives hors du cytoplasme. L'ATP est l'archtype des molcules nergtiques dites haut potentiel et source d'nergie chimique directe. Ces deux rservoirs communiquent par une pompe membranaire rversible, qui est l'ATPase/ATP synthase. L'hydrolyse de l'ATP en ADP et phosphate peut gnrer un potentiel de membrane. Inversement ce potentiel, qui voque celui d'un condensateur charg, peut actionner une synthse en retour de l'ATP. L'ide fondamentale est donc de voir que toute l'nergie immdiatement disponible pour la cellule est rpartie entre ces deux rservoirs. Le potentiel lectrochimique membranaire ou force protonmotrice (p) est aliment essentiellement par les respirations et les oxydorductions lies la photosynthse. De l'autre ct, le rservoir ATP reprsente les molcules haut potentiel nergtique produites par les fermentations. Celles-ci engendrent de l'ATP en phase soluble par couplage direct avec des ractions du mtabolisme. Une autre fraction d'ATP est produite par la pompe rversible qui est l'ATPase/ATP synthase. Elle permet de recharger le potentiel membranaire par l'hydrolyse de l'ATP, ou au contraire de faire une synthse d'ATP partir d'ADP et de phosphate au dtriment du potentiel membranaire.
ATP synthase potentiel p
++++++++
ATPase
ATP
Ce schma est utile aux microbiologistes et biochimistes, car il fait appel au mcanisme mis en jeu au cours de la conservation d'nergie. Les modalits sont parfois plus complexes et le mcanisme des changes d'nergie n'est pas toujours connu
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avec certitude. La notion de fermentation adopte ici est restrictive. Dans la pratique industrielle, la rcupration de produits utiles partir d'une culture de microorganismes est considre comme une fermentation au sens large. L'oxydation de l'alcool en acide actique dans la prparation du vinaigre est ainsi dsigne comme une fermentation, alors qu'au sens biochimique du terme c'est le rsultat d'oxydations respiratoires. Le potentiel membranaire est bti par des oxydorductions capables de coupler le transport d'lectrons avec une translocation de protons. Ce principe de conservation d'nergie est rversible. Le potentiel membranaire peut contribuer aux courants d'lectrons inverses, gnrateurs de molcules rduites comme le NADH ou le NADPH. Il actionne de faon gnrale un retour des protons travers la membrane, coupl un certain nombre d'activits comme la rotation des flagelles ou le transport de substances et d'ions travers la membrane. Ce sont les transports actifs dits de type 1. Ainsi la permase du lactose dans le colibacille fait entrer simultanment une molcule de glucose et un proton. La pression exerce sur l'entre du proton tire la molcule de lactose vers l'intrieur. La permase agit donc comme synporteur. Si l'entre des protons tait couple la sortie d'une autre entit, il s'agirait d'un antiporteur. La contribution essentielle du potentiel membranaire consiste videmment coupler la synthse d'ATP par phosphorylation de l'ADP grce au retour des protons vers le cytoplasme. Le rservoir ATP renferme une nergie convertible en diffrentes molcules haut potentiel nergtique dont l'actyl-coenzyme A. L'ATP actionne de nombreuses synthses, actionne la mobilit cellulaire chez certaines espces, ainsi que des transports actifs, notamment les transporteurs ABC* des bactries. Dans la ralit l'ATP n'est pas le seul nuclotide nergtique, mais il faut introduire en toute rigueur l'ADP, ou encore des nuclotides susceptibles d'changer leur phosphate comme l'UDP, le CDP et le GTP. L'hydrolyse de l'ATP en ADP et phosphate libre 32 kJ . mol1 dans les conditions standards. L'nergie relle est bien suprieure (50-70 kJ . mol1). Elle crot avec le rapport ATP/ADP, ou mieux avec la "charge nergtique" dfinie par ATKINSON comme (ATP + 0,5 ADP) / (ATP + ADP + AMP). Comparable en quelque sorte la charge d'une batterie, ce rapport serait troitement rgul par les cellules dans une fourchette d'environ 0,85-0,95 dans les conditions normales de croissance. On sait que la variation d'nergie libre au cours d'une oxydorduction est donne par la loi de NERNST*. Une oxydation chimique quelconque devrait dgager essentiellement de la chaleur. Les biomembranes offrent un milieu hydrophobe favorable la conservation de l'nergie par translocation unidirectionnelle d'entits ioniques. On admet que cette conversion s'opre avec un rendement trs lev par le canal de protines membranaires transporteurs d'ions, animes de changements de conformation. L'nergie des oxydations est donc consacre des changements de conformations cycliques au sein de ces transporteurs, qui leur permettent de se charger d'un ion sur une face de la membrane, et de le rejeter de l'autre ct, crant un potentiel lectrochimique. Dans les cas les plus courants, le potentiel s'tablit par une translocation de protons. Des ions sodium peuvent jouer le mme rle. Les protons, ou noyaux
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d'hydrogne, ne sont pas des entits libres comme le serait un ion sodium anhydre, par exemple. En milieu aqueux, un proton est prsent combin des molcules d'eau, sous forme H3O+ (ou H5O2+ et autres), alors que dans les molcules organiques et en particulier les protines, sous forme de groupes ionisables caractre acide (cystine, tyrosine, aspartate, glutamate), basique (arginine, lysine, histidine) 1. Les transferts de protons dans les protines se font de groupe donneur vers groupe accepteur (acide vers base). Lorsque les protons parviennent l'extrieur, ils sont accepts par des molcules d'eau et leur prsence contribue faire baisser le pH. Ils peuvent tre aussi retenus la surface de la membrane sous forme de charges positives changeables. La translocation des protons revient donc acidifier le milieu extrieur, ou crer un excdent de charges positives, ou les deux la fois. Le potentiel lectrochimique membranaire a donc deux composantes : une acidit par rapport l'autre face, une charge globale positive par rapport celle-ci. La tendance qu'ont les protons faire ce mouvement inverse dpend la fois du pH et de la rpartition asymtrique des charges. C'est pourquoi on a coutume de reprsenter le potentiel membranaire par une force protonmotrice, analogue une force lectromotrice, dsigne par p ou H, et exprime en volts : p = 2,3 (RT/F) pH. La diffrence de potentiel lectrique entre les deux faces de la membrane est positive si l'extrieur est charg positivement par rapport au cytoplasme. La diffrence pH du pH entre les deux compartiments est ngative si l'extrieur est le ct le plus acide. Le coefficient 2,3 (RT/F) vaut peu prs 0,059 volt. Selon ces conventions de signe, une p positive tend faire entrer des protons et donc faire synthtiser de l'ATP. Beaucoup d'auteurs prfrent l'exprimer en millivolts. Elle est couramment de 200 250 millivolts dans les systmes biologiques. On voit tout de suite que pH peut tre nul si toute la force protonmotrice est tablie par une diffrence de charges entre les deux faces de la membrane qui peut provenir d'une distribution ingale d'ions sodium, potassium ou autres. Des interconversions plus compliques peuvent avoir lieu par le jeu des mouvements de molcules et d'ions chargs travers la membrane, soit par diffusion, soit l'aide de transporteurs spcifiques. Toute substance rendant la membrane permable certains ions peut donc avoir un effet dcouplant. C'est le cas des ionophores et des protonophores. Par exemple la valinomycine transporte spcifiquement les ions potassium travers la membrane et agit comme dcouplant si ces ions sont prsents. Ce phnomne peut ralentir le dveloppement de la microflore et retarder les biodgradations, quand sont rpandues certaines substances phnoliques qui ont un tel effet dcouplant. Les oxydations respiratoires ont donc une fonction cruciale dans l'tablissement d'un potentiel membranaire. Les oxydations lies la photosynthse fonctionnent
1 - Rappel - la notion d'acide ou de base donne ici correspond aux dfinitions de BROENSTED, trs commode pour les biochimistes. Un acide est donneur de proton, une base un accepteur. Par exemple l'acide glutamique se dissocie rversiblement en acide glutamique glutamate + H+, le proton tant accept par une base (molcule organique, eau).
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sur le mme principe. La figure symbolise le modle de base d'une chane de transporteurs d'lectrons dbouchant sur un accepteur final qui est suppos ici tre le dioxygne.
succinate SDH UQ NADH NDH NQ quinones oxydases terminales et rductases cyt. bc1 O2 et accepteurs cyt. c
DH substrats varis
Chanes respiratoires
Les rectangles ombrs sont des sites de conservation d'nergie. Ils correspondent des systmes enzymatiques complexes o le passage des lectrons contribuent btir un potentiel membranaire par la translocation sens unique de protons. On y voit la NADH dshydrognase (NDH) qui est un systme complexe avec un composant flavinique et des noyaux fer-soufre, le cytochrome bc1 et la cytochrome c oxydase terminale ou cytochrome aa3 2, remplaable en anarobiose par des rductases (comme la nitrate rductase). Vers les quinones respiratoires de la membrane convergent les lectrons venant du NADH, du succinate et de donneurs varis par le canal de diverses dshydrognases ou de l'hydrognase, systmes enzymatiques qui ont tous des noyaux fersoufre dans leur structure. Les quinones forment un rservoir d'lectrons qu'elles distribuent en aval dans diffrentes directions.
NADH formiate 0 0 rservoir des quinones OH DMSO TMAO ttrathionate nitrite OH fumarate nitrate lactate
H2 dshydrognases
glycrol-3P
rductases
Anarobiose (E. coli)

2 - Une nomenclature traditionnelle mais vieillie appelle "complexe I" de la mitochondrie animale la NADH dshydrognase (NDH), "complexe II" la SDH, "complexe III" le bc1 et "complexe IV" la cytochrome c oxydase.
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Elles canalysent les lectrons vers une quinone respiratoire dissoute dans la phase lipidique membranaire. En bas du schma sur l'anarobiose figurent diffrents accepteurs. Les rductases correspondantes ont galement des noyaux fer-soufre et sont ventuellement associes des cytochromes. L'accepteur le plus favorable est le nitrate (E' = + 420 mV). D'autres ont un potentiel plus bas, comme le dimthylsulfoxyde (DMSO, E' = + 160 mV), le trimthylamine-N-oxyde (TMAO, E' = + 130 mV) et le fumarate (E' = + 30 mV). La quinone respiratoire n'est plus une ubiquinone (E' = + 100 mV), mais une mnaquinone potentiel plus bas (E' = 74 mV). Les ubiquinones (une des plus communes est l'ubiquinone-8 ou UQ-8, de potentiel E' = + 100 mV), sont des molcules trs lipophiles 3, en excs dans la membrane par rapport aux autres transporteurs d'lectrons. Une de leurs caractristiques essentielles est de pouvoir changer les lectrons un un en passant par un stade intermdiaire radicalaire ou semiquinone.
O O O O OH e + 2 H+ e + 2 H+ O e e O
OH quinol
O semiquinone
O quinone
Ubiquinone-8
En absence d'oxygne dans les respirations dites anarobies, les ubiquinones sont souvent remplaces par des naphtoquinones (NQ), appeles aussi mnaquinones, au comportement similaire mais avec un potentiel redox plus bas. Leur forme rduite, ou mnaquinol, n'est pas roxyde par un cytochrome bc1, car ces derniers sont caractristiques des chanes arobies, sauf chez certains phototrophes o ils sont des pices essentielles dans les changes d'nergie. Le complexe bc1 sera dcrit plus loin. Leur quivalent chez les cyanobactries s'appelle b6f. La participation d'un bc1 aux oxydorductions n'est pas absolument gnrale. Dans certaines chanes respiratoires bactriennes s'effectue une oxydation directe des quinols par l'oxydase terminale, dont nous retrouverons plus loin des exemples.
3 - Solubles dans le pentane ou l'hexane.
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1.2 - LE RLE DES FERMENTATIONS

Les mcanismes respiratoires pratiqus avec l'oxygne ou des accepteurs de remplacement sont gnralement les meilleures sources d'nergie pour les cellules. Mais quand aucune respiration n'est possible, une fermentation s'impose et produit de l'ATP en phase soluble, sans passer par un potentiel membranaire. Les fermentations consomment beaucoup de matires premires, les oxydations sont trs incompltes et librent en excs des produits caractristiques. Leur importance directe dans les biodgradations est parfois secondaire quand les conditions ncessaires sont loignes des conditions relles. Elles participent cependant au recyclage de la matire organique et interviennent au moins indirectement au nettoyage de l'environnement. Le principe de base d'une fermentation est illustr de faon exemplaire par la trs classique fermentation lactique. La voie glycolytique ou voie EMP 4 transforme une molcule de glucose en deux molcules de pyruvate, consomme 2 ATP mais en produit 4. Il y a 2 oxydations qui librent au total 4 lectrons emports dans 2 molcules de NADH.
NADH ATP ATP FBP NADH COO C=O CH3 NADH COO HCOH CH3 lactate La fermentation lactique proprement dite TrioseP NADH ATP PGA ATP ATP ATP COO C=O CH3 pyruvate
La voie glycolytique ordinaire

Tout le problme des fermentations est de roxyder le NADH. Si les oxydations se poursuivaient au-del du pyruvate, il y aurait davantage de NADH produit. La fermentation lactique fait deux choses essentielles : roxyder tout le NADH et obtenir un gain net en ATP. Le bilan est quilibr, mais le rsultat est une production d'nergie modeste pour un grand gchis de matire premire. Dans la ralit il y a un peu moins de lactate form, soit 1,8 1,9 moles par mole de glucose, parce qu'une partie du carbone est prleve aux stades FBP, PGA et pyruvate, pour les synthses carbones de la cellule. Le tableau suivant n'est qu'un simple rappel pour montrer les fermentations effectues partir du pyruvate, les flches paissies dsignant des phases rductrices produisant 2 lectrons par mole.
4 - Voie d'EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS ; FDP : fructose-1,6-bisphosphate ; Triose-P : dihydroxyactone-phosphate et 3-phosphoglycraldhyde ; PGA : acide 3-phosphoglycrique. Les voies classiques sont l'EMP, la voie des pentose-phosphates et celle d'ENTNER-DOUDOROFF.
glucose CO2 oxaloactate CO2 pyruvate CO2 actaldhyde CO2 formiate lactate CO2 H2 actyl-CoA fumarate acrylate actoactyl-CoA CO2 succinate CO2 propionate isopropanol butanol butyrate actone butyryl-CoA acides gras thanol actate butanediol actolactate CO2 actone thanol
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malate
Grandes fermentations partir du pyruvate

La principale difficult d'un mtabolisme de fermentation est de roxyder entirement le NADH ou quivalent form au cours des oxydations qui doivent fournir une nergie rentable. Le mtabolisme cellulaire doit tre compatible avec ces exigences. C'est pourquoi les voies de fermentation sont en gnral ramifies, celles du lactate de Lactobacillus ou de l'thanol dans la levure tant plutt des exceptions. La multiplicit des voies autorise une meilleure adaptation aux conditions comme on peut s'en rendre compte par l'exemple trs simple de la transformation du pyruvate par le colibacille en anarobiose. Les produits sont l'thanol, l'actate et le formiate, qui est transform en CO2 et H2. Seule est productrice d'ATP la voie de l'actate.
HCOO formiate H2 CO2 COSCoA HSCoA CH3 actyl-CoA HSCoA actaldhyde thanol actyl-phosphate Pi HSCoA ADP actate ATP
COO C=O CH3 pyruvate
Le passage du pyruvate l'actyl-coenzyme A est une oxydation classique dcrite dans tous les manuels, mais elle a ici une particularit : les lectrons sont vacus sous forme d'hydrogne gazeux par l'intermdiaire du formiate. Seule la voie passant par l'actyl-phosphate est nergtique. Elle ne permet pas la cellule de roxyder le NADH produit avant la fabrication du pyruvate. La seconde voie s'en charge. Un aiguillage au niveau de l'actyl-CoA va orienter le mtabolisme plutt
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vers une voie ou l'autre en fonction des impratifs cellulaires du moment. Il y a finalement quatre produits de fermentation en proportions variables : l'hydrogne, le gaz carbonique, l'acide actique et l'thanol. L'quilibrage entre roxydation du NADH et production d'nergie n'est pas le seul impratif. La cellule a besoin de certains substrats carbons de dpart pour ses synthses. Par exemple l'oxaloactate est le prcurseur de plusieurs acides amins dont l'aspartate, et le succinate est l'origine des porphyrines. Une voie de fermentation peut donc en profiter pour produire au passage de tels prcurseurs. Elle est dite voie anaplrotique. Le petit dtournement ainsi effectu ne compromet pas la fermentation proprement dite puisque la matire premire est disponible en grande quantit. Les fermentations produisent ventuellement de grandes quantits de gaz et de produits volatils tels que gaz carbonique, hydrogne, des alcools, des acides carboxyliques courte chane Les manations s'ajoutent aux produits forms par d'autres routes, comme l'ammoniac et H2S. L'hydrogne gazeux est un vecteur extrmement important dans l'environnement mais ne s'accumule pas, car il diffuse facilement vers la surface du sol et des eaux. En outre il est rapidement roxyd en arobiose par des germes qui l'utilisent comme substrat nergtique. Enfin une concentration trop forte en H2 abaisse le potentiel redox du milieu des valeurs basses et se montre inhibitrice sur de nombreuses ractions de fermentation. Le diagramme de SCHINK [1] indique le potentiel redox pH 7 de l'hydrogne en fonction de sa pression partielle exprime en pascals (Pa). Le potentiel standard pH 7 de plusieurs couples d'oxydorduction a t repr. On voit que le potentiel de l'hydrogne est plus bas que la majorit d'entre eux.
E (mV)
0
fumarate/succinate glyoxylate/glycolate oxaloactate/malate actaldhyde/thanol NAD+/NADH pyruvate + CO2/malate actyl-CoA/actaldhyde + CoA 2 H+/H2 actyl-CoA + CO2/pyruvate + CoA
200
400
10
10
10
10
10
PH2 (Pa)
Variations du potentiel de l'hydrogne

La ligne de dmarcation entre fermentation et oxydation respiratoire n'est pas toujours vidente. Le meilleur exemple est celui de la fumarate rductase membranaire sur laquelle nous reviendrons par la suite. Le fumarate est utilis comme accepteur et fait du succinate par un mcanisme qui s'accompagne d'une translocation de protons. Un autre cas subtil est celui d'une apparente fermentation propionique par des espces anarobies strictes telles que Propionigenium modestum et Veillonella alcalescens. La premire est une bactrie marine, la seconde se rencontre dans la plaque dentaire. DIMROTH a montr en 1982 que Propiogenium tirait son nergie d'un systme indit [2].
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On la cultive sur succinate dans un milieu contenant 20 g . L1 de NaCl. La transformation du succinate peut s'crire 5 : succinate + propionyl-CoA
succinyl-CoA + propionate succinyl-CoA (R)-mthylmalonyl-CoA (R)-mthylmalonyl-CoA (S)-mthylmalonyl-CoA (S)-mthylmalonyl-CoA + H+ propionyl-CoA + CO2
(1) (2) (3) (4)
Les enzymes catalysant ces ractions sont une coenzyme A transfrase (1), la mthylmalonyl-CoA mutase (2), une racmase (3) et la mthylmalonyl-CoA dcarboxylase (4). La raction (1) fait entrer du succinate, et le propionate est rejet audehors comme produit de la fermentation. Or ce sont deux charges ngatives qui entrent pour une seule qui sort. Consquence : une charge ngative supplmentaire du ct interne de la membrane. La raction (4) est la partie la plus intressante. Elle consomme un proton du ct interne. Elle fonctionne avec la biotine comme cofacteur et couple la dcarboxylation du substrat avec une translocation d'ions sodium vers l'extrieur de la cellule. Les bactries font donc un gradient d'ions sodium comme d'autres feraient un gradient de H+. La dcarboxylation est "exergonique" 6 (E' = 30 kJ . mol1). Comment la cellule rcupre-t-elle l'nergie correspondante ? Par une translocation en retour d'ions sodium et synthse d'ATP. Le passage des ions sodium en sens inverse actionne une ATP synthase trs comparable l'enzyme courante (dite de type F0F1 qui utilise les protons), et le rsultat est donc une synthse d'ATP par l'intermdiaire du potentiel membranaire. Le gradient de sodium est effaable exprimentalement par la nigricine et la monensine. On a montr avec des membranes isoles que le systme pouvait fonctionner dans les deux sens ! La dcarboxylase reprsente un modle qu'on retrouve dans plusieurs espces [3].
2 Na+ extrieur membrane intrieur H+ CH3
n Na+
D C
A B
CO2 H3CCH2 CSCoA ADP Pi n Na+ ATP
OOCCHCSCoA 2 Na+
O mthylmalonyl-CoA
O succinyl-CoA
Mthylmalonyl-CoA dcarboxylase (P. modestum)

Les fermentations s'accompagnent parfois de l'entre et de la sortie de molcules organiques ioniques par le jeu de transporteurs, avec pour rsultat un dsquilibre
5 - La notation R,S des configurations carbones est celle des chimistes. La notation usuelle D,L est encore traditionnellement admise dans certains cas, par exemple pour dsigner les acides amins. 6 - C'est--dire productrice d'nergie libre.
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des charges de part et d'autres de la membrane et naissance d'un potentiel. Un exemple classique est fourni par la fermentation malolactique 7 qui comporte en mme temps une oxydation du malate en actate et une dcarboxylation en lactate dans Oenococcus oeni. La figure montre comment l'change des deux produits cre une dissymtrie de charge. Un phnomne du mme genre se produit dans Oxalobacter formigenes dans la transformation de l'oxalate. L'excdent extrieur de charges positives permet d'actionner la synthse d'ATP par l'ATP synthase F0F1.
extrieur ++++++ membrane intrieur lactate malate2 n H+ oxalate2 formiate
lactate CO2
F0 F1 malate2 H+ ADP + Pi nH
+
oxalate2 ATP H+
formiate CO2
Oenococcus oeni
Oxalobacter formigenes
Terminons cette vocation des fermentations par les bactries Gram-positives du genre Clostridium. Ce sont des germes sporulants prsents dans tous les milieux, strictement anarobies, trs sensibles O2, totalement dpourvus de transporteurs d'lectrons comme les cytochromes. Leurs ressources nergtiques sont souvent fondes sur des fermentations sophistiques. L'une d'elles est la raction de STICKLAND.
alanine COOH Donneurs alanine histidine isoleucine leucine valine Accepteurs arginine glycine histidine hydroxyproline ornithine tryptophane H2NCH CH3 [2 H] [2 H] 2 NH3 2 Pi 2 actyl-P 2 glycine COOH HOOC H2NCH2 H2CNH2
COOH C=O CH3 CO2 COOH CH3
2 ATP HOOC COOH H3C CH3 3 actates
Fermentation de STICKLAND
7 - La fermentation malolactisque est d'importance dans la maturation des vins, dont elle abaisse lacidit et assouplit le got. Elle doit se produire immdiatement aprs la fermentation alcoolique, de faon pouvoir raliser rapidement la stabilisation biologique du vin, de 10 25C, pH 3-3,5, en prsence d'thanol de 10 13% en V. On peut inhiber le processus par SO2, l'acclrer par des bactries lyophilises.
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Un acide amin, comme la L-alanine, est oxyd par dshydrognases gnratrices de NADH, symbolis par [2H]. La roxydation du NADH se fait par une voie rductrice portant sur 2 molcules d'un autre acide amin, ici la glycine. L'nergie est rcupre sous forme d'ATP partir de l'actyl-phosphate comme indiqu par le tableau ci-dessus. Le bilan entre le donneur alanine et l'accepteur glycine est donc ici de 3 molcules d'acide actique formes et de 2 ATP. Plusieurs acides amins pouvant intervenir comme donneurs ou accepteurs ont t indiqus. Nous retrouvons ici l'actate comme un produit de fermentation. Une classe particulire de bactries dites actognes font de l'acide actique comme principal produit de leur activit, mais se dtachent par des caractres particuliers. Dans ce groupe figurent des bactries du genre Clostridium. Nous examinerons les actognes dans un chapitre ultrieur. Une phase critique de ce mtabolisme est la rduction dsaminante de la glycine par la glycine rductase. L'enzyme de Clostridium sticklandii n'a pas d'quivalent ailleurs, et l'une de ses particularits est de fonctionner l'aide de slnium. On y trouve plusieurs parties appeles A, B et C, qui ont chacune un ple ractif caractristique. La partie A (17,1 kDa) contient un thiol essentiel et surtout un rsidu de slnocystine [4]. La protine B renferme du pyruvate comme cofacteur attach par lien covalent. Le site ractif essentiel est le carbonyle (C=O) du pyruvate. La protine C est un ttramre de formule 22 ( : 58 kDa, : 49 kDa) [5]. Elle contient un thiol indispensable et catalyse la dernire tape de la raction. La figure ci-dessous reprsente le cycle de faon simplifie.
glycine HOOC A SeH CO B actyl-P Pi SeH CO B C H2O 2 e + 2 H+ S O CCH3 A C H2O SH H2N CH2 HOOC CH2 SeH N A C B C
SH
NH3
SeCH2COOH CO B C
SH
Cycle de la glycine rductase

Le substrat est charg sur la protine B, forme une liaison covalente temporaire de type ctimine, appele aussi base de SCHIFF. Celle-ci est hydrolyse et il y a transfert sur la slnocystine de la protine A, avec dsamination. Une tape rductrice sous la dpendance de la thiordoxine rduite* s'effectue avec transfert sur le thiol de la protine C. La thiordoxine oxyde sera rduite nouveau par la thiordoxine rductase. Enfin une phosphorolyse termine le cycle, o le phosphate est entran
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sous forme d'actyl-phosphate. On voit que l'acide amin, H2NCH2COOH, a t transform en CH3COOH et NH3 et il y a bien eu un apport de deux lectrons et deux protons. L'actyl-phosphate sera la source de phosphate pour la synthse d'une molcule d'ATP.
1.3 - ATPASES, ATP SYNTHASES

L'ATP est un donneur de phosphate haut potentiel et sert de substrat pour les phosphorylations catalyses par les kinases. L'hydrolyse de l'ATP est couple d'autres ractions dans de trs nombreuses tapes du mtabolisme et fait figure d'agent moteur pour maintes synthses. L'ATP et l'ADP fonctionnent toujours sous form chlate par un magnsium dont la prsence est sous-entendue. L'hydrolyse est reprsente par : ATP4 + H2O ADP3 + PO4H2 + H+ (1) G' = 29,4 kJ . mole1 (25C) Une hydrolyse en AMP et pyrophosphate libre une nergie comparable, la valeur indique tant celle qui correspond l'tat standard. C'est un point de repre qui est trs loign de la ralit car l'nergie d'hydrolyse de la molcule d'ATP dpend du rapport [ATP] / [ADP] que les cellules s'efforcent de maintenir un niveau lev par des mcanismes rgulateurs prcis. Le graphique montre les variations de l'nergie ATP en fonction de ce rapport. On voit que l'nergie a presque doubl quand le rapport est de 100.
G' (kJ . mol 1)
0
20
concentration de phosphate 10 mM 1 mM
nergie d'hydrolyse de l'ATP croissante
40
60
80
106
102
102
106
[ATP]/[ADP]
Les ATPases membranaires* appartiennent plusieurs catgories dsignes par H ou F0 F1, A0 A1, P et V. Celles qui nous intressent ici sont les pompes rversibles de type H qui font communiquer les deux rservoirs d'nergie. Elles synthtisent de l'ATP en faisant entrer des protons dans la cellule. Inversement lorsquelles consomment de lATP, elles expulsent des protons lextrieur et btissent un potentiel de membrane. C'est pourquoi on dsigne ce type d'enzyme par ATPase/ATP synthase, dont le modle unique est tir de la membrane interne mitochondriale ou du colibacille. Ce modle prvaut, semble-t-il, dans la totalit du monde vivant. L'ATP synthase est toujours un complexe volumineux de plus de 450 kDa.
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L'enzyme est compose de deux parties, dsignes par F0 et F1. La portion basale F0 est membranaire, de formule a b2 c12, avec un cylindre de sous-units c disposes en couronne, avec les sous-units et situes latralement par rapport au cylindre. La tte F1 est de composition 3 3 et fait saillie dans le cytoplasme des procaryotes, dans la matrice des mitochondries ou dans le stroma des thylakodes. Le socle F0 fonctionne comme un canal pour le passage des protons. La partie F1 peut tre dtache sous forme soluble. ATP Cest la mieux connue sur le plan structural. Les sousunits et se ressemblent ADP + Pi par leur structure, mais les 3 sites actifs sont ports F1 essentiellement par les . Les lient aussi des nuclb otides, et auraient un rle b + 4 H rgulateur.
a c 12
F0
ATPase/ATP synthase mitochondriale
+ + +
4 H+
+ + +
De nombreuses techniques biochimiques et gntiques ont t mises en uvre pour une cartographie des sites catalytiques. La partie F1 a t cristallise et analyse aux rayons X avec des analogues non hydrolysables de l'ATP en place dans les sites de la protine. L'ATP synthase est une des mcaniques molculaires les plus extraordinaires que la nature nous ait permis d'entrevoir. La synthse d'ATP, par ADP + Pi ATP + H2O, ne peut se faire qu' contre-courant thermodynamique. Pour que l'quilibre soit dplac effectivement du ct de la synthse de lATP, il faut que celui-ci soit limin au fur et mesure de sa formation. La solution observe est originale. Les units sont animes, en mme temps que le reste de l'enzyme, de changements de conformation. Cela signifie que l'affinit de la protine pour les diffrents substrats et produits peut varier en fonction de changements structuraux. Une faon d'carter l'ATP form des conditions d'quilibre est de former un lien haute affinit entre lui et l'enzyme : ATP + enzyme
complexe [enzyme-ATP] haute affinit.
Cette situation devrait conduire normalement un blocage, puisque le site enzymatique ne pourrait plus se dbarrasser du produit de la raction. Une action extrieure est donc ncessaire et consistera faire un nouveau changement de conformation qui aura pour effet de faire tomber l'affinit pour l'ATP et de faciliter sa libration avant un nouveau cycle ractionnel. Ces changements ne sont pas
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gratuits, et ncessitent un apport d'nergie qui tire sa source de la force protonmotrice p. C'est la partie F0 qu'il appartient d'effectuer ce couplage. F0 fonctionne comme un canal protons et commande les changements de conformation de la partie F1. Cette fonction est clairement mise en vidence aprs l'enlvement de F1, qui laisse un vide rendant la membrane permable aux protons par le canal de F0. On peut bloquer le passage par des agents dcouplants comme l'oligomycine et le DCCD, qui forment un lien covalent avec les sous-units c en un site acide plac mi-chemin des deux faces de la membrane et conserv dans l'volution. Une fois dtach de F0, le bloc F1 est soluble et ne fonctionne plus que comme une vulgaire ATPase. Une recombinaison de F0 et F1 sur la membrane reconstitue lATP synthase. Le fonctionnement de l'ATP synthase est fond par des variations de conformation subies par les trois sites actifs l'un aprs l'autre, modifiant leurs affinits pour l'ADP, le phosphate et l'ATP. Ces changements sont commands par la sous-unit qui occupe avec le centre de l'anneau et qui explore successivement les trois paires par un mouvement de rotation autour de l'axe . Une pice tournante ! Cette rotation est actionne par le courant de protons tabli au niveau de la pice de base F0 et affecte la sous-unit , qui confre l'anneau de F1 une structure gnrale asymtrique. La explore successivement les trois sites catalytiques appartenant aux qui passent tour tour par au moins trois conformations au cours de la rotation, principe que le schma symbolise de manire simplifie, montrant les tapes successives et les rapports avec la sous-unit l'intrieur de l'anneau [6].
Pi g ADP Pi ADP ATP Pi Pi g ATP ADP
ADP Pi
ATP ADP ATP ADP Pi
Cycle de l'ATP synthase
La conversion de l'ADP + Pi en ATP provoque une modification du site qui retient l'ATP avec une haute affinit. L'apport nergtique consiste donc ouvrir le site pour relcher l'ATP et admettre une nouvelle molcule d'ADP. L'ide avait t mise depuis longtemps par BOYER [7], qui voyait dans certaines conformations
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molculaires un mode essentiel de stockage de l'nergie dans les changes biologiques 8. En somme l'ADP arrive, puis le phosphate, l'ATP se fait et sa forte rtention sur le site tire l'quilibre ractionnel en faveur de sa formation. La sousunit reoit alors un coup d'paule qui la force librer l'ATP et le cycle recommence. Cette notion n'est devenue plausible que par l'avance des connaissances sur la dynamique des protines en gnral. Il y a un couplage mcanique entre et les successives qu'elle voit dfiler au cours de la rotation [8]. La rotation subie par la chane a t vrifie par des techniques spectaculaires avec le secours de la microscopie de fluorescence, en particulier dans le laboratoire de Masasuke YOSHIDA [9]. L'exprience a consist immobiliser les particules F1 sur le verre l'aide d'un lien histidine par l'extrmit N-terminale des chanes 9. La partie avait t soude un filament d'actine porteur d'un groupe fluorescent afin de le rendre visible plus facilement. Une camra vido fixe au microscope permettait de voir tourner les filaments d'actine pendant l'hydrolyse de l'ATP ! La direction de rotation n'tait pas quelconque, toujours dans le sens inverse des aiguilles d'une montre vu du ct F0. On peut penser que la rotation seffectue en sens inverse au cours de la synthse dATP. La structure trs dtaille de la par tie F0 loge dans la membrane reste ADP ATP dterminer, mais on a une ide assez Pi prcise de la topologie des units c qui forment une couronne solidaire [10]. Ce F1 sont des polypeptides assez courts (79 acides amins) replis en deux hlices alpha formant pingle cheb b veux. Les units c sont des barreaux e H+ intrieur organiss en dodcamres et sont orients peu prs perpendiculairemembrane ment la membrane. Leur structure H+ H+ H+ H+ est dduite d'tudes faites en RMN. c Elles subissent un changement de conc c c c a formation et d'orientation en fonction F0 de leur protonation et dprotonation. H+ Ces changements ont fait l'objet d'une analyse trs fouille par RASTOGI et GIRVIN [11]. Ils arrivent la conclusion que l'ensemble des units c forme effectivement une pice tournante entranant dans son mouvement l'axe qui pntre dans F1. Le rle des sous-units b et reste incertain, mais leur prsence a t montre comme indispensable. Il s'agit peut-tre d'lments stabilisateurs (par exemple pour empcher F1 d'tre entran par le mouvement de rotation de l'axe ). La
8 - BOYER a reu tardivement le prix NOBEL en 1997, aprs que ses ides eussent t confirmes par les travaux sur l'ATP synthase mitochondriale. 9 - Ces prouesses sont autorises par la connaissance de la structure de la protine et par les techniques de modification covalente des protines de plus en plus perfectionnes.
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protine b est sous la forme d'un dimre. Sa structure est assez exceptionnelle. Chaque sous-unit est une hlice alpha unique trs allonge (95 ), et les deux hlices b sont torsades en une super-hlice dont la structure a t dtermine haute rsolution [12]. Ce systme tonnant est, semble-t-il, fortement conserv dans toute l'volution, et va continuer susciter un important courant de recherche. D'autres possibilits sont galement dbattues. N'oublions pas que loriginalit de se systme est de pouvoir fonctionner comme une pompe protons rversible, caractristique essentielle, car elle permet aux cellules dpourvues de chane respiratoire et tirant toute leur nergie par fermentation de reconstituer un potentiel membranaire partir de leur ATP. Ce potentiel est vital pour tous les procaryotes et indispensable au fonctionnement des mitochondries et plastes chez les eucaryotes.
1.4 - CYTOCHROMES
Les protines hminiques appeles cytochromes ont pour activit la plus courante de transfrer des lectrons d'un donneur vers un accepteur. Ils tirent parti de l'alternance du fer entre les tats Fe(II) et Fe(III), et sont des outils cellulaires omniprsents dans maintes biodgradations. Nous en rappelerons quelques proprits. Leur intervention est pratiquement obligatoire chez les organismes arobies, mais de nombreuses espces vivant en absence d'oxygne se servent aussi de cytochromes pour des transformations importantes au sein de l'environnement. Certains cytochromes ont mme une activit enzymatique intrinsque, comme les cytochromes P450. D'autres ont une structure complexe associant divers cofacteurs comme des ions mtalliques, des noyaux fer-soufre et des flavines.
absorbance (M1 cm1)
rduit
10000
a
oxyd
300
500
(nm)
5000

300 500
(nm)
L'identification des cytochromes est relativement aise grce au spectre diffrentiel d'absorption, qui tire parti du dplacement spectral par oxydorduction. La figure a montre les spectres du cytochrome c de cheval, petite protine soluble souvent utilise pour des tests enzymatiques l'tat oxyd (ox.) et l'tat rduit (red.). En b, la courbe mesure la diffrence d'absorption toutes les longueurs d'onde du visible entre la prparation rduite par dithionite et la mme l'tat oxyd. Cette technique est indispensable dans le cas des cytochromes lis une membrane, car elle permet d'effacer le bruit de fond caus par la turbidit du milieu. Un raffinement consiste effectuer ces tracs de spectre la
abs. (rd. ox.)
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temprature de l'azote liquide (77 K), car les bandes obtenues, plus hautes et plus fines, accordent une meilleure rsolution. Une autre spectroscopie utilise est la RPE qui mesure les variations de spin* du fer. La structure molculaire des porphyrines est une des plus stables de la biosphre, son origine remonte aux origines les plus lointaines de la vie. Les porphyrines se distinguent par la nature des chanes latrales qui entourent la couronne azote ttrapyrrolique. Une des plus importantes est la protoporphyrine IX, porteuse de 4 mthyle, 2 propionyle, 2 vinyle. L'insertion du fer donne l'hme B, qu'on aperoit dans le petit formulaire. On sait que l'hme B porteur de Fe(II) est prsent dans l'hmoglobine 10. L'hme O drive de l'hme B : un groupe vinyle est remplac par une longue chane hydroxythyl-farnsyle (rectangle ombr) [13]. Une nouvelle transformation catalyse par une oxygnase sur un mthyle engendre l'hme A. Ce schma reste provisoire, vu l'existence de plusieurs varits d'hme A dans le monde bactrien.
H2C CH2 HOCH N Fe2+ N CH2 CH2 COOH N CH2 CH2 COOH N N N O CH2 CH2 COOH H H2C CH2 HOCH N N
Fe2+ N N CH2 CH2 COOH
Fe2+ N N C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH
Formules des hmes B, O et A

L'hme C est un hme B attach la protine par deux liens covalents tablis par les chanes latrales vinyle et le soufre de la cystine. L'attachement se fait sur un fragment de squence conserv Cys-x-x-Cys-His (ou Lys), l'histidine formant la sixime coordinence sur le fer. La cinquime coordinence de l'autre ct est le plus souvent l'histidine (la mthionine dans le cytochrome c mitochondrial). Les cytochromes c* sont typiquement des transporteurs d'lectrons extra-cytoplasmiques, logs dans le priplasme des Gram-ngatifs ou accols la face externe de la membrane cytoplasmique, mais des espces comme le colibacille en sont dpourvues. On distingue les cytochromes c en classes I, II et III. Certains contiennent 2, 6, 8 hmes C et davantage, formant des chanes de transfert intramolculaires. l'examen d'une squence, la prsence de deux cystines espacs de deux autres rsidus et voisin d'un histidine ou d'un rsidu basique est un indice srieux de la prsence d'un hme C. 10 - Lorsque le fer s'oxyde le Fe (III), l'hme est transform en hmine. Pour des raisons de simplicit, on a coutume d'appeler hme la porphyrine contenant du fer sans prciser son degr d'oxydation, qui alterne entre + 2 et + 3 dans les cytochromes.
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Cys Cys polypeptide Cys Fe His N CH2 CH2 COOH S X X Cys S His N Fe
2+
His N N
HO N Fe2+ N N N CH2 CH2 COOH
N N CH2 CH2 COOH
C Cytochrome c
CH2 CH2 COOH
L'hme D est un cas particulier rencontr dans une oxydase terminale de E. coli et diverses espces bactriennes. Il remplace l'hme O ou un hme A dans certaines oxydases en fonction des conditions physiologiques. Il est gnralement facile dtecter grce sa bande alpha exceptionnellement dporte vers le rouge (630 nm). Un tableau simplifi indique plusieurs catgories de cytochromes en fonction du type d'hme qu'ils hbergent. Les cytochromes qui ragissent avec des substrats tels que O2, NO, NO2 sont facilement inhibs par CO, l'ion cyanure ou azoture ("azide"), qui prennent la place du substrat normal. Dans d'autres cas (cytochromes b ou c), l'inhibiteur peut s'installer en dplaant une des liaisons de coordinence. Les potentiels d'oxydorduction ne sont donns qu' titre indicatif. Cyt. a b c d o a (nm)
585 - 605 555 - 565 545 - 554 630 554 - 565
Type d'Hme
Hme A Hme B Hme B Hme D Hme O
E' (mV)
vers 300 - 350 50 + 100 + 200 250 vers 300 - 350 > + 250
Observations
lipophile lien covalent bactrien bactrien
Inhibiteurs
CO, CN, N3 raction lente avec CN CO, CN, N3 CO, CN, N3
Le cytochrome c mitochondrial est une des premires protines analyses en dtail. Sa faible masse molculaire en faisait un modle idal. En outre elle prsente un conservatisme remarquable au cours de l'volution, la squence et la structure ayant gard de fortes ressemblances des bactries la levure de bire et l'homme. Autrement dit l'tude d'un cytochrome de mammifre donne une ide assez prcise du fonctionnement des cytochromes en gnral chez les micro-organismes. La rduction du fer dans le cytochrome c s'accompagne d'un changement structural de la molcule. Il y a des mouvements de certaines chanes latrales et une lgre rorientation de la charpente polypeptidique certains endroits, au point que la protine rduite ne cristallise plus dans le mme systme gomtrique que la protine oxyde, comme l'ont montr TAKANO et DICKERSON [14] La structure du cytochrome c de cheval est illustre ici l'tat oxyd et l'tat rduit 11. 11 - Les structures ont t tablies manuellement ici comme ailleurs dans ce livre, avec les coordonnes compltes tlcharges de la Brookhaven Data Base, et en utilisant le programme RasMac (Rasmol pour Mac) 2.7.1 crit par R. SAYLE.
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hme
Oxyd, avec chanes latrales
Oxyd
Rduit
Cytochrome c de cheval
Les modifications de conformation du cytochrome c au cours des oxydorductions ouvrent une fentre sur le mcanisme des transferts d'lectrons dans les protines de ce type. La porphyrine et la chane polypeptidique assurent des changes radicalaires d'un lectron entre le fer et la surface. Le changement conformationnel aurait une fonction fondamentale. Le transfert d'un lectron entre le donneur (complexe bc1) et l'accepteur (cytochrome c oxydase) entrane le cytochrome c dans un cycle dcrit par un dessin. L'oxydorduction correspond au dplacement vertical, le changement structural dans le sens horizontal. La protine qui s'oxyde n'est donc plus tout fait la mme que celle qui restitue un lectron l'oxydase, un peu comme s'il y avait alternance entre deux couples redox diffrents. Le cycle est ici parcouru dans le sens des aiguilles d'une montre, il ressemble un cycle d'hystrsis accompagn d'un change d'nergie, celui qui est requis par la modification de conformation. tat rduit Ce principe quivaut pour les chimistes un A B nivellement de l'nergie d'activation de la rduction de l'oxydase par le donneur.
e bc1 oxydase e
A tat oxyd
L'ide est de voir le cytochrome comme une sorte d'enzyme catalysant l'change d'lectrons et utilisant les mmes rgles de mouvements conformationnels que les protines en gnral. On retrouve cette proprit dans l'azurine de Pseudomonas aeruginosa qui est une petite protine contenant du cuivre servant de transporteur coupl un cytochrome c551. La structure dtaille de l'azurine est connue et bascule entre deux conformations alternes au cours de l'change d'un lectron et d'un proton avec le cytochrome [15].
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Les cytochromes c fonctionnent invariablement l'extrieur du cytoplasme chez les procaryotes. Ils sont libres dans le priplasme des bactries Gram-ngatives, ou attachs la face externe de la membrane cytoplasmique. De mme ils sont logs du ct lumen dans les thylakodes des cyanobactries et des chloroplastes. Les mitochondries animales et vgtales portent leurs cytochromes c dans le compartiment intermembranaire. Il semble donc que pour devenir fonctionnel un cytochrome c doive franchir obligatoirement les limites du cytoplasme o il est synthtis. Il y a un principe gnral qui veut que l'apocytochrome c (la protine sans sa porphyrine) soit transport destination avant de recevoir son groupe hminique. Comme celui-ci est synthtis dans le cytoplasme, il faut donc qu'il traverse la membrane avant d'tre soud la protine par des rsidus de cystine. La dernire tape de la synthse de l'hme est l'insertion du fer dans la porphyrine l'aide d'une ferrochlatase, donnant l'hme B, et c'est l'tat rduit que l'hme sera insr dans un cytochrome c et soud pour devenir un hme C. La fabrication des cytochromes c montre diffrents niveaux de complexit dans la nature et demande au moins 9 facteurs dans les protobactries et , les archaebactries et les mitochondries des plantes. Le processus est plus simple dans les mitochondries animales, ou encore chez les champignons qui ont un mcanisme particulier [16]. La complexit est intermdiaire dans les chloroplastes, les bactries Gram-positives et les cyanobactries. La fonction des diffrents facteurs et leur volution gardent encore beaucoup de points d'ombre [17].
1.5 - COMPLEXES DE TYPE BC1

Les cytochrome bc1 canalisent les lectrons des ubiquinones vers le cytochrome c dans les chanes respiratoires qui en possdent. C'est le complexe III dans les mitochondries. L'oxydorduction correspondante s'accompagne d'une translocation de protons d'un ct de la membrane, et offre un exemple emblmatique de la conservation de l'nergie sous forme de potentiel lectrochimique membranaire coupl aux oxydations. La constitution d'un complexe bc1 semble universelle par sa composition. On y rencontre un cytochrome b intgr la membrane et contenant deux hmes B proches l'un de l'autre , un cytochrome c1 dont la plus grande partie se trouve l'extrieur et une protine fer-soufre ou ISP ("iron-sulfur protein"), noyau [2Fe-2S] d'un type spcial dit de RIESKE*. Le complexe mitochondrial bovin a t obtenu cristallis et porte d'autres polypeptides extrieurs la membrane qui sont absents dans les bactries [18]. Le complexe semble fonctionner partout sous forme de dimre. Le dessin ne reprsente que la charpente des polypeptides l'exclusion des chanes latrales d'acides amins. Les trois sous-units sont figures ensemble en II, soit le cytochrome b, la partie fer-soufre (lISP, avec [2Fe-2S]) et la partie c1 ont respectivement 42, 22 et 27 kDa. Les autres chanes reprsentent environ 154 kDa au total dans le complexe bovin (ajoutes en III). Les bc1 sont donc les intermdiaires obligs entre les quinones respiratoires (ubiquinones) et le cytochrome c. La rduction d'une quinone en quinol, puis sa roxydation par un cytochrome bc1 donne lieu par elle-mme une conservation
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d'nergie. On l'explique aisment par la disposition asymtrique du donneur et de l'accepteur dans la membrane, soit d'un ct une dshydrognase et de l'autre le complexe bc1 ou tout autre accepteur.
[2 Fe2 S]
hme C extrieur hmes B
intrieur
cytochrome b cytochrome c1
I
I : cyt. b et c1 seuls (sans hmes) II : aprs addition de l'ISP III : monomre complet
II
III
Monomre bc1 mitochondrial

La rduction complte de la quinone consomme deux protons, la roxydation les restitue. Si par suite de cette asymtrie, la rduction a lieu prs de la face interne de la membrane et sa roxydation du ct externe, le cycle des quinones produira chaque tour un flux net vers l'extrieur de deux protons pour deux lectrons, en faveur d'un potentiel de membrane (une p).
face externe UQH2 2 H+ accepteur
donneur face interne 2 H+
UQ
Le cycle ractionnel du complexe bc1 permet d'augmenter ce bilan. L'oxydation de l'ubiquinol se fait en deux tapes avec passage par le stade semiquinone, et envoi chaque fois d'un lectron vers les deux hmes B, puis au noyau fer-soufre de l'ISP (la protine de RIESKE), et enfin l'hme C de la sous-unit c1. la fois l'ISP et la sous-unit c1 sont ancres la membrane par des hlices alpha, mais leurs parties
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essentielles dbordent largement vers l'extrieur 12. Le cytochrome c1 occupe donc la sortie. Il entre en contact avec l'accepteur final du complexe qui est un cytochrome c faible masse molculaire. Chose intressante, l'ISP porte son noyau fer-soufre dans une tte porte par un axe flexible, et l'on pense qu'elle peut basculer alternativement du cytochrome b vers la partie c1. Les deux hmes B sont dsigns habituellement dans la littrature par bL et bH (L et H pour low et high potential). Ils sont orients l'un au-dessus de l'autre peu prs perpendiculairement au plan de la membrane et se distinguent par leurs proprits 13. Le premier est un b566 bas potentiel (-30 mV), l'autre (bH) est un b560 potentiel plus lev (+90 mV). Le fonctionnement du complexe est inhib par deux sries d'agents qui se lient des endroits diffrents : l'antimycine et le HQNO d'une part, le myxothiazol, la stigmatelline et le MOA-stilbne de l'autre. En outre la partie cytochrome b a deux sites o peuvent s'installer les quinones/quinols, l'un tant prs de l'extrieur (ct P ou ct positivement charg), l'autre de la face interne (ct N ou ngatif)... Le fonctionnement du complexe bc1 est encore controvers. Le cycle ractionnel appel cycle Q, propos par MITCHELL [19] est certainement rvisable mais ses grandes lignes font la base des discussions. Au dpart est une molcule de QH2 sur le complexe. Le modle est fond sur deux oxydations successives en 1 et 2 transformant QH2 en semiquinone puis en quinone.
2 H+ e QH2 QH2 Q 1 Q ct extrieur (P) 2 H+ e QH2 e Q 2 Q Q 3 face interne (N)
.
QH2
e QH2
Q e QH2 Q 4 2 H+ QH2 e Q e 5
Cycle Q (interprtation simplifie

La premire oxydation rduit l'ISP, la deuxime l'un des hmes B. Deux protons sont expulss. En 3, un hme B transmet un lectron l'autre, dans un ordre qui est controvers. Une quinone changeable avec la membrane est prsente. En 3 et 4, le processus se rpte et deux protons sont jects nouveau. Deux molcules de QH2 ont t oxydes et deux lectrons stocks sur le tandem des hmes B. En 5, ces deux lectrons sont rutiliss pour rduire une des deux 12 - Donc dans le priplasme pour les bactries Gram-ngatives, dans l'espace intermembranaire pour les mitochondries. 13 - Rappel : deux structures chimiques identiques, ici les hmes B, peuvent avoir des proprits physiques et ractionnelles diffrentes en fonction de leur environnement molculaire au sein de la protine, et diffrentes de celles qu'elles auraient en solution.
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molcules de quinone en quinol QH2, l'autre tant change avec la membrane. Tout se passe donc comme si l'une des deux molcules de QH2 traites tait rgnre sous sa forme initiale. Au point de vue bilan, une molcule de quinol a t oxyde avec envoi de 2 lectrons un par un sur l'ISP, 2 protons ont t prlevs dans le cytoplasme et 4 protons ont t jects. Le cycle Q est dfendu notamment par TRUMPOWER et associs [20]. Pour d'autres chercheurs, en particulier HATEFI, une rvision du cycle Q comme modle s'impose nanmoins [21]. Une proprit capitale du bc1 est de pouvoir fonctionner de faon rversible. Dans le sens de l'oxydation d'un quinol par le cytochrome c, il gnre un gradient de protons. Inversement, par le retour de protons du ct extrieur vers l'intrieur, il engendre un courant d'lectrons en sens inverse vers la rduction des quinones. Il y a donc utilisation de la p pour renvoyer les lectrons vers des valeurs plus ngatives du potentiel, une disposition particulirement importante dans le mtabolisme des autotrophes. Le cycle Q a t pass au crible des tudes cintiques utilisant des inhibiteurs. L'antimycine et le myxothiazole avaient t supposs initialement se comporter comme des analogues des quinones et quinols. La premire s'installerait du ct N et l'autre du ct P, ceci en considrant l'existence des deux sites de fixation (QH2 et Q) comme explicit antrieurement. Le site quinonique plac du ct P (extrieur, prs de ISP) permettant la fixation QH2 n'a pas t localis sur les structures dtermines par cristallographie, et son existence est conteste. En outre la cintique du courant d'lectrons inverse, en partant de ISP et c1 pralablement rduits, indique un transfert d'lectrons de bL vers bH. Le transfert des lectrons partir de l'ubiquinol aurait donc lieu de bH vers bL, en sens contraire de celui qui tait prvu par le modle du cycle Q. La tendance est de considrer que les inhibiteurs ne prennent pas la place des quinones, mais contribuent verrouiller la structure en empchant les mouvements ncessaires l'accomplisement du cycle.
IPS (Fe/S)
N N
N N
c1 ct P +++++++++
++++++++
N N N N
bL
N N
N N
bH
ct N
Modle simplifi du complexe bc1
Les changements conformationnels au cours du cycle sont devenus vidents grce aux indications convergentes de la cristallographie, de l'analyse gntique, des mesures spectrales et cintiques [22]. L'un d'eux parat admis par tous les auteurs. La sous-unit ISP avec son noyau fer-soufre possde l'extrieur de la membrane une tte porte par une tige flexible, qui l'amne tantt dans le voisinage de bL, tantt vers le cytochrome c1. On peut comprendre l'importance de ce mouvement de la faon suivante. Quand deux lectrons arrivent en provenance du quinol membranaire (QH2), la partie flexible ISP s'carte en direction du cytochrome c1 ds
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qu'elle a reu un premier lectron. Le mouvement empche le deuxime lectron de suivre le mme chemin et permet son envoi vers la paire des hmes (bH/bL). Celle-ci peut stocker deux lectrons en tout, soit un sur chaque hme. En somme quand le quinol cde ses lectrons, l'un va d'un ct (sur ISP), le second de l'autre ct sur la paire bH/bL. Cet aiguillage est essentiel pour que le cycle effectue un deuxime tour, augmentant le nombre de protons relchs vers l'extrieur, soit quatre en tout au lieu de deux. Des mouvements plus compliqus du complexe sont envisags, en particulier dans l'association au sein du dimre. Divers spcialistes considrent les cytochromes complexes bc1 comme les reprsentants d'un dispositif molculaire ancestral de valeur universelle, appartenant une chane respiratoire primitive, dont le plan se retrouve chez les eubactries et les archaebactries : une courroie de transmission gnratrice d'nergie lectrochimique entre quinones rduites et oxydase terminale.
1.6 - OXYDASES RESPIRATOIRES TERMINALES

Les oxydases terminales reoivent les lectrons d'une chane de transporteurs respiratoire, et catalysent la raction : O2 + 4 e + 4 H+ 2 H2O. L'oxygne parvient par la face cytoplasmique de la membrane bactrienne. Le donneur direct est un cytochrome c ou une quinone respiratoire rduite ou quinol. Ces enzymes se rpartissent donc en cytochrome c oxydases et quinol oxydases. En outre la plupart des oxydases respiratoire effectuent une translocation de protons couple la rduction d'O2 et autorise une conservation d'nergie sous forme de potentiel membranaire. La cytochrome c oxydase ou cytochrome aa3 des mitochondries animales ou de levure appartient la membrane interne et ne renferme pas moins de 13 sous-units diffrentes, numrotes par ordre de mobilit croissante l'lectrophorse. Les bactries n'ont en gnral que les trois premires (I, II et III), qui sont les sous-units fondamentales trouves chez tous les tres vivants. Les parties I et II sont essentielles au transfert des lectrons, tandis que la III est surtout stabilisatrice au niveau de la membrane. Celles des mitochondries sont codes par l'ADN des particules que l'on sait avoir driv de lointains procaryotes. Les cytochromes c oxydases de Paracoccus denitrificans et Rhodobacter sphaeroides ont servi de bons modles d'tude. Elles sont associes une chane respiratoire dont le plan est grosso modo calqu sur celui de la mitochondrie, o l'ubiquinone rduite est roxyde par l'intermdiaire d'une chane de cytochromes bc1 et c. Les quinol oxydases sont au bout d'une chane plus simple et ne sont pas toujours conservatrices d'nergie par translocation de protons. Leur fonction peut consister ponger rapidement l'excs d'O2 dans les conditions de plthore d'nergie ou lorsque l'oxygne en excs se montre toxique pour la cellule 14.
14 - L'activit des chanes respiratoires est souvent trs facile doser sur des suspensions de fragments de membrane par oxydation du NADH (test de la "NADH oxydase"). On peut, soit examiner la disparition du NADH 340 nm, soit utiliser un test colorimtrique base de DCIP et PMS, ou encore un sel de tetrazolium.
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Les oxydorductions internes de l'oxydase respiratoire se font selon un dispositif commun moyennant quelques variantes. Dans les cas typiques, il existe 4 noyaux mtalliques : deux renferment du cuivre et sont dsigns par CuA et CuB, les deux autres sont hminiques. Donc deux 2 Cu et 2 Fe. Le noyau CuA peut tre bimtallique, avec deux atomes de Cu, ou tre absent. Le contenu est alors de 5 atomes mtalliques ou seulement de 3, et non pas quatre. La varit des situations est importante ce niveau et le dessin ne servira que de repre. La partie gauche symbolise les sous-units I et II dans un cytochrome aa3 dans la mitochondrie de la levure de bire, de Paracoccus denitrificans et de Rhodobacter sphaeroides . La partie droite reprsente le ba3 d'Acetobacter aceti, l'aa3 de Bacillus subtilis et le bo de E. coli. Les hmes sont symboliss par des traits noirs comme vus par la tranche, orients perpendiculairement au plan de la membrane.
n H+ ct extrieur Fe Fe CuB membrane ct cytoplasmique QH2 e Fe Fe CuB n H+
cyt. c Fe
CuA e
II
II
n H+ Cytochrome c oxydase
n H+ Quinol oxydase
Les deux types d'oxydases terminales

Les sigles tels aa3 et bo, font rfrence la nature des deux hmes de la sousunit I. C'est l que se font la rduction de l'oxygne et la translocation de protons. Ces hmes sont de type A, O, B ou D selon les cas. Comme on pouvait s'y attendre, la structure des units I et II ancres la membrane a t fortement conserve dans l'volution. Dterminer la structure du complexe qu'elles forment ne fut pas chose facile, car il s'agit de protines membranaires trs insolubles difficiles cristalliser autrement qu'en prsence de dtergent et de facteurs trangers comme des anticorps. La structure des oxydases aa3 dans les mitochondries bovines et Paracoccus denitrificans est maintenant connue en dtail et constitue un pas important pour comprendre le mcanisme de ces tonnantes machineries molculaires [23]. Les lectrons arrivent du ct priplasmique et sont livrs un un par le cytochrome c sur la partie II qui dpasse hors de la membrane. Deux lectrons sont provisoirement emmagasins au niveau de CuA grce au deux ions cuivre qui sont rduits en Cu(I). Le cheminement se fait par l'hme A hexacoordonn dans la partie II, puis vers l'hme A3 penta-coordonn 15. Le fer de celui-ci est 4,5 de CuB. Il forme avec celui-ci une paire mtallique diamagntique (pas de signal en On mesure alors essentiellement la NDH. Le test est stimul par le cyanure, qui supprime la comptition avec le reste de la chane respiratoire en aval et oblige tous les lectrons aller vers les colorants. Chez les bactries dtentrices d'un bc1, on peut mettre en vidence l'oxydation de l'ascorbate ou du TMPD par la partie aval de la chane. 15 - Hexa-coordonn : 6 liaisons dont 4 dans le plan de la porphyrine, et deux perpendiculaires de chaque ct. Penta-coordonn : la sixime position est libre et peut s'tablir avec un ligand tranger.
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RPE) et constitue la zone essentielle o s'effectue la rduction de l'oxygne. On a dcouvert un site supplmentaire recevant un mtal divalent (M2+), comme le calcium, le magnsium ou le manganse, dont la fonction reste inconnue. Les pices I et II de la cytochrome oxydase traversent la membrane par une fort d'hlices alpha hydrophobes au sein desquelles s'effectue le passage des protons. Il faut 4 protons prlevs du ct interne pour former aprs rduction d'O2 les deux molcules d'eau. Un nombre de protons supplmentaires estim 4 sont exports de l'intrieur vers l'extrieur, pendant que 8 lectrons sont reus et rduisent O2 en 2 H2O. Le flux total est donc de 8 protons prlevs l'intrieur et 4 mis l'extrieur, la diffrence de charges ainsi cre tant la base de la conservation de l'nergie lie l'oxydorduction.
II
Met Cys CuA His His Cys Glu M2+ CuA CuB
site O2 membrane His His CuB Tyr His His His His a3 a
hme a hme a3
Parties I et II de l'oxydase de Parococcus denitrificans

Un travail exprimental important a t effectu depuis la dcouverte de cette translocation de protons par WIKSTRM [24] et a conduit dterminer la voie de passage probable des protons travers le systme, la translocation tant actionne l'vidence par des changements alterns de conformation de tout l'difice chaque cycle ractionnel. Les quinol oxydases fonctionneraient sur le mme principe. L'oxydase bo de E. Coli a une sous-unit II homologue de celle de Paracoccus sur le plan structural, mais n'a pas de cuivre. Les lments rducteurs sont achemins par une ubiquinone (UQ8) qui oscille entre tat oxyd et rduit en passant par un stade radicalaire (semiquinone), les lectrons tant transmis un par un.
4 e 4H+ cyt. c 4 e CuA 4 H+ 4 e hme A3 4 e hme A O2 2 H2O 4 H+ 4 H+ CuB O2 2 H2O
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cytochrome c
Cytochrome c oxydase
4 H+ (chimie)
4 H+ (translocation)
Le cycle catalytique de l a cytochrome oxydase [25] est indiqu ici de faon simplifie. Les symboles O, R H ont t maintenus pour faire le lien avec la littrature scientifique. Dans les rectangles, le tandem Fe-Cu symbolise le couple bi-mtallique form par l'hme a3 et le CuB dans le site actif.
O
H2O H+ Fe(III) Cu2+ e e
H
Etats successifs O : oxyd R : rduit 2 lectrons A : fixation de O2 sur Fe(II) P : stade "peroxy" F : stade "oxoferryl" H : stade "hydroxy"
Fe(III) Cu2+ OH H+
Fe(II) Cu+ O2
Fe(II) Cu+ e O=O
Fe(IV) Cu2+ O2 H2O 2 H+ Fe(III) Cu+ O O e Fe(III) Cu2+ O O
Cycle de la cytochrome c oxydase
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Une des principales difficults est l'identification des tapes de changement de conformation que l'on crot tre responsables de la translocation des protons. On voit que le tandem Fe/Cu est d'abord pleinement rduit l'tat R, et que l'oxygne se fixe ensuite sur l'hme A3 au niveau du fer 16. Au stade P, l'oxygne diatomique est rduit au niveau peroxyde. Aprs l'arrive d'un troisime lectron, la liaison entre atomes d'oxygne est rompue. L'opration est une sorte de dismutation : il y a d'un ct une rduction deux lectrons qui donne une molcule d'eau, le groupe restant est oxyd en donnant le stade F. Un quatrime lectron rduit celui-ci en H, et l'hydroxyle est limin sous forme de la deuxime molcule d'eau. Nous avons donc 4 lectrons arrivant dans le cycle en ordre dispers, production de 2 molcules d'eau avec entre de 4 protons, qui sont prlevs du ct interne. Les 4 protons supplmentaires soumis translocation ne sont pas inscrits sur le diagramme. quels stades la translocation a-t-elle lieu ? En se fondant sur les donnes spectroscopiques, il a t prouv que des changements de conformation ont lieu au cours du cycle, chaque transition tant couple une jection de protons dans un seul sens [26]. Un seul serait mis lors de la rduction de O vers R, deux au cours de la transition de P F, et un dernier de F O. Pendant que fonctionne cette subtile mcanique, chaque molcule d'O2 atteint le noyau Fe/Cu par un chenal qu'on crot avoir identifi dans la structure, tandis que les molcules d'eau s'chappent l'oppos par un autre chenal. Nanmoins la nature des changements de conformation pendant le cycle est controverse et l'existence de changements structuraux d'ensemble a t conteste. KANNT et coll. ont prsent un modle labor qui ne fait appel qu'aux changements d'ionisation de plusieurs groupes [27]. Tout ceci est un schma moyen qui ne s'applique pas exactement aux quinol oxydases. Le cytochrome bd de E. Coli est une ubiquinol oxydase spciale ne contenant que deux sous-units et trois noyaux mtalliques comprenant les hmes b558, b595 et D. Son fonctionnement est radicalaire (lectron par lectron) comme celui du cytochrome bo [28]. L'architecture de la protine est diffrente, sa ligne volutive est distincte, et sa rsistance des inhibiteurs comme le cyanure ou l'azoture est plus marque.
quinol oxydases dshydrognases D-lactate L-lactate succinate NADH pyruvate L-proline glycrol-P OH Cu2+ b562 FAD FMN Fe/S OH O b558 b595 d
NO3
o555 O2
NO 3 b 556
nitrate rductase
Chanes respiratoires de E. coli
16 - Rappel : l'oxygne diatomique est li dans les porphyrines par le fer ferreux, comme dans l'hmoglobine.
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Un caractre saillant des chanes respiratoires bactriennes arobies est leur multiplicit dans une mme cellule. Diffrentes voies sont utilises en parallle ou en alternance en fonction des conditions. Le poste d'aiguillage est au niveau des quinones respiratoires loges dans la membrane et constituant l'tat rduit un rservoir d'lectrons jouant le rle de tampon entre les substrats oxyds en amont et les accepteurs en aval. Le colibacille offre le cas le plus simple. Les lectrons sont prlevs par les dshydrognases sur des substrats varis et canaliss sur l'ubiquinone. La forme quinol (ou semiquinone, non figure) est roxyde en arobiose vers une quinol oxydase, sans passer par un cytochrome c. Les bactries renferment plusieurs dshydrognases membranaires ragissant avec les quinones, comme celles du lactate, du succinate et autres. La plus importante est la NADH dshydrognase, ou NDH. Ce systme est particulirement complexe et ne contient pas moins de 14 sous-units, si on en juge par le nombre des gnes et de polypeptides identifiables. Les cofacteurs sont FMN, non li de faon covalente, et au moins 8 noyaux fer-soufre de type [2Fe-2S] et [4Fe-4S]. Le passage des lectrons s'accompagne d'une translocation de protons, une situation qu'on retrouve dans la NDH mitochondriale, appele site I, et qui est encore plus complexe puisqu'elle n'a pas moins de 42 sous-units! Du ct oppos de la chane, l'aiguillage des quinones favorise la quinol oxydase bo en milieu fortement ar dans une population soumise des divisions rapides. La voie de la quinol oxydase bd (cytochrome bd) prend la relve en oxygne limitant ou en culture surpeuple. Ce cytochrome possde une affinit trs leve pour l'oxygne par rapport au cytochrome o 17. En outre la voie de l'oxydase bd n'est inhibe par le cyanure qu' des doses 100 fois plus fortes (de l'ordre de 0,5 mM). L'emploi en parallle de ces deux systmes arobies est rgul avec prcision au sein de la bactrie. La surpopulation et la baisse de l'oxygne disponible induisent la synthse du cytochrome bd et rpriment celle du cytochrome bo. Le systme rgulateur deux composants ArcB/ArcA participe au contrle. Comment ? Chez E. coli, ArcB fait deux choses, dtecter la chute du potentiel d'oxydorduction dans la cellule lorsque O2 devient limitant, et se phosphoryler elle-mme en ArcB-P l'aide d'ATP. La protine est ancre dans la membrane et dpasse vers l'extrieur. Sa squence de 778 acides amins chez E. coli est symbolise sur le schma comme une succession de domaines 18. Une petite structure rpte note PAS* est courante dans ce genre de rcepteur. La phosphorylation se fait sur un premier site not H (pour histidine) la position 292. Le phosphate est transmis sur un second site not D (pour aspartate) en 576, ou directement sur la protine ArcA. Le phosphate peut aussi gagner l'autre bout de la squence, en un site H la position 717. Celui-ci peut aussi phosphoryler ArcA. En somme ArcA devient ArcA-P la position D en 54, par deux voies diffrentes. ArcA-P se lie par un domaine terminal l'ADN et fonctionne comme rgulateur de transcription [29].
17 - Son coefficient Km pour l'oxygne est 0,38 M, contre 2,9 M dans le cas du cytochrome o. 18 - La structure de la protine est constitue de plusieurs modules articuls entre eux et replis chacun de faon plus ou moins autonome (comme s'il y avait un chapelet de plusieurs protines diffrentes plus petites).
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ADP ATP P
P D 576
P H 717
ArcB
H 292 PAS tat mtabolique dfavorable P
778
taux faible de O2 chute du potentiel redox
ArcA
D 54
se lie l'ADN
Le systme ArcB/ArcA du colibacille

ArcB est une sorte de capteur qui transmet son signal en agissant comme kinase sur lui-mme, puis sur ArcA. En somme, ArcB sert de dtecteur et rpercute les signaux sur ArcA comme activateur de transcription. La zone PAS aurait un rle dans la dtection du manque d'oxygne, mais il n'y a aucune certitude sur le mcanisme. Une fois phosphoryl, ArcB-P active une collection d'oprons impliqus dans la physiologie de lanarobiose : synthse de dshydrognases flaviniques ; induction d'enzymes de la bta-oxydation des acides gras ; modification de la carte enzymatique du cycle de KREBS et de la voie appele "shunt glyoxylique" ; inhibition de l'amorage de la rplication de l'ADN ; remplacement du cytochrome terminal bo par le cytochrome bd. Tous les gnes concerns correspondent un rgulon*. Parmi les oprons ainsi rguls sont cyoABCDE et cydAB qui codent respectivement pour les quinol oxydases bo et bd, comme indiqu un peu plus loin. Une rgulation supplmentaire dtecte la fois la disparition d'O2 et la prsence du nitrate. Elle est sous la dpendance de protines rgulatrices telles que FNR 19 et Nar, que nous retrouverons en examinant la dnitrification, celle-ci tant une respiration de remplacement quand l'oxygne fait dfaut. De faon gnrale, les protines rgulatrices telles que ArcB-P ou FNR interviennent sur la transcription des gnes en se liant sur l'ADN au voisinage immdiat ou petite distance des gnes concerns. La figure montre qu'une diminution de l'oxygne favorise le recours l'oxydase bd code par cydAB et met en veilleuse l'autre oxydase. L'anarobiose inhibe la synthse des deux oxydases devenues inutiles. L'activateur FNR entre alors en lice et induit la nitrate rductase ncessaire la respiration sur nitrate. Nous verrons que FNR est un rgulateur majeur du passage l'anarobiose. Le dessin rsume le principe de ce double contrle. La baisse du taux d'O2 favorise 19 - FNR = "fumarate-nitrate-reduction".
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la phosphorylation de ArcA, active la sortie de l'une des oxydases et refoule la synthse de l'autre.
arcB ArcB O2 + O2 ArcB ArcA arcA
P ArcA
+
cydAB
cyoABCDE
enzymes diverses du mtabolisme anarobie
FNR fnr + O2 O2
FNR
ArcA/ArcB, FNR
En absence d'oxygne, FNR active la production de diverses enzymes du mtabolisme anarobie, rprime ici la sortie des deux oxydases devenues inutiles. En outre FNR rprime en permanence sa propre synthse, ce qui fait que cette protine rgulatrice reste taux faible dans la cellule. Nous retrouverons FNR propos de la dnitrification. Cette protine agit la fois comme capteur dans la dtection d'O2, et comme rgulateur de transcription. Nous finirons par un deuxime modle qui sera celui de Paracoccus denitrificans. Il atteint un niveau de sophistication lev, car ces bactries sont adaptables toutes sortes de conditions quand elles oscillent entre l'arobiose et l'anarobiose.
c mthylamine mthanol formaldhyde formiate FMN Fe/S OH Fe/S c552 OH O b c1 amicyanine mthylamine c550 b b3
Cu2+ Cu2+
O2
a a3 cytochrome c oxydases
NADH
complexe bc1
Cu2+ b a3 quinol oxydase
Paracoccus denitrificans en arobiose
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Elles sont capables de rduire des nitrates et autres oxydes d'azote (nitrites, NO, N2O), oxyder l'hydrogne molculaire et se dvelopper sur des substrats monocarbons (mthanol, mthylamine). Cette espce est donc mthylotrophe. Le dessin montre la chane de transfert des lectrons allant de gauche droite partir de divers donneurs, transmis par NADH, le complexe NADH dshydrognase (marqu FMN-Fe/S), les quinones, le complexe bc1, des cytochromes c, des oxydases terminales. L'originalit est ici la prsence simultane en arobiose de cytochrome c oxydases et de quinol oxydases. Deux portes de sortie sur le dioxygne. Les pices supplmentaires par rapport aux transferts d'lectrons du colibacillle sont le complexe bc1 et plusieurs cytochromes c. Toutes ces relations fonctionnelles ont t dtermines par la slection de mutants [30]. Comme dans le colibacille, une oxydase affinit plus faible pour O2 est la principale utilise quand l'oxygnation est forte (aa3), tandis que la cbb3 est davantage synthtise dans les conditions inverses. Un aiguillage important est le cytochrome c552. La quinol oxydase ba3 correspond la bo de E. coli. Pourquoi une troisime oxydase ? Une hypothse est de la considrer comme une valve rgulatrice, qui permet de dsengorger la rserve des quinones rduites lorsque les oxydations sont trop intenses en amont [31]. Une autre particularit est la synthse en prsence d'une mthylamine dshydrognase qui produit du formaldhyde et de l'ammoniac. Est induite galement une petite protine contenant du cuivre, l'amicyanine, qui rduit les diffrents cytochromes c. La dichotomie des chanes respiratoires se rencontre chez les Pseudomonas et espces relies, qui se caractrisent par une gamme immense de potentialits dans les biodgradations de substrats trs nombreux. La plupart des espces qui privilgient la vie arobie sont munies d'une voie contenant un complexe bc1, un cytochrome c et une cytochrome oxydase. Une chane de cette sorte, qui rappelle celle de la mitochondrie, est typiquement inhibe par l'antimycine A. En outre elle est facilement repre par un test microbiologique courant, qui consiste vrifier l'oxydation du TMPD, avec apparition d'une zone colore en bleu violet autour des colonies sur bote glose. Cette raction caractrise les espces "oxydasepositives" et dnote la prsence d'un cytochrome c. En conclusion, nous constatons un formidable pouvoir d'adaptation aux conditions de vie arobies et une multiplicit de solutions aux problmes poss. La principale fonction est la rcupration d'nergie mais ce n'est pas la seule. Les oxydases terminales ont aussi pour rle d'ponger l'oxygne excdentaire afin d'en viter les effets toxiques.
1.7- PHOTOTROPHIE NON-OXYGNIQUE

Le principe de la photosynthse est connu de tous les biologistes. Il est gnralement dcrit en dtail dans le cas des vgtaux verts pour des raisons videntes. La photosynthse des procaryotes a des caractres particuliers mais garde la mme finalit. L'nergie lumineuse capte par des pigments fait apparatre des
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entits assez rductrices pour l'assimilation du dioxyde de carbone. Nanmoins les modalits de la photosynthse des plantes et des algues ne sont pas extrapolables telles quelles aux procaryotes. Deux cas de figure bien nets sont observs chez ces derniers. Le premier est une photosynthse non oxygnique parce que l'eau n'est pas un donneur d'lectrons. Elle fonctionne essentiellement en anarobiose. Le second est la photosynthse oxygnique pratique par les cyanobactries. Le principe est en gros celui qu'utilisent les plantes mais avec des modalits originales. On le laissera de ct provisoirement. Les bactries phototrophes sont souvent strictement anarobies, mais certaines espces montrent une plus grande tolrance O2 et acceptent parfois l'arobiose complte. La plupart peuvent utiliser comme source d'lectrons l'hydrogne et diverses entits minrales comme le soufre et les sulfures, ou encore des composs organiques. L'assimilation du gaz carbonique permet au plus grand nombre de vivre en autotrophie. Ce sont donc des photo-autotrophes. Le pouvoir rducteur n de l'nergie lumineuse ne sert pas qu' rduire le dioxyde de carbone, mais peut se voir diriger vers la rduction de certains composs organiques. Les bactries photosynthtiques forment un ensemble htrogne aux potentialits complexes et varies dans les eaux douces ou marines. On les trouve en abondance dans les mares et les tangs, les mangroves, dans les milieux non brasss mais exposs la lumire. Le tableau offre quelques points de repre. Grand groupe
I - Pourpres sulfureuses
Proprits
Anarobies strictes, autotrophes par cycle de CALVIN, utilisent H2, le soufre, les sulfures. Accumulent des granules de soufre intra-cellulaires. Flagelles Anarobies mais supportant parfois une certaine arobiose, autotrophes par cycle de CALVIN, utilisent H2, des composs organiques. Htrotrophie possible la lumire ou avec O2 l'obscurit. Flagelles. Sensibles aux sulfures. Anarobies strictes, autotrophes par cycle spcial des acides tricarboxyliques, utilisent H2, le soufre, les sulfures. Chlorosomes. Croissance possible en lumire trs faible. Anarobies ou arobies photo-htrotrophes, utilisent des sulfures et composs organiques, mobiles par glissement dans les sources chaudes, ont des chlorosomes.
Types
Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa (-protobactries) Rhodobacter, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas (-protobactries) Chlorobium, Pelodictyon
II - Pourpres non sulfureuses
III - Vertes sulfureuses
IV - Vertes non sulfureuses
Chloroflexus
V - Hliobactries Anrobies strictes proches des Gram-positives, photo-htrotrophes, vivent dans le sol dessch et non sulfureux des rizires [32]
Heliobacterium, Heliobacillus, Heliochlorum
Ces diffrentes catgories sont gnralement bien dcrites dans les manuels de microbiologie, mais il a fallu ajouter rcemment un nouveau groupe rassemblant des espces trs htrognes. On y relve un nombre important d'-protobactries marines qui prennent une part notable, peut-tre de 5%, la photosynthse
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du picoplancton des ocans [33]. Ce sont donc des arobies plus htrotrophes qu'autotrophes. Aucune n'utilise l'eau comme donneur d'lectrons et aucune ne libre de l'oxygne. Elles utilisent des composs soufrs et surtout des composs organiques. La dcouverte tonnante de ces organismes sans liens taxonomiques les uns avec les autres a t facilite par des techniques fluorimtriques perfectionnes autorisant l'identification prcise des pigments chlorophylliens. Toutes ces bactries sont surtout des photo-htrotrophes qui se servent d'O2 pour oxyder des matires organiques. D'autre part la prsence d'oxygne serait ncessaire la synthse de la chlorophylle. Il y a donc une sorte de paradoxe. Quel est le rle de la lumire? Il est probable que le bas potentiel gnr est utilis pour rduire des molcules organiques en composs qui seront oxyds ensuite par l'oxygne. En somme il s'agirait de tirer une meilleure nergie des oxydations en partant de substrats rendus un potentiel plus bas qu'au dpart. Les bactries de cette catgorie ont souvent moins de pigments chlorophylliens et davantage de carotnodes* que les bactries phototrophes anarobies, sans doute parce que leur mtabolisme ne dpend pas uniquement de la lumire. On les considre provisoirement comme capables de jouer simultanment sur les deux tableaux au cours de l'clairement diurne, par un mtabolisme mixte la fois autotrophe et htrotrophe [34]. Il est devenu clair que ces espces participent avec les cyanobactries l'conomie carbone des ocans. Leur dcouverte tend remettre en cause les modles climatiques et la prise en compte du cycle du carbone. Leur intervention dans les biodgradations reste cependant dterminer. Nous revenons maintenant aux phototrophes les plus classiques, savoir les bactries pourpres et vertes des lignes I III. Elles utilisent comme pigment rcepteur des bactriochlorophylles (BChl) trs proches des pigments utiliss par les plantes et contenant comme eux du magnsium comme mtal. La plus commune est la bactriochlorophylle a, qui drive de la chlorophylle a des vgtaux par des modifications mineures. D'autres pigments, BChl b, c et d sont des variantes. Une longue chane latrale hydrophobe est faite par estrification avec un alcool insatur. Les pigments chlorophylliens sont gnralement accompagns de carotnodes. Ces pigments participent la collecte de la lumire, mais n'y sont pas essentiels, car des mutants bactriens sans carotnodes continuent faire une photosynthse malgr une plus grande fragilit aux conditions externes. Les carotnodes sont des anti-oxydants contre les radicaux libres ou l'oxygne singulet et participent une dfense contre O2. La nature des pigments et leurs relations avec les protines dterminent les caractristiques spectrales des rcepteurs. Ainsi les chlorophylles a et b des plantes absorbent dans le bleu au-dessous de 450 nm et dans le rouge, respectivement 680 et 675 nm, tandis que les bactriochlorophylles vont plus loin dans le rouge et le proche infrarouge : 805 et 850-910 pour la BChl a, et 840, 1020-1035 pour la Bchl b. Les carotnodes contribuent combler partiellement les trous du spectre par leur absorbance dans la zone des 450-510 nm. Les proprits spectrales ont d'importantes rpercussions sur le plan cologique. En effet les bactries pourpres et vertes, spcialises dans une photosynthse anarobie, se placent en milieu aquatique l'cart de la surface, sous les zones habituellement colonises par les vgtaux verts, les algues et les cyanobactries. Leurs caractristiques spectrales les aident capter
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des tranches du spectre qui n'ont pas t arrtes par d'autres. Les bactries sulfureuses vertes adoptent une autre stratgie. Leurs chlorophylles spcialises absorbent dans la zone 715-760 nm, o la comptition est svre, mais compensent par une extraordinaire adaptation un clairement trs faible. En eau calme s'tablit une stratification thermique entre les eaux de surface, les mieux claires et les plus chaudes, et les eaux profondes, plus froides, enrichies par les manations sulfureuses des sdiments et pauvres en oxygne. Les bactries pourpres se tiennent au-dessous de la zone de transition appele thermocline. Leur rpartition s'tablit en fonction de la lumire, du taux d'O2, de celui du sulfure et des mati1,0 res organiques. Les zones cyanobactrie les plus sombres, totalement anarobies et riches bactrie en sulfure sont favorables pourpre aux sulfureuses vertes du genre Chlorobium. Cyano0,5 bactries, algues et vgtaux comme les lentilles d'eau (Lemna) s'tablissent au-dessus de la thermocline.
absorbance (u.a.)
400
600
800
1000
(nm)
Une telle rpartition dans les milieux aquatiques est rarement stable. Les perturbations sont de nature saisonnire ou mtorologique, le brassage des couches provoque une redistribution des germes et des constituants dissous, avec des remontes de matriaux venant du fond. Ce phnomne trs important, appel "upwelling", redistribue les matires organiques dposes sur le fond. Il s'effectue grande chelle dans les milieux marins. Le terme de photosynthse recouvre videmment deux phases. La premire est la collecte de la lumire et sa transformation en nergie chimique. La seconde est le mtabolisme d'assimilation de CO2 en molcules organiques et relve de la biochimie classique 20. Nous ne retiendrons ici que la premire pour ses caractres particuliers. La conversion de l'nergie lumineuse en nergie chimique sous forme d'un bas potentiel d'oxydorduction se fait dans des complexes membranaires dits centres ractionnels. Ces derniers sont entours par une nappe de pigments associs des protines et constituant l'antenne. L'ensemble form par un centre ractionnel et son antenne est dsign comme photosystme (PS) et les bactries non oxygniques n'en renferment que d'une seule catgorie. Grce aux pigments antennaires, une plus grande surface rceptrice est obtenue pour capter la lumire. Celle-ci engendre des excitons* qui convergent grande vitesse de pigment pigment jusqu'au centre ractionnel dans un laps de temps de l'ordre de la
20 - Le cycle de CALVIN est rsum en glossaire, l'exclusion du cycle rducteur des acides tricarboxyliques.
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picoseconde. L'ensemble de ces transferts n'est ralis que par une architecture molculaire trs stricte des complexes antennaires et du centre ractionnel. Celui-ci est charg de matrialiser un exciton sous forme d'un lectron potentiel trs rducteur. La conversion se fait alors au niveau d'une paire de molcules de bactriochlorophylle (BChl/BChl). Le mcanisme fondamental est celui de la sparation de charges. L'arrive d'un exciton (astrisque) se traduit par la sparation des charges positive et ngative dans la paire de Bchl. Un lectron est vacue dans une chane de transferts qui est d'abord interne au centre ractionnel laissant un trou (la charge positive) qui sera combl par retour d'une charge venant de l'extrieur.
* e cascade de transferts BChl/BChl* BChl+/BChl BChl+/BChl e (recharge)
BChl/BChl
Le trou form dans la paire de Bchl par le dpart d'un lectron se traduit par un affaiblissement du signal spectral dans la partie rouge lointain du spectre. Par exemple ce phnomne sobserve 870 nm chez Rhodobacter sphaeroides, et le centre ractionnel est dsign comme P870, tandis qu'un Chlorobium a un P840 et une plante verte un P700. La figure symbolise chaque centre ractionnel par un rectangle gris. Les potentiels rducteurs sont vers le haut. Les dimres de Bchl ayant reu un exciton (P870, P840)* sont ports un trs bas potentiel et amorcent un courant d'lectrons partiellement cyclique faisant retour aux dimres chargs positivement et ports un potentiel oxydant (P870+, P840+).
pourpres (et vertes non sulfureuses)
E' (mV)
1500
vertes sulfureuses P840* e A1 e
P870*
1000
Bph h QA QB e Q e c bc1 c2 NADH NDH p P840+ h
Fe/S
Fd MQ
e NADH bc1 p
500
P870+
+ 500
c553
source d'lectrons
e source d'lectrons
Bph - bactriophophytine QA, QB, Q, MQ - quinones transporteurs d'lectrons A1, Fe/S - noyaux fer-soufre Fd - ferrdoxine bc1 - complexe cytochrome bc1 NDH - NADH dshydrognase fonctionnant en courant d'lectrons inverse
L'nergie lumineuse apporte par un exciton fait jaillir le P870 et le P840 un niveau d'nergie suprieur qui amorce un courant lectronique visible dans les deux cas sur la figure, un peu comme fonctionnerait une photopile. Les lectrons ont deux destinations. La premire est de faire retour au niveau de base par un circuit ferm qui passe par un cytochrome complexe bc1 de mme nature que celui qui a t dcrit. Cette tape est capitale, car elle est translocatrice de protons et charge
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le potentiel membranaire signal par p. L'nergie ainsi rcupre conduira une synthse d'ATP. La deuxime voie des lectrons sert rduire le NAD+ en NADH par la dshydrognase note NDH. Dans le cas des bactries pourpres, la sortie des lectrons se fait par quinones interposes (Q) un potentiel moins ngatif que celui du NADH. En consquence un courant d'lectrons inverse est ncessaire, actionn par l'nergie de la force protonmotrice p. Dans le cas des bactries vertes comme Chlorobium limicola, droite sur la figure, ce retour n'est pas ncessaire car les lectrons sortent du centre ractionnel par une ferrdoxine rduite un potentiel suffisamment ngatif (Fd). Il est vident que la synthse de NADH dans les deux cas dtourne une part des lectrons du circuit. La source d'lectrons extrieure est l pour combler le dficit. Il s'agit de l'hydrogne, des composs soufrs, et dans le cas des bactries pourpres de substances organiques. L'ensemble du dispositif met donc en jeu des molcules de pigments (BChl, Bph), des quinones, des complexes protiques (bc1, NDH), divers cytochromes c qui n'ont pas tous t indiqus. Les bactries vertes fonctionnent un potentiel plus ngatif que les pourpres, utilisent une ferrdoxine et font appel de prfrence une mnaquinone (MQ). Le centre ractionnel des bactries pourpres non sulfureuses, Rhodobacter sphaeroides et Rhodospirillum rubrum, est le mieux connu aprs les tudes cintiques, la dtermination de la structure [35] et l'usage de mutants. C'est une petite merveille molculaire. Chaque centre contient deux polypeptides fondamentaux, L et M (ou A et B) de structure similaire. Ils sont associs au dimre de BChl, et plusieurs pigments, des bactriophophytines (BphA, BphB) et bactriochlorophyles (BChlA et BChlB). Ils comportent aussi un ion Fe2+ et deux sites de fixation pour quinone (QA, QB). La prsence de peptides supplmentaires du ct cytoplasmique, comme H, n'est pas gnrale. Chez la plupart des espces sauf Rhodobacter capsulatus, le centre ractionnel est troitement associ du ct priplasmique un cytochrome c.
(Bchl)2 BchlB BchlA
L
BphB Fe2+ QB QA BphA
ct chane H et cytoplasme
Centre ractionnel de Rhodobacter sphaeroides
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Les lectrons retournent au cycle des oxydorductions par ce canal. La pice essentielle est videmment le dimre form des deux molcules de BChl dsignes dans la littrature par DA et DB. C'est l que se fait la sparation des charges, qui survient en quelques picosecondes aprs l'arrive de chaque exciton. Le croquis est une image simplifie du centre ractionnel de R. sphaeroides o seuls sont indiqus les chanes L, M, et leurs cofacteurs. Les autres cofacteurs forment deux chanes de transport d'lectrons vers le site QB, l'une tant utilise plus souvent dans L que l'autre. Les transferts sont trs rapides (infrieurs la nanoseconde). Les deux sites de fixation des quinones n'auraient pas la mme valeur. Une quinone en QA est fermement lie au complexe, alors qu'en QB elle apparat comme changeable avec les quinones de la membrane. Le rle du fer n'est pas clairement cern. La symtrie de l'ensemble n'est pas parfaite. Le cheminement prfr des lectrons est du ct L par BchlA et BphA, QA et QB. Cette dernire est le vritable point de sortie du pouvoir rducteur vers la membrane. Les quinones membranaires font partie d'une chane de transport d'lectrons analogue une chane respiratoire faisant appel un cytochrome bc1, qui effectue une translocation de protons hors du cytoplasme bactrien. Pour approvisionner le centre ractionnel en excitons, les antennes des bactries pourpres sont constitues de complexes LH (pour "light-harvesting") disposs tout autour par un assemblage qui est une autre merveille. Les LH sont de deux sortes. Les LH-1, appels aussi B875, entourent directement le centre ractionnel. Les LH-2 (ou B800-850) forment un ensemble priphrique d'importance variable en fonction des conditions. La structure d'ensemble prsente de profondes analogies dans tous les cas de figure, avec quelques variantes seulement [36] Les similitudes sont soulignes par les homologies de squence entre les polypeptides. Ces complexes ont une organisation rigoureuse de telle sorte que les excitons peuvent se transmettre de l'une l'autre trs grande vitesse jusqu'au centre ractionnel sans dissipation en chemin avec un rendement de 95%. La structure des LH est faite d'un multiple de paires o les chanes et sont organises en hlices alpha traversant la membrane. Ainsi dans chaque LH-1 de R. sphaeroides, chaque paire est associe 2 molcules de bactriochlorophylle et 2 molcules de carotnode, tous les dimres formant une couronne de 16 units autour du centre ractionnel. De la mme faon, les paires des LH-2 sont arranges en couronne avec un nombre dfini de molcules de pigment (3 BChl) [37]. Un nouveau croquis tente d'expliquer la nature des relations entre les complexes antennaires LH et les centres ractionnels o se fait la sparation des charges. En a, le centre ractionnel est symbolis comme vu latralement dans la membrane et on reconnat la disposition de la figure prcdente. En b, le plan de la page est celui de la membrane. Le dimre de BChl est symbolis par les deux petites barres noires et le signe +/. Les 16 sous-units de LH-1 entourent le centre ractionnel, les excitons voyagent rapidement d'un pigment l'autre vers le centre ractionnel qui les "traite" un un.
h cyt. c priplasme M BchlB membrane BPhB QB cytoplasme Fe H h LH-2 LH-1 QA DB DA L BchlA BPhA h
+/
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II
centre ractionnel
a - Centre ractionnel
b - Complexes antennaires
Tout cet appareillage molculaire est mis en place selon des rgulations trs strictes obissant aux diffrentes conditions, et varie avec les espces. Ainsi chez Rhodopseudomonas capsulatus une chute brusque de l'intensit lumineuse entrane l'arrt de la croissance. De nouvelles synthses sont induites. Le nombre des centres ractionnels est multipli par 5, et la masse des pigments antennaires qui entoure chaque centre est double [38]. Il y a en mme temps augmentation d'efficacit gnrale de la collecte d'nergie lumineuse. L'acclration de la synthse concerne la fois la formation des pigments et des polypeptides associs. Les nouvelles molcules de protine s'assemblent dans la membrane autour des molcules de pigment pour former des complexes fonctionnels. Les bactries pourpres sont en gnral dpigmentes en arobiose et l'obscurit. Certaines espces continuent faire du pigment dans le noir complet condition qu'il n'y ait pas d'oxygne. Celui-ci est donc un facteur critique et l'appareil photosynthtique ne se dveloppe la lumire que si le taux d'oxygne est faible ou nul. La synthse de la bactriochlorophylle apparat comme l'opration la plus sensible l'oxygne, avec de grandes diffrences selon les espces. Rhodobacter capsulatus est trs arotolrant et fait encore un peu de pigment dans un milieu en quilibre avec l'air ambiant, tandis que Rhodospirillum rubrum n'en fait plus.
n H+
n H+
cytoplasme
ATP
priplasme extrieur ATP synthase chromatophore
Chromatophores
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Finalement, tout l'appareil photosynthtique des bactries pourpres est log dans des excroissances membranaires internes, de dveloppement plus ou moins grand avec les conditions, de forme variable selon les espces, appeles chromatophores (a), et disposes comme en b. Les protons rejets par les oxydorductions entrent nouveau en dterminant une synthse d'ATP. Nous n'voquerons que trs rapidement le cas des bactries vertes. Elles sont remarquables par leur phobie absolue de l'oxygne et leur capacit se dvelopper en lumire trs faible grce leurs chlorosomes contenant un pigment antennaire particulier (BChl c), polymris en grande quantit dans des btonnets membranaires. Les chlorosomes, symboliss par le diagramme b, apparaissent comme un sac allong d'une longueur d'environ 200 nm, bourr principalement de BChl c polymrise en cordons ou en btonnets. Les chlorosomes sont relis la face interne de la membrane par une plaque basale contenant de la BChl a et des protines organises en trimres appeles FMO dans la oligomre littrature 21. plaque basale
cytoplasme P840 protine FMO
Chlorosome
La bactriochlorophylle c n'est prsente que dans les chlorosomes. On estime que chacun contient plus de 200 000 de ces molcules, de telle sorte que le rapport serait de 10 000 20 000 BChl c par centre ractionnel. Les chlorosomes apparaissent donc comme les dispositifs antennaires les plus tendus et les plus performants connus pour capter la lumire. Les bactries vertes sulfureuses peuvent se dvelopper dans des eaux anoxiques profondes et riches en sulfure, o la lumire parvient difficilement sous la vgtation aquatique et les particules en suspension. Un certain nombre de protines des chlorosomes ont t rpertories, une dizaine au moins, parmi lesquelles trois sont en quantit majeure [39]. Ces antennes sont adaptables. Un mcanisme rgulateur supprime toute photosynthse en cas d'exposition des traces d'O2, et les trimres FMO seraient des valves charges de ce rglage [40]. Les excitons ns dans les chlorosomes parviennent en quelques picosecondes aux centres ractionnels par la plaque basale et les trimres FMO, et cette norme efficacit passionne de nombreuses recherches en biophysique, avec l'espoir de concevoir des modles artificiels. Chose curieuse, C. tepidum peut se passer de ses chlorosomes. Il suffit pour cela qu'une mutation empche la synthse de la BChl c. Les bactries ncessitent alors un clairement plus fort et leur photosynthse repose sur la BChl a et des carotnodes [41].
21 - Ou protines FENNA-MATTHEWS-OLSON, du nom des dcouvreurs. Elles sont absentes dans les bactries vertes non sulfureuses du type Chloroflexus.
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Les centres ractionnels des sulfureuses vertes ont des analogies structurales avec ceux des bactries pourpres, notamment par l'existence de deux sous-units principales porteuses de cofacteurs assurant les transferts d'lectrons. Alors que chez les bactries pourpres existe une dissymtrie fondamentale (chanes L et M) portant deux voies de transfert, dont l'une est privilgie par rapport l'autre, le centre ractionnel de Chlorobium limicola ou de C. tepidum apparat comme symtrique. En effet il n'y a qu'un seul gne pour coder les deux parties essentielles. La structure de base est un homodimre auquel s'ajoutent plusieurs sous-units.
cytochrome c555 P840
priplasme A'0 BChla A'1 FB FMO FX A1 FA FMO A0 BChla FB FA
Centre ractionnel de bactrie verte sulfureuse

Deux voies de transfert d'lectrons partent du donneur primaire (le P840 constitu de deux BChl a), avec bactriophophytine (A0, A'0), des sites occups par des quinones (A1, A'1), un noyau fer-soufre (Fx) occupant la position o se trouve du fer chez les bactries pourpres. Du ct cytoplasmique se trouve une partie dtaille en B, construite comme une ferrdoxine, portant deux noyaux [4Fe-4S] et dsigns par FA et FB . Le centre ractionnel renferme 2 molcules de carotnode. De nombreuses molcules antennaires de BChl a (16 au total) l'entourent. Il est au contact de deux trimres FMO contenant 42 BChl a et placs au contact du chlorosome [42]. En conclusion de cette partie, nous voyons que les bactries photosynthtiques non oxygniques vivent le plus souvent sinon exclusivement en anarobiose. Leur importance dans les cycles naturels et les biodgradations est sans doute plus faible que celle des cyanobactries, par lesquelles nous terminerons ce chapitre. Mais elles nous aident sur le plan fondamental mieux comprendre les mcanismes de la captation de l'nergie lumineuse dans la photosynthse. Ces bactries reprsentent sans doute des dispositifs ancestraux, antrieurs la monte de l'oxygne dans l'atmosphre terrestre, et repris par les cyanobactries dont des formes cousines ont conduit aux chloroplastes des plantes. Les cyanobactries et les chloroplastes, support d'une photosynthse oxygnique, on copi la structure des centres ractionnels vus prcdemment. Cette photosynthse utilisant deux photosystmes diffrents, le PS1 et le PS2, driverait pour le premier du photosystme des bactries pourpres, et pour le second de celui des bactries vertes.
56
1.8 - LES CYANOBACTRIES

Il n'existe probablement aucun endroit de la biosphre qui ne soit pourvu de cyanobactries. On les appelait algues bleu-vert, cyanophyces, cyanophytes. Elles ne font que ressembler aux algues sans appartenir cette catgorie, car ce sont des procaryotes. Leur importance, ou plutt celle des formes ancestrales des cyanobactries, semble avoir t colossale dans l'histoire de la vie. Les formes les plus anciennes remonteraient plus de trois milliards d'annes. Elles sont rvles par les stromatolites fossiles, figures feuilletes ou ondoyantes en pelures d'oignon inscrites dans la pierre. On en connat la signification parce que des formes vivantes quivalentes se trouvent sur la cte Nord-Ouest de l'Australie (Shark Bay). Les cyanobactries forment ces structures par alternance de prolifrations cellulaires et de dpts de carbonate de calcium. Une nouvelle couche se formait au-dessus, et ainsi de suite. Des stromatolites fossiles ont t dtects dans des terrains d'ge vari 22. Ces organismes ont t probablement les initiateurs de la photosynthse oxygnique, productrice d'oxygne molculaire. Ils n'taient sans doute pas les premiers faire une photosynthse. Ils auraient pris la relve d'organismes antrieurs qui devaient utiliser les ions ferreux et H2S comme donneurs d'lectrons, et auraient t l'origine des deux types de centres ractionnels appels PS1 et PS2. Une baisse de l'anhydride carbonique atmosphrique sous l'effet de la photosynthse a sans doute t le rsultat de leur activit, provoquant une diminution de l'effet de serre et un important refroidissement 23. Les chloroplastes des algues et plantes vertes sont les hritiers d'anciennes cyanobactries symbiotiques. Cette hypothse est corrobore par un large faisceau d'observations biochimiques et gntiques convergentes. Les cyanobactries les plus anciennes ont laiss leur signature chimique sous forme de bactriohopane-polyols (PHP). Ces produits servent rigidifier la paroi et sont souvent mthyls en position 2, tels les 2-mthylhopanes dont les cyanobactries actuelles ont pratiqueOH OH ment l'exclusivit au sein 21 de la microflore (R dsigne une partie glucidique).
H3C OH R
2 3 1
2-Mthylhopanes
22 - Les stromatolites fossiles bien conservs sont nanmoins peu communs. Il y en a dans le Trias en Allemagne (rgion de Hanovre). Un beau gisement prcambrien se trouve en Mauritanie prs d'Atar. Parmi les plus anciens se trouvent ceux du Canada. Les formations australiennes actuelles sont ctires et juste au-dessous de la limite des mares. 23 - Cette hypothse mise par JL. KIRSCHCINK et autres chercheurs californiens, est celle de le "Terre boule-deneige". Une longue glaciation aurait affect une grande partie du globe au Prcambrien jusqu' l'Ordovicien. Son origine est probablement plus complexe, ainsi que le rchauffement qui s'est accompagn d'une explosion de formes animales regroupant dj toutes les grandes lignes animales modernes.
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Le noyau principal est peu de chose prs celui des strols eucaryotiques dont la structure est donc particulirement "ancienne", car des lipides de structure trs voisine ou gohopanes ont rsist au temps et ont t vus dans des schistes bitumineux gs de 2,5 milliards d'annes, jusqu'aux terrains sdimentaires du Tertiaire. Le noyau des hopanes est extrmement stable, rsistant la biodgradation, li du soufre et incorpor aux krognes, supportant un lger mtamorphisme avec des modifications mineures comme la rorientation du mthyle. Les cyanobactries forment un groupe d'organismes particulirement rsistants et adaptables toute sorte de conditions. La squence gnomique complte d'un Anabaena est disponible [43] ainsi que celle d'une espce, Nostoc punctiforme, remarquable par la diversit de ses habitats et sa capacit d'entrer en symbiose avec divers vgtaux [44]. Capables de supporter de grands carts de temprature et de salinit, les cyanobactries contribuent de manire importante la microflore des dserts et reprsentent une part majeure de la biomasse ocanique. Les espces les plus abondantes dans les ocans sont des Synechococcus unicellulaires et des Trichodesmium filamenteuses. Le picoplancton des ocans renferme des quantits prodigieuses de cyanobactries dans une zone comprise entre la surface et 100 m. Leur impact sur les cycles du carbone et de l'azote est probablement norme, non seulement par la photosynthse, mais aussi par l'assimilation de l'azote. Les cyanobactries sont galement trs communes dans les lacs, les eaux courantes et les sols. Les formes filamenteuses sont abondantes en zone littorale et dans les mers peu profondes. Une espce comme Nostoc commune est rpandue sur tout le globe, des rgions polaires aux rgions tropicales. Une autre forme, Cyanidium caldarium, peut se dvelopper dans des sources chaudes plus de 60-70C. Elles compensent leur multiplication plus lente par rapport d'autres organismes en exerant une comptition vitale acharne o est mise en jeu la fabrication d'une grande varit de substances vocation antibiotique. Une proprit commune aux cyanobactries et aux algues marines comme les Rhodophytes (algues rouges) est la synthse de composs halogns partir des chlorures, bromures et iodures de l'eau de mer l'aide de chloro- et bromoperoxydases [45]. Les cyanobactries prsentent un certain nombre de caractres essentiels rsums ici brivement. Leurs cellules procaryotiques vivent l'tat spar ou en filaments pluricellulaires selon les espces. Divers critres biochimiques, comme la prsence de peptidoglycanes, les rapprochent des protobactries. l'instar des vgtaux suprieurs, les cyanobactries ont deux photosystmes PS1 et PS2, mais ne contiennent que la chlorophylle a (pas de chlorophylle b comme chez les plantes). Les pigments antennaires sont constitus de chlorophylle et de phycobilines, qu'on ne retrouve que dans des groupes trs limits d'eucaryotes (algues rouges). Ces pigments participent la collecte de la lumire, et entrent dans la composition de complexes particuliers appels phycobilisomes. L'assimilation du gaz carbonique la lumire se fait par le cycle de CALVIN, et des particules intra-cellulaires spciales, ou carboxysomes, sont des rservoirs de la Rubisco*. Une anhydrase carbonique intracellulaire puissante jointe un transport du bicarbonate 24 permet aux
24 - Le gaz carbonique traverse facilement les membranes biologiques, la diffrence des ions.
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cyanobactries d'utiliser ce dernier comme source de carbone et de s'adapter aux milieux alcalins plus facilement que les algues vertes (voir DIC*). La photo-autotrophie est un rgime quasi obligatoire pour la majorit des cyanobactries. Elles n'ont gnralement qu'une aptitude limite consommer les substrats organiques carbons qu'on leur offre l'obscurit en culture. La vie htrotrophe en prsence d'oxygne, est possible chez certaines espces, mais ne donne lieu qu' une croissance lente, quelques exceptions prs comme Oscillatoria terebriformis, une espce thermophile qui peut survivre sans oxygne et l'obscurit en faisant une fermentation lactique du glucose ou du fructose [46]. L'htrotrophie des cyanobactries repose gnralement sur l'utilisation des rserves internes et facilite leur adaptation l'alternance entre le jour et la nuit On a tent d'expliquer cette proprit par l'absence de systmes de transport adquats ou d'enzymes cls du mtabolisme intermdiaire. En fait la situation relle parat plus complexe. Certaines cyanobactries tirent un bnfice de l'alternance jour/nuit, et paraissent adapter leur mtabolisme carbon l'absence de lumire [47]. Anabaena variabilis pousse lentement l'obscurit sur saccharose, glucose, fructose ou autres glucides [48], et des facilits du mme genre ont t maintenant reconnues dans plus d'une vingtaine d'espces. L'oxydation des glucides l'air en l'absence de lumire existe chez des espces spcialises qui utilisent de prfrence la voie des pentose-phosphates, le cycle de KREBS y tant gnralement incomplet par dfaut de la 2-oxoglutarate dshydrognase. L'enzyme essentielle est la glucose-6-phosphate dshydrognase, qui est active par oxydation et inhibe par rduction. Elle pourrait donc avoir une fonction rgulatrice dans un mcanisme de contrle dont l'oxygne serait le signal initial [49]. La dsactivation de l'enzyme en anarobiose obligerait les cellules concernes se rabattre sur une fermentation de survie produisant de l'ATP comme nergie de secours. De nombreuses espces rduisent l'azote atmosphrique et librent de l'hydrogne par la nitrognase, mais celle-ci craint la prsence d'O2. Une adaptation spciale consiste ne faire fonctionner la nitrognase que lorsqu'il n'y a pas d'oxygne. cela existent deux solutions majeures. La premire est de ne faire fonctionner la nitrognase qu'au cours de l'obscurit nocturne quand la photosynthse est arrte et ne produit plus d'O2. La seconde est de faire assimiler l'azote par des cellules spciales, appeles htrocystes, dont la diffrenciation met en jeu le rglage de plus de 60 gnes. Le mtabolisme y est modifi, la nitrognase y est induite et la production d'O2 est ramene au minimum par arrt du photosystme 2 (PS2). Les cyanobactries dans leur ensemble fabriquent une varit considrable de produits secondaires comme des toxines ou des terpnes volatils comme la gosmine et le 2-mthyl-isobornol qui sont connus pour donner dose infime un mauvais got l'eau. Les espces toxiques se trouvent surtout dans les eaux douces 25 en provoquant parfois des intoxications chez les animaux. L'anatoxine-a est un poison neuromusculaire produit par certaines souches d'Anabaena flosaquae, les microcystines sont des neurotoxiques de Microcystis aeruginosa [50]. La 25 - En milieu marin, les intoxications estivales des bords de mer par des floraisons intempestives d'"algues" sont dues principalement des dinoflagells.
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nodularine est un pentapeptide de Nodularia spumigena. La structure dtaille de ces produits est connue [51]. Leur action toxique est de bloquer les protine phosphatases srine et thronine (PP-1, PP-2A) dont l'intervention est cruciale dans les rgulations mtaboliques cellulaires. Ces toxines sont le plus souvent des polypeptides structure cyclique comportant des acides amins inhabituels. Diverses toxines restent incompltement caractrises. Elles accompagnent des prolifrations priodiques constates dans des lacs ou tangs partiellement eutrophiss, et ont des effets dommageables sur la faune piscicole. La cyanobactrine est un compos de nature aromatique qui s'avre toxique une dose de 5 M pour d'autres formes cyanobactriennes et permet Scytonema hofmanni de se maintenir malgr la concurrence d'espces plus performantes. La cyanobactrine agit comme un herbicide naturel sur le photosystme 2 et fait sentir ses effets sur les plantes vertes. Un taux de 1 M suffit inhiber la prolifration des lentilles d'eau (Lemna gibba) [52], pourtant rputes trs envahissantes sur les plans d'eau. Enfin l'espce coloniale Microcystis flos-aquae est une forme abondante dans les lacs d'eau douce alcalins o elle prolifre volontiers au sein d'une gangue muqueuse de polysaccharides forte teneur en acide galacturonique. Elle contribue ainsi former ce qu'on appelle les "fleurs d'eau". Cette gangue fortement anionique fixe facilement des ions mtalliques et se comporte comme un agent glifiant aux proprits qui rappellent les pectines des plantes [53]. Retenons donc les cyanobactries comme des colonisateurs agressifs, capables de lutter contre la concurrence en s'aidant de substances toxiques ou antibiotiques varies, et de vivre dans une multiplicit de milieux difficiles. Leur prsence dans l'environnement est donc bien loin d'tre neutre. La prolifration des cyanobactries conjointement celle des algues devient importante dans les milieux aquatiques eutrophiss par le dversement de matires organiques et de phosphate. Le croquis et le graphique reprsentent une coupe dans un milieu aquatique o s'tablit une stratification thermique entre les eaux plus chaudes en surface (en t) et une zone profonde plus dense et plus froide.
vgtaux
surface
10
20
cyanobactries thermocline bactries pourpres
3 bactries pourpres sulfureuses mthanogense boues

0 5 10
CH4
O2 ou H2S (mg/L)
profondeur
60
Un gradient de sparation en eau calme, la thermocline, spare aussi la partie la plus oxygne prs de la surface et la profondeur, plus ou moins anoxique et riche en sulfure prs du fond. Le graphique reprsente la temprature (1), l'oxygne dissous (2) et la teneur en H2S (3). La photosynthse non oxygnique se tient dans la zone la moins oxygne ou compltement anarobie sous la thermocline. Munies de vacuoles gaz qui leur permettent de monter et descendre dans l'eau la manire d'un ludion, les cyanobactries libres sont capables d'ajuster en mme temps la sensibilit spectrale et l'tendue de leurs pigments antennaires, de faon optimiser la captation de la lumire. Les cyanobactries ressemblent des chloroplastes isols. Leur appareil photosynthtique est log comme ceux-ci dans la paroi de sacs membranaires internes appels thylakodes. Le schma en "Z" de la photosynthse avec les deux photosystmes PS1 et PS2 ressemble celui des plantes vertes.
E'0 (mV) e
1000
P700*
A1 P680* e pheo PQA 2H+ PQB PQH2 b6f h H2O e
A2 NADPH 2H+ fdred Fe/S h pc c553 cyt. aa3 e P700
500
1/2 O2
500
PS1
1000
P680
PS2
b6f - cytochrome complexe de type bc1 Fd - ferrdoxine A1, A2, Fe/S - noyaux fer-soufre
Pheo - phophytine PQ - phylloquinones Pc - plastocyanine
PS1 et PS2 des cyanobactries

On note dans ce schma un dtail important qui est la prsence d'une vritable chane respiratoire dont le cytochrome complexe b6f fait partie. L'accepteur final est O2 par une cytochrome c oxydase. Le b6f, qui est en fait un complexe bc1, permet une rcupration d'nergie comme prcdemment chez les bactries pourpres et vertes. Les cyanobactries peuvent donc oxyder des substrats exognes sur l'oxygne sans utiliser la lumire. Les PS1 et PS2 des cyanobactries sont homologues sur le plan structural des photosystmes trouvs respectivement chez les bactries vertes et pourpres. La structure dtaille des centres de Synechococcus a t dtermine par cristallographie avec une rsolution de 2,5
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(PS1) [54] et de 3,8 (PS2) [55] L'avance considrable des connaissances sur la question devrait clairer la structure des PS des chloroplastes. Les centres ractionnels ont toujours deux sous-units fondamentales de structure hydrophobe avec une charpente d'hlices alpha traversant la membrane, et portant les cofacteurs essentiels comme nous l'avons vu chez les bactries. Autour de ces noyaux centraux sont disposes d'autres sous-units et l'ensemble est entour par les complexes antennaires. Les centres ractionnels PS1 sont organiss en trimres, comme sur la figure dans la partie a, o la membrane serait dans le plan de la page. Chacun des monomres a 12 sous-units, les plus importantes appeles PsaA, PsaB et PsaC autour desquelles gravitent 9 plus petites et 3 places au-dehors de la membrane. Les cofacteurs sont nombreux, soit 127 au total. Qu'on en juge : 96 chlorophylles a, 3 noyaux fer-soufre [4Fe-4S], 2 molcules de phylloquinone, 22 molcules de carotnode et 4 de lipides !
ct lumen
PsaB
sous-unit antennaire centre ractionnel organis en trimre B2 B3
A1
B1
PsaA
A2 A3
QKB FX ct stroma FB
Q KA
PsaC
FA
b
PS1 de Synechocystis
Parmi les molcules de chlorophylle a, six sont loges dans les sous-units principales PsaA et PsaB, et leur disposition relative est reprsente dans la partie b de la figure. Les lettres A et B font rfrence sous-unit qui les lie, notamment par leur magnsium. Le dimre essentiel de chlorophylle o se fait la sparation de charges est A1B1 et reprsente le P700. Sont prsentes galement les deux molcules de phylloquinone (QKA, QKB), un centre fer-soufre cheval sur les deux parties et deux autres, FA et FB, localiss dans la sous-unit PsaC faisant saillie dans le stroma. La structure est hautement conserve dans l'volution jusqu'aux plantes, notamment les acides amins qui coordonnent le magnsium des molcules de chlorophylle. Il y a donc deux branches par lesquelles peuvent s'effectuer les transferts d'lectron. Par suite de la petite dissymtrie entre PsaA et PsaB, les deux voies ne fonctionnent probablement pas avec la mme frquence.
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Les excitons achemins par les pigments antennaires arriveraient prfrentiellement du ct PsaB. Le P700 est recharg du ct lumen (en haut de la figure), donc sur la face externe par rapport au cytoplasme. Les lectrons sont mis de l'autre ct par PsaC (en passant par Fx) et pris en charge par une ferrdoxine. Cet difice molculaire est extraordinaire. Les sous-units PsaA et PsaB portent en plus des 6 molecules A et B, un total de 79 molcules de chlorophylle a, dont la plupart, non reprsentes, font office de pigments antennaires. Restent 11 sur les 96, attaches aux petites sous-units priphriques. Le PS1 fonctionne donc comme une unit intgre, recevant l'nergie lumineuse par sa chlorophylle et son carotne, mettant un un dans le stroma des lectrons trs bas potentiel, et recharg du ct lumen par la plastocyanine, une petite protine contenant du cuivre, et le cytochrome c6. Le PS2 est la seconde pice de l'appareil photosynthtique des cyanobactries. Sa double originalit et d'tre muni d'un dispositif manganse permettant la photolyse de l'eau, et de complexes antennaires spciaux o l'on trouve la chlorophylle a, des carotnodes, et surtout des phycobilisomes. Ces derniers renferment des pigments particuliers appels phycobilines. Les carotnodes ont comme ailleurs un double rle de rcepteur et de protecteur contre la formation d'oxygne singulet. Ils sont gnralement difficiles localiser dans les structures dduites de la diffraction des rayons X, car ils sont souvent trop mobiles pour occuper une place rigoureusement constante d'un PS2 un autre. Le PS2 ne renferme pas moins de 17 sous-units dont 14 sont dans la membrane du thylakode. L encore, le centre ractionnel renferme deux sous-units majeures porteuses des cofacteurs essentiels, dsignes par D1 (PsbA) et D2 (PsbD), selon un arrangement "pseudo-symtrique". Ces deux protines sont homologues l'une de l'autre par la squence et la structure, et il est visible que les gnes psbA et psbD drivent d'une duplication ancestrale, qui a d conduire un avantage slectif puisqu'on retrouve ce caractre dans tous les centres ractionnels que nous avons rencontrs l'exclusion de celui des bactries sulfureuses vertes (o l'arrangement est symtrique). Il faut donc s'attendre trouver l encore deux voies possibles pour le transfert des lectrons un un l'intrieur du centre, l'une tant privilgie par rapport l'autre. Il est vraisemblable que ces deux voies correspondent une possibilit d'adaptation en fonction des conditions, par exemple un effet rgulateur ou amortisseur permettant le transfert des lectrons sans -coups. Le schma s'inspire d'un article de RUTHERFORD et FALLER [56] et reprsente le cur du PS2, constitu par les polypeptides fondamentaux D1 et D2, leurs cofacteurs et quelques pices annexes. Le PS2 est homologue du photosystme des bactries pourpres mais en plus compliqu. Une pice essentielle est le noyau manganse qui contient 4 ions Mn2+ capables de s'oxyder en Mn3+. L'ensemble peut donc acheminer successivement 4 lectrons par une chelle de transferts radicalaires, catalysant la photolyse de l'eau : 2 H2O O2 + 4 H+ + 4 e. Ces lectrons transitent jusqu'au P680 par l'intermdiaire d'une position radicalaire essentielle porte par TyrZ. Chaque lectron mis par le 680 aprs sparation de charge voyage par une phophytine vers QA puis QB, qui oscille entre l'tat QB, et l'tat radicalaire QB.Chaque fois que
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cette plastoquinone "mobile" QB a reu un lectron deux fois de suite, elle est transforme avec l'apport de deux protons en QBH2, abandonne le PS2, et une nouvelle molcule de QB la remplace. La plastoquinone est donc le point de sortie des lectrons provenant de l'eau. Le PS2 est bord par des sous-units internes fonction antennaire, dsignes par CP43 et CP47, contenant respectivement 12 et 14 molcules de chlorophylle a, organises en 2 couches parallles au plan de la membrane. Dans cet environnement complexe s'observent deux molcules de chlorophylle particulires, notes sur le schma par ChlZD1 et ChlZD2. Leur fonction est peut-tre d'acheminer les excitons partir des pigments antennaires vers le P68O, mais cela ne reste qu'une hypothse.
QA Fe QB b559 Pheo membrane ChlZD1 Chl D1 site tyrosine essentiel noyau manganse PsbO TyrZ (Mn)4 Pheo Chl D2 ChlZD2
P680
D2 D1
c550
H2 O
O2 + 4
H+
PS2 de Sybecchoccus elongatus

La forte originalit de l'antenne de PS2 est la prsence des phycobilines, des ttrapyrroles apparents aux porphyrines, mais non referms en couronne comme ces dernires. Les phycobilines sont rattaches des protines porteuses par une ou deux liaisons covalentes sur fonction thiol. Les protines sont les phycobiliprotines et les pigments leur sont lis par des segments de squence que l'volution a conservs. La plupart des cyanobactries en ont au moins trois, caractrises par leur maximum d'absorption. Les voici en ordre d'abondance dcroissante : des phycocyanines ou PC (620 nm), proches des phytochromes vgtaux, l'allophycocyanine ou APC (650 nm), et l'allophycocyanine B ou APCB (670 nm). De nombreuses espces ont en outre de la phycorythrocyanine ou PE (568 nm) et des phycorythrines B et R (546 et 565 nm). Voici deux exemples de ces pigments reprsents attachs leur protine par un ou deux ponts thiother 26. 26 - Le lien s'tablit chimiquement par une raction d'addition du thiol sur une chane latrale vinylique -CH=CH2. Une disposition semblable existe aussi dans les cytochromes c entre porphyrine et protine.
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protine HOOC H3C H3C H O H N H N H N H N H S H O H 3C H O COOH H3C
protine HOOC S H H N H N H N H H N H O COOH H3C S H
phycocyanobiline
phycorythrobiline
Exemples de phycobilines
Les phycobiliprotines absorbent donc diffrentes longueurs d'onde et sont loges dans des complexes antennaires spciaux associs au PS2 et appels phycobilisomes. Leur nom et les bilines associes sont indiqus en glossaire. L'organisation des phycobilisomes obit un plan caractristique. Les principales protines porteuses de phycobilines (1, 2 ou 3 molcules par peptide, attaches par pont thiother) correspondent deux catgories de sous-units et . Ces protines sont groupes en trimres de composition ()3 formant un anneau muni d'un trou central d'un diamtre d'environ 100 . Deux anneaux ()3 superposs en ()6 s'emmanchent sur une sous-unit spciale dpourvue de pigment et appele "linker " (L). L'unit lmentaire ainsi forme a donc pour formule ()6L . Les phycobilisomes portent ainsi sur un noyau central des btonnets dirigs en ventail (il y en a habituellement 6), constitus par des chanes d'units ()6L.
phycobilisome L ()3 phycorythrine phycocyanine
()6L
noyau du phycobilisome
stroma membrane du thylakode lumen 2 H2O O2 PS1 PS2 Mn PS1
Appareil photosynthtique des cyanobactries

Le noyau central a une composition spciale. Il est constitu d'un trimre d'allophycocyanine, absorbant dans le rouge lointain du spectre, li un linker particulier de masse molculaire leve et dsign dans la littrature par LCM. L'nergie capte par les btonnets est canalise vers le noyau qui la transmet directement au PS2. Ce dispositif est extraordinaire, car le dveloppement et la composition en pigments des phycobilisomes est tributaire des conditions
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physiologiques. Les phycobilisomes rgressent en cas de carence nutritionnelle (les pigments servent de rserve azote et sont recycls). Ils rgressent galement en lumire vive, qui a pour effet de provoquer un fort abaissement du potentiel redox interne. De nombreuses espces de cyanobactries vivant en milieu aquatique, comme les Anabaena, sont dcolores sous un clairement fort. La composition des btonnets en phycobilines varie en fonction de la qualit spectrale de la lumire. C'est le phnomne le plus intressant, appel adaptation chromatique. Les units les plus proches du noyau contiennent essentiellement de la phycocyanine dont le maximum d'absorption est dans le rouge. Les zones priphriques ont comme constituant principal une phycorythrine, dont l'absorption est dans le vert. L'adaptation joue sur le dveloppement de la phycorythrine par rapport la phycocyanine. La premire prend le pas sur la seconde en lumire verte. C'est l'inverse en lumire rouge.
PE lumire verte (500 560 nm)
lumire rouge (650 700 nm) PC PE PC
Adaptation chromatique
Les cyanobactries sont donc capables de se dvelopper la lumire verte tamise des milieux aquatiques quand l'clairement de surface est en partie intercept par des vgtaux verts. Cette partie du spectre est celle o la chlorophylle est la moins efficace. Il y a un autre aspect, avec l'action conjointe de la turbidit du milieu et de la profondeur de l'eau. Un milieu trouble devient de plus en plus opaque au fur et mesure que la longueur d'onde de la lumire diminue. Le rouge passe donc mieux que le bleu. Inversement les radiations rouges sont plus fortement absorbes par l'eau que les courtes longueurs d'onde. Consquence : la lumire verte est un moyen terme, une eau profonde et trouble est claire en vert. Les cyanobactries ont donc la possibilit de moduler la composition de leurs phycobilisomes en fonction de la qualit de l'clairement [57].
chl.a + carot. PE PC AP
absorbance relative
absorbance
PC
PE en lumire verte en lumire rouge
400
500
600
700 (nm)
400
500
600
700
(nm)
Absorbance de F. diplosiphon en suspension
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Le graphique montre en a les zones d'absorption des diffrents pigments : la chlorophylle a et les carotnodes, la phycorythrine (PE), la phycoyanine (PC) et l'allophycocyanine (AP). En b, changement d'absorbance des cellules en suspension selon la couleur de la lumire incidente. La puissance d'adaptation des cyanobactries est donc remarquable et les rend comptitives dans nombre de niches cologiques. Leur facult de se dvelopper dans des milieux hostiles en font des acteurs importants dans les grands cycles naturels.
CONCLUSION
Ce chapitre nous a fait passer en revue les principales recettes utilises par les micro-organismes bactriens pour se procurer l'nergie dont ils ont besoin pour se dvelopper. Sans cela bien des biodgradations ne pourraient avoir lieu. Les modes utiliss sont probablement trs anciens et se sont perptus dans l'volution en conservant la fois les mcanismes de base et la structure de maints composants. Ces mcanismes sont extraordinaires par leurs performances. Ils se montrent souvent adaptables toute sorte de conditions. Les formidables ressources en nergie apportes par les oxydorductions et la lumire vont actionner les transformations et biodgradations varies que nous examinerons dans les chapitres suivants.
RFRENCES
[1] S C H I N K B (1997) Microbiol. Mol. Biol. 61 : 262-280. [2] D I M R O T H P (1982) Eur. J. Biochem. 121 : 443-449 ; H I L P E R T W & D I M R O T H P (1984) Eur. J. Biochem. 138 : 579-583 ; H I L P E R T W & D I M R O T H P (1991) Eur. J. Biochem. 195 : 79-86. [3] B U C K E L W (2001) Biochim. Biophys. Acta 1505 : 15-27. [4] G A R C I A G E & S T A D T M A N TC (1992) J. Bacteriol. 174 : 7080-7089 ; G R A E N T Z D O E R F F E R A, P I C H A & A N D R E E S E N JR (2001) Arch. Microbiol. 175 : 8-18. [5] S T A D T M A N TC & D A V I S JN (1991) J. Biol. Chem. 266 : 22147-22153. [6] D U N C A N TM, B U L Y G I N VV, Z H O U Y , H U T C H E O N ML & C R O S S RL (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 10964-10968. [7] B O Y E R PD , C R O S S RL & M O M S E N W (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 70 : 2837-2839. [8] I K O Y , S A M B O N G I Y , T A N A B E M, I W A M O T O - K I H A R A A, S A I T O K, U E D A I, W A D A Y & F U T A I M (2001) J. Biol. Chem. 276 : 47508-47511. [9] N O J I H , Y A S U D A R, Y O S H I D A M & K I N O S I T A K (1997) Nature 386 : 299-302. [10] G I R V I N ME, R A S T O G I VK, A B I L D G A A R D F, M A R K L E Y JL & F I L L I N G H A M E RH (1998) Biochemistry 37 : 8817-8824. [11] R A S T O G I VK & G I R V I N ME (1999) Nature 402 : 263-268.
1 LA COLLECTE DE L'NERGIE [12] D E L R I Z Z O PA, B I Y , D U N N S D & S H I L T O N BH (2002) Biochemistry 41 : 6875-6884. [13] P U U S T I N E N A & W I K S T R M M (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88 : 6122-6126 ; M O G I T, S A I K I K & A N R A K U Y (1994) Molec. Microbiol. 14 : 391-398. [14] T A K A N O T & D I C K E R S O N RE (1981) J. Mol. Biol. 153 : 79-84 et 95-115. [15] N A R H , M E S S E R S C H M I D T A, H U B E R R, V A N D E K A M P M & C A N T E R S G W (1991) J. Mol. Biol. 221 : 765-772 ; W I L L I A M S RJP (1995) Eur. J. Biochem. 234 : 363-381. [16] P A G E MD , S A M B O N G I Y & F E R G U S O N S J (1998) Trends Biochem.Sci. 23 : 103-108. [17] K R A N Z R, L I L L R, G O L D M A N B, B O N N A R D G & M E R C H A N T S (1998) Molec. Microbiol. 29 : 383-396. [18] I W A T A S , L E E JW , O K A D A K, L E E JK & I W A T A M (1998) Science 281 : 64-71 ; K I M H , X I A D , Y U C - A , X I A J- Z , Z H A N G L, Y U L & D E I S E N H O F E R J (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 8026-8033 ; H U N T E C , K O E P E J, L A N G E C , R O S S M A N I S H T & M I C H E L H (2000) Structure with Folding & Design 8 : 669-684. [19] M I T C H E L L P (1976) J. Theor. Biol. 62 : 327-367. [20] S N Y D E R C H & T R U M P O W E R BL (1999) J. Biol. Chem. 274 : 31209-31216 ; S N Y D E R C H , G U T I E R R E Z - C I L L O S EB & T R U M P O W E R BL (2000) J. Biol. Chem. 275 : 13535-13541. [21] M A R S U N O - Y A G I A & H A T E F I Y (1999) J. Biol. Chem. 274 : 9283-9288 ; M A R S U N O - Y A G I A & H A T E F I Y (2001) J. Biol. Chem. 276 : 19006-19011. [22] D A R R O U Z E T E, M O S E R C C , D U T T O N L & D A L D A L F (2001) Trends Biochem. Sci. 26 : 445-451. [23] O S T E R M E I E R C , H A R R E N G A A, E R M L E R U & M I C H E L H (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 10547-10553 ; T O M I Z A K I T & 8 auteurs (1999) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 55 : 31-45 ; F E I MJ, Y A M A S H I T A E, I N O U E N, Y A O M, Y A M A G U C H I H , T S U K I H A R A T, S H I N Z A W A - I T O H K, N A K A S H I M A R & Y O S H I K A W A S (2000) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 56 : 529-535. [24] W I K S T R M M (1977) Nature 266 : 271-273. [25] B A B C O C K G T & W I K S T R O M M (1992) Nature 356 : 301-309. [26] M I C H E L H (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 12819-12824. [27] K A N N T A, L A N C A S T E R C RD & M I C H E L H (1998) Biophys. J. 74 : 708-721. [28] K O B A Y A S H I K, T A G A W A S & M O G I T (1999) Biochemistry 38 : 5913-5917. [29] M A T S U S H I K A A & M I Z U N O T (1998) J. Bacteriol. 180 : 3973-3977. [30] O T T E N MP, V A N D E R O O S T J, R E I J N D E R S W NM , W E S T E R H O F F H V, L U D W I G B & V A N S P A N N I N G RJM (2001) J. Bacteriol. 183 : 7017-7026. [31] O T T E N MP, R E I J N D E R S W NM , B E D A U X JJ, W E S T E R H O F F H V, K R A B K, L U D W I G B & V A N S P A N N I N G RJM (1999) Eur. J. Biochem. 261 : 767-774. [32] G E S T H & F A V I N G E R JL (1983) Arch. Microbiol. 136 : 11-16. [33] K O L B E R ZS , V A N D O V E R C L, N I E D E R M A N RA & F A L K O W S K I PG (2000) Nature 407 : 177-179. [34] Y U R K O V VV & B E A T T Y JT (1998) Microbiol. Mol. Rev. 62 : 695-724. [35] E R M L E R U, F R I T Z S C H G , B U C H A N A N S K & M I C H E L H (1994) Structure 2 : 925-936 ; D E I S E N H O F E R JO , E P P K, M I K I R, H U B E R R & M I C H E L H ( 1985) Nature 318 : 618- 62 4.
67
68 [36] Z U B E R H (1985) Photochem. Photobiol. 42 : 821-825.
[37] M C D E R M O T T G , P R I N C E S M, F R E E R AM, H A W T H O R N E T R H W A I T E - L A W L E S S AM, P A P I Z AZ, C G D E L L RJ & I S A A C S NW (1995) Nature 374 : 517-521. [38] R E I D L H & coll. (1983) Biochim. Biophys. Acta 725 : 455-463 ; Biochim. Biophys. Acta 808 : 328-333. [39] V A S S I L I E V A RV, S T I R E W A L T VM, J A K O B S C U, F R I G A A R D NU, I N O U E - S A K A M O T O K, B A K E R MA, S O T A K A & B R Y A N T D A (2002) Biochemistry 41 : 4358-4370. [40] Z H O U W , L O B R U T T O R, L I N S & B L A N K E N S H I P RE (1994) Photosynth. Res. 41 : 89-96. [41] F R I G A A R D NU, V O I G T G D & B R Y A N T D A (2002) J. Bacteriol. 184 : 3368-3376. [42] H A U S K A G , S C H O E D L T, R E M I G Y H & T S I O T I S G (2001) Biochim. Biophys. Acta 1507 : 260-277. [43] K A N E K O T, N A K A M U R A Y & 20 auteurs (2001) DNA Res. 8 : 205-213, 227-253. [44] M E E K S JC & coll. (2001) Photosynthesis Res. 70 : 85-106. [45] F E N I C A L W (1982) Science 215 : 923-928. [46] R I C H A R D S O N & C A S T E N H O L Z (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53 : 2151-2158. [47] M U R LR (1983) Annales Microbiol. (Paris) 134B : 61-72 ; P O S T AF & c ol l . (1985) FEMS Microbiol. Ecol. 31 : 97-102. [48] W O L K C P & S H A F F E R PW (1976) Arch. Microbiol. 110 : 123-127. [49] U D V A R D Y J & coll. (1984) J. Bacteriol. 157 : 681-683. [50] T H O R N PM & coll. (1991) Chem. Res. Toxicol. 4 : 535-540 ; [51] A N N I L A A, L E H T I M K I J, M A T T I L A K, E R I K S S O N JE, S I V O N E N K, R A N T A L TT & D R A K E N B E R G T (1996) J. Biol. Chem. 271 : 16697-16702. [52] G L E A S O N FK & B A X A C A (1986) FEMS Microbiol. Lett. 33 : 85-88 ; G L E A S O N FK & C A S E D E (1986) Plant. Physiol. 80 : 834-838. [53] P L U D E JL & coll. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 1696-1700. [54] J O R D A N P, F R O M M E P, W I T T H T, K L U K A S O , S A E N G E R W & K R A U B N (2001) Nature 411 : 909-917. [55] Z O U N I A, W I T T H - T , K E R N J, F R O M M E P, K R A U S S N, S A E N G E R W & O T H P (2001) Nature 409 : 739-743. [56] R U T H E R F O R D AW & F A L L E R P (2001) Trends Biochem. Sci. 26 : 341-344. [57] T A N D E A U D E M A R S A C N & H O U M A R D J (1993) FEMS Microbiol. Rev. 104 : 119-190.
CHAPITRE 2 GNOMES - ADAPTATIONS - COMMUNICATIONS

S'adapter : c'est l'impratif essentiel de la survie dans la comptition infernale de l'environnement, o celui qui gagne est gnralement celui qui va vite, ou sait faire ce que d'autres ne font pas. Pour cela il faut acqurir la bonne information gntique. Il faut aussi disposer d'un arsenal performant de protines, se prmunir contre les agressions, rparer, se dbarrasser des outils inutiles. Enfin il est profitable de s'installer aux endroits les plus favorables. La cartographie complte du gnome d'un nombre grandissant de micro-organismes permet de se faire une ide prcise de leur organisation gntique et de comprendre comment une population microbienne peut s'adapter rapidement par des transferts de gnes de cellule cellule, modifier son patrimoine par des transposons et intgrons. Contrairement aux apparences, une cellule bactrienne n'est pas livre elle-mme, mais construit avec d'autres de vritables cits qui sont les biofilms, o sa physiologie est modifie. En outre les bactries s'informent mutuellement de conditions particulires par des changes de signaux chimiques. 2.1 - La gnomique des micro-organismes 2.2 - Protomique et complexes multi-protiques 2.3 - Transferts gntiques horizontaux 2.4 - Plasmides 2.5 - Squences d'insertion - Transposition 2.6 - Les transposons simples et composites 2.7 - Intgrons et cassettes 2.8 - La biologie particulire des biofilms 2.9 - Communication et bioluminescence 71 80 84 90 95 99 107 115 119
2 GNOMES - ADAPTATIONS - COMMUNICATIONS

S'adapter : c'est l'impratif essentiel de la survie dans la comptition infernale de l'environnement, o celui qui gagne est gnralement celui qui va vite, ou sait faire ce que d'autres ne font pas. Pour cela il faut acqurir la bonne information gntique. Il faut aussi disposer d'un arsenal performant de protines, se prmunir contre les agressions, rparer, se dbarrasser des outils inutiles. Enfin il est profitable de se dplacer vers les endroits les plus favorables.
2.1 - LA GNOMIQUE DES MICRO-ORGANISMES

Depuis quelques annes, un nombre grandissant d'espces vivantes ont vu leur gnome complet squenc, des bactries l'homme, en passant par la levure, des plantes et des invertbrs. Une rvolution dans l'analyse gntique, une meilleure comprhension des rgulations mtaboliques et du dveloppement, et pour divers procaryotes pathognes, la nature du pouvoir infectieux. l'origine d'une somme colossale de donnes obtenues sont des associations de nombreux laboratoires dans le monde. Parmi les outils de base essentiels figurent les nuclases de restriction, la constitution de banques gnomiques, l'amplification par PCR, le perfectionnement des techniques d'lectrophorse et le renfort capital de l'informatique. Ces progrs sont mettre en parallle avec ceux de l'analyse structurale des protines par cristallographie, RMN et maintenant spectromtrie de masse. Quelques ralisations techniques de base ont dclench la plus grande perce des connaissances de tous les temps sur les mcanismes vitaux de base. Le but n'est pas ici d'en retracer le droulement, mais de comprendre comment les micro-organismes ont pu voluer de faon s'adapter aux contingences du milieu, en particulier pour s'accommoder des diffrentes ressources nergtiques et nutritives qui lui sont offertes, soit partir des constituants naturels, soit l'aide des produits rpandus artificiellement par l'activit humaine. La taille des gnomes varie normment des animaux aux plantes et aux microorganismes. Le gnome d'un animal aussi rudimentaire qu'un nmatode (Caenorhabditis elegans) fait plus de 100 millions de pdb avec 16384 gnes, et le gnome de la petite plante Arabidopsis thaliana est du mme ordre de grandeur, alors qu'il atteint 170 millions pour la Drosophile. Du ct des champignons, Aspergillus niger et Neurospora crassa ont des gnomes de 31 et 47 millions de pdb respectivement.
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Le gnome des bactries est d'ordinaire plus petit, car son importance s'chelonne de 0,5 prs de 6 millions de pdb. La recherche s'est attaque en priorit des souches pathognes, dont certaines ont un gnome assez court, le plus simple tant celui du Mycoplasma genitalium long de 580 kb seulement. Il s'agit de comprendre comment des organismes parfois trouvs dans l'environnement banal peuvent devenir de redoutables agents infectieux. On cherche aussi savoir par quels mcanismes les germes de l'environnement ont pu voluer, et acqurir parfois de formidables potentialits dans le domaine des biodgradations. Les donnes permettent de voir qu'il y a plusieurs chemins possibles. Le tableau est une srie d'exemples donnant la longueur du gnome, et le nombre de gnes dtects chez la levure, une cyanobactrie, des bactries Gram-positives (G+) et ngatives (G). Gnome
Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharom. pombe Anabaena PCC 7720 Pseudomonas aeruginosa Ralstonia solanacearum Escherichia coli Bacillus subtilis Caulobacter crescentus Synechocystis PCC 6803 Lactococcus lactis Neisseria meningitidis Thermotoga maritima Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae M. thermoautotrophicum 1 Treponema pallidum Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium
pdb
Gnes
Observations
Eucaryote, levure de bire, bourgeonnante Eucaryote, levure fissipare Cyanobactrie, avec 6 plasmides, de 5 408 kb G, ubiquiste, pathogne opportuniste G, en 2 parties, chromosome et grand mgaplasmide G, entrobactrie, quelquefois pathogne G+, protines scrtes, mtabolisme secondaire, abondant G, cycle entre stade fix et stade libre Cyanobactrie, avec plusieurs plasmides G+, lactobactrie, fermentation aro-tolrante du lait G, un agent pathogne de la mningite Thermophile primitif proche des archaebactries G+, pathogne, plus de 40 gnes de virulence G, pathogne occasionnel, transformable Archaebactrie mthanogne thermophile G, spirochte agent de la syphillis G agent du trachome, proche des rickettsies G, rpandus, parasites intracellulaires, sans paroi
14 213 386 6231 12 462 637 4929 6 413 771 6 264 403 5 810 922 4 639 221 4 214 810 4 016 942 3 573 470 2 365 589 2 272 231 1 860 725 1 852 442 1 830 137 1 751 377 1 138 006 1 042 519 580 070 5400 5570 5129 4288 4100 3767 3168 2310 1158 1877 1752 1703 1855 1041 894 470
Comment dnombrer les gnes dans la squence ? La dmarche procde de l'identification des ORFs*. En principe chaque ORF reprsente une protine ou une des
1 - Methanobacterium autotrophicum.
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sous-units d'une protine si celle-ci a une structure quaternaire dote de polypeptides diffrents. La totalit de ces ORF ne reprsente pas toute la longueur du gnome, car il existe des sections non transcrites. Ce sont des promoteurs, ou des squences codant pour des fonctions rgulatrices sur l'expression des autres parties, ou encore des squences codant pour des ARNr et des ARNt. Pseudomonas aeruginosa possde un gnome relativement volumineux, et la rpartition des ORF rpond un diagramme qui rsume quelques interprtations [1] :
A - gnes dont la fonction est dmontre
B - gnes homologues de gnes dont on connat la fonction dans dautres organismes C - gnes dont la fonction relle est rendue probable par des homologies limites
D - gnes homologues dautres gnes dont on ignore la fonction E - gnes sans homologies trouves dans les bases de donnes, fonction inconnue
Affectation des gnes chez Pseudomonas aeruginosa

On voit que l'affectation des gnes reconnus dans la squence n'est dtermine que pour un quart des ORF, dont moins de 7% avec certitude (par mutations, comparaison avec la squence d'acides amins de la protine, etc.). La proportion des gnes auxquels on peut attribuer une fonction est de 54%. Comme d'autres espces classes dans le groupe des Pseudomonas, ce germe bactrien a un pouvoir d'adaptation exceptionnel. Il habite les sols, marais et milieux littoraux, peut dgrader une foule de composs (phnols, hydrocarbures, halodrivs), rsiste un srie d'antibiotiques et de dsinfectants, se dveloppe sur les plantes, forme volontiers des biofilms (section 8), et se comporte comme un pathogne opportuniste tous azimuts, en particulier pour l'homme o il est responsable d'infections graves chez les blesss et en milieu hospitalier. Un trs gros palmars ! Le mtabolisme cellulaire de base met en jeu environ 750 gnes, dont 119 pour fabriquer des cofacteurs et transporteurs. Le plus remarquable est l'importance du matriel gntique consacr aux protines rgulatrices, soit 403 gnes reconnus. Cette valeur leve accompagne logiquement le grand pouvoir d'adaptation des conditions varies. cela s'ajoutent les systmes de rgulation deux composants* qui sont actionns par 118 gnes supplmentaires. l'autre extrmit de l'chelle, les gnomes les plus simples, comme ceux des mycoplasmes, accompagnent des espces parasites, qui n'ont pas besoin d'une chimie de synthse aussi complique puisque la plupart des lments sont soutirs de la cellule hte [2]. Comment les espces ont-elles pu voluer pour s'adapter un changement de milieu ? On possde des lments de rponse en ce qui concerne les bactries grce aux donnes de la gnomique. Des bactries grand pouvoir d'adaptation comme les Pseudomonas et le colibacille ont de nombreux gnes concernant des fonctions rgulatrices, des mcanismes de rparation et de recombinaison, ainsi
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que de nombreux facteurs anti-stress. Les mutations elles-mmes sont rgules. Une trs longue slection s'exerce au sein des populations pour faire merger peu peu les lignes les mieux adaptes alors que l'environnement est trs riche en antibiotiques 2 et en substances organiques de dfense d'origine vgtale. Les bactries s'adaptent par slection, par rgulations pousses, parfois par une certaine redondance dans leur arsenal enzymatique. Un intrt considrable est soulev par l'tude des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles. Ce sont gnralement des archaebactries et des formes bactriennes primitives qui ont conserv un souvenir de leur parent avec les archaebactries. Les thermophiles n'ont pas qu'un intrt purement acadmique, car on recherche des enzymes thermostables et des espces pouvant faire des biodgradations temprature leve. Un thermophile clbre est Thermus aquaticus, qui a permis la mise au point de dpart de la mthode PCR. Thermotoga maritima et un Aquifex aeolicus sont des habitants des sources chaudes et sont connus comme des reprsentants particulirement primitifs du groupe des bactries sur la base de leur ARN 16S. Leurs gnomes ont t squencs et rvlent une parent avec les archaebactries. Les gnomes archaebactriens dj squencs sont l'objet d'une grande curiosit car on peut y dceler des ressemblances avec les autres grandes divisions du monde vivant. Les archaebactries constituent un vaste groupe qui a buissonn normment au cours de l'volution. Prs de la moiti des gnes ont une ressemblance de squence avec ceux des protobactries, et 10-15% ont manifestement des affinits avec des gnes de type eucaryote. Dans le premier cas, les analogies se trouvent principalement dans les gnes de la synthse de cofacteurs et de petites molcules, d'enzymes du mtabolisme intermdiaire, de transporteurs, de protines rgulatrices et des enzymes de fixation de l'azote. Dans le second cas, les ressemblances concernent le mtabolisme de l'ADN, la cription et la traduction sur les ribosomes, sans oublier des ATPases. Ces indices ont fait supposer que les premires cellules d'eucaryotes taient des organismes anctres des archaebactries actuelles. Elles auraient acquis secondairement par endosymbiose les organismes prcurseurs des mitochondries et des plastes. L'acquisition en bloc de gnes trangers est la voie d'adaptation des gens presss. Il s'agit d'acqurir d'un seul coup une information gntique extrieure par ce qu'on appel un transfert horizontal, autorisant une adaptation prcipite sans attendre le hasard des mutations. Les acquisitions peuvent tre compenses par des liminations, qui font que le gnome n'augmentera pas ncessairement dans des proportions dmesures. Les bactries ont trois modes d'acquisition de ce type : une transformation, un change de plasmide, une infection virale. Le ct remarquable de l'accumulation des squences gnomiques est de permettre la dtection des traces laisses par les diffrents apports, parfois anciens, tel point qu'on a pu parler d'une "archologie" du gnome. Elle se fonde sur l'examen de la composition en bases, l'usage des codons, la prsence de squences homologues avec d'autres espces, des squences d'insertion, des traces de prophages
2 - Les antibiotiques utiliss en thrapeutique ne reprsentent qu'un pourcentage trs faible parmi ceux qui ont t dcouverts.
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Nous en citerons des exemples. Ces phnomnes sont particulirement frquents chez les pathognes, mais existent aussi chez les bactries capables de faire des biodgradations. L'apport de voies mtaboliques entires n'y est sans doute pas exceptionnel. Peut-on reproduire artificiellement l'volution au sein d'une mme espce ? Le problme pourrait paratre a priori saugrenu, car l'volution est un processus extrmement lent. Pourtant les bactries offrent un terrain d'tude favorable cause de la brivet de leur temps de gnration. Une constatation remarquable a t faite. Elles savent grer le taux des changements dans leur patrimoine gntique. Le choix exprimental s'est port sur Escherichia coli, car c'est l'espce dont on connat le mieux la physiologie et la gntique. Elle a cependant l'inconvnient d'tre relativement spcialise, et on peut craindre que les donnes ne soient pas automatiquement gnralisables aux autres espces. Le principe exprimental de dpart est trs simple. Une souche de E. coli gntiquement homogne et asexue (un clone) est cultive sur un milieu dfini aussi simple que possible : du glucose dans un mlange salin. Les bactries sont cultives en milieu liquide et repiques priodiquement en diluant chaque fois un chantillon de la culture dans du milieu frais, et ainsi de suite des milliers de fois. L'exprience a t faite sur plusieurs annes et sur 12 lignes diffrentes. Plus de 20.000 gnrations ont ainsi t obtenues. Comme les bactries ont eu l'occasion de se multiplier abondamment avant chaque transfert, c'est en fait un trs grand nombre de divisions qu'elles ont subi. Des chantillons sont examins pour la drive de leurs proprits et les changements de leur appareil gntique. Une faon d'observer l'volution en chambre et en raccourci. La difficult de cette exprimentation vient de la mthode de mesure. Beaucoup de mutations ponctuelles sont "silencieuses", c'est--dire qu'elles n'amnent aucun changement phnotypique et ne seraient dtectables que par un squenage prohibitif. L'absence d'effet immdiat d'une mutation peut survenir deux niveaux. Le premier est le passage d'un triplet de bases ou codon un autre de mme signification, par exemple le changement de CUG en CUA, ces deux codons tant pour la leucine. Le plus souvent les mutations de ce type portent sur la troisime base d'un triplet pour donner un synonyme. Le deuxime niveau est plus complexe, car il concerne l'activit biologique et la stabilit du polypeptide form. Certains remplacements d'un acide amin par un autre dans une protine restent neutres. D'autres entranent un changement de proprits ou mme l'inactivation du produit. Il existe bien entendu d'autres types de mutations*, et les changements ont d'autant plus de chance de crer des perturbations immdiates dans la descendance, voire tre ltales, qu'ils sont plus importants ou concernent des zones sensibles. Dans une ligne bactrienne ne recevant aucune information de l'extrieur (ni virus, ni transformations, ni plasmides), on peut mesurer l'accumulation des mutations par la disparition de certaines voies mtaboliques. La mthode de COOPER et LENSKI consiste analyser le pouvoir du colibacille crotre sur diffrentes sources carbones au cours de son volution [3], les tests tant faits
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sur des galeries Biolog 3. Au fil des nombreux transferts, les lignes tudies cultives sur glucose perdent peu peu toute une srie de proprits. Cette dgradation apparente s'accompagne-t-elle d'une perte de comptitivit ? Pas forcment. Une amlioration des performances par rapport la souche mre semble se dessiner. Les deux schmas simplifis symbolisent l'volution d'une population dans deux cas extrmes. Les segments reprsentent les sous-populations au cours du temps. Chaque embranchement est une mutation. En a, la pression slective est faible ou inexistante, la dpart population se diversifie en rameaux buissona b nants. En b, une pression slective s'exerce chaque mutation et donne la prpondrance une ligne. Au cours de chaque volution, des rameaux viennent extinction face la concurrence exerce au sein des populations. En b l'arbre volutif passe par plusieurs goulots d'tranglement, figurs par les cercles aux embranchements. Les populations finales observes drivent d'une srie d'anctres successifs communs. Il va sans dire que l'volution au sein du rgne animal et chez les eucaryotes en gnral pose des problmes sans commune mesure avec celle d'une population bactrienne de laboratoire. Les changes sexuels, changements du milieu, pidmies et migrations apportent autant de facteurs supplmentaires. Une conclusion intressante faite la suite des cultures long terme du colibacille est l'influence bnfique que peut avoir l'abandon de certaines voies mtaboliques. Cette disparition intervient tt dans ces expriences et s'accompagne d'un rythme acclr des mutations. En somme les bactries, quand elles se dbarrassent des voies inutiles, ne s'en portent que mieux aprs avoir trouv par chance les bons numros. O les mutations se produisent-elles et quand ? Une autre voie d'approche utilisant aussi les nombreuses gnrations successives du colibacille consiste fragmenter le gnome par des nuclases de restriction. Dans le chromosome de E. coli sont disperses des squences spciales en exemplaires multiples (1-10 et davantage) appeles squences d'insertion ou IS, examines plus loin dans ce chapitre. Ces IS servent ici de marqueurs [4]. Quand le gnome a t dcoup en fragments par une nuclase de restriction qui les laisse toutes intactes, on peut reprer les morceaux porteurs de ces IS. Le reprage se fait par hybridation par une sonde spcifique pour chaque IS. Par exemple la prsence dans la population des morceaux contenant une squence IS3 sera identifie aprs dnaturation 4, lectrophorse et rcupration sur filtre (voir Southern*). Une sonde nuclique approprie pourra s'hybrider avec IS3 et rvler sa prsence. On obtient ainsi une sorte d'empreinte digitale spcifique. Toute mutation qui drange le dcoupage initial par la nuclase, par exemple une dltion ou une inversion, se traduit par une modification de l'empreinte. Les tests utilisant plusieurs nuclases de restriction et les sondes spcifiques des divers IS permettent de se faire une ide, aprs analyse
final
3 - Faites sur le mme principe que les galeries API System de Biomrieux, comme API 50. 4 - Transformation de l'ADN bicatnaire en ADN un brin.
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statistique, de la pluralit de ces mutations et de leur importance au cours du temps. La prsence des IS est d'ailleurs responsable d'une partie des variations constates, et nous verrons ultrieurement pourquoi. Les expriences d'volution en chambre ont toutes montr que le gnome bactrien tait extraordinairement plastique en absence de tout lment gntique tranger. la base est la comptitivit des cellules et leur volution par slection. On mme se demander pourquoi le gnome n'volue pas plus vite et pourquoi les mutations ne sont pas plus nombreuses. Or l'intgrit du gnome, en l'occurrence de l'ADN, est surveile constamment dans la cellule par diverses protines, les erreurs ventuelles, qui se traduisent gnralement par la perte d'une base ou un dfaut d'appariement au cours de la rplication, tant rpares par des systmes complexes. L'exactitude des copies est tout aussi importante dans nos ordinateurs quand nous enregistrons ou recopions un fichier ! On citera seulement deux types de lsion dans l'ADN. La premire est d'ordre chimique, la plus classique tant l'action photochimique de l'ultraviolet. Cette lsion dclenche notamment l'induction d'un systme de rparation qu'on appelle la rponse SOS*. Elle induit l'expression de nombreux gnes qui consistent rparer un dfaut dans un brin d'ADN, exciser la partie malade et refaire la partie manquante. Les bactries ont plusieurs systmes de rparation qui se compltent et mettent en commun certains facteurs. Un cas particulirement intressant est celui des protines MutS, MutL et MutH. Nous nous limiterons ici cet exemple. Ces protines sont charges de corriger une erreur de rplication, l o une base errone aurait t place en face du modle. Par exemple A en face de C au lieu de G. La protine MutS reconnat le dfaut d'appariement, active MutH qui est une endonuclale et MutL qui dcide sur quel brin aura lieu la rparation. Cette dtection suivie de rparation n'a pas lieu n'importe quand. Elle survient de prfrence aprs le passage de la fourche de rplication, o le brin d'ADN nouveau est appari au brin parental par une exacte complmentarit. Si un dfaut survient, le systme Mut doit tre capable de reconnatre le nouveau et l'ancien, puisqu'il s'agit de remplacer une base qui n'est pas sa place. Si l'enzyme se "trompait", elle provoquerait un changement dans le brin parental et serait cause d'une mutation. Comment les deux brins sont-ils distingus ? Par le systme Dam. Il est fond sur la prsence de nombreux motifs GATC, chelonns le long de l'ADN. Cette petite squence est symtrique, elle se lit dans les deux sens. Chaque site GATC se prsente au mme niveau sur les deux brins d'ADN. Il est la cible d'une mthylase, code par le gne dam, qui mthyle l'adnine ces positions. Quelle est la signification de cette opration ? Quand la rplication de l'ADN dpasse ce motif, il y a sparation des brins parentaux qui emmnent chacun leurs sites GATC mthyls. Le passage de la fourche de rplication fait donc apparatre des motifs dam nouveaux, qui n'ont pas encore eu le temps de se faire mthyler. Ils le seront au bout de quelques minutes mais la prsence d'adnine non mthyle est un signal qui veut dire que la rplication vient d'avoir lieu cet endroit.
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5' 3'
* GATC
CTAG
3' 5'
5' 3'
G T C
*A TA G
site dam temporairement hmimthyl
site dam doublement mthyl
G C A T T A C * G
Rgulation par mthylation

Un site GATC non mthyl sert de motif de reconnaissance MutS pour distinguer le brin nouveau du brin parental. Les dfauts que MutS est charge de dtecter ne se trouvent pas ncessairement au voisinage immdiat. MutS est une protine dimre dote d'une structure flexible. Elle fait plusieurs choses : se lier l'ADN, reconnatre un dfaut, lier et hydrolyser de l'ATP, puis aprs avoir rencontr un dfaut, lier l'ATPase MutL, et l'endonuclase MutH. C'est une mcanique molculaire trs intressante car on connat la structure de ces diffrentes protines. MutS (2 811 rsidus) a une affinit naturelle pour l'ADN, mais cette affinit devient 20 fois plus forte quand elle rencontre un dfaut qui se traduit par une dformation de la double hlice d'ADN. MutS est le dtecteur. La protine est en mme temps une ATPase. La rencontre d'un dfaut lui fait lier de l'ATP. Elle subit un changement de conformation qui lui permet de se cramponner l'ADN et de coulisser sur sa longueur, tout en hydrolysant de l'ATP. On pense que cette consommation d'nergie sert de moteur ce dplacement de la protine, mais le mcanisme exact est encore dbattu. MutS est donc une protine qui patrouille la longueur de l'ADN jusqu' ce qu'elle rencontre un dfaut. Ces mouvements molculaires ncessitent de l'nergie apporte par l'ATP. La structure dtaille de MutS a t publie et permet de se rendre compte du fonctionnement de l'enzyme [5].
attachement de MutL et MutH site "clamp"
ADN
site de reconnaissance connecteur
ATPase
a - Complexe form avec l'ADN
b - Sous-unit isole
MutS sur l'ADN
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Les deux sous-units de la protine sont vues sur le schma structural a en direction de l'axe de l'ADN. Elles sont embotes de faon lgrement dissymtrique l o l'ADN prsente une distorsion structurale due une base non apparie. La protine s'accroche l'ADN par des portions flexibles formant le "clamp", indiqu sur la structure d'une sous-unit en b. Il y a un site pour l'ATP par sous-unit dans une rgion o les deux parties sont en contact, et la partie appele connecteur jouerait le rle de courroie de transmission entre les deux extrmits. La rparation fonctionnerait comme ceci. La liaison de MutS avec une anomalie sur l'ADN localement tordu dclencherait un changement conformationnel autorisant la liaison avec l'ATP. Une protine partenaire qui est elle-mme une ATPase, MutL, serait alors active [6] en venant s'accoler MutS et stabiliserait son attachement l'ADN. Elle est accompagne du troisime larron [7], MutH. Le complexe form, MutS-MutL-MutH se dplacerait dans un sens ou dans l'autre le long de l'ADN, jusqu' rencontrer une squence GATC dont il a t question plus haut. Si le site contient un GATC non mthyl, celui-ci est coup par l'endonuclase H. D'autres protines vont alors parachever le travail. Une hlicase dbobine l'ADN coup sur un brin, en direction de la zone malade, des exonuclases dcapent toute cette partie et mme un peu au-del. Une nouvelle synthse rparatrice par la polymrase III a lieu, et la ligase fait la soudure.
ADN
*
GATC MutS MutL
*
MutH + ATP exonuclase polymrase III ligase ADN rpar
Les bactries mutes dans leur gne mutS restent viables, mais prsentent un taux de mutation accru. Ce systme un rle majeur dans la rparation des erreurs de rplication chez E. coli, mais n'est certainement pas spcifique cette espce. MutS est le chef de file d'une famille structurale de protines rpandue chez les procaryotes et les eucaryotes et toutes les espces vivantes pourraient rparer leur ADN sur un principe similaire. Les rares mutations qui chapent la rparation ont une fonction utile. Elle est sans consquence dans une population de milliards d'individus et le mutant a toute chance d'tre limin. Mais si une mutation tire le bon numro, celui qui va lui permettre par exemple de dgrader un produit nouveau du milieu, l'avantage slectif sera tel que le mutant inondera rapidement de sa descendance la population, et ce sera un facteur d'adaptation considrable de celle-ci.
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2.2 - PROTOMIQUE ET COMPLEXES MULTI-PROTIQUES

Alors que la liste des gnomes compltement squencs ne cesse de s'allonger pour atteindre la centaine, des avances considrables ont eu lieu dans la protomique, qui est l'tude des protines d'un organisme dans leur ensemble, ainsi que l'examen de toutes les interactions qu'elles prsentent entre elles. Chaque protine n'est pas une pice isole travaillant pour son propre compte dans le contexte cellulaire, mais peut s'associer de faon temporaire ou permanente d'autres en formant des units fonctionnelles plurivalentes, pouvant par exemple catalyser, lorsque chaque partenaire est une enzyme, une succession de ractions mtaboliques dans le mme mtabolisme. L'existence de complexes multi-enzymatiques a t reconnue depuis longtemps. Dans les cas les plus sophistiqus s'observent des protines haute masse molculaire dont les chanes sont formes de plusieurs domaines, chacun d'eux renfermant un site catalytique distinct. Un exemple classique est le complexe de synthse des acides gras saturs chez la levure et les mammifres, o 7 ractions catalyses soit autant de sites enzymatiques sont regroups dans une mme macromolcule. Dans d'autres cas l'association est non covalente. Deux protines peuvent s'associer ainsi la faveur d'un quilibre entre le complexe form et les entits spares. La formation du complexe est favorise en milieu concentr comme celui du cytoplasme cellulaire. La dilution encourage au contraire la sparation, comme dans les manuvres d'extraction et de purification courantes. C'est pourquoi beaucoup d'associations sont perdues dans l'exprimentation habituelle. La preuve de l'existence du complexe repose gnralement sur l'apparition d'une proprit nouvelle que les protines n'ont pas lorsqu'elles ne sont pas associes. L'analyse biochimique de ces problmes est souvent laborieuse, la slection des mutants gntiques appropris n'est pas toujours facile ni mme ralisable. Un grand progrs a t ralis sur la levure. Son gnome contient plus de 6000 gnes. Le but est de rechercher les relations spcifiques entre protines, par des contacts qui ne se font pas au hasard mais impliquent une connection la fois structurale et fonctionnelle. L'ide est symbolise par un dessin en forme de diagramme. Certaines protines fonctionnent en solitaire, d'autres, en majorit, sont relies fonctionnellement 3,4 partenaires et mme davantage. La consquence est trs importante. La dotation de la cellule en protines, son protome, apparat comme un norme rseau o certaines protines occupent des nuds, et ont probablement une importance critique. Comme par hasard, toute mutation concernant l'un de ces nuds risque d'avoir des incidences beaucoup plus graves que les mutations touchant les protines priphriques par rapport au rseau. On a mme compar le principe de ces rseaux la carte d'Internet.
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Consquences immdiates : chaque mutation sur l'un des nuds risque d'tre ltale pour la cellule (cercles foncs), et le taux d'volution des protines correspondantes sera beaucoup plus lent que pour les autres. Comme une mutation leur niveau a une probabilit trs grande de lser une ou plusieurs relations essentielles, le conservatisme de leur squence et de leur structure nen sera que plus marqu. La tche de dtecter les interactions au sein d'un trs grand nombre de produits serait paru premire vue insurmontable. Peter UETZ et coll. [8] ont obtenu environ 6000 transformants de levure par insertion d'un nombre quivalent de gnes ou d'ORF, soit des chantillons de la quasi-totalit du gnome. La technique de base utilise est celle des doubles hybrides*. Son principe est sommairement expliqu en glossaire avec un croquis explicatif. Une levure recombinante est capable d'exprimer la -galactosidase du colibacille 5 condition de possder un activateur de transcription appel GAL4. Ce facteur permet l'amorage de la transcription grce deux domaines structuraux, l'un qui interagit avec l'ARN-polymrase, l'autre qui se lie l'ADN. GAL1-LacZ est un gne recombin artificiellement dont l'expression se traduit par des colonies de couleur bleue sur les botes de milieu, alors que les autres restent blanches. Pour que la transcription ait lieu, il faut que l'ARN-polymrase s'installe en amont sur le site promoteur. Elle peut le faire avec l'aide de l'activateur GAL4 constitu de plusieurs domaines, qui s'attache en amont sur l'ADN sur un site UAS*. L'ide est de remplacer cet activateur par deux protines, l'une contenant le domaine charg de se lier l'ADN et soud une protine X, l'autre contenant le domaine activateur soud une protine Y. Lorsque X et Y peuvent s'associer ensemble parce qu'elles ont une affinit lune pour lautre, elles remplacent toute la partie centrale de l'activateur. La protine chimrique ainsi reconstitue peut jouer le rle d'activateur de transcription. Le criblage de toutes les combinaisons possibles (un norme travail fait par des techniques exprimentales automatises) a permis de dtecter les protines qui peuvent s'apparier ainsi et d'en faire un catalogue. Bien souvent, une interprtation logique de ces associations est possible quand elles concernent deux enzymes impliques dans un mme mtabolisme. Dans d'autres cas, il peut s'agir d'lments de fonction inconnue, qu'on peut deviner cependant si on connat lune des protines partenaires. Au total 957 interactions ont t dtectes impliquant plus de mille protines ! Ainsi se dgage peu peu l'norme architecture en rseau, o certaines protines occupent les nuds d'un vaste filet. La grande question est de savoir si l'agencement gnral est plus ou moins conserv d'un organisme l'autre, et l'avenir nous l'apprendra. On comprend mieux pourquoi certaines protines sont affectes d'un grand conservatisme, des bactries la levure et l'homme. Elles occupent les "nuds" associant plusieurs partenaires. Toute modification de l'une des protines concernes devrait s'accompagner de changements parallles et conformes dans les autres protines, ce qui est trs peu probable statistiquement. 5 - La synthse de l'enzyme se traduit par un test trs simple sur bote, donne des colonies bleues, les autres restant blanches.
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D'autres mthodologies sont bases sur la spectromtrie de masse. L encore sont testes en nombre norme par un criblage en partie robotis les diffrentes combinaisons possibles. Voici le principe. On veut savoir avec quelles protines de la levure un des composants peut s'associer. On va se servir de celui-ci comme hameon. Dans un premier temps, on allonge lgrement sa squence par recombinaison gntique de faon lui faire porter un fragment qui sera reconnu spcifiquement par un gel d'affinit* (voir chromatographie d'affinit*). C'est la mthode du TAP-tag* [9]. La protine, sur laquelle a t soud une "tiquette" par une partie flexible, est retenue sur gel chromatographique. Si cette protine est associe des partenaires, c'est tout le complexe qui est fix avec toutes ses composantes. Il s'agit donc ensuite de rcuprer le complexe par coupure enzymatique du bras flexible porteur de l'tiquette, de le dissocier et d'en reprer les morceaux spars par une lectrophorse. L'identification des fragments un un se fait par spectromtrie de masse [10].
protine "hameon" tiquette (TAPtag) groupe rcepteur greff sur le polymre protines associes polymre du support chromatographique (billes de gel)
complexe retenu sur le support
Pigeage des associations

Cet norme travail de criblage a port sur 1739 gnes, identifis par leur squence et leur homologie avec des gnes connus chez d'autres espces dont l'homme. Les grands progrs faits dans la spectromtrie de masse des protines depuis une quinzaine d'annes ont facilit le squenage et l'identification de tous les peptides en sappuyant sur des analyses automatises 6. Plus de 200 complexes ont t identifis, avec une taille allant de 2 83 composants relis une mme protine, la moyenne tant de 12. Plus de la moiti des complexes avaient au plus 5 protines. De faon gnrale les regroupements concernaient tous les grands secteurs de l'conomie cellulaire comme l'indique le diagramme.
6 - Les peptides sont dcoups en fragments dfinis, la spectromtrie de masse permet de reconstituer leur squence acide amin par acide amin, et les rsultats sont analyss par ordinateur.

1 - Cycle cellulaire 2 3 8 4 7 6 5 2 - Polarit cellulaire et structure 3 - Mtabolisme intermdiaire et nergtique 4 - Synthse et renouvellement des membranes 5 - Synthse des protines 6 - Transport (ARN, protines) 7 - Mtabolisme de lARN 8 - Rgulations 9 - Transcription, rparation dADN, chromatine
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1 9
Distribution par fonction des complexes de la levure

Les amas de protines contractant des associations entre elles sont dtects par les techniques cites, mais ne sont probablement pas des groupes tanches juxtaposs les uns aux autres. Au contraire les communications entre groupes sont visibles quand une mme protine se retrouve associe plusieurs dentre eux. Ainsi les protines rgulatrices semblent avoir une rpartition complexe. Nous avons bien la notion d'un vritable et immense rseau, comme cit antrieurement, dont toutes les mailles ne sont pas ncessairement connues. Les connections entre les groupes sont considrables. En outre cette volumineuse analyse a permis de dterminer la fonction hautement probable de gnes dont on ignorait totalement l'identit. D'autres auteurs ont mis en vidence de nombreux complexes multiprotiques chez la levure par immunoprcipitation et spectromtrie de masse [11]. Ils ont dtect environ 3600 associations couvrant le quart du protome de levure. Des observations passionnantes permettent de comparer cette extraordinaire rpartition avec le gnome humain. Les protines ayant leurs quivalents orthologues chez l'homme (par comparaison des squences et fonctions) sont prcisment celles qui contractent le plus grand nombre d'associations, et dont l'importance stratgique pour la vie cellulaire est probablement la plus grande. L'existence des normes rseaux de la protomique n'exclut pas les apports gntiques extrieurs. L'entre d'un plasmide porteur de tous les gnes d'une voie mtabolique, par exemple celle qui permet le dgradation du tolune, ne fait que surajouter des protines nouvelles dont l'intgration au rseau existant n'est sans doute pas ncessaire. Le vritable nombre des interactions entre protines chez la levure atteindrait au moins 30 000. Malgr ces avances remarquables, des rserves prudentes doivent tre mises. Les auteurs reconnaissent l'existence d'un bruit de fond non spcifique qui ferait apparatre de fausses interactions. D'autres cas dmontrs par les mthodes traditionnelles ne sont pas dtects. La prcision est donc loin d'tre absolue, mais les perspectives sont trs grandes. Ce volet de la recherche a permis de remettre au premier plan une notion banale, qui est celle de la forte concentration des macromolcules dans une cellule vivante. En fait les enzymes et autres facteurs qui actionnent la chimie cellulaire fonctionnent dans une pure organique concentre qui limite les diffusions et modifie les cintiques ractionnelles. On estime que la concentration des protines et acides nucliques dans
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une cellule de colibacille quivaut 300-400 g/L. C'est norme par rapport aux conditions habituelles de laboratoire, o ces macromolcules sont manipules des concentrations 100 500 fois plus faibles ! Or les hautes concentrations intracellulaires ont plusieurs rpercussions. Les conditions sont trs loignes des solutions idales examines gnralement en thermodynamique des quilibres. Dans un entassement de macromolcules se produit un effet d'exclusion du solvant conduisant une augmentation des activits d'un facteur d'autant plus considrable que les masses molculaires sont plus leves et l'exclusion du solvant plus marque. L'encombrement du milieu dplace les constantes d'quilibre des associations-dissociations. Il en rsulte qu'en milieu hyperconcentr les associations entre protines sont favorises, ainsi que les dimrisations, oligomrisations. Le systme tendra voluer dans le sens qui diminue l'influence du solvant, rend les protines plus compactes, favorise leur repliment et facilite les associations. La stabilit des protines tend augmenter. Enfin les effets cintiques sur les ractions sont complexes, car l'augmentation d'activit tend les acclrer, tandis que les diffusions de substrats sont entraves. On admet qu'il existe un optimum, celui-ci est difficile dterminer exprimentalement 7. En somme la ractivit intracellulaire des protines peut tre beaucoup plus leve que celle qu'on mesure habituellement dans le tube essai. Ces aspects importants sont discuts dans un article de R.J ELLIS [12]. Ils laissent les biochimistes raliser que pendant longtemps ils ont pu faire fausse route, en tudiant les protines dans des conditions loignes de leur cadre naturel. Les avances de la protomique et la dcouverte des nombreuses associations spcifiques entre protines jettent une lumire nouvelle sur ces problmes.
2.3 - TRANSFERTS GNTIQUES HORIZONTAUX

Les cellules de micro-organismes ne sont pas des botes tanches tout change d'information gntique, qui transmetterait leur descendance une bibliothque inviolable de gnes. Les transferts gntiques horizontaux mettent en jeu des changes de cellule cellule. Le phnomne s'est certainement produit sur une vaste chelle au cours de l'volution. Des changes considrables ont eu lieu galement au sein des cellules des eucaryotes entre l'ADN de leurs plastes, de leurs mitochondries et du noyau. Dans les bactries du sol et des milieux aquatiques, il est devenu vident que l'acquisition en bloc de nouvelles proprits tait possible, venant augmenter les capacits d'adaptation et de biodgradation des diverses lignes. L'acquisition horizontale d'information gntique a notamment attir l'attention par la prolifration de germes pathognes qui prsentaient des rsistances multiples aux antibiotiques. Il est devenu vident que l'acquisition rapide et simultane de multiples facteurs ne pouvait pas se faire par le jeu de
7 - On peut imiter ces conditions dans des solutions de protines in vitro en ajoutant des "crowding agents", macromolcules provoquant l'effet d'exclusion : polythylnes glycols, Ficoll, albumine.
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mutations ordinaires survenues au hasard, mais correspondait l'acquisition globale de segments gntiques importants maintenus dans la descendance par un avantage slectif [13]. Comment se rendre compte de l'tendue de ces transferts ? Un outil capital est l'observation des squences. L'apport d'ADN se fait principalement par plasmides et transposons, dont les caractres seront revus plus loin. Les gnomes bactriens prsentent des longueurs trs ingales. Le diagramme suivant compare les dimensions de quelques gnomes entirement squencs [14]. Les astrisques notent des archaebactries. On peut voir la petite proportion des gnes extrieurs sous forme d'ADN tranger (surtout plasmidique) ou d'ADN mobile (transposons) intgr au gnome principal.
Escherichia coli Mycobacterium tuberculosis Bacillus subtilis Synechocystis PC6803 Deinococcus radiodurans Archeoglobus fulgidus Thermotoga maritima Pyrococcus horikoshii Methanobacterium therm. Haemophilus influenzae Helicobacter pylori Methanococcus jannaschii Treponema pallidum Borrelia burgdorferi Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma genitalium
0
* * * * ADN natif ADN tranger ADN mobile
1000
2000
3000
4000
squences codantes (kb)
Longueur de l'ADN codant pour des protines

Cette figure reprise et modifie de l'article de Ochman et coll., ne peut pas donner une vision moyenne de l'ensemble des espces bactriennes. Les efforts de squenage ont port en priorit sur les espces dont on connaissait bien la gntique (le colibacille), qui avaient des gnomes courts (mycoplasmes), qui vivaient dans des environnements exceptionnels (thermophiles) ou qui taient pathognes (trponmes). On peut voir malgr tout que les transferts horizontaux reconnus comme vidents ne sont pas rares. Divers auteurs admettent que, dans le chromosome du colibacille, ils atteignent au minimum 10 16%. Les apports extrieurs les plus visibles sont les plus rcents. Une souche bnigne d'Escherichia coli s'est transforme en pathogne dangereux par l'acquisition en une seule fois d'un lot de pathogncit appel Pais*. De mme l'acquisition des rsistances multiples est considre depuis longtemps comme l'entre de squences entires plutt qu'une srie de mutations ponctuelles affectant des gnes prexistants. Le gnome complet du colibacille MG1655 contient 4 639 221 pdb [15], et a t pass au crible pour dtecter des squences exognes, en utilisant une analyse statistique recherchant les dviations en contenu G + C* et dans l'emploi des codons [16]. L'analyse suggre que 755 cadres de lecture (ORF) sur 4288 sont d'origine
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externe, ce qui reprsente un total de 548 kb rpartis sur tout le chromosome. Ces insertions se seraient produites un grand nombre de fois au cours de l'volution, et leur dtection ne reprsente peut-tre que la partie merge de l'iceberg, parce que les apports les plus anciens auraient vu leurs particularits effaces. Diffrentes constatations ont donn lieu spculation sur l'histoire du gnome de E. coli. Par exemple, bon nombre d'insertions semblent avoir t ralises proximit immdiate d'un gne commandant la synthse d'un ARNt, et c'est aussi leur voisinage que s'insrent des coliphages lysognes. Ce phnomne se retrouve dans une dizaine d'espces diffrentes. En outre les diffrentes squences d'insertion (IS) trouves dans le gnome du colibacille sont situes pour la plupart au voisinage de l'ADN d'importation. Ces squences d'insertion, sur lesquelles nous reviendrons, sont essentielles la mobilit de l'ADN par transposition. Par consquent les transferts horizontaux d'ADN ont pu s'effectuer la fois par l'apport des virus et des IS. La taille du gnome tend donc augmenter, mais se voit limiter par excisions et dltions liminant les squences nouvelles. Celles-ci seront maintenues nanmoins si elles apportent un avantage slectif suffisant. Le gnome bactrien, au moins celui du colibacille, parat donc extraordinairement dynamique. Des apports extrieurs ont introduit dans la cellule des gnes fonctionnels et des oprons l'origine de sauts importants dans les performances, notamment dans les voies de biodgradation. On admet que l'exprience accumule par l'observation du colibacille, bien qu'il s'agisse d'une espce assez fortement spcialise, nous apporte des indications prcieuses sur l'volution des bactries du sol et des eaux, et le dveloppement de la microflore dans l'environnement. Ces phnomnes intressent aussi particulirement l'tude des maladies infectieuses nes de l'acquisition d'un pouvoir pathogne par les souches dotes d'lots de pathogncit (Pais). Quels sont les mcanismes moteurs des acquisitions de gnes trangers dans la nature ? Les trois principaux sont la transformation, l'infection virale et la conjugaison. Dans une transformation, la cellule reoit des portions d'ADN nu deux conditions. Le nouvel ADN doit pouvoir s'intgrer dans son gnome et la bactrie doit se trouver dans un tat de "comptence" qui est soit permanent (Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae), soit obtenu certains stades de dveloppement (Bacillus subtilis). Ce mode d'acquisition permet aux bactries de renouveler leur stock gntique partir des dbris d'autres cellules. Dans le cas d'Haemophilus, l'ADN doit provenir de cellules identiques ou de souches apparentes. L'analyse du gnome a permis de dcouvrir un caractre trs curieux. L'ADN exogne n'est accept qu' l'aide d'une squence de reconnaissance dite des 9 bases : AAGTGCGGT. Ce motif est prsent 1465 fois dans tout le gnome, au sein d'un consensus plus grand (29 pdb) termin par une rgion riche en A/T. La spcificit de la transformation semble reposer sur ce dispositif [17]. Une infection par bactriophage peut injecter dans l'hte des gnes provenant d'une autre cellule. Ces derniers sont perptus dans la descendance si l'ADN apport par le virus, pouvant atteindre 100 kb, peut s'installer dans l'ADN de l'hte sous forme de prophage, lequel se transmet la descendance aussi longtemps que les fonctions de multiplication du virus restent dormantes (lysognie). Le
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prophage peut avoir amen avec lui des gnes provenant d'autres cellules infectes, et c'est ce qu'on appelle la transduction. Les prophages sont nombreux dans les gnomes bactriens, ils correspondent souvent d'anciens virus devenus incapables de clore leur cycle. Des prophages sont prsents dans beaucoup d'espces virulentes dont Vibrio cholerae et Yersinia pestis. La conjugaison est comparable une sexualit rudimentaire, o un contact physique entre un donneur et un accepteur se traduit par la transmission d'un ADN de lun l'autre. Un cas particulirement important est le transfert des plasmides, units pouvant se perptuer dans la cellule hte en rplicons autonomes, s'intgrer au chromosome ou changer des parties avec celui-ci par recombinaison. Les proprits les plus communment apportes par un transfert gntique horizontal sont multiples. La premire est la rsistance des antibiotiques ou des facteurs toxiques. Les espces microbiennes de l'environnement sont soumises une guerre chimique continuelle qui favorise la slection de moyens de dfense et l'acquisition de gnes codant pour des protines capables de neutraliser les facteurs adverses, par exemple des enzymes (comme la pnicillinase). Les gnes acquis sont souvent cods par des lments mobiles facilement transmissibles, plasmides, et transposons, ventuellement intgrs ou facilement limins ds que le besoin ne s'en fait plus sentir. Les transposons et intgrons pouvant voyager d'un segment d'ADN un autre font partie de l'ADN mobile et transportent volontiers des gnes de rsistance. Les plasmides sont les vecteurs les plus courants. D'autres transferts concernent les facteurs de virulence. Tout comme l'acquisition d'une rsistance aux antibiotiques, celle des facteurs de virulence permet une espce de se maintenir dans un environnement hostile et lui confre des proprits agressives. Il s'agit souvent d'units gntiques importantes qui apportent avec elles leur propre mcanisme rgulateur. Les facteurs de virulence codent pour des toxines, des hmolysines, des protines adhsives (adhsines), des protases, etc. Ils peuvent tre vhiculs par de grands plasmides ou tre apports par des phages comme dans le cas du vibrion du cholra. L'apparition d'une virulence peut aussi provenir, non pas de l'acquisition de gnes nouveaux, mais au contraire de la disparition d'un facteur qui empchait tout comportement pathogne [18]. Les entrobactries ont une protase de surface, OmpT, qui est prsente chez les colibacilles non pathognes mais absente chez Shigella. Cette protase diminue la virulence en s'attaquant la protine VirG, dont Shigella a besoin pour sa dissmination. Ces bactries manquent aussi de CadA, une lysine dcarboxylase qui inhibe le processus infectieux en formant de la cadavrine. Le cas de Shigella est intressant au regard de l'volution, car ces bactries partagent un anctre commun avec le colibacille dont elles sont particulirement proches. Les Shigella ont volu de leur ct. Elles sont devenues des formes pathognes par acquisition d'un trs grand plasmide de virulence (230 kb) et sur le chromosome de plusieurs Pais* dsigns par SHI-1, SHI-2, en remplacement de rgions entires contenant ompT et cadA. Le dessin voque ces transformations (dans un ordre chronologique arbitraire) :
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SH1-2 SH1-1
plasmide de virulence SH1-1
ompT anctre de E. coli - Shigella
cadA
SH1-2 Shigella flexneri
Acquisition d'une virulence

On connat au moins une douzaine de plasmides de virulence et prs d'une trentaine d'lots de pathogncit chez prs d'une vingtaine d'espces diffrentes [19]. Le SHI-1 de Shigella dtermine la formation d'une entrotoxine et d'une protase, le SHI-2 une synthse d'un transporteur et d'un facteur pour piger le fer qui est arobactine. Le squenage de nouveaux gnomes rvle des situations extraordinaires. Des espces dpourvues de toute action pathogne contiennent des squences voisines des Pais, souvent placs ct de gnes d'ARNt et appeles lots gnomiques. Ces diverses squences rapportes ne sont pas toutes inertes. Elles codent ventuellement pour des protines, des facteurs de symbiose, des transporteurs du fer, une rsistance des antibiotiques ou une dgradation de xnobiotiques. On a l'impression que ces lments ajouts et stabiliss par slection naturelle sont des outils anti-stress, et que la virulence est elle-mme une rponse un stress impos par le combat avec l'hte pour rcuprer du fer. Il apparat que la marge est troite entre une souche inoffensive de l'environnement et une nouvelle forme pathogne. On s'en est rendu compte avec le colibacille. De nouvelles souches virulentes appeles pathotypes sont hmolytiques ou dclenchent des infections hmorragiques intestinales, et sont porteuses de Pais prs du gne selC, qui code pour un ARNt 8. Des espces banales de l'environnement peuvent devenir potentiellement pathognes. Le Listeria monocytogenes prsent en particulier dans les matires en dcomposition est responsable des listrioses qui sont de graves infections d'origine alimentaire. Un transfert qui nous intresse particulirement ici est l'acquisition de proprits mtaboliques. Des germes courants obtiennent les outils leur permettant de coloniser de nouvelles niches cologiques et de profiter des lieux contamins par des xnobiotiques. L'apport de gnes ou d'oprons entiers a sans doute t courante au cours de l'volution. Le colibacille et Salmonella enterica sont des espces trs voisines, l'une a acquis les gnes d'utilisation du lactose et une meilleure adaptation coloniser l'intestin des mammifres, l'autre a reu le pouvoir d'utiliser le citrate. Dans tous les cas o deux espces voisines se distinguent comme ici par deux proprits divergentes, la modification s'observe dans une rgion du chromosome qui n'a pas d'quivalent dans l'autre espce. En gnral l'acquisition d'une voie mtabolique partielle ou complte s'effectue sous forme de gnes groups apports par un plasmide. Il est rare qu'un plasmide s'intgre dans le chromosome autrement que par des recombinaisons de certaines parties ou par 8 - Cet ARNt a un caractre exceptionnel, parce qu'il participe l'insertion de la slnocystine dans certaines enzymes (voir slnocystine*).
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des transpositions. Une condition importante pour que la voie importe fonctionne dans son nouvel environnement est la prsence des modes de rglages essentiels, savoir l'induction et la rpression des gnes en fonction des conditions. Les nouveaux gnes sont donc apports groups en un ou plusieurs oprons accompagns de gnes rgulateurs. Un transfert gntique horizontal par le biais de grandes units comme les plasmides offre un cadre favorable pour l'acquisition globale d'une nouvelle aptitude. Les exemples abondent en examinant les biodgradations. La cohabitation des espces en petit nombre dans des milieux difficiles, comme les sources thermales, favorise probablement des changes importants, comme le suggre la comparaison de Thermotoga maritima avec plusieurs archaebactries [20]. Les transferts paraissent possibles entre organismes n'ayant aucune parent entre eux. Les gnes lis la transcription, la traduction et la rplications sont beaucoup plus rarement transmis que les gnes lis aux fonctions mtaboliques. Les premiers sont les gnes d'information, ils forment des ensembles complexes et les protines produites interagissent troitement les unes avec les autres. On peut donc concevoir que leur exportation en bloc a un caractre beaucoup plus acrobatique, avec un taux de russite faible. La seconde catgorie de gnes concernent des protines de "mnage" (housekeeping proteins) qui agissent seules ou en comit restreint. Leur acquisition est donc moins susceptible de provoquer de grands bouleversements dans le mtabolisme cellulaire. Des constatations intressantes ont t faites partir de Bacillus subtilis, bactrie Gram-positive du groupe des firmicutes, o l'on trouve galement les Clostridium et Streptococcus. Le gnome complet a t publi par des chercheurs de l'Institut Pasteur [21]. Il a l'intrt de concerner une espce trs commune de l'environnement, connue pour diverses biodgradations, figurant dans un groupe qui occupe des niches cologiques varies (certaines espces sont des pathognes). Le gnome a une longueur de 4 214 810 pdb, contient prs de 4100 gnes codant pour des protines, dont beaucoup sont impliques dans la dgradation de molcules d'origine vgtale. Les Bacillus scrtent dans le milieu extrieur une palette de protines comme des protases, dont certaines sont exploites industriellement. Le gnome de B. subtilis rvle 5 signal peptidases* diffrentes sans doute en rapport avec ces scrtions. Il y a aussi des gnes du mtabolisme secondaire, comme ceux qui gnrent des antibiotiques. On dcouvre surtout une dizaine de prophages ou leurs traces, laissant supposer que les transferts gntiques horizontaux ont t abondants et se sont produits la faveur d'infections virales. En conclusion, la gnomique laisse merger une nouvelle conception de la sparation des espces et de leur volution chez les procaryotes, faisant largement appel des transferts gntiques horizontaux capables de se produire grande chelle.
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2.4 - PLASMIDES
Cette section et la suivante seront vues comme les rsums de notions dcrites dans les manuels de gntique et de microbiologie. Nous l'utiliserons comme aidemmoire car nous en avons besoin pour comprendre la dynamique adaptative des micro-organismes face aux biodgradations. Les plasmides sont communs chez les bactries et se prsentent gnralement comme des units circulaires d'ADN dont la taille est trs variable de 4 kb plus de 100 kb (mgaplasmides), indpendantes du gnome principal ou chromosome et rpliques en mme temps que lui au cours des divisions cellulaires. Chaque cellule bactrienne peut en contenir un ou plusieurs exemplaires. Un plasmide contient les signaux ncessaires sa reproduction sous forme d'units identiques et constitue un rplicon. Le gnome bactrien est lui-mme un norme rplicon, ou "chromosome". Un ADN exogne qui ne respecterait pas ces conditions serait rapidement dtruit. Les gnes acquis de l'extrieur doivent donc tre intgrs un rplicon. Les micro-organismes ont le pouvoir fantastique de modifier leur patrimoine gntique par l'accueil de nouveaux rplicons qui peuvent s'intgrer par recombinaison au chromosome ou se laisser propager comme units indpendantes. Les plasmides se rpandent dans une population par contacts entre cellules au cours d'une conjugaison : un donneur rplique son plasmide, garde une copie et injecte l'autre dans la cellule partenaire. Il en rsulte une propagation dans la population la manire dune infection virale. La prsence des plasmides dans une souche bactrienne est rvle par sparation physique de leur ADN qui est de petite taille et prsent sous forme d'une fraction homogne par rapport l'ADN chromosomique fragment en morceaux de taille htrogne. Sa composition en G + C est ventuellement diffrente, et les cercles plasmidiques non dgrads sont affects de super-tours rendant les molcules plus compactes. Les plasmides sont galement dtects par des sondes nucliques spcifiques, et spars par lectrophorse ou ultracentrifugation. La reconnaissance et la fragmentation des plasmides par nuclases de restriction sont, comme on le sait, des piliers essentiels de la gntique bactrienne moderne. On notera au passage que des organismes eucaryotes, notamment les levures [22] et les plantes [23], peuvent hberger aussi des plasmides. Voici trs sommairement quelques points de repre supplmentaires sur les plasmides. On peut distinguer des caractres communs tous les plasmides, et ceux qui ne se rencontrent pas dans tous mais dont l'importance mrite d'tre mentionne. Les deux caractres fondamentaux communs sont la prsence des fonctions rplicatives et l'appartenance un groupe d'incompatibilit. La rplication exige une ou plusieurs origines de rplication* reconnues par des protines spcifiques, codes par le plasmide lui-mme ou empruntes la machinerie cellulaire, et agissant "en trans". Ce dtail permet au plasmide de se rpliquer ventuellement dans une espce diffrente qui ne reconnat pas les mmes squences origines, car il apporte ses propres outils. Cette situation est mise profit artificiellement dans les vecteurs navettes*. Tous les plasmides se rpartissent en groupes d'incompatibilit. On en connat plus d'une trentaine. Cette proprit est
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lie la possibilit pour un plasmide donn d'tre prsent en exemplaires multiples dans une mme cellule, o leur nombre est rgul. Quand deux plasmides en prsence appartiennent au mme groupe, le mcanisme rgulateur ne fait pas la distinction entre eux et compte en bloc le nombre total des origines. Les deux plasmides entrent donc en comptition et tendent s'exclure mutuellement dans la descendance. Le schma montre la rpartition d'un plasmide une seule copie, lorsqu'il est mis en prsence d'un second plasmide du mme groupe. Les plasmides d'un mme groupe se font concurrence, ils sont dits "gostes". Le nombre des origines reste le mme.
un seul plasmide croissance, rplication du plasmide division cellulaire +
deux plasmides du mme groupe
pas de rplication des plasmides
division cellulaire +
Les proprits particulires appartenant aux plasmides sont nombreuses. Quelques-unes ont dj t cites, notamment la prsence de gnes codant pour un mtabolisme ou un pouvoir pathogne. La plupart des plasmides utiliss en gntique molculaire vhiculent des marqueurs ou gnes de rsistance des antibiotiques qui facilitent le criblage des clones recombinants. Une autre proprit importante des plasmides est de pouvoir intgrer leur ADN par recombinaison dans le chromosome ou de s'en exciser nouveau. La recombinaison peut aussi porter sur des segments limits. La conjugaison permet aux plasmides de promouvoir leur propre propagation de cellule cellule. Ils sont alors dits conjugants (ou conjugatifs). Le plasmide du donneur renferme un site important, oriT ou mob (pour origin of transfer ou mobility). Il sert de point de dpart du transfert. En outre les gnes tra codent pour des protines qui reconnaissent oriT et assurent diffrentes fonctions, dont le rapprochement des deux cellules et leur communication par un pilus. Un mcanisme assez compliqu dclenche une rplication du plasmide partir de oriT, l'mission d'une copie vers le receveur alors que l'autre reste dans le donneur. Le schma de la conjugaison en donne le principe simplifi. L'ADN bicatnaire subit une coupure au site oriT, et se dbobine progressivement sur toute la longueur du cercle, pendant que l'un des brins est mis par un pilus de conjugaison qui forme un pont entre les deux cellules. L'autre brin reste au dpart. L'ADN monocatnaire est rpar des deux cts par une nouvelle synthse du brin complmentaire, rtablissant l'ADN bicatnaire, et celui-ci est de nouveau soud en ADN circulaire. On voit donc que ce systme de rplication, dit par "cercle roulant", fait passer l'ADN d'une cellule l'autre sous forme linaire, avant d'tre circularis nouveau l'arrive aprs la synthse complmentaire. Il peut se faire qu'un plasmide ne
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soit pas conjugant, mais le transfert peut tout de mme avoir lieu avec un site oriT reconnu par des facteurs tra venant d'une autre source dans le donneur.
pilus de conjugaison oriT 5
donneur
cellule rceptrice
donneur
cellule rceptrice
oriT
synthse du brin complmentaire
Conjugaison, rplication par "cercle roulant"

La conjugaison du colibacille entre cellules F+ dites mles et F dites femelles transmet le plasmide F. Elle a servi de modle historique pour comprendre ce trs important phnomne de transmission gntique [24]. Cette opration est complexe et fait intervenir une srie de facteurs diffrents. Les cellules doivent entrer en contact, tablir un pont entre les partenaires et rpliquer d'une faon programme l'ADN transmettre. Ceci exige plusieurs manipulations molculaires sur l'ADN, catalyses par des enzymes spcifiques. L'ensemble des oprations met contribution la fois des protines codes par le plasmide et des facteurs de l'hte. Il y a aussi synthse de protines de surface TraS et TraT charges d'empcher l'entre de plasmides F supplmentaires dans une cellule qui est dj devenue F+. Le plasmide n'est prsent qu' un seul exemplaire dans la bactrie et entend le rester : la place est prise ! En somme pour faire marcher tout cela, il faut prs d'une trentaine de gnes, soit environ la moiti de tous ceux qui ont t identifis sur le plasmide F. Ils sont tous groups dans une portion d'ADN d'environ 33 kb appele rgion tra. Une vingtaine de ces gnes font partie d'un trs grand opron activ par le produit du gne traJ. Les cellules F deviennent F+ aprs transfert et deviennent des donneurs leur tour. C'est donc toute la population bactrienne qui devient rapidement F+. Le plasmide F n'offre pas le cadre le plus favorable l'tude cause de sa complexit. Il existe heureusement des plasmides conjugants plus simples, comme le R388 du colibacille, d'une longueur de 33 kb. Il dtermine une rsistance aux sulfamides et la trimthoprime. Deux sries de gnes dterminent les protines de conjugaison. La premire ne code que pour trois protines, TrwA, TrwB et TrwC. Elles sont en charge des manipulations sur l'ADN et le mcanisme du "cercle roulant" dj cit. La deuxime srie de gnes code pour une dizaine de protines, de TrwD TrwM, dont la fonction est d'assurer la communication entre les deux
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cellules. Il en rsulte trois pices de machinerie symbolises sur le diagramme suivant. La premire est le relaxosome, un ensemble qui a pour effet de prparer l'ADN au transfert. Le deuxime est un anneau form par TrwB, reprsent de face (a) ou en coupe latrale (b). Cet hexamre constitu d'units implantes dans la membrane forme un canal central large de 8-10 nm. Enfin le translocon* est l'appareil extrieur formant un tube transporteur vers l'autre cellule [25].
ATP TrwB TrwB TrwB TrwB TrwB TrwB TrwC TrwA TrwB
translocon 3
IHF relaxosome
ATP
membrane
L'appareil de translocation
Cet ensemble fonctionne en gros comme ceci. Pour que le transfert d'ADN ait lieu, il faut que l'un des deux brins soit coup au site origine oriT sur le plasmide de dpart, et que les deux chanes soient spares : cette dnaturation de l'ADN prpare le brin qui sera expdi de l'autre ct. Pas n'importe quel brin. C'est le brin T, qui pntre dans le pont intercellulaire extrmit 3' en avant. C'est un peu ce qui se passe quand la cellule rplique son chromosome. L'ADN est dnatur partir du point origine et il se cre une fourche de rplication. Une protine spciale participe cette dnaturation et s'empare de l'un des brins de l'ADN dnatur. La protine TrwB est similaire une hlicase. Sa structure dtaille partielle a t dtermine [26]. La protine dnature l'ADN de proche en proche, s'empare de ce filament d'ADN et l'expdie par une ouverture travers la membrane tandis que l'autre sert de modle une nouvelle synthse (procd du cercle roulant). Pour faire ce travail, TrwB a besoin d'une source d'nergie et rgle le problme en hydrolysant de l'ATP chaque avance de la chane (le mode de couplage n'est pas encore bien connu). La protine TrwC a pour rle de dtortiller la double hlice (relcher les super tours), complte l'action de l'hlicase et peut s'appeler une "relaxase". La protine TrwA est un rgulateur de transcription, elle se lie l'ADN et agit comme un rpresseur. Tout ce dispositif, dont une partie est code par le plasmide, est complt par des facteurs de l'hte. Des mcanismes particuliers rglent la sgrgation des diffrentes copies d'un mme plasmide entre les cellules filles aprs division. La rpartition peut tre ce point ingale que l'une des cellules n'emporte aucun exemplaire. Exprimentalement on peut encourager la perte du plasmide par une action chimique (acridines, bromure d'thidium, novobiocine), opration appele curing. Inversement, la multiplication des cellules bien pourvues en plasmide peut tre encourage en cas d'avantage slectif important. En fait tous les plasmides ne
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sont pas indfiniment stables, la sgrgation des copies dans les cellules filles peut tre imparfaite et des cellules sans plasmide apparaissent dans la descendance. Elles sont conserves ou limines en fonction de la pression slective du moment. Il peut se faire que plasmides ne portent pas toutes les fonctionnalits autorisant leur rplication intracellulaire ou leur transfert par conjugaison. Ces oprations ne sont alors possibles qu'avec l'aide de facteurs appartenant d'autres lments, par exemple un plasmide tranger, un virus, ou des gnes appartenant l'hte. Donc contrairement au facteur F qui reprsente le sommet de la sophistication, beaucoup de plasmides ont besoin d'tre "aids", en particulier dans le cas des plus petits (moins de 10 kb). Sur le plan exprimental, on peut forcer l'entre d'un ADN plasmidique dans une souche rceptrice par lectroporation ou divers procds physiques ou chimiques qui ont pour effet de crer des lsions momentanes dans la membrane. C'est une possibilit essentielle pour le gnie gntique, car on peut utiliser comme vecteurs d'entre de gnes nouveaux des petits plasmides ou encore des ADN viraux, en s'affranchissement du mcanisme naturel beaucoup plus compliqu. En outre les plasmides les plus petits peuvent exister prs de 50 exemplaires dans la cellule, se rpliquent indpendamment du chromosome et permettent une amplification gntique de l'expression des gnes qu'ils renferment. Une recombinaison peut intgrer un plasmide dans le chromosome et l'information gntique insre en partie ou en totalit est transmise la descendance au fil des divisions cellulaires comme le sont les autres facteurs du gnome.
plasmide
ADN du chromosome
attachement et recombinaison
intgration complte
Intgration d'un plasmide

On pense que ce phnomne a pu jouer un rle important au cours de l'volution pour la diversification des voies mtaboliques. Une cellule peut ainsi acqurir en bloc tout un segment lui confrant des proprits nouvelles. Celles-ci ne seront pas ncessairement exploites. Il faut pour cela que l'expression des gnes nouveaux obisse un certain nombre de conditions, c'est--dire ne pas bouleverser les fonctions existantes et obir des rgulations prcises, moyennant quoi la pression slective du milieu pourra favoriser la nouvelle souche. Le squenage des gnomes a permis de se rendre compte que diverses espces doues de proprits de biodgradations ont probablement reu les gnes ncessaires aprs de telles intgrations. La disposition primitive des gnes n'a pas toujours t conserve comme un segment distinct, et a t brouille par des phnomnes de recombinaison et de transposition. L'identit de ces gnes peut nanmoins tre devine par leur structure particulire, l'emploi des codons (codon-bias) ou par des homologies de squence avec d'autres espces. Un critre remarquable est celui du groupement des gnes, parfois dans un ordre caractristique qui se retrouve dans des espces distinctes. On peut alors supposer que les espces en prsence
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ont t l'origine "contamines" par une mme squence de type plasmidique, et en auraient ainsi gard le souvenir en dpit des remaniements ultrieurs.
2.5 - SQUENCES D'INSERTION - TRANSPOSITION

Les transposons sont des lments d'ADN mobile contenant ce qu'on appelle des squences d'insertion ou IS, capables de sauter d'une position d'ADN une autre. Chez les bactries, ils transportent avec eux des lments variables qui peuvent tre par exemple des gnes de rsistance des antibiotiques. La technique est celle du "couper/coller" des ordinateurs dans un traitement de texte. Un fragment du texte est prlev et insr ailleurs un endroit dtermin. Une autre opration consiste copier le fragment sous forme identique et l'insrer ailleurs en laissant le premier exemplaire en place. Il en est de mme dans une transposition o le fragment d'ADN est transport d'un endroit l'autre sans rplication, ou aprs avoir t rpliqu en laissant une copie en place. En somme ABCDEFGH deviendrait ABECDFGH dans le premier cas, ABECDEFGH dans le second. La transposition n'est pas rserve aux procaryotes. Dcouverte initialement chez le mas par Barbara MCCLINTOCK en 1951, elle a fait l'objet d'observations trs dtailles chez la levure, la drosophile, et vrai dire dans toutes les espces o on l'a cherche [27]. Cela fait partie des outils dont les tres vivants disposent pour grer l'volution de leur patrimoine gntique. Le dplacement d'un lment peut provoquer des insertions et dltions, ou dplacer une squence d'un endroit un autre, en inactivant parfois certains gnes quand l'insertion se produit en leur sein. Une transposition peut aussi avoir des effets plus subtils quand l'insertion drange les rapports d'un gne avec un promoteur ou une squence rgulatrice. Avec les plasmides, les lments transposables apportent d'extraordinaires moyens d'adaptation, et constituent des outils de recherche en gntique d'une valeur inestimable. Les lments mobiles les plus simples sont les squences d'insertion (IS). Elles contiennent de 700 1600 bp, encadres aux extrmits par deux courts segments inverss de 15 25 bp. Un lment IS contient le signal ncessaire la transposition, qui est catalyse par une transposase. L'enzyme se lie aux deux extrmits rptes inverses (ou IR), reconnat la squence cible et y effectue l'insertion. La transposase agit sur la cible en y pratiquant une ouverture formant des "bouts collants" la manire de ce que ferait une nuclase de restriction. Son gne occupe presque toute la longueur intermdiaire de l'lment, et son promoteur se situe en partie dans l'un des segments rpts inverss, qui est dsign par convention comme extrmit gauche IRL (inverted repeat, left). L'autre extrmit est IRR (inverted repeat, right).
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extrmits rptes inverses
IRL
lment IS
IRR
TACATGCACCAG ATGTACGTGGTC ouverture de la squence cible TACATGCAC ATG
CAG TACATGCAC ATG TACGTGGTC insertion CAG TACGTGGTC rparation
TACATGCAC ATGTACGTG
ATGCACCAG TACGTGGTC
IRL
IRR
rptition directe
Insertion d'un lment IS

On voit que la petite squence servant de cible l'insertion subit une duplication en tandem et l'IS s'installe entre les deux copies. Chaque IS possde ses caractres propres et le petit tableau en donne une ide en ce qui concerne le colibacille. IS
IS1 IS2 IS3 IS4 IS5 IS10R*
Nombre (E.coli)
6-10 5 5-16 1 ou 2 abondant
(pdb)
768 1327 1258 1426 1296 1329
Cible, pdb
9 5 3-4 11-12, 14 4 9
Rpt. inverses, pdb

18-23 32-41 29-40 16-18 15-16 17-22
ORF
2 1 2 1 1 1
* Chez Salmonella typhimurium, dans la structure du tranposon Tn10.
Le colibacille renferme d'autres IS non ports dans ce tableau, comme IS30, IS150, IS186. De nombreux IS ont t rpertoris hors du colibacille. Par exemple IS3 se retrouve dans Caulobacter crescentus, Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Pseudomonas aeruginosa, ainsi que chez des pathognes (Neisseria meningiditis, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae), des cyanobactries (Synechocystis sp.) et d'autres espces. En 1998 on rpertoriait dj environ 500 lments d'insertion dans 159 espces groupant la fois des eubactries et des archaebactries [28]. Le plasmide F renferme une copie d'IS2 et trois de IS3. Les lments d'insertion sont classs par famille sur la base de caractres communs de structure et de squence. Les IS3 et IS5 sont les plus rpandus, IS1 est le plus anciennement connu et le plus petit. Il a la particularit d'avoir deux
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cadres de lectures, A et B, commands par un promoteur localis au niveau de l'extrmit gauche (IRL). La vraie transposase serait B. L'existence de deux cadres de lecture s'observe aussi dans la nombreuse famille des IS3. Le dispositif particulier de IS1 nous permettra d'introduire une proprit importante d'un lment d'insertion. Pour illustration voici sa carte schmatique. Le promoteur est marqu d'une petite flche sur la gauche de la figure.
insA IRL InsA InsAB' stop insB IRR les deux protines produites
His Leu Lys Asn Ser
Gly
Arg Ser Pro
Arg
GCCAUUUAAAAAACUCAGGCCGCAGUCGGUAACCUCGCGCAUACAG
Lys Leu Arg Gln Ser Val Thr Ser Arg Ile Gln
Les deux cadres de lecture de ISI

La transcription partir de ce promoteur s'effectue en bloc sur toute la longueur de l'lment d'insertion, en ne s'arrtant qu'un peu en avant de IRR. Malgr l'existence des extrmits rptes et inverses (IRL et I R R), les squences d'insertion ou IS ont donc une polarit dicte par le sens de transcription du gne de la transposase. Ce dtail est important pour comprendre le fonctionnement des transposons. Dans 99% des cas, la traduction par les ribosomes ne s'effectue que sur la partie insA, car elle y rencontre un codon Stop (UAA). La partie situe en aval ne devrait donc pas tre traduite, ce qui interdirait la synthse de la transposase ! Un mcanisme particulier permet de contourner l'obstacle dans un petit nombre de cas. Entre les rgions insA et insB' existe une zone de chevauchement dont la squence est dtaille dans le bas de la figure. On peut y remarquer une curieuse rptition de 6 fois la lettre A. On a des preuves exprimentales que ce motif fait draper la transcription en provoquant ce qu'on appelle un changement de cadre de lecture (frameshift) avec la nouvelle squence de codons comme il est indiqu. Les ribosomes semblent ramorcer la lecture de la suite du message la faveur de ce changement de cadre. La protine synthtise est InsAB' et fait office de transposase. La petite protine basique InsA reste majoritaire, mais elle se lie aux squences terminales IRL et IRR sur l'ADN et a pour effet d'entraver la transposition de l'lment d'insertion, car ce sont justement les zones que la transposase devrait reconnatre [29]. La transposase InsAB', qui n'est faite qu' taux rduit, ne peut donc effectuer la transposition (avec ou sans rplication dans le cas d'IS1) qu'avec une frquence trs faible, qui est de l'ordre de 107 par rapport aux divisions cellulaires. Si on ajoute une septime lettre A au motif rpt de la zone de chevauchement, ou si on en retire une, le cadre de lecture qui devrait normalement dboucher sur le codon Stop s'en voit dcal, et la protine InsA n'est plus produite (la traduction continue jusqu'au bout). Elle est remplace par la transposase qui peut fonctionner alors sans entrave [30]. Le dplacement de l'IS
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intervient avec une frquence bien plus leve qui est de l'ordre de 0,1 1%. Une limitation existe cependant et serait due un deuxime dispositif ne concernant plus la traduction mais la transcription par l'ARN-polymrase. Une rgion en fin de insA tend faire cesser la transcription en aval. Les molcules d'ARN messager sont alors tronques et la transposase n'apparat pas. Une proprit importante d'IS1 et des squences d'insertion en gnral est de s'accompagner de mcanismes ayant pour effet de limiter leur propagation. En effet la multiplication des lments dinsertion dans un gnome bactrien devrait entraner des effets dltres et leur nombre doit tre ramen une valeur acceptable. La destruction de la cellule serait aussi celle de l'IS, qui se compare un parasite rduit sa plus simple expression. Ces lments sautent d'une position l'autre sur l'ADN, soit au sein du chromosome, soit vers un plasmide, avec une frquence faible de l'ordre de 105 107 par rapport aux taux des divisions. tonnant : c'est comme si l'lment IS se munissait de mcanismes rgulateurs avec le souci de freiner le plus possible sa propre multiplication. Il en rsulte un taux moyen d'exemplaires peu prs stable dans le chromosome bactrien. Les effets d'une insertion dans l'ADN peuvent tre multiples. La premire est l'inactivation d'un gne. Une seconde est d'introduire un ou deux promoteurs supplmentaires provoquant des amorages de transcription intempestifs, ou inversement d'introduire des points d'arrt. En outre une insertion peut inactiver ou dvier un mcanisme rgulateur. Des effets secondaires parfois inexpliqus se produisent au voisinage d'un IS, en particulier une dltion laissant l'IS intact. Certains lments peuvent s'isoler en cercles d'ADN au cours de leur transposition [31], comme l'indique le schma. L'excision et l'intgration se font par des mcanismes diffrents d'un IS l'autre, mais ils ne seront pas abords ici pour des raisons de simplicit. Le principal intrt des IS est leur participation la mobilit des transposons, dont il sera question dans la section suivante.
coupure de lun des brins par la transposase
coupure du 2e brin, rplication
circulation insertion par la transposase IS IS squence dADN cible IS IS
Transposition
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La prsence des IS dans un gnome (comme celle des transposons) est responsable d'une proportion importante des mutations chez les bactries, et constitue un facteur d'volution considrable [32]. Les effets des IS compltent ceux des gnes mutateurs. En intervenant taux faible, les mouvements des IS sont autant de ballons d'essai volutifs qui peuvent faire surgir par hasard un avantage slectif [33]. On estime que l'volution des gnomes peut se faire aussi la faveur de squences rptitives se succdant en tandem, distinctes des IS. Il en existe plusieurs catgories, les Rep* tant les plus courtes. Elles sont nombreuses dans le colibacille et diffrentes espces. Les divers lments rpts le long de l'ADN confrent au patrimoine gntique une grande plasticit, en permettant le rapprochement de portions loignes et l'apparition de solutions favorables sous la pression de l'environnement. Ces lments multiples sont frquents dans le gnome des protobactries, le plus souvent sous forme de squences rptes inverses. Les eucaryotes ont aussi des rptitions en tandem et d'autres structures de ce type [34]. Tous ces motifs se rencontrent dans leur quasi-totalit l'extrieur des gnes, et ne sont donc pas dans les rgions traduites en protines. Certains auteurs pensent qu'une partie du travail des IS est de dclencher de temps en temps des transpositions qui viennent inactiver des gnes. Si ces derniers ne sont pas indispensables, la modification est transmise sans inconvnient dans la descendance. Ce phnomne participerait une simplification du gnome en liminant peu peu les squences qui ne servent rien.
2.6 - LES TRANSPOSONS SIMPLES ET COMPOSITES

Un transposon est donc une portion d'ADN mobile utilisant les proprits des lments d'insertion. Dans les transposons de la Classe 1, une portion plus ou moins longue est borde aux extrmits par deux lments IS orients dans le mme sens ou en sens contraire. Ces lments sont responsables de la transposition de l'ensemble, qui renferme typiquement des gnes de rsistance des antibiotiques. Des exemples classiques sont Tn5, Tn9, Tn10, Tn903 . Les transposons de la Classe 2, appels quelquefois transposons complexes ou composites, ressemblent de grands IS qui renfermeraient, outre celui de la transposase, d'autres gnes et des lments rgulateurs plus ou moins compliqus. Des exemples sont Tn3, Tn1, Tn4. La longueur des transposons est donc bien plus grande que celle des IS, allant de 4 21 kb. Tous renferment aussi des gnes supplmentaires qui n'ont rien voir avec la fonction de transposition. Si les chromosomes bactriens ou les plasmides ne renfermaient que de simples lments d'insertion comme les IS de la section prcdente, les avantages physiologiques ne seraient pas toujours vidents. Au contraire la prsence des IS serait plutt nfaste par ses effets ravageurs, l'inactivation de gnes utiles tant plus probable que l'apparition fortuite de formules nouvelles et bnfiques. Le problme prend donc toute sa dimension quand les IS accompagnent des gnes dtermins et les transportent avec eux. Beaucoup de transposons peuvent sauter d'un plasmide vers le chromosome et vice versa. Tous ont des mcanismes rgulateurs pour
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endiguer le taux de transposition et faire de celle-ci un vnement plutt rare. Enfin il existe pour mmoire des transposons de Classe 3, qui sont des bactriophages multiplis par transposition, leur chef de file tant le bactriophage Mu.
IS10L
TetR
IS10R
ARN "OUT"
IS10 R IS10R
ARN "IN" zone de chevauchement
Tn10
Le transposon Tn10 est un premier exemple. Sa longueur est de 914 bp et il appartient la classe 1. Il correspond la catgorie des transposons composites, du fait qu'il existe un lment IS chaque extrmit. Ces lments ici sont des IS10. Ils diffrent lgrement par quelques paires de bases et on les distingue par les sigles IS10L (gauche) et IS10R 9. Les deux lments I S pourraient thoriquement tre fonctionnels et commander chacun une transposition par leur transposase. En fait seul l'IS10R a ce pouvoir. La transposase d'IS10L n'apparat que dans certaines situations, par exemple quand le transposon est dans un environnement o il existe un promoteur extrieur capable de promouvoir la transcription de IS10L. Le transposon transporte en outre des gnes de rsistance (TetR) aux ttracyclines, la blomycine, la nomycine, et plusieurs cadres de lecture dont quatre sont homologues de gnes bactriens impliqus dans le mtabolisme des acides amins [35]. Au point de vue volutif, ce type de structure aurait pu natre la faveur de la prsence de deux IS voisins encadrant par hasard plusieurs gnes, dont la propagation en bloc rendue possible aurait apport un avantage slectif. Le schma de Tn10 indique le dispositif intressant qui contribue limiter le taux de sa transposition. L'extrmit d'IS10R, seule fonctionnelle, comporte deux promoteurs se chevauchant en partie sur une longueur de 36 pdb, l'un commandant la transcription vers la droite (ARN "OUT") sur 69 bases, l'autre vers la gauche et formant un ARN beaucoup plus long (ARN "IN"). Cette dernire transcription commande la synthse de la transposase. Il y a donc conflit entre deux transcriptions. Mais le combat est quelque peu ingal. Le promoteur "OUT" est un promoteur fort, fonctionnant avec un temps moyen de 70 minutes, alors que l'ARN "OUT" est beaucoup plus instable, avec seulement 40 secondes de vie moyenne. Il se comporte comme un anti-sens* [36]. Cet ARN est susceptible d'empcher la synthse de la transposase, non seulement dans le mme Tn10, mais dans d'autres transposons identiques se trouvant dans la mme cellule. En outre la protine transposase est instable, et n'agit essentiellement qu'en cis courte distance aux extrmits du transposon (sur les deux IS). Aussi lorsque la cellule contient
9 - Le choix d'une gauche et d'une droite tant videmment purement conventionnel !
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plusieurs exemplaires de Tn10, aucune augmentation du rythme des transpositions n'est observe. cela s'ajoute une difficult supplmentaire. La transposase n'est active que sous forme multimrique comportant plusieurs sous-units identiques, et la ralisation d'un polypeptide isol reste insuffisante ! Un autre mode de contrle de la transposition tout aussi tonnant agit par mthylation de l'ADN. Celle-ci intervient sur l'adnine dans le motif 5'GATC3', reconnue par la D-adnine mthylase (sites dam). Il a t question de ce systme dans la premire section de ce chapitre. Une squence dam se trouve dans le promoteur de la transposase (dans l'IS10R) et gne le dmarrage de la transcription. Quand cette squence est hmimthyle sur un brin d'ADN, l'ARN-polymrase se lie plus efficacement, l'expression du gne de la transposase est augmente ainsi que le rythme des transpositions. Pourquoi ce dispositif ? Probablement pour favoriser la transposition juste aprs la rplication de l'ADN, ce qui offre au transposon une meilleure opportunit de sauter d'un rplicon l'autre 10. Ce n'est pas tout. Les petites rptitions inverses de l'IS10R contiennent aussi un site dam. Or la transposase qui est charge de reconnatre ces extrmits ne s'y intresse que si elles sont hmimthyles, donc juste aprs le passage de la fourche de rplication. Ce rglage trs subtil veille donc ce que la transposition ne survienne si possible que juste ce moment-l ! En rsum s'exercent au moins quatre actions pour contrler cette transposition : l'apparition d'un ARN anti-sens, une transposase instable constitue de plusieurs polypeptides, une mthylation sur le site dam du promoteur, une mthylation des sites dam aux extrmits de l'IS10R. Le transposon Tn5 (5700 bp) prsente une situation assez comparable. La partie centrale contient aussi un marqueur de rsistance ( la kanamycine) entre deux lments d'insertion, IS50L et IS50R. Ces derniers ne diffrent entre eux que d'une seule base, marqu d'une toile sur le dessin. La transcription centripte pour une transposase part des deux cts partie d'un promoteur (p) et la disposition est presque symtrique.
IS50L kan
x p1 p2 *
IS50R
p2 p1
p3
Tn5
Le fonctionnement de Tn5 met en jeu non seulement les facteurs du transposon luimme, mais des protines trangres provenant de l'hte. Limitons-nous aux faits marquants. Du ct de l'lment de droite, IS50R. La squence renferme deux 10 - Le chromosome apparat en double avant que les deux cellules se sparent. Dans une bactrie en cours de multiplication rapide, comme le colibacille en milieu favorable, la sparation des cellules est en retard sur la synthse d'ADN, ce qui fait que la cellule peut contenir 4 exemplaires du chromosome et plus.
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promoteurs successifs, p1 qui lance la transcription de l'ARN messager de la transposase, une protine de 476 acides amins, p2 qui est dcal en aval et dtermine un messager plus court tout en utilisant le mme cadre de lecture. Il en rsulte une protine incomplte Inh qui n'a que 421 acides amins au lieu de 476 et n'a pas d'activit comme transposase. Elle se comporte en inhibiteur de la transposition. Son mcanisme d'action est mal connu, mais elle est fabrique en excs par rapport la transposase. Il y a une explication possible. La transposase n'est active que sous forme de multimre (comme celle de Tn10). La protine Inh avec sa longueur un peu plus courte pourrait jouer le rle de sous-unit de la transposase et la protine multimre hybride contenant la fois les sous-units correctes et Inh, serait inactive comme transposase [37]. Par consquent, la prsence de Inh aurait de toute faon une action inhibitrice. Quoiqu'il en soit, c'est probablement un systme de contrle freinant la mobilit de Tn5 comme dans le cas de Tn10. En outre le Tn5 a aussi un contrle de type dam comme dans le cas prcdent. Que fait l'lment d'insertion IS50L dans Tn5 ? La mme disposition est observe puisque la squence est la mme, mis part le remplacement d'une seule base. Or ce changement introduit un codon Stop dans l'ARN messager, une cinquantaine de bases avant le Stop normal. Les protines faites en fonction de p1 et p2 de IS50L sont donc tronques, la transposase est inactive et a une action inhibitrice comme Inh. La transposition dpend donc totalement de la transposase faite par l'autre IS. En outre le changement de base active un nouveau promoteur pour une transcription vers le centre du transposon (de gauche droite sur le schma). L'expression des gnes contenus dans cette partie est alors sous la dpendance de IS50L. En rsum IS50R contrle la transposition, IS50L dirige l'expression des gnes transports par le transposon Tn5. Comment la transposition de Tn5 et Tn10 est-elle ralise ? Ces units et celles du mme type sont mobiles par transposition conservatrice selon le principe du "couper/coller". L'lment transposable est excis du site de dpart en laissant derrire une cassure irrparable entranant la destruction du rplicon donneur.
ADN de dpart Tn1O deux brches ADN cible
coupure sur les 2 brins
insertion
rparation ligation
rptitions directes
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Au site d'insertion sont cres des coupures dcales. L'lment s'y installe, les brches sont rpares et ligatures. Le nombre de transposons n'a pas augment. Il ne le sera qu la faveur des divisions cellulaires. On sait que la transposition entrane une duplication de la petite squence cible. Le transposon Tn10, dcouvert en 1968 par WATANABE et coll., a donn lieu de nombreuses recherches. Il a la particularit de s'installer des endroits dtermins et l'on retrouve donc de chaque ct d'un Tn10 aprs transposition une squence appartenant au mme consensus de 9 bases (o N dsigne n'importe quelle base), soit NGCTNAGCN>, et sur le brin complmentaire NGCTNAGCN> 11. Le passage du transposon d'une molcule d'ADN une autre est un vnement rare par rapport au rythme des divisions celulaires : un Tn5 ou un Tn10 prsent dans le chromosome se voit rpliqu en mme temps que lui. Le mode de transposition garantit qu'il n'y aura pas daugmentation du nombre des transposons. C'est heureux pour la cellule, car la prsence d'un transposon introduit des anomalies, telles que des promoteurs supplmentaires ou des signaux d'arrt de transcription. Il en rsulte au niveau des gnes voisins des expressions sauvages et des perturbations dans les rgulations, affectant les rglages de l'activit cellulaire. Si maintenant on revient la structure des deux IS terminaux de Tn5, chacune est borde comme il se doit par des rptitions inverse de 19 bp, qui devraient tre identiques, au nombre de 4 par transposon. Elles ne le sont pas exactement. La squence la plus externe de chaque IS diffre de celle qui est en contact avec la partie centrale de Tn5 par 7 positions. Cependant ces deux morceaux de squence sont reconnus par la transposase dans IS50R aussi bien que dans IS50L. La transposase est une enzyme perfectionne qui catalyse plusieurs rarrangements dans l'ADN. Elle est aide par d'autres protines provenant de la cellule hte : Dam (la mthylase dj rencontre), DnaA implique dans l'amorage de la rplication du chromosome, et des protines qui ont la proprit d'induire des courbures dans l'ADN (Fis, IHF). Il s'agit de mcanismes de reconnaissance trs subtils, car le simple changement d'une base dans ces portions de squence relativement courtes amne immdiatement de fortes perturbations ou abolit l'activit de la transposase. Lentre d'un transposon dans un plasmide est certainement un facteur d'volution dans une population. Voici un dessin montrant les deux faons qu' un Tn10 de s'insrer dans un plasmide. L'opration peut conduire l'apparition d'un nouveau transposon de grande taille, ici avec des lments d'insertions retourns mais fonctionnels. Un dtail retenir, parce que l'analyse des gnomes rvle que des segments importants dans les plasmides ou le chromosome figurent dans ce qui semble tre un ancien trs grand transposon.
11 - Lu dans lautre sens sur lADN, le consensus est donc symtrique.
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Tn10 tet+ IS10L IS10R IS10L IS10L
Tn10
IS10R Tet+ IS10R
gnes plasmidiques gnes plasmidiques
Plasmide porteur de Tn10

Le Tn3 est un transposon de Classe 2, dcouvert en 1974 par HEDGES et JACOB, par son pouvoir de transmettre un facteur de rsistance la pnicilline de plasmide plasmide ou de plasmide chromosome. Le Tn3 est non-composite, car il correspond une seule squence d'insertion qui aurait t dilate jusqu' 5 kb environ de faon hberger des gnes supplmentaires non ncessaires la transposition.
tnpA ITR tnpR res ampR ITR
GUA
58
II
III
AUG
+ 105
ARN
ARN
Transposon Tn3
Aux extrmits se trouvent des squences rptes inverses de 38 bp (ITR). Ici intervient une situation nouvelle : Tn3 subit une transposition rplicative, o un exemplaire reste au dpart tandis que le second s'installe ailleurs. Deux protines essentielles sont codes par le transposon dans des directions divergentes : une transposase (TnpA) et une rsolvase (TnpR). La rgion res a une fonction particulire dans la rplication, et c'est l que se chevauchent les deux promoteurs, un pour la transcription de tnpA, l'autre pour tnpR, comme l'indique le dessin. La rgion res est dtaille. Les sites I, II et III sont reconnus par la rsolvase, le site I tant res proprement dit. Les deux ARN divergents sont indiqus, ainsi que la position relative du codon marquant le dbut de la traduction, aux bases 58 et + 105 du site res. La rplication s'effectue par une succession de coupures et d'changes. Une jonction runit l'ADN donneur et l'ADN cible au niveau des brches formes. La structure forme est dite en X d'aprs les images en microscopie lectronique. Elle est soumise ensuite rplication et rparation. Elle correspond deux fourches de rplication qui avanceraient l'une vers l'autre. Le transposon et l'ADN cible tant
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initialement sur deux rplicons diffrents (par exemple deux plasmides), une recombinaison faisant suite la rplication forme un cercle unique, le co-intgrat. On y retrouve les deux rplicons et deux exemplaires du transposon. La rplication n'a pas affect que le transposon de dpart, mais aussi la squence cible qui apparat maintenant en double.
transposon cible
coupures
soudures bout bout
figure en X
co-intgrat rplication, rparation
Figure en X, rplication, formation d'un co-intgrat

Le co-intgrat correspond deux cercles d'ADN entortills l'un dans l'autre et incapables de se sparer. Pour mener bien la sparation, il est ncessaire de faire dans un cercle une coupure suivie immdiatement d'une nouvelle soudure. Cette tche dlicate revient la rsolvase, assiste par des protines cellulaires qui participent l'entretien de l'ADN. Lorsque le co-intgrat a t dml, le transposon initial se retrouve intact dans son environnement de dpart, mais sa nouvelle copie transporte dans l'autre rplicon est borde de deux squences rptes de mme orientation.
cointgrat
deux rplicons
recombinaison
+
transposon de dpart nouveau transposon
La transposase dmle le co-intgrat

Ces mcanismes comportent donc une rplication et la rsolution du co-intgrat. Ils dterminent une multiplication du transposon qui est plus rapide que le seul rythme
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des divisions cellulaires. L encore interviennent des mcanismes rgulateurs qui empchent une multiplication trop intense des transposons qui aboutirait la mort cellulaire. Des complications supplmentaires surgissent quand certaines bactries, contrairement la majorit d'entre elles, ont plusieurs chromosomes. Ceci facilite les recombinaisons et les transpositions. Certains Brucella ont deux chromosomes (2100 et 1200 kb) portant l'un et l'autre des gnes essentiels la survie. D'autre part les bactries en croissance rapide ne sont pas strictement haplodes et plusieurs copies du gnome peuvent coexister diffrents stades de la rplication quand celle-ci est en avance sur les divisions. Chez certaines espces la polyplodie est la rgle mme au repos. C'est le cas de Deinococcus radiodurans, o il y a 4 ou 5 copies du chromosome, ce qui lui permet de reconstruire rapidement des exemplaires corrects aprs une exposition prolonge des radiations. L'ADN du bactriophage Mu est comparable un trs grand transposon de classe 2 (38 kb). Il est capable de s'intgrer peu prs n'importe o dans le chromosome du colibacille, contrairement l'ADN Lambda qui s'installe en un site prcis. Le transposon Mu nat de l'entre d'une particule infectieuse, s'intgre en prophage par un mcanisme de transposition conservatrice partir de l'ADN viral, et se transmet comme un prophage au cours des divisions cellulaires. Comme dans Lambda, la plupart des gnes du transposon Mu restent dormants pendant le stade lysogne. Ils s'expriment aprs induction au cours de la phase lytique, conduisent alors de nombreuses transpositions rplicatives et la synthse de nouvelles particules infectieuses. La prsence du prophage Mu dans un gnome provoque un certain nombre d'accidents gntiques, notamment des dltions. Il existe donc une vaste gamme d'lments d'ADN mobiles, allant des I S rudimentaires au transposons de la classe 1, ceux de la classe 2 jusqu' des difices gntiques au programme perfectionn comme Mu. On peut s'interroger sur la signification des lments transposables dans la nature et leur maintien dans les cellules o leur prsence pourrait s'accompagner de divers dsordres. Nous avons vu que la transposition est limite un taux faible, le cas du phage Mu en phase lytique mis part. En fait il existe dans les populations de microorganismes un impratif trs important qui est celui de connatre des mutations leur permettant d'voluer. Dans une population contenant un nombre immense de cellules, chaque vnement mutationnel a de grandes chances d'apporter des effets dltres, et les cellules correspondantes seront limines par slection sans que le volume de la population s'en ressente vraiment. Mais les mutations nouvelles peuvent aussi amener des combinaisons favorables, permettant par exemple de mieux rsister des conditions adverses ou d'acqurir une activit enzymatique nouvelle ou plus performante. Il existe de nombreux mcanismes mutationnels. La mobilit de l'ADN est l'un d'eux. Toute cellule amene se multiplier plus rapidement peut engendrer une descendance capable de conqurir peu peu le milieu. Le passage d'information gntique d'une cellule une autre par insertion dans des plasmides et conjugaison est un mcanisme capable d'acclrer la propagation des trouvailles utiles. La transposition fait donc partie des moteurs de l'volution, en particulier dans l'apparition de formes comptentes pour effectuer une biodgradation.
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Il est intressant de constater que toute situation de stress impose une population tend stimuler la fois les mcanismes de rparation et les changes d'ADN. Par exemple la rponse SOS dclenche chez le colibacille par irradiation ultraviolette provoque l'induction de nombreux gnes dont celle des gnes umu dont l'expression conduit une augmentation du taux de mutation. Un tat de stress augmente aussi le taux de transposition de certains lments. Il s'agit donc bien d'une rponse de dfense permettant d'explorer des issues possibles. Sur des milliards et des milliards d'individus, peu importe que la plupart des mutants disparaissent aprs mutation pouvu que quelques cellules tirent le numro gagnant et perptuent la ligne 12.
2.7 - INTGRONS ET CASSETTES

Comment un micro-organisme peut-il devenir rsistant un facteur toxique tranger ? Pour que sa proprit de rsistance reste stable dans la population considre, il est ncessaire que la modification gntique soit transmise la descendance. Les individus rsistants seront donc slectionns et leur proportion ne fera quaugmenter au sein de la population. Il y a plusieurs faons de rsister lagression chimique exerce par les antibiotiques ou par des polluants divers. Lune delles est de modifier la cible intracellulaire que lagent toxique vient perturber. Un exemple classique est la streptomycine, dont laction paralyse la synthse protique des procaryotes en agissant au niveau de la protine S12 des ribosomes. Une mutation gntique altrant cette protine sans lser le fonctionnement des ribosomes rend les cellules rsistantes. Un autre mcanisme de rsistance apparat lorsquune ou plusieurs mutations rendent la membrane impermable la pntration de lagent hostile. Enfin lacquisition dune enzyme capable de dtruire ou de neutraliser lagresseur est un mcanisme important dans lapparition de souches rsistantes aux antibiotiques. Un bon exemple est celui des bta-lactamases neutralisant les pnicillines. Dans tous les cas la rsistance nat d'une ou plusieurs modifications gntiques par mutation de gnes prexistants ou par l'apport de gnes nouveaux partir dune origine extrieure. Cette deuxime possibilit est examine ici. Les structures gntiques appeles intgrons ont attir l'attention comme supports de rsistances multiples des antibiotiques. Ce phnomne est une calamit faisant natre des souches pathognes, le plus souvent Gram-ngatives, qui ont acquis la capacit de rsister une batterie d'antibiotiques, utiliss en thrapeutique. Il est devenu clair que les bactries devenaient rsistantes par l'acquisition de gnes nouveaux exprims au sein de la cellule. On s'est aperu que certaines espces pouvaient de la mme faon acqurir des facteurs de virulence, c'est--dire des gnes dont l'expression rendait les bactries pathognes, soit par la formation de toxines, soit par d'autres facteurs facilitant la pntration et la
12 - Comme disait la publicit d'une loterie bien connue, tous les heureux gagnants sont des gens qui ont jou !
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multiplication du germe dans l'organisme infect. Le mme principe utilis par les bactries pour se dfendre peut aussi leur permettre de passer lattaque. Une information gntique trangre ne peut se maintenir et s'exprimer dans la souche rceptrice que si elle s'intgre un rplicon. Encore faut-il que ces gnes soient en aval d'un promoteur ad hoc pour tre exprims. Plasmides et transposons apportent couramment ces promoteurs, et les gnes nouveaux arrivent dans une structure qui est capable d'assurer la fois sa rplication et son expression. Il peut arriver aussi qu'un ou plusieurs gnes soient introduits l'tat "sec" sans tre accompagns du promoteur ncessaire, dans un petit ADN circulaire muni seulement d'une squence d'attachement. Cet ADN porteur est une cassette, incapable de s'exprimer et de se rpliquer si elle n'est pas intgre dans un ADN cible. Ce dernier apporte les fonctions manquantes essentielles, notamment production d'une intgrase, un site spcifique d'attachement et un promoteur. La cassette diffre d'un plasmide par sa taille rduite et son incapacit se rpliquer par ses propres moyens. Elle deviendra fonctionnelle aprs intgration dans un ADN cible servant de structure d'accueil. Celle-ci est appele intgron. Elle assure la fois l'intgration de la cassette et son expression. L'intgration d'une cassette met en jeu une recombinaison spcifique de site 38. On y rencontre trois lments essentiels : une portion codant pour une intgrase (int), un promoteur fort (c'est--dire efficace) et un site d'insertion (attI). L'intgrase travaille spcifiquement sur le site attI, o se fera l'intgration d'une cassette, juste en aval du promoteur, de telle sorte que les nouveaux gnes pourront tre transcrits et exprims. Le dessin indique le modle de base d'un intgron. L'apport d'une cassette constitue la partie variable entre deux zones constantes. Celle de gauche sur le dessin contient les trois facteurs essentiels (int, promoteur fort not (p), et attI). Dans la partie droite figure par le rectangle blanc sont localiss plusieurs facteurs de rsistance. Cette zone caractrise l'intgron. Dans ceux qui ont une structure complexe, cette partie peut tre assez longue.
zone o se feront des insertions de nouveaux gnes p attI
int
gnes de rsistance
La structure de dpart d'un intgron
On peut voir qu'il y a en fait deux promoteurs (p) en partie superposs sur le mme segment d'ADN, mais l'un concerne la transcription du gne de l'intgrase vers la gauche (int et flche en pointill), l'autre vers la droite pour la transcription des nouveaux gnes qui seront introduits dans la rgion indique en amont de gnes prexistants qui sont des facteurs de rsistance [39]. Leur promoteur est efficace et fonctionne beaucoup plus souvent que celui de l'intgrase en direction des gnes introduits partir des cassettes. L'existence de transcriptions divergentes partir de promoteurs partiellement chevauchants est une disposition banale chez les bactries. L'une d'elles commande souvent la synthse d'une protine rgulatrice, qui
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contrle la transcription des gnes en direction oppose. La protine rgulatrice est ici l'intgrase qui permet l'installation de la cassette. Les deux transcriptions opposes n'utilisent pas comme modle le mme filament d'ADN. Un promoteur est reconnu sur l'un d'eux, l'autre sur le brin complmentaire. Comment les cassettes sont-elles constitues ? l'tat libre dans le cytoplasme bactrien, une cassette est donc un petit ADN circulaire dpassant rarement 1 kb, renfermant un gne de rsistance (par exemple un antibiotique) sans promoteur mais avec une squence d'insertion attC. Un gne tranger transport ne peut pas s'exprimer tant qu'il n'a pas t introduit dans un intgron. Le site attC s'appelle aussi lment "59 bases", bien que sa longueur varie d'une cassette l'autre de 57 141 bp. Sa structure est celle d'un palindrome imparfait et contient un lment de squence consensus retrouv dans attI, GTTRR(C ou G)RY (o R dsigne une purine A ou G, et Y une pyrimidine C ou T). L'intgrase reconnat la fois la partie de l'intgron o se trouve attI et le site attC dans une cassette. Celle-ci sera positionne par coupure et recombinaison entre les sites att.
attC premire cassette intgrase
int
attI gne 1 la rgion attI
gnes de rsistance dcals
la rgion attC
3
site p ... AAAACAAAG TTAGATGCAC ... ... RYYYAAC ... TTTTGTTTC AATCTACGTG ... ... YRRRTTG (ICS) int site p point dchange
5
variable
G TTRRGC C AAYYCG (CS) point dchange
Insertion d'une premire cessette

Le dessin montre des dtails de squence aux rgions attI et attC, au niveau du consensus critique GTTRR. Les petits rectangles en noir soulignent les courtes rgions qui se ressemblent entre attI et attC, autorisant ainsi la recombinaison. La sparation se fait entre G et T [40]. Deux rptitions inverses sont visibles aux extrmits de la rgion attC, qui est donc partiellement palindromique aux deux bouts. Elles sont dsignes par CS ( core site) et ICS (inverted core site). Une fois intgr, le gne apport par la cassette peut tre transcrit en mme temps que les gnes qui taient dj prsents. La rgion constante reprsente par le rectangle blanc est transcrite partir de un ou plusieurs promoteurs situs plus loin sur l'ADN qui n'ont pas t reprsents.
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Une proprit remarquable des intgrons est de pouvoir accueillir successivement plusieurs cassettes, conduisant un empilement de gnes placs la queue leuleu et accumulant des facteurs de rsistance des antibiotiques ou des facteurs toxiques. Comment cela se peut-il ? La rgion attC apporte par chaque cassette contient le mme consensus (CS) que celui qui est dans le site d'intgration initial attI. Ce consensus est donc reconnu comme un site d'intgration. Le dessin montre l'arrive d'une deuxime cassette. L'insertion peut se faire sur attI ou un attC, avec une prfrence pour le premier. La figure montre qu'il y a deux possibilits.
attC deuxime cassette
int attI int attI gne 2 attC gne 1 attC gne 1 attC gne 2 attC
Insertion d'une deuxime cassette

Chaque intgron continue faire son intgrase, laquelle fait partie d'une famille de protines o l'on reconnat dj plus d'une centaine de membres [41], dont celle du phage Lambda. Toutes ces enzymes fonctionnent sur le mme principe qui est potentiellement rversible [42]. Dans un intgron la mme enzyme qui catalyse l'insertion d'une cassette peut inversement la librer. Cette cassette peut se voir nouveau rcuprer par un autre intgron. Deux plasmides porteurs d'intgrons ont ainsi la possibilit d'changer des gnes, et comme les plasmides sont souvent transmissibles d'une cellule l'autre, on peut voir ici l'un des mcanismes de propagation et de regroupement des facteurs de rsistance. Ce mcanisme de base prsiderait l'apparition des rsistances multiples aux antibiotiques et autres agents antibactriens. On sait que l'utilisation des antibiotiques des fins thrapeutiques est devenue une vritable course aux armements o la propagation rapide d'espces pathognes rsistantes cre une situation proccupante. Parmi les germes infectieux isols en milieu hospitalier sont des souches rsistantes une gamme tendue d'antibiotiques, notamment Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. Tout porte croire qu'il s'agit de l'exploitation par le monde microbien d'un dispositif prexistant en rponse des agressions de toutes sortes. On ne sait pas encore quelle est l'importance exacte des intgrons dans l'adaptation des bactries, mais plusieurs niveaux de complexit leur sont connus [43]. Il y a trois classes d'intgrons distingues par les homologies entre gnes d'intgrase.
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Les diffrents types d'intgrase conservent une homologie de squence (45-58%) qui laisse supposer une divergence volutive ancienne, certainement bien antrieure l'utilisation des antibiotiques des fins thrapeutiques par l'homme. La multiplication des rsistances multiples dans les lignes bactriennes pathognes aurait bnfici d'un terrain favorable utilis vraisemblablement lors de la propagation d'autres gnes. Les intgrons ne sont pas mobiles par eux-mmes, et n'occupent pas une place quelconque sur l'ADN. En fait ils sont souvent associs des squences d'insertion appartenant des transposons ou des plasmides transmissibles par conjugaison. Il devient alors vident que leur transfert de cellule cellule, voire entre espces distinctes, n'en est que facilite. Les intgrons de classe 1 correspondent grosso modo la structure de base indiqu par la figure, et comportent une zone variable entre deux segments constants. La rgion conserve comprend classiquement un gne de rsistance au bromure d'thidium (qacE), un gne de rsistance aux sulfamides (sul I) et un gne de fonction non connue (ORF5). La rgion variable peut ne contenir aucun gne, ou au contraire renfermer la suite 8-10 gnes de rsistance provenant d'autant de cassettes.
promoteur qacE sul I ORF5
int intgrase
attI rgion variable (insertion de facteurs de rsistance)
attC rgion conserve
Intgron de classe 1
On sait maintenant que les intgrons sont rpandus dans les populations bactriennes et que les gnes transports ne concernent pas uniquement la rsistance aux antibiotiques. La dissmination et l'insertion de facteurs mtaboliques par intgrons interposs sont des mcanismes plausibles d'adaptation gntique [44]. On s'interroge sur l'origine volutive d'un tel appareil. Le modle de base que nous avons rencontr, sans gnes nouveaux intgrs, se rencontre dans l'intgron In0 du plasmide pVS1 transport par Pseudomonas aeruginosa. Les gnes conservs (par exemple sul I) auraient une origine commune. L'intgron aurait ensuite volu par apport de nouvelles cassettes 13, et les structures produites auraient t conserves par pression slective [45]. Les choses se compliquent un peu dans le cas des intgrons de classe 2, car ils contiennent des gnes de transposition. Ils font partie du transposon Tn7 et de ses
13 - La plupart des intgrons de ce type descendent d'une version o le gne qacE a t tronqu par l'arrive du gne de rsistance aux sulfamides, sans doute postrieure. On remarque en effet que l'introduction de qacE a pu se produire vers 1920, alors que l'acridine orange tait utilise des fins thrapeutiques. L'avnement des sulfamides est postrieure (aprs 1930). L'intgron ainsi constitu est peut-tre un ancien transposon, ou le reste d'un phage lysogne.
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analogues. On y retrouve les mmes gnes imports que dans les intgrons de type 1, mais en nombre plus limit. Les gnes de rsistance codent pour des enzymes capables d'hydrolyser leur cibles (exemples : bta-lactamases), de les modifier (cas des aminoglycosides). Parfois ils portent d'autres fonctions. Citons le gne cmlA qui dtermine une rsistance au chloramphnicol par le jeu d'une protine membranaire qu'on pense tre une protine d'expulsion de l'antibiotique 46. La superposition de la transposition et du mcanisme de propagation de cassettes constitue une redoutable machine de guerre assurant la slection rapide de formes pathognes rsistantes une quantit de choses ! On a assist une diversification des bta-lactamases qui hydrolysent les pnicillines. Il en rsulte une course aux armements thrapeutiques avec production de nouvelles pnicillines de synthse. Rcemment est apparue une rsistance au carbapenem (ou meropenem) et produits similaires par une bta-lactamase d'un nouveau type. Transport par plasmide, son gne se propage chez Serratia et Shigella par intgron interpos, porteur d'une intgrase appartenant une famille d'un troisime type. Nous avons remarqu que les intgrases catalysent les allers et retours des gnes entre intgrons et cassettes. la base de ces changes se trouvent les segments 59 bases signals plus haut, dsigns par attC. Des squences homologues de attC (de l'ordre d'une centaine de bp, symtrie imparfaite, et portant aux extrmits GTTRRRY) sont trouves chelonnes rptition sur le chromosome de certaines bactries, et localises sur ce qui semble tre un prophage. On pense donc un vaste intgron qui serait vhicul par transmission virale. La situation se complique lorsque ces chapelets de gnes peuvent contribuer aussi bien une adaptation physiologique nouvelle qu' l'acquisition d'une virulence comme agent pathogne. Nous en arriverons donc la notion de super-intgron. Le cas le plus remarquable est celui de Vibrio cholerae. Deux srovars seulement sont les agents du cholra, diarrhe pidmique souvent mortelle. Le genre Vibrio hberge de nombreuses espces bactriennes htrotrophes dans les ocans, les eaux ctires et les estuaires. Leur intervention dans les cycles nutritifs serait considrable en milieu marin [47]. Bien qu'elles soient responsables d'invasions infectieuses chez les poissons, les mollusques et les mammifres, leur biologie est incompltement connue. L'agent du cholra, V. cholerae, se maintient en milieu aquatique entre les pidmies, se diversifie en nombreuses souches, passe par des phases de dormance o sa prsence est sournoise, et circule avec le zooplancton. Son gnome a t entirement squenc [48], et l'on espre en obtenir une moisson de renseignements sur l'adaptation gntique et la variabilit en gnral. Ce gnome est constitu de deux ADN circulaires, le chromosome 1 (2961 kb) et le chromosome 2, plus petit (1072 kb). Celui-ci serait peuttre un ancien mgaplasmide acquis au cours de l'histoire trs ancienne de l'espce. La notion de super-intgron a t forge pour dsigner une situation tonnante concernant le chromosome 2. Il renferme une multitude de squences de 123-126 kb, imparfaitement symtriques et homologues d'une squence de type "59 bases" du genre attC, associe un intgron de Pseudomonas. Ces lments de squence sont dsigns par VCR (ou Vibrio cholerae repeated sequence) et alternent avec
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des gnes qu'on suppose reprsenter autant de cassettes insres dans un norme intgron [49]. Les squences VCR sont reconnues par l'intgrase de type 1 cite antrieurement. Le nombre de ces petites squences est considrable, suprieur une centaine, et l'on y rencontre chaque fois le consensus GTTRRRY considr comme une cible d'intgrase. De bonnes candidates pour recevoir des cassettes ! L'ensemble reprsente 125 kb, et contient 216 ORF dont les fonctions n'ont pas toutes t dtermines [50]. Il y a des facteurs de rsistance, une hmagglutinine, une toxine thermostable, une lipoprotine, des nuclases et mthylases de restriction ainsi que divers facteurs mtaboliques. Certaines cassettes sont orientes en sens inverse, d'autres sont prsentes en exemplaires multiples. L'une d'elles, de fonction inconnue, a 532 pdb et il en existe 24 exemplaires. Mais la plupart de ces cassettes intgres ne sont prsentes qu'une seule fois et ont la mme orientation en amont d'une squence VCR. Si un tel ensemble est bien un intgron, il est forcment sous la dpendance d'une intgrase. Le gne de celle-ci, intI4, a t localis et prsente la mme disposition que dans un intgron classique [51]. Au voisinage se trouvent aussi un promoteur et un site appel attI4. Tout porte croire qu'il s'agit d'une norme machine gntique pour incorporer des cassettes.
intI4 intgrase gnes impliqus dans la synthse des protines RYYYAAC attI4 cassettes (ORF)
VCR 123126 pdb
GTTRRRY
Le gne intl4 et les squences rptes (VCR) chez Vibrio cholerae

Cependant la situation est probablement plus complique que dans les intgrons ordinaires, et la transcription d'ensembles aussi grands ne peut se faire qu'au moyen de promoteurs secondaires chelonns ici et l. Une recherche systmatique a rvl que d'autres espces de Vibrio, notamment V. mimicus et V. metschnikovii, contenaient des squences VCR et des structures comparables. Certaines cassettes se retrouvent chez plusieurs espces, d'autres sont plus spcifiques. Pour rsumer de faon simplifie, on peut tirer les conclusions gnrales suivantes. Les ensembles gntiques interprts comme des super-intgrons se retrouvent dans une varit d'espces dbordant le cadre de Vibrio (Xanthomonas, des Pseudomonas), mais paraissent provisoirement plus dvelopps chez les espces pathognes. Les ORF des cassettes intgres dans le gnome concernent essentiellement des facteurs de dfense ou d'adaptation. Leurs fonctions restent souvent obscures, dans la mesure o elles ne peuvent pas encore tre dtermines par comparaison avec des squences de facteurs connus. L'examen des squences et des intgrases suggre que l'acquisition des super-intgrons est dj ancienne, bien antrieure l're industrielle et le dveloppement de la chimie
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moderne. Les caractristiques des cassettes sont en faveur d'une acquisition externe. Le mcanisme d'entre et d'installation de cet ADN tranger reste obscur, mais confre probablement un pouvoir d'adaptation important qui pourrait jouer un grand rle dans l'environnement et amliorer lefficacit des bactries au cours des biodgradations. Le Vibrio Cholerae prsente une particularit capitale en rapport avec son caractre infectieux dangereux. Ce sont les lots de pathogncit (ou Pais), dont la nature a dj t signale dans ce chapitre. Ils sont indpendants du super-intgron. Ce sont des regroupements considrs comme des apports gntiques extrieurs o les facteurs ncessaires la virulence forment un seul bloc. La liste des cas rpertoris de ces lots ne cesse de grandir. Les premiers ont t dcouverts chez les entrobactries [52] avant d'tre observs chez le vibrion [53]. Les espces pathognes concernent aussi bien les plantes que le rgne animal et nous intressent ici dans la mesure o les mcanismes mis en jeu pourraient expliquer ladaptation des espces de lenvironnement aux conditions nouvelles. Nous retrouvons encore le principe des transmissions horizontales de linformation gntique, et pas seulement entre bactries. La dissmination toujours possible de gnes d'une espce une autre est apparue soudain comme un phnomne inquitant mis en avant dans les polmiques concernant les plantes cultives gntiquement modifies, et les risques possibles de dispersion intempestive de facteurs gntiques. Mais, dira-t-on, les super-intgrons sont-ils aussi courants que cela ? La rponse est trs probablement oui, au moins chez les bactries de la famille des vibrions. Le dveloppement de la gnomique permet de reconnatre des super-intgrons dans divers groupes de protobactries gamma : Pseudomonas, Nitrosomonas, Xanthomonas, Photobacterium, etc. Chaque structure possde son gne d'intgrase intI transcrit en sens oppos. Ces intgrases sont spcifiques. On se trouve maintenant devant un grand nombre d'intgrases rpertories. On en a une preuve convaincante de lanciennet des intgrons et super-intgrons en construisant un arbre volutif l'aide des squences intI connues, et en le comparant ceux qu'on peut dj btir avec des marqueurs peu enclins subir un transfert horizontal, celui de l'ARN 16S et rplT, un gne qui code pour la protine L20 des ribosomes. Les arbres obtenus montrent de fortes ressemblances [54], ce qui montre que leur diversification ne date pas d'hier. Dans le super-intgron de V. cholerae, les squences rptes ou VCR sont lies la spcificit de l'intgrase correspondante. Autres intgrases, autres squences rptes. La recherche systmatique de ces squences a conduit une nomenclature conventionnelle (voir XXR*). Toute rptition de squence favorise les changes par recombinaison homologue, ou encore peut conduire des dltions. Les intgrons ne sont pas essentiels aux transferts de gnes si d'autres mcanismes effectuent ce travail, et semblent ne concerner que des fonctions adaptatives, non pas des fonctions essentielles du mtabolisme. Les entrobactries ont peut-tre perdu l'usage des intgrons, conservs dans d'autres groupes. Les rapports frquents entre super-intgrons et bactriophages restent expliquer.
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Tout ceci montre quen introduisant des xnobiotiques dans lenvironnement, on offre la possibilit de nombreux systmes bactriens de mettre profit des mcanismes gntiques sophistiqus qui existaient certainement bien avant lre industrielle.
2.8 - LA BIOLOGIE PARTICULIRE DES BIOFILMS

Un tourbillon d'changes gntiques permet aux populations bactriennes de s'adapter et de slectionner ceux de leur membres qui vont perptuer au mieux l'espce. Mais les cellules ne sont pas isoles et livres elles-mmes. Elles contractent des associations, changent des informations et font collaborer leurs mtabolismes. On ne peut pas examiner valablement le mcanisme des biodgradations dans la nature sans porter un regard sur ces problmes. De trs nombreux organismes des milieux aquatiques et terrestres forment des associations attaches un support, qui peut tre une plante ou un lment du sol. Le rsultat est un biofilm, qui peut se dfinir comme le dveloppement d'une population de micro-organismes adhrente un support et consolide par un ciment commun. La masse des cellules associes peut excder celle du support, et celui-ci peut la limite tre pratiquement inexistant. Par extension, la notion de biofilm est gnralisable des associations formes en eau libre ou une interface, notamment dans ce qu'on appelle le floc ou les granules dans les stations d'puration. Ces regroupements peuvent mettre en contact des champignons, des algues et des protistes et sont cimentes par des substances extracellulaires. Ils contribuent non seulement former le floc mais produire des dpts souvent nuisibles sur la paroi des canalisations. La formation de biofilms a des consquences pratiques importantes, qui vont de la dtrioration de certaines installations industrielles des effets pathologiques. L'inclusion des micro-organismes dans un biofilm leur confre une protection contre les antibiotiques et les antiseptiques et tend rendre leur radication plus difficile. Les microbiologistes ont constat que la plupart des espces microbiennes de l'environnement sont capables de participer la constitution de biofilms. Diffrentes espces se regroupent en scrtant des polysaccharides extracellulaires qui peuvent former 85% de la masse totale, jusqu' constituer de formidables cits poly-ethniques, si on peut dire, ou chacun interagit avec les voisins. Il en rsulte des avantages physiologiques importants dans le domaine des biodgradations, parce que les cellules changent des mtabolites et peuvent tablir un syntrophisme*. Pour amorcer un biofilm, les bactries doivent adhrer au support par des structures de surface, les fimbriae et pili [55]. Les entrobactries (Salmonella, E. coli) ont aussi des fibres distinctes appeles curlis 56. Ces structures se lient des protines faisant partie du ciment entre cellules. Les bactries mobiles par flagelles comme Pseudomonas aeruginosa, migrent la surface du support la recherche d'un terrain favorable. Les cellules se dposent et tendent ventuellement migrer les unes vers les autres en mettant des curlis et des
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filaments protiques rtractiles appels pili de type IV qui les aident se regrouper. L'adhsion doit vaincre les forces lectrostatiques rpulsives entre leur surface communment anionique et les nombreux matriaux porteurs de charges ngatives. Les polymres extracellulaires contribuent rduire ces forces contraires. L'adhsion ou adhrence peut tre passive ou active. Dans l'adhrence passive, les bactries ont dj des proprits de surface qui permettent leur attachement immdiat. Dans l'adhrence active au contraire, les bactries sont attires par des forces de VAN DER WAALS ou autres mais ne s'attachent pas aussitt trs solidement. Une faible agitation du milieu (ou le mouvement des flagelles) suffit les dtacher rversiblement. L'adhrence active devient efficace dans une deuxime phase o l'attachement prend un caractre irrversible et obit un mcanisme complexe fond sur un changement des proprits de la surface cellulaire. Ce rsultat dpend de l'expression d'un ensemble de gnes et rappelle le phnomne de diffrenciation des cellules qu'on voit dans les tissus animaux et vgtaux. Ce phnomne a t bien mis en vidence l'aide de Pseudomonas marins sur des surfaces de polystyrne [57]. Certaines espces comme les Planctomyces* ont un cycle d'alternance entre stade mobile et stade fix. On peut voir la fixation des bactries et la fabrication d'un biofilm comme la rponse un tat de stress. Le biofilm une fois form est un havre de protection contre des conditions adverses prsentes en milieu libre. Les surfaces colonises, qu'il s'agisse de verre, de silicates, de plastiques, de bois ou autres, ne sont jamais absolument "propres", mais rapidement tapisses par de fins dpts de molcules organiques. Celles-ci sont reconnues par la surface des bactries. Un clairage intressant a t apport par un groupe lyonnais (P. LEJEUNE l'INSA) oprant sur le colibacille [58]. Dans les cultures en milieu libre de E. coli K12, dpourvu de tendance se fixer, apparaissent progressivement des colonies sur les parois de verre ou de plastique. Ces biofilms sont forms de cellules qui ont subi une mutation. L'tude a montr que celle-ci a eu lieu dans OmpR, une protine de contrle pour laquelle des explications sont donnes en glossaire. Elle est un peu la gardienne des conditions extrieures comme la pression osmotique, l'agent de contrle de la synthse des porines et d'autres facteurs. Dans le colibacille K12 libre, OmpR entrave la formation des curlis et c'est pourquoi sa modification par une mutation ponctuelle lve l'inhibition et encourage la prparation d'un biofilm. La protine OmpR fait partie d'une large gamme de rgulateurs dont nous trouverons des exemples dans les autres chapitres. Le principe de base est presque toujours celui-ci. Une protine dtecte une situation et sert de capteur. Elle modifie une protine rgulatrice qui intervient sur la transcription d'une srie de gnes, donc sur leur expression. OmpR transmet son signal dans plusieurs direction. Dans le cas de l'adhsion, la seconde protine rgulatrice est RpoS. Celui-ci a une action multiple dont la philosophie gnrale est d'accrotre la rsistance des cellules, et c'est bien ce qui se passe quand elles forment un biofilm, la formation des curlis tant encourage par RpoS quand OmpR lui en a donn l'ordre. Quels sont les signaux perus pour l'installation d'un biofilm ? Il y en a plusieurs. On a pu montrer que certaines bactries peroivent un contact comme un signal qui va les inciter passer du stade de nageuses libres la formation d'un difice multicellulaire. Un autre signal est le stress dclench par une surpopulation. Les
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cellules communiquent entre elles par mission de substances fonctionnant un peu la manire des hormones (quorum-sensing signals) et reconnues par des rcepteurs de surface. Les molcules de signalisation sont du type acylhomosrinelactone 59. Elles sont produites en continu par les cellules, traversent la membrane et s'accumulent dans le milieu o leur taux est jaug par les cellules individuelles. Au-dessus d'un certain seuil d'intensit du signal sont induits des gnes qui commandent une rponse la surpopulation. La formation d'un biofilm fait partie de ces rponses qui peuvent prendre plusieurs formes selon les espces. Chez Ps. aeruginosa, l'induction du gne algC commande l'laboration dans le biofilm du principal polymre de la matrice, qui est l'alginate. Le dmarrage d'un biofilm est donc une affaire complexe dont on a pu montrer qu'il tait sous la dpendance d'une modification du taux d'expression d'un grand nombre de gnes [60]. Cette question a des prolongements assez graves quand il s'agit d'espces pathognes dont le pouvoir infectieux est pilot en grande partie par un tat de stress. La scrtion de toxines est l'une de ces ractions adaptatives en rponse un dficit en fer ou en nutriments, ainsi qu'aux ractions de dfense de l'hte. Un aspect fascinant des relations entre les cellules est l'existence de signaux capables de dtecter la proximit de cellules trangres. Une bactrie individuelle serait capable distinguer les signaux mans de la mme espce de ceux des autres [61]. L'emploi de substances analogues capables de flouer ces mcanismes de reconnaissance pourraient servir d'outils pour lutter contre la formation de biofilms partout o leur prsence cre des problmes. Un biofilm n'est pas un milieu homogne. Au sein des biofilms peuvent se concentrer des relations physiologiques complexes entre espces. Par exemple la biodgradation de l'alcool benzylique par Acinetobacter peut associer celui-ci Pseudomonas putida qui consomme l'acide benzoque produit par le premier et l'en dbarrasse. D'importantes diffrences de conditions physiologiques existent dans la masse du biofilm. Les couches les plus profondes proches du support sont beaucoup plus pauvres en oxygne que les couches superficielles. Des mesures par micro-lectrode ont montr que la teneur en O2 peut varier sur des distances extrmement courtes, de moins d'un dixime de millimtre. Les bactries sont organises au sein de la matrice sous forme de microcolonies parcourues par de minuscules veines de liquide assurant le transport des nutriments. Enfin chaque biofilm apparat comme un monde o ses occupants ne restent pas des emplacements figs, mais migrent au sein de la masse et en change avec l'extrieur selon des rgles encore mal cernes. L'effet protecteur exerc sur les cellules au sein d'un biofilm a des consquences importantes [62]. Les substances antibiotiques doivent diffuser dans la matrice compacte et leur concentration en profondeur est plus faible qu' la surface. Leur efficacit est rduite d'autant. Dans le cas des pnicillines, il peut arriver que le biofilm contienne des germes comme les staphylocoques, dtenteurs d'une bta-lactamase. L'antibiotique est alors dtruit plus rapidement avant d'atteindre les couches profondes du biofilm. En outre ces antibiotiques n'ont que peu d'action sur les cellules des couches profondes qui ont cess de se diviser. Les cellules qui ne se divisent pas ou sont fatigues gardent leur vieille paroi en l'tat et ne sont pas inquites. Elles restent insensibles l'antibiotique tant qu'elles ne font pas de nouvelle paroi.
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L'antibiotique reste alors sans effet sur les couches profondes du biofilm. Un effet protecteur existe aussi pour les antiseptiques, qui doivent neutraliser progressivement les diffrentes couches du biofilm avant d'accder certaines cellules [63]. La formation d'un biofilm offre des facteurs favorables aux changes gntiques entre cellules. On a pu montrer que la prsence de plasmides et la conjugaison cellulaire induisent le dveloppement de tels rassemblements [64]. Pourquoi ? La conjugaison bactrienne est un moteur efficace de la transmission horizontale de gnes, en particulier de ceux qui autorisent une biodgradation. Autant dire qu'elle facilite l'adaptation d'une population entire s'attaquer de nouveaux substrats. Inversement la conjugaison ne peut avoir lieu qu'au hasard de la rencontre entre cellules partenaires. Sa probabilit est faible dans une population dilue. La propagation d'un plasmide est au contraire beaucoup plus facile quand les cellules sont en contact les unes avec les autres. Comme les plasmides codent communment pour des adhsines et pili, l'induction des gnes responsables ne fait que renforcer le pouvoir conjugatif et l'adhsion des cellules les unes aux autres.
cellules donneurs
cellules transconjugantes (en noir) dans un biofilm cellules rceptrices
support
Le dessin en voque le principe. La conjugaison partir d'un donneur entrane la propagation du plasmide et des facteurs qui lui sont lis. Les transconjugants expriment les proprits qui permettent au biofilm de se consolider, en particulier la production de polysaccharides. En mme temps ces transconjugants acquirent le pouvoir de fabriquer de nouvelles enzymes dont les gnes sont ports par le plasmide. On peut voir que cette question a de profondes rpercussions sur la comprhension de certains mcanismes environnementaux. Les micro-organismes, trs souvent associs sur des particules solides, notamment dans les sols, forment de vritables cits multicellulaires o s'tablissent des changes gntiques ainsi que des relations mtaboliques complexes. C'est pourquoi les recherches sur les biofilms ont pris depuis quelques annes une importance de premier plan, en particulier pour mieux comprendre et piloter certaines biodgradations. L'immobilisation artificielle des cellules sur un support permet d'exploiter les proprits spciales constates dans les biofilms. L'avantage des bactries immobilises est souvent leur meilleure rsistance aux conditions adverses. On a dcrit de nombreuses techniques d'immobilisation, qui consistent notamment
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inclure les cellules dans un gel, ou crer des ponts covalents entre les constituants de la surface cellulaire et le support. Il est ventuellement question de reproduire de faon contrle les proprits constates dans le floc des stations d'puration. La formation de ces flocs est une opration tout fait essentielle du traitement des eaux uses. Elle est assure par des bactries floculantes qui s'agrgent entre elles pour donner des assemblages qui sont la base des boues. Ces flocs sdimentent et se concentrent au cours de la phase de dcantation, en entranant des matires organiques, des phosphates, etc. Parmi les bactries floculantes sont des nitrifiantes, qui jouent un rle cl dans l'oxydation de l'ammoniac en nitrite puis en nitrate. La structure des flocs est encore imparfaitement comprise. Des recherches sont faites pour amliorer leur efficacit et permettre une meilleure diffusion des substances dissoutes dans la masse des particules. La dcantation des flocs est parfois perturbe par le dveloppement de bactries filamenteuses, dont Microthrix parvicella et Sphaerotilus natans, qui perturbent le bon fonctionnement des stations d'puration. La gestion de ces problmes est videmment un challenge important, avec l'extension du volume de dchets et des pollutions de toute nature.
2.9 - COMMUNICATION ET BIOLUMINESCENCE

Cette section prolonge la prcdente car les bactries peuvent changer des renseignements laide des substances qu'elles mettent au sein du milieu. Les interactions par phromones sont nombreuses et peuvent avoir une influence ici et l sur la rpartition de la microflore et son activit dans l'environnement. La communication est importante pour la survie des espces quand il s'agit de lutter contre une surpopulation, un dficit en ressources, une agression, ou lorsqu'il faut mettre en commun des outils de dgradation pour amliorer leur efficacit. Ce sujet est devenu extrmement important pour comprendre le comportement des populations bactriennes.
OH O 1 3 O N H O
3 hydroxy-octanoyl-homosrine-lactone
Les premires phromones bactriennes connues sont les N-acyl-L-homosrinelactones ou AHLs , dont il existe toute une famille chez les Gram-ngatifs en fonction de la nature de leur formule. Une mme espce peut librer dans le milieu plusieurs AHLs reconnues par diffrentes protines rceptrices. Les AHLs sont typiquement des signaux indiquant une forte concentration cellulaire. Leur spcificit est dtermine par la longueur de la chane carbone et la nature de la position 3, qui est soit un alcool secondaire comme ici, soit une fonction ctonique. Ces produits sont hydrophobes et traversent facilement la membrane. Lorsque les bactries se multiplient en milieu confin, la concentration des AHLs augmente. partir d'un certain seuil, variable de 105 109 M selon les cas, des
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rgulateurs de transcription sont activs spcifiquement, provoquant l'expression d'un ou plusieurs gnes groups en oprons. Le phnomne est ce qu'on appelle le quorum sensing [65] en somme le rsultat d'un effet de foule. Il conduit une sorte d'tat de crise dans la population bactrienne, et peut se manifester dans les espces pathognes par un accroissement de la virulence. La bioluminescence de Photobacterium fischeri a permis de se faire une premire ide sur l'effet de foule. Cette espce ocanique met de la lumire grce une oxydase flavinique agissant sur des composs aldhydiques longue chane (de 7 11 carbones) appels lucifrines*. L'mission de lumire rsulte de leur oxydation. Cette question est mentionne ici essentiellement pour sa valeur en tant que modle. L'accumulation des bactries dans des organes spciaux appartenant certains poissons et cphalopodes cre le confinement et provoque l'augmentation de la lumire mise. La rgulation de ce systme a stimul l'tude de divers phnomnes biologiques qui ne se limitent pas l'mission de lumire et concernent les biodgradations. La bioluminescence est fonde sur une structure gntique qui nous servira d'illustration du phnomne. La lumire est mise condition que soient exprims les gnes luxA et B codant pour une lucifrase 14, et les gnes luxC , D et E codant pour trois protines contribuant la synthse partir d'une lucifrine, qui est ici un aldhyde.
luxR
luxI
E ACP synthtase
AI
acyle transfrase I acide gras rductase
lucifrase
synthse de lauto-inducteur
Opron lux de Vibrio fischeri

Le gne luxG coderait pour une flavine rductase [66]. Quant la protine code par luxI, elle participe la synthse d'un inducteur interne ou auto-inducteur (AI), un produit du type N-acylhomosrine lactone qui diffuse et s'accumule au dehors de la cellule L'expression de l'opron des gnes lux est sous la dpendance de la protine rgulatrice LuxR et de LuxI, enzyme implique dans la synthse de l'auto-inducteur AI. LuxR est un activateur de transcription pour son propre gne et pour cet opron luxICDABEG. Le gne rgulateur luxR et l'opron sont transcrits dans des directions opposes partir d'une mme rgion promotrice, une disposition que nous retrouverons souvent. L'auto-inducteur est prsent en quantit infime dans les cellules isoles mais commande sa propre production. Il en rsulte un effet amplificateur. Quand la population cellulaire devient dense, par exemple dans les organes lumineux des calmars, sa concentration s'accrot dans des proportions normes. 14 - Le principe est expliqu en glossaire Lucifrine.
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LuxR est fixe la membrane et fonctionne comme dimre. La protine peut se lier l'ADN par le domaine C-terminal de chaque monomre sur une squence palindromique appele "bote lux" dans la rgion du promoteur. L'association ne se fait pas en temps normal, parce que la partie N-terminale de la squence recouvre dans la mme molcule la partie C-terminale responsable de l'attachement. La rgion N-terminale fait office de couvercle qui empche l'attachement et entrane une inhibition interne. Ce blocage cesse quand l'auto-inducteur AI se fixe sur cette rgion de LuxR, provoque un changement de conformation, et dvoile la partie qui doit s'attacher l'ADN. Chez Vibrio fischeri, c'est donc AI qui fait sauter le bouchon. L'association forme entre LuxR et AI est le vritable activateur transcriptionnel. Il fait deux choses : dclencher l'expression de l'opron, et acclrer celle du gne luxR. Ceci est ralis une condition expresse qui est l'aide d'une protine supplmentaire appele CRP* [67]. La protine CRP (ou CAP) est un activateur de transcription supplmentaire agissant comme pour divers sites gntiques lorsqu'elle a li de l'AMP cyclique (AMPc). Son attachement sur l'ADN ne se fait que si le taux d'AMPc est suffisant. Ce taux baisse en milieu glucos, avec pour effet une diminution de la bioluminescence. Le maximum de lumire mise s'observe donc : quand l'acylhomosrine-lactone (AI) se lie LuxR ; quand le tandem LuxR + AI se lie l'ADN ; quand le rgulateur CRP se lie galement l'ADN partir d'un taux suffisant d'AMPc. Un diagramme montre la zone cruciale de 240 kb o se fait la rgulation chez V. fischeri. Sont indiqus les deux promoteurs (caractriss chacun par les botes 10 et 35, les botes o s'installent CRP et LuxR (lux), et les points de dpart des transcriptions (flches).
transcription de lopron 35 10 luxR transcription de LuxR 10 35 CRP LuxR luxI
La zone rgulatrice sur l'ADN

Ce systme ne peut fonctionner que s'il y a en permanence assez d'autoinducteur AI pour activer la protine LuxR. L'auto-inducteur AI est apport de l'extrieur par les autres cellules de la colonie et il y a en mme temps une petite transcription de fuite de l'opron luxICDABEG, de telle sorte que AI est produit en permanence mais au ralenti. L'ensemble de la population fabrique donc de l'autoinducteur en continu et c'est pourquoi il tend s'accumuler progressivement. La brusque acclration se fait au-del d'un certain niveau avec l'entre en lice du rgulateur LuxR et la formation du complexe activateur avec AI. L'activation produite par la monte de l'auto-inducteur AI devrait avoir une allure explosive, avec expression massive des gnes concerns. Il n'en est rien, car un mcanisme secondaire en limite les excs. Quand le complexe LuxR-AI s'accumule, il tend se limiter lui-mme, car la protine inhibe alors l'expression de son gne luxR. Elle limite elle-mme sa propre production ! C'est donc une boucle de rtro-
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contrle. D'autres mcanismes assez compliqus semblent intervenir. Vibrio fischeri ne fait pas qu'un seul AI mais trois, AI-1, AI-2 et AI-3, qui diffrent par leur chane latrale. AI-1 et AI-3 sont des acylhomosrine-lactones ou AHL, fabriqus par la mme enzyme, alors qu'AI-2 est produit par une voie indpendante. Tous ces composs drivent du mme prcurseur mtabolique, qui est la S-adnosylmthionine*. Or AI-2 n'active que faiblement LuxR. Il entre en comptition avec les autres AI et se comporte en fait comme un inhibiteur [68]. Il y a donc un jeu subtil entre tous ces facteurs, et un rglage sophistiqu qui peut clairer, c'est le cas de la dire, d'autres rgulations bactriennes du mme genre. Des variantes de ce mcanisme s'observent en fonction des espces. Oprentelles de la mme faon ? Le vibrion V. harveyi produit et reoit deux auto-inducteurs, dsigns par AI-1 et AI-2, mais distincts de ceux de V. fischeri. Ces deux produits rgulent l'opron de la luminescence, mais la situation repose sur une cascade de protines rgulatrices un peu plus compliques. Les deux autoinducteurs sont reconnus par des rcepteurs diffrents LuxN et LuxQ, et les signaux sont intgrs par une mme protine rgulatrice. Nous ne dcrirons pas cette cascade ici, mais on pourra en trouver les dtails dans les articles de FREEMAN et BASSLER [69]. L'auto-inducteur AI-1 de V. Harveyi est une homosrine lactone spcifique de l'espce. Par contre AI-2 est fabriqu par de nombreuses espces, y compris le colibacille et les salmonelles. On a identifi l'enzyme catalysant la dernire tape de la synthse de AI-2 et baptise LuxS. Cette question est exemplaire car la connaissance du gne luxS permet de faire une recherche systmatique de ce type de facteur dans les populations bactriennes. Il a t constat avec surprise que des gnes fortement homologues de luxS sont trs rpandus dans la nature. La conclusion logique est que AI-2 reprsente un signal interspcifique du quorum sensing, chang au sein des populations mixtes. La rvlation de la nature exacte de AI-2 a t une surprise. Cet auto-inducteur contiendrait du bore [70]. Ce dtail est soulign ici pour la curiosit. Le bore, apport en gnral sous forme de borate, est ncessaire de nombreux organismes, mais il est trs rare de lui attribuer une fonction prcise. Or l'AI-2 fait maintenant figure de signal bactrien universel compris par un grand nombre d'espces [71].
B(OH)4 LuxS OH O OH O O O OH CH3 HO O HO AI-2 HO O B OH O CH
3
S-adnosyl-mthionine
HO 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione
prcurseur de A1-2
Le bore dans un signal universel ?

Les deux auto-inducteurs de Vibrio harveyi reprsentent peut-tre une situation trs rpandue. Un premier signal de surpopulation, AI-1, est rserv l'espce concerne. Le second, AI-2, s'change entre bactries d'espces diffrentes. On pense que de tels changes d'information ont lieu au sein des populations mixtes responsables de biodgradations dans l'environnement. Le quorum sensing ou effet de
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foule ne gouverne pas qu'une fonction physiologique, mais peut moduler les effets d'une protine rgulatrice qui exerce son action sur des activits divergentes commandes par des oprons diffrents [72]. Ces derniers forment ce qu'on appelle un rgulon*. De nombreuses activits physiologiques sont modules par la concentration bactrienne. Le tableau en cite quelques uns. Espce bactrienne
Photobacterium fischeri, Vibrio harveyi Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aureofaciens Erwinia carotovora Agrobacterium tumefaciens Serratia marcescens Yersinia enterocolitica
Activit stimule par une AHL

mission de lumire Induction de l'lastase et de facteurs de virulence Induction de phnazines antibiotiques Induction d'enzymes lytiques et de carbapenem Induction du transfert de plasmide Ti entre cellules Changement de mobilit, swarming Induction de protines non caractrises
Les N-acylhomosrine-lactones (NAHs) ne sont pas les seuls agents de communication du monde bactrien. Chez les Streptomyces comme S. griseus, le signal se transmet par un produit un peu plus simple, la gamma-butyrolactone. Le rsultat est une tendance mettre des antibiotiques ou sporuler. Les Gram-positifs ont souvent des mcanismes particuliers qui mettent en jeu des oligopeptides de 5 25 acides amins (dont certains sont modifis par rapport aux formules classiques). Voici quelques exemples. Dans le cas de B. subtilis, les effets constats sont dclenchs par plusieurs peptides. Espce bactrienne
Bacillus subtilis Bacillus subtilis Lactococcus lactis Lactobacillus plantarum Lactobacillus sake Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus
Activit stimule par un peptide

Comptence la transformation Sporulation Production de nisine (lantibiotique) Production de plantaricine (antimicrobien) Production de sakacine (antimicrobien) Agglutination, transfert de plasmide Exotoxine, virulence...
Bacillus subtilis est l'archtype des bactries sporulantes rpandues dans l'environnement, et offre un cas de figure complexe. La densit de population favorise la fois la comptence (voir transformation*) et la sporulation. La comptence est stimule par deux facteurs extracellulaires, la phromone ComX (un dcapeptide), et CSF, un pentapeptide qui agit galement sur la sporulation [73]. Dans les deux cas, il s'agit d'une rponse qui intgre plusieurs situations adverses comme un dficit de ressources nutritives, des atteintes l'intgrit de l'ADN (la transformation est un moyen de rparer), une atteinte toxique ou l'inhibition d'une tape du mtabolisme. Les signaux sont pris en charge par une permase (SpoK) et par le rcepteur de CSF. Leur action dbouche en fin de compte sur des rgulateurs de transcription, soit ComK pour la comptence, et SpoA pour la sporulation. Un jeu
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complexe entre les diffrentes rgulations oriente le comportement des cellules. Il dclenche ou inhibe la sporulation. Chez les Gram-positifs, ces polypeptides sont gnralement fabriqus sous forme de chanes plus longues, dont une partie est limine par une coupure hydrolytique. La partie restante est alors prise en charge et exporte dans le milieu par un transporteur ABC*, avant d'tre reconnue par une autre cellule qui se sert d'un rcepteur appropri. Ce dernier peut faire partie d'une rgulation deux composants* avec capteur et rgulateur. D'autres agents de communication sont des acides gras, des macrolides (antibiotiques de Streptomyces alboniger) et autres produits. Ces communications sont nombreuses et trs diverses chez les actinomyctes et organismes capables de faire des filaments mycliens ariens et des fructifications. Un des aspects les plus intressants des communications entre bactries est l'existence d'une organisation collective, qu'on a souvent compare au dveloppement des organismes pluricellulaires. Ceci avait t remarqu par l'examen des colonies d'Escherichia coli sur bote glose [74]. La rgle qui gouverne l'organisation de la colonie semble tre d'augmenter au maximum les contacts de cellule cellule, avec des diffrences sur l'longation et la mobilit des cellules individuelles. Le point le plus important est peut-tre la scrtion des polysaccharides extracellulaires formant une matrice dans laquelle la population s'organise. C'est exactement ce qu'on observe dans un biofilm, et probablement un facteur majeur qui rgle le dveloppement des populations denses de microorganismes dans l'environnement. Une application spectaculaire est le swarming. Certaines espces, comme Proteus vulgaris et P. mirabilis, ont la proprit bien connue des microbiologistes de s'taler trs rapidement sur bote glose. L encore cette question est voque par sa valeur comme modle. Il y a division du travail entre des cellules allonges et hyperflagelles, qui se migrent dans une matrice de polysaccharides externes, et des cellules nageuses qui ne sont mobiles qu'en milieu liquide. Ce comportement est collectif, dpend de certains facteurs du milieu 15 et ne survient qu'au sein d'une population nombreuse. Une priodicit trs curieuse peut s'tablir, avec des zones d'talement et des alternances de swarming et de repos [75]. Une colonie de Proteus mirabilis s'tablit en cercles concentriques, faisant alterner une phase de swarming (expansion), et une phase de consolidation o les cellules se divisent activement. Les cellules oscillent donc entre deux phases, o les cellules en expansion ont une forme beaucoup plus allonge et se dplacent dans un film de polymre, formant une zone dense pousse par la prolifration des bactries en phase de consolidation, situes en zones plus claires. Ces bactries en voie de division se sont ddiffrencies partir des cellules essaimeuses ou swarming cells. Elles se diffrencieront nouveau en cellules essaimeuses. L'anneau le plus externe en contient. La prolifration des bactries dans le cercle interne adjacent cre une pression qui tend agrandir le cercle, indpendamment des mouvements des cellules essaimeuses.
15 - Le swarming complique l'obtention de colonies isoles sur glose, peut s'inhiber en utilisant un agar plus concentr ou en ajoutant du dsoxycholate.
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cellules en expansion cellules en phase de consolidation
Colonie de Proteus mirabilis

Celles-ci cessent leur migration et entrent en consolidation, prparant un nouveau cercle de cellules vgtatives division rapide, avant que s'tablisse une nouvelle vague de bactries essaimeuses. Le plus trange est la synchronisation du mcanisme dans toute la colonie, qui suppose l'existence d'un programme bien dfini et de communications intercellulaires qui demandent encore tres lucides. Des morphologies diffrentes sont adoptes par les colonies de Bacillus subtilis en cours de croissance sur milieu solide et semblent avoir intress particulirement les physiciens cause des figures formes voquant les fractales.
Croissance fractale : Bacillus subtilis sur agar

Les dendrites apparaissent gnralement sur un milieu carenc en lments nutritifs et concentr en agar. La formation de dendrites permet la colonie d'augmenter sa surface de contact avec le milieu neuf et de faciliter la diffusion interne des ressources. Les dendrites avancent quand la masse cellulaire pousse devant elle la gangue d'exopolymres [76]. Les figures formes ont donn lieu de nombreuses modlisations mathmatiques. Cet exemple nous permettra de conclure sur l'importance des associations bactriennes rgles par des messages chimiques entre cellules et entre espces diffrentes, avec la cl des bnfices adaptatifs importants. On peut en citer
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quelques-uns. L'un d'eux est la division du travail. On l'observe par la diffrenciation de cellules spcialises, trs marque chez les actinomyctes ou chez les cyanobactries (htrocystes). Un autre avantage est l'utilisation commune d'une source nutritive qui n'est pas suffisamment accessible aux cellules isoles. Dans la plupart des cas, il s'agit de la fabrication d'enzymes lytiques extracellulaires. Chez une espce parasite des vgtaux, Erwinia carotovora, la scrtion d'enzymes attaquant les parois vgtales est sous le contrle d'un quorum sensing par phromone (une AHL) et n'intervient donc qu' partir d'un certain volume de la population. Le regroupement des cellules est un mcanisme de dfense et peut induire la scrtion d'antibiotiques ou augmenter la rsistance des agents extrieurs, comme les peroxydes. C'est un phnomne qu'on observe aussi dans les biofilms, ou dans les cellules immobilises artificiellement. La sporulation est une rponse qui apparat comme une raction de secours pour la population entire. Enfin le regroupement favorise les changes gntiques par conjugaison, transformation, pntration de plasmides. On pense que ces changes gntiques ont une importance cologique capitale en favorisant l'adaptation des populations aux biodgradations. Certains auteurs voient une population bactrienne comme une sorte d'organisme multicellulaire o le patrimoine de chaque individu reste accessible tous les individus de la collectivit [77]. Les bactries et les procaryotes en gnral ne sont donc pas faits uniquement de cellules isoles qui vivent pour leur propre compte, mais s'associent temporairement ou en permanence des ensembles plus grands o s'tablissent changes et communications entre individus. Des niveaux d'association complexes, siges de diverses diffrenciations, sont atteints par les myxobactries*, et surtout par les nombreux actinomyctes du sol qui forment un myclium et des fructifications, en imitant la structure plus complexe des champignons.
CONCLUSION RAPIDE
Le monde des micro-organismes qui prennent part aux grands cycles des substances naturelles et artificielles de l'environnement a une norme plasticit d'adaptation. En se limitant aux bactries, nous avons dj pu voir que des mcanismes diversifis peuvent remanier leur patrimoine gntique et faire natre dans une population des cellules rendues plus aptes grer leur mtabolisme ou leur rsistance face des conditions nouvelles. Les modifications vont de la mutation ponctuelle banale survenant au hasard des bouleversements plus grands par la transmission de matriel gntique de cellule cellule. Dans la comptition vitale l'agressivit et les hautes performances sont de rgle. Le pouvoir infectieux des bactries pathognes est un aspect particulier de ce comportement, qui peut nous donner des indications sur des mcanismes plus gnraux allant jusqu' l'apparition de nouvelles formes aptes effectuer des biodgradations.
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RFRENCES
[1] S T O V E R C K & C O L L . (2000) Nature 406 : 959-964. [2] H E R R M A N N R & R E I N E R B (1998) Curr. Opin. Microbiol. 1 : 572-579. [3] C O O P E R VS & L E N S K I RE (2000) Nature 407 : 736-739. [4] P A P A D O P O U L O S D , S C H N E I D E R D , M E I E R - E I S S J, A R B E R W , L E N S K I RE & B L O T M (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 3807-3812. [5] O B M O L O V A G , B A N C , H S E I H P & Y A N G W (2000) Nature 407 : 703-710 ; L A M E R S MH , P E R R A K I S A, E N Z L I N JH , W I N T E R W E R P H H K , D E W I N D N & S I W M A TK (2000) Nature 407 : 711-717. [6] B A N C , J U N O P M & Y A N G W (1999) Cell 97 : 85-97. [7] B A N C & Y A N G W (1998) EMBO J. 17 : 1526-1534. [8] U E T Z P & 18 auteurs (2000) Nature 403 : 623-627 et annexe. [9] P U I G O , C A S P A R Y F, R I G A U T G , R U T Z B, B O U V E R E T E, B R A G A D O - N I L S S O N E, W I L M M & S E R A P H I N B (2001) Methods 24 : 218-229. [10] G A V I N A- C & 37 auteurs (2002) Nature 415 : 141-147. [11] H O Y & 45 auteurs (2002) Nature 415 : 180-183. [12] E L L I S RJ (2001) Trends Biochem.Sci. 26 : 597-604. [13] D A V I E S J (1996) Microbiologia 12 : 9-16. [14] O C H M A N H , L A W R E N C E JG & G R O I S M A N EA (2000) Nature 405 : 299-304. [15] B L A T T N E R FR & autres auteurs (1997) Science 277 : 1453-1474. [16] L A W R E N C E JG & O C H M A N H (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 9413-9417. [17] S M I T H H O , T O M B JF, D O U G H E R T Y BA, F L E I S C H M A N N RD & V E N T E R JC (1995) Science 269 : 468-470. [18] M A U R E L L I AT, F E R N A N D E Z RE, B L O C H C A & R O D E C K V F A S A N O A (1998) Proc. Natl. Acad.Sci. 95 : 3943-3948. [19 D O B R I N D T U & R E I D L J (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290 : 519-527. [20] N E L S O N KE & C O L L . (1999) Nature 399 : 323-329 ; L O G S D O N JM & F U G U Y D M (1999) Curr. Biol. 9 : R747-R751. [21] K U N S T F & 25 autres auteurs (1997) Nature 390 : 237-238. [22] H E I N E M A N N JA & S P R A G U E G FJ (1989) Nature 340 : 205-209. [23] S T A C H E L S E & Z A M B R Y S K I P (1986) Cell 47 : 155-157. [24] W I L L E T T S N & S K U R R A Y R (1987) In "Escherichia coli and Salmonella typhimurium", N E I D H A R D T FC ed., Amer. Soc. Microbiol., Washington : 1110-1133. [25] C H R I S T I E PJ (2001) Mol. Microbiol. 40 : 294-305. [26] C H R I S T I E PJ (2001) Mol. Microbiol. 40 : 294-305. [27] B E R G D E & H O W E MM (1989) Mobile DNA, American Soc. For Microbiology, Washington, D.C. [28] M A H I L L O N J & C H A N D L E R M (1998) Microbiol. Molec. Biol. Reviews 62 : 725-774. [29] M A C H I D A C & M A C H I D A Y (1989) J. Mol. Biol. 208 : 567-574.
128
[30] E S C O U B A S JM, P R E R E MF, F A Y E T O , S A L V I G N O L I, G A L A S D , Z E R B I B D & C H A N D L E R M (1991) EMBO J. 10 : 705-712 ; F A R A B A U G H PJ (1996) Microbiol. Rev, 60 : 103-134. [31] P O L A R D P & C H A N D L E R M (1995) Genes Dev. 9 : 2846-2858 ; P O L A R D P & C H A N D L E R M (1995) Mol. Microbiol. 125 : 13-23. [32] B L O T M (1994) Genetica 93 : 5-12. [33] C O O P E R VS , S C H N E I D E R D , B L O T M & L E N S K I RE (2001) J. Bacteriol. 183 : 2834-2841. [34] C O X R & M I R K I N S M (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 5237-5242. [35] L A W L E Y TD , B U R L A N D V & T A Y L O R D E (2000) Plasmid 43 : 235- 23 9. [36] K L E C K N E R (19 90) Annu.Rev.Genetics 124 : 449-454 ; K L E C K N E R N (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6 : 297-327. [37] D E L A C R U Z NB, W E I N R E I C H MD , W I E G A N D TW , K R E B S MP, R E Z N I K O F F W S (1993) J. Bacteriol. 175 : 6932-6938. [38] S T O K E S H W & H A L L RM (1989) Mol. Microbiol. 3 : 1669-1683. [39] O C H M A N H , L A W R E N C E JG , G R O I S M A N EA (2000) Nature 405 : 299-304. [40] H A N S S O N K, S K L D O , S U N D S T R M L (1997) Molec. Microbiol. 5 : 1941-1959 ; G R A V E L A, M E S S I E R N, R O Y PH (1998) J. Bacteriol. 180 : 5437-5442. [41] N U N E S - D B Y S E, K W O N H J, T I R U M A L A I RS , E L L E N B E R G E R T, L A N D Y A (1998) Nucleic Acids Res. 26 : 391-406. [42] G R I N D L E Y ND F (1997) Curr. Biology 7 : R608-R612. [43] R O W E - M A G N U S D A & M A Z E L D (1999) Curr. Opininion Microbiol. 2 : 483-488. [44] F R A N C I A MV & G A R C I A L O B O JM (1996) J. Bacteriol. 178 : 894-898. [45] B I S S O N E T T E L & R O Y PH (1992) J. Bacteriol. 174 : 1248-1257. [46] B I S S O N E T T E L, C H A M P E T I E R S , B U I S S O N J- P , R O Y PH (1991) J. Bacteriol. 173 : 4493-4502. [47] C O L W E L L RR (1996) Science 274 : 2025-2031. [48] H E I D E L B E R G JF et coll. (32 auteurs au total) (2000) Nature 406 : 477-486. [49] B A R K E R A, C L A R K C A, M A N N I N G PA (1994) J. Bacteriol. 176 : 5450-5458. [50] R O S E - M A G N U S D A, G U E R O U T A- M , M A Z E L D (1999) Res. Microbiol. 150 : 641-651. [51] L E V E S Q U E C , B R A S S A R D S , L A P O I N T E J, R O Y PH (1994) Gene 142 : 48-9-54 ; M A Z E L D , D Y C H I N C O B, W E B B VA, D A V I E S J (1998) Science 280 : 605-608. [52] H A C K E R J, B L U M - O E H L E R G , M H L D O R F E R I, T S C H P E H (1997) Molec. Microbiol. 23 : 1089-1097. [53] K A R A O L I S D KR , J O H N S O N JA, B A I L E Y C C , B O E D E K E R EC , K A P E R JB, R E E V E S PR (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 3134-3139. [54] R O W E - M A G N U S D A, G U E R O U T A- M , P L O N C A R D P, D Y C H I N C O B, D V I E S J, M A Z E L D (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98 : 652-657. [55] D A N E S E PN, P R A T T LA, D O V E S L, K O L T E R R (2000) Mol. Microbiol. 37 : 424-432. [56] O L S N A, J O H N S S O N A, N O R M A R K S (1989) Nature 338 : 652-655. [57] P O W E R K & M A R S H A L L KC (1988) Biofouling 1 : 163-174 ; M A R S H A L L KC (1992) ASM News 58 : 202-207.
2 GNOMES - ADAPTATIONS - COMMUNICATIONS [58] V I D A L O , L O N G I N R, P R I G E N T - C O M B A R E T C , D O R E L C , H O O R E M E N M & L E J E U N E P (1998) J. Bacteriol. 180 : 2442-2449. [59] E B E R L S (1999) Syst. Appl. Microbiol. 22 : 493-506 ; M A N E F I E L D M, D E N Y S R, K U M A R N, R E A D R, G I V S K O V M, S T E I N B E R G P & K J E L L E B E R G S (1999) Microbiology 145 (pt2) : 283-291. [60] P R I G E N T - C O M B A R E T C & L E J E U N E P (1999) Methods Enzymol. 310 : 56-79. [61] S U R E T T E MG , M I L L E R MB, B A S S L E R BL (1999) 96 : 1639-1644. [62] S T E W A R T PS & C O S T E R T O N JW (2001) Lancet 358 : 135-138. [63] C O C H R A N W L, M C F E T E R S G A, S T E W A R T PS (2000) J. Appl. Microbiol. 88 : 22-30. [64] G H I G O J- M (2001) Nature 412 : 442-445. [65] M I L L E R MB & B A S S L E R BL (2001) Annu. Rev. Microbiol. 55 : 165-199. [66] L I N JW , C H A O Y F, W E N G S F (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 : 446-452. [67] S T E V E N S AM, D O L A N KM, G R E E N B E R G EP (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 12619-12623. [68] K U O A, C A L L A H A N S M, D U N L A P PV (1996) J. Bacteriol. 178 : 971-976. [69] F R E E M A N JA & B A S S L E R BL (1999) J. Bacteriol. 181 : 899-906 ; B A S S L E R BL (1999) Curr. Opin. Microbiol. 2 : 582-587. [70] C H E N X, S C H A U D E R S , P O T I E R N, V A N D O R S S E L A E R A,P E L C Z E R I, B A S S L E R BL, H U G H S O N FM (2002) Nature 415 : 545-549. [71] M I L L E R MB & B A S S L E R BL (2001) Annu. Rev. Microbiol. 55 : 165-199. [72] C A L L A H A N S M & D U N L A P PV (2000) J. Bacteriol. 182 : 2811-2822. [73] S O L O M O N JM, L A Z A Z Z E A BA, Grossman AD (1996) Genes Dev. 9 : 547-558. [74] S H A P I R O JA (1987) J. Bacteriol. 197 : 142-156 ; Shapiro JA (1995) J. Bacteriol. 17 : 597-607. [75] R A U P R I C H O , M A T S U S H I T A M, W E I J E R K, S I E G E R T F, E S I P O V S & S H A P I R A JA (1996) J. Bacteriol. 178 : 6525-6538 ; M A T S U Y A M A T, T G A G I Y , N A G A G A W A Y , I T O H H , W A K I T A J & M A T S U S H I T A M (2000) J. Bacteriol. 182 : 385-393. [76] B E N - J A C O B E, S C H O C H E T O , T E N E B A U M A, C O H E N I, C Z I R K A & V I C S E K T (1994) Nature 368 : 46-48. [77] S H A P I R O JA (1998) Annu. Rev. Microbiol. 52 : 81-104.
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OXYDATIONS MINRALES
Le mthane, l'ammoniac, le monoxyde de carbone, l'hydrogne sulfur, le fer, le cyanure sont autant de substrats trs simples dont l'oxydation par l'oxygne de l'air fournit aux organismes spcialiss toute l'nergie ncessaire leur dveloppement. Ce chapitre passe en revue les principales oxydations de ce type. Les germes responsables sont des chimio-lithotrophes, parfois des autotrophes qui utilisent le gaz carbonique comme seule source de carbone. Tous ces germes acceptent un mode de vie spartiate, mais ce sont des maillons essentiels dans le cycle des lments de la biosphre. Ils contribuent dans une large mesure au nettoyage de l'environnement en limitant l'accumulation de produits indsirables. L'limination des dchets de l'activit humaine a souvent besoin de leur intervention. 3.1 - Un cycle naturel du mthane 3.2 - Le mthane, source de carbone et dnergie 3.3 - Croissance sur mthane et mthanol 3.4 - Mthanotrophes contre organochlors 3.5 - Halomthanes 3.6 - L'oxydation de l'ammoniac 3.7 - Monoxyde de carbone et carboxydotrophes 3.8 - Du sulfure au sulfate 3.9 - limination de composs soufrs simples 3.10 - L'oxydation du fer et du manganse 3.11 - Cyanure - cyanate - thiocyanate 133 135 144 152 155 159 167 171 177 179 184
CHAPITRE 3
3 OXYDATIONS MINRALES
Le mthane, l'ammoniac, l'hydrogne sulfur, le fer, le cyanure sont autant de substrats trs simples dont l'oxydation fournit aux organismes spcialiss toute l'nergie ncessaire leur dveloppement. Ces germes sont des chimiolithotrophes. Il n'est pas rare de trouver parmi eux des autotrophes qui utilisent le gaz carbonique comme seule source de carbone. Tous ces germes acceptent donc un mode de vie spartiate, mais ce sont des maillons essentiels dans le cycle des lments de la biosphre. Ils contribuent dans une large mesure au nettoyage de l'environnement en limitant l'accumulation de produits indsirables, et beaucoup de biodgradations se font avec leur aide...
3.1 - UN CYCLE NATUREL DU MTHANE

Le mthane est somme toute le plus simple des composs carbons, un gaz discret et omniprsent dans la biosphre. Dans l'atmosphre terrestre primitive qui a vu apparatre les premires formes vivantes, le mthane pourrait avoir aid la gense de molcules organiques plus compliques, alors que les conditions taient trs rductrices. On a suppos que les missions volcaniques les plus anciennes contenaient des formes plus rduites (H2, NH3, CH4, H2S) que les exhalations modernes : CO2, H2O, N2, SO2, traces de H2 et CO. Le mthane a t identifi dans latmosphre de Titan [1]. Les expriences de SCHLESSINGER et MILLER [2] ont signal son importance possible pour les premires bauches de la vie en dmontrant une synthse d'acides amins et dautres composs biologiques par dcharges lectriques dans diffrents mlanges de mthane, d'hydrogne, de monoxyde de carbone et de CO2. Ce sujet a t discut, il a quelques annes, par KASTING [3]. L'influence du mthane contemporain sur l'environnement se fait sentir au moins deux niveaux. Le premier correspond l'effet de serre. Le second est l'utilisation du mthane comme source nergtique par des micro-organismes arobies. La source du mthane est en grande partie biologique, partout o l'oxygne fait strictement dfaut, dans le sol, les sdiments et le fond des ocans. Les activits humaines viennent en renfort parce que le mthane est produit dans les cultures (rizires), par l'extension de l'levage ou par l'pandage des dchets. La production de mthane lie aux activits humaines serait de 330 400 millions de tonnes par an. L'examen des gaz emprisonns dans les glaces polaires indique que le mthane atmosphrique a plus que doubl depuis le dbut de l're industrielle. La
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teneur actuelle du mthane atteint 1,8 ppmv aprs avoir augment de 1% par an depuis trente ans [4]. La contribution du mthane atmosphrique l'absorption de l'nergie solaire et l'effet de serre n'est pas ngligeable. La concentration moyenne en CO2 est passe de 315 358 ppmv entre 1800 et 1995, elle est maintenant proche de 370, soit 50% d'augmentation lie en grande partie la combustion des hydrocarbures fossiles. Malgr sa teneur bien plus faible, le mthane absorbe 24 fois plus d'nergie masse gale et son influence grimpe prs de 12% de leffet total 1. On estime dautre part que d'normes rserves de mthane sont ltat immobilis par association avec leau sous forme dhydrate de mthane*. Les sdiments ocaniques profonds en contiendraient de grandes quantits constituant un rservoir potentiel de gaz.
O2 matires organiques CO2 oxydations microbiennes surface du sol et des sdiments, rhizosphres...
arobiose anarobiose
produits de fermentation actate, formiate, formaldhyde, mthanol... H2, CO2
mthanognse
CH4
Alternance mthane / dioxyde de carbone

Le deuxime niveau d'influence du mthane sur l'environnement tient son oxydation par des micro-organismes qui s'en servent comme source d'nergie. L'apport de mthane dans la biosphre est double. Une partie est d'origine tellurique (mthane gologique) et provient des grandes profondeurs de l'corce. Le reste rsulte de l'activit des bactries mthanognes par rduction du gaz carbonique et de diffrents produits de fermentation. Inversement le mthane est oxyd l'air par les mthanotrophes. Leur action est double par la destruction photochimique qui intervient dans la basse atmosphre par raction du mthane sur les radicaux hydroxyle (OH.), et on estime que cette voie d'limination du mthane atmosphrique est prdominante. La raction produit du monoxyde de carbone, de l'ozone et de l'eau. La dure moyenne de sjour d'une molcule de mthane dans la troposphre n'est pas connue avec certitude. Elle serait d'une dizaine d'annes. Du mthane atmosphrique est rabsorb par le sol et les eaux. 1 - Les diffrentes contributions des gaz effet de serre autres que la vapeur d'eau sont en gros 57% pour le gaz carbonique, 6% pour les oxydes nitreux. Le reste (25%) est d aux chlorofluorocarbones et autres composs d'origine industrielle.
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La destruction du mthane revient surtout des micro-organismes. Il y a donc un cycle biologique du mthane qui contribue au brassage du carbone dans la nature au mme titre que les autres changes gazeux de la photosynthse, des fermentations et des oxydations de matires organiques. Le taux de mthane dans la biosphre rsulte de l'quilibre dynamique o s'affrontent la vitesse de sa formation et son taux d'utilisation. Nous savons que la synthse biologique du mthane est la proprit exclusive de micro-organismes strictement anarobies qui sont tous des archaebactries. Ces organismes tirent leur nergie de la synthse du mthane qui se fait par rduction du gaz carbonique, ou encore par dcomposition de l'acide actique et d'autres composs organiques. Les bactries utilisatrices du mthane sont arobies et rcuprent lnergie de son oxydation. Elles se trouvent la surface du sol, dans les eaux et aussi autour des racines des plantes au niveau de la rhizosphre. Une certaine arobiose y est maintenue parce que les racines mettent de l'oxygne que les micro-organismes rcuprent pour leurs oxydations. Cet oxygne est absolument indispensable aux champignons. Ainsi des racines ou des rhizomes baignant dans des sdiments ou des vases anoxiques peuvent nanmoins maintenir leur surface un microenvironnement suffisamment oxygn pour autoriser la croissance des champignons et autres espces arobies. La vgtation flottante des rivires et des tangs n'est pas en reste. On a constat une oxydation significative du mthane au niveau des jacinthes d'eau (Eichornia crassipes) et des lentilles d'eau (Lemna minor). Il y a donc d'un ct les mthanognes et de l'autre les mthanotrophes, deux populations qui ne s'interpntrent pas. On peut remarquer que le cycle du mthane avec son va-et-vient du carbone entre CO2 et CH4 est une affaire exclusive de procaryotes. Un des objectifs de ce chapitre est l'oxydation du mthane. Il nous fera dcouvrir une voie assimilatrice originale du carbone et signalera en mme temps son intrt dans la biodgradation de composs naturels ou artificiels.
3.2 - LE MTHANE, SOURCE DE CARBONE ET DNERGIE

Le mthane nest pas seulement un trs bon carburant pour usages domestiques, cest aussi une excellente source dnergie pour des bactries qui sen nourrissent et en tirent tout le carbone pour leurs synthses. Un petit miracle parce qu'il est trs stable et chimiquement peu ractif, inerte pour la plupart des tres vivants, sauf pour les mthanotrophes, qui sont des procaryotes et quelques levures spcialises renfermant une mthane mono-oxygnase. Les bactries sont les acteurs majoritaires de l'oxydation du mthane. Des micro-organismes marins dtects depuis peu prsentent cependant une situation particulire [5]. Le mthane est consomm par une association anarobie entre deux partenaires au sein de sdiments o l'oxygne diatomique n'intervient pas. Des bactries sont capables de catalyser la raction CH4 + H2O CO2 + H2, qui est l'inverse de la mthanognse. Leurs associes sont des sulfato-rducteurs, qui consomment rapidement l'hydrogne form en rduisant le sulfate jusqu'au niveau sulfure. Cette
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association de deux organismes rsulte d'une syntrophie*. En somme le recyclage du mthane dans la nature fait appel aux deux ractions globales : CH4 + 2 O2 CO2 + 2 H2O (arobie) (1) (association anarobie) (2) CH4 + SO42 HCO3 + HS + H2O
Le premier mcanisme est celui qui nous intresse ici. Le second est un vnement compltement distinct sur lequel nous reviendrons en examinant les sulfato-rducteurs. Les mthanotrophes se caractrisent donc par leur pouvoir de se dvelopper sur mthane comme seule source de carbone et d'nergie. Le principe de base est trs simple. Quatre oxydations successives convertissent le mthane en CO2. La premire engendre du mthanol. Tous les mthanotrophes sont donc en mme temps des mthylotrophes potentiels, mais la plupart des espces ont absolument besoin de mthane pour se dvelopper. Elles sont alors des mthanotrophes obligs [6]. Inversement les mthylotrophes sensu stricto n'utilisent pas le mthane, car ils manquent de l'enzyme essentielle qui est la mthane mono-oxygnase, mais peuvent se dvelopper sur le mthanol et dautres substrats. Le mthane est un substrat nergtique. Les quatre oxydations successives qui conduisent au gaz carbonique mettent en jeu chacune deux lectrons. Le mthane sert aussi de source de carbone sans laquelle aucune croissance ne serait possible. En principe plusieurs solutions sont offertes. La premire est une rduction assimilatrice du gaz carbonique par un cycle de type CALVIN-BENSON, comme le font les plantes. Les autres procdent de l'incorporation dans les molcules organiques d'un stade d'oxydation intermdiaire du mthane. La nature a accord sa prfrence au formaldhyde, qui est assimil selon une biochimie particulire. La raction 1 du schma correspond une mono-oxygnation consommatrice de pouvoir rducteur, qui produit du mthanol plus facile mtaboliser, tandis que les ractions suivantes sont gnratrices d'nergie. CH4 + O2 + NADH + H+ CH3OH + H2O + NAD+
oxydations nergtiques 1 CH4 CH3OH 2 H2C=O 3 HCOO 4 CO2
(3)
assimilation du carbone au niveau formaldhyde
Le mthane est source de carbone et d'nergie

Les bactries tirent lessentiel de leur nergie par les oxydations 2, 3 et 4. Les lectrons sont canaliss par une chane respiratoire complexe construite chez diverses espces par une batterie de cytochromes c qui renferment invariablement plusieurs hmes. Cette particularit se retrouve dans les bactries qui l'oxydent l'ammoniac. Plusieurs cytochromes c "multi-hmes" existent chez Methylococcus
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capsulatus. L'un d'eux possde une haute masse molculaire pas moins de 16 hmes de type C [7] ! Cette complexit permettrait une adaptation perfectionne des conditions varies ainsi qu l'usage d'une gamme tendue de substrats. La mthane mono-oxygnase catalyse la raction 1. L'enzyme utilise l'oxygne molculaire et une source d'lectrons qui peut tre NADH. Elle existe sous deux formes, membranaire et soluble. L'enzyme lie la membrane existe chez toutes les espces et reoit les lectrons de la chane respiratoire, tandis que la forme soluble les rcupre sur NADH et n'existe que chez certaines espces. Cette dernire est cependant la plus facile purifier, et par consquent la mieux connue aprs cristallisation et analyse structurale trs dtaille. Son site actif contient du fer. L'oxygnase membranaire fonctionne aussi avec du cuivre. Elle n'apparat d'habitude que lorsque le milieu contient une quantit suffisante de cuivre l'tat de Cu(I) ou de Cu(II). Certains auteurs ont propos que le mtal tait prsent dans le site actif sous forme d'un noyau regroupant trois ions cuivre [8]. Il est peu prs prouv que le cuivre est indispensable la stabilit de l'enzyme. Son intervention directe dans la catalyse est moins vidente. ZAHN et DISPIRITO [9] ont montr que l'oxygnase contenait aussi du fer. Sur la foi de rsultats obtenus par RPE, ces auteurs avancent l'ide selon laquelle le cuivre serait surtout un lment stabilisateur, le site catalytique pouvant contenir un centre bi-mtallique mixte du type fer-cuivre comme celui qui existe dans la cytochrome c oxydase. La question reste donc ouverte. Le facteur le plus performant dans les biodgradations lies l'oxydation du mthane est la mono-oxygnase soluble (ou mthane hydroxylase). Sa biosynthse ne s'observe que dans les conditions o il y a peu de cuivre, soit au-dessous de 1 mol . mg1 de biomasse. Elle rsulte l'vidence d'une volution compltement indpendante de la prcdente. Il n'est plus question ici de la participation du cuivre, mais de celle du fer. Pourquoi cette enzyme est-elle extraordinaire ? Grce son manque de spcificit, elle peut transformer par l'oxygne de l'air bien d'autres substrats que le seul mthane. L'ventail de ses comptences est encore plus large que celui de l'enzyme membranaire. D'o son utilit dans l'environnement. Non seulement l'enzyme aide boucler le cycle du mthane, empchant celui-ci de s'accumuler dans l'atmosphre, mais est trs peu regardante sur son substrat oxyder. On lui connat largement plus de cent substrats possibles o se rencontrent des hydrocarbures saturs ou non, et divers drivs halogns dont le trichlorothylne. L'attaque de celui-ci est l'un des meilleurs fleurons de la monooxygnase soluble, qui est cet gard au moins mille fois plus ractive que la mono-oxygnase membranaire. Parmi les composs dgrads figurent des polluants divers rpandus par l'industrie, et l'on ralise immdiatement tout l'intrt de ce systme. La mthane mono-oxygnase soluble de Methylococcus capsulatus est un complexe de masse molculaire leve (225 kDa) comportant trois parties : une hydroxylase ou protine A, une protine dite de couplage B et une rductase flavinique C contenant du FAD et un centre fer-soufre de type [2Fe-2S]. La prsence de ce centre fer-soufre unique met la puce l'oreille. Elle montre que les lectrons sont canaliss un par un vers l'hydroxylase aprs avoir t prlevs par paires sur le
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donneur initial qui est NADH ou NADPH, puis transmis par la flavine. Cette disposition est assez caractristique de nombreux systmes du type rductase/oxygnase. L'hydroxylase a le rle essentiel, car elle contient les sites fixant le substrat et l'oxygne. Son fer est non hminique, ce qui la distingue d'autres mono-oxygnases que nous observerons par la suite. Les lectrons transmis par la rductase en provenance du NAD(P)H vont rduire l'atome d'oxygne qui se retrouvera dans la molcule d'eau. La protine B aurait une fonction rgulatrice. Sa prsence acclre normment le cycle catalytique et oriente son fonctionnement vers la mono-oxygnation au dtriment dune action comme oxydase [10]. On a l'impression que la protine B dforme l'hydroxylase et modifie ses performances. Cette ide n'a pas encore reu d'explication claire, mais tout suggre que la prsence de B n'est pas neutre, et qu'elle intervient d'une faon ou d'une autre dans la catalyse. La structure dtaille de la protine A (l'hydroxylase) est connue [11]. Elle est constitue de deux parties symtriques de formule quaternaire totale ()2. L'association des deux protomres se fait surtout par les chanes , et mnage une profonde crevasse centrale vers laquelle sont tourns les deux sites actifs. Le fer est reprsent au niveau de chaque sous-unit sous forme de deux ions Fe(III) relis par un pont hydroxo. Le noyau form par les deux ions mtalliques placs environ 3,1 l'un de l'autre et relis par un atome d'oxygne constitue un ple ractif exceptionnel permettant lactivation d'O2, lanion tant soit du carbonate soit de lactate. Les deux ions Fe ont chacun 6 coordinences avec des donneurs reprsents par Glu, anion O O Asp, His ou des molcules deau. Il y a touGlu Glu jours sur chaque mtal une liaison qui est H O dplaable par le substrat ou par un atome His doxygne appartenant O2. Glu
His H O Asp H Glu
Le noyau bi-mtallique
Les deux ions du fer sont lis par un hydroxyle. Le noyau bi-mtallique du dessin a t caractris en spectroscopie optique, RPE ou MSSBAUER. Il est trs similaire celui que nous retrouverons dans une srie d'enzymes : dioxygnases du benzne et du naphtalne, mono-oxygnases du tolune et du phnol, tolune 2- et 4-monooxygnases et phnol hydroxylase. Toutes ces protines sont apparentes par leur squence renfermant deux motifs consensus (D ou E)-x28-37DExRH qui correspondent chacun aux liens avec un ion fer. Ce type de structure n'est pas rare. Dautres protines ont un centre bi-mtallique du mme type, notamment lhmrythrine et la ribonuclotide rductase. Le fer a pour fonction d'activer l'oxygne diatomique de faon lui permettre de se scinder. Lun des atomes est inject dans le substrat. L'autre atome est emport par une molcule d'eau dans le cas dune mono-oxygnase, ou est plac une autre position du substrat si lenzyme est une dioxygnase comme celle du benzne. Le mcanisme prcis est incompltement lucid. L'oxydation d'une position carbone sature dans un hydrocarbure implique normalement le passage
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par un radical intermdiaire. La formation transitoire d'un tel radical est facilite dans une chane carbone au niveau d'une ramification. Le mthane reprsente un cas extrme, puisqu'il y a 4 atomes d'hydrogne autour du carbone sans aucune substitution. Le mthane est donc une molcule stable, peu ractive, relativement trs solide. Son attaque exige les grands moyens, et cest pourquoi l'enzyme a donc une double fonction, qui consiste exacerber la ractivit d'O2 et forcer l'apparition du radical .CH3 partir du mthane. Cet aspect chimique particulier explique peut-tre pourquoi il a t slectionn dans la nature un catalyseur dot d'un ple ractif bi-mtallique o les deux ions Fe(II) ou Fe(III) sont runis par un pont comportant un hydroxyle. Cette question appelle une petite digression. Un site bi-mtallique du mme genre existe dans la ribonuclotide rductase* de la majorit des organismes arobies. Cette enzyme cre le dsoxyribose partir du ribose. Le remplacement d'un hydroxyle la position 2' du ribose par un atome d'hydrogne demande un mcanisme ractionnel particulier o la formation intermdiaire d'un radical carbon est absolument requise. L'enzyme comporte deux parties dsignes par R1 et R2. Le site catalytique est sur R1. Un noyau ferrique double comparable celui de la mthane mono-oxygnase est sur la partie R2. Celle-ci se contente de stabiliser un radical plac sur une chane latrale de tyrosine. Le radical est transmis distance la partie R1 qui l'utilise dans son site catalytique pour modifier le substrat. Le centre bi-mtallique de la ribonuclotide rductase est donc un dispositif charg de maintenir en place le radical ncessaire au cycle catalytique sur R1. On peut penser qu'un dispositif de mme nature a t appel au cours de l'volution pour l'oxydation du mthane, en vue de faciliter l'apparition d'un radical au cours de l'oxydation du substrat. l'vidence l'apport du double noyau ferrique n'a t qu'une solution parmi d'autres, puisque la seconde oxygnase du mthane, localise dans la membrane, a un ple diffrent contenant du cuivre. La mthane oxygnase soluble a des proprits extraordinaires. Son site catalytique n'est qu'une surface d'adhsion non slective, capable de fixer un peu n'importe quoi si des interactions hydrophobes sont possibles. Des molcules hydrocarbones dont la plus simple est videmment CH4, sont susceptibles de venir "scotcher" temporairement la plage hydrophobe de chaque protomre autour du centre bi-mtallique et au contact direct de l'oxygne activ. D'autres exemples sont les peroxydases et diverses protases. Dans la majeure partie des cas, la reconnaissance d'un substrat par une protine se fait sur des critres plus prcis o la taille et l'orientation de la molcule partenaire dans le site sont cruciales. Le facteur essentiel reste ici la possibilit pour la molcule trangre de venir adhrer au voisinage du fer, l o se forme un ple ractif constitu par l'oxygne activ. La mthane oxygnase soluble effectue une transformation efficace du mthane 1 1 (Km = 3 M, Vm = 56 nmol . mg de protine . min ) [12]. Chose curieuse, ce n'est pas le meilleur substrat possible. L'enzyme est mme bien plus active sur le chloroforme ou le dichloro-mthane [13]. Le naphtalne est transform en naphtols, dont la prsence est facilement mesurable par diazotation en composs de couleur violette par l'ortho-dianisidine. Cette proprit tombe pic pour dtecter les monooxygnases solubles dans les mthanotrophes en culture ou sur bote avec un taux minimal de cuivre. L'enzyme membranaire ne fait pas de naphtols et ne donne pas cette coloration.
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Lattaque des composs halogns est particulirement intressante, puisqu'il s'agit souvent de produits nuisibles pour l'environnement. Le chloroforme et le dichloro-mthane sont dgrads compltement par les bactries en CO2 et H2O, l'halogne tant limin sous forme de chlorure. Cette minralisation par les mthanotrophes survient par comtabolisme sous l'effet initial de la mono-oxygnase soluble. Il y a gnralement corrlation entre le taux d'attaque de diffrents composs halogns et le taux de mono-oxygnase soluble dans les bactries. Une augmentation du cuivre ambiant nuit cette proprit, car l'oxygnase soluble est rprime et l'enzyme membranaire qui tend la remplacer ne peut pas prendre aussi bien le relais de ces biodgradations. Le TCE est reconnu et trait efficacement, avec un Km trs bas (0,35 M) et un taux de conversion presque aussi lev que celui du mthane. Or le TCE est particulirement redoutable, car il peut engendrer des produits toxiques et cancrignes. En outre c'est un rejet industriel frquent dont le grand dfaut est dtre rmanent. Le TCE et le ttrachlorothylne ont t dnoncs comme des contaminants majeurs dans les eaux de certains pays, notamment aux tats-Unis, et sa dure de vie moyenne dans les aquifres atteindrait 300 jours ! L'attaque du TCE par la mthane mono-oxygnase soluble de Methylosinus trichosporium conduit la formation d'un poxyde. Elle est relativement rapide, raison de 680 nmol . mg de protine1. min1, avec un Km gal 35 M. L'poxyde est transform en chloral, acide glyoxylique et chlorure, puis en CO2 et H2O. Le nettoyage du TCE par la mono-oxygnase soluble a ses revers. Celle-ci n'est pleinement exprime dans un biotope contamin qu'en fonction du dveloppement des mthanotrophes, qui est soumis la prsence d'autres substrats (comtabolisme), aux effets toxiques du TCE faible dose et la comptition entre espces dans les sols. Par exemple la prsence d'ammoniac a un effet contraire. En outre le trichlorothylne n'est pas un substrat de tout repos pour la mono-oxygnase, car son oxydation cre des liaisons covalentes avec les sous-units de l'enzyme, dont linactivation devient irrversible. On admet que chaque molcule de protine est inactive aprs avoir oxyd de l'ordre de 200 molcules de TCE. Aussi doit-on s'attendre ce que la disparition du TCE dans l'environnement soit assez lente. Sa vie moyenne dans les nappes phratiques est alors assez longue pour exercer des effets nfastes sur la faune et la flore. Un tableau permet de comparer l'activit de l'enzyme sur le mthane et sur plusieurs substrats chlors dont le TCE et le chloroforme. La mono-oxygnase est d'autant plus efficace que Vm et 1/Km sont plus grands. La faiblesse de l'attaque sur le trichlorothane s'explique probablement par l'encombrement strique local d l'entassement des atomes de chlore. Mme explication pour le ttrachlorothylne, qui ne figure pas dans le tableau. Ce driv totalement halogn rsiste l'action de l'enzyme et se comporte comme un inhibiteur comptitif. La varit des substrats traits par la mthane mono-oxygnase soluble a de quoi sduire. L'enzyme oxyde aussi en alcool benzylique le tolune, qui n'est jamais qu'un driv phnyl du mthane. C'est donc bien le groupe mthyle qui est oxygn. Dans le cas du styrne (vinylbenzne), la double liaison du groupe vinyle est sujette poxydation. Le noyau benznique lui-mme peut tre attaqu, comme dans le cas du nitrobenzne.
1. trichlorothylne 2. cis-1,2-dichlorothylne 3. trans-1,2-dichlorothylne 4. 1,1dichlorothylne 5. 1,1,1trichlorothane 6. 1,2dichlorothane 7. chloroforme 8. dichloromthane 9. mthane 0 H Cl Cl Cl H Cl H Cl H Cl Cl H Cl Cl 5 H H 10 H Cl H CC Cl H Cl 5 Cl H H CC H H Cl 6 15 (Vm/Km)
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C=C 1
C=C 2
C=C 3
C=C 4
Cl H C Cl Cl 7
Cl H C H Cl 8
Substrats de la mthane mono-oxygnase

Ce substrat est hydroxyl en un mlange de 3- et 4-nitrophnols. Le tableau rvle la remarquable efficacit de l'enzyme sur le chloroforme, une proprit assez caractristique de l'enzyme soluble par rapport la mono-oxygnase membranaire qui n'attaque le chloroforme que faiblement. L'oxygnase soluble n'est cependant pas une panace utilisable l'limination de n'importe quel substrat chlor. On le voit bien par la faiblesse de son action sur le mthylchloroforme (1,1,1-trichlorothane). Ce solvant largement utilis pour le dgraissage et le nettoyage sec a t mis l'index par le protocole de Montral (1987) par suite de sa rmanence dans la troposphre. Sa vie moyenne y est de plusieurs annes. Il disparat lentement par raction sur les radicaux hydroxyle, mais gagne la stratosphre o il libre du chlore par photolyse. On le considre comme indirectement nocif pour la couche d'ozone. Le cycle catalytique de la mthane mono-oxygnase commence par une rduction deux lectrons qui prcde la venue du substrat dans la poche du site actif. Le noyau bi-mtallique passe l'tat Fe(II). Fe(II) qui reoit une molcule d'O2. Il en rsulte l'apparition d'une entit ractive de type oxne, valence leve : Fe(IV).Fe(IV) = O. Le substrat intervient tardivement dans le cycle reprsent page suivante. Sa transformation comporte l'ablation d'un atome d'hydrogne et l'apparition d'un radical. Le centre bi-mtallique prend alors une valence mixte Fe(III).Fe(IV)OH. Le retour l'tat initial se ferait par la raction du radical avec l'oxygne du noyau bi-mtallique. Ces diffrentes tapes ont t tudies en dtail par RPE et cintique rapide dans le groupe de LIPSCOMB [14], et le cycle indiqu est une interprtation des rsultats du fonctionnement de l'hydroxylation par la protine A. Ltape essentielle est donc la formation dun radical responsable de l'attaque sur divers substrats. Dans le cas du noyau aromatique, l'oxygnation pourrait se faire directement par injection d'un atome d'oxygne sans formation d'un radical intermdiaire [15].
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H O
produit hydroxyl ROH
2e
rduction
H O H2O2 Fe(IV) Fe(III) Fe(II) R. H O H O ROH H+ H O O2
HO H O H+
HOO
substrat
RH
H 2O O
Le cycle catalytique de la mthane hydroxylase

L'enzyme a le pouvoir d'agir de plusieurs faons. Elle peut court-circuiter l'tape de rduction de l'oxygne et du fer en oxydant le noyau bi-mtallique directement par l'eau oxygne. Cette proprit se retrouve dans les peroxydases et peut seffectuer en absence d'oxygne diatomique. On voit que la mthane mono-oxygnase mrite bien le qualificatif d'"enzyme miracle". L'emploi des souches formant une mthane oxygnase soluble n'est pas trs facile. Son gne dans Methylosinus trichosporium est rprim par des doses faibles d'ions Cu. En outre l'attaque du trichlorothylne est fortement retarde par la prsence du mthane, qui est ncessaire pour la croissance des germes. Pour y remdier, un fragment de squence d'ADN d'une longueur de 5,5 kb contenant les gnes de la mono-oxygnase a t clon dans un plasmide et exprim chez plusieurs Pseudomonas. On a obtenu ainsi des souches croissance relativement rapide, capables de dgrader le trichlorothylne et le chloroforme, sans avoir les inconvnients prsents par la prsence du cuivre et la comptition entre le substrat et le mthane [16]. En somme les mthanotrophes capables de produire la mono-oxygnase soluble offrent de grandes possibilits. La mono-oxygnase membranaire confre des proprits comparables mais distinctes. Les cellules de la premire catgorie peuvent se dvelopper sur alcanes et alcnes chane droite ou ramifie comportant 4 8 atomes de carbone, ainsi que sur divers composs cycliques et aromatiques qui n'interviennent pas comme substrats de croissance. Les bactries ne se dveloppent que sur des hydrocarbures chane courte. Certains substrats, comme les drivs halogns, sont traits par comtabolisme, mais leur transformation n'apporte aucune nergie la cellule. L'enzyme membranaire des mthanotrophes contient donc du cuivre. En prsence des ions Cu, les cellules dveloppent des empilements de membranes internes riches en mthane mono-oxygnase insoluble. Le dveloppement de ces
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membranes permet une augmentation de la surface o peut s'insrer l'enzyme essentielle. Cette proprit commune dans les mthanotrophes s'observe aussi chez les bactries capables d'oxyder l'ammoniac et de participer la nitrification des sols. Or l'enzyme membranaire des mthanotrophes a une certaine ressemblance avec la mono-oxygnase qui oxyde l'ammoniac chez des espces comme Nitrosomonas europeae. L'ammoniac mono-oxygnase possde aussi du cuivre. Les deux systmes prsentent une nette homologie au niveau gntique et auraient une origine commune [17]. On manque de donnes structurales prcises parce que ces protines membranaires sont difficiles purifier. Toutefois la monooxygnase de l'ammoniac a t obtenue sous forme homogne chez N. europeae et l'on connat la squence de ses gnes [18]. On suppose que les deux enzymes ont conserv le mme modle d'organisation molculaire avant d'voluer dans deux directions, d'une part vers l'oxydation de NH3, d'autre part vers l'oxydation du CH4. Do la tentation d'extrapoler les proprits de l'une de ces enzymes l'autre. Cependant la physiologie de ces germes de part et d'autre n'est pas identique, et les niches cologiques qu'ils occupent ne se recouvrent que trs partiellement. voquons les rapidement. Nitrosomonas europeae fait partie des bactries nitrifiantes et transforme l'ammoniac en hydroxylamine (NH2OH), laquelle sera oxyde son tour en nitrite par une dshydrognase priplasmique. Le mthane est galement oxyd un taux plus faible. Ces oxydations sont productrices d'nergie et sont couples avec milation de CO2 par un cycle de CALVIN, car ces bactries sont chimio-autotrophes et utilisent l'nergie des oxydations pour assimiler le gaz carbonique, contrairement aux plantes et autres organismes utilisateurs de lumire et dsigns comme photoautotrophes. Une section ultrieure plus dtaille (page 159) sera consacre l'oxydation de l'ammoniac. Les mthanotrophes ont une physiologie trs diffrente, mais oxydent un peu d'ammoniac paralllement au mthane, et renferment d'ailleurs comme les bactries nitrifiantes une oxydorductase capable de transformer l'hydroxylamine en nitrite. Malgr la production de CO2 partir du mthane, beaucoup de mthanotrophes n'ont pas recours au cycle de CALVIN, mais assimilent une grande partie de leur carbone ou mme sa totalit sous forme de formaldhyde (HCHO). Les mono-oxygnases de ces deux sries de germes se ressemblent sur le plan fonctionnel. La source d'lectrons directe n'est pas NADH. Ce rle appartient un cytochrome de type b ou c, ou encore une quinone respiratoire rduite [19]. Les deux enzymes se ressemblent par une proprit intressante. L'actylne les inhibe en crant une liaison covalente avec l'un des polypeptides de la molcule. Cette raction facilite le reprage de ces oxygnases, soit en utilisant de l'actylne marqu au carbone-14, soit l'aide d'un marqueur fluorescent contenant un groupe alknyle. On sait que l'efficacit d'une enzyme dans les conditions optimales de son action dpend de deux paramtres : kcat et Km. Le premier exprime le nombre maximum de molcules de substrat que chaque molcule d'enzyme transforme par seconde. Le second est la concentration de substrat qui permet l'enzyme de fonctionner une vitesse moiti de la vitesse maximale thorique. La constante kcat de la majorit
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des enzymes est de plusieurs centaines, voire plusieurs milliers par seconde. Pour l'ammoniac mono-oxygnase, kcat ne serait que de 20. s1 sur NH3, une valeur faible. Chose curieuse, l'enzyme a la potentialit d'oxyder le mthane pratiquement la mme vitesse. Il faudrait pour cela que le mthane atteigne un niveau trs lev qui n'est jamais atteint dans la pratique (la valeur du Km de la protine pour le mthane est bien plus grande que pour NH3). L'ammoniac reste donc le substrat prfr de cette mono-oxygnase. La mthane mono-oxygnase prsente une situation analogue, mais inverse. L'enzyme est galement lente et oxyde aussi l'ammoniac, mais le mthane est cette fois le meilleur substrat. Les oxygnases membranaires Cu ont l'intrt d'tre peu spcifiques et de pouvoir transformer une foule de substrats organiques en mme temps que leur substrat normal, ce qui leur confre une participation intressante dans la dfense de l'environnement. Il n'est pas rare dans la nature qu'une faible slectivit des catalyseurs enzymatiques aille de pair avec une lenteur d'action (kcat faible), mais cette relation n'a pas de caractre absolument gnral. Les deux mono-oxygnases cites ont la capacit de transformer divers substrats aliphatiques, notamment des composs halogns du type chloroforme ou trichlorothane [20]. Cette activit est nanmoins assez restreinte. La mthane mono-oxygnase membranaire des mthanotrophes n'est exprime que si la teneur en cuivre atteint un taux suffisant, de l'ordre de 1 mole . mg1 de biomasse. En outre l'oxydation du mthane est sensible l'inhibition exerce par l'ammoniac engendr par la dcomposition des matires organiques ou lapport dengrais. L'influence du cuivre complique les choses, parce que cet lment n'est gnralement prsent l'tat libre dans les sols qu' trs faible concentration. Il est volontiers adsorb par l'humus, les argiles et les composs organiques. En somme les mthanotrophes et les bactries nitrifiantes se partagent le march des oxydations tous azimuts dans l'environnement. Ils oxydent la fois le mthane, l'ammoniac et divers composs organiques selon des modalits diverses trs sensibles aux conditions du milieu et difficiles contrler exprimentalement. On aura une meilleure ide de ces potentialits dans la section suivante. Il existe heureusement des moyens pour valuer la part relle revenant aux mthanotrophes. Par exemple l'oxydation du mthane dans les sols est inhibe par 0,5 mM d'acide picolinique (pyridine-2-carboxylique), alors que la transformation de NH3 en nitrate rsiste des taux trs suprieurs [21]. La prsence des mthanotrophes dans les terrains est galement rvle par amplification par PCR de l'ADN bactrien et l'identification de squences gnomiques relatives des enzymes caractristiques que nous rencontrerons plus loin. Quant aux proprits des bactries nitrifiantes, des donnes supplmentaires seront accessibles plus loin.
3.3 - CROISSANCE SUR MTHANE ET MTHANOL

On connat actuellement plus d'une centaine d'espces bactriennes capables de se dvelopper sur mthane. Toutes ces bactries ont en commun d'avoir une mthane mono-oxygnase transformant le mthane en mthanol, lequel est pris en
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charge par une mthanol dshydrognase spciale, une quinoprotine dont le cofacteur est le PQQ*. HANSON et d'autres auteurs ont galement signal l'existence de levures capables de se comporter facultativement comme des mthanotrophes [22], mais cette observation n'a pas t confirme. Par contre les levures mthylotrophes (se dveloppant sur mthanol) ne sont pas rares. La plus tudie est Hansenula polymorpha. Ces germes sont galement capables dutiliser des alcanes. Les bactries utilisatrices de mthane ne forment pas un groupe taxonomique homogne et ont volu en lignes indpendantes. Elles se rpartissent en deux grands groupes, I et II, qui se distinguent par des critres morphologiques et surtout par leur physiologie. Les premires, du type I, (Methylococcus, Methylobacter, Methylomonas) assimilent le carbone partir du formaldhyde, en utilisant un cycle mtabolique spcial appel cycle de l'hexulose monophosphate (XuMP). Les secondes, du type II, (Methylosinus, Methylocystis) assimilent le formaldhyde par une voie compltement diffrente appele cycle de la srine. Ces deux modes seront expliqus plus loin. Sur la base de la comparaison des ARN 16S, le type I fait partie des protobactries gamma*, et le type II aux alpha. On a reconnu depuis un type X, proche du type I, mais contenant la Rubisco du cycle de CALVIN et dot de caractres particuliers. Les mthanotrophes dans leur quasi-totalit ne peuvent se dvelopper qu'en prsence de mthane (mthanotrophes obligs 2). Ils utilisent volontiers une foule de composs monocarbons mthyls, sulfurs ou non (sulfure de mthyle, dimthylsulfure, choline, carbofuran) Voici un tableau trs simplifi pour montrer les diffrences entre les groupes I, X et II. Type I
Groupe de protobactries Cycle du XuMP Cycle de la srine Fixation de N2 Rubisco Morphologie dominante Vsicules membranaires internes Membranes internes concentriques Croissance 45C Gamma OUI non non non btonnets OUI non non
Type X
Gamma OUI quelquefois OUI OUI cocci OUI non OUI
Type II
Alpha non OUI OUI non btonnets non OUI non
Le diagnostic d'appartenance d'un isolat ces diffrents groupes peut se faire par hybridation molculaire avec des sondes nucliques, dtection d'enzymes caractristiques du mtabolisme ou composition en acides gras des phospholipides. Les mthanotrophes sont prsents partout o il y a une source de mthane et d'oxygne. Les espces dotes d'une nitrognase rduisent N2 lorsque le milieu est dpourvu d'azote ammoniacal ou organique, et ne peuvent le faire qu'en prsence 2 - Il y a une incertitude sur ce sujet. Beaucoup de mthanotrophes peuvent oxyder une grande varit de composs organiques (d'o leur intrt dans la dpollution), mais les transformations ont gnralement lieu par comtabolisme, la source carbone principale tant le mthane.
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d'un taux faible d'oxygne dissous. Les donnes actuelles montrent que ces bactries ont des potentialits extraordinairement varies, mais leur multiplication en culture pure est lente et rend plus difficile l'tude de leur physiologie. La raction limitante de leur mtabolisme est catalyse par les mono-oxygnases du mthane, mais leur coefficient Km pour CH4 est toujours infrieur 10 M traduisant une assez forte affinit pour le substrat. Les mthanotrophes n'ont donc pas besoin de fortes concentrations de mthane pour se dvelopper. Un grand nombre d'tudes ont tent de mesurer le taux de mthane dans divers milieux et la vitesse de sa disparition. La situation la surface du sol est trs diffrente selon que le mthane disponible diffuse partir les couches sous-jacentes o vivent les mthanognes, ou si le gaz est dissous directement partir de l'air ambiant. Dans le premier cas, la concentration en CH4 peut tre de l'ordre de 1 100 M, des taux largement suffisants pour un bon dveloppement des mthanotrophes. Dans le second cas, la teneur est beaucoup plus faible, de l'ordre de 2,5 nM seulement. On s'accorde penser que les mthanotrophes ont malgr tout une activit non ngligeable dans l'oxydation du mthane atmosphrique [23]. Les bactries les mieux adaptes aux faibles taux de mthane appartiennent le plus souvent au type I. Quelques applications pratiques utilisent les mthanotrophes pour le traitement des sols, car un apport relativement restreint de gaz naturel suffit favoriser le dveloppement des mthanotrophes et leur emploi dans les dcontaminations. La plupart des mthanotrophes sont msophiles et se dveloppent des tempratures infrieures 40C, avec un optimum vers 25C. Cependant Methylococcus capsulatus peut se dvelopper prs de 50C. On a isol dans les terres arctiques des souches qui croissent bien au-dessous de 15C. L'optimum de pH est souvent situ du ct lgrement acide (6,0), mais l'oxydation du mthane peut continuer en milieu encore plus acide, notamment dans les tourbires (o le pH peut s'abaisser au-dessous de 4). Elle est partage par des cellules de levure. La forte concentration en sel des marais salants et des lagunes ctires empche pratiquement toute oxydation microbienne du mthane. La plupart des analyses de terrain montrent que les mthanotrophes ont gnralement l'habitude de se dvelopper en association avec d'autres germes qui leur apportent des facteurs de croissance et les aident se dbarrasser de produits secondaires issus des substrats autres que le mthane. Des espces souvent associes aux mthanotrophes sont les Hyphomicrobia utilisatrices de mthanol, des bactries prosthque comme les Caulobacter. Les Hyphomicrobia ont une trs forte capacit fixer les matires carbones volatiles transportes par l'air et prdominent dans les milieux trs pauvres. Ce sont des mthylotrophes facultatifs trs spartiates pouvant se dvelopper sur le formaldhyde, l'thanol et l'acide actique. Leur dveloppement se fait par un cycle de bourgeonnement particulier qui rappelle celui des Caulobacter. La convivialit naturelle des mthanotrophes et la varit de leurs associations expliquent pourquoi il est difficile d'extrapoler les rsultats des cultures pures aux conditions relles de l'environnement. Un problme classique, qui n'est d'ailleurs pas particulier aux mthanotrophes.
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Comment le mthane et le mthanol sont-ils mtaboliss ? Les germes qui partent du mthane sont les mthanotrophes et sont exclusivement des bactries, tandis que ceux qui partent du mthanol, ou mthylotrophes, se recrutent la fois chez les bactries et les champignons, notamment les levures. Le stade cl est l'oxydation du mthanol en formaldhyde par une alcool dshydrognase* ou ADH. Ces enzymes acceptent divers alcools. Le mthanol n'est substrat que pour certaines d'entre elles. Contrairement aux levures qui utilisent une mthanol oxydase FAD, les bactries Gram-ngatives ont une mthanol dshydrognase (EC 1.1.99.8) qui a la particularit d'utiliser un cofacteur particulier appel PQQ. Cette enzyme de formule 22 est priplasmique et contient du calcium dont le rle est structural. Elle transmet ses lectrons la cytochrome oxydase membranaire par l'intermdiaire de cytochromes c dont le premier terme (cL) appartient une catgorie spciale. Un dessin reprsente la situation dans Methylobacterium extorquens e t Paracoccus denitrificans [24]. La croissance de celui-ci sur mthanol se fait gnralement en milieu arobie, mais reste possible en absence de O2 avec le nitrate comme accepteur.
2 H+ + 1/2 O2 cytoplasme membrane cytoplasmique PQQ PQQ 2+ Ca2+ PQQ Ca2+ HCHO 2 e 2 H+ cyt. cL CH3OH cyt. c 2 e oxydase H2O
priplasme
2 e
mthanol dshydrognase membrane externe
Oxydation du mthanol
Cette oxydation est moins bien connue chez les Gram-positives et offre des solutions varies avec la participation de PQQ et de NAD+. Bacillus methanolicus est une espce thermo-tolrante capable de se dvelopper sur mthanol plus de 50C [25] et contient NAD+ comme cofacteur fortement li. Une autre espce particulirement tudie est Amycolaptopsis methanolica [26]. Il convient de signaler que le mthanol ne provient pas uniquement de l'oxydation du mthane. Il est produit en abondance par la dgradation de composants naturels du rgne vgtal : esters et thers mthyliques manant des pectines et lignines. Cela explique pourquoi les mthylotrophes sont si nombreux et varis dans le sol. Le formaldhyde occupe une position cl du mtabolisme. Il existe deux grandes stratgies mtaboliques pour l'assimiler chez les bactries. Dans le cycle de l'hexulose-monophosphate, le formaldhyde est soud par aldolisation un accepteur en C5. Le cycle de la srine implique une double incorporation de formaldhyde et de CO2, le premier sur la glycine, le second par carboxylation du PEP.
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Les levures mthylotrophes ont une stratgie distincte, mais utilisent un cycle similaire (xylulose-monophosphate). Dans le cycle du ribulose-monophosphate des mthanotrophes de type I (Methylosinus, Methylocystis), l'accepteur de formaldhyde est le ribulose-5-phosphate [27]. L'hexulose-6-phosphate synthase (HPS) et l'hexulose-phosphate isomrase (HPI) sont les enzymes caractristiques. Le bilan global de l'entre du formaldhyde peut s'crire : 3 HCHO + ATP Glycraldhyde-3P + ADP
CH2OH HCOH C=0 HCOH HCOH CH2O P 3 hexulose-6-phosphate
CH2OH C=0 HCOH HCOH CH2O P
H C=O H 3 HPS
HPI
CH2OH C=O HOCH HCOH HCOH CH2O P 3 fructose-6-phosphate
3 ribulose-5-phosphate rarrangements CHO HCOH CH2O P
biomasse
6 glycraldhyde-3-phosphate (G3P)
Le cycle du ribulose monophosphate

Le cycle n'a pas t reprsent en entier pour ne garder que l'essentiel. Ce mtabolisme assimilateur est considr comme performant car il consomme peu d'nergie ATP. La succession des transformations du fructose-6-phosphate en ribulose-5-phosphate n'est pas dtaille. Elle met en jeu plusieurs tapes qu'on retrouve dans le cycle de CALVIN 3, mais avec une dpense d'nergie totale bien plus faible. C'est un point important. Divers mthylotrophes sont en mme temps des autotrophes : ils utilisent le dioxyde de carbone form partir du formaldhyde pour l'assimiler par le cycle de CALVIN et profitent justement des enzymes qui fonctionnent en mme temps dans les deux voies. Les mthanotrophes de type II (Methylomonas, Methylobacter) incorporent le formaldhyde dans la srine selon un principe qui n'a rien voir avec le prcdent. La raction de dpart est catalyse par la srine-hydroxymthyl transfrase (STHM) utilisant la glycine et le formaldhyde sous forme d'une combinaison avec le ttrahydrofolate*. Le schma du cycle, assez compliqu, est celui qui reoit le meilleur assentiment malgr diverses incertitudes [28]. L'ensemble de cette voie consiste incorporer deux molcules de formaldhyde sous forme d'actyle (dans l'actyl-CoA). 3 - C'est en quelque sorte une variante de celui-ci. Le fragment monocarbon assimil n'est pas CO2 mais HCHO, et le compos accepteur n'est pas le 1,5-ribulose-diphosphate, mais le monophosphate.
COO C=O CH2OH 2 srine
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2 HCHO 2 glycine succinate COO HC=O
STHM
SGAT
2 3-hydroxypyruvate 2 NAD(P)H HPR 2 NAD(P)+ 2 glycrate 2 ATP
ICL
2 glyoxylate
GK MCL
2 ADP
actyl-CoA
2 3-phosphoglycrate
malyl-CoA CoA malate NAD+ Pi NADH oxaloactate
2 2-phosphoglycrate 2 H2O
PEPC
CO2
2 phosphonolpyruvate ATP pyruvate NAD+
actyl-CoA NADH
CoA
Le cycle de la srine
Les tapes enzymatiques importantes ont t indiques en abrg. la suite de la STHM interviennent la srine:glycine aminotransfrase (SGAT), l'hydroxypyruvate rductase (HPR) et la glycrate kinase (GK). Le mtabolisme du 3-phosphoglycrate suit un cheminement classique jusqu' l'actyl-CoA. Une molcule sur deux de phosphonolpyruvate (PEP) est carboxyle par la PEP carboxylase (PEPC) [29], une enzyme qu'on trouve aussi dans les plantes dites C4. On constatera que cette opration ne correspond pas ici une assimilation de CO2, car celui-ci est produit par la dcarboxylation du pyruvate. La fermeture du cycle consiste rgnrer le glyoxylate. Une partie est engendre par la malyl-CoA lyase (MCL), et l'autre par les transformations de l'actyl-CoA par le chemin classique du citrate (par la citrate synthase) et de l'isocitrate. L'enzyme cl est alors l'isocitrate lyase (ICL) dans ce qu'on appelle couramment le shunt glyoxylique, l'isocitrate tant scind en glyoxylate et succinate. Le bilan des oxydorductions de cette srie ractionnelle est globalement nul. Ce n'est pas tonnant du fait que le niveau d'oxydation du formaldhyde est proche de celui du carbone dans la cellule. La facture nergtique en ATP est modique. Une part revient l'activation du formaldhyde en mthylne-FH4 (substrat de la premire tape catalyse par la STHM), une autre la phosphorylation du glycrate. Une molcule d'ATP est restitue par le passage du PEP au pyruvate. On peut donc considrer que ce cycle d'assimilation du formaldhyde est relativement trs
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performant. Les bactries de type II ne pratiquent pas le cycle de CALVIN d'assimilation de CO2 et n'ont pas de Rubisco. Mais elles ont la possibilit d'assimiler l'azote de l'air par une nitrognase, dont les bactries de type I sont dpourvues. Les bactries de type I et II se rpartissent donc en deux groupes distincts qui diffrent la fois par leurs proprits mtaboliques, leurs potentialits physiologiques et leur origine volutive. Les mthanotrophes de type I se dveloppent plus facilement en prsence d'un faible taux de CH4, tandis que le type II prfre davantage de mthane plus fort et des taux plus faibles d'O2, d'azote organique et de cuivre. Ces diffrences contribuent rgler la rpartition des mthanotrophes dans l'environnement. Ainsi la rhizosphre des plantes aquatiques contient surtout des mthanotrophes de type II, l o il y a beaucoup de mthane et un peu d'oxygne apport par la plante. C'est le cas des lentilles d'eau (Lemna minor) flottant la surface des mares et des tangs, et des jacinthes d'eau (Eichornia crassipes) qu'on voit envahir les plans d'eau et les rivires dans les pays chauds. Ces vgtaux sont souvent gnants par leur prolifration, mais participent indirectement au recyclage du mthane et la dpollution. On a not que les mthanotrophes de type II avaient de fortes potentialits pour dpolluer l'environnement, notamment en oxydant le trichlorothylne (TCE). L'abondance des levures mthylotrophes dans les sols a dj t signale. Elles sont avides de profiter de la dgradation des substances pectiques. Leur mtabolisme du mthanol diffre de celui des bactries. Une premire diffrence est de mettre contribution les peroxysomes de la cellule. La seconde est de transformer le formaldhyde par un cycle du xylulose-5-phosphate (Xu5P). La raction cl indique par le schma est catalyse par une dihydroxyactone synthase (EC 2.2.1.3), qui est une ctolase particulire.
CH2OH C=0 H C OH H C OH CH2O P ribulose-5P (Ru5P) CH2OH C=0 HO C H C OH CH2O P xylulose-5P (Xu5P) H C=O H CH2OH C=0 CH2OH +
C=O H C OH CH2O P
glycrone glycraldhyde-3P (G3P)
Dihydroxyactone synthase
La glycrone ou dihydroxyactone est phosphoryle en dihydroxyactone phosphate. Celui-ci avec le glycraldhyde-3P sont mtaboliss par les voies classiques. Des rarrangements en srie rgnrent cycliquement le xylulose-5P, avec des tapes communes la voie des pentose-phosphates ou au cycle de CALVIN. L'oxydation des molcules monocarbones (mthane, mthanol, formaldhyde) met donc en jeu une biochimie particulire dont les rpercussions sur l'environnement sont considrables. Pour terminer cette section en faisant un peu diversion, on citera une question qui peut n'avoir qu'une importance assez marginale dans la dfense de la biosphre, mais l'histoire mrite tout de mme d'tre conte, car elle met en scne des associations intressantes en milieu marin grande profondeur.
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Des programmes de recherche ont t financs aux tats-Unis par la NASA pour tudier l'adaptation des tres vivants au mthane tellurique dgag au fond des mers. Le mthane produit par voie biologique prsente un dficit isotopique en carbone-13, et l'on peut donc dterminer grce cette "signature" si le mthane est effectivement produit par des tres vivants. Dans les grands fonds ocaniques, l'absence de lumire rend impossible toute photosynthse et la vie ne peut se dvelopper qu'en tirant de l'nergie de ractions chimiques. Le long d'accidents tectoniques et de fissures, la circulation de l'eau de mer entrane des constituants du manteau basaltique. Les manations hydrothermales apportent des gaz riches en hydrogne sulfur. Ce dernier est oxyd par des bactries et leur sert de source d'nergie. Plusieurs espces de mollusques et de vers spcialiss s'tablissent autour des sources hydrothermales des grands fonds. Leurs tissus renferment des bactries symbiotiques, qui sont couramment des organismes utilisateurs de sulfure (dits thio-autotrophes), c'est--dire des germes capables d'assimiler le dioxyde de carbone grce l'nergie fournie par l'oxydation des sulfures. Les vers marins du genre Riftia isols prs des souffleurs volcaniques sous-marins prsentent une telle association. Au cours de leur dveloppement, ils perdent leur tube digestif et sont rapidement coloniss par des bactries autotrophes tirant leur nergie de l'oxydation des sulfures. L'animal livre aux bactries qu'il hberge l'oxygne et le gaz carbonique dont elles ont besoin, en utilisant pour cela plusieurs hmoglobines. Le ver tire sa propre nergie l'aide de ses mitochondries tout en profitant des matires organiques produites par les bactries. Celles-ci les ont produites partie du CO2 assimil. Tout se passe donc comme si l'animal tirait son carbone du CO2, et la dviation du rapport isotopique du carbone en apporte la preuve. Il y a d'autres faits tonnants de ce genre. On connat aussi des "souffleurs froids" ramenant de grandes quantits de mthane et permettant le dveloppement de la vie. Au fond du golfe du Mexique au large de la Louisiane ont t dcouvertes des moules particulires (Calyptogena) qui renferment une grande quantit de mthanotrophes symbiotiques au niveau de leurs branchies. On a pu montrer que l'animal hberge des bactries dans ses tissus et s'en nourrit. Les molcules organiques qu'il synthtise sont appauvries en carbone-13, ce qui montre qu'elles tirent leur origine d'un mthane de source biologique. Les mthanotrophes symbiotiques fabriquent une srie de composs insaturs de structure apparente celle des strols et du cholestrol. Or les bactries ne font pas de cholestrol, qui est l'apanage des eucaryotes. Tous ces composs, y compris le cholestrol fait par l'animal, ont t trouvs dficients en carbone-13. On a pu en dduire que le mollusque faisait son cholestrol en profitant de certains prcurseurs intermdiaires (hopanodes, mthyl-strols) synthtiss par les bactries mthanotrophes symbiotiques partir du mthane rcupr dans le milieu. D'autres prlvements faits grande profondeur ont permis de rcolter des moules hbergeant la fois des mthanotrophes et des thio-autotrophes. Elles ont t rcoltes 3476 m de profondeur sur la dorsale mdio-atlantique par le sous-marin exprimental ALVIN. On y dtecte la fois la mthanol dshydrognase caractristique des mthanotrophes et la Rubisco, l'enzyme cl du cycle de CALVIN. Une situation biologique exceptionnelle o apparat une double symbiose [30] entre un animal et deux espces procaryotiques diffrentes !
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La dcouverte de telles relations biologiques dans des environnements considrs comme hors du commun suscitent de nombreuses spculations. Une hypothse consiste voir les organismes dcouverts comme des reliques de formes ancestrales qui auraient t vinces partout dans la biosphre, mais prserves des endroits privilgis. Une autre interprtation voit les formes vivantes bizarres comme le rsultat d'une volution rgressive partant d'organismes communs sur lesquels se serait exerce une pression slective importante. Ainsi la colonisation des grandes profondeurs aurait ncessit une adaptation pousse par transformation d'espces ordinaires. Cette question suscite actuellement un courant de recherche fascinant.
3.4 - MTHANOTROPHES CONTRE ORGANOCHLORS

Les mthanotrophes dtenteurs de mthane mono-oxygnase soluble sont capables d'liminer une grande varit de produits comprenant des xnobiotiques. Les bactries comptentes sont en gnral de type II ou X. Les mthanotrophes de type II assimilent le carbone du formaldhyde et du CO2 par le cycle de la srine. Ils contribuent dcontaminer les sols pollus par des solvants organochlors comme le trichlorothylne (TCE), le 1,2-dichlorothane et le chloroforme. Les organochlors sont consomms en grande quantit car ils ont l'avantage d'tre d'excellents solvants, de cot modique, stables et peu inflammables. On les rencontre dans les activits de dgraissage, dans la fabrication des matires plastiques, dans les procds d'extraction (comme dans la fabrication du caf dcafin), dans le contrle des parasites et des champignons, et enfin comme anesthsiques. Des produits chlors de ce type apparaissent fortuitement au cours de la purification de l'eau par chloration. Comment ces solvants organochlors sont-ils transforms dans les milieux contamins ? Le principe de base de leur limination diffre selon que les conditions sont arobies ou anarobies. Lorsqu'elle est ralise, l'limination de l'halogne se fait toujours sous forme d'ions chlorure. La partie carbone du substrat est soit minralise jusqu'au stade du CO2, soit convertie en produits secondaires rcuprs par d'autres organismes. Toute dgradation complte est facilite par deux conditions. La premire est celle du comtabolisme. Le substrat chlor n'assure pas la croissance du germe par lui-mme. Il faut qu'une autre source carbone soit transforme par un arsenal enzymatique peu spcifique qui traite le substrat chlor dans la foule [31]. Par exemple le trichlorothylne et le chloroforme sont dans ce cas. L'apport de germes comptents sur le terrain pollu ne sera gnralement pas suffisant pour obtenir un nettoyage efficace. Il faudra prvoir l'introduction de sources nutritives supplmentaires, notamment du mthane pour stimuler les mthanotrophes. En somme on lutte contre une pollution nfaste par une deuxime pollution qui a l'avantage d'tre inoffensive. La seconde condition pour une dgradation complte est le dveloppement d'associations bactriennes. L'limination d'un xnobiotique est souvent impossible avec un seul germe. Un mthanotrophe de type II apporte une contribution qui sera complte
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par d'autres organismes comme un Hyphomicrobium. La pice matresse de dpart est videmment la mthane mono-oxygnase soluble. L'enzyme a t examine en dtail chez Methylosinus trichosporium. Nous savons que cette enzyme trois composants contient un noyau bi-mtallique dans son site actif. Si on se reporte au cycle catalytique de la mthane mono-oxygnase indiqu plus haut, on voit que chaque noyau bi-mtallique FeOFe lie O2 aprs avoir subi une rduction. L'opration fait exploser la molcule d'oxygne diatomique et libre une molcule d'eau. Un atome d'oxygne reste alors sur le centre bi-mtallique, qui devient une entit extrmement ractive et stabilise par rsonance, symbolise sur le schma par les trois formules msomres [32]. L'attaque du TCE serait de nature radicalaire.
H O Fe IV Fe IV III H O Fe Fe IV III O. Fe H O Fe III Cl Cl TCE Cl H
+
tape oxydante du cycle catalytique
Cl Cl H O
+
Cl . H Cl Cl
+
O. Fe III III
Cl H O Fe H O Cl III poxydation Fe Cl O H O Fe III III Cl H
III Cl Cl Cl H O III Fe
Fe H O
Fe
migration du chlorure Fe
III
Oxydation du TCE par la mthane mono-oxygnase

Il apparat deux produits de transformation du TCE, l'poxyde de trichlorothylne ( droite sur la figure) et l'hydrate de chloral. L'poxydation est majoritaire et emporte 95% de la transformation. Il n'y a donc pas de dchloration ce stade. Ce n'est pas le seul inconvnient. Quand on a voulu utiliser un mthanotrophe tel que Methylosinus pour liminer le TCE des sols contamins, il a fallu se rendre compte que l'efficacit n'tait pas toujours au rendez-vous. En effet, le TCE par lui-mme ne peut pas assurer la croissance des bactries et le vritable substrat de croissance, qui est le mthane, entre en comptition avec le TCE pour l'oxygnase. Il en rsulte une baisse de rendement, mais plusieurs solutions existent pour y pallier. La premire mthode consiste obtenir des associations de germes, o des Pseudomonas et bactries apparentes liminent le chloral et l'poxyde. Le chloral est oxyd en trichloro-actate, qui est mtabolis en oxaloactate et autres drivs par un mcanisme connu chez un Pseudomonas [33]. L'poxyde est transform
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son tour par la mthane mono-oxygnase et la tolune 2-mono-oxygnase appartenant des Pseudomonas. L'efficacit tend rester incertaine, cause des dgts causs par la ractivit de l'poxyde. La deuxime solution consiste isoler des mthanotrophes dont les performances ont t amliores par mutation. Cette voie a t explore par FICH et coll. [34]. Ces auteurs ont tout simplement slectionn un mutant de Methylosinus trichosporium qui avait perdu toute sensibilit au cuivre (sans doute par dficience du transporteur spcifique), ce qui lui permettait de fabriquer la mono-oxygnase soluble dans toutes les conditions. La troisime voie relve du gnie gntique. Il s'agit de cloner le groupe de gnes codant pour la mono-oxygnase dans une autre espce, elle-mme dote de potentialits supplmentaires. JAHNG et WOOD ont log les gnes de Methylosinus dans un plasmide, lui-mme introduit dans un Pseudomonas putida [35]. Les bactries modifies transformaient le TCE un peu moins vite que le mthanotrophe de dpart. Lattaque restait partielle (40%), mais ne subissait aucune inhibition par le cuivre. Toute comptition avec le mthane tait absente. En outre ce Pseudomonas minralisait trs activement le chloroforme. La dpollution arobie de solvants chlors comme le TCE nest pas propre la mthane mono-oxygnase. Elle est ralise gnralement par des enzymes trs peu slectives. Nous la retrouverons au Chapitre 8 avec la tolune dioxygnase et la tolune 2-mono-oxygnase. Cette dernire a des similitudes avec l'oxygnase du mthane par sa structure et l'existence d'un noyau de type FeOFe dans chaque site catalytique. L'enzyme oxyde aussi le TCE en poxyde, qu'il transforme nouveau en dichloro-actate [36]. Les vertus des mthanotrophes ont rapidement fait germer l'ide d'une utilisation pratique. Il s'agissait de favoriser le dveloppement des bactries dans des conditions o la mthane oxygnase soluble tait fonctionnelle. Pour aboutir ce rsultat, il fallait bien sr leur fournir du mthane, ainsi que des sources d'azote et de phosphore. Les polluants taient destins tre oxyds en mme temps que la source carbone principale par comtabolisme. Un procd a t dvelopp par une firme amricaine 4, consistant injecter horizontalement au-dessous de la nappe phratique un mlange d'air et de mthane faible concentration (moins de 5%) afin d'viter tout risque d'explosion. Les gaz diffuss taient recueillis au-dessus de la nappe aquifre. Une dcontamination efficace tait obtenue en quelques semaines avec un cot rduit 5. Quelques difficults peuvent surgir dans cette opration. Le mthane industriel doit tre dbarrass de toutes traces d'actylne car celui-ci inhibe l'oxygnase du mthane. Il faut veiller ensuite favoriser la multiplication des bactries. On doit donc ajouter une source de phosphore et d'azote. Si cela ne s'avre pas suffisant, on instille dans le sol des bactries comptentes. Les ingnieurs ont inject en mlange l'air du trithyl-phosphate (un compos volatil) 0,07% et de l'oxyde nitreux 0,007%. Afin d'viter l'effet de comptition par le mthane, celui-ci est inject raison de 4% de faon
4 - Westinghouse Savannah River Co. 5 - D'aprs un rapport d'expertise de T.C. HAZEN et coll. (1995); la socit est Aiken (North Carolina) et a fait breveter son procd en 1995. Voir : S.M. PFIFNER et coll.(1997) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 : 204-212.
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discontinue : des injections de mthane pendant plusieurs heures alternent avec l'emploi d'un mlange gazeux sans mthane. La premire phase stimule la croissance des bactries, alors que la seconde favorise la destruction des matires polluantes. Une puration des produits indsirables a t ralise ainsi aprs une priode de quelques jours quelques semaines. L'utilisation des mthanotrophes des fins pratiques ne fait que reproduire certaines conditions naturelles o sont limins une foule de composs un seul atome de carbone ou portant des groupes mthyle : drivs de la choline, sulfure de mthyle, bromure de mthyle, Carbofuran (un pesticide) et beaucoup d'autres, sans oublier la destruction, comme nous l'avons vu, du trichlorothylne et de divers hydrocarbures halogns. En rsum, l'oxydation biologique du mthane est une proprit rpandue, caractrise par une biochimie particulire, pratique par des germes divers qui sont susceptibles de faire des biodgradations performantes comme la destruction du TCE et d'autres produits. Leur fonction cologique dans l'environnement semble considrable et donne lieu des applications pratiques intressantes. La section suivante est consacre plus particulirement aux halomthanes en gnral.
3.5 - HALOMTHANES
Les drivs mono-halogns du mthane sont en majorit des produits naturels prsents dans l'atmosphre. On les accuse de contribuer la destruction de la couche d'ozone. Le plus abondant est le chloromthane (CH3Cl), soit environ 0,0006 ppmv. Cela peut paratre bien peu, mais reprsente tout de mme 5 millions de tonnes dans l'atmosphre terrestre avec une demi-vie estime 1,2 anne. Beaucoup plus faibles sont les taux de CH3Br et CH3I, mais le premier est bien plus ractif par ses effets sur la couche d'ozone, qui sont presque aussi importants que ceux de son homologue chlor [37]. L'action sur la couche d'ozone est le rsultat d'une chimie radicalaire complexe. Par exemple CH3Cl subit en prsence de radicaux hydroxyle une photolyse qui gnre du monoxyde de chlore (ClO) et du chlore atomique (Cl) transports dans la stratosphre. Ces entits ragissent avec l'ozone qui fait retour O2. Le rsultat global est alors : 2 O3 3 O2. La plus grande partie est produite par les ocans, par la combustion du bois ou sa dcomposition par des champignons. Les plantes mettent un peu de chlorure de mthyle, par exemple les tubercules de pomme de terre [38]. On estime que les missions de CH3Cl et CH3Br d'origine humaine sont relativement faibles, peine quelques pour cent du total 6. Il existe donc une destruction naturelle de la couche d'ozone, dont le mcanisme et l'importance sont encore matire controverse. Mais l'intervention humaine s'est manifeste surtout par l'mission des chlorofluorocarbones ou CFC, qui ont donc renforc de faon alarmante un processus naturel. La couche d'ozone est surveille quasi quotidiennement par les
6 - Elle est plus importante, tout en restant minoritaire, dans le cas du bromure, utilis comme dsinfectant par fumigation. L'iodure de mthyle semble beaucoup moins important cause de son temps de sjour qui reste bref (quelques jours).
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stations scientifiques de l'Antarctique. L'importance de cette diminution d'ozone dans cette rgion du globe loin des principaux foyers d'activit humaine semble due au rgime climatique trs froid et ses variations pourraient tre naturelles. Le problme n'est toujours pas rsolu et dborde sur des controverses scientifiques, conomiques, politiques et mdiatiques. Revenons au chlorure de mthyle ou chloromthane. Quelles sont les sources naturelles des halomthanes ? Il semble que les principaux producteurs soient des organismes marins du plancton, des algues, et des plantes halophiles du littoral (Salicornia, Spartina). Des estimations quantitatives faites sur des marais salants californiens confirment l'intervention des vgtaux halophiles [39]. Les champignons et divers vgtaux terrestres font couramment des halocarbones. Par exemple les champignons des genres Fomes et Phellinus librent du CH3Cl, qui est peut-tre un agent de dfense. Cette production a t observe aussi chez Mesembryanthemum crystallinum ou Herbe Glace (une petite ficodace dcorative utilise dans les rocailles) et les tubercules de pomme de terre frachement rcolts [40]. Les halomthanes ont plusieurs origines. On en connat au moins deux. La premire est fonde sur l'action d'une peroxydase spcialise, ou haloperoxydase. Un ion halognure X est oxyd en X+ l'aide de H2O2, et l'halogne est insr sur un accepteur RH contenant plusieurs atomes de carbone (un intermdiaire du mtabolisme) selon la raction gnrale [41] : RH + X + H2O2 + H+ RX + 2 H2O (1)
Les plantes et les champignons ne sont pas les seuls gnrer des composs halogns. Cette proprit a t reconnue chez diverses bactries qui dtiennent une haloperoxydase spciale plus ou moins spcifique et contenant une flavine [42]. Le driv halogn (RX) se dcompose ensuite ici en librant CH3Cl ou CH3Br. De telles haloperoxydases sont communes chez les algues et champignons, qui utilisent aussi une autre voie fonde sur un donneur de mthyle trs classique dans le mtabolisme, la S-adnosylmthionine ou AdoMet*, selon : X + AdoMet CH3X + AdoHCys 7 (2)
La petite Herbe Glace possde ce systme [43], et l'enzyme est une mthyl-transfrase. Le chou (Brassica oleracea) renferme en abondance une enzyme du mme type. Le plus extraordinaire est que des bactries utilisent CH3Cl comme substrat de croissance malgr sa dilution dans l'atmosphre. Les mthylotrophes sont en premire ligne. Plusieurs organismes mthylotrophes capables de se dvelopper sur chloromthane comme seule source de carbone et d'nergie ont t isols. L'un d'eux est un homo-actogne strictement anarobie (Acetobacterium dehalogenans), d'autres sont des mthylotrophes arobies des genres Hyphomicrobium et Methylobacterium. On s'arrtera ici aux seuls arobies. cause de la dilution du substrat dans l'air ambiant, on imagine mal que les bactries puissent se nourrir autrement que par le chlorure de mthane produit in situ dans le sol par les champignons et les plantes, dans des environnements minuscules o le gaz est plus concentr.
7 - S-adnosylhomocystine.
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L'assimilation de CH3Cl peut se faire avec ou sans comtabolisme par oxydations successives. En anarobiose, Acetobacterium dehalogenans rcupre le groupe mthyle pour en faire du mthyl-FH4 [44]. C'est un intermdiaire que nous connaissons aprs avoir examin le mtabolisme des actognes, et il nous fera faire un petit retour en arrire. Le mthyl-FH4 fait partie de la voie de l'actyl-CoA ou voie de WOOD, qu'on trouve aussi chez les mthanognes. Le Methylobacterium souche CM4, un mthylotrophe arobie tudi par VANNELLI et coll. [45] (chapitre 4), utilise le chlorure de mthyle comme seule source de carbone et d'nergie par un mcanisme qui ressemble curieusement celui des actognes et des mthanognes. Cependant le rsultat des transformations n'est pas l'actyl-CoA mais le formiate. Le rendement de croissance est lev, soit 2,8 g de protine cellulaire par mole de substrat carbon. Des oxydations du bromomthane et du fluoromthane par les mthanotrophes ont t galement observes. Pour Hyphomicrobium chloromethanicum, CH3Cl est galement utilisable comme seule source de carbone et d'nergie et donne lieu un mtabolisme similaire dont un dessin montre le principe [46].
CH3 Co(I) enz. CH3Cl CmuA Co(III) enz. FH4 Cl CmuB CH3 FH4 [2H] CH2 FH4 [2H] CH FH4 [2H] HC FH4 H2O FH4 HCOOH
Oxydation du chlorure de mthyle par Methylobacterium

Les deux premires tapes sont catalyses par les mthyl-transfrases CmuA et CmuB, utilisant un corrinode. On pourra comparer le mcanisme avec celui des actognes. Les oprations se droulent ici en sens inverse. Elles sont dduites des rsultats obtenus avec des extraits acellulaires. Le mthyle est greff sur le cobalt quand celui-ci passe de l'tat CoI CoIII, puis dcharg sur le ttrahydrofolate (FH4) pour produire le mthyl-FH4. Observons ici les diffrentes oxydorductions ralisables sur le FH4, avec la sortie le formyl-FH4 et le formiate. Les trois oxydations successives sont symbolises par [2H] 8. Cette voie conduisant au formiate est un mtabolisme nergtique. Comme les bactries ont galement besoin d'une source de carbone, elles prlvent celui-ci au niveau de mthylne-FH4, qui alimente le cycle de la srine dcrit antrieurement. L'intervention d'un corrinode est assez exceptionnelle chez des organismes ayant un mode de vie arobie. Chose intressante, la protine CmuA a des analogies reconnaissables avec la mthionine synthase du colibacille. Cette enzyme reprsente une tape cl du mtabolisme des lments monocarbons (voir mthionine*). Une ressemblance significative au niveau d'une portion de squence a t trouve avec une mthyl-transfrase appartenant un mthanogne (Methanosarcina barkeri). Il y a plus tonnant encore. Un autre Methylobacterium (M. extorquens AM1) utilise en
8 - On reconnat successivement les stades mthyl-FH4, mthylne-FH4, mthnyl-FH4 et formyl-FH4.
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plus du FH4 une ttrahydro-mthanoptrine trs proche de celle que les mthanognes mettent en jeu au cours de la rduction de CO2 en mthane [47]. On croyait antrieurement que ce cofacteur tait strictement rserv aux archaebactries mthanognes et rductrices de sulfate. Cette trouvaille laisserait supposer que les gnes impliqus dans la mthylotrophie et la mthanognse ont une origine commune trs ancienne, avec le mme schma directeur dans la gestion mtabolique des lments monocarbons entre bactries arobies et archaebactries strictement anarobies. Chose intressante, l'assimilation du CH3Cl par les mthylotrophes donne lieu une diminution du rapport 13C/12C de mme ordre de grandeur que celui de la mthanognse. Le dficit en carbone-13 est de l'ordre de 7% par rapport au rservoir carbon de dpart. On suppose videmment que le mcanisme de base mis en jeu est similaire [48]. Il existe donc un cycle des halognures de mthyle dans la nature, le principal tant celui du CH3Cl. Un quilibre dynamique, dont les paramtres ne sont pas entirement connus, s'tablit entre la production biologique de ces halognures et leur oxydation par les bactries mthylotrophes du sol. Le mtabolisme de celles-ci prsente une ressemblance troublante avec celui de certaines archaebactries. La mthyltransfrase corrinode retient particulirement l'attention. Sa spcificit est assez large. Elle peut catalyser un va-et-vient de mthyle entre un donneur et un accepteur, utilisant CH3Cl, CH3 Br ou CH3I pour mthyler toute une panoplie d'accepteurs: halognures, nitrite (NO2), cyanure (CN), thiocyanate (SCN) et hydrosulfure (HS) ! L'industrie humaine n'a fait que contaminer l'environnement par de nouveaux lments monocarbons sous la forme des chlorofluorocarbones proprement dits et des halons.
CH3Cl
CH3Br
CFC halons
HCFC
CH3CCl3 + CCl4
Le diagramme montre la rpartition en quivalents chlore des gaz halogns de la troposphre, d'aprs des mesures faites en 1999 et rapportes par BUTLER [49]. Sont reprsentes en blanc les parts attribues aux missions naturelles. Les autres, en gris, proviennent de l'activit humaine et reprsentent 77% du total (certaines abrviations sont redfinies en glossaire). On estime que les CFC ont un temps moyen de rmanence lev dans l'atmosphre, de l'ordre de 60 100 ans. Les plus connus sont le fron-11 (CCl3F) et le fron-12 (CCl2F2), utiliss dans les rfrigrateurs et les climatiseurs, et maintenant bannis. On a tent de les remplacer par les HCFC (hydrochloro-fluorocarbones). Leur temps de rsidence est calcul d'aprs la cintique de raction avec le radical hydroxyle. Il serait de 15 ans et on les suppose moins nocifs pour la couche d'ozone [50]. L'un d'eux est le HCFC-21
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(CHCl2F). Ils seraient plus susceptibles une dgradation biologique. L'attaque arobie de plusieurs HCFC dans le sol l'tat de traces a t dtecte et les responsables probables sont l encore des mthanotrophes [51]. Par contre les CFC paraissent rfractaires toute attaque anarobie et ne sont dgrads la rigueur que par les mthanognes, sans doute par dshalognation rductrice. Cette transformation apparat clairement dans le cas du fron-11 par Methanosarcina barkeri [52]. La question semble progresser assez peu actuellement. Les halons regroupent un certain nombre de gaz utiliss dans les extincteurs. En font partie le perfluoro-propane (C3F8), le perfluoro-butane (C4 F10), le trifluoroiodo-mthane (CF3I), et un certain nombre de composs 1-4 atomes de carbone, contenant du chlore et du fluor, par exemple le chlorottrafluorothane (CHFClCF3). Il est vraisemblable que la fabrication de ces gaz sera totalement interrompue la suite des confrences internationales. On cherche les remplacer par des hydrocarbures chlors qui seraient sans danger sur la couche d'ozone. Sont galement catalogus abusivement comme halons des mlanges gazeux qui n'ont rien voir avec les organo-halogns, comme le dioxyde de carbone, l'argon et l'azote, utiliss aussi dans les extincteurs ou les bombes arosols.
3.6 - L'OXYDATION DE L'AMMONIAC

Cette question, dont on a dj fourni quelques lments, complte logiquement l'oxydation du mthane, car l'ammoniac, dgag en abondance par les dcompositions de matire organique animale ou vgtale, est oxyd par une oxygnase dont nous connaissons les analogies avec l'enzyme membranaire du mthane. L'oxydation de l'ammoniac dans l'environnement reste enveloppe d'incertitudes. Aussi est-ce un sujet difficile mais important. L'ammoniac est trs toxique pour les tres vivants et son caractre volatil faciliterait son vasion dans l'atmosphre, si ce n'est qu' pH neutre dans les sols et les eaux, il est essentiellement l'tat d'ion ammonium NH4+ (le pKa est 9,1 30C). Son oxydation arobie jusqu'au stade nitrate, la principale ressource azote des plantes vertes, s'appelle nitrification et se fait en deux tapes. La premire est la transformation de NH3 (ou NH4+) en nitrite (NO2) chez Nitrosomonas par l'ammoniac mono-oxygnase (1) et l'hydroxylamine oxydorductase (2 ) : NH3 + O2 + NADH + H+ NH2OH + NAD+ + H2O NH2OH + H2O NO2 + 4 e + 5 H+ La seconde tape transforme le nitrite en nitrate chez Nitrobacter : NO2 + O2 + NADH + H+ NO3 + H2O + NAD+ (3) (1) (2)
Les vgtaux disposent de l'azote minral sous forme ammoniacale ou nitrate, avec une prfrence de nombreuses espces pour la seconde. Beaucoup de plantes cultives peuvent utiliser indiffremment ces deux sources azotes. Il en est de mme pour les espces pionnires sur terrain difficile. Le taux d'assimilation de
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l'ammonium par rapport celui du nitrate est alors proche de l'unit [53]. La toxicit de NH4+ entrane la prfrence de nombreuses plantes pour le nitrate. Inversement le riz, les bruyres et les conifres se contentent de sols enrichis en ammonium et matires organiques, et rsistent bien la toxicit ammoniacale. Cette question a une grande importance en conomie forestire. Des arbres comme les picas croissent mieux sur ammonium que sur nitrate. Ils se contentent donc facilement de sols o la nitrification est faible. Par contre si celle-ci augmente la suite d'un changement des conditions, la monte des nitrates peut gner la rimplantation de ces arbres. Ce problme a fait l'objet d'tudes par des auteurs nordamricains [54]. Des facteurs supplmentaires sont considrer, comme le prlvement azot par la microflore du sol et les mycorhizes, dont la prfrence va vers l'ammonium. L'conomie azote du monde vgtal est donc sous la dpendance d'influences complexes dont la nitrification n'est que l'un des lments. La nitrification est un facteur de fertilisation des milieux naturels pour de nombreuses plantes, mais contribue rgler la rpartition des espces en fonction de l'apport azot et du rapport NH4+/NO3. Il y a trois stades considrer : l'oxydation de l'azote ammoniacal en hydroxylamine, le passage au nitrite, l'oxydation du nitrite en nitrate. Ces ractions sont arobies. Nitrosomonas europaea catalyse les deux premires tapes. C'est un Gram-ngatif appartenant au groupe des -protobactries, vivant en autotrophie avec une croissance trs lente, son temps de gnration tant d'au moins 7 heures dans les conditions optimales. La premire raction (1) est catalyse par l'ammoniac monooxygnase (AMO) code par trois gnes formant un l'opron amoAB. Elle utilise NADH et consomme de l'nergie. L'nergie est apporte par la raction (2), catalyse par l'hydroxylamine oxydorductase (HAO, EC 1.7.3.4) associe une chane de transporteurs d'lectrons. L'ammoniac mono-oxygnase (AMO), est construite sur le mme modle que la mthane mono-oxygnase membranaire des mthanotrophes, comme l'a suggr une comparaison entre leurs gnes [55]. Son substrat est NH3 et non pas l'ion ammonium. Elle oxyde aussi mais plus faiblement le mthane. Nous savons qu'elle oxyde aussi un peu l'ammoniac. L'AMO est inhibe slectivement par la nitrapyrine et oxyde une riche palette de substrats comme le fait l'enzyme du mthane. En somme il y a bien une sorte de cousinage entre les deux enzymes, qui dfaut d'une forte homologie de squence ont beaucoup de caractres communs et pourraient avoir volu partir de la mme solution ancestrale. Lorsque l'AMO attaque des substrats secondaires, comme des composs organiques halogns, elle ne peut le faire que paralllement l'oxydation de l'ammoniac, qui apporte l'nergie ncessaire. Toute chute du taux d'oxygnation de l'ammoniac entrane de fait une baisse de l'activit dpolluante de l'enzyme. Comme l'ammoniac mono-oxygnase est une enzyme cl du cycle de l'azote, toute inhibition de son action pourrait avoir des effets pervers dans l'environnement. Or l'enzyme est fragilise par l'tendue mme de ses potentialits. Loxydation du TCE par l'AMO engendre des intermdiaires nocifs qui ragissent avec plusieurs protines cellulaires dont l'AMO. Il y a plusieurs critres montrant que l'oxygnase est bloque par les produits de transformation du TCE. Tout d'abord l'inhibition dfinitive de l'AMO ne se produit qu'en prsence d'O2, ce qui montre que le cycle catalytique est ncessaire cette
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inactivation qui est dfinitive. Elle est contrebalance dans les cellules entires par la synthse de novo de nouvelles molcules d'enzyme. Un deuxime critre est l'inhibition comptitive par l'allylthioure, qui retarde la destruction de l'enzyme en ralentissant l'oxydation du TCE. L'AMO s'empoisonne galement par l'oxydation de substrats autres que le TCE. L'un d'eux est l'actylne. La raction de l'actylne marqu au carbone-14 installe la radioactivit dans l'un des polypeptides de l'oxygnase, uniquement si l'oxygne est prsent, et l encore l'allylthioure protge l'enzyme contre son inactivation irrversible. Enfin un autre inhibiteur agissant la manire de l'actylne est le sulfure d'allyle. Son action puissante sur l'enzyme s'explique peut-tre par formation d'un poxyde ou d'un sulfoxyde ractif. La formation d'un produit de ce type parat plausible, car l'AMO transforme le dimthylsulfure en DMSO [56]. L'oxydation de l'ammoniac dans la biosphre est donc un mcanisme fragile relativement exigeant vis--vis de divers paramtres. Il est facilement empoisonn par des produits polluants. L'hydroxylamine oxydorductase est une enzyme tonnante et complexe. Elle a trois sous-units identiques contenant chacune 8 hmes C lis au polypeptide par le consensus courant CxxCH, le fer tant coordonn des deux cts par l'histidine. L'un de ces hmes est inhabituel par sa bande SORET* 460 nm en prsence de CO, ce qui le fait dsigner comme P460.
1re sousunit P460 4 6 5 2 1 3 5 6,7
8 1 sousunit
re
1 2
P460 Cter
Hydroxylamine oxydorductase (structure partielle)

Ce noyau hminique particulier est considr comme le site actif o le fer est haut spin et penta-coordonn, la sixime coordinence tant tablie avec le substrat. L'oxydorductase est donc dote d'une chane interne de transporteurs d'lectrons qui ressemble celle qu'on trouve chez les mthanotrophes [57]. Le dessin reprsente deux des trois sous-units de l'enzyme. Les cercles noirs sont les atomes de fer au centre des 8 porphyrines par sous-unit. Les hmes sont numrots de 1 8 en fonction de la position de leurs liens covalents avec la squence.
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Ils forment 4 groupes I, II, III et IV qui sont autant dunits fonctionnelles au sein de la chane de transferts : I (4 + 6 + 7), II (3 + 5), III (1 + 2) et IV (8). L'hme n4 est le P460 du site actif. Les potentiels s'chelonnent entre 400 et 100 mV, le plus bas tant celui de l'hme 8. Le P460 a une structure atypique. La porphyrine dj attache par deux liens covalents sur cystine en contracte un troisime avec un rsidu tyrosine de la sous-unit voisine travers la surface de contact. La protine n'a rien d'une fantaisie isole dans la nature. On retrouve un P460 chez Methylococcus capsulatus, un mthanotrophe capable d'oxyder l'ammoniac en hydroxylamine puis en nitrite. Les lectrons sont-ils achemins directement sur l'oxygne ou vers une oxydase terminale membranaire ? L encore existe une longue chane d'hmes C dans les cytochromes c554 et c552.
NH2OH + H2O hydroxylamine oxydorductase
+ NO2 +5H
O2 + 4 H+ 4 e 2 cyt.554 4 e 4 cyt.552 4 e oxydase terminale
4 e
2 H2O
Le c554 est un transporteur 4 hmes de potentiels allant de + 47 276 mV. Ils sont aligns dans un ordre qui rappelle le tronon de squence portant les hmes 3 6 dans l'oxydorductase [58], bien qu'il n'y ait pas d'homologie de squence entre les deux protines. Les lectrons entrent sous +47 mV sur deux hmes dont l'un est penta-coordonn et ressemble ainsi au P460 prcdent. Le c552 est un petit cytochrome un seul hme qui est bti comme celui des mitochondries animales. L'oxydase terminale rappelle celle de Paracoccus. Les bactries telles que Nitrosomonas ont un gnome relativement petit (2 200 kb) dont la squence complte est attendue avec intrt car il s'agit de cellules autotrophes. Chose curieuse, les gnes de l'oxygnase, de l'oxydorductase et des cytochromes fonctionnellement associs existent en plusieurs exemplaires de squences pratiquement identiques [59], ce qui n'est pas sans compliquer l'analyse gntique. En effet l'inactivation d'un site par mutation est facilement compense par un autre gne de la srie. La raison de cette pluralit est nigmatique. Deux gnes identiques peuvent amliorer la production de l'enzyme correspondante sur le plan quantitatif. Si la bactrie n'en tirait aucun avantage physiologique, le hasard des mutations aurait toute chance de faire disparatre le matriel gntique superflu. En ralit l'explication se situe probablement au niveau des rgulations, qui conduiraient exprimer l'un ou l'autre des gnes dans des circonstances diffrentes. Le pouvoir d'adaptation de la bactrie aux conditions du milieu s'en trouverait amlior. Nous arrivons maintenant l'oxydation du nitrite en nitrate. La nitrite-cytochrome c oxydorductase appartient aux bactries telles que Nitrobacter winogradskyi, qui est le principal matriel d'tude. La protine est hminique et contient des noyaux fer-soufre et du molybdne. Celui-ci est log dans un cofacteur organique spcial du
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type de ceux qu'on trouve dans la majorit des molybdo-enzymes. Les chefs de file en sont la xanthine oxydase et les nitrate rductases [60]. Il y a une certaine ressemblance ici avec la sulfite oxydase, qui catalyse une raction assez similaire. Parce que l'oxydorductase contient des hmes A et C, on la dsigne habituellement comme cytochrome a1c1. Les lectrons sont achemins ensuite vers l'oxygne par un cytochrome c et une cytochrome c oxydase de type aa3 similaires ceux des mitochondries [61].
NO2, H2O nitrite oxydorductase cyt. a1c1 NO3, 2 H+ 2 e 2 e 1/2 O2 + 2 H+ cytochrome c oxydase cyt. aa3
2 cyt. c
H 2O
L'importance de la nitrification dans l'environnement se manifeste dans trois directions. La premire est une rcupration de l'azote ammoniacal et sa transformation finale en nitrate (ractions 1, 2 et 3 indiques antrieurement), crant la principale source azote des vgtaux verts et un maillon essentiel du cycle de l'azote. La deuxime apparat dans l'puration des eaux lourdement charges en ammoniac, notamment en aval des stations d'levage industriel. L'ammoniac est toxique pour la vie aquatique, le nitrate form est entran facilement et servira de support la dnitrification dont le terme ultime est N2. L'ensemble contribue ainsi liminer le trop-plein en azote. La troisime direction d'importance est celle des biodgradations amorces en grande partie par l'ammoniac mono-oxygnase : oxydation et dshalognation d'hydrocarbures chlors, du TCE L'attaque de ces diffrents polluants n'apporte aucun bnfice nergtique la cellule et ne peut se faire que conjointement celle de l'ammoniac. La plupart des tudes ont port initialement sur Nitrosomonas europaea pour la transformation de NH3 en nitrite, et sur Nitrobacter winogradskyi pour l'oxydation du nitrite en nitrate. Ces organismes ne sont pas les seuls conduire la nitrification dans la nature, mais ont l'avantage d'tre faciles obtenir partir des collections et leurs proprits sont bien tablies. Une recherche systmatique des organismes nitrifiants par l'analyse des squences d'ARN 16S et l'emploi de sondes nucliques rvle pourtant une certaine diversit [62]. Les Nitrosococcus sont des -protobactries, tandis que les Nitrosomonas et un groupe de germes apparents entre eux (Nitrosobolus et Nitrosovibrio) sont des -protobactries. Nitrospira forme un groupe part. L'oxydation des nitrites est ralise par des bactries appartenant 4 genres, Nitrobacter (de la sous-classe alpha), Nitrospina (delta), Nitrococcus (gamma) et Nitrospira. La biologie de ces espces est encore insuffisamment tudie par manque de donnes en culture pure. Certaines sont htrotrophes, la plupart entrent volontiers dans des biofilms o se crent des associations syntrophiques entre celles qui oxydent NH3 et celles qui oxydent le nitrite. L'importance de certaines formes dans les boues d'puration reste facilement inaperue cause de la lenteur de dveloppement des isolats.
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Des travaux rcents ont montr l'importance des Nitrospira (N. marina, N. moscoviensis) dans l'oxydation des nitrites en nitrates [63]. Ces bactries, qui occupent une place part dans la phylognse des procaryotes, sont prsentes dans une grande varit de milieux et se dveloppent sur des concentrations de nitrite de l'ordre de 200 mg . L1. Elles ont une forte affinit pour les nitrites mais une croissance assez lente. Les Nitrobacter ont des proprits inverses, se dveloppent sur forte concentration de nitrite (2 g . L1), ont une faible affinit pour celui-ci, et se multiplient rapidement. Les premires sont dites de type K (pour Km), les secondes de type r (pour rate ou vitesse) [64]. La juxtaposition dans l'environnement de comptiteurs K et r se dveloppant sur le mme substrat n'existe pas que pour les nitrites. Elle correspond un certain partage des tches et un moteur d'volution dans les populations 9. La nitrification reprsente petite chelle un facteur essentiel de la maintenance d'un aquarium, biotope naturel en miniature o les principaux lments sont recycls en vase clos. Hormis l'apport de nourriture aux poissons et les changes gazeux avec l'atmosphre, l'aquarium garni de plantes vertes fonctionne en autarcie complte. L'azote ammoniacal en provenance des poissons et des dbris vgtaux est roxyd en continu par les bactries nitrifiantes venues coloniser le filtre. Il est bien connu des aquariophiles que l'installation d'un nouveau bac ncessite une priode d'adaptation de plusieurs semaines, au cours de laquelle les nitrites sont produits plus rapidement qu'ils ne sont oxyds en nitrates. Leur teneur peut atteindre une valeur toxique pour les poissons. On acclre le processus par un ensemencement bactrien et une bonne oxygnation. Lorsque l'aquarium est "install", le taux de nitrite doit retomber une valeur faible. La monte des nitrates des valeurs situes autour de 10-20 mg . L1 tmoigne d'une bonne nitrification, mais elle doit se stabiliser grce au dveloppement des plantes. L'usage d'eau dminralise et purifie l'excs n'est pas forcment recommand puisqu'il risque de faire disparatre des oligo-lments ou d'autres composants (comme les phosphates) ncessaires l'conomie gnrale du bac. Les Nitrospira auraient un rle essentiel dans les aquariums pour faire disparatre les nitrites au fur et mesure, les Nitrobacter interviendraient davantage aprs une forte monte des nitrites. Un mauvais dveloppement de ces bactries est la source d'une monte dommageable des nitrites. Revenons l'oxydation de l'ammoniac. Sa transformation en nitrate repose sur un mcanisme fragile qui n'opre que dans une gamme de pH assez troite, avec un optimum plac vers 7,5-8,5 ; elle cesse avec le froid (au-dessous de 5-10C) et ds que l'oxygne tombe des valeurs faibles. La nitrification risque donc d'tre absente dans les sols forestiers acides ou peu ars, et reste sensible des actions inhibitrices varies. L'effet inhibiteur d'un pH au-dessous de la neutralit peut s'expliquer par l'quilibre entre NH3 et NH4+, dj fortement dplac en faveur de l'ammonium pH neutre. Or l'ammonium n'est pas le substrat de la nitrification, contrairement NH3. Le pH acide provoque donc une rarfaction accrue de
9 - Une question de dynamique des populations, applique la croissance cellulaire comme l'volution humaine, appele par certain auteurs thorie de RUSHTON.
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l'ammoniac disponible. Il en rsulte aussi des effets complexes exercs par la nature du sol. Certains constituants agissent comme changeurs de cations et adsorbent l'ammonium, effectuant ainsi un dtournement global de l'azote qui sera moins disponible pour l'oxygnation. La nitrification conserve des aspects obscurs et les limites de son action ne sont pas encore bien cernes, ce qui est bien dommage vu l'intrt qu'elle prsente pour l'agriculture. C'est lors de l'oxydation de l'ammoniac en nitrite que son utilit dans les biodgradations apparat au mieux, puisque l'ammoniac mono-oxygnase possde, comme l'enzyme correspondante active sur le mthane, un pouvoir de transformer une gamme tendue de substrats parmi lesquels figurent des hydrocarbures halogns. La section suivante porte sur un aspect nouveau de l'oxydation de l'ammoniac, qui pourrait tre d'une grande utilit pour le traitement des eaux. Un aspect indit de l'oxydation de l'ammoniac n'est connu que depuis quelques annes. On pensait autrefois qu'elle tait, pour des raisons videntes, tributaire de l'oxygne. Des observations prouvant une oxydation de NH3 en anarobiose sont venues compliquer les choses. Elles ont t faites en bioracteur install pour une tude de dnitrification [65]. L'ammoniac est oxyd en absence complte d'O2, en passant probablement par des stades intermdiaires comme l'hydroxylamine et l'hydrazine (H2NNH2), le stade final tant l'azote diatomique (N2) ! Quel est l'oxydant ? Le nitrite ou peut-tre le nitrate. Ce nouveau mcanisme biologique a t dsign par anammox (anaerobic ammonium oxidation). Il intervient pH 7,5-8,5, se montre encore plus lent que la nitrification arobie. Quand l'ammoniac marqu l'azote-15 est mis en prsence de nitrite contenant l'azote-14, le N2 form est constitu d'un atome 14N et d'un atome 15N. La dtection de ce diazote "hybride" peut donc servir rvler le fonctionnement de l'anammox, qu'on pourrait symboliser par : NH4+ + NO2 N2 + 2 H2O Malheureusement les germes incrimins n'ont pas t clairement caractriss, et leur croissance est extrmement lente : une division toute les 2 3 semaines ! Les cellules sont autotrophes. Elles se dveloppent dans des biofilms au contact des eaux uses charges en ammoniac. C'est sans doute la difficult de les obtenir en culture qui fait que beaucoup de dtails sur cette question manquent encore. Une nouvelle oxydorductase a t caractrise partir d'une culture anarobie. Elle oxyde in vitro l'hydroxylamine et l'hydrazine en utilisant des accepteurs d'lectrons artificiels. L'enzyme contient de nombreux hmes. Son spectre inhabituel l'a faite dsigner comme cytochrome P468. Elle ne parat prsenter aucune ressemblance avec l'enzyme correspondante de Nitrosomonas europaea. Cette dernire espce, qui est en principe arobie, possde un mtabolisme qui ressemble l'anammox en taux faible d'oxygne. Elle fait du NO par oxydation de l'ammoniac avec le nitrite. Ce processus est trs lent, mais un tel chass-crois de ractions en milieu anarobie ne facilite videmment pas les analyses. En somme il y a deux voies d'oxydation diffrentes de l'ammoniac dans la nature. La premire et la plus importante est la nitrification, une oxydation par O2 dont le nitrate est le stade terminal
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nitrate. La seconde voie est appele anammox. Elle est anarobie et totalement indpendante de la premire. L'ammoniac est transform en azote molculaire, le nitrite servant d'oxydant. Les germes responsables de l'anammox sont des bactries atypiques du genre Candidatus dans le groupe spcial des planctomyctes dont la morphologie comporte une compartimentation inhabituelle. L'oxydation de l'ammoniac a lieu dans la membrane priphrique d'une particule interne entoure d'une double membrane et appele anammoxosome.
parahyphoplasme membrane externe membrane interne anammoxosome riboplasme nuclode
Les cellules sont entoures de deux membranes, interne et externe, et d'une zone cytoplasmique priphrique dpourvue de ribosomes, trouve chez tous les planctomyctes connus, et dsigne comme le parahyphoplasme. Une rgion plus interne entoure d'une membrane simple ou riboplasme 10 renferme des ribosomes, un ou plusieurs nuclodes rendus fluorescents par le DAPI et l'anammoxosome [66]. Le mtabolisme de l'ammoniac s'effectue cycliquement par une nitrite rductase, une hydrazine hydrolase et une enzyme d'oxydation de l'hydrazine productrice de N2 et non entirement caractrise. Ces facteurs catalysent respectivement les ractions (1), (2) et (3). NO2 + 4 e + 5 H+ NH2OH + H2O NH2OH + NH3 H2NNH2 + H2O H2NNH2 N2 + 4 H+ + 4 e (1) (2) (3)
Sur le schma a du cycle des oxydorductions, on peut voir que des protons sont prlevs du ct cytoplasmique, d'autres sont expulss l'intrieur de l'anammoxosome. Il est donc possible qu'un gradient lectrochimique s'tablisse de part et d'autre de cette membrane, mais on ignore comment l'nergie est rcupre. La composition biochimique de la membrane des anammoxosomes rvle des caractres extraordinaires sans quivalent connu ailleurs dans le monde vivant. On y rencontre des lipides exceptionnels appels ladderanes, du mot anglais voulant dire chelle. Les chanes hydrocarbones sont greffes sur le glycrol par des liaisons ther ou ester, mais le dtail le plus curieux est la succession de cycles 4 et 6 atomes de carbone (cyclobutane, cyclohexane) relis en cis selon les conventions chimiques usuelles. Deux exemples ont t figurs en b. 10 - Appel pirellulosome dans une autre espce, Pirellula marina.
NO2 cytoplasme NH2OH nitrite rductase 4 e hydrazine hydroxylase hydrazine oxydorductase 4 H+ OH O O O 5 H+ OH O O
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N2H4 NH3 anammoxosome
N2
a - Cycle des oxydorductions
b - Exemples de ladderanes
Certains lipides sont des esters mthyliques d'acides gras ayant la mme structure bizarre. La rpartition des chanes et leur composition n'est pas quelconque. Elle a t dtermine par des auteurs nerlandais en s'aidant de la technique d'extraction et de purification partielle, marquage par anticorps, examen par fluorescence et spectromtrie de masse [67]. La physiologie de ces cellules particulires reste donc nigmatique. Les anammoxosomes ont t obtenus l'tat isol. Les ladderanes confrent la membrane spciale qui les entoure une rigidit accrue par rapport aux biomembranes habituelles. Ces lipides exceptionnels ont t prpars par synthse, s'organisent en bicouche, mais confrent une plus grande densit la membrane ainsi qu'une permabilit moindre. Il est suppos que cette organisation spciale est une adaptation contre la diffusion de l'hydrazine, qui entranerait des pertes importantes dans le mtabolisme nergtique. Il s'agit d'une adaptation de ces germes non-conformistes qui reste dcouvrir. La compartimentation interne des cellules n'a encore reu aucune explication.
3.7 - MONOXYDE DE CARBONE ET CARBOXYDOTROPHES

De grandes quantits de monoxyde de carbone, de l'ordre de 600 800 millions de tonnes par an sont dverss dans l'environnement. La combustion des carburants dans les moteurs et les installations thermiques a pris une part prpondrante dans les missions de CO dans l'atmosphre. Le cinquime environ de ce gaz est oxyd assez rapidement dans les couches superficielles du sol par des bactries arobies. Quant au monoxyde de carbone atmosphrique, il est soumis une oxydation photochimique et ragit avec les radicaux hydroxyles qu'il contribue ponger. La prsence de ces radicaux dans l'atmosphre a une grande importance pour empcher l'accumulation de CO, d'hydrocarbures, de terpnes et autres produits volatils. L'ozone en est une source principale. En conditions arobies, le CO est utilis comme seule source de carbone et d'nergie par les bactries dites carboxydotrophes disperses dans des groupes
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taxonomiques divers. Ce sont la plupart du temps des chimio-lithotrophes, l'nergie tant produite par l'oxydation de CO en CO2. L'utilisation du second fait de ces bactries des autotrophes . En somme, lorsqu'elles se dveloppent sur CO, elles jouent sur deux tableaux : production d'nergie et fabrication du gaz carbonique comme source de carbone. En anarobiose, le CO est utilis par divers organismes mthanognes, actognes, sulfato-rducteurs et phototrophes. Le mcanisme utilis est trs diffrent dans les deux cas. Chez les arobies, le CO est oxyd par une CO dshydrognase, qui est une flavoprotine contenant du molybdne, du slnium et des noyaux fer-soufre. La CO dshydrognase des anarobies est trs diffrente. Elle contient du nickel et fonctionne comme actyl-CoA synthase. C'est l'enzyme dj rencontre chez les actognes et les mthanognes. On s'attardera ici l'oxydation arobie du monoxyde de carbone. Le carboxydotrophe servant de modle est Oligotropha carboxydovorans. L'oxydation suivante est catalyse par une molybdo-enzyme flavinique : CO + H2O CO2 + 2 e + 2 H+ La dshydrognase travaille en contact troit avec la face interne de la membrane o le monoxyde de carbone est oxyd, contrairement au mthane qui l'tait sur la face externe. Les protons sont expulss vers l'extrieur, et l'nergie est donc en partie rcupre sous forme d'un potentiel de membrane. Il existe d'ailleurs une autre diffrence avec l'oxydation du mthane. La spcificit de la CO dshydrognase est assez troite pour n'accepter que CO. dfaut de la prsence de monoxyde de carbone, les bactries peuvent continuer vivre comme des chimiolithotrophes en oxydant de l'hydrogne par une hydrognase. Le potentiel du couple CO2/CO est trs ngatif , soit E' = 540 mV, plus bas que celui de l'hydrogne ( 414 mV). C'est pourquoi la rduction de CO2 en CO des espces anarobies est une opration thermodynamiquement difficile exigeant une source d'lectrons trs rductrice. Inversement l'oxydation devrait pouvoir s'effectuer facilement avec des effecteurs varis, et comme le saut nergtique jusqu' O2 est important, le monoxyde de carbone apparat comme un trs bon carburant. Divers colorants font l'affaire comme accepteurs artificiels (bleu de mthylne, thionine, phnazine mthosulfate), alors que la dshydrognase ne rduit pas les accepteurs bas potentiel comme les violognes. L'accepteur physiologique de la CO dshydrognase de O. carboxydovorans est un cytochrome b561, vers lequel convergeraient aussi les lectrons en provenance de l'hydrogne. Comme la plupart des carboxydotrophes, cette espce a deux voies respiratoires fonctionnant avec O2, l'une tant rsistante l'inhibition par CO ou le cyanure (1 M), l'autre tant de type standard avec un cytochrome c et un cytochrome c oxydase [68]. On sait que les bactries ont couramment plusieurs chanes respiratoires pour faire face des conditions changeantes. Les bactries ont la possibilit ici de vivre en htrotrophie ou en autotrophie. Le premier cas est celui de la voie ordinaire o interviennent des dshydrognases NAD+/NADH, des cytochromes b et c, une cytochrome c oxydase terminale de type aa3. Cette voie est bloque par la rotnone et l'antimycine A. Le NADH est en mme temps une source d'lectrons pour l'assimilation de CO2 en autotrophie. Une seconde voie est insensible au CO et au
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cyanure. Son oxydase terminale est de type o et l'inhibiteur est le HQNO. Les deux voies sont indiques par un plan.
E' (mV)
400
CO
H2
NADH rotnone
cycle de CALVIN
200
cyt. b563
0
quinone cyt. b561 cyt. o
quinone cyt. b558 antimycine A cyt. c cyt. aa3

(voie ordinaire)
200
400
(voie insensible CO)

600
800
O2
O2
Voies respiratoires de O. carboxydovorans

L'oxydation de CO ou de H2 fait passer les lectrons prfrentiellement vers la voie insensible CO, ce qui semble logique. Un caractre intressant de cette physiologie est la possibilit d'engendrer le NADH ncessaire la vie en autotrophie, puisque le cycle de CALVIN exige la fois un rducteur et de l'ATP. Des expriences ont t faites pour dterminer comment les lectrons parviennent au NAD+ pour sa rduction en NADH [69]. On voit d'aprs le diagramme que les lectrons produits par l'oxydation de CO ou de H2 ne peuvent aboutir NADH qu'en remontant l'chelle des potentiels vers les valeurs ngatives. Le problme est le mme que celui des phototrophes. Un courant d'lectrons inverse actionn par le potentiel de membrane est l'origine du NADH. Les faits exprimentaux militent en faveur de cette conclusion. Un apport soudain de CO et d'oxygne des cellules de O. carboxydovorans dclenche une formation immdiate de NADH qui est inhibe par la rotnone. Les agents dcouplants suppriment la rduction en NADH, ainsi que les inhibiteurs de l'ATPase, tandis que l'antimycine A n'a pas d'effet 11. Aucune rduction directe de NAD+ par le flux d'lectrons en provenance de CO n'est observe, mais les intermdiaires obligs sont les cytochromes b561 et b558. L'inhibition exerce par les agents dcouplants sur le courant d'lectrons inverse montre bien que le potentiel de membrane est indispensable l'opration. Le courant d'lectrons inverse nest plus ncessaire au cours de la croissance htrotrophe, par exemple sur pyruvate. Des mesures ont montr que le flot des lectrons emprunte de prfrence la voie respiratoire sensible CO quand la croissance s'effectue sur CO2 + H2 ou sur pyruvate. Le rapport H+ /O, qui mesure la translocation de protons par atome d'oxygne, est de l'ordre de 6 dans les deux
11 - Rappels : la rotnone inhibe le complexe respiratoire de la NADH dshydrognase, alors que l'antimycine A agit sur l'tape bc1.
170
cas. La croissance sur le seul CO est moins rapide avec un rapport H+/O qui tombe 4. Comme elle met contribution la voie respiratoire insensible CO, on peut supposer que celle-ci recharge galement le potentiel de membrane, mais qu'elle le fait moins efficacement. On constate une fois de plus la multiplicit des circuits nergtiques chez les bactries, leur offrant d'optimiser les oxydations, la production d'ATP et l'tablissement du potentiel membranaire au gr des conditions. Quelles sont les proprits de la CO dshydrognase des carboxydotrophes ? Chez Oligotropha carboxydovorans, l'enzyme a la structure (LMS)2, donc un dimre de trimres. Les trois gnes correspondants, cobx, cobs et col sont groups dans cet ordre sur un grand plasmide de 128 kb (pHCG3). Ils sont placs sur un segment de 30 kb prs des gnes du cycle de CALVIN et de ceux de l'hydrognase (hox). Un fort conservatisme de squence a t trouv avec d'autres espces [70]. Aprs limination du plasmide, O. carboxydovorans perd en mme temps la capacit d'oxyder CO et H2, et n'assimile plus CO2. Les sous-units L (88,7 kDa), M (30,2 kDa) et S (17,8 kDa) forment un complexe contenant une chane de transporteurs d'oxydorduction. Sur la base des squences, l'enzyme fait partie d'une famille d'hydroxylases molybdne [71].
chane M
FAD Fe/S MCD
chane S
chane L
CO dshydrognase de O. carboxidovorans
L'attaque du substrat se fait dans les sous-units M au niveau d'un cofacteur contenant le molybdne (molybdoptrine-cytosine dinuclotide ou MCD) de mme nature que celui que nous retrouverons bientt dans la rduction des nitrates. Les intermdiaires suivants sont deux noyaux [2Fe-2S] dsigns comme I et II (ils sont dans des environnements diffrents). Enfin une flavine, qui est le FAD, reoit les lectrons avant de les expdier aux transporteurs respiratoires. Le dispositif n'est pas sans analogie avec celui d'une autre molybdo-enzyme classique, la xanthine oxydase. Une particularit importante ici est la prsence du slnium dans le site actif. Celui-ci se trouve enfoui assez profondment dans la sous-unit L en mme temps que le cofacteur molybdne. La position exacte de Se dans la protine a t dtermine dans la structure obtenue par cristallographie [72]. Son rle catalytique dans l'oxydation de CO semble essentiel. Le slnium est port sur le soufre d'un rsidu de cystine modifie, la S-slanylcystine qu'il ne faut pas confondre avec la slnocystine, acide amin o le slnium remplace le soufre. Ici le slnium est surajout au soufre.
O VI Mo OH S O S
171
Se C S O
IV
= =
= =
MCD
S Mo OH O S
VI
O S Mo O C S O Se Se C O S H S
Mcanisme hypothtique de la CO dshydrognase

Le mcanisme est encore hypothtique. Il ferait passer Mo(VI) penta-coordonn Mo(IV) ttra-coordonn, avec participation du slnium sous forme de slnure de carbonyle SeCO. Nous retrouvons le slnium dans une oxydorduction concernant CO2 ou un carbonyle. D'autres exemples sont cits en glossaire. Grce cette chimie particulire, le monoxyde de carbone produit en quantit par nos moteurs ne s'accumule pas sur la plante, et l'on ne peut que s'en rjouir !
3.8 - DU SULFURE AU SULFATE

L'activit volcanique mondiale dverse sans cesse de grandes quantits de composs soufrs dans la biosphre, soit au cours des ruptions, soit par les fumerolles. Il y a dans le monde un peu plus d'une cinquantaine de volcans qui ont une ou plusieurs ruptions par an ou mme par jour (Stromboli). La majeure partie du soufre mis est sous forme de dioxyde de soufre (SO2), accompagn de H2S, de soufre lmentaire 12, de sulfure de carbonyle (COS), de disulfure de carbone (CS2) et de petites quantits de produits secondaires tels que AsS. L'estimation des quantits de SO2 annuelles mises est trs difficile mais serait au minimum de 9 11 millions de tonnes. Or l'activit industrielle humaine en rpandrait bien davantage, de l'ordre de 80 millions de tonnes par an. Une partie se retrouve l'tat d'acide sulfurique et peut atteindre la haute atmosphre ou participer aux pluies acides. Le soufre est prsent dans les constituants de la vie son niveau d'oxydorduction le plus bas, qui est celui de l'ion sulfure (S2), de l'hydrosulfure (HS) et de l'hydrogne sulfur (H2S). Les sulfures sont galement produits par l'activit des sulfatorducteurs, et sont dverss en abondance par la dcomposition de la matire vivante, animale ou vgtale. Ils sont pris en charge par des bactries qui les oxydent, soit en soufre lmentaire (S0), soit en produits plus oxyds jusqu' l'ion sulfate. Cette fonction est bnfique pour l'environnement, car les composs rduits du soufre sont toxiques faible dose pour les cellules vivantes, et leur accumulation finirait par dvaster toute la biosphre !
12 - Certains volcans mettent de la vapeur de S qui se condense en dpts importants. Le Kawah Ijen, l'Est de Java, prsente une fontaine de soufre liquide mise 225C, se solidifiant en masses compactes qui sont exploites. Le volcan porte 2280 m d'altitude un vaste lac de cratre contenant de l'acide chlorhydrique et sulfurique un pH de 0,3 ! Parmi d'autres volcans connus pour leur soufre est le Chicn au Mexique.
= =
172
S2 sulfure 2 e S soufre 2 e SSO32 thiosulfate 4 e 2 e 2 e
SO32 sulfite 2 e SO42 sulfate
[O3SS2SO3]2
ttrathionate
Il faut un dpart de 8 lectrons pour passer du sulfure au sulfate, et ces oxydations se font le plus souvent en arobiose, notamment par les bactries du genre Thiobacillus. Les bactries phototrophes oprent un cheminement similaire en anarobiose. Le passage inverse du sulfate au sulfure est pratiqu par les organismes sulfato-rducteurs anarobies examins dans un chapitre ultrieur. Ces conversions dans un sens ou dans l'autre fonctionnent dans le cycle naturel du soufre, o des tapes effectues en prsence d'oxygne alternent avec des phases ralises en son absence, comme dans le cycle du carbone mettant en jeu le mthane et le gaz carbonique. Le pouvoir d'oxyder le soufre et ses drivs n'est pas l'apanage d'un groupe taxonomique particulier. On peut distinguer au moins trois ensembles de bactries capables de pratiquer ces oxydations. Les phototrophes anarobies forment un premier groupe. Ces bactries pourpres ou vertes se servent de soufre rduit comme source d'lectrons pour faire marcher leur photosynthse, mais nous les laisserons de ct ici. Par contre les chimio-autotrophes (ou chimio-litho-autotrophes) sont parmi les plus importants. Ils assimilent le gaz carbonique en utilisant l'nergie de l'oxydation des sulfures, du soufre ou du thiosulfate par O2. Le terme ultime de ces oxydations est gnralement l'ion sulfate. Le genre Thiobacillus occupe une place minente dans ce deuxime groupe de bactries. Un troisime groupe rassemble les chimio-htrotrophes qui pratiquent les mmes oxydations, mais ont besoin d'une source de carbone organique. Le genre Thiobacillus renferme toute une gamme d'espces exclusivement autotrophes, mais qui se distinguent par leurs caractres physiologiques. Thiobacillus thioparus, T. neapolitanus et T. denitrificans se dveloppent de prfrence un pH proche de la neutralit. Le dernier a en outre la facult de rduire le nitrate en nitrite et N2, processus appel dnitrification et fonctionnant en absence d'O2. C'est, en somme, une espce pouvant passer de la respiration classique sur O2 une respiration anarobie sur nitrate, le substrat oxyd tant du sulfure, du soufre, du thiosulfate Ces germes remarquables sont en mme temps des autotrophes. Cette proprit, qui consiste assimiler CO2 par le cycle de CALVIN, s'accompagne d'inclusions caractristiques appeles carboxysomes*. Une autre srie du genre Thiobacillus rassemble des espces se dveloppant pH acide (optimum de 2 4 : T. acidophilus, T. thiooxidans, T. ferrooxidans) ou mme trs acide (jusqu' 1, T. prosperus). T. ferrooxidans peut se dvelopper en tirant son nergie de l'oxydation du fer ferreux. Parmi les chimio-htrotrophes figurent des espces trs diffrentes par leurs caractres morphologiques et physiologiques. Ces bactries gnralement aquatiques sont moins acidophiles que les prcdentes. Les Beggiatoa et Cytophaga
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sont mobiles par glissement. Les premiers se dveloppent dans les eaux sulfureuses, les eaux douces avec des plantes en dcomposition, les rizires et les sdiments marins. Les Cytophaga sont importants dans l'puration des eaux uses, attaquent la cellulose, la chitine et autres polymres, corrodent le bois. Les bactries du genre Thiothrix forment des colonies de filaments. La physiologie de ces espces est imparfaitement connue et prsente de grandes variations en fonction des conditions, mais ce sont des espces "tout-terrain". Celles qui attaquent les sulfures accumulent des granules de soufre intracellulaires qui leur servent de rserve de substance oxyder en fonction d'un changement du milieu. Cette proprit adaptative est commune dans le genre Thiobacillus. La diversit des aptitudes physiologiques rgle la rpartition des espces dans le temps et dans l'espace. Elles se succdent en fonction de l'puisement du substrat, de l'acidit du milieu lie la production de H2SO4, des changements de temprature, de l'vaporation Il en rsulte une certaine stratification des espces dans les sdiments et dans le sol. Dans les conditions physiologiques habituelles, le sulfure est surtout prsent comme hydrosulfure (HS), le sulfite comme hydrosulfite (HSO3). Voici un tableau donnant les potentiels redox des diffrents couples l'tat standard et pH neutre [73] : Couple Sulfate/Hydrosulfite Thiosulfate/Hydrosulfure + Hydrosulfite Soufre lmentaire/Persulfure d'hydrogne Soufre lmentaire/Hydrosulfure Persulfure d'hydrogne/sulfure d'hydrogne Hydrosulfite/Hydrosulfure Hydrosulfite/Soufre lmentaire Ttrathionate/Thiosulfate Forme physiologique SO42/HSO3 S2O32/HS + HSO3 2 S /H2S2 S /HS
0 0
E' (mV) 516 402 340 270 200 116 38 + 24
H2S2/2 H2S HSO3/HS HSO3/S0 S4O6 /S2O3

2 2
Ces potentiels standards sont comparer avec celui du couple form par l'oxygne et l'eau (+ 820 mV), mais ils ne sont que des points de repre, puisque les valeurs relles dpendent du rapport entre formes oxyde et rduite, et sont gnralement trs diffrentes ! Du sulfure ou de l'hydrosulfure au sulfate, il y a donc deux sauts nergtiques majeurs, le plus important tant celui de l'oxydation de l'hydrosulfite au sulfate puisque le potentiel du couple correspondant est trs bas, soit 516 mV. Les lectrons sont canaliss jusqu' O2 par la chane respiratoire qui comporte ici une quinone et au moins un cytochrome c. La rduction de l'oxygne se fait par une cytochrome c oxydase cbb3, l'homologue du cytochrome aa3 des mitochondries [74]. Les oxydases terminales de ce type sont des pompes protons, et aident l'tablissement du potentiel membranaire (p) [75].
174
HS 2 e S 4 e cytochromes respiratoires SO32 2 e
SO42
2 O2 + 8 H+
cbb3
4 H2O
Parmi les interconversions entre produits soufrs se placent des intermdiaires qui sont des oxydes complexes du type thiosulfate, trithionate, ttrathionate et polythionates. Ces produits sont placs comme des voies de garage ou des variantes sur le chemin qui va du sulfure au sulfate. Certaines sont des oxydorductions, d'autres des hydrolyses. Prs de la moiti des espces bactriennes vivant de l'oxydation des sulfures et du soufre peuvent se dvelopper sur ttrathionate, un substrat d'emploi commode au laboratoire. L'interconversion entre thiosulfate (S2O32) et ttrathionate (S4O62) se fait par la thiosulfate dshydrognase priplasmique utilisant le cytochrome c comme donneur ou accepteur chez Thiobacillus W5 [76], selon : 2 S2O32 + 2 cytochrome c (Fe3+) S4O62 + 2 cytochrome c (Fe2+) (1)
Chez Thiobacillus acidophilus, des hydrolases permettent de mtaboliser le ttrathionate et le trithionate selon les modles suivants [77] : Pour le ttrathionate : S4O62 + H2O S2O32 + S0 + SO42 + 2 H+ Pour le trithionate : S3O6
2
(2) (3)
+ H2O S2O
2 3
+ SO4 + 2 H
Les bactries responsables sont tenues de s'adapter des conditions trs changeantes et modifient leurs proprits en consquence. L'limination rapide des sulfures excdentaires est un facteur essentiel dans l'environnement. Les sulfures sont toxiques pour de nombreux micro-organismes, et leur accumulation dans les sdiments freine les biodgradations. En les oxydant trs activement, un Thiobacillus peut engorger son mtabolisme respiratoire et y fait face en stockant provisoirement du soufre lmentaire [78] ou en dirigeant une partie du soufre vers le thiosulfate et le ttrathionate, qui jouent en quelque sorte le rle de rservoir tampon. Cette activit bactrienne est un facteur important d'acidification du milieu. Elle entrane des phnomnes de corrosion dans les canalisations et distributions industrielles partout o il y a apport de soufre ou de sulfures. Thiobacillus caldus se dveloppe en culture 45C et pH trs acide (2,5), sur ttrathionate 5 mM comme source d'nergie. La source carbone est apporte par barbotage d'air enrichi en gaz carbonique [79]. L'oxydation des composs soufrs en sulfate est ralise en grande partie ou en totalit par des enzymes cytoplasmiques, l'exception du passage thiosulfate (S2O32) vers le ttrathionate (S4O62) qui a lieu dans le priplasme. Comme le milieu extrieur est trs acide relativement au cytoplasme, les cellules doivent pomper les substrats soufrs vers l'intrieur et y consacrer de l'nergie. Des diffrences importantes de localisation
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et de fonctionnement des enzymes semblent exister d'une espce l'autre et la question devient vite ardue. L'oxydation du sulfure ou de l'hydrosulfure en S0 se fait typiquement par un flavocytochrome , constitu de deux sous-units ingales contenant le FAD et l'hme C. La sulfure dshydrognase chez Thiobacillus W5 fonctionne un pH optimum de 8,6 alors que le pH extrieur est acide [80] ! L'archtype de ces flavocytochromes fut l'origine celui de Chromatium vinosum, un phototrophe anarobie qui utilise prfrentiellement le sulfure comme source d'lectrons pour faire marcher sa photosynthse. L'enzyme de Pyrococcus furiosus, un hyperthermophile, contient 2 FAD et plusieurs noyaux fer-soufre de nature diffrente [81]. D'autres espces oxydent le sulfure sans se servir d'un flavocytochrome. Cependant la plupart des formes qui se dveloppent sur thiosulfate en possdent un qui pourrait avoir d'autres fonctions selon une hypothse avance par FRIEDRICH [82]. L'oxydation du sulfite (ou d'hydrosulfite) en sulfate se fait par deux mthodes. La premire est une oxydation directe catalyse par la sulfite oxydase, ou sulfite : cytochrome c oxydorductase (EC 1.8.2.1), ou encore SOR. La seconde se fait en deux tapes par l'APS rductase (1.8.99.2) suivie de l'ADP sulfurylase. Ces terminologies un peu compliques cachent des oprations simples. La premire (l'oxydation directe) est la plus rpandue et correspond la raction : HSO3 + 1/2 O2 SO42 + H+ (4)
L'enzyme est priplasmique. Elle n'est pas propre aux bactries. Elle figure dans l'espace inter-membranaire des mitochondries animales o elle a t trs tudie. On continue l'appeler sulfite oxydase bien que le vritable accepteur dans tous les cas examins ne soit pas l'oxygne mais un cytochrome c (l'oxygne n'intervient donc qu'en aval). L'enzyme contient du molybdne au sein d'une molybdoptrine (MPT), et fait donc partie de la famille des molybdo-enzymes. Le molybdne passe par plusieurs niveaux d'oxydorduction, Mo(IV), Mo(V) et Mo(VI), identifiables en RPE. La sulfite oxydase a t purifie rcemment partir de Thiobacillus novellus cultiv pH 8,5 sur carbonate de sodium et thiosulfate [83]. L'enzyme possde deux sous-units ingales de 40 et 8 kDa. La premire renferme la molybdoptrine, la seconde est un cytochrome c552. L'ensemble fonctionne comme une seule et mme molcule pouvant stocker 3 lectrons, deux sur le mtal, un seul sur le cytochrome.
HSO3 + H2O SO42 + H+
Mo(VI) Fe(III)
Mo(IV) Fe(III)
Mo(V) Fe(II) cyt. c Fe(III)
Mo(V) Fe(III) cyt. c Fe(II)
Mo(VI) Fe(II) cyt. c Fe(III) e
Mo(VI) Fe(III) cyt. c Fe(II) e
Oxydation du sulfite
176
L'oxydation d'une molcule de sulfite n'apporte que 2 lectrons, dchargs un par un la sortie comme l'indique le dessin. Un cytochrome c550 indpendant du prcdent est laccepteur, et se roxyde sur la chane respiratoire. Observons un petit dtail significatif : l'oxydation de l'hydrosulfite, qui est proton Ph neutre, libre un proton avec le sulfate dans le priplasme, opration qui facilite l'acidification de la surface externe de la membrane cytoplasmique et contribue son potentiel lectrochimique. La deuxime mthode d'oxydation du sulfite passe par l'APS avec conservation de l'nergie sous forme d'ADP ou d'ATP. Elle se fait en deux tapes.
APS adnosine-5'-phosphosulfate O O O O OH O N N NH2 N N APS rductase HSO3 + AMP ADP sulfurylase APS + phosphate
O=S O P O CH2
APS + 2e
OH
ADP + SO42
La premire est une oxydation par l'APS rductase (EC 1.8.99.2), mieux connue chez les bactries assimilatrices du sulfate (qui font la raction inverse). L'examen des squences laisse supposer que la rductase conserve des similitudes chez toutes les bactries qui catalysent une oxydorduction entre sulfate et APS, que ce soit dans un sens ou dans l'autre [84]. La structure est celle d'un htrodimre comportant une flavine (FAD) et deux noyaux [4Fe-4S]. Quand la biosphre s'est enrichie en O2 dans un pass lointain, les arobies auraient rcupr un modle ancien dj en service chez les anarobies. L'norme accumulation du sulfate dans l'eau de mer, o il atteint une concentration de 28 mM, a t favorise au cours de l'histoire de la terre par l'activit des organismes photosynthtiques utilisant les sulfures comme sources d'lectrons. Les oxydations arobies voques ici seraient donc apparues ultrieurement. La deuxime conversion est catalyse par l'ADP sulfurylase (EC 2.7.7.4), elle libre le sulfate et de l'nergie sous forme d'ADP (par sa liaison pyrophosphate haut potentiel). La raction correspond en somme la mobilisation de l'nergie produite au cours de la formation de l'APS. Deux molcules d'ADP (des sous-ATP !) sont facilement traites par une raction classique dite de l'adnylate kinase ou myokinase : 2 ADP ATP + AMP. Un mcanisme analogue se retrouvera chez les sulfato-rducteurs mais fonctionnera en sens inverse. L'ADP sulfurylase de Thiobacillus denitrificans a t tudie en dtail.
AMP-S E + AMP-S (= APS) E E AMP E ADP E + ADP
SO42
phosphate
"ADP sulfurylase"
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Son fonctionnement comporte la formation d'une liaison covalente transitoire entre l'enzyme (E) et l'APS [85]. Diffrents arguments tirs de l'emploi des inhibiteurs comme l'arsniate montrent que les tapes dsignes par les flches noires sont irrversibles. L'enzyme ne peut donc pas revenir en arrire et faire de l'APS avec du sulfate et de l'ADP. Le schma ci-dessus reste pourtant valable en remplaant le phosphate par du pyrophosphate et le produit de la raction est alors l'ATP ! C'est pourquoi BRSER et coll. ont propos d'appeler cette enzyme, non pas ADP sulfurylase, mais ATP sulfurylase. Ce n'est pas une simple subtilit de nomenclature, parce que la sulfurylase ressemble d'autres enzymes qui fonctionnent aussi avec l'ATP ou un triphosphate, et il est possible et mme probable que ce soit la vritable raction physiologique. L'enzyme est inhibe exprimentalement par le molybdate (Mo42) qui intervient comme analogue du sulfate. C'est un inhibiteur caractristique de cette tape du cycle du soufre. Il agit aussi bien chez Thiobacillus et les phototrophes, qui oxydent le soufre, que chez les sulfato-rducteurs oprant en sens inverse. La rcupration de l'nergie ATP par l'intermdiaire de l'APS apporte donc aux bactries un bnfice essentiel au cours de l'oxydation du sulfite en sulfate. En rsum l'oxydation du sulfite en sulfate est productrice d'nergie de deux faons diffrentes. La premire utilise la sulfite oxydase et repose sur une translocation de protons contribuant la formation d'un potentiel membranaire. La seconde privilgie l'apparition d'ADP ou d'ATP, et se fait en deux tapes, celles de l'APS rductase et de l'ADP(ATP) sulfurylase.
3.9 - LIMINATION DE COMPOSS SOUFRS SIMPLES

Il y a d'normes quantits de produits soufrs dans l'atmosphre, mais pour une fois l'homme n'est pas le principal responsable de cette pollution. Il s'agit pour prs de la moiti du dimthyl-sulfure (DMS), accompagn de H2S, de sulfure de mthyle (ou mthanethiol) et du dimthyl-disulfure (DMDS). Ces produits tirent leur origine de deux sources principales, la mthionine (l'acide amin entrant dans la composition des protines) et le dimthylsulfonium-propionate ou DMSP. L'environnement renferme galement une foule de composs secondaires, comme le thiocyanate (S=C=N), les isothiocyanates (RN=C=S), et des glucosinolates forms par les plantes.
H3CSH H3C CH3 H3C CH3 H3C H3C S+(CH2)2COO
SS
Mthanethiol
DMS
DMDS
DMSP
Le DMSP est produit par le phytoplancton marin, les algues de la zone des mares et les gramines littorales du genre Spartina. Ce produit agirait comme rgulateur physiologique de la pression osmotique en milieu salin et comme cryoprotecteur
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quand l'azote est limitant. Il aurait aussi le rle d'un agent anti-oxydant [86] ou de dfense contre les prdateurs (crustacs, protozoaires). Le prcurseur du DMSP chez l'algue verte Enteromorpha intestinalis est la mthionine [87]. L'attaque prpondrante du DMSP se fait par une lyase qui libre de l'acrylate et du dimthylsulfure (DMS). L'oxydation du DMSP produit aussi du dimthylsulfoxyde (DMSO).
COS H2SO4 SO2 CH3SO3H oxydations H3C CH3 oxydation photosynthsique rduction H 3C CH3 S DMS mthylation oxygnation rduction
CH3SH
DMDS
O DMSO
DMSP
H2C=CHCO acrylate
CH4
H2S
CO2
Les voies du dimthyl-sulfure

Le petit tableau montre quelques conversions du dimthyl-sulfure (DMS). Le DMSP est la source principale de DMS, qui nat galement de la rduction du DMSO par des sulfato-rducteurs. La quantit de DMS mise annuellement dans l'atmosphre est estime 45 millions de tonnes de soufre [88]. La concentration en DMSP et DMS peut atteindre 1 M et davantage dans les tapis de cyanobactries et les marais sals. Ils sont abondants dans les coraux, les algues, les diatomes et certaines plantes. La surface de la mer, l o elle est riche en phytoplancton, est sature en DMS car celui-ci est trs peu soluble et volatil comme l'ther (il bout 36C). Sa prsence confre l'eau de mer une odeur perceptible et son origine est surtout biologique. Par oxydation photochimique dans l'atmosphre, il engendre du sulfure de carbonyle, du dioxyde de soufre, de l'acide sulfurique et de l'acide mthane-sulfonique, ainsi que des produits mineurs. Toute augmentation des produits oxyds du soufre comme l'acide sulfurique, soit la suite d'une pollution d'origine humaine, soit au cours d'ruptions volcaniques, est responsable de pluies acides. L'introduction d'arosols d'acide sulfurique dans la haute atmosphre a aussi pour consquence d'intercepter une part de rayonnement solaire et d'avoir des rpercussions climatiques, car il se forme des noyaux de condensation l'origine d'une nbulosit. L'quilibre radiatif gnral de la biosphre est donc concern. L'mission de DMS et la production d'acide sulfurique suggre une relation inattendue entre l'activit du plancton ocanique et le climat ! Le Thiobacillus thioparus et bactries de la mme srie sont capables d'oxyder divers substrats soufrs, DMS, DMDS, mthanethiol, en tirant leur nergie la fois de l'oxydation de la partie carbone et de celle de la partie soufre [89]. Il y a plusieurs voies d'oxydation par O2. La premire, qui est l'oxydation en dimthylsulfoxyde (DMSO) est intressante sur le plan biologique, car le DMSO est un accepteur d'lectrons dans des respirations dites anarobies, o l'oxygne est remplac par le nitrate, le sulfate et d'autres composs. L 'oxydation du DMS en DMSO
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est pratique aussi en anarobiose par les bactries phototrophes non oxygniques qui s'en servent comme source d'lectrons. La deuxime voie d'oxydation utilise successivement la dimthyl-sulfure mono-oxygnase et la mthanethiol oxydase. Ces enzymes catalysent respectivement les ractions : Dimthyl-sulfure + O2 + NADH mthanethiol + formaldhyde + NAD+ + OH Mthanethiol + O2 + H2O H2S + formaldhyde + H2O2 (1) (2)
Ces ractions ont t observes chez les bactries appartenant aux genres Thiobacillus et Hyphomicrobium [90]. Le formaldhyde est pris en charge par le mtabolisme monocarbon utilisant le FH4*, et l'eau oxygne est dtruite par la catalase. Une variante de la raction (2) repose sur une mthyltransfrase et la formation de mthyl-FH4. Ces oxydations biologiques du DMS sont compltes par l'action photochimique faisant natre dans l'atmosphre un produit stable, l'acide mthanesulfonique (CH3SO3H), qui est entran par la pluie et la neige ou qui se dpose avec la poussire. Des bactries mthylotrophes spcialises peuvent le rcuprer comme source de carbone et d'nergie l'aide d'une mthanesulfonate mono-oxygnase [91]. Le DMS est galement mtabolis en H2S par anarobiose, et les mthanognes le transforment en mthane. Le sulfure d'hydrogne est nouveau mthylable en DMS, et il existe donc un cycle faisant alterner le DMS, le mthanethiol et le H2S. Nous le retrouverons au Chapitre 7. Et l'activit humaine l-dedans ? La contamination biologique de l'atmosphre en disulfure de carbone (CS2) par le sol et les plantes a t estime 5 millions de tonnes de soufre, et l'activit industrielle, principalement la fabrication de viscose et de cellophane, introduirait un million de tonnes supplmentaires. La plus grande partie de la pollution soufre vient du raffinage du ptrole, de la combustion des carburants utiliss pour le transport (malgr les progrs raliss pour dsulfurer l'essence et le gazole), de l'industrie minire et mtallurgique et des appareils de chauffage. Cette pollution est surtout sous forme de SO2 et contribue l'apparition du smog au-dessus des grandes mtropoles humaines (Los Angeles, Pekin, Mexico) En rsum, on a pu constater que le cycle du soufre a des ramifications complexes dans la biosphre. Nous n'avons abord ici que la partie des oxydations. Les plus importantes traitent des produits simples comme l'hydrosulfure et accumulent des ions sulfate ou de l'acide sulfurique. Le dimthyl-sulfure est pour l'essentiel d'origine biologique et donne lieu un chass-crois de ractions d'une varit surprenante. Les organismes responsables n'ont pas tous t rpertoris et il reste beaucoup dcouvrir sur la varit des enzymes impliques.
3.10 - L'OXYDATION DU FER ET DU MANGANSE

De nombreuses espces bactriennes tirent leur nergie de l'oxydation l'air du fer et du manganse. Les "bactries du fer" oxydent le fer ferreux en fer ferrique.
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Certaines espces oxydent aussi les sulfures et le soufre. Les ractions sont reprsentes par : 4 Fe2+ + O2 + 4 H+ 4 Fe3+ + 2 H2O S2 + 2 O2 SO42 2 S + 3 O2 + 2 H2O 2 SO4
0 2
(1) (2)
+ 4H
(3)
Parmi celles-ci, Gallionella ferruginea et Leptothrix ochracea sont des habitants communs des sources ferrugineuses et font d'importants dpts d'hydroxyde de fer grce la raction (1). Les Gallionella ont une morphologie curieuse : leurs cellules en forme de haricot excrtent une matrice organique dans laquelle les hydroxydes de fer prcipitent, formant des filaments torsads de 50 nm de diamtre. Les Leptothrix et Sphaerotilus s'entourent de gaines tubulaires dans lesquelles s'accumulent des oxydes de fer et de manganse. Les sources thermales renferment des espces voisines.
Gallionella ferruginea
Sphaerotilus
Ces organismes sont souvent adapts des eaux trs pauvres en lments nutritifs. Les Gallionella ont une Rubisco indicatrice d'un cycle de CALVIN assurant l'autotrophie. Ils sont en fait mixotrophes, car ils peuvent se fournir la fois en CO2 et en sources carbones organiques (glucose, fructose, saccharose). Ce sont des espces difficiles cultiver. En culture are contenant du sulfure, les bactries peuvent tirer tout leur carbone de CO2. Les premires cultures de G. ferruginea ont t obtenues 20-25C par une technique dite de KUCERA et WOLFE [92]. Leur dveloppement est trs lent au-dessous de 12 et leur croissance est arrte au-dessus de 30 (comme il arrive souvent pour les bactries du sol). Ces bactries sont micro-arophiles et croissent un pH optimum de 6,5. Contrairement Gallionella, les Leptothrix et Sphaerotilus n'assimilent pas CO2 et vivent en stricte htrotrophie. Nous savons que les bactries du genre Thiobacillus ont une importance conomique considrable, car elles interviennent dans la dsulfuration des rejets et des hydrocarbures, ainsi que dans les oprations minires. La vedette revient Thiobacillus ferrooxidans. Cette espce fortement acidophile est autotrophe et peut vivre dans des conditions extrmes, soit pH 2-3 et en prsence de concentrations mtalliques trs fortes. Sa tolrance pour le cadmium, le zinc et le cuivre atteint des concentrations proches de la molarit. Elle rsiste au cobalt (0,15 M), au chrome (75 mM), au plomb (1mM) et aux sels mercuriques (10 M). Elle rsiste
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aussi un niveau lev d'ions sulfate (0,15 M). Ce germe extraordinaire assimile donc CO2 et tire son nergie de l'oxydation du fer et des sulfures par le dioxygne laide des ractions (2) et (3). Le fer sous forme ferrique se comporte lui-mme comme oxydant du sulfure et de quelques oxydes mtalliques. Le sulfure de fer le plus abondant dans la nature tant la pyrite (FeS2), la raction thorique peut s'crire : 14 Fe3+ + FeS2 + 8 H2O 15 Fe2+ + 2 SO42 + 16 H+ (4) L'oxydation du fer de la pyrite libre sur ce principe donc de grandes quantits d'acide raison de 16 protons par mole. La teneur leve de la pyrite en soufre fait qu'elle n'est pas un bon minerai de fer. La pyrite cde gnralement la place d'autres formes minralogiques (voir Fer*). En principe, l'oxydation du fer ferreux en fer ferrique correspond un potentiel redox standard Ph 7 de + 770 mV. Cette valeur leve est proche de celle du couple O2/H2O (+ 820 mV), laissant supposer que le saut nergtique utilisable par Thiobacillus pour sa croissance sur le fer est faible. Cependant l'ion Fe3+ forme des hydroxydes insolubles par raction sur l'eau : Fe(OH)2+, Fe(OH)3, ou Fe(OH)4. Cette proprit et l'apport d'acide dplacent l'quilibre d'oxydorduction correspondant la raction (1) vers la droite, favorisent l'oxydation du fer ferreux et abaissant le potentiel correspondant. Donc en l'absence de sulfure oxyder, la raction (1) est plus mme de fournir l'nergie aux bactries, en particulier si le milieu s'acidifie. La prsence de pyrite ou de sulfure produit normment d'acide (raction 2). La chute du pH des valeurs proches de 2 ou au-dessous dissocie en partie les hydroxydes de fer, mais favorise la raction (4) vers la droite, produisant davantage d'acidit et rgnrant galement du fer ferreux disponible pour la raction (1). Il y a donc un cycle d'une partie du fer entre les deux ractions (1) et (4). En les combinant ainsi (par multiplication des coefficients) : 28 Fe2+ + 7 O2 + 28 H+ Le bilan rsultant est : 2 FeS2 + 7 O2 + 2 H2O 2 Fe2+ + 4 SO42 + 4 H+ (5) 28 Fe3+ + 14 H2O (1') (4') 28 Fe3+ + 2 FeS2 + 16 H2O 30 Fe2+ + 4 SO42 + 32 H+
La raction (5) nous claire sur l'activit de Thiobacillus ferrooxidans comme espce minire. Le pH acide lui permet d'amorcer une oxydation du fer. Celui-ci va lui servir mobiliser la pyrite, avec production d'acide sulfurique et de fer ferreux, entrans l'un et l'autre par lessivage. En fait la bactrie utilise ici surtout l'nergie de l'oxydation l'air du sulfure, une source d'nergie relativement confortable ! Comme l'ion ferreux est facilement roxyd par les bactries ou mme spontanment par O2, il y aura toujours assez de fer pour ramorcer l'oxydation de la pyrite en cas de besoin. Une partie du fer ainsi mobilis tend former des oxydes et hydroxydes insolubles ds que l'acide est limin, et il en rsulte des dpts ferrugineux importants appels jarosite, alors que l'acide form rend corrosives et polluantes les eaux de lessivage.
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Sur le plan enzymatique, on dispose de quelques renseignements sur la S-Fe(III) oxydorductase de T. ferrooxidans. L'enzyme a t purifie [93] et parat attache la membrane du ct du priplasme. Les renseignements sur son fonctionnement restent trs fragmentaires. Les ions ferriques sont capables d'oxyder divers ions et oxydes mtalliques. Par exemple l'oxyde d'uranium(IV) de l'uraninite ou pechblende (UO2) est solubilis en uranium(VI) : UO2 + 2 Fe3+ UO22+ + 2 Fe2+ (6)
Les bactries roxydent le fer par un va-et-vient qui favorise ainsi la solubilisation de l'oxyde d'uranium. Le mme principe peut tre appliqu d'autres minerais, grce l'alternance entre l'tat oxyd et l'tat rduit du fer et l'entranement des mtaux par l'acide form. Ces ractions ont conduit au dveloppement de ce qu'on appelle la biolixiviation. Avec Thiobacillus et bactries apparentes, il est ainsi possible de rcuprer du cuivre partir de minerais faible teneur ou de dchets miniers. Le cuivre est tir de plusieurs minraux dont la chalcopyrite (CuFeS2) et la chalcosine (Cu2S). Un procd du mme type a t utilis pour l'extraction d'autres mtaux comme l'or. Voici un schma de principe de l'extraction du cuivre par lixiviation 13 :
minerai sulfate ferrique
I. raction entre sulfate de fer et chalcopyrite, formant du sulfate de cuivre
air II. le fer rduit le sulfate de cuivre minerai lessiv fer prcipit de cuivre III
fermenteur Thiobacillus
L'opration reprsente comporte trois phases. En (I), la chalchopyrite est traite en prsence de sulfate ferrique, qui est rduit en sulfate ferreux avec solubilisation du cuivre en sulfate : 2 Fe2(SO4)3 + CuFeS2 + 2 H2O + 3 O2 CuSO4 + 5 FeSO4 + 2 H2SO4 (7)
13 - Schma imit de Microbiologie par PRESCOTT, HARLEY et KLEIN (DEBOECK)
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En (II), le mlange acide soluble, contenant CuSO4 et FeSO4, est pass sur un lit de fer mtallique qui procde la rduction du sulfate de cuivre et la prcipitation du mtal : CuSO4 + Fe FeSO4 + Cu (8)
En (III), les bactries sont l'uvre dans un fermenteur contenant un milieu nutritif acide et ar, aliment par le sulfate de fer. Celui-ci est oxyd en Fe2(SO4)3 par les bactries. Il est rcupr et recycl. Le pilotage de ce type d'extraction reste dlicat dans la pratique en fonction de la nature du minerai. Thiobacillus commence gnralement par oxyder prfrentiellement le sulfure avant le fer, ce qui retarde la biolixivation. Des auteurs japonais ont prconis un procd par flottation o les bactries qui adhrent aux particules de pyrite l'tat divis tendent couler au fond de la suspension et facilitent l'limination des impurets par flottation [94]. Et le manganse ? Cet lment est abondant et se rencontre principalement l'tat de Mn(II) soluble ou de formes oxydes insolubles Mn(II) et Mn(III). Le dioxyde de manganse MnO2 est un solide brun et la forme la plus stable dans l'environnement. Le cycle d'oxydorduction du manganse dans la nature est en partie parallle celui du fer. Nous en aurons une indication dans un chapitre ultrieur, o les deux mtaux apparatront comme des accepteurs respiratoires. Une particularit des oxydes de manganse est leur pouvoir oxydant sur divers lments minraux et organiques. En outre MnO2 peut vhiculer d'autres mtaux : Cd, Cu, Co, Zn. Le Mn(II) engendr par rduction est roxyd par de nombreuses espces bactriennes, par exemple par les Leptothrix dj mentionns. L. discophora se caractrise par la double prcipitation d'oxyde de Fe et de Mn dans la gaine qui l'entoure. Le manganse s'oxyde de deux faons dans la nature, soit par une raction spontane acclre en milieu alcalin, soit par action enzymatique. La prcipitation des oxydes par Leptothrix rsulte de l'action d'une protine de 110 kDa excrte par les cellules. Cette enzyme a t caractrise ds 1987 et prsente des similitudes avec les oxydases renfermant plusieurs ions cuivre [95]. L'oxydation du manganse parat gnralement ralise par une cuproprotine, tudie chez Pseudomonas putida, une espce commune qui a l'avantage d'tre plus facile manipuler exprimentalement. Chose curieuse, certains Bacillus marins font des spores qui oxydent les ions Mn2+ et s'entourent d'un prcipit de dioxyde, mais l'isolement de l'enzyme partir des spores s'est avr difficile. L'oxydation du manganse parat jusqu' prsent toujours sous la dpendance d'oxydases contenant du cuivre et inhibes par l'azoture (ou azide) qui est un inhibiteur classique des cuproprotines. Ce problme a t revu assez rcemment par FRANCIS et TEBO [96]. Il a des prolongements vers la circulation d'autres mtaux dans l'environnement, puisque MnO2 peut les oxyder son tour, ou adsorber sa surface diffrents radionuclides et mtaux toxiques, facilitant leur limination dans le traitement des eaux ou autres oprations de dpollution. La circulation des mtaux dans l'environnement est une question importante qui claire certains cycles naturels, et cette question trouvera son prolongement au Chapitre 14.
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3.11 - CYANURE - CYANATE - THIOCYANATE

Le cyanure a la rputation d'tre un poison violent et figure habituellement sous forme d'anion CN. L'acide correspondant qui est le cyanure d'hydrogne (HCN) a un pKa de 9,3, et l'anion domine largement pH physiologique. La solution de cyanure de potassium pH 7 est instable cause de sa dissociation et de la perte de HCN. Celui-ci est volatil et moins dense que l'air, il s'limine rapidement dans l'atmosphre o sa concentration devient trs dangereuse 300 ppm. Mais l'quilibre entre HCN et l'anion est facilement dplac en faveur du second qui est fortement nuclophile. Il agit comme complexant des mtaux (Ni, Fe, Cu, Zn, Au) et donne des cyanohydrines avec les groupes carbonyles. On sait que le cyanure se fixe facilement sur les ferriporphyrines des cytochromes, notamment dans la cytochrome oxydase, ce qui en fait un poison mtabolique 14. Le cyanure est la fois un produit naturel et un polluant industriel. La production de cyanolipides ou de drivs glycosidiques des alpha-hydroxynitriles est trs rpandue dans le rgne vgtal. La production de ces drivs emprunte plusieurs voies partir d'acides amins par dcarboxylation et transformation de l'amine en nitrile. Leur hydrolyse par la -glucosidase provenant de champignons et de diverses espces bactriennes, dont Lactobacillus plantarum [97], libre le cyanure. Une raction intressante est la production de HCN par certaines bactries. Pseudomonas aeruginosa et P. fluorescens en font comme produit secondaire n'intervenant pas dans le mtabolisme central de la cellule [98]. L'enzyme responsable est une oxydase flavinique membranaire qui oxyde la glycine en CO2 et HCN. Ce systme est induit quand les bactries sont limites en oxygne et entrent en phase stationnaire. Quelle est la fonction de ce curieux dispositif ? Les produits du mtabolisme secondaire uvrent souvent comme armes de dfense ou de contrle de la concurrence. Quand il est produit par des Pseudomonas logs sur les racines des plantes, le cyanure est peut-tre un agent de lutte contre la multiplication des champignons. Cette fonction cologique possible reste vrifier. Les cyanures sont donc produits en continu et petite dose dans l'environnement. L'industrie en libre ventuellement des quantits considrables par les activits minires, le traitement des mtaux et la production de fibres synthtiques. Le cyanure ne s'accumule pas dans l'environnement, mais le danger des pollutions vient surtout des dversements brusques et abondants dans les rivires, avec leurs consquences catastrophiques pour la faune piscicole. L'organisme des mammifres est arm pour se dfendre contre les petites quantits de cyanure provenant de l'alimentation. L'enzyme de dfense est la rhodanse, qui est galement rpandue chez les micro-organismes, notamment les bactries de la photosynthse : Chromatiuvinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Chlorobium limicola et d'autres. L'enzyme est une transfrase, prenant sur le
14 - L'action du cyanure sur la cytochrome oxydase mitochondriale a t dmontre pour la premire fois avant 1930 par WARBURG et KEILIN. Toxicit mortelle chez l'homme 1 mg par kg.
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thiosulfate un atome de soufre (appel sulfane) pour le placer sur un accepteur. Si celui-ci est un cyanure, il est transform en thiocyanate : S2O32 + KCN SO32 + KSCN La dtoxication du cyanure est donc une des fonctions de la rhodanse. L'enzyme intervient aussi dans le mtabolisme des thiols, et ne serait pas tranger la formation des noyaux fer-soufre. La transformation du cyanure dans la nature est intressante et peut suivre plusieurs voies rsumes par ce schma [99] :
SCN thiocyanate
sulfite 1 2 H2O H+ HCOO + NH4+ 2 2 H2O 1. rhodanse 2. nitrilase 3. oxygnase 4. hydratase CN 4 HCONH2 formamide thiosulfate 3 NH4+ + CO2
O2 NADH 3H+
NAD+
Devenir du cyanure
Les ractions 2 et 3 permettent aux bactries de rcuprer l'azote sous forme ammoniacale. Le cyanure est alors utilis comme seule source d'azote pour une croissance assez lente. La raction 2 est catalyse par une nitrilase particulire (EC 3.5.5.1) dcrite chez Bacillus pumilus [100], Alcaligenes xylooxidans et un Pseudomonas [101]. Une formiate dshydrognase est induite en mme temps que la nitrilase et permet probablement de restaurer le NADH ncessaire la raction 3. La voie 4 est peut-tre une voie secondaire. La raction 3 de la cyanure oxygnase a t dcrite chez un Pseudomonas fluorescens et serait la plus importante [102]. Cette enzyme ressemble une dioxygnase, coupant O2 et incorporant les deux atomes dans le gaz carbonique. Elle fonctionne en fait comme une mono-oxygnase faisant parvenir seulement l'un des atomes d'oxygne au gaz carbonique, l'autre tant apport indirectement par l'eau. Le cheminement serait le suivant : CN + O2 + NADH + 2 H+ [XOH] + H2O + NAD+
(XOH tant un produit carbon et azot, qui pourrait tre HOCN). Cette monooxygnation obissant au modle standard serait suivie d'une hydrolyse : [XOH] + H2O CO2 + NH3 Une variante de l'oxygnation du cyanure (raction 3 du schma mtabolique) conduit HOCN ou cyanate, attaqu par la cyanase. Nous y reviendrons un peu plus loin. KUNZ et coll. ont dcouvert un phnomne curieux [103]. Ils ont cultiv les
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bactries sur cyanure avec une limitation en azote. La prsence du cyanure induit la mono-oxygnase. En observant la monte de celle-ci et la disparition du cyanure dans le milieu de culture de Ps. fluorescens, ils se sont aperus qu'il n'y avait pas de concordance dans le temps. Une partie du cyanure disparaissait indpendamment de l'activit enzymatique induite. Ils ont constat en outre que les bactries excrtaient des oxoacides (pyruvate et 2-oxoglutarate), lesquels formaient avec le cyanure des cyanohydrines. Le cyanure se retrouvait alors pig non enzymatiquement par ces oxoacides l'extrieur de la cellule. On a pu voir que les cyanohydrines pouvaient servir de substrats azots, mais que leur utilisation tait soumise la prsence de l'oxygnase. Ce phnomne fait sans doute office de protection. La toxicit du cyanure dans le milieu est contrecarre par l'action des oxoacides. Les cyanohydrines sont prises l'intrieur de la cellule, mtaboliss avec rcupration du carbone et de l'azote tout la fois. Il y a sans doute hydrolyse de ces cyanohydrines et libration de cyanure qui est trait son tour par l'oxygnase. Cependant les modalits exactes restent dterminer, ainsi que le vaet-vient d'oxoacides d'un compartiment l'autre. La nature de l'oxygnase est inconnue, mais il s'agit peut-tre d'une mtallo-enzyme comme les autres oxygnases.
CN RCCOO OH mb
HCN + RCOCOO
RCCOO + CO2 + NH3 NADH O2 oxygnase
assimilation
Revenons maintenant au cyanate (HOCN) 15. Ce produit peut rsulter d'une monooxygnation du cyanure (1), prcdant une raction sur bicarbonate (2) ou d'hydrolyse (3) par la cyanase (EC 4.2.1.104). CN + O2 + NADH + H+ N=C=O + H2O + NAD+ N=C=O + HCO3 + 2 H+ 2 CO2 + NH3 N=C=O + H2O + H
+
(1) (2) (3)
CO2 + NH3
On pense gnralement que la transformation de HCN en cyanate n'est pas une raction mtabolique importante, alors que la cyanase est une enzyme trs rpandue. Pourquoi ? La formation de N=C=O rsulterait surtout de la dcomposition spontane de l'ure et du carbamyl-phosphate*, et n'aurait la plupart du temps rien voir avec le cyanure. Le rle de la cyanase serait donc de maintenir dans la cellule un niveau suffisamment faible de cyanate pour tre tolr. La cyanase peut aussi mieux faire. E. coli K12 est muni d'une cyanase catalysant la raction (2). Elle est produite par l'opron cynTSX et inductible par l'azoture (ou azide, N3) [104]. Cette enzyme CynS lui permet de se multiplier sur cyanate comme seule source azote ! La protine CynT code par le mme opron est une
15 - Les questions de terminologie sont rappeles en glossaire cyanate*.
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anhydrase carbonique dont le rle est peut-tre de rhydrater le gaz carbonique en bicarbonate pour approvisionner la cyanase. Le thiocyanate donne lieu un problme similaire. N de la raction du soufre sur le cyanure, il est moins toxique que celui-ci, tout en tant un polluant de l'industrie chimique. Le thiocyanate a aussi une origine botanique. De nombreuses plantes fabriquent des glucosinolates (thioglucosides) qui sont trs rpandus chez les Crucifres. Par exemple la consommation de chou fait apparatre du thiocyanate dans le sang et dans la salive. L'hydrolyse de ces produits libre du thiocyanate en mme temps par la rhodanse. La dgradation du thiocyanate emprunte plusieurs voies. L'une d'elles a t analyse chez Thiobacillus thioparus, un chimio-lithotrophe capable de tirer son nergie du thiocyanate. Des auteurs japonais [105] ont mis en vidence une thiocyanate hydrolase transformant le substrat en sulfure de carbonyle (SCO) et ammoniac, selon un schma impliquant deux intermdiaires. La premire tape a des analogies avec l'hydratation d'un nitrile (RCN) et l'enzyme possde effectivement une homologie avec la famille des nitrilases. De faon gnrale les nitriles sont transforms en acide carboxylique par deux hydratations successives, la premire par la nitrilase formant l'amide, grce laquelle une amidase libre l'ammoniac.
H 2O
SC=N SCNH
H2O
NH3
SCOH
OH S=C=O sulfure de carbonyle
thiocyanate
Thiocyanate hydrolase
Une deuxime voie d'attaque du thiocyanate a t dcrite chez un Gram-ngatif non clairement identifi et dsign comme souche 26B. Elle est fonde sur une premire hydrolyse librant du sulfure et du cyanate [106]. Le soufre est oxyd en thiosulfate puis en ttrathionate, qui est souvent le produit terminal de cette voie. Le thiocyanate est un substrat tonnant en ce qu'il peut servir la fois de source d'nergie, de carbone, de soufre ou d'azote. Voil bien des possibilits pour une molcule aussi simple ! L'oxydation du thiocyanate en sulfate, CO2 et NH3 libre au total 8 lectrons. Les bactries capables de se dvelopper en autotrophie avec le thiocyanate comme donneur d'lectrons sont gnralement des Thiobacillus, notamment T. thioparus. Diffrentes catgories de bactries htrotrophes (Arthrobacter, Pseudomonas, Methylobacterium thiocyanatum) peuvent tirer leur azote du thiocyanate. Son attaque au cours de l'puration d'eaux lourdement contamines est faite par des associations bactriennes o dominent des germes tels que T. thioparus. L'utilisation du thiocyanate par des bactries capables de se dvelopper dans des milieux carbonats fortement alcalins contenants de l'actate (pH 10) a t dmontre rcemment [107] Ces bactries sont des associations d'autotrophes et d'htrotrophes qui accumulent du cyanate, apparemment la suite de l'hydrolyse du thiocyanate par la raction (3) indique prcdemment. Voici bien des possibilits et des transformations naturelles multiples qui auraient pu rester insouponnes !
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Que devient le SCO form ? Nous l'avons vu engendrer sous l'action de la thiocyanate hydrolase de Thiobacillus thioparus. Il se forme galement partir du disulfure de carbone (S=C=S). Ce compos mrite un bref dtour. Liquide dense non-miscible l'eau, inflammable et volatil, il est utilis dans l'industrie de la viscose 16 et comme solvant des rsines, caoutchoucs et graisses. Un Paracoccus denitrificans se dveloppe en autotrophie en utilisant comme source d'nergie du succinate, du thiosulfate ou du disulfure de carbone. Celui-ci est transform en sulfure de carbonyle par une oxygnase [108] Le devenir du SCO est en principe trs simple. T. thioparus l'hydrolyse en CO2 + H2S. Mais le plus tonnant est sa rduction par la nitrognase d'Azotobacter vinelandii, l'enzyme charge en principe d'assimiler en ammoniac le diazote atmosphrique. SCO + 2 e + 2 H+ H2S + CO L'un des produits de la raction est du monoxyde de carbone, dont la formation a t mise en vidence par spectroscopie ou en le pigeant avec l'hmoglobine [109]. La nitrognase est trs sensible la prsence d'O2 mais elle en est protge l'intrieur de la cellule par la grande activit des oxydations qui s'y droulent. La nitrognase fonctionne avec une ferrdoxine rduite comme source d'lectrons, et de l'ATP comme source d'nergie. La nitrognase peut rduire de toute faon les liaisons NN, NO, NC ou CC doubles ou triples. Elle accepte donc SCO comme substrat, mais le disulfure de carbone est un inhibiteur. Aprs rduction de SCO en CO, celui-ci est gnralement oxyd en CO2. Il est galement substrat de la mthane mono-oxygnase ! La liste des possibilits n'est pas close pour autant. On en veut pour preuve la dcouverte d'un mthylotrophe facultatif, Methylobacterium thiocyanatum, capable d'utiliser le cyanate comme seule source d'azote, et le thiocyanate comme seule source la fois d'azote et de soufre [110]. Ces bactries cultives sur mthanol possdent un taux lev d'hydroxypyruvate rductase et sont donc prsumes utiliser le cycle de la srine. Le thiocyanate serait transform en cyanate, qui est attaqu son tour par une cyanase trs active fonctionnant avec du bicarbonate comme substrat selon la raction (2) donne antrieurement. Cette discussion montre la fois la varit, la complexit des transformations affectant ces drivs, et l'intervention d'enzymes particulirement polyvalentes. Du cyanure au thiocyanate, isothiocyanate, nitriles, cyanohydrines, sulfure de carbonyle et disulfure de carbone, on ne se serait pas attendu une telle diversit d'interactions au sein de l'environnement.
16 - Raction de la cellulose traite par la soude avec le sulfure de carbone, donnant des acides xanthogniques de la cellulose (S=C(SH)OR, o R est un alcoyle), servant rgnrer la cellulose par traitement acide. CS2 se forme par raction trs endothermique du soufre sur le charbon 900C
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CONCLUSION BRVE
Ce chapitre nous a fait passer en revue rapidement l'incroyable varit des oxydations biologiques par l'air touchant des molcules carbones, azotes, soufres et des lments mtalliques. Des transformations cycliques s'entrecroisent et brassent d'une manire essentielle la circulation des lments dans la biosphre sans laquelle les biodgradations, l'puration biologique, seraient impossibles. Les deux chapitres suivants viendront complter ce constat.
RFRENCES
[1] O W E N T (1982) J. Mol. Evol. 18 : 150-156. [2] S C H L E S S I N G E R G & Miller SL (1983) J. Mol. Evol. 19 : 376-382. [3] K A S T I N G JF (1993) Science 259 : 920-926. [4] B A T T L E M & coll. (1996) Nature 383 : 231-235. [5] B O E T I U S A, R A V E N S C H L A G K, S C H U B E R T C J, R I C K E R T D , W I D D E L F, G I E S E K E A, A M A N N R, J R G E N S E N BB, W I T T E U & P F A N N K U C H E O (2000) Nature 407 : 623-626. [6] H A N S O N RS & H A N S O N TE (1996) Microbiol. Reviews 60 : 430-471. [7] B E R G M A N N D J, Z A H N JA & D I S P I R I T O AA (1999) J. Bacteriol. 181 : 991-997. [8] N G U Y E N H H T & coll. (1994) J. Biol. Chem. 269 : 14995-15005. [9] Z A H N JA & D I S P I R I T O AA (1996) J. Bacteriol. 178 : 1018-1029. [10] L I U Y , N E I S H E I M JC , L E E S K & L I P S C O M B JD (1995) J. Biol. Chem. 270 : 24662-24665. [11] R O S E N Z W E I G AC , F R E D E R I C K C A, L I P P A R D S J & N O R D L U N G P (1993) Nature 366 : 537-543. [12] F O X BG & coll. (1989) J. Biol. Chem. 266 : 240-250 ; F O X BG , Y . L I U , D E G E JE & L I P S C O M B JD (1991) J. Biol. Chem. 266 : 540-550. [13] O L D E N H U I S R & coll. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 3155-3161. [14] L E E S K & coll. (1993) J. Biol. Chem. 268 : 21569-21577; L I U Y , N E S H E I M JC , L E E S K & L I P S C O M B JD (1995) J. Biol. Chem. 270 : 24662-24665. [15] W I L K I N S PC , D A L T O N H , S A M U E L C J & G R E E N J (1994) Eur. J. Biochem. 226 : 555-560. [16] J A H N G D & W O O D TK (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 2473-2482. [17] H O L M E S AJ, C O S T E L L O A, L I D S T R O M ME, M U R R E L L JC & coll. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 132 : 203-208. [18] M C T A V I S H H , F U C H S JA & H O O P E R AB(1993) J. Bacteriol. 175 : 2436-2444; B E R G M A N N D J & H O O P E R AB (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204 : 759-762. [19] S C H I E M K E AK & coll. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 321 : 421-428. [20] V A N N E L L I T, L O G A N M, A R C I E R O D M & H O O P E R AB (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 : 1169-1171. [21] M E G R A W S R & K N O W L E S R (1989) Soil Biol. Biochem. 89 : 11-20.
190 [22] W O L F H J & H A N S O N RS (1980) J. Gen. Microbiol. 114 : 187-194; S A H A Y & C H E N M (1989) Natl. Acad. Sci. Lett. 12 : 373-376.
[23] S C N E L L S & K I N G G M (1995) FEMS Microbiol. Ecol. Lett. 4 : 285-294; B E N D E R M & C O N R A D R (1995) Soil Biol. Biochem. 27 : 1517-1527. [24] G O O D W I N PM & A N T H O N Y C (1998) Adv. Microb. Physiol. 40 : 1-80. [25] D E V R I E S G E, A R F M A N N, T E R P S T R A P & D I J K H U I Z E N L (1992) J. Bacteriol. 174 : 5346-5353 ; H E K T O R H J, K L O O S T E R M A N H & D I J K H U I Z E N L (2002) J. Biol. Chem. 277 : 46966-46973. [26] B Y S T R Y K H LV, G O V O R U K H I N A NI, D I J K H U I Z E N L & D U I N E JA (1997) Eur. J. Biochem. 247 : 280-287. [27] K E M P MB & Q U A Y L E JR (1967) Biochem. J. 102 : 94-102; S T R O M T, F E R E N C I & Q U A Y L E JR (1974) Biochem. J. 144 : 465-476. [28] N E W M A N LP & W A C K E T T LM (1995) Biochemistry 34 : 14066-14076 ; S H I E L D S MS , R E A G I N MJ, G E R G E R RR, C A M P B E L L R & S O M E R V I L L E C (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 1352-1356 ; D I J K H U I Z E N L & coll. (1992) In "Methane and methanol oxidizers", M U R R E E L JC & D A L T O N H eds, Plenum Press, N.Y. [29] B O W M A N JP, S L Y LI & S T A C K E B R A N D T E (1995) Int. J. Syst. Bacteriol. 45 : 182-185. [30] D I S T E L D L & C A V A N A U G H C M (1994) J. Bacteriol. 176 : 1932-1938 ; D I S T E L D L & C A V A N A U G H C M (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92 : 9598-9602. [31] W A C K E T T LP, B R U S S E A U G A, H O U S E H O L D E R S R & H A N S O N RS (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2960-2964 ; E N S L E Y BS (1991) Annu. Rev. Microbiol. 45 : 283-299. [32] W I L K I N S PC , D A L T O N H & S A M U E L C J & G R E E N J (1994) Eur. J. Biochem. 226 : 555-560. [33] M O T O S U G I K, E S A K I N & S O D A K. (1982) J. Bacteriol. 150 : 522-527. [34] F I C H MW , G R A H A M D W , A R N O L D RG , A G A R W A L S K, P H L E P S P, S P E I T E L G E & G E O R G I O U G (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 2771-2776. [35] J A H N G D & W O O D TK (1994) Appl. Env. Microbiol. 60 : 2473-2482. [36] S H I E L D S M.S . & coll. (1991) Appl. Environ. Microbiol 57 : 1935-1941; S H I E L D S MS , R E A G I N MJ, G E R G E R RR, C A M P B E L L R & S O M E R V I L L E C (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 1352-1356. [37] J E F F E R S PM, W O L F E NL, N Z E N G U N G V (1998) Geophys. Res. Lett. 25 : 43-46. [38] H A R P E R D B, H A R V E Y BMR , J E F F E R S MR & K E N N E D Y JT (1999) New Phytol. 142 : 5-17. [39] R H E W RC , M I L L E R BJ & W E I S S RF (2000) Nature 403 : 292-294. [40] H A R P E R D B, H A R V E Y BMR , J E F F E R S MR & K E N N E D Y JT (1999) New Phytol. 142 : 5-17. [41] H A R P E R D B (1993) Biogenesis and metabolic role of halomethanes in fungi and plants. In Metal Ions in Biological Systems, S I G E L H & S I G E L A eds, Marcel Dekker, New York : 345-388 ; H A R P E R D B & H A M I L T O N JTG (1988) J. Gen. Microbiol. 134 : 2831-2839. [42] V A N P E E KH (2001) Arch. Microbiol. 175 : 250-258. [43] W U O S M A A AM & H A G E R LP (1990) Science 249 : 160-162. [44] W O L F A R T H G & D I E K E R T G (1997) Curr. Opin. Biotecnol. 8 : 290-295.
3 OXYDATIONS MINRALES [45] V A N N E L L E T, S T U D E R A, K E R T E S Z M & L E I S I N G E R T (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 1933-1936 ; V A N N E L L E T,M E S S M E R M, S T U D E R A, V U I L L E U M I E R S & L E I S I N G E R T (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 4615-4620. [46] M C A N U L L A C , W O O D A L L C A, M C D O N A L D IR, S T U D E R A, V U I L L E U M I E R S , L E I S I N G E R T & M U R R E L L JC (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 307-316. [47] C H I S T O S E R D O V A L, V O R H O L T JA, T H A U E R RK & L I D S T R O M ME (1998) Science 281 : 99-102. [48] M I L L E R L G , K A L I N RM, M C C A U L E Y S E, H A M I L T O N JT, H A R P E R D B, M I L L E T D B, O R E M L A N D RS & G O L D S T E I N AH (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98 : 5833-5837. [49] B U T L E R JH (2000) Nature 403 : 260-261. [50] M A C F A R L A N D (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 807-811. [51] O R E M L A N D RS , L O N E R G A N D J & C U L B E R T S O N C W , L O V L E Y D R (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 1818-1821. [52] K R O N E UE & T H A U E R RK (1992) FEMS Microbiol.Lett. 90 : 201-204. [53] L E E RB, P U R V E S JV, R A T T C L I F F E RG , S A K E R LR (1992) J. Exp. Bot. 43 : 1385-1396 ; F E N T E M PA, L E A PL & S T E W A R T G R (1983) Plant Physiol. 71 : 502-506. [54] K R O N Z U C K E R H J, S I D D I Q I Y & G L A S S AD M (1997) Nature 385 : 59-61 ; S T A R K JM & H A R T S C (1997) Nature 385 : 61-64. [55] H O L M E S AJ, C O S T E L L O A, L I D S T R O M ME & M U R R E L L JC (1995) FEMS Microbiol. Lett. 132 : 203-208. [56] J U L I E T T E LA, H Y M A N MR & A R P D J (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3718-3727 et 3728-3735. [57] I G A R A S H I N, M O R I Y A M A N, F U J I W A R A H , F U K U M O R I T & T A N A K A Y , (1997) Nature Struct. Biol. 4 : 276-284. [58] I V E R S O N TM, A R C I E R O D M H S U BT, L O G A N MS P , H O O P E R AB & R E E S D C (1998) Nature Struct. Biol. 5 : 1005-1012. [59] H O M M E S NG , S A Y A V E D R A - S O T O LA & A R P D J (2001) J. Bacteriol. 183 : 1096-1100. [60] F U K U O K A M, F U K U M O R I Y & Y A M A N A K A T (1987) J. Biochem. (Tokyo) 102 : 525-530. [61] Y A M A N A K A T & F U K U M O R I Y (1988) FEMS Microbiol. Rev. 4 : 259-270.
191
[62] J U R E T S C H K O S , T I M M E R M A N N G , S C H M I D M, S C H L E I F E R K- H , P O M M E R E N I N G - R S E R A, K O O P S H P & W A G N E R M (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 3042-3051. [63] B A R T O S C H S , H A R T W I G C , S P I E C K E & B O C K E (2002) Microbial Ecol. 43 : 26-33. [64] A N D R E W S JH & H A R R I S RF (1986) Adv. Microbiol. Ecol. 9 : 99-147. [65] V A N D E G R A A F AA, M U L D E R A, D E B R U I J N P, J E T T E N MS N , R O B E R T S O N LA & K U E N E N JG (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 1246-1251 ; S T R O U S M, K U E N E N JG & J E T T E N MS N (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 3248-3250. [66] L I N D S A Y MR, W E B B RI, S T R O U S M, J E T T E N MS , B U T L E R MK, F O R D E RJ & F U E R S T JA (2001) Arch. Microbiol. 174 : 413-429. [67] D A M S T JS S , S T R O U S M, R I J P S T R A W IC , H O P M A N S EC , G E E N E V A S E N JAJ , V A N D U I N AC T , V A N N I F T R I K LA & J E T T E N MS M (2002) Nature 419 : 708-712. [68] C Y P I O N K A H & M E Y E R O (1983) J. Biol. Chem. 156 : 1178-1187.
192 [69] J A C O B I T Z S & M E Y E R O (1986) Arch. Microbiol. 145 : 372-377. [70] M. K R A U T & coll. (1989) Arch. Microbiol. 152 : 335-341. [71] H I L L E R (1996) Chem. Rev. 96 : 2757-2816.
[72] D O B B E K H , G R E M E R L, M E Y E R O & H U B E R R (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 8884-8889. [73] T H A U E R RK, J U N G E R M A N N K & D E C K E R K (1977) Bacteriol. Rev. 41 : 100-181 ; B I T T E R E R H , cit par B R U N E D C (1989) Biochim. Biophys. Acta 975 : 189-221. [74] O H JI & K A P L A N S (1999) Biochemistry 38 :2688-2696. [75] D E G I E R JW , S C H E P P E R M, R E I J N D E R S W N, V A N D Y C K S J, S L O T B O O M D J, W A R N E A, S A R A S T E M, K R A B K, F I N E L M, S T O U T H A M E R AH , V A N S P A N N I N G RJ & V A N D E R O O S T J (1996) Mol. Microbiol. 20 : 1247-1260. [76] V I S S E R JM, D E J O N G G AH , R O B E R T S O N LA & K U E N E N JG (1996) Arch. Microbiol. 166 : 372-378. [77] M E U L E N B E R G R, P R O N K JT, F R A N K J, H A Z E U W , B O S P & K U E N E N JG (1992) Eur. J. Biochem. 209 : 367-374. [78] V I S S E R JM, R O B E R T S O N LA, V A N V E R S E V E L D H K & K U E N E N JG (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 : 2300-2305. [79] H A L L B E R G KB, D O P S O N M, L I N D S T R M B (1996) J. Bacteriol. 178 : 6-11. [80] V I S S E R JM, D E J O N G G AH , R O B E R T S O N LA & K U E N E N JG (1997) Arch.Microbiol. 167 : 295-301. [81] H A G E N W R, S I L V A PJ, A M O R I M MA, H A G E D O O R N PL, W A S S I N K H , H A A K E R H & R O B B FT (2000) J. Biol. Inorg. Chem. 5 : 527-534. [82] F R I E D R I C H C G (1998) Adv. Microbiol. Physiol. 39 :235-289. [83] K A P P L E R U, B E N N E T T B, R E T H M E I E R J, S C H W A R T Z G , D E U T Z M A N N R, M C E W A N AG & D A H L C (2000) J. Biol. Chem. 275 : 13202-13212. [84] F R I T Z G , B U C H E R T T, H U B E R H , S T E T T E R KO & K R O N E C K PM (2000) FEBS Lett. 473 : 63-66. [85] B R S E R T, S E L M E R T & D A H L C (2000) J. Biol. Chem. 275 : 1691-1698. [86] S U N D A W , K I E B E R D J, K I E N E RP & H U N T S M A N S (2002) Nature 418 : 317-320. [87] G A G E D A, R H O D E S D , N O L T E KD , H I C K S W A, L E U S T E K T, C O O P E R AJL & H A N S O N AD (1997) Nature 387 : 891-894. [88] K E L L Y D P & S M I T H NA (1989) Adv. Microbiol. Ecol. 11 : 345-385. [89] S M I T H NA & K E L L Y D P (1988) J. Gen. Microbiol. 134 : 3031-3039. [90] D E B O N T JAM , V A N D I J K E N JP & H A R D E R W (1981) J. Gen. Microbiol. 127 : 315-323 ; S U Y L E N G MH , L A N G E PJ, V A N D I J K E N JP & K U E N E N JG (1987) J. Gen. Microbiol. 133 : 2989-2994 ; V I S S C H E R PT & T A Y L O R BF (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3784-3789. [91] K E L L Y D P & M U R R E L L JC (1999) Arch. Microbiol. 172 : 341-348. [92] K U C E R A S & W O L F E RS (1957) J. Bacteriol. 74 : 344 ; H A L L B E C K L, S T A H L T & P E D E R S E N K (1993) J. Gen. Microbiol. 139 : 1531-1535. [93] S U G I O T, M I Z U N A S H I W , I N A G A K I K & T A N O T (1987) J. Bacteriol. 169 : 4916-4922. [94] N A G A O K A T, O H M U R A N & S A I K I H (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 3588-3593. [95] A D A M S LF & G H I O R S E W C (1987) J. Bacteriol. 169 : 1279-1285 ; B O O G E R D RC & D E V R I N D JPM (1987) J. Bacteriol. 169 : 489-494 ;
3 OXYDATIONS MINRALES C O R S T J E N S PLA M, D E V R I N D JPM , G O O S E N T & D E V R I D - D E J O N G EW (1997) Geomicrobiol. J. 14 : 91-108. [96] F R A N C I S C A & T E B O BM (1999) J. Mol. Biotechnol. 1 : 71-78. [97] L E I V, A M O A - A W U A W K & B R I M E R L (1999) Int. J. Food Microbiol. 53 : 169-184. [98] B L U M E R C & H A A S D (2000) Arch. Microbiol. 173 : 170-177. [99] K U N Z D A, N A G A P P A N O , S I L V A - A V A L O S J & D E L O N G G T (1992) Microbiology 140 : 1705-1712. [100] M E Y E R S PR, R A W L I N G S D E, W O O D S D R & L I N D S E Y G G (1993) J. Bacteriol. 175 : 6105-6112. [101] W H I T E JM, J O N E S D D , H U A N G D & G A U T H I E R JJ (1988) J. Ind. Microbiol. 3 : 263-272. [102] H A R R I S RE & K N O W L E S C J (1983) J. Gen. Microbiol. 129 : 1005-1011 ; W A N G C S , K U N Z D A & V E N A B L E S BJ (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 2195-2197. [103] K U N Z D A, C H E N JL & G U A N G L I A N G P (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 4452-4459. [104] L A M B L I N AF & F U C H S JA (1994) J. Bacteriol. 176 : 6613-6622. [105] K A T A Y A M A Y , M A T S U S H I T A Y , K A N E K O M, K O N D O M, M I Z U N O T & N Y U N O Y A H (1998) J. Bacteriol. 180 : 2583-2589. [106] S T R A T F O R D J, D I A S AE, K N O W L E S C J (1994) Microbiology 140(Pt 10) : 2657-2662. [107] S O R O K I N D Y , T O U R O V A TP, L Y S E N K O AM & K U E N E N JG (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 528-538. [108] J O R D A N S L, M C D O N A L D IR, K R A C Z K I E W I C Z - D O W J A T AJ, K E L L Y D P, R A I N E Y FA, M U R R E L L JC & W O O D AP (1997) Arch. 168 : 225-236. [109] S E E F E L D T LC , R A S C H E ME & Ensign SA (1995) Biochemistry 34 : 5382-5389. [110] W O O D AP, K E L L Y D P, M C D O N A L D IR, J O R D A N S L, M O R G A N TD , K H A N S , M U R R E L L JC & B O R O D I N A E (1998) Arch. Microbiol. 169 : 148-158.
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CHAPITRE 4 HYDROGNE - ACTATE - MTHANE

Ce chapitre concerne des transformations qui se droulent pour l'essentiel l'abri de l'air. L'hydrogne, l'acide actique et le mthane reprsentent un important courant de matire dans la biosphre, et sont des intermdiaires incontournables de la chimie de l'environnement. Des mcanismes biochimiques indits sont mis en jeu. Une part importante de ce chapitre sera consacr la synthse du mthane, gaz effet de serre, dont le mcanisme dtaill a t dmont rcemment. Les organismes responsables sont probablement parmi les plus anciens dans l'histoire de la vie, bien avant la monte de l'oxygne atmosphrique et le dveloppement des oxydations arobies. 4.1 - Hydrogne et hydrognases 4.2 - Les hydrognases sont rgules 4.3 - Bactries actognes 4.4 - La gense du mthane 4.5 - Les tapes de la mthanognse 4.6 - Lnergie de lhtrodisulfure rductase 4.7 - De lacide actique au mthane 4.8 - Mthanognes et biodgradations 4.9 - Hydrognosomes 197 201 205 213 218 227 229 232 235
4 HYDROGNE - ACTATE - MTHANE

Ce chapitre concerne des transformations qui se droulent pour l'essentiel l'abri de l'air. L'hydrogne, l'acide actique et le mthane reprsentent un important courant de matire dans la biosphre, et sont des intermdiaires incontournables de la chimie de l'environnement. Ce ne sont pas les seuls, mais nous commenons par ceux qui sont probablement parmi les plus anciens dans l'histoire de la vie, bien avant la monte de l'oxygne atmosphrique et le dveloppement des oxydations arobies.
4.1 - HYDROGNE ET HYDROGNASES

Les hydrognases mtabolisent l'hydrogne molculaire selon l'quilibre rversible thorique : H2 2H+ + 2e selon le potentiel standard E' = 430 mV ( pH 7).
Les lectrons sont fournis ou capts par un donneur ou un accepteur selon le sens dans lequel fonctionne la raction. Dans la raction de gauche droite, l'hydrogne diatomique est scind sur un mtal de faon htrolytique en ion hydrure et proton (H2 H + H+). L'oxydation porte sur l'hydrure, qui met le deuxime proton et deux lectrons. En tant rversible, ce mcanisme provoque un change de deutrium entre H2 et D2 et entrane la formation de HD. L'oxydation de l'hydrogne s'effectue selon trois modes privilgis. Le premier utilise typiquement O2 comme accepteur par l'intermdiaire d'une chane respiratoire. De nombreuses espces bactriennes chimio-lithotrophes en tirent de l'nergie, et sont d'ailleurs souvent des autotrophes, c'est--dire utilisatrices de CO2 comme seule source de carbone. Le second mode est celui des bactries phototrophes anarobies utilisatrices de H2 comme source d'lectrons pour l'assimilation de CO2, la source d'nergie principale tant videmment la lumire. Enfin le troisime mode s'observe chez les bactries mthanognes qui peuvent employer H2 comme source d'lectrons dans la rduction de CO2 en mthane. La raction inverse aboutit la formation d'hydrogne. Elle s'observe dans diverses ractions de fermentation o H2 apparat comme produit conjointement d'autres entits qui sont des composs organiques et CO2. Comme nous l'avons constat, la production d'hydrogne correspond l'vacuation d'un excdent de pouvoir rducteur. C'est pourquoi elle peut s'observer galement chez les phototrophes, quand labondance d'nergie lumineuse engendre un excs de pouvoir rducteur par rapport aux cibles assimiler, comme CO2 ou N2. Il y a
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donc un vritable cycle de l'hydrogne dans la nature faisant alterner consommation et production. Ces deux volets mettent en lice des enzymes distinctes, qui sont presque toutes des protines fer-soufre. Celles qui consomment H2 sont des hydrognases [NiFe] renfermant du nickel, parmi lesquelles certaines ont aussi du slnium, les hydrognases [NiFeSe]. Les secondes produisent de l'hydrogne, n'ont ni slnium ni nickel, et sont les hydrognases [Fe]. Une revue rcente sur ce sujet a t publie par P.M. VIGNAIS et A. COLBEAU [1]. Les hydrognases sont donc des enzymes essentiellement procaryotiques. Elles n'appartiennent pas qu'aux bactries effectuant des fermentations car elles s'observent chez les phototrophes, les actognes, les rducteurs des composs soufrs, du nitrate et du fumarate, ainsi que chez les archaebactries mthanognes. De faon gnrale les hydrognases occupent une position centrale dans le mtabolisme anarobie, probablement depuis les temps les plus anciens de l'volution biologique. Malgr sa participation essentielle la chimie de l'environnement, l'hydrogne molculaire ne s'accumule jamais forte concentration. On peut y voir plusieurs explications. La premire est la proprit du gaz H2 de diffuser trs rapidement et de s'chapper dans l'atmosphre. Ensuite l'hydrogne est un excellent carburant pour les oxydations biologiques, et se voit trs avidement consomm au fur et mesure de sa production. Enfin l'hydrogne est lui-mme toxique ds que sa concentration s'lve, en abaissant exagrment le potentiel redox du milieu et en freinant les fermentations. La production biologique de H2 est nanmoins une perspective bien tentante pour l'obtention d'un carburant nrgtique propre, dont la combustion ne produit que de l'eau. Des recherches ont t entreprises dans ce sens depuis la crise ptrolire des annes 70. La difficult d'obtenir de l'hydrogne en grande quantit et bas prix l'aide de cultures biologiques est un obstacle important. Il n'a pas t renonc cet objectif pour autant. En particulier des micro-algues telles que les Chlamydomonas pourraient devenir des outils intressants pour cela [2]. Les hydrognases [NiFe] sont communment priplasmiques ou membranaires. Les premires analyses structurales [3] ont port sur les bactries appartenant au genre Desulfovibrio, o la rduction des ions sulfate peut s'effectuer partir de l'hydrogne comme source d'lectrons. La complexit de ces enzymes contraste avec la simplicit de la raction catalyse. On y rencontre deux sous-units ingales, L et S (de 60 et 28 kDa respectivement), plusieurs centres fer-soufre et des ligands inattendus [4] comme CO, et CN. Le nickel est li quatre rsidus de cystine par les atomes de soufre et fait partie avec le fer dun centre bi-mtallique. Une tude phylogntique dtaille sur la base des squences et des fonctions permis de distinguer au moins 4 groupes diffrents dans ces enzymes [5]. La figure montre larchitecture des deux parties de l'hydrognase de Desulfovibrio vulgaris. La petite sous-unit S contient trois centres fer-soufre (dont deux [4Fe-4S] de part et d'autre d'un [3Fe-4S]), formant comme un fil conducteur partir du domaine N-terminal jusqu'au site catalytique de la sous-unit partenaire. La structure de S ressemble celle d'une flavodoxine*, et l'on pense que les lectrons partent de ce ct sur un accepteur qui serait une ferrdoxine.
4 - HYDROGNE - ACTATE - MTHANE
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fer nickel
chane S
noyaux Fe/S
site catalytique
chane L domaine N-terminal
Hydrognase NiFe de Desulfovibrio vulgaris

Du volume important de travaux dj consacrs aux hydrognases [NiFe] par les mthodes gntiques, cintiques et physiques, le plus tonnant est sans doute la structure du site catalytique contenant du nickel et du fer. L'enzyme contient galement un ion magnsium dont la fonction est inconnue. La rupture de la molcule de H2 par oxydation se fait probablement au niveau du fer et des ligands trs spciaux qu'il porte figurs sur le dessin. La structure hypothtique est celle de l'enzyme oxyde, les mtaux tant ponts par le soufre appartenant deux rsidus de cystine. Des remaniements dans la coordination des deux mtaux et les ponts soufrs auraient lieu au cours de loxydorduction. Dans l'enzyme oxyde de D. gigas, un atome d'oxygne occuperait la position X entre le fer et le nickel.
O Fe S x S Ni S S C C C Cys Cys
O Cys
Cys
La grande sous-unit renferme un ion magnsium li spcifiquement la chane polypeptidique. Dans l'enzyme au repos, les deux mtaux sont l'tat Fe(II) et Ni(II) [6] et passent l'tat Fe(II) et Ni(III) au cours du cycle. En bref, l'hydrogne subirait une coupure htrolytique en H et H+ sur le fer. Celui-ci retiendrait l'hydrure (H) en laissant partir le proton capt par l'un des thiolates Cys-S qui entourent le nickel. Comme le cycle ractionnel nest pas encore totalement tabli, nous le laisserons de ct, mais il est certain que les deux mtaux collaborent pour oxyder l'hydrure en H+ + 2e. La structure dtaille de l'enzyme a montr la prsence d'un chemin pour l'arrive de H2, l'expulsion des deux protons successifs, la canalisation des lectrons vers la petite sous-unit. Les centres [4Fe-4S] fonctionnent bas potentiel (vers 350 mV), alors que le [3Fe-4S] qui les spare a un potentiel plus lev ( 35 mV). C'est une nigme de plus dans cette mcanique sophistique. Le
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noyau [3Fe-4S] n'existe pas dans toutes les hydrognases homologues, et certains auteurs pensent mme qu'il n'a aucune fonction essentielle. Une nouvelle hydrognase appartenant un type particulier (HupUV) [7] a t mise en vidence dans le cytoplasme de Rhodobacter capsulatus. Elle sert de systme de dtection et de rgulation command par l'hydrogne gazeux. noter que les enzymes [NiFe] appartiennent plusieurs classes et participent une varit de fonctions physiologiques. Certaines dshydrognases sont associes dautres protines lies la membrane pour former un complexe avec des dshydrognases liant NAD(P)+ ou du F420 (mthanognes, Section 5). Cest un sujet vaste et complexe qui soulve une grand intrt 1. Le slnium des hydrognases [NiFeSe] fait partie de la slnocystine*, une cystine dguise o le slnium remplace le soufre. La slnocystine prend la place d'un rsidu de cystine li au nickel, dont la ractivit se verrait renforce par le voisinage du slnium. Ces hydrognases qui ont une structure trs voisine de celle des [NiFe], sont rpandues chez les bactries sulfato-rductrices et les archaebactries. part la prsence de cette slnocystine, il y a quelques diffrences avec les [NiFe]. Le fer remplace le magnsium aperu dans la sous-unit L de l'enzyme prcdente, et le noyau [3Fe-4S] de la petite sous-unit est remplac par un [4Fe-4S]. La structure de l'hydrognase [Ni/Fe/Se] chez Desulfomicrobium baculatum a t dtermine [8]. La comparaison avec l'hydrognase nickel et fer mais sans slnium montre que l'organisation reste sensiblement la mme. On y retrouve des ligands exotiques comme CO et CN fermement lis au mtal et identifis par des mthodes chimiques et spectroscopiques [9]. Avec ou sans slnium, les deux dshydrognases appartiennent visiblement la mme famille structurale. Les hydrognases [Fe], dites fer seul, diffrent totalement des prcdentes, malgr des analogies qui rsultent d'une volution convergente. Ces enzymes ont t analyses plus tardivement, car elles sont plus sensibles O2 et moins commodes manipuler. Elles sont fortement inhibes par le monoxyde de carbone et le nitrite. Ces hydrognases sont plus souvent productrices d'hydrogne molculaire que consommatrices. Les mieux connues sont maintenant celles de Clostridium pasteurianum et de Desulfovibrio desulfuricans 2. Les hydrognases [Fe] sont trs performantes dans les conditions optimales, et peuvent produire de 6000 9000 molcules de H2 par seconde 30C. C'est pourtant une machinerie complique, dont on connat maintenant la structure chez Clostridium [10]. Son hydrognase est cytoplasmique, n'a qu'une seule chane de 438 rsidus et contient 5 groupes fer-soufre, soit un [2Fe-2S], trois [4Fe-4S] et un "centre H" plus complexe contenant deux atomes de fer portant chacun des ligands CO et CN. Ces deux Fe sont lis la protine par des rsidus de cystine, et lun deux est li par cystine un centre [4Fe-4S]. Le lobe N-terminal, gauche du dessin, est la partie qui reoit les lectrons ncessaires la production de H2. L'enzyme de Desulfovibrio est
1 - Sur le plan fondamental bien sr, mais aussi dans les perspectives appliques pour produire lhydrogne ! 2 - Ces bactries ont donc la fois des hydrognases qui consomment de l'hydrogne, et d'autres qui en produisent. La localisation de ces enzymes dans la cellule n'est pas la mme et elles participent un cycle interne de l'hydrogne.
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localise dans son priplasme. Le centre H qui sy trouve est un peu diffrent du prcdent et les groupes [2Fe-2S] et [4Fe-4S] voisins manquent. Par contre l'enzyme a une sous-unit supplmentaire qui serait ncessaire son exportation dans le priplasme.
[4Fe-4S] S Fe Fe S S S Fe CO S Cys centre H [4Fe-4S] [2Fe-2S] CN Fe CO S Fe S CO Fe
2H+
CN
Nterm. Cterm.
H2
Hydrognase [Fe] de Clostridium pasteurianum

Imiter les performances des hydrognases [Fe], tel est le challenge pour le futur, et donne lieu des recherches de modlisation [11]. En somme les bactries nous montrent la voie pour fabriquer peut-tre des quantits inpuisables du carburant hydrogne. Ce rve deviendra-t-il ralit ?
4.2 - LES HYDROGNASES SONT RGULES

Le mtabolisme de l'hydrogne fait le lien entre divers secteurs de l'conomie cellulaire en conditions anarobies ou micro-arobies lorsque le potentiel redox est suffisamment bas. Les hydrognases rpondent des problmes prcis et ne sont synthtises que lorsque les conditions garantissent leur utilit. Les microorganismes ont souvent plusieurs hydrognases appartenant diffrents types, chacune d'elles tant adapte une situation particulire. L'oxydation de H2 peut alimenter en lectrons l'assimilation de CO2 en autotrophie, la rduction de l'azote en ammoniac, la rduction du nitrate, du fumarate, ou une gamme assez tendue d'accepteurs susceptibles d'intervenir en anarobiose.
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L'assemblage des hydrognases est sous la dpendance de nombreux gnes qui commandent la synthse des sous-units, leur maturation et leur transport (notamment pour les enzymes priplasmiques), l'acquisition et le transport des mtaux ainsi que l'insertion des groupes annexes tels que CO et CN. Voici par exemple la rgion gnomique dont dpend l'hydrognase [NiFe] de Rhodobacter capsulatus par les gnes hup (pour hydrogen uptake) :
hup W X hypF T U V S hup L C hup D FG H J K hyp AB R systme deux composants hydrognase HupR hyp C D E
Les loci hup et hyp de R. capsulatus

Les deux sous-units de hydrognase proprement dite sont codes par hupS et hupL. Le gne hupC code pour un cytochrome b, un accepteur d'lectrons associ hydrognase. Les trois gnes sont transcrits d'une seule pice partir d'un promoteur (petite flche), de telle sorte que les polypeptides correspondants sont synthtiss de faon concerte. Tous les autres gnes concernent des oprations de service ou de contrle. Les gnes hypF, hypAB, hypCDE sont concerns par le transport et l'introduction dans l'enzyme du nickel et du fer associs leurs ligands CO et CN. La protine HypB lie ce mtal et fonctionne comme une GTPase, tandis que HypC interviendrait dans la maturation de la sous-unit catalytique HupL de l'enzyme. HypF est apparemment responsable de l'introduction des groupes CO et CN dans le site catalytique de hydrognase. L'exportation des deux sous-units de l'hydrognase aprs assemblage et maturation se fait l'aide du systme Tat rcemment dcouvert. Il fait partie des mcanismes de transport chargs d'insrer diverses protines dans la membrane ou de les amener dans le priplasme [12]. Ces indications sommaires sont donnes titre d'exemple, les solutions pouvant varier d'une espce l'autre, mais elles permettent de raliser combien la mise en place d'une hydrognase fonctionnelle ncessite un vritable arsenal de moyens molculaires ! Le plus intressant revient aux gnes hupR, hupTUV. Ils dterminent des facteurs rgulateurs. L'activit hydrognase de R. capsulatus est forte en prsence de H2, grce la transcription des gnes hupSLC. C'est l'inverse quand H2 disparat du milieu. Il y a donc un mcanisme de dtection relatif la prsence ou non de H2. Cette fonction appartient HupU et HupV. Les deux polypeptides forment un complexe qui ressemble hydrognase HupSL par sa structure et ses proprits. Cest une deuxime hydrognase [13]. Les mutants dpourvus de HupUV conservent une forte activit hydrognase, mme quand il n'y a plus d'hydrogne dans le milieu. Que fait cette hydrognase rgulatrice ? Elle sert de capteur, un peu la manire d'une lectrode hydrogne. En prsence de H2, elle subit un changement de conformation qui est peru et transmis vers HupR, la protine qui va dcider si les gnes hupSLC seront transcrits ou non. Ce systme est un cas de rgulation deux composants, dont le principe est trs rpandu chez les bactries. On y voit une kinase et un rgulateur. La kinase est une protine qui se phosphoryle
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elle-mme sur histidine la suite de la rception d'un signal. Elle rejette alors son phosphate sur la deuxime protine, le rgulateur, qui s'associe l'ADN au voisinage des gnes dont il rgule la transcription. Toutes ces paires de protines prsentent des domaines conservs reconnaissables par des homologies de squence et des ressemblances structurales. La rgulation deux composants se fait donc ici par HupT (la kinase) et HupR (le rgulateur) [14]. Un dessin nous aidera comprendre le mcanisme [15]. Le complexe HupUV reconnat donc l'hydrogne. Il interagit avec la kinase HupT et lempche de sautophosphoryler en prsence de H2. En A, il n'y a pas d'hydrogne. Le facteur HupT est alors libre de sautophosphoryler sur histidine. Il phosphoryle son tour HupR et bloque ainsi son action comme activateur. En B, lautophosphorylation de HupT est empche. Comme la protine HupR n'est pas modifie, elle active la transcription des gnes hupSLC de l'hydrognase [16]. Cette opration est rversible parce que HupR non phosphoryle est une phosphatase qui hydrolyse la liaison du phosphate sur HupT, et cette action antagoniste de la phosphorylation autorise un rglage fin entre les deux actions contraires. Le systme de rgulation deux composants HupT/HupR se comporte de manire exceptionnelle, car dans les rgulations de ce type, cest gnralement la forme phosphoryle du rgulateur qui active la transcription, alors quici HupR-P fait linverse.
ADP ATP P P R hupSLC ARNm
T a
H2
T
R
U T
V U
T b V U V U
R transcription hupSLC
Rgulation de hup SLC

Cette cascade d'effets est donc place sous la dpendance de l'hydrogne et participe au contrle du potentiel redox de la cellule. R. capsulatus est une espce photo-autotrophe capable d'assimiler le dioxyde de carbone, de rduire l'azote atmosphrique et de faire une respiration sur O2. Cette dernire met contribution lhydrognase HupSL pour lancer des lectrons dans la chane respiratoire, et fournir ainsi de lnergie plusieurs chanes mtaboliques grce larobiose. Dans le mme temps les diffrentes activits sensibles loxygne comme lassimilation de lazote et la photosynthse sont freines. Cette situation est renverse au cours de lanarobiose. D'o la ncessit d'un contrle gnral qui permet de coordonner tout cela. L'opron hupSLC est contrl par HupR, mais dpend aussi chez Rhodobacter dun second rgulateur d'action plus gnrale qui est ici la protine RegA. Celle-ci contrle non seulement hupSLC mais des gnes de la photosynthse, de lassimilation de CO2, de la respiration et de la nitrognase, une rgulation globale !
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Pour que l'action de l'ARN-polymrase puisse commencer transcrire en amont d'un groupe de gnes, il faut qu'elle reconnaisse la squence d'un promoteur par l'intermdiaire d'un facteur sigma* ou facteur d'amorage*. Dans bien des cas, elle a le feu vert pour dclencher seule le processus. Dans d'autres cas, il lui faut un rgulateur, soit pour activer la transcription, soit au contraire pour linterdire (contrle ngatif). RegA est un rgulateur ngatif pour hupSLC et pour son propre gne. Les diffrentes protines rgulatrices interagissent avec la polymrase et s'installent sur l'ADN en des zones spcifiques, le plus souvent sous forme de dimres. Le site dattachement de HupR sur lADN est relativement distant du promoteur, mais le schma explique comment les protines HupR et RegA peuvent se regrouper pour interagir avec lARN-polymrase :
ARN-pol RegA HupR ADN site HupR site IHF IHF sigma-70 IHF promoteur hupSLC RegA ARN-pol hupSLC HupR ADN
La solution est fonde sur la courbure de la double hlice d'ADN avec l'aide de IHF*, permettant HupR dentrer en contact avec la polymrase. Le site dattachement de RegA chevauche en partie le promoteur la faon dun rpresseur, mais dborde aussi sur le site de liaison de IHF. Or RegA est elle-mme soumise rgulation. Elle fait partie son tour d'un systme deux composants, RegB/RegA. Le composant RegB est une kinase membranaire, tandis que RegA est cytoplasmique. Daprs un schma publi par ELSEN et coll. [17], RegA phosphoryle active la synthse des photorcepteurs, des enzymes du cycle de CALVIN, de la nitrognase et des cytochromes respiratoires. Mais sa phosphorylation renforce son attachement lADN devant lopron hupSLC, dont elle entraverait lexpression. Il a t montr rcemment par SWEM et coll. que RegB est sensible des conditions oxydantes causes par O2, sautophosphoryle et cde son phosphate RegA. Ces auteurs ont propos un mcanisme pour expliquer la transduction du signal qui conserve encore des points obscurs [18]. Cette description succincte ne rend compte que de la situation chez Rhodobacter, qui est un phototrophe non oxygnique. Labsence de O2 rend moins utile lhydrognase HupSL mais stimule la machinerie assimilatrice de carbone et dazote. Des solutions diffrentes existent chez dautres espces. Chez certaines bactries, la synthse de l'hydrognase n'est pas rgule par H2 mais par O2, et ne se fait qu'en arobiose ou micro-anarobiose. Les protines sensibles O2 sont galement des rgulateurs globaux dont nous retrouverons ultrieurement plusieurs exemples. Le contrle des hydrognases fait partie des mesures physiologiques prises par les cellules quand elles passent de larobiose lanarobiose ou vice versa. Mais rappelons-nous que l'hydrogne a un rle cl dans l'environnement. La suite nous en persuadera aisment.
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4.3 - BACTRIES ACTOGNES

L'acide actique est une entit chimique particulirement rpandue dans l'environnement. Certains organismes en font un sous-produit de leur mtabolisme nergtique, d'autres l'utilisent comme substrat de croissance. En milieu priv d'oxygne, les bactries actognes font partie de la premire catgorie, les mthanognes de la seconde. Les actognes ont t dcrits pour la premire fois par WIERENGA en 1940 et les premires tudes ont t faites sur Clostridium thermoaceticum. L'acide actique est le rsultat de transformations qui ont pour but de fournir de l'nergie la cellule. Il fait le lien entre les produits d'hydrolyse et de fermentation ns des matires animales et vgtales d'une part, et la transformation ultime en mthane de l'autre. Les actognes s'accommodent frquemment de conditions trs frustes, mais ont l'intrt de raliser des biodgradations anarobies complmentaires de celles qui sont faites sous oxygne. En somme ils occupent une niche importante, voire essentielle, dans le cycle naturel des lments carbons. Les actognes sont presque tous strictement anarobies 3, typiquement prsents dans les vases des lacs, les boues d'puration, les rejets de distillerie et les effluents domestiques. On distingue les formes homo-actognes, qui ne font que de l'acide actique, par opposition aux htro-actognes, produisant en mme temps d'autres acides (butyrique, caproque et autres). Eubacterium limosum et Butyribacterium methylotrophicum en sont des exemples. Le caractre actogne n'appartient pas un groupe taxonomique particulier et se rattache aussi bien des espces Gram-positives sporulantes appartenant au genre Clostridium qu' des non sporulantes (Acetobacterium woodii). On rencontre des formes msophiles et des espces thermophiles comme Clostridium thermoaceticum, qui se dveloppe 55-60C. Certains actognes Gram-ngatifs sont en mme temps des sulfatorducteurs (Desulfovibrio barsii). Les actognes stricts vivent en autotrophie sur CO2 + H2 et font de l'acide actique avec ces seules ressources. L'emploi du dioxyde de carbone des fins nergtiques est une dissimilation, par opposition l'assimilation o le CO2 est pris comme source de carbone pour les synthses organiques. D'autres espces sont htrotrophes et font leur acide actique sur un substrat organique. Les mixotrophes utilisent les deux modes. C'est le cas de C. thermoaceticum : 2 CO2 + 4 H2 NADH CH3COO + H+ + 2 H2O NADH C6H12O6 (glucose) 3 CH3COO + 3 H+ (G' = 310 kJ mole1) (G' = 95 kJ mole1)
Ces deux voies sont productrices d'nergie, la premire tant beaucoup plus efficace que la seconde. On voit aisment que la croissance sur glucose, nergie gale, produit environ 10 fois plus d'acide actique que la croissance autotrophe symbolise par la premire ligne. L'acide actique est donc rejet en abondance pour un rendement nergtique assez mdiocre comme dans une fermentation
3 - Ces bactries n'ont donc rien voir avec Acetobacter et les germes qui contribuent transformer le vin en vinaigre, une oxydation arobie de l'thanol en acide actique.
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ordinaire. Une petite partie est nanmoins rutilise comme source de carbone sans laquelle la cellule ne pourrait effectuer ses synthses. Au cours de la croissance autotrophe, l'assimilation de CO2 conduit par consquent des synthses organiques ne passant pas par le mcanisme habituel du cycle de CALVIN utilis par les plantes vertes et maints organismes autotrophes. C'est l que se manifeste le caractre le plus extraordinaire du mtabolisme nergtique des actognes. Il est symbolis par ce petit diagramme indiquant les transformations du glucose.
glucose 4 H+ + 4 e 2 CH3CO-COOH 4 H+ + 4 e 2 CO2 2 CH3COOH actyl-CoA CH3COOH actyl-CoA cette branche revient former l'acide actique avec 2 CO2 + 4 H2
CO2 du milieu
Actognse sur glucose

Parmi les 3 molcules d'acide actique formes partir du glucose, 2 sont issues de l'acide pyruvique grce une voie qui n'est autre que la glycolyse bien connue (symbolise par le rectangle gauche). Elle produit deux fois 4 lectrons, soit 8 au total, et la dcarboxylation des 2 molcules d'acide pyruvique libre 2 CO2. La troisime molcule d'acide actique correspond la soudure des 2 CO2 par la raction : 2 CO2 + 8 e + 8 H+ CH3COOH + 2 H2O. L'acide actique est indiqu ici par souci de simplification, mais le vritable produit est l'actyl-coenzyme A, dont l'hydrolyse en actate et coenzyme A libre sera couple la formation d'une molcule d'ATP. Cette voie particulire s'appelle la voie de WOOD-LJUNGDAHL (voie WL). Elle permet aux bactries de cette classe de se dvelopper sur CO2 ou CO comme seule source de carbone. Les dtails de cette voie ont t rcolts depuis 1962 et ont donn lieu un volumineux travail d'analyse [19]. La voie WL n'est pas rserve l'actognse, car elle existe aussi chez les mthanognes. Elle fonctionne avec l'intervention d'une enzyme exceptionnelle dans la nature, appele alternativement CO dshydrognase ou actyl-coenzyme A synthase que nous retrouverons plus loin (page 211). Le glucose n'est pas ncessairement la source organique et certaines espces utilisent le mthanol, le formiate et mme le monoxyde de carbone. Par exemple Eubacterium limosum utilise le mthanol la fois pour faire son acide actique (dissimilation) et comme source de carbone (assimilation). C'est donc un mthylotrophe. L'hydrogne est une excellente source d'lectrons pour commuer le gaz carbonique en acide actique grce son bas potentiel standard ( 430 mV pH 7), mais n'est pas le donneur obligatoire de l'actognse sur CO2. D'autres sources d'lectrons sont employes pourvu que leur potentiel soit suffisamment bas. En outre presque tous les homoactognes transforment en acide actique
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des hexoses, des pentoses, des polyols, des acides uroniques, des acides amins, divers mtabolites comme le malate et le lactate. Les actognes occupent donc un crneau important dans les transformations de l'environnement. Ils s'emparent des produits dj dgrads par les hydrolyses et oxydations faites en amont partir des matires organiques animales ou vgtales et transforment tout cela en acide actique. Celui-ci sera repris son tour par les mthanognes pour faire du mthane. Le monoxyde de carbone rendu clbre par sa toxicit pour les humains est un produit biologique. Le degr d'oxydation du carbone y est quivalent celui de l'acide formique. Il y a deux faons d'utiliser le CO dans la nature. La premire est une oxydation arobie en dioxyde de carbone par les bactries dites carboxydotrophes. Elle est parallle la transformation du formiate en CO2 par la formiate dshydrognase. La seconde mthode est celle des actognes et se fait en anarobiose, par la raction globale : 4 CO + 2 H2O CH3COOH + 2 CO2 Ainsi Peptostreptococcus productus est capable de crotre sur monoxyde de carbone comme seule source de carbone et d'nergie [20]. Deux molcules de CO parmi les quatre sont oxydes en 2 CO2. Les 4 lectrons fournis servent rduire un troisime CO en radical mthyle, qui sera soud au quatrime pour donner l'acide actique (actyl-CoA). Ces bactries sont ubiquistes dans les milieux non marins privs d'oxyne. Leur isolement exige un milieu rendu suffisamment rducteur l'aide de citrate de titane(III). On a eu la surprise de constater que les actognes n'taient pas strictement anarobies car ils pouvaient tre isols d'environnements privs incompltement d'O2, soit dans des sols bien drains ou dans le tube digestif de certains insectes. Leur tolrance l'oxygne peut s'lever des concentrations atteignant 5% de celle de l'air ambiant. L'oxygne faible concentration provoque un retard de multiplication mais n'empche pas toute synthse d'actate. Il y a mieux. Certains actognes colonisent les racines de plantes marines, avec lesquelles ils contractent une association physiologique [21]. Or les racines mettent de l'oxygne, et les bactries y sont donc priodiquement exposes. Clostridium glycolicum est adapt cette situation et dvie son mtabolisme en fonction de la prsence d'O2. Ces germes ont les moyens de rsister ou de se dbarrasser de l'oxygne. Dpourvus de catalase et de superoxyde dismutase, ils ont une NADH oxydase et une peroxydase trs actives qui expliqueraient cette rsistance [22]. Les sdiments marins profonds hbergent une prolifration d'actognes. Des expriences de laboratoire suggrent que la chaleur gothermique grande profondeur dans les sdiments stimule l'actogense [23]. Les acides gras courte chane sont des intermdiaires de la dgradation de la matire organique qui aboutit l'actate, et ce dernier est consomm en partie par les mthanognes. Les actognes, comme les mthanognes que nous examinerons plus loin, font l'actyl-coenzyme A par un procd qui ne ressemble en rien ce que font la plupart des organismes. Le principe de base est fond sur l'tablissement d'une liaison carbone-carbone partir de deux molcules de CO2. L'une de ces molcules est rduite trois fois de suite jusqu'au stade mthyle (X tant un accepteur).
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La seconde n'est rduite qu'une seule fois en CO. La CO dshydrognase (CODH) est l'enzyme cl : elle rduit CO2 en monoxyde de carbone, et fait la soudure pour aboutir l'actyl-CoA selon les deux tapes indiques en trait paissi. C'est donc aussi une actyl-CoA synthase 4.
HS-CoA ATP CO2 CO2 2e 2e 2e 2e CH3-X [CO] CODH CODH synthses cellulaires CH3COSCoA actate
Les rductions successives du dioxyde de carbone sont indpendantes de la CODH et mettent en uvre un cofacteur trs important, l'acide ttrahydrofolique ou FH4, connu en biochimie classique comme transporteur d'units mono-carbones aux trois niveaux d'oxydation : formiate, formaldhyde, mthanol. Le passage d'un niveau l'autre s'effectue sur le cofacteur*.
2 CH3COCOOH HSCoA HSCoA 1 [2H] 8 2 e+2 H+ 9 H2 H FH4 FH4 CHO FH4 4 H2O CH FH4 [2H] 5 CH2 FH4 [2H] 6 CH3 FH4 H CH3COOH CO H 7 [CO] CH3CoIII corrinode CoI 1 CH3CO glucose HSCoA synthses carbones
SCoA CO2
CH3CO SCoA 8
CH3COOH~SCoA HO P 10 HSCoA
[2H]
ATP ADP + Pi
HCOOH 3
CH3CO~ P ADP ATP
N Terminologie 1 2 3 4 5 Pyruvate-ferrdoxine oxydorductase Formiate dshydrognase 10-Formyl-FH4 synthtase 5,10-Mthnyl-FH4 cyclohydrolase 5,10-Mthnyl-FH4 dshydrognase
N 6 7 8 9 10
Terminologie 5,10-Mthylne-FH4 rductase Mthyl-transfrase (CFeSP) Monoxyde de carbone dshydrognase (CODH) Hydrognase Actyl transfrase
Voie de WOOD
4 - Le symbole [CO] signifie que le monoxyde de carbone form reste associ l'enzyme.
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Pour simplifier, les diffrentes tapes n'ont t figures que dans un seul sens, bien qu'elles soient rversibles. Voici quelques indications sur les tapes numrotes : 1 - Le pyruvate provient du glucose par la voie glycolytique dite EMP. Sa dcarboxylation du pyruvate avec oxydation donne CO2 ou CO, et produit de l'actyl-coenzyme A. Dans le mtabolisme arobie classique, la dcarboxylation avec oxydation du pyruvate utilise comme accepteur de la paire d'lectrons une flavine (FAD). Chez les anarobies vivant bas potentiel redox comme les actognes, la dcarboxylase est une enzyme fer-soufre et l'accepteur est une ferrdoxine, qui dcharge les lectrons sur une hydrognase formant H2. La raction est exceptionnelle ici parce que l'enzyme peut librer elle-mme de l'hydrogne et fonctionner directement comme hydrognase sans suivre la procdure habituelle [24]. La voie figure en pointill est hypothtique. Une autre particularit est le fonctionnement rversible en pyruvate oxydorductase, pouvant oxyder H2 en protons et faire du pyruvate. La dcarboxylase est donc une pyruvate synthase, que Clostridium thermoaceticum utilise pour crotre sur CO2 ou CO [25]. Les bactries peuvent donc assimiler CO2 simultanment par deux voies, selon que l'enzyme utilise est une pyruvate synthase ou une CO dshydrognase. 2, 3 - Les formiate dshydrognases* sont des enzymes rpandues dans le monde bactrien. Elles fonctionnent ici dans le sens de la rduction de CO2 en formiate par NADPH. Le partenaire accepteur ou donneur d'lectrons est diffrent selon les cas. C. thermoaceticum. Les formiate dshydrognases sont typiquement des enzymes noyau fer-soufre et slnium. La soudure de l'lment mono-carbon sur le ttrahydrofolate (FH4) comme accepteur s'effectue sans oxydorduction mais avec un apport d'nergie ATP. La liaison est haut potentiel et facilite le transfert de l'lment mono-carbon sur d'autres accepteurs. 4, 5, 6 - La dshydratation et les deux rductions successives procdent d'un mtabolisme classique en biochimie. Le mthylne-FH4, qui est au niveau d'oxydation du formaldhyde, est un intermdiaire essentiel du mtabolisme, car il correspond une entre majeure des units mono-carbones dans les synthses cellulaires. 7 - Le groupe mthyle est transfr sur une protine porteuse d'un cofacteur corrinode ou CFeSP (corrinoid-iron-sulfur protein). On l'a appel parfois protine B12. Les corrinodes*, dont il existe une multiplicit (notamment chez les mthanognes), sont des outils biologiques tout fait remarquables, car ils tablissent une liaison directe entre un lment carbon et un mtal, qui est le cobalt. Des indications sommaires sont donnes en glossaire. Le mtal occupe trois niveaux d'oxydation : Co1+, Co2+ et Co3 + ou Co(I), Co(II) et Co(III). La mthylation du cobalt n'est possible qu'au niveau Co1+. Son oxydation au niveau Co3+ fragilise la liaison et facilite le transfert sur un accepteur. Il y a donc sur le cobalt un cycle d'oxydorduction interne avec canalisation des lectrons par noyau fer-soufre [26]. Le groupe mthyle est transmis du FH4 (en haut) la CODH ou actyl-CoA synthase (en bas), par le corrinode de la mthyl-transfrase (cadre central). Au cours du premier transfert, le cobalt passe de l'tat I l'tat III, puis revient de III I au cours du deuxime transfert.
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Une oxydation spontane de Co(I) Co(II) conduit l'inactivation du systme, mais le retour l'tat Co(I) actif est possible in vivo l'aide d'une ferrdoxine rduite, ou in vitro par des agents rducteurs puissants, car le potentiel redox du couple Co(II)/Co(I) est trs bas, soit E' = 502 mV. On a dcouvert que le site accepteur de mthyle sur la CODH contient du nickel.
CH3 H FH4 5-mthyl-FH4 CH3 CoI CoII inactif CH3 CoIII H FH4 H
Ni
Ni CODH
CODH CO HSCoA
CH3CO-SCoA
Selon cette interprtation [27], le passage Co(I)-Co(II) ne fait pas partie du cycle catalytique de l'enzyme. Le mcanisme de la transfrase ne comporterait que l'alternance entre les tats Co(I) et Co(III), en mettant contribution un noyau fer-soufre du type [4Fe-4S] servant alternativement de donneur et d'accepteur interne, en mme temps qu'un autre site non identifi. La structure de la mthyl-transfrase comporte deux sous-units de 33 et 55 kDa. La premire contient la cobalamine et lie le mthyl-FH4, tandis que la seconde renferme le noyau fer-soufre. La structure dtaille de la premire partie chez C. thermoaceticum a t dtermine 2,2 de rsolution [28] et montre une structure en tonneau o s'insrent cte cte FH4 et cobamide. Cette mthyl-transfrase joue avec une liaison directe entre un mtal et un atome de carbone, un processus trs rare en biologie. Le procd utilis par la protine s'interprte comme un renforcement de la ractivit du mthyle port par le FH4 quand celui-ci vient se fixer. Voici un petit schma hypothtique [29]. La protonation du donneur dclenche une raction de substitution avec changement de conformation de l'enzyme et concession d'un lectron par le noyau [4Fe-4S]. En mme temps le mthyle prend un caractre lectrophile et attaque le mtal comme le ferait un carbocation.
H+ FH4 H C H H CoI FH4 H H H H C CoIII
[4Fe-4S] ++ [4Fe-4S] +
Attaque lectrophile sur le cobalt
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Imaginons que cette opration soit entirement rversible. En remplaant le FH4 par un accepteur qui ne sera autre que la CODH, le mthyle quitterait un mtal pour aller vers un autre mtal qui serait le nickel, tandis que le noyau [4Fe-4S] restituerait l'lectron qu'il a reu. 8, 9 - L'tape fondamentale de la voie de WOOD-LJUNGDAHL consiste assembler le mthyle, le monoxyde de carbone et le coenzyme A (HSCoA). Quand CO2 remplace CO, une rduction fait intervenir l'hydrogne comme le donneur initial d'une paire d'lectrons, achemins par hydrognase et ferrdoxine. L'enzyme qui fait l'assemblage gnral est comme on le sait la fois une CO dshydrognase et une actyl-CoA synthase que nous continuerons dsigner en abrg CODH. Cette enzyme extraordinaire n'a pas d'autre quivalent dans le monde vivant et se retrouvera aussi comme pice matresse des mthanognes. L'tape 9, qui est la raction d'une hydrognase, serait catalyse par la CODH elle-mme 5. En somme l'enzyme serait capable de se passer d'une hydrognase spare et d'utiliser elle-mme H2, ce qui lui ferait catalyser trois ractions rversibles : l'oxydorduction CO2/CO, l'oxydorduction 2H+/H2, la synthse ou la rupture de l'actyl-CoA ! La consquence est un pouvoir d'adaptation remarquable. Clostridium thermoaceticum peut se dvelopper sur monoxyde de carbone, faire son CO2 et de l'hydrogne, fabriquer de l'actyl-CoA pour son mtabolisme et faire aussi du pyruvate ! La CODH a des caractres similaires chez les actognes et les mthanognes. Chez C. thermoaceticum, la CODH est un ttramre de structure 22. Il y a trois noyaux contenant du fer et du soufre, appels A, B et C. L'enzyme est code par un opron contenant les gnes acsA et acsB (les sous-units et ), acsC, acsD (la protine corrinode) et acsE (la mthyl-transfrase). Voici les caractres des sous-units de la CODH : Sous-unit - 81 kDa. Un noyau [4Fe-4S] ou centre A, associ du nickel et du cuivre. C'est l que se fait l'assemblage de l'actyl-CoA, le CO tant port par du cuivre et le mthyle accept par le nickel. Sous-unit - 72 kDa. Il y a deux noyaux fer-soufre, les centres B et C. Cette partie est consacre l'oxydorduction CO2/CO qui a lieu sur le site C, un [4Fe-4S] modifi de structure encore incertaine et li du nickel fermement li. Un [4Fe-4S] canalise les lectrons changs par B. Trs schmatiquement : la partie est l'actyl-CoA synthase, par l'apport de CO (provenant des sous-units ) et de groupes mthyle (provenant de la transmthylase cobalt). La partie est la CO dshydrognase proprement dite. C'est sans doute elle qui fonctionne aussi comme hydrognase. Elle figure seule dans la CO dshydrognase de certaines espces bactriennes, qui ne font pas l'actyl-CoA comme le phototrophe Rhodospirillum rubrum [30]. L'hypothse du groupe de RAGSDALE est fonde sur l'emploi des spectromtries RPE et RAMAN, ainsi que des isotopes du fer, du nickel et du carbone (54Fe, 64Ni, 13 C) [31]. Le dplacement des raies de rsonance des liaisons carbone-mtal permet de se faire une ide de l'entit qui reoit CO ou CO2. La rduction du CO2
5 - Montr par MENON et RAGSDALE (1996) cits plus haut, comme pour la pyruvate oxydorductase.
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s'effectue sur la partie de la CODH. Le CO form comme intermdiaire dans la synthse de l'actyl-CoA gagnerait alors un noyau fer-soufre-nickel. Celui-ci se trouve sur un site appel A dans la partie . Le passage se ferait par un "tunnel", une voie de communication interne entre les deux sous-units, empchant tout change avec l'extrieur. D'aprs un article rcent de SERAVALLI [32] , l'accepteur de CO sur le site A serait le cuivre, tandis que le groupe mthyle achemin par la transfrase serait dpos sur le nickel dans une tape considre comme limitante [33]. Le schma suivant est une interprtation encore provisoire montrant la synergie entre une partie synthtase () et une partie CO dshydrognase (). Le coenzyme A serait stock sur un site voisin du noyau fer-soufre-nickel.
Co(I)CH3 CO Cu CH3 CH3 CO Ni Cu CO Ni Cu
Ni
Cu
CO2
Ni
Cu
CO
Ni
Ni CO2
Cu
HSCoA CH3Co-SCoA
Synthse de l'actyl-CoA
Une structure dtaille de la CODH a t rcemment publie par DARNAULT et collaborateurs [34]. Le mcanisme ractionnel a t propos par SERAVALLI et le groupe de RAGSDALE. Il est montr ici titre indicatif car le rle du cuivre reste controvers.
O S [4Fe-4S] S [4Fe-4S]
+ +
C Cu+ Cys S S Cys Ni+
CFeSP CH3Co(III) N N
CO Cu
+
Cys S S Cys Ni+ N N
O S [4Fe-4S]
2+
CFeSP Co(I) Cys S
O CH3CSCoA CH3 C Cu+ Cys S S Cys Ni2+ N N H+ CoA-SH SCoA S [4Fe-4S]2+
C Cu+ CH3 Ni2+ N N
O S [4Fe-4S]2+
S Cys O C Cu+ CH3 Cys S S Cys Ni2+ N N
Synthse de l'actyl Co-A
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Dans la structure cristallographique publie par DARGAULT et collaborateurs, deux compositions diffrentes des sites actifs ont t identifies : zinc-nickel-fer pour une des sous-units en conformation ferme, et nickel-nickel-fer pour l'autre sousunit en conformation ouverte. Ces auteurs pensent que l'htrognit vient des conditions exprimentales. Les mtaux cits sont exposs au solvant et sont probablement facilement changeables. Il est possible que la paire Ni-Ni soit le ple essentiel, l'un des nickel tant plus labile et remplac par du cuivre et mme du zinc. Tous les rsultats exprimentaux convergent vers le caractre indispensable du nickel, alors que le rle du cuivre reste problmatique. Il a t possible rcemment de faire exprimer par Escherichia coli la CODH complte de C. thermoaceticum . Ces bactries se sont montres assez complaisantes pour faire une CODH active aprs insertion du nickel [35]. 10 - La dernire tape est classique chez les bactries de la fermentation. L'actyl-phosphate a un potentiel nergtique comparable celui de l'actyl-CoA. Il y a formation d'ATP. Le principe de la voie de WOOD-LJUNGDAHL, dcrite ici chez les actognes, est adopt aussi par les mthanognes, mais nous trouverons d'importantes diffrences au niveau des cofacteurs et une physiologie particulire.
4.4 - LA GENSE DU MTHANE

Nous savons qu'il existe un cycle du mthane dans l'environnement. Il est temps maintenant de prciser comment se forme le mthane dont nous savons qu'il peut tre un maillon important des biotransformations. Le mthane d'origine biologique prsente un dficit caractristique en carbone-13. La mesure du rapport 13C/12C dans le gaz naturel, qui est riche en mthane, a permis de montrer quil est en grande partie d'origine biologique fossile. La mthanisation peut-elle intervenir dans le nettoyage de notre environnement ? La rponse est affirmative pour deux raisons. La premire se rapporte l'activit rductrice des mthanognes eux-mmes. Divers substrats peuvent y tre rduits au mme titre que le CO2. C'est pourquoi la mthanognse peut s'accompagner de la transformation d'une varit de substances. La deuxime raison dcoule de l'association des mthanognes dans les populations mixtes qu'ils contribuent stabiliser. En effet ils dbarrassent leurs partenaires de certains produits ns de leur activit, comme le gaz carbonique, l'hydrogne, les acides formique et actique. Sans la mthanognse, l'accumulation de ces produits entraverait rapidement le dveloppement de la microflore. Les mthanognes sont en somme les boueurs de ces populations anarobies. Le mthane en est le principal dchet non rutilisable sur place, car son mtabolisme ncessite de l'oxygne. La mthanisation enlve les dchets. Une biodgradation totale ou partielle de polluants organo-halogns, par exemple, peut s'tablir ainsi en anarobiose au sein de ces associations. Elle limine alors l'halogne sous forme d'anions inoffensifs (chlorure, bromure ou iodure) tout en librant des molcules carbones plus facilement mtabolisables. Les mthanognes sont abondants dans tous les sdiments anoxiques, fonds de lacs, mangroves, marcages, fonds marins.
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La mthanognse n'existe que chez les archaebactries et correspond un processus gnrateur d'nergie qui s'empare des produits abondants engendrs par d'autres organismes. L'acide actique des fermentations ou des actognes est l'un d'eux. La mthanognse dite actoclastique utilise l'acide actique selon un bilan trs simple : CH3COOH CH4 + CO2 Il correspond une part importante du mthane produit dans la nature en recyclant cet acide actique qui sans cela s'accumulerait en abondance en milieu anarobie. Un autre mode de synthse du mthane est la rduction du gaz carbonique par l'hydrogne : CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O De faon gnrale la production de CH4 est ralise dans un milieu trs rducteur o les mthanognes sont associs la plupart du temps d'autres micro-organismes au sein de populations mixtes souvent complexes. La mthanognse est le premier volet du cycle du mthane qui sera complt par les oxydations en dioxyde de carbone pratiques par les organismes arobies mthanotrophes. Une partie du CH4 chappe cette destruction en diffusant dans l'atmosphre. Cette "vaporation" est facilite par les plantes. On estime par exemple que les plants de riz canalisent plus de 90 pour cent du mthane produit leur pied, le reste tant en partie mis par la monte du gaz la surface de la rizire 6. Le mthane du sol est en partie capt par les racines avant d'tre vhicul vers le feuillage, qui en assure la dissmination dans l'air ambiant. On a dcouvert que le fond des mers recle des quantits normes de mthane sous forme dhydrate. Il se prsente sous forme dune glace gristre, instable et inflammable. Chimiquement, cest un clathrate o les molcules de mthane sont entoures dune cage rigide de molcules deau associes par des ponts hydrogne. La quantit de mthane ainsi immobilise dpend de la gomtrie du clathrate. Le rapport moyen CH4/H2O est 5,75. La fusion de lhydrate libre 164 fois son volume de mthane gazeux. O trouve-t-on cet hydrate ? Les conditions typiques ncessaires existent en bordure du plateau continental en eau trs froide (0C) et sous forte pression (plus de 3 MPa, soit 200-450 m de profondeur). Lhydrate est instable moins de 190 m, mais il se concentre sous la surface des sdiments jusqu une paisseur de 1000 m au moins. Sa prsence se traduit par un cho particulier au cours des prospections sismiques. On en a trouv un peu partout dans le monde 7. Le mthane est un gaz mobile, qui peut voyager dans les sdiments, diffuser dans des roches poreuses, rester bloqu par des couches sdimentaires impermables. La formation de l'hydrate est donc probablement ralise en conditions physiques favorables quand les teneurs en mthane et en eau sont suffisantes. Lhydrate de 6 - Des gaz autres que le mthane tels que le phosphure d'hydrogne sont spontanment inflammables, et engendrent les fameux feux follets. 7 - Peu le long de nos ctes mais surtout en zones arctiques et antarctiques, le long des ctes amricaines, au large du Japon, dans les zones continentales o il y a un permafrost (Sibrie). Ailleurs en Caspienne, Mer Noire, Golfe du Mexique, au large du Prou.
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mthane a t regard longtemps comme une curiosit, un phnomne parasite qui pouvait bloquer les gasoducs dans les rgions froides. La situation sest inverse. On le voit comme une source dnergie potentielle, particulirement au Japon o sont menes des recherches trs actives. Selon les estimations les plus pessimistes, le mthane mondial immobilis sous cette forme reprsenterait plus de mille milliards de tonnes. Encore faudrait-il pouvoir l'exploiter. Lhydrate de mthane, en se dcomposant brusquement, peut faire natre un grand volume de gaz et provoquer des accidents au moment des forages. Pour l'tudier, il a donc fallu le remonter avec prcaution sous pressurisation. Dautre part on craint que toute cause comme le rchauffement climatique puisse faciliter le dpart de ce mthane vers latmosphre et renforcer leffet de serre. Il y aurait alors un phnomne d'amplification, renforcement de l'effet de serre, rchauffement, libration de davantage de mthane, et ainsi de suite. Do vient tout ce mthane ? Il a t tent de rpondre cette question par des mesures isotopiques en IRMS*. L'tude d'un hydrate provenant de la cte nord de l'Alaska donne une rponse mitige. La mthanognse biologique serait responsable de 30 40% du gaz tudi, le reste tant considr comme d'origine thermogne, provenant des couches profondes de l'corce et accompagn de petites quantits d'thane et de propane. Le problme rejoint celui de l'origine du ptrole, dont le mthane est finalement le composant le plus simple. Deux thses s'affrontent. Soit les hydrocarbures sont considrs comme d'origine essentiellement tellurique, soit ils sont au contraire d'origine biologique. Les tenants de l'origine tellurique des hydrocarbures, comme Thomas GOLD [36], font remarquer que le carbone est le quatrime lment en abondance dans l'univers (aprs H, He et O), et que le mthane est abondant dans le systme solaire. L'appauvrissement du mthane en carbone-13 ne serait pas caus ncessairement par un effet biologique, mais par un fractionnement physique au cours de la migration du gaz. Pour les tenants de l'origine biologique au contraire, les tres vivants seraient la source principale. La question est encore loin d'tre tranche, mais une double origine pour le mthane et les hydrocarbures reste tout fait possible. Peut-on valuer l'importance des rejets par les bactries mthanognes ? Les estimations ne sont forcment que des ordres de grandeur. Les mesures faites en des endroits diffrents donnent souvent des rsultats contradictoires. La quantit totale de CH4 libr dans la biosphre dpasserait 550 millions de tonnes par an. Le mthane produit sans intervention humaine n'en reprsenterait qu'un tiers. Il s'agit du gaz des marais et des sols (50 150 millions de tonnes), des manations de gaz naturel et du mthane produit par les bactries intestinales de nombreuses espces animales : termites, coloptres varis et autres arthropodes, ainsi que des mammifres ruminants sauvages. Pour certains auteurs, les missions totales de mthane partir des insectes des pays chauds comme les termites apporteraient une contribution non ngligeable au mthane atmosphrique [37]. La part prpondrante depuis plusieurs dcennies serait anthropognique : industrie minire (charbon, ptrole, fuites des installations de gaz naturel), culture du riz, pandage de dchets, levage intensif des ruminants. Le tout pour au moins 200 350 millions de tonnes par an dont la plus grande part revient l'hmisphre nord. La seule culture du riz qui ne cesse de se dvelopper contribuerait pour plus de
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60 millions de tonnes par an. Si on admet que la plante comptera plus de 8 milliards d'tres humains en 2020, la production de riz devrait augmenter de 50 70%. Or le riz est la base de l'alimentation de plus de la moiti des habitants de la terre. En 1995, sa production tait dj suprieure celle du bl, raison de 550 millions de tonnes de riz non dcortiqu (ou paddy). Grce l'emploi de varits nouvelles, le rendement peut atteindre 150 quintaux l'hectare (davantage que pour le bl), et les efforts actuels tendent l'amliorer fortement. Malgr la slection de nouvelles varits, la culture du riz reste dpendante de ressources considrables en eau et cre des conditions trs favorables la mthanisation. Pourquoi ? Sans doute parce que les rizires comme tous les terrains inonds, au moins temporairement, sont riches en matires organiques et rapidement appauvris en oxygne. Les fermentations et la production de CO2, d'hydrogne et d'acide actique sont favorables la production du mthane. Les racines des plantes scrtent pourtant un peu d'oxygne utile aux organismes de la rhizosphre, et il ne devrait pas y avoir de mthanognse leur contact. Ce n'est pas le cas. Des auteurs ont montr que les racines du riz sont truffes de mthanognes, dont la survie semble pouvoir s'accommoder d'une exposition temporaire O2. La biologie des mthanognes dans les terrains anoxiques inonds met en vidence des espces nouvelles et une complexit imprvue [38]. La dtection des mthanognes dans un biotope donn, outre les mthodes d'isolement classique, fait appel la mise en vidence chromatographique des lipides di-thers caractristiques des archaebactries et la recherche d'ARN ribosomique spcifique. Une autre source de mthane est directement lie la population humaine, car elle correspond la dgradation des dchets industriels ou urbains dans les dcharges et terrains d'pandage. La lgislation franaise a prvu d'interdire toutes les dcharges depuis 2002 (avec des entorses ici et l !). L'idal est videmment d'obtenir l'limination des dchets en rcuprant le mthane produit, celui-ci tant brl ensuite comme source d'nergie. Cette opration est conduite ici ou l dans des usines spcialises ou dans des installations domestiques petite chelle (Biogaz). Malheureusement la mthanisation des dchets est souvent lente et ncessite sur le plan industriel des investissements trs importants, qui sont en concurrence avec les sources de gaz naturel. Plus de 50 millions de tonnes de CH4 par an seraient mis dans l'atmosphre partir de nos dchets, assez pour qu'on s'en proccupe ! Les ocans sont galement le sige d'une mthanognse, et un quilibre s'tablit entre le mthane dissous et celui de l'atmosphre. Certaines mers sont plus riches en mthane que d'autres. C'est le cas notamment de la Mer Noire. Elle contiendrait elle seule 96 millions de tonnes de CH4, lequel se concentrerait plus de 100 m de profondeur, o sa teneur atteindrait 11 mM. La Mer Noire est une mer quasi ferme dont le taux de pollution par les nombreux pays riverains devient particulirement alarmant. Le dveloppement excessif des strates profondes prives d'oxygne retarde la dpollution et provoque une disparition massive d'une partie de la faune aquatique [39]. Dans les lacs et tangs, la mthanognse est souvent trs active certaines priodes de l'anne, parce que les eaux de surface, rchauffes par le soleil et oxygnes au contact de l'atmosphre, forment une
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zone isolante au-dessus des eaux profondes plus froides et donc plus denses, spares par la zone de transition appele thermocline. Celle-ci peut se former 10-20 m de profondeur dans les lacs en t. Les eaux profondes perdent alors plus rapidement leur oxygne, reoivent des matires organiques coulant partir de la surface, et deviennent propices la formation et au stockage du mthane. La stratification des eaux favorise donc la cration de rservoirs anoxiques de gaz dissous. La production de mthane atteint son plus haut degr de sophistication dans le rumen, milieu complexe tabli dans la panse des ruminants (bovins, moutons, chvres, chameaux, girafes, cervids) avant que les vgtaux brouts et mastiqus parviennent l'estomac proprement dit. Le rumen est une formidable usine transformer la matire vgtale, o se dveloppent dans une ambiance anarobie et sous brassage temprature constante une grande quantit de micro-organismes varis. Les ruminants produisent une masse importante de salive (plus de 100 L par jour pour une vache adulte ), qui apporte de l'eau et du bicarbonate. Elle aide maintenir le pH du rumen. L'hydrolyse bactrienne de la cellulose libre du cellobiose et du glucose, d'excellents substrats soumis d'intenses fermentations productrices d'acides organiques, actique, butyrique et propionique, ou encore des acides gras. Ces acides fournissent de 40 70% des ressources nergtiques de l'animal. L'acide propionique est l'un des facteurs importants. Une microflore complexe comprend des eubactries, des protozoaires et des champignons. Les mthanognes tels que les Methanosarcina transforment en mthane divers composs issus de l'activit des autres espces. L'acide actique est l'un de ces produits. Tout ce peuplement risquerait de se trouver cours d'azote si l'animal ne fournissait de l'ure, qui diffuse travers la muqueuse digestive partir du sang et se transforme en CO2 et ammoniac par l'urase microbienne. Aprs avoir t profondment brasse et dgrade dans le rumen, la matire vgtale est transmise l'estomac proprement dit. Il s'y fabrique de grandes quantits de lysozyme. On sait que cette enzyme, qui existe communment dans les scrtions animales (larmes, salive, blanc d'uf) hydrolyse des composs particuliers de la paroi bactrienne, appels peptidoglycanes. Le lysozyme est donc une enzyme antibactrienne qui facilite ici la digestion de nombreuses bactries lorsque celles-ci ont fini leur travail 8. Chose intressante, les ruminants ont dvelopp au cours de l'volution des lysozymes modifis plus actifs en milieu acide et plus rsistants l'action de la pepsine que les lysozymes courants comme celui qu'on trouve chez l'homme dans les scrtions lacrymales. Moyennant quoi l'apport des animaux d'levage dans le cycle du mthane est donc loin d'tre ngligeable. La quantit de gaz mise par une vache adulte peut s'lever 30-50 litres par heure, contre 5 litres pour moutons et chvres dans le mme temps. Ce sont finalement 65 100 millions de tonnes de mthane qui sont mises dans l'atmosphre chaque anne par les fermentations digestives des animaux sauvages et domestiques. Comme les activits pastorales augmentent en mme temps que la
8 - C'est une simple approximation, parce que le lysozyme n'attaque pas la paroi de toutes les bactries ; les archaebactries et eubactries qui ont une paroi modifie ou une couche S rsistent.
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population mondiale, leur part dans le cycle du mthane ne devrait pas diminuer, bien au contraire. Cette intense activit mthanogne ne fait pas que participer un cycle biologique trs important, elle obit une biochimie trs particulire. Voici en rsum les caractristiques essentielles de la mthanognse. Le mthane est produit en conditions strictement anarobies par des archaebactries lexclusion de toute autre catgorie dorganismes. C'est le stade ultime dune chane de transformations des matires organiques, commences en prsence doxygne, poursuivie en anarobiose plus ou moins complte par les fermentations, la dnitrification ou d'autres respirations anarobies, et par lactognse. Le mthane produit par voie biologique se reconnat par son dficit en carbone-13 qui correspond un fractionnement isotopique*, l'un des plus importants parmi les processus biologiques. L'abondance naturelle de l'isotope 13 du carbone par rapport au carbone-12 peut diminuer de 5% et plus dans le mthane. Les comptiteurs naturels des mthanognes sont les bactries sulfatorductrices, car leur activit dtourne lhydrogne et tend freiner l'apparition du mthane l o le sulfate est abondant (notamment en milieu marin). En outre le sulfure dgag inhibe le dveloppement des mthanognes. Lnergie de la mthanognse est directement couple un transport de protons ou dions sodium vers lextrieur, c'est--dire ltablissement dun potentiel membranaire. Elle sapparente donc une respiration. Comme lnergie rcupre est relativement faible, les mthanognes sont contraints de transformer une grande quantit de source carbone et tendent sassocier avec dautres espces microbiennes complmentaires par leur lactivit. La mthanognse est donc souvent une affaire de syntrophisme dans des communauts cellulaires dotes dun mtabolisme global complexe. Ces associations sont actives en particulier dans le floc des stations dpuration et des formations particulires appeles granules. Il en rsulte des biodgradations performantes librant du mthane comme un des stades ultimes. La formation du mthane obit une mcanique particulire fonde sur lemploi de coenzymes indits. Les gnomes de Methanococcus jannaschii et Methanobacterium thermoaceticum [40] ont t entirement squencs et apportent une mine de donnes pour rpertorier et comparer tous les lments de la biochimie trs particulire de ces organismes.
4.5 - LES TAPES DE LA MTHANOGENSE

Plusieurs voies sont possibles pour engendrer le mthane. Le point de dpart est le dioxyde de carbone ou un produit organique simple. En rgle gnrale les matires premires utilises sont des sous-produits de fermentations au cours de la dcomposition de la matire vgtale : CO2, H2, formiate, actate, butyrate, mthanol,
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thanol Le dioxyde de carbone est rduit en mthane en quatre tapes successives avec lhydrogne comme donneur. La raction globale est : CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O
2 H+ + 2 e CO2 2 H++ 2 e HCOOH acide formique 2 H+ + 2 e HCHO formaldhyde H 2O
(G' = 131 kJ . mol1)

2 H+ + 2 e
CH3OH mthanol H 2O
CH4
Les quatre rductions

Les trois intermdiaires du schma sont thoriques, car llment mono-carbon reste li un coenzyme au cours des tapes successives. On voit que lensemble du processus est exergonique ltat standard et pH 7. La valeur indique ( 131 kJ) est une valeur thorique puisque dans les conditions relles le gaz carbonique et lhydrogne sont loin de ltat standard. On sait que lhydrogne ne saccumule pas dans les milieux naturels, et une pression de 10 Pa seulement, cette valeur de G' est en ralit proche de 40 kJ. Le CO2 n'est pas obligatoirement la source du mthane. Le groupe des mthano-sarcinales contient des espces comme Methanosarcina mazei, qui sont capables dutiliser H2 et des sources de carbone diversifies : mthanol, mthylamine, actate. Leur action stend des composs tels que CCl4 et le chloroforme, ce qui est utile pour la dfense de lenvironnement. Ces organismes sont dsigns comme les mthanognes mthylotrophes par rapport aux autres qui sont des hydrognotrophes. Ltape la plus nergtique de la cascade de rductions est la dernire aprs le passage au niveau mthyle. On peut sen rendre compte par la transformation du mthanol en mthane, qui reprsente plus de 80% de lnergie obtenue partir de CO2 ltat standard : CH3OH + H2 CH4 + H2O(G' = 112 kJ . mol1) La mthanognse est galement possible partir du formiate issu des fermentations, et se fait par une dismutation produisant la fois CO2 et CH4 : 4 HCOO + 4 H+ CH4 + 3 CO2 + 2 H2O Les mthanognes sont seuls raliser ces transformations nergtiques qui rejettent le mthane comme sous-produit inutile. Comment les cellules rcuprent-elles cette nergie ? En couplant plusieurs tapes ltablissement dun potentiel de membrane, tabli par translocation de protons et dions sodium. La nature de cette opration a t rvle par les expriences de B LAUT et GOTTSCHALK [41]. Il sagit dun mtabolisme de type respiratoire anarobie, o le substrat oxyd est lhydrogne, et laccepteur final le CO2. La mthanisation peut se faire aussi partir de lacide actique. Cest la mthanognse actoclastique, une forme de mthylotrophie car le mthane est produit partir du groupe mthyle. Lacide actique est rcupr l encore partir de l'activit des fermentations et de l'actognse. CH3COOH CH4 + CO2(G' = kJ . mol1)
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L'nergie obtenue en partant de l'acide actique est relativement modeste. Pourtant une part trs importante de la mthanognse dans la nature se ralise ainsi, et lacide actique est parfois la source prdominante du mthane. On peut le comprendre aisment puisque lactate est un produit de fermentation abondant, alors que lhydrogne est un gaz volatil, rapidement oxyd par dautres voies et gnralement prsent taux trs faible. Le mcanisme biochimique de la conversion de CO2 en mthane nest connu que depuis une priode rcente, il est assez compliqu et met en jeu une batterie de cofacteurs qui nexistent nulle part en dehors des mthanognes (sauf rares exceptions). On en donnera un aperu condens. Des revues rcentes contiennent beaucoup de renseignements utiles et de longues bibliographies [42]. Un diagramme montre les diffrentes tapes. L'chelle symbolise les variations dnergie libre approximatives l'tat standard, et chaque raction avec son numro est une marche descalier. Le dioxyde de carbone est rduit en mme temps quil est dcharg sous forme de formyle (O=CH) sur un coenzyme spcial ressemblant au FH4. Llment mono-carbon qui lui est li va subir nouveau deux rductions. Nous avons dj rencontr le FH4 (ttrahydrofolate) chez les actognes. Le principe est ici le mme, le FH4 tant remplac par le MPTH4 (ttrahydromthanoptrine). La dernire partie (ractions 6 et 7) est la plus complique et la principale exclusivit des archaebactries. La plupart des tapes ont besoin dun bas potentiel doxydorduction, infrieur 300 mV, et sont catalyses par des enzymes sensibles loxygne. Les manipulations de laboratoire doivent donc se faire sous atmosphre inerte.
G' (kJ . mol1) 1
0
CO2
4 5
O=CH O=CH MF MPTH4
CH MPTH4 CH3 MPTH4
CH2 MPTH4
40
6 CH3SCoM
80
HS-CoB mthanophnazine F430
120
MF : mthanofurane MPTH4 : ttrahydromthanoptrine HS-CoM : coenzyme M HS-CoB : coenzyme B
CH4
Cheminement nergtique de l'lment monocarbon
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Il faut se rappeler que le FH4 ou le MPTH4 ne subissent pas doxydorduction, mais servent de supports pour les interconversions entre formiate et mthanol. Les ractions sont potentiellement rversibles, entre tapes formyl-, mthnyl- (aprs cyclisation catalyse par une cyclo-isomrase), mthylne-, mthyl-. Deux dshydrognases sont dans ce va-et-vient. Les ractions sont repres par numro. 1 - Le CO2 est rduit en acide formique qui dcharge son groupe formyle sur un accepteur appel mthanofurane (MF). Un coenzyme inhabituel, dont voici la structure :
COO
OOC
O N H
COO H N O
+ NH3
O N H O O
NH+ 3
COO
COO CO2
NH O O CHO
2 H++ 2 e
Lintermdiaire form est le formyl-mthanofurane (formylMF). Lenzyme de structure complexe est une dshydrognase qui a t purifie chez Methanosarcina barkeri [43]. Elle a cinq sous-units diffrentes, possde une ribambelle de noyaux fer-soufre et une molybdoptrine. Ce cofacteur est courant dans le nature et nous le retrouverons dans la rduction du nitrate ou du formiate. Il a ici la structure dun dinuclotide (MGD*), contient du molybdne ou du tungstne. On suppose que cette partie a le rle essentiel dans la catalyse, les lectrons tant fournis par une hydrognase et dirigs vers le site actif par la chane de noyaux fer-soufre de type [4Fe-4S]. La formation du formyl-mthanofurane est lgrement endergonique et correspond la marche nergtique montante en haut du diagramme. La rduction catalyse par une formiate dshydrognase s'accompagnerait d'un saut en nergie bien plus marqu, et l'intervention du mthanofurane semble une solution pour franchir facilement la petite colline nergtique par un effet de siphon, le formyl-MF tant absorb en aval au fur et mesure. 2 - Un transfert du formyle se fait sur le ttrahydromthanoptrine (MPTH4), pour donner le N5-formyl-MPTH4. Il ny a pas doxydorduction. Le formyle change simplement de vhicule. Le nouvel accepteur ressemble au ttrahydrofolate (FH4) aperu chez les actognes, et servira de support pour les deux rductions suivantes. Sa formule a t simplifie 9. Ont t symbolises les trois combinaisons de llment mono-carbon avec le MPTH4, en fonction de son niveau doxydorduction. Des archaebactries sulfato-rductrices [44] et quelques protobactries utilisatrices du mthanol [45] renferment aussi ce cofacteur. Ont t repres comme pour le FH4 les deux positions azotes essentielles 5 et 10. Lenzyme responsable de cette tape a t purifie [46] et sa structure dtaille est connue pour un hyperthermophile, Methanopyrus kandleri [47]. 9 - R dsigne une chane contenant du ribose, un groupe phosphate, un groupe glutaryle (en C5).
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O HN H2N N H N
5
H N
10
N H
CH3
CH2 I CHOH I CHOH I CHOH I CH2 R N CH3 N

5
N
5
CH
+
10
N
5
CH2
10
H N
10
5,10-mthnyl-MPTH4
5,10-mthylne-MPTH4
5,10-mthyl-MPTH4
Ttrahydromthanoprine (MPTH4)
3, 4 - Une cyclo-isomrase catalyse une cyclisation avec limination dune molcule deau. Le rsultat est le N5,N10-mthnyl-MPTH4. Celui-ci est rduit en N5,N10-mthylne-MPTH4 par la mthylne-MPTH4 dshydrognase avec un partenaire qui nest ni NAD+ ni FAD, mais un compos flavinique dsign comme F420 (avec un pic dabsorbance 420 nm). La raction est : N5,N10-mthnyl+-MPTH4 + F420-H2 N5,N10-mthylne-MPTH4 + F420 + H+. Le systme ne peut avancer que si le F420 est rduit nouveau. Une hydrognase [NiFe] particulire, contenant du nickel et spcifique du F420 utilise H2 comme source dlectrons. Le F420 est une dazaflavine, analogue une flavine classique comme le FAD mais dote d'un carbone la position 5 la place de l'azote. Cette diffrence est fondamentale, parce que le F420 est un accepteur de deux lectrons la fois pour devenir le F420H2, alors que la rduction d'une flavine est possible lectron par lectron et peut passer par un stade intermdiaire radicalaire. Le F420 se prte donc une utilisation plus rigide que celle des flavines 10. En outre son potentiel doxydorduction est plus bas, soit environ 350 mV.
F 420 O
5
F420-H2 H NH N
4
H O
5
2H +2e
NH N H
4
HO
N CH2
O CH3 NH O COO
H O N C00 CH CH2 CH2 C00
O O P O O OH OH
OH
La dazaflavine des mthanognes

10 - Une 5-dazaflavine est donc un accepteur dhydrure, la manire du NAD+. Exprimentalement, les dazaflavines peuvent remplacer parfois le FAD ou le FMN lorsque la raction supporte un change de deux lectrons. Si la raction passe par un stade intermdiaire radicalaire de type semiquinone, une azaflavine est inhibitrice et sert d'outil pour examiner le mcanisme des ractions flaviniques.
223
Le recours au F420 n'est pas obligatoire. Deux catgories de dshydrognases peuvent coexister dans le mme organisme, celles qui dpendent de F420 (codes par gnes mtd) et celles qui en sont dpourvues et fonctionnent comme hydrognases (codes par hmd). Les dshydrognases F420 (Mtd) de plusieurs espces, dont Methanosarcina barkeri et Methanopyrus kandleri ont t purifies [48] et ont donn lieu des tudes de strochimie intressantes [49]. Le F420 intervient dans (1), et la deuxime enzyme (Hmd) catalyse (2). cela s'ajoute une troisime protine qui rduit directement F420 avec l'hydrogne. L'enzyme est une hydrognase Ni atypique et dpourvue de noyaux fer-soufre. Elle obit un mcanisme particulier [50] et catalyse (3) : F420 + N5,N10-mthnyl+-MPTH4 N5,N10-mthylne-MPTH4 + F420 rduit + H+ H2 + N5,N10-mthnyl+-MPTH4 N5,N10-mthylne-MPTH4 + H+
+
(1) (2) (3)
H2 + F420 F420 rduit + H
La raction (2) mrite une parenthse. Son caractre rversible lui permet de faire de lhydrogne partir du mthylne-MPTH4. Lenzyme Hmd est une dshydrognase fonctionnant comme une hydrognase particulire distincte par ses proprits des autres hydrognases, car elle na pas de noyau [NiFe], ne rduit pas les violognes et ne catalyse pas lchange H/D. Elle est inductible en conditions de carence en nickel [51]. On admet actuellement que cette hydrognase possde un cofacteur qui serait constitu par du fer. Pourquoi ce luxe de protines diffrentes dans cette tape de la mthanognse ? Une explication partielle consiste voir ce dispositif comme une parade aux conditions trs changeantes du ct de la fourniture en hydrogne. Quand celui-ci est rare, la dshydrognase F420 est synthtise en priorit par rapport lenzyme atypique Hmd.
CO2 CH H2 Hmd 2 H+ MPTH4 CH2 MPTH4 CH4 Mtd F420 F420-H2 hase Ni H2 2H+ autres ractions
Utiliser au mieux l'hydrogne

Cest linverse quand lhydrogne est abondant. Mais la forme rduite du F420, soit F420-H2, est prcieuse car elle sert faire marcher dautres tapes rductrices de la mthanognse, et c'est pourquoi sa formation en permanence par la raction (3) est rendue ncessaire. Sur un petit diagramme est figure une chane ractionnelle. Elle met contribution lenzyme Hmd, qui rduit le mthnyl-MPTH4. Lenzyme Mtd fait la mme chose mais utilise F420-H2 comme donneur la place de H2. Enfin lhydrognase nickel rduit directement F420 avec lhydrogne.
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Quand lhydrogne est abondant, le flux des lectrons venant de lhydrognase Hmd, permet linterconversion rapide entre mthnyle et mthylne sur le MPTH4. Le va-et-vient entre ces deux formes permet Mtd de maintenir un taux lev du F420 rduit (F420-H2) ncessaire dautres ractions de la mthanognse. Si lhydrogne est peu abondant, lhydrognase Ni, spcifique du F420, possde une plus forte affinit pour H2 et alimente le systme de droite gauche sur le diagramme. Il est probable que ce modle est trs simplifi par rapport la ralit, et que des mcanismes rgulateurs complexes permettent doptimiser les flux du carbone et des lectrons. 5 - Lenzyme dont le nom complet est N5,N10-mthylne-MPTH4 rductase opre la rduction du mthylne en mthyle. Elle a t purifie partir de plusieurs espces dont Methanosarcina barkeri [52], et fonctionne avec le F420 rduit comme donneur dlectrons. Partant du CO2, le carbone a donc subi trois rductions successives conduisant au stade mthyle qui quivaut au mthanol. Il faudra donc une rduction supplmentaire pour parvenir au mthane. 6 - Un transfert prcde lultime rduction. Elle fait passer le mthyle sur un coenzyme caractristique de la mthanognse ou coenzyme M (acide 2-mercaptothane-sulfonique). Ce facteur est un thiol et sera dsign en abrg par HS-CoM. Une transfrase tablit la liaison thio-ther sur le coenzyme M : CH3MPTH4 + HSCoM MPTH4 + CH3SCoM
O HS S O avant O H3C S et aprs O S O mthylation O
Le coenzyme M
Cette raction en apparence modeste est une des tapes nergtiques essentielles G' = 30 kJ . mol1 environ) et contribue btir le potentiel membranaire. La mthyltransfrase a trois caractres principaux. Elle est membranaire, contient un corrinode* et fonctionne en expulsant des ions sodium raison dun rapport molaire de 1,7 Na+ environ pour 1-mthyl-MPTH4 utilis [53]. On a pu cloner et squencer les gnes codant pour les 8 sous-units diffrentes de la transfrase 11 chez Methanosarcina mazei G1 [54]. Cette souche a offert un cadre favorable trs utile la recherche, car il est peu facile dobtenir des vsicules isoles (liposomes) montrant des couplages nergtiques in vitro partir des archaebactries 12. Cependant les mthanognes connus montrent une grande diversit de proprits physiologiques et de compositions enzymatiques. Il nest pas sr quon puisse extrapoler automatiquement les donnes acquises partir de G1. Il a t montr exprimentalement que les cellules de Methanosarcina barkeri mises en prsence 11 - Lenzyme est code par l'opron mtrEDCBAFGH. La sous-unit MtrA contient le corrinode. 12 - Cela est d aux contacts troits et interdigitations de la couche externe de glycoprotines avec la membrane cytoplasmique proprement dite, et on ne peut pas dcoller aussi facilement celle-ci du reste de lenveloppe ou faire des protoplastes comme on le fait par exemple avec un colibacille.
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des substrats H2 et HCHO expulsaient des ions sodium, et que cette proprit se retrouvait dans des liposomes contenant la transfrase. Le potentiel engendr par la translocation de Na+ atteint 60 mV environ et rsiste laction des ingrdients qui permabilisent les membranes aux protons. Le transfert fonctionnerait en deux temps. Le mthyle transport par le MPTH4 serait dcharg sur le cobalt(I) du corrinode dans la transfrase, formant une liaison transitoire CH3Co(III). Une oxydorduction rversible et interne lenzyme ferait passer le cobalt ltat Co(I), rompant la liaison et facilitant le transfert sur le coenzyme M. Chacune des deux tapes devrait engager une variation dnergie denviron 15 kJ . mol1. La premire nest pas stimule par les ions Na+, contrairement la seconde. On pense que la translocation du sodium est couple au passage du mthyle entre cobalt et coenzyme M.
Co(I)
CH3_MPTH4 G'0 = 15 kJ MPTH4 HS-CoM G'0 = 15 kJ CH3 S-Com cytoplasme

_
CH3_ Co(III) Na+ Co(I) membrane
Rle du corrinode dans le transfert de mthyle sur coenzyme M

Lintervention du corrinode ressemble la situation dcrite chez les actognes. On observe que le cobalt n'est oxyd que temporairement. Le potentiel membranaire form est converti en ATP par une ATP synthase qui est mue par un gradient de Na+ ou de H+ selon les espces.
F430 COO H H 3C H2NOC HS coenzyme B O H N CH3 CO O O P O O
OOC
O HN CH3 N Ni + N COO COO
H O COO
Coenzymes de la phase finale
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7 - La dernire tape de la mthanognse est la plus trange. Le passage au mthane implique une dernire rduction deux lectrons du groupe mthyle. Lenzyme est la mthyl-coenzyme M rductase. Elle a deux cofacteurs, le coenzyme B (son nom chimique est donn en glossaire) et le F430 ( ne pas confondre avec le F420) Le coenzyme B est un thiol comme le CoM, mais sa chane est plus longue. Le F430 est une porphyrine modifie renfermant du nickel.Le principe de la raction parat le suivant. La rduction du mthyle est compense par loxydation des deux thiols, les coenzymes M et B qui vont former ensemble ce quon appelle lhtrodisulfure. Le coenzyme M est occup par le mthyle, mais celui-ci est chass et rduit en CH4 tandis que se forme le disulfure. Le schma indique les trois phases essentielles.
CH4 S 1 CoM MPTH4 3 mthyl-MPTH4 S htrodisulfure 2 HS 2 H+ + 2 e HS
CoB HS
+
H3CS
Formation du mthane et de l'htrodisulfure

La raction 1 engendre le mthane et lhtrodisulfure par une raction doxydorduction. L'enzyme essentielle est appele mthyl-CoM rductase, pour laquelle on a des renseignements dtaills chez Methanobacterium thermoautrophicum [55]. Lenzyme de 300 kDa est code par de trois gnes B, G et A dans un opron mcrBDCGA, possde 3 sous-units diffrentes et une structure globale 2 2 2 avec deux molcules de F430. Le nickel semble tre un lment capital. Voici une interprtation. Le mtal formerait une liaison temporaire avec le mthyle arrach au coenzyme M. Ce serait la vraie phase rductrice, pendant que le mtal soxyderait de Ni(I) Ni(III) 13, comme l'indique un schma simplifi. On observe une ressemblance intressante du comportement du nickel avec celui du cobalt dans le corrinode.
HS S CH3 N N NiI N N N N CoB SO3
S
CoB SO3 CH4 N N
S S
CoB SO3
CoM F430
HS CH3 NiIII
N N
NiI
N N
Naissance du mthane
13 - Observez le parallle avec la liaison Co(III)-mthyle dans les corrinodes.
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La deuxime raction est donc celle qui rompt lhtrodisulfure et rgnre les deux thiols pour les rendre nouveau disponibles. Ce rle appartient lhtrodisulfure rductase. Il est dtaill dans la section suivante. Cette nouvelle rductase est compltement distincte de la prcdente. Elle est charge de clore le cycle des oprations de rgnration des deux thiols.
4.6 - LNERGIE DE LHTRODISULFURE RDUCTASE

La rduction de lhtrodisulfure form entre les coenzymes M et B est un deuxime site de couplage nergtique aprs celui de la mthyl-transfrase aperu antrieurement. Une tape essentielle. Quel est son principe de ce couplage ? Si on fait le point, on constate que la ralisation du mthane est maintenant termine. L'tape ultime consiste rendre nouveau disponibles le coenzyme M et l'autre thiol, le coenzyme B. C'est le rle de cette rductase. L'opration a lieu dans la membrane. Le donneur est soit H2, soit la dazaflavine rduite (F420H2). Examinons le cas o le donneur est H2. Son utilisation ncessite une hydrognase, mais celle-ci ne sait pas transmettre les lectrons directement la rductase. Il faut un transporteur intermdiaire au sein de la membrane, un produit qui ressemble une quinone respiratoire et lipophile comme elle. Il s'agit de la mthanophnazine (MP) [56]. Elle na t mise en vidence ailleurs que chez les espces mthylotrophes, qui oxydent du mthanol. En dpit de cette exception qui est peuttre une survivance volutive ancienne ou une convergence, ce cofacteur reste particulier la mthanognse.
N N
forme oxyde
O H N N H
forme rduite
Mthanophnazine
Une mini-chane de transporteurs entre l'hydrogne et l'htrodisulfure est symbolise par une figure. Des protons sont mis sur la face extrieure. Les principaux rsultats exprimentaux ont t acquis avec Methanosarcina mazei [57]. Lhydrognase est dsigne par son sigle gntique VhoAG. Elle ne fonctionne pas avec le F420 rduit. Le transport des lectrons fait appel des cytochromes et la mthanophnazine figure par MP. La membrane est symbolise la page suivante comme vue par sa tranche, face extrieure en haut, cytoplasmique en bas. Lhydrognase gauche forme un complexe de trois sous-units, VhoA, VhoG et VhoC. Cette dernire est un cytochrome b1. Par les homologies de squence, il a t dmontr que VhoAG ressemble aux hydrognases [Fe-Ni] des eubactries.
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H2 2 H+
2 H+ htrodisulfure rductase cyt. b1 VhoC 2 e MPred MPox 2 e cyt. b2 HdrE HdrD 2 e
extrieur membrane cytoplasme
VhoAG 2 e
hydrognase 2 H+ 2 H+ + CoM-S-S-CoB HS-CoM HS-CoB
La rductase HdrDE
Cest donc un systme dot dune structure courante, la partie cytochrome tant surajoute.Lhtrodisulfure rductase forme un complexe de deux sous-units, HdrD o se trouve le site actif ainsi que deux noyaux [4Fe-4S] [58]. HdrE est un cytochrome b2. Enfin la mthanophnazine (MP) fait un va-et-vient entre les deux systmes. Elle peut tre remplace exprimentalement par un analogue soluble plus facile utiliser, la 2-hydroxyphnazine, et son cycle rappelle celui dune quinone dans une chane respiratoire classique. En comptabilisant les protons changs par lensemble, on voit que quatre protons sont prlevs dans le cytoplasme, et quatre autres sont mis au-dehors. Pour chaque paire d'lectrons transfrs partir d'une molcule d'hydrogne, il y a donc un pompage thorique de quatre protons. L'exprience en indique 3,6. Le saut nergtique total est de lordre de 42 kJ . mol1, suffisant pour la formation dune molcule dATP ( 32 kJ . mol1 ltat standard). On estime que dans les conditions relles o le taux dhtrodisulfure prdomine sur celui des thiols ltat spar, lnergie disponible est nettement suprieure. Lhydrognase VhoAGC nest pas seule pourvoir un pouvoir rducteur pour ce systme. Une autre hydrognase peut la remplacer en catalysant : F420-H2 + mthanophnazineox F420 + H2 + mthanophnazinered.
L'nergie serait libre en deux temps. On sait que le F420-H2 est produit par dautres ractions en amont. Cette hydrognase, quon appelle aussi la F420-H2 dshydrognase, pourrait aussi faire une translocation de protons la manire de la NADH dshydrognase mitochondriale. L'tude exprimentale faite avec des membranes isoles de Methanosarcina mazei semble confirmer cette analogie. Elle montre qu'il y a bien tablissement d'un gradient transmembranaire de H+ au cours de l'oxydation de la F420-H2. La mthanophnazine est reprsente par son analogue soluble, la 2-hydroxyphnazine (2OH-P) [59], et les membranes isoles catalysent les deux ractions successives : H2 + 2OH-P dihydro-2-OH-phnazine (2OH-PH2) 2OH-PH2 + CoM-S-S-CoB 2OH-P + HS-CoM + HS-CoB (G' = 31,8 kJ . mol1) (G' = 10,6 kJ . mol1)
229
Ces ractions sont donc exothermiques l'une et l'autre. La seconde n'est autre que celle de l'htrodisulfure rductase. L'exprience montre que les membranes sont le sige la fois d'un gradient de protons et d'une synthse d'ATP partir d'ADP et de phosphate. Chaque raction s'accompagne d'une translocation de protons dans un rapport H+/2e dont la valeur mesure est au plus de 0,9 pour chacune. La p qui en rsulte est suffisante pour une synthse d'ATP. Les mesures indiquent 0,25 ATP par paire d'lectrons. L'action de dcouplants confirme que l'une et l'autre de ces tapes sont productrices d'nergie utilisable par la cellule. Si on fait le bilan des aspects nergtiques de la mthanognse partir de CO2 + H2, on voit quelle entrane la formation dun potentiel ionique fond sur un gradient de protons ou d'ions Na+. Nous avons vu en effet que le sodium intervient aussi dans certaines tapes nergtiques. LATP peut-il tre form la fois partir de Na+ et H+ ? La question reste controverse, mais la tendance est de l'expliquer par la prsence de deux facteurs, un antiporteur Na+/H+ (un ion Na+ rentre pour un proton qui sort), et une ATP synthase de type F couplant la synthse dATP avec le retour des protons vers l'intrieur [60]. Il est nanmoins possible que certains mthanognes possdent une ATP synthase capable d'effectuer ce couplage directement avec les ions sodium. Un tel dispositif est connu en dtail dans une eubactrie, Propionigenium modestum. En conclusion de ces deux dernires sections, nous assistons une biochimie tonnante qui s'carte des circuits classiques prsents dans la majorit des espces vivantes, et loin de faire figure d'organismes frustes et primitifs, les mthanognes rvlent en fait une physiologie trs sophistique. L'nergie dgage par la fabrication du mthane est rcupre en grande partie par un potentiel membranaire. La mthanognse est une oxydation d'hydrogne par le CO2 comme accepteur et apparat en principe comme une respiration anarobie sur CO2. En somme le mthane n'est pas un produit de fermentation au sens biochimique du terme, contrairement ce que l'on croit souvent.
4.7 - DE LACIDE ACTIQUE AU MTHANE

Une part importante du mthane de la biosphre tire son origine de lacide actique produit par les fermentations et les actognes. Cest lactotrophie, tudie en particulier avec Methanosarcina thermophila. La synthse de mthane partir de l'acide actique est dite actoclastique. Le MPTH4 y est remplac par un cofacteur trs voisin appel ttrahydrosarcinaptrine (SPTH4) [61], une particularit relativement peu importante car le fonctionnement reste exactement le mme 14. Pour faciliter la comprhension, la notation MPTH4 a t conserve ici tout en gardant en mmoire cette petite diffrence.
14 - La chane latrale hydroxyglytaryle est allonge par une liaison amidique avec lacide glutamique.
230 Lacide actique est trait de la faon suivante :
Actate + ATP Actyl-phosphate + ADP Actyl-phosphate + HS-CoA CH3CO-S-CoA + phosphate CH3CO-S-CoA + MPTH4 + H2O CH3-MPTH4 + HS-CoA + CO2 + 2H + 2e
+
(1) (2) (3)
La raction (3) portant sur lactyl-coenzyme A est la plus importante, car elle revient scinder rversiblement lactyle en mthyle et CO2 avec libration dun pouvoir rducteur emport par une ferrdoxine rduite. Ce mcanisme est indirectement gnrateur de mthane, car le CH3-MPTH4 peut dcharger son mthyle sur le coenzyme M. Ce dernier participera son tour la formation de lhtrodisulfure comme dcrit antrieurement. La raction (3) a une trs grande importance car elle peut marcher dans les deux sens. En fonctionnant de droite gauche, elle fait de l'actyl-CoA susceptible dentrer dans le mtabolisme cellulaire comme point de dpart de multiples synthses, l'indispensable source de carbone sans laquelle les mthanognes ne sauraient se dvelopper. Mais le dioxyde de carbone est utilis par la raction (3) dans la direction inverse. Il sagit dune vritable assimilation de CO2, lactyl-CoA tant le maillon initial qui permettra la synthse de tous les autres constituants cellulaires. La mme raction ncessaire la mthanognse partir de lactate est donc aussi la base dune autotrophie, puisque le CO2 est utilisable comme seule source de carbone. Par sa rversibilit, la raction (3) fait se superposer deux protocoles distincts, la mthanognse actoclastique, qui est productrice d'nergie, et l'assimilation du CO2. Lorsque la mthanognse fonctionne, celui-ci n'est pas totalement rcupr. La mthanognse sur actate laisse chapper un peu de dioxyde de carbone dont l'origine est prouve par les expriences de marquage. Pour synthtiser l'actyl-coenzyme A, le mthyl-MPTH4 fournira le groupe mthyle tandis que le carbonyle sera produit par la rduction de CO2 en CO [62]. Cette opration est catalyse par la CO dshydrognase. Cette enzyme dj rencontre chez les actognes fonctionne ici selon un principe similaire, soit pour la scission de la liaison C-C dans lactyl-CoA, soit comme actyl-CoA synthase. Nous la dsignerons en abrg par CODH/ACS. La raction (3) n'allant pas jusqu'au bout s'arrte au monoxyde de carbone en devenant : CH3CO-S-CoA + MPTH4 CH3-MPTH4 + HS-CoA + CO (4)
Le CH3-MPTH4 est alors la source du mthane par le mme cheminement que vu antrieurement. Lactate pourrait avoir exist aux temps les plus anciens de lvolution. Cette raction reprsenterait un modle primitif dautotrophie dans une atmosphre primitive, et les fortes homologies de squence releves en comparant les enzymes cls dans les bactries et les archaebactries semblent indiquer qu'il a t repris dans des directions parallles, mais avec des diffrences dans la stratgie utilise [63]. Ainsi chez les bactries actognes, le gaz carbonique tait rduit et activ en phase soluble grand renfort dATP avant d'tre transform en formyl-FH4 par le canal de la formiate dshydrognase et de la formyl-FH4 synthtase. Le potentiel du couple CO2 + mthanofurane/formyl-mthanofurane est vers 500 mV. Il est compens par un courant dlectrons inverse actionn par le potentiel membranaire (H+ ou Na+).
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La CO dshydrognase dite CODH/ACS est donc la fois au cur de la mthanogense actoclastique et de lautotrophie des archaebactries du type Methanosarcina. On admet provisoirement que lenzyme fonctionne par un mcanisme inverse de celui qui a t dcrit chez les actognes du genre Clostridium [64]. Rappelons que la CODH/ACS a la particularit de renfermer du nickel. La CODH/ACS de Methanosarcina barkeri et de M. thermophila est un complexe de masse molculaire trs leve (1600 kDa environ) de formule 6 6 6 6 6. On y distingue plusieurs parties [65], dont lactyl-CoA synthase proprement dite par les sous-units, dsignes ici , et , avec un site actif port par les sous-units appeles ici et rappelant celui de la CODH des actognes. On y trouve du nickel et des noyaux [4Fe-4S]. Tous les auteurs s'accordent pour reconnatre le caractre essentiel du nickel. La prsence du cuivre reste confirmer, mais elle semble probable car Cu a t dtect depuis longtemps dans la CODH/ACS de M. barkeri [66]. C'est un point qui reste obscur. Le lieu o se fait ou se dfait la liaison CC de lactyle est un noyau bi-mtallique spcial de type Ni-x-[4Fe-4S]. Les sous-units et correspondent la mthyl-transfrase et renferment le corrinode. Le mcanisme enzymatique regard ici dans le sens actyl-CoA mthyle + CO est encore imparfaitement connu et sujet controverses. Lintervention du fer et du nickel a t prouve par RPE, et apparat comme certaine. Le groupe mthyle n de la rupture de l'actyle est inject sur le corrinode dune sous-unit voisine, moyennant un changement de valence du cobalt sur le principe expliqu antrieurement. Le mthyle sera transmis par la suite au coenzyme M en vue de la prparation du mthane. Le carbonyle quitte le site actif sous forme de monoxyde de carbone. Celui-ci reste attach au complexe o il migre sur un site (appel site C) contenant aussi, croit-on, un noyau bi-mtallique renfermant du nickel et un noyau [4Fe-4S] qui serait le support de lactivit CO dshydrognase. Les ions cyanure inhibent fortement cette phase. Le monoxyde de carbone reste li l'enzyme tant qu''il n'a pas t oxyd. Les lectrons librs par cette oxydation lectrons sont changs avec l'extrieur par lintermdiaire dune ferrdoxine, et ils seront utiliss dans la conversion du mthyl-coenzyme M en mthane. [CO] + Ferrdoxine oxyde + H2O CO2 + Ferrdoxine rduite + 2 H+
La ferrdoxine rduite cde les lectrons une oxydorductase membranaire qui fait office dhydrognase comme dans le systme rencontr antrieurement, avec la chane : cytochrome b1 mthanophnazine cytochrome b2 htrodisulfure rductase. Le fonctionnement de la CODH/ACS rejoint donc le mcanisme dj rencontr. On s'attend trouver de grandes similitudes de mcanisme entre l'actyl-CoA synthase des mthanognes et celle des actognes, la premire pratiquant la mthanognse actoclastique. On constate cependant des divergences d'une espce l'autre et la prudence s'impose. Il n'y a qu'une homologie de squence insignifiante entre ces enzymes des actognes au mthanognes. Il apparat qu'elles ont diverg dans des temps trs anciens de l'volution sans qu'on puisse dire si le mcanisme de la catalyse a t exactement conserv. Tout le monde
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s'accorde penser qu'il s'agit bien d'un modle d'autotrophie trs primitif, dont il existe des vestiges chez des bactries phototrophes . la mthanognse sur acide actique se trouve associe une anhydrase carbonique. Cette enzyme catalyse la raction : CO2 + H2O HCO3 + H+. La raction n'a pas besoin de catalyseur pour fonctionner dans un sens ou dans l'autre, mais elle est acclre dun facteur norme par les anhydrases carboniques isoles un peu partout dans le monde vivant, chez les animaux, plantes, cyanobactries et bactries. Celles des archaebactries appartiennent un type spcial mais fonctionnent comme les autres avec du zinc. On dispose dune structure dtaille de cette enzyme dans le cas de Methanosarcina thermophila [67]. Quelle peut tre lutilit de lanhydrase carbonique au cours de la mthanognse, puisqu'elle ne fait qu'acclrer une raction qui se produirait de toute faon sans elle ? Si on se reporte lnergie produite par la mthanognse actoclastique ( 36 kJ . mol1 dans les conditions standard), il est clair quelle est assez faible, car elle nat principalement de la rduction du mthyl-CoM. Le rsultat devrait tre amlior si le gaz carbonique engendr aprs rupture de l'actyl-CoA tait rapidement soustrait de lquilibre ds son apparition, dplaant celui-ci dans un sens favorable et renforant la production d'nergie. C'est peut-tre le rle de lanhydrase de soutirer le plus rapidement possible le CO2 form afin d'amliorer le gain nergtique.
4.8 - MTHANOGNES ET BIODGRADATIONS

Les archaebactries mthanognes se dveloppent dans des milieux strictement anarobies, localiss en principe dans les couches les plus profondes d'une stratification o se succdent partir de la surface les arobies, les dnitrifiants, les bactries rductrices du fer et du manganse, les sulfato-rducteurs, les actognes, et finalement les mthanognes. Les biodgradations de substances naturelles ou xnobiotiques peuvent avoir lieu tous les niveaux, mais les plus actives sont gnralement dans les milieux arobies. C'est une constatation facile faire par la pratique du compostage. On pourrait supposer que certains polluants transports profondment l'abri de toute trace d'oxygne deviennent rcalcitrants une biotransformation et conduire des accumulations nuisibles. Compares aux arobies tels que les Pseudomonas, ou encore les bactries qui oxydent le mthane, les mthanognes peuvent apparatre comme des organismes trs spcialiss disposant de potentialits limites en dehors de leur mtabolisme trs particulier et inimitable. Les mthanognes sont tributaires de produits simples qui sont gnrs par les autres, comme l'hydrogne, le gaz carbonique, l'acide actique et quelques produits carbons faible masse molculaire. Ils sont nanmoins capables de transformer en mthane des substrats plus labors tels que des glucides. On peut donc supposer que la mthanognse peut s'accomplir sur une varit de composs plus grande qu'initialement escompt. La difficult des recherches est d'ordre technique. Le dveloppement des mthanognes est
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relativement lent, et ncessite des contraintes qui n'ont rien voir avec celles des organismes versatiles dveloppement trs rapide comme la plupart des bactries leves au laboratoire. L'isolement de mthanognes pour les tudes de biodgradation se fait gnralement partir de vases et sdiments o le dgagement de CH4 est constat. L'oxygne, le nitrate, le fer et le sulfate doivent avoir pratiquement disparu, mettant hors course les comptiteurs. De trs nombreuses recherches ont eu lieu pour tenter de comprendre comment des contaminants peuvent tre pongs par l'action des mthanognes, qui reprsentent en fait le dernier recours quand les autres possibilits sont puises. Un exemple reprsentatif est le travail de ZENGLER et coll [68]. Un enrichissement progressif a t fait partir d'un chantillon de sdiment, dans un milieu minral sans sulfate et priv d'oxygne, contenant un tampon bicarbonate pH 7 et du sulfure comme source de soufre. Le substrat carbon tait un hydrocarbure (hexadcane). L'exprience a dur de un deux ans. Le gaz form tait principalement du mthane, qui apparaissait seulement lorsque l'hydrocarbure tait prsent. Cette lente transformation s'expliquait par l'association de plusieurs groupes de micro-organismes actognes et archaebactriens. Leur relation tait celle du syntrophisme. Des actognes dgradaient l'alcane. L'hydrogne, le gaz carbonique et l'acide actique taient rcuprs par les mthanognes pour faire du mthane. 4 C16H34 + 64 H2O 32 CH3COO + 32 H+ + 68 H2 (G = 929 kJ) 32 CH3COO + 32 H+ 32 CH4 + 32 CO2 (G = 385 kJ) 68 H2 + 17 CO2 17 CH4 + 34 H2O (G = 282 kJ) Le bilan total est : 4 C16H34 + 30 H2O 49 CH4 + 15 CO2 (G = 1596 kJ) (4) (1) (2) (3)
Les ractions (2) et (3) sont celles des mthanognes. Les variations d'nergie libre ne sont pas l'tat standard, mais sont des valeurs moyennes estimes partir des concentrations relles. La consommation de l'hydrogne au fur et mesure de sa production est un point important, sinon la raction (1) des actognes ne produiraient aucune nergie. La quantit relle de mthane enregistre au cours de la consommation d'hexadcane tait un peu infrieure la quantit thorique, probablement cause des pertes de gaz et du dtournement du carbone pour les synthses cellulaires. L'emploi d'hexadcane enrichi en carbone-13 a rvl que le mthane form tait bien produit partir de l'hydrocarbure, malgr le risque d'artefact introduit par l'usage du bicarbonate comme tampon. Quelle est la nature de l'association microbienne ? Les analyses d'ARN 16S ont indiqu par comparaison avec les squences connues la prsence de protobactries de la classe delta, de mthanognes actoclastiques (proches de Methanosaeta) et de mthanognes utilisateurs de CO2 et de H2. Les mthanognes peuvent raliser par eux-mmes une dchloration de substrats carbons chlors un ou deux atomes de carbone. Cette proprit est partage par d'autres espces anarobies qui ont toutes en commun l'utilisation de la voie de WOOD-LJUNGDAHL o intervient l'actyl-CoA synthase. Le ttrachloromthane (CCl4) est transform en produits partiellement dchlors ou en CO2 par des mthanognes,
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des actognes (Acetobacterium woodii) et des sulfato-rducteurs (Desulfobacterium autotrophicum). Cette transformation est observable avec des suspensions cellulaires ou des extraits autoclavs, ce qui souligne le pouvoir catalytique d'au moins un des cofacteurs de la voie de WOOD-LJUNGDAHL, savoir un corrinode. Cette hypothse est clairement vrifie dans le cas de Methanosarcina barkeri. Ce mthanogne transforme le 1,2-dichlorothane en chlorothane ou en thylne. Or cette intressante dshalognation appartient aussi la cobalamine ou au F430, condition de placer dans le milieu du citrate de titane, Ti(III), afin de maintenir un bas potentiel rducteur (voir Titane*). Le premier cofacteur a du cobalt, le couple Co(II)/Co(I) a un potentiel de 610 mV. Le second a du nickel, avec un couple Ni(II)/Ni(I) dont le potentiel est comparable au prcdent. Ces deux cofacteurs ont donc par eux-mme un puissant pouvoir catalytique qui explique facilement l'action des cellules mthanognes. Le cycle catalytique pour la cobalamine serait le suivant. Le citrate de Ti(III) servirait de source d'lectrons. Le cobalt(I) ragirait avec le substrat par oxydation en Co(III) avec le dpart du chlorure et la formation d'une liaison CoC. Nous retrouvons les changements structuraux des liens autour du cobalt* en fonction de l'tat d'oxydorduction, rencontrs prcdemment et expliqus en glossaire. La lettre L symbolise une liaison interne forme sur la cobalamine au cours de ces changements.
Cl H CoI N: Ti(IV) Ti(IV) Ti(III) CoII N Ti(III) L CoIII N H H H H2O H Cl H H H CI H H CI Cl H H H H
CoIII N + CI H H H
1,2-dichlorothane
Le F430 catalyserait un cycle similaire, selon un mode en partie radicalaire et un passage altern du nickel entre Ni(I) et Ni(II). L'attaque du substrat se ferait par Ni(I), le citrate de titane tant utilis comme source d'lectrons. Cette remarquable chimie non enzymatique a t tudie par HOLLIGER et coll. [69] et s'est trouve facilite par les modifications spectrales des catalyseurs. Elle permet de comprendre le mode d'action des mthanognes dans ces dshalognations. Des tudes ont lieu en vue d'applications pour l'assainissement des eaux contamines par des hydrocarbures halogns, notamment au Canada. Une opinion gnralement admise veut que les mthanognes puissent participer des biodgradations dans les sdiments profonds la faveur d'un syntrophisme
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avec d'autres espces. Ils seraient les boueurs terminaux utilisateurs des sousproduits de l'activit de leurs partenaires. C'est peut-tre leur fonction dominante dans les quilibres naturels. On peut les voir en particulier comme des organismes qui contribuent dtoxifier l'acide actique et l'hydrogne. Dans la section suivante, nous rencontrerons des mthanognes dans une symbiose de type original.
4.9 - HYDROGNOSOMES
la fin de ce chapitre o nous avons examin la gense de l'hydrogne, de l'actate et du mthane, il convient de citer une bizarrerie de la nature : les hydrognosomes. Ce sont particules subcellulaires, d'une taille comparable celle des mitochondries (0,5-2 m), observes pour la premire fois dans un eucaryote parasite unicellulaire responsable d'infections vnriennes, Trichomonas vaginalis. On a pu les obtenir l'tat isol et dterminer leur biochimie. Leur proprit essentielle est de produire, en anarobiose, de l'actate partir du pyruvate, ainsi que H2 et CO2 en quantits comparables. En prsence d'oxygne, les particules effectuent une respiration sans faire d'hydrogne, mais dgnrent rapidement sans doute cause de l'apparition de peroxyde et de superoxyde. Le terme d'hydrognosome est d LINDMARK et MLLER [70]. Les hydrognosomes n'ont encore jamais t rencontrs chez les animaux pluricellulaires et les plantes. Ils existent dans les champignons et protozoaires cilis du rumen ainsi que dans les euglnes. Leur structure est assez rudimentaire, comportant le plus souvent une seule membrane. Ils sont en principe dpourvus d'ADN, et leur synthse interne la cellule relve de gnes localiss dans le noyau. Les cellules qui les hbergent n'ont bien souvent ni peroxysomes, ni mitochondries, et vivent gnralement en milieu quasi-anarobie. Les hydrognosomes tiennent lieu de producteurs d'nergie, non pas comme les mitochondries en faisant un potentiel membranaire, mais en synthtisant de l'ATP au niveau du substrat comme dans une fermentation. Un tableau simplifi reprsente le mtabolisme anarobie observ dans ces particules [71]. Il indique les enzymes utilises, et met en vidence le rle d'une ferrdoxine (Fd) contenant des noyaux [2Fe-2S], d'une hydrognase et du coenzyme A (CoA). La dshydrognase 2, d'un type particulier puisqu'elle conduit une dcarboxylation, est couramment appele enzyme malique chez les plantes o elle est omniprsente. Les particules comportent un certain nombre de transporteurs membranaires. Le pyruvate est issu du mtabolisme du glucose. On constate qu'il y a un seul ATP form partir d'une molcule de pyruvate. La transformation de l'actyl-CoA en actate prsente une variante intressante dans les protozoaires du rumen. Il y a d'abord conversion de l'actyl-CoA en actyl-phosphate, et c'est celui-ci qui sert de donneur la synthse d'ATP. Cette particularit est intressante, car elle est typique du mtabolisme des procaryotes dans certaines fermentations. On ne la trouve pas normalement chez les eucaryotes. Un autre caractre tonnant s'observe chez les protozoaires cilis.
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cytoplasme CO2 pyruvate NADH 3 2 Fdox 1 CO2 CoA 2 Fdred 4 actyl-CoA 2 NAD+ malate
hydrognosome
H2 2 H+ 5 succinyl-CoA 6 ATP ADP Pi actate
succinate
1 - Pyruvate-ferrdoxine oxydorductase 2 - Malate dshydrognase (enz. malique) 3 - NAD-ferrdoxine oxydorductase
4 - Hydrognase 5 - Actate-succinate CoA transfrase 6 - Succinate thiokinase
Tous ceux qui ont des hydrognosomes hbergent en mme temps des endosymbiontes. Les hydrognosomes et les symbiontes sont en contact assez troit l'intrieur des cellules. On s'est aperu que ces derniers taient des archaebactries mthanognes, trahis par la fluorescence de leur cofacteur F420 ! L'explication serait la suivante. Les mthanognes rcuprent le gaz carbonique et l'hydrogne, ventuellement l'actate, pour la synthse du mthane. Des changes ont lieu l'intrieur de la cellule. Les cilis dpourvus d'endosymbiontes produisent de l'hydrogne, ceux qui en possdent n'en font pas. Il y a des cas particuliers. Par exemple Giardia intestinalis, un agent banal des dsordres intestinaux, n'a pas d'hydrognosomes, et pourtant il fait de l'hydrogne, ce qui constitue une nigme [72] ! Il s'avre que les protozoaires et champignons hydrognosomes sont peut-tre lgion dans l'environnement. Au fond ces particules aident les cellules survivre dans un environnement anarobie, ce que la plupart des eucaryotes ne font que difficilement ou au prix de mtabolismes d'attente insuffisants pour la croissance. Les hydrognosomes participent au flux mtabolique de la cellule et contribuent faire de l'ATP. Mais la question de leur nature et de leur origine se pose. Ils prsentent avec les mitochondries des analogies certaines. Les similitudes portent sur les squences de diverses protines comme les ferrdoxines [73], la succinate thiokinase [74], l'adenylate kinase et des protines de transport. Un indication trs probante est la similitude constate entre les protines dites du stress*, Hsp60 et Hsp70 parmi les bactries, les mitochondries et les hydrognosomes. La parent avec les mitochondries a fait l'objet de nombreuses spculations.
237
Les mitochondries sont supposes driver des -protobactries. Il est possible que les hydrognosomes rsultent d'une ou plusieurs symbioses survenues avant l'apparition des mitochondries dans les cellules des eucaryotes [75]. La dgradation des bactries d'origine serait alle plus loin, conduisant la capture totale du matriel gntique au profit du noyau, alors que les mitochondries conservent encore un ADN et des synthses autonomes. Une autre hypothse consiste supposer une origine commune aux mitochondries et aux hydrognosomes. Les premires mitochondres auraient colonis des eucaryotes primitifs dots d'un mtabolisme anarobie. Ces premires mitochondries auraient pu faire de l'ATP par respiration anarobie sur fumarate et nitrate, contrairement aux mitochondries de la quasitotalit des eucaryotes modernes qui utilisent le dioxygne. Des mitochondries utilisatrices de nitrate ont t aperues chez divers champignons et protozoaires amens manquer d'oxygne dans leur habitat. Les hydrognosomes auraient donc pu driver des mitochondries les plus primitives. La question a t relance par la dcouverte d'un ADN dans certains hydrognosomes prsents dans Nyctotherus ovalis, un cili htrotriche de l'intestin des grandes blattes (Periplaneta americana). L'ADN a t dtect par une mthode immunologique. L'amplification de cet ADN et l'examen d'une squence de 3,6 kb rvle un segment susceptible de coder pour une hydrognase fer seul, avec des sites de liaison pour le FAD et NAD+ qui suggrent une fonction de roxydation de NADH [76]. L'hydrognase prsume serait bien code en partie par l'ADN des hydrognosomes, et en partie par l'ADN nuclaire. Cette question originale et intressante pose encore plus de questions qu'elle n'en rsoud. Tous les organismes dtenteurs d'hydrognosomes vivent dans des niches cologiques anarobies ou faible taux d'O2. Ils sont nanmoins disperss dans plusieurs groupes volutifs qui contiennent des espces voisines hbergeant toutes des mitochondries. Il est donc probable qu'il y a plusieurs lignes conduisant aux hydrognosomes. L'volution et la signification de ces tranges symbiontes sont encore des challenges pour la recherche. Cette question indite et encore entoure de mystre termine point nomm un chapitre o les solutions naturelles originales n'ont pas manqu.
CONCLUSION
Dans ce chapitre nous avons ajout une pice au grand cycle du carbone dans la biosphre, soulign le rle central de l'acide actique, rencontr la biochimie trs particulire de la mthanognse. Les organismes responsables contribuent tendre aux milieux anarobies le champ des biodgradations. Ils ont diverg et se sont diversifis depuis une priode trs ancienne, utilisant des mcanismes qui ont fonctionn tout au long de la longue priode d'volution pour laquelle nous avons des traces. Dans le chapitre suivant, nous reviendrons au cycle de l'azote, dj entrevu avec l'oxydation de l'ammoniac, pour entrer dans des tapes essentielles observes l encore dans les milieux anarobies.
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RFRENCES
[1] V I G N A I S PM & C O L B E A U A (2004) Curr. Issues Mol. Biol. 6 : 159-188. [2] G H I R A R D I ML, Z H A N G L, L E E JW , F L Y N N T, S E I B E R T M, G R E E N B A U M E & M E L I S A. (2000) Trends Biotechnol. 18 : 506-511. [3] V O L B E D A A, C H A R O N MH , P I R A S C , H A T C H I K I A N EC , F R E Y M & F O N T E C I L L A - C A M P S JC . (1995) Nature 373 : 556-557 ; F O N T E C I L L A - C A M P S JC , F R E Y M, G A R C I N E, H A T C H I K I A N C , M O N T E T Y , P I R A S C , V E R N E D E X & V O L B E D A A ( 1997) Biochimie 79 : 661- 66 6 ; H I G U C H I Y , O G A T A H , M I K I K, Y A S U O K A N & Y A G I T (1999) Structure Fold 7 : 549-556 ; D E L A C E Y AL, S A N T A M A R I A E, H A T C H I K I A N EC & F E R N A N D E Z VM (2000) Biochim. Biophys. Acta 1481 : 371-380. [4] V O L B E D A A, G A R C I N E, P I R A S C , D E L A C E Y AL, F E R N A N D E Z VM, H A T C H I K I A N EC , F R E Y M & F O N T E C I L L A - C A M P S JC (1996) J. Am. Chem. Soc. 118 : 12989-12996. [5] V I G N A I S PM, B I L L O U D B & M Y E R J (2001) FEMS Microbiol. Rev. 25 : 455-501. [6] R O B E R T S LM & L I N D A H L PA (1995) J. Am. Chem. Soc. 117 : 2565-2572 ; P A V L O V M, S I E G B A H N PEM , B L O M B E R G MRA & C R A B T R E E RH (1998) J. Am. Chem. Soc. 120 : 548-555 ; C A M M A C K R (1999) Nature 397 : 214-215. [7] V I G N A I S PM, D I M O N B, Z O R I N NA, T O M I Y A N M A M & C O L B E A U A (2000) J. Bacteriol. 182 : 5997-6004. [8] G A R C I N E, V E R N E D E X, H A T C H I K I A N EC , V O L B E D A A, F R E Y M & F O N T E C I L L A - C A M P S JC (1999) Structure Fold 7 : 557-566. [9] P I E R I K AJ, R O S E B O O O M W , H A P P E RP, B A G L E Y KA & A L B R A C H T S P (1999) J. Biol. Chem. 274 : 3331-3337 ; G A R C I N E, V E R N E D E X, H A T C H I K I A N EC , V O L B E D A A, F R E Y M & F O N T E C I L L A - C A M P S JC (1999) Structure Fold 7 : 557-566. [10] P E T E R S JW , L A N Z I L O T T A W N, L E M O N BJ & S E E F E L D T LC (1998) Science 282 : 1853-1858 ; N I C O L E T Y , P I R A S C , L E G R A N D P, H A T C H I K I A N EC & F O N T E C I L L A - C A M P S JC (1999) Structure 7 : 13-23. [11] G L O A G U E N F, L A W R E N C E JD , S C H M I D T M, W I L S O N S R & R A U C H F U S S TB (2001) J. Amer. Chem. Soc. 123 : 12518-12527. [12] V O O R D O U W G (2000) Biophys. Chem. 86 : 131-140 ; D U B I N I A & S A R G E N T F (2003) FEBS Lett. 549 : 141-146. [13] V I G N A I S PM, D I M O N B, Z O R I N NA, C O L B E A U A & E L S E N S (1997) J. Bacteriol. 179 : 290-292. [14] R I C H A U D P, C O L B E A U A, T O U S S A I N T B & V I G N A I S PM (1991) J. Bacteriol. 173 : 5298-5392 ; E L S E N S , C O L B E A U A, C H A B E R T J & V I G N A I S PM (1996) J. Bacteriol. 178 : 5174-5181 ; E L S E N S , C O L B E A U A & V I G N A I S PM (1996) J. Bacteriol. 179 : 968-971. [15] E L S E N S , D U C H O & C O L B E A U A (2003) J. Bacteriol. 185 : 7111-7119. [16] D I S C H E R T W , V I G N A I S PM & C O L B E A U A (1999) Mol. Microbiol. 34 : 995-1006. [17] E L S E N S , D I S C H E R T W , C O L B E A U A & B A U E R C E (2000) J. Bacteriol. 182 : 2831-2837.
239
[18] S W E M LR, K R A F T BJ, S W E M D L, S E T T E R D A H L AT, M A S U D A S , K N A F F D B, Z A L K E S K I JM & B A U E R C E (2003) EMBO J. 22 : 4699-4708. [19 L J U N G D A H L LG (1986) Annu. Rev. Microbiol. 40 : 415-450 ; R A G S D A L E S W (1997) Bio Factors 9 : 1-9. [20] M A K, S I E M O N S & D I E K E R T G (1987) FEMS Microbiol. Lett. 43 : 367-371. [21] K S E L K, K A R N H O L Z A, T R I N K W A L T E R T, D E V E R E U X R, A C K E R G & D R A K E H L (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 4734-4741. [22] K A R N H O L Z A, K S E L K & G N E R A, S C H R A M M A, D R A K E H L (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68 : 1005-1009. [23] W E L L S B U R Y P, G O O D M A N K, B A R T H T, C R A G G BA, B A R N E S S P & P A R K E S RJ (1997) Nature 388 : 573-576. [24] M E N O N S & R A G S D A L E S W (1996) Biochemistry 35 : 15814-15821. [25] F U R D U I C & R A G S D A L E S W (2000) J. Biol. Chem. 275 : 28494-28499. [26] M E N O N S & R A G S D A L E S W (1999) J. Biol. Chem. 274 : 11513-11518. [27] M E N O N S & R A G S D A L E S W (1998) Biochemistry 37 : 5689-5698. [28] D O U K O V T, S E R A V A L L I J, S T E Z O W S K I JJ & R A G S D A L E S W (2000) Structure Fold Des. 8 : 817-830. [29] S E R A V A L L I J, Z H A O S & R A G S D A L E S W (1999) Biochemistry 38 : 5715-5728. [30] K E R B Y RL, H O N G S S , E N S I G N S A, C O P P O C LJ, L U D D E N PW & R O B E R T S G P (1992) J. Bacteriol. 174 : 5284-5294. [31] Q I U D , K U M A R M, R A G S D A L E S W & S P I R O TG (1994) Science 264 : 817-819. [32] S E R A V A L L I J, G U W , T A M A, S T R A U S S E, C R A M E R S P & R A G S D A L E S W (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100 : 3689-3694. [33] R O B E R T S JR, L U W - P & R A G S D A L E S M (1992) J. Bacteriol. 174 : 4667-4676. [34] D A R N A U L T C , V O L B E D A A, K I M EJ, L E G R A N D P, V E R N E D E X, L I N D A H L PA & F O N T E C I L L A - C A M P S JC (2003) Nat. Struct. Biol. 10 : 271-279. [35] L O K E H K, B E N N E T T G N & L I N D A H L PA (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 : 12530-12535. [36] G O L D T (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 6045-6049. [37] H A C K S T E I N JH & S T U M M C K (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 91 : 5441-5445. [38] G R O K O P F R, J A N S S E N PH , L I E S A C K W (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 960-969 ; G R O K O P F R , S T U B N E R S , L I E S A C K W (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 4983-4989. [39] W .S . R E E B U R G H & coll. (1991) Deep Sea Res. 38 : 1189-1210. En Juillet 1996 s'est runie Istambul une premire confrence internationale destine faire l'tat des lieux et proposer des mesures au niveau mondial. [40] B U L T C J & coll. (1996) Science 273 : 1058-1073 ; S M I T H D R & coll. (1997) J. Bacteriol. 179 : 7135-7155. [41] B L A U T M & G O T T S C H A L K G (1985) Trends Biochem.Sci. 10 : 486-489 ; L A N C A S T E R JR (1989) J. Bioenerg. Biomembr. 21 : 717-740. [42] F E R R Y JG (1999) FEMS Microbiol.Rev. 23 : 13-38 ; S C H F E R G , E N G E L H A R D M & M L L E R V (1999) Microbiol. Molecul. Biol. Rev. 63 : 1092-2172. [43] K A R R A S C H M, B O R N E R G , E N S S L E M & T H A U E R RK (1990) Eur. J. Biochem. 394 : 167-172.
240 [44] T H A U E R RK (1998) Microbiology 144 : 2377-2406.
[45] C H I S T O S E R D O V A L, V O R H O L T JA & T H A U E R RK, L I D S T R O M ME (1998) Science 281 : 99-102. [46] K U N O W J, S H I M A S , V O R H O L T JA & T H A U E R RK (1996) Arch. Microbiol. 165 : 97-105. [47] E R M L E R U, M E R C K E L M, T H A U E R R & S H I M A S (1997) Structure 5 : 635-646. [48] E N S S L E M, Z I R N G I B L C , L I N D E R D , T H A U E R RK (1991) Arch. Microbiol. 155 : 483-490 ; K L E I N AR, K O C H J, S T E T T E R KO & T H A U E R RK (1993) Arch. Microbiol. 160 : 186-192. [49] K L E I N AR & T H A U E R RK (1995) Eur. J. Biochem. 227 : 169-174. [50] Z I R N G I B L C , V A N D O N G E N W , S C H W O R E R B, V O N B U N A U R, R I C H T E R M, K L E I N A & T H A U E R RK (1992) Eur. J. Biochem. 208 : 511-520. [51] S C H W R E R B, F E R N A N D E Z VM, Z I M G I B L C & T H A U E R RK (1993) Eur. J. Biochem.212 : 255-261 ; T H A U E R RK, K L E I N AR & H A R T M A N N G C (1996) Chem. Rev. 96 : 3031-3042 ; A F T I N G C , K R E M M E R E, B R U C K E R C , H O C H E I M E R A & T H A U E R RK (2000) Arch. Microbiol. 174 : 225-232. [52] B R O M M E L S T R O E T BW J , G E E R T S W J, K E L T J E N S JT, V A N D E R D R I F T C & V O G E L S G D (1991) Biochim. Biophys. Acta 1079 : 293-302. [53] B E C H E R B, M U L L E R V, G O T T S C H A L K G (1992) J. Bacteriol. 174 : 7656-7660 ; G A R T N E R P, W E I S S D S , H A R M S U & T H A U E R RK (1994) Eur .J. Biochem. 226 : 465-472 ; L I E N A R D T, B E C H E R B, M A R S C H A L L M, B O W I E N S & G O T T S C H A L K G (1996) Eur. J. Biochem. 239 : 857-864. [54] L I E N A R D T & G O T T S C H A L K G (1998) FEBS Lett. 425 : 204-208. [55] R O S P E R T S , L I N D E R D , E L L E R M A N N J & T H A U E R RK (1990) Eur. J. Biochem. 194 : 871-877 ; E R M L E R U, G R A B A R S E W , S H I N A S , G O U B E A U D M & T H A U E R RK (1997) Science 278 : 1457-1462. [56] A B K E N H J, T I E T Z E M, B R O D E R S E N J, B A M E R S , B E I F U S S U, D E P P E N M E I E R U (1998) J. Bacteriol. 180 : 2027-2032. [57] D E P P E N M E I R U,M L L E R V & G O T T S C H A L K G (1996) Arch. Microbiol. 165 : 149-163 ; I D E T, B A M E R S & D E P P E N M E I R U (1999) J. Bacteriol. 181, 4076-4080. [58] S I M I A N U M, M U R A K A M I E, B R E W E R M & R A G S D A L E S W (1998) Biochemistry 37 : 10027-10039. [59] B R O D E R S E N J, B A M E R S , A B K E N H J, G O T T S C H A L K G & D E P P E N M E I E R U (1999) Eur. J. Biochem. 259 : 218-224. [60] R U P P E R T C , W I M M E R S S , L E M K E R T, M L L E R V (1998) J. Bacteriol. 180 : 3448-3452. [61] V A N B E E L E N P, L A B R O JF, K E L T J E N S JT, G E E R T S W J, V O G E L S G D , L A A R H O V E N W H , G U I J T W & H A A S N O O T C A (1984) Eur. J. Biochem. 139 : 359-365. [62] S H I E H J & W H I T M A N W B (1988) J. Bacteriol. 170 : 3072-3079. [63] O L S E N G J & W O E S E C R (1996) Trends Genet. 12 : 377-379 ; H U B E R C & W A C H T E R S H A U S E R G (1997) Science 276 : 245-247. [64] R A G S D A L E S W (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2 : 208-215. [65] G R A H A M E D A (1991) J. Biol. Chem. 266 : 22227-22233 ; G R A H A M E D A & D E M O L L E (1991) J. Biol. Chem. 271 : 8352-8358 ; M U R A K A M I T & R A G S D A L E S W (2000) J. Biol. Chem. 275 : 4699-4707. [66] K R Z Y C K I JA, M O R T E N S O N LE & P R I N C E RC (1989) J. Biol. Chem. 264 : 7217-7221. [67] K I S K E R C , S C H I N D E L I N H , A L B E R BE, F E R R Y JG & R E E S D C (1996) EMBO J. 15 :2323-2330.
4 - HYDROGNE - ACTATE - MTHANE [68] Z E N G L E R K, R I C H N O W H H , R O S S E L L - M O R A R, M I C H A E L I S W & W I D D E L F (1999) Nature 401 : 266-269. [69] H O L L I G E R C , S C H R A A G , S T U P P E R I C H E, S T A M S AJM & Z E H N D E R AJB (1992) J. Bacteriol. 174 : 4427-4434. [70] L I N D M A R K D G & M L L E R M (1973) J. Biol. Chem. 248 : 7724-7728. [71] M L L E R M (1993) J. Gen. Microbiol. 139 : 2879-2889. [72] L L O Y D D , R A L P H S JR & H A R R I S JC (2002) Microbiology 148(Pt 3) : 727-733. [73] J O H N S O N PJ, D ' O L I V E I R A C E, G O R R E L L TE & M L L E R M (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87 : 6097-6101. [74] L A H T I C J, D ' O L I V E I R A C E & J O H N S O N PJ (1992) J. Bacteriol. 174 : 6822-6830. [75] B A R O I N - T O U R A N C H E A U A, D E L G A D O P, P E R A S S O R & A D U O T T E A (1992) Proc. Natl. cad. Sci. 89 : 9764-9768 ; D Y A L L S D & J O H N S O N PJ (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3 : 404-411. [76] A K H M A N O V A A, V O N C K E N F, V A N A L E N T, V A N H O E K A, B O X M A B, V O G E L S G , V E E N H U I S M & H A C K S T E I N JH P (1998) Nature 396 : 527-528.
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CHAPITRE 5 AZOTE ET ANAROBIOSE

Le cycle de l'azote passe par des tapes essentielles qui sont l'azote atmosphrique, l'ammoniac et le nitrate. Les aspects essentiels dvelopps ici sont l'assimilation du premier et la dnitrification qui rduit par tapes le nitrate en N2. L'assimilation de N2 n'est ralise que par des procaryotes grce leur nitrognase. La dnitrification fournit une part importante de l'nergie ncessaire au recyclage de la matire organique l'abri de l'air. Elle met en jeu des outils spcifiques. L'alternance entre les conditions arobies et anarobies dans une mme espce bactrienne met en jeu des remaniements physiologiques importants qui sont voqus la fin de ce chapitre. 5.1 - Le cycle biologique de lazote 5.2 - Ceux qui assimilent lazote 5.3 - La nitrognase 5.4 - Contrle de lassimilation de lazote 5.5 - Les voies du nitrate 5.6 - Le passage lanarobiose 5.7 - Une optimisation trs pousse 245 248 252 258 264 270 275
5 AZOTE ET ANAROBIOSE
Les biodgradations et le recyclage de la matire organique dans la biosphre dpendent pour une part de la dnitrification. Ce procd consiste utiliser l'ion nitrate comme accepteur d'lectrons en l'absence d'oxygne, et son intervention est considrable dans les biodgradations anarobies. Le nitrate est une tape fondamentale du cycle de l'azote dans la nature, comme l'est l'azote atmosphrique. Le cycle de l'azote constitue donc un tout, sans lequel on ne pourrait pas comprendre bon nombre des transformations de la biosphre.
5.1 - LE CYCLE BIOLOGIQUE DE LAZOTE

Compar au carbone, loxygne et lhydrogne, lazote est un constituant minoritaire des tres vivants, mais il est tout aussi essentiel comme chacun sait. Lazote fait souvent partie des lments limitants au cours de la croissance des plantes, sinon nul serait le besoin dutiliser autant de fertilisants azots dans lagriculture. La biosphre est en contact avec deux grands rservoirs dazote. Le premier est latmosphre, o N2 est la principale forme (78%) conjointement des composs mineurs tels que les oxydes dazote et le gaz ammoniac. Le second est constitu par le sol et les ocans [1]. L'azote est immobilis en grande quantit dans des roches o il nest pas mobilisable par les tres vivants. Il y est trs ingalement rparti, abondant sous forme de KNO3 dans le salptre et de NaNO3 dans les vaporites. Les nitrates du Chili proviennent notamment de l'important gisement de nitrate de sodium des hauts plateaux dsertiques et secs de l'Altacama. Lammonium existe en faible proportion dans les roches cristallines, o il peut remplacer le potassium des minraux. Une teneur en azote relativement leve (200 4000 ppm) sobserve dans le granite et rsulte sans doute de lassimilation de roches sdimentaires au cours de lintrusion du magma. La quantit dazote log dans les roches sdimentaires, majoritairement sous forme organique, atteindrait 1015 tonnes, principalement dans les schistes et ptroles, et le sol vgtal superficiel ne contiendrait finalement quune part trs minime de lazote terrestre. La teneur en azote dun sol est videmment trs variable. Elle oscille couramment autour de 5% en poids de N, principalement sous forme organique. Lazote directement assimilable par les tres vivants pour leurs synthses doit se trouver sous forme ammoniacale, cest--dire ltat le plus rduit. C'est sous cette forme qu'il sera intgr dans les acides amins et autres matriaux de base. Le tableau est un petit aide-mmoire pour ces voies dentre :
246 Enzyme
Glutamate dshydrognase* Aminotransfrases*
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Principe ractionnel

2-oxoglutarate + NH3 + NAD(P)H, H+ F L-Glutamate + NADP+ + H2O
Glutamine synthtase* L-Glutamate + NH3 + ATP T L-Glutamine + ADP + phosphate Glutamate synthase*
L-Glutamate + 2-oxoacide F 2-oxoglutarate + acide amin
L-Glutamine + 2-oxoglutarate + NAD(P)H, H+ F 2 L-Glutamate + NADP+
Pour de trs nombreuses espces bactriennes, les ions ammonium offrent la source azote la plus favorable la croissance. On observe galement que sur un milieu riche en ammonium, la synthse des enzymes qui permettraient l'utilisation d'autres sources azotes est souvent rprime. L'activit de la glutamine synthtase est essentielle l'assimilation azote quand le milieu est pauvre en ammonium, mais elle est son niveau le plus bas si le milieu est riche en azote ammoniacal. La glutamine sert la fois d'acide amin pour la construction des protines et comme donneur d'azote dans des synthses de constituants cellulaires aussi essentiels que les bases des acides nucliques L'activit de l'enzyme est donc gnralement contrle en fonction du taux d'ammonium disponible, de faon qu'il y ait toujours suffisamment de glutamine pour le mtabolisme. Tandis que le taux de glutamine synthtase est son minimum en excs de source azote, une deuxime voie d'entre par la glutamate dshydrognase devient prpondrante. Inversement une disette en azote entrane une monte de la glutamine synthtase, dont le produite engendre du glutamate par le jeu de la glutamate synthase. Or l'azote des constituants organiques cellulaire vient du glutamate pour environ 85% ! Le cycle de lazote dans la biosphre est reprsent sur le schma suivant sous une forme trs simplifie dicte par les seuls objectifs immdiats de l'environnement. La quantit globale dazote est rgle par les apports provenant surtout de latmosphre, et par les pertes dues aux missions de gaz (N2, N2O, NH3 et composs mineurs). Lactivit humaine perturbe cet quilibre par lusage des fertilisants, la dforestation, la combustion des carburants fossiles et diverses pollutions. On sait que le nitrate est la source azote prfre des vgtaux, car il est vhicul des racines aux parties ariennes et facilement rduit en ammoniac par le pouvoir rducteur n de la photosynthse. Certaines plantes utilisent aussi lammonium, en particulier des essences forestires quand lacidit du sol nuit la nitrification [2]. La prsence de la microflore autour des racines (rhizosphre) est prendre en compte dans tous les cas de figure. Le nitrate ne concerne pas que les vgtaux terrestres. Sa rpartition a une grande importance dans la biologie des ocans la faveur des migrations du phytoplancton. Des tudes ont montr que des organismes tributaires de la photosynthse comme les diatomes (Rhizosolenia) peuvent effectuer des migrations verticales alternes travers la nitracline*, entre la surface pauvre en azote et les zones profondes plus riches en azote, en phosphates et en matires carbones [3]. Il en rsulte un apport azot la surface de vastes zones ocaniques.
N2 atmosphre 1 2
247
3 6 NH3 4 5 4
nitrate
NH3
Assimilation de N2 par bactries non symbiotiques, phototrophes, cyanobactries Assimilation symbiotique de N2 par bactries des nodules ou au niveau des tiges Dcompositions animales et vgtales, interconversions au niveau de la microflore Nitrification (en plusieurs tapes) par des chimio-lithotrophes Assimilation du nitrate par les plantes et les micro-organismes Dnitrification en oxydes dazote, N2 tant le stade final
Cycle de l'azote
La biosphre s'appauvrirait en azote sans une recharge partir de latmosphre. La rduction de N2 en ammoniac est lexclusivit absolue des procaryotes vivant dans le sol, les ocans ou en symbiose avec des plantes. Lenzyme cl est la nitrognase. Les cyanobactries unicellulaires ou filamenteuses du nanoplancton ocanique ( Trichodesmium, Richelia) apporteraient u n e contribution autrefois insouponne dans l'conomie azote de la vie sur la plante [4]. La fixation de lazote en milieu continental est ralise aussi par de nombreuses cyanobactries et des organismes qui ne sont pas tous phototrophes. Certaines bactries vivent ltat libre (type Azotobacter), dautres sont symbiotiques comme les Rhizobium et Frankia. Ce flux dentre dans les sols et les eaux compense, au moins en partie, les pertes dues la dnitrification. Celle-ci est catalyse par les bactries en respiration anarobie, change le nitrate en nitrite puis en oxydes (NO, N2O), et enfin en N2. Il en sera question plus loin dans ce chapitre. Dans les conditions naturelles la charge totale de lazote du sol cre des conditions limitantes. Lazote y est reprsent en majorit (autour de 80%) par des rsidus organiques provenant de la dcomposion des matires animales et vgtales. Lazote disponible est donc de premire importance non seulement pour lagriculture mais dans les recyclages nombreux et varis que les micro-organismes sont amens pratiquer. Les techniques dassolement de lagriculture traditionnelle utilisent comme "engrais vert" les plantes fixatrices dazote comme le trfle ou la luzerne. Un quivalent existe dans la culture du riz, grce aux petites fougres du genre Azolla porteuses de cyanobactries assimilatrices dazote.
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La recherche de productivit outrance ne se contente plus des anciennes techniques agricoles et a recours massivement aux engrais, notamment aux nitrates. Lemploi de ces derniers grande chelle cre les problmes denvironnement quon sait. Les nitrates en excs sont facilement entrans jusque dans les aquifres et les cours deau, o leur teneur peut dpasser largement les taux acceptables, soit 50 mg . L1 pour les nitrates, 0,1 mg . L1 pour les nitrites. L'apport des nitrates dans les eaux ctires est responsable des "mares vertes" constates depuis quelques annes l'embouchure de plusieurs rivires armoricaines, diffrentes formes d'eutrophisation accompagnent la prolifration d'algues vertes (ulves) et du phytoplancton contenant des espces toxiques (Alexandrium minutum). L'excs de nitrate a aussi l'inconvnient d'exacerber la dnitrification gnratrice doxydes dazote comme loxyde nitreux (N2O), qui est un gaz effet de serre. Peu ractif, sa dure de vie dans latmosphre est trs longue et cre au niveau de la stratosphre des ractions secondaires destructrices de la couche dozone. Leffet dun autre produit, loxyde nitrique (NO) est au contraire de contribuer la formation dozone, non pas trs haute altitude mais dans la troposphre, par une raction photochimique utilisant aussi les hydrocarbures et les gaz dchappement mis par la circulation automobile. Laccroissement continuel de la population du globe devrait saccompagner dune augmentation de la production agricole et de llevage. Le recours des engrais azots peut sembler inluctable, mais le dveloppement de nouvelles techniques agricoles (culture bio, culture raisonne) sefforcent dy remdier et de limiter la pollution par les nitrates. Des experts ont calcul que lemploi dengrais vert et de fumier animal permet desprer un apport annuel de 200 kg dazote par hectare de terre arable, et de nourrir 15 personnes dans les conditions les plus favorables possibles. Le chiffre est en ralit infrieur, cause de lutilisation de fourrage, de la culture de plantes non destines lalimentation, des incidences climatiques Le recours aux engrais azots artificiels est parfois ncessaire, notamment dans les pays en voie de dveloppement. Lhistoire retiendra sans doute la dcouverte de la synthse de lammoniac par le procd HABER-BOSCH, comme une perce technique majeure faite lore du XXme sicle. Lconomie azote de lenvironnement na pas que des incidences sur lagriculture. Ses rpercussions sont nombreuses et complexes sur la microflore, lactivit des biodgradations et des recyclages divers concernant aussi bien les dchets naturels que les pollutions de source humaine. Cela sera la toile de fond de cette introduction.
5.2 - CEUX QUI ASSIMILENT LAZOTE

Lair que nous respirons reprsente pour la biosphre un colossal rservoir dazote. Lentre de lazote ou dinitrogne (N2) chez les tres vivants a des incidences profondes sur lenvironnement, car elle est une phase cl du cycle de lazote. On ne peut la disjoindre du problme gnral des biodgradations, car beaucoup de germes assimilateurs contribuent aux quilibres naturels et participent directement ou indirectement des transformations diverses. Elle encourage le dveloppement
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de la vie dans des rgions arides ou sur des sols trs pauvres qui sont ventuellement contamins par les rejets de lactivit humaine. On se contentera ici de repres assez succincts. Pour bien comprendre les contraintes biologiques svres de la fixation de N2, il convient de se rappeler les lments suivants. La nitrognase est une enzyme procaryotique et cytoplasmique. Elle catalyse la raction : N2 + 8 e + 8 H+ + n ATP 2 NH3 + H2 + n ADP + n Pi La rduction dune molcule de N2 est irrversible et ncessite 8 lectrons. Elle ne produit pas que de lammoniac (ou des ions ammonium) mais gnre aussi de lhydrogne et hydrolyse de lATP raison dau moins 2 molcules par lectron (n est gal au minimum 16). Lenzyme est donc extraordinairement gourmande en nergie. En outre la source dlectrons exige est bas potentiel, le plus souvent une ferrdoxine rduite. Enfin une dernire contrainte est de taille, car lenzyme est immdiatement inactive par O2. On en dduit que lassimilation de lazote ne peut se faire que dans un environnement sans oxygne. Par des espces anarobies ? Pas ncessairement, si loxygne nest prsent quau compte-goutte ou s'il est consomm si rapidement la surface de la cellule quil na pas le temps de diffuser jusqu' la nitrognase. Les organismes assimilateurs de N2 sont des eubactries et archaebactries procaryotes rpartis dans plus de 100 genres. Certains fixent lazote en vivant ltat libre, dautres le font au cours d'une symbiose. Quels sont les organismes de la premire catgorie ? On y rencontre des anarobies stricts comme Clostridium pasteurianum, bactries tirant leur nergie de fermentations varies et sophistiques, et communes dans les matires vgtales en dcomposition. Des anaorobies facultatifs font partie des -protobactries (le groupe o se situe le colibacille). Klebsiella aerogenes et K. oxytoca sont des fixateurs d'azote trs tudis. On peut citer des espces arobies appartenant aux -protobactries (Azotobacter chroococcum et Az. vinelandii), et des -protobactries souvent prsentes dans la rhizosphre des plantes : Azospirillum brazilense, Azospirillum lipoferum. Les fixateurs d'azote sont galement nombreux chez les phototrophes non oxygniques comme Rhodobacter capsulatus e t Rodospirillum rubrum, ou parmi les cyanobactries (Anabaena, Nostoc). Diverses espces bactriennes spcialises se rencontrent ici et l dans la taxonomie (Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae). Ils convient de citer enfin divers mthanognes, comme Methanococcus maripaludis ou Methanosarcina barkeri. Une espce trs tudie est Azospirillum brasilense, car ce germe Gram-ngatif colonise les rhizosphres de plantes telles que les crales cultives et diverses monocotyldones tropicales. Cette espce versatile peut crotre en arobiose, anarobiose o dans les conditions micro-arophiles compatibles avec la fixation de N2 et ralises dans les rhizosphres. En labsence dair, les bactries peuvent tirer leur nergie de la dnitrification (section 5) [5]. faible concentration doxygne, une oxydase respiratoire puissante de type cytochrome cbb3 leur fournit lnergie ncessaire la fixation de lazote [6]. De faon gnrale, la fixation de lazote en prsence d'O2 exige des adaptations particulires. Aerobacter peut tolrer une teneur assez forte en oxygne parce que les oxydations respiratoires de ces bactries sont assez rapides pour l'ponger avant quil n'atteigne la nitrognase. Les cyanobactries fixatrices de N2 sont confrontes un problme
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particulirement critique puisque leur photosynthse fabrique du dioxygne. Elles y font face par des adaptations physiologiques spciales. Lune delles consiste cantonner l'assimilation de lazote des cellules spciales (htrocystes), o la production d'O2 par le PS2 est mise en veilleuse. L'autre solution consiste faire fonctionner la photosynthse et lassimilation en alternance. La seconde catgorie des organismes fixateurs concerne des symbioses avec des plantes ou des champignons. Trois situations diffrentes sont reprsentes par les Rhizobium et organismes de la mme famille, les Frankia, et les cyanobactries dans les lichens. Les Rhizobium et organismes voisins colonisent typiquement les racines de plantes lgumineuses herbaces (fve, luzerne) ou ligneuses (robiniers, acacias). Les bactries pntrent les racines par les poils absorbants et provoquent la formation de nodules dans lesquels elles subissent une transformation en bactrodes.
Cortex de la racine
Nodule en formation
Les germes sont attirs par des substances flavonodes mises par la plante. Ils rpondent par un signal chimique que la plante reconnat laide dune lectine* 1. Les deux partenaires se modifient mutuellement au cours de la symbiose. Les cellules bactriennes entrent par un poil absorbant, perdent leur membrane externe et changent de forme, tout en produisant une cytokinine (sorte dhormone de croissance). L'entre des bactries est lorigine dune tumorisation locale conduisant la formation dun nodule. Celui-ci peut se comparer une galle, une raction de dfense l'invasion trangre. Les cellules bactriennes de leur ct sont assez profondment modifies par la nouvelle situation. Enfermes dans une vacuole, elles subissent un remaniement important qui les conduit exploiter les facilits apportes par le vgtal. Mais elles sont destines dgnrer et disparatre sous l'effet des dfenses de la plante. Le principe de cette association est donc fort complexe. Cette symbiose tient la fois de l'infection, du parasitisme, de ractions de dfense et d'un quilibre assez tonnant entre des changes mtaboliques qu'on pourrait considrer comme des bnfices mutuels. Il y a induction de la nitrognase, rduction de N2 et apparition de divers caractres biochimiques qui autoriseront des changes de composs organiques avec lhte. Les bactrodes ont besoin de beaucoup dnergie quils tirent doxydations par loxygne, et reoivent celui-ci de la plante qui fabrique au niveau des nodules une protine fixatrice de O2, la leghmoglobine. Celle-ci est une hmoprotine analogue lhmoglobine de notre sang. Elle capte l'oxygne avec une trs haute affinit, et le distille
1 - Un ttrasaccharide sulfat et porteur d'une chane hydrophobe, qui fonctionne en quelque sorte comme une cl de sret reconnue par la serrure (la lectine).
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en petite quantit aux bactrodes [7] selon un dosage critique prservant l'intgrit de la nitrognase. Chose curieuse, les bactrodes ne sont pas capables de fabriquer par eux-mmes des molcules azotes partir de lammonium quils produisent. Cest la plante qui rcupre lammonium, et les bactrodes recevront en retour du glutamate et des substrats carbons comme le malate et le fumarate. Lassociation symbiotique est gnralement trs spcifique, chaque souche ninfectant quune espce de plante ou une gamme trs limite dhtes. Un thme de recherche important consiste slectionner des souches capables de sassocier avec une gamme de plantes cultives plus tendue. Les Frankia sont des bactries du sol organises en filaments pluricellulaires ou hyphes et appartenant au groupe des actinomyctales. La symbiose seffectue avec de nombreuses espces vgtales, souvent des arbres et arbustes croissant sur des terrains arides ou extrmement pauvres, soit pas moins de 200 dicotyldones appartenant 25 genres et 8 familles diffrentes [8]. Citons les aulnes (Alnus), les filaos (Casuarina, Allocasuarina), largousier (Hyppophae), lolivier de Bohme (Elaeagnus angustifolia), les Myrica et diverses Rosaces comme les Dryas. Les bactries pntrent les racines la faon des Rhizobium, mais leur nodulation des racines est diffrente. Le germe sy propage dans la zone corticale, produit des sporanges et des spores, ainsi que des vsicules servant de rservoir la nitrognase. La spcificit dhte est moins stricte que pour les Rhizobium. Contrairement ces derniers, les Frankia exportent des aminoacides vers la plante plutt que lammonium. La symbiose par les Frankia autorise la conqute naturelle des terrains difficiles, et offre de nombreuses applications pour lamnagement du territoire. Elles concernent le reboisement, la rsistance au sel, au feu, la pollution. Comme exemples simples, les aulnes (A. incana) colonisent les moraines et boulis des montagnes alpines, les filaos diversifis dans les pays chauds sont les pionniers des dunes, des boulis des zones semi-arides et des environnements dont les ressources sont spartiates. Une recherche systmatique des espces vgtales concernes est facilite par lamplification de fragments dADN (technique PCR) et l'emploi de sondes spcifiques, une mthodologie qui a t pratique par exemple en France lUniversit de Lyon [9]. En fait, mme si les arbres tirent bnfice de leur Frankia, linvasion de celui-ci ressemble, comme pour les Rhizobium, un mcanisme infectieux. On en veut pour preuve le taux trs lev de superoxyde dismutase chez les Frankia [10]. Pourquoi ? Lorsquune plante est attaque par un agent infectieux, elle tente de s'en protger par l'mission de superoxyde et de peroxyde [11]. Frankia dclenche cette raction, mais possde les dfenses pour y faire face. Les cyanobactries vivent en association avec des champignons dans certains lichens ou avec des fougres aquatiques (Azolla) dans les rizires 2. Les lichens reprsentent comme on le sait une association symbiotique particulirement pousse entre un champignon ascomycte et un organisme chlorophyllien qui est selon
2 - Lassociation avec Azolla est permanente, dans des lobes latraux des feuilles de fougre. Les cyanobactries (Anabaena) assimilent lazote dans leurs htrocystes. Il y a parfois un troisime larron, qui est un Arthrobacter.
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les espces soit une algue verte du type Trebouxia, soit une cyanobactrie (souvent un Nostoc). Seuls les lichens renfermant un partenaire cyanobactrien sont susceptibles dassimiler directement N2. Le champignon confre au lichen sa morphologie, enveloppe son partenaire phototrophe qui est confin dans certaines zones du thalle, le protge contre la dessiccation, fournit des lments nutritifs et des minraux. Il bnficie en retour des produits carbons de la photosynthse, du glucose par les cyanobactries ou des polyols (mannitol, ribitol) par les algues. Les lichens sont par essence des organismes pionniers. On a souvent dcrit leur sensibilit la pollution atmosphrique des villes, notamment par le dioxyde de soufre. Malheureusement on connat mal leur pouvoir de dcontamination. La lenteur extrme de leur dveloppement et la difficult quil y a de les tudier par les mthodes standards de la microbiologie ne facilitent pas les recherches. Certaines usnes peuvent avoir un dveloppement relativement rapide, mais des lichens comme ceux qui tapissent les rochers ont une croissance atteignant pniblement 1 mm par an. Parmi les nombreux lichens observs dans lAntarctique certains pourraient tre vieux de plusieurs milliers dannes ! Lenzyme qui fixe lazote est une sorte de petit miracle biologique. Nous avons vu que la nitrognase est purement procaryotique, quelle rduit N2 en ammoniac grand renfort dune dpense dnergie sous forme dATP, et quelle fabrique en mme temps de lhydrogne. Le travail de la nitrognase cote cher la cellule, qui a donc intrt ne lutiliser que lorsquelle est vraiment ncessaire. La bonne marche de cette assimilation de lazote obit trois conditions. La premire est une source dnergie suffisante. Chez les bactries phototrophes ou les cyanobactries, l'nergie est apporte par la lumire et la machinerie photosynthtique. Les autres espces se servent de diverses oxydations pour produire cette nergie. La deuxime condition est labsence de molcules azotes minrales ou organiques dans le milieu, car dans le cas contraire le fonctionnement de la nitrognase serait inutilement dispendieux. Il y a donc des systmes rgulateurs qui limitent la synthse de l'enzyme ou son fonctionnement. La troisime condition est labsence de O2 au contact de la nitrognase. En effet loxygne inactive vigoureusement l'enzyme, qui ne peut fonctionner thoriquement quen anarobiose complte. C'est pourquoi une chane respiratoire efficace a un rle protecteur en pongeant les molcules d'oxygne, comme il a t idiqu antrieurement. La section suivante passe rapidement en revue les diffrents aspects de cette question, si fondamentale pour lquilibre de la biosphre que sans lassimilation de N2 les rservoirs azot du monde vivant viendraient certainement spuiser.
5.3 - LA NITROGNASE
La nitrognase est bien une sorte de miracle puisquelle ralise dans des conditions physiologiques ordinaires une opration qui nest ralise dans lindustrie que sous hautes pression et temprature. Les connaissances sur la nitrognase ont fortement progress la suite de lanalyse gntique et des travaux cristallographiques, dont les premiers ont port sur l'enzyme molybdne dAzotobacter
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vinelandii, puis sur celle de Clostridium pasteurianum [12]. Lazote nest pas le seul substrat de lenzyme, qui rduit aussi loxyde nitreux (N2O), les ions cyanure, cyanate, thiocyanate, azoture, et surtout lactylne, qui offre un moyen de dosage par chromatographie en phase gazeuse. La nitrognase d'A. vinelandii rduit le sulfure de carbonyle (COS) en CO + H2S. Dans ce cas particulier, le monoxyde de carbone form est un inhibiteur de l'enzyme, et pour obtenir et mesurer la raction, il est ncessaire d'liminer au fur et mesure le CO en le fixant par l'hmoglobine. Le changement spectral d la formation de la carboxyhmoglobine sert alors mesurer la raction, freine par l'actylne et N2, alors qu'il n'y a pas d'inhibition par l'hydrogne [13]. La nitrognase a toujours une structure complexe constitue de deux parties contenant lune et lautre des centres fer-soufre. Dans le type courant la plus grosse (240 kDa environ), ou dinitrognase, est un ttramre 22 renfermant du fer et du molybdne. On la dsigne parfois comme protine Fe-Mo. La rduction de N2 se fait sur cette portion. La plus petite des deux parties (60 kDa) est la "dinitrognase rductase", un dimre ne contenant quun seul centre fer-soufre. A. vinelandii et d'autres espces renferment aussi deux dinitrognases supplmentaires, dont l'une contient du vanadium la place du molybdne, et une enzyme dite "alternative nitrogenase" ou nitrognase de remplacement, dpourvue la fois de Mo et de V qui sont remplacs par Fe. Les deux parties, rductase et dinitrognase, sont remarquables par la batterie de cofacteurs quelles renferment. La structure constitue de deux parties semblables est symbolise par un diagramme :
site ATP site ATP
symboles des cofacteurs centre P noyau [4Fe-4S] homocitrate cofacteur Fe-Mo
rductase
dinitrognase (protine Fe-Mo)
Les deux parties de la nitrognase

La rductase munie de son centre fer-soufre unique de type [4Fe-4S] reoit des lectrons un un par un donneur qui est soit une ferrdoxine ou une flavodoxine. Ces petites protines ne font que servir dintermdiaires entre une source de dpart (oxydations du mtabolisme, photosynthse) et la rductase. Cette dernire sassocie la dinitrognase (la protine Fe-Mo) et dcharge sur elle chaque lectron un par un au prix de lhydrolyse de 2 ATP. Pour rduire une molcule de N2, la dinitrognase doit donc recevoir un total dau moins 6 lectrons, et mme 8 en comptant la formation de la molcule dhydrogne. La rduction a lieu sur le noyau Fe-Mo, cofacteur spcial qui est une sorte de double noyau fer-soufre contenant du molybdne. C'est une exception dans la nature car toutes les autres enzymes contenant cet lment le renferment dans un cofacteur de type nuclotidique. Lenzyme contient aussi des centres fer-soufre doubles, sans molybdne, appels
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centres P. Enfin un constituant organique, lhomocitrate, est reli au noyau Fe-Mo et parat participer aux transferts dlectrons et de protons. Pourquoi faut-il autant dnergie pour le fonctionnement de la nitrognase ? Le passage de N2 NH3 implique 3 tapes de 2 lectrons chacune, produisant N2H2 (un intermdiaire trs instable qui tend se dcomposer en N2 + H2), puis H2NNH2 (lhydrazine), enfin lammoniac. Ltape la plus difficile est la premire, car elle ncessite une rduction sous un potentiel extrmement bas de lordre de 600 mV pour un lectron chang, une valeur assez peu physiologique, alors que le potentiel de la rductase au repos est estim E = 290 mV. La liaison de la protine avec 2 ATP-Mg est facilite quand elle est ltat rduit, elle provoque une contraction de la structure et abaisse ce potentiel environ 400 mV. Comment ? Certainement la faveur d'un changement de conformation de la protine, qui devient un meilleur donneur dlectron quand elle est rduite. Les deux molcules dATP sont fixes par un mcanisme coopratif en des sites relativement loigns du noyau fer-soufre. Leur hydrolyse renforce le changement structural et rend donc la protine plus facilement rductrice. Labaissement du potentiel est compens par lnergie dhydrolyse de lATP, soit une valeur 32 kJ par mole ltat standard, et une chute du potentiel de 330 mV, soit 660 mV pour 2 ATP. Un trs bas potentiel est alors atteint, de lordre de 1000 mV, une valeur suffisante pour linjection dun seul lectron sur la dinitrognase. Le transfert saccompagne du changement de conformation inverse, de la libration de lADP et du phosphate, et d'un retour aux conditions initiales.
ATP ATP ATP association 2 ADP hydrolyse d'ATP transfert d'un lectron 2 Pi 2 ATP ADP ADP dissociation ADP ADP ADP ADP protine Fe oxyde ATP ATP protine Fe rduite Fe-Mo oxyde Fe-Mo partiellement rduite Symboles
En rsum, le cycle de la dinitrognase rductase comporte successivement une rduction par ferrdoxine sur son unique noyau [4Fe-4S], la liaison cooprative avec deux molcules d'ATP, l'association de la rductase avec la dinitrognase (protine Fe-Mo), l'hydrolyse des deux molcules d'ATP, l'injection d'un lectron la dinitrognase et le retour aux conditions initiales. Un tel cycle est donc parcouru 8 fois La suite des oprations est symbolise par un diagramme qui ressemble un cycle d'hystrsis parcouru dans le sens des aiguilles d'une montre. pour qu'une seule molcule d'azote diatomique soit assimile 3. La rductase utilise ici lhydrolyse dATP comme une impulsion supplmentaire, rendant le noyau fer-soufre plus rducteur et facilitant l'apport dun lectron la
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protine Fe-Mo . La suite des oprations est symbolise par un diagramme qui ressemble un cycle d'hystrsis parcouru dans le sens des aiguilles d'une montre. Il apparat que le noyau fer-soufre de la rductase vient proximit immdiate dun cofacteur accepteur sur la Fe-Mo, probablement un centre P. En fait la protine Fe-Mo , constitue de deux parties quivalentes, peut thoriquement recevoir deux molcules de rductase. Les noyaux P et Fe-Mo de la dinitrognase ont des structures particulires, longtemps demeures mystrieuse mais claires par les travaux cristallographiques. Ce sont des centres fer-soufre doubles de structure inhabituelle et ponts par des atomes de soufre.
Cys Cys
centre P
Cys
Cys
Cys
fer soufre Mo molybdne
Cys
Cys
cofacteur Fe-Mo O C homocitrate
Mo O C O His
La spectroscopie RPE suggre que le cofacteur Fe-Mo, dont on voit la structure hypothtique sur le dessin droite, renferme lquivalent de 3 Fe(III) et 4 Fe(II), joints Mo(VI). Larchitecture trs spciale de ces diffrents noyaux intrigue les spcialistes, qui y voient une structure trs souple en cage dformable. Il faut reconnatre quil y a comme un caractre magique dans cette enzyme, la fois par sa complexit et la difficult de la raction catalyse. Le rve serait de raliser des catalyseurs artificiels fonctionnant dans lindustrie sur un principe analogue ! On connat des nitrognases sans molybdne. Les enzymes "V" d'Azotobacter vinelandii et d'A. chroococcum ont du vanadium. Un cofacteur Fe-V remplace donc le Fe-Mo, avec une organisation du mme type. Les enzymes "Fe" de A. vinelandii, Rhodobacter capsulatus et Rhodospirillum rubrum nont que du fer dans un cofacteur Fe-Fe, o le fer remplace le molybdne ou le vanadium. Ces enzymes ne semblent pas trs diffrentes de la nitrognase molybdne par leur organisation gnrale. Les trois catgories d'enzyme correspondent des ensembles gntiques dsigns dans la nomenclature officielle par nif, vnf, anf. L'existence de ces diffrentes nitrognases suggre que la prsence du molybdne dans le noyau complexe o se fait la rduction de N2 n'est pas requise. Quelle explication donner cette multiplicit ? On observe que la prsence de Mo taux trs faible dans le
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milieu (6 nM) rprime la synthse des autres nitrognases chez Rhodobacter et A. vinelandii. L'enzyme molybdne pourrait savrer avantageuse. Une tude dtaille de la nitrognase fer seul dans Rhodobacter capsulatus rvle quelques diffrences significatives [14]. Par exemple pour chaque N2 rduit, cette nitrognase fait environ 7,5 molcules de H2 au lieu d'une seule pour l'enzyme Mo. Cette forte production d'hydrogne est moins inhibe par d'autres substrats, l'affinit pour l'actylne est plus faible, l'enzyme est moins stable et diffre par un certain nombre de proprits cintiques. La raison physiologique de ces nitrognases multiples dans une mme espce reste encore inexplique. Revenons lenzyme Mo "canonique". Les ides de base sur le mcanisme de la nitrognase ont t poses par le modle de LOWE et THORNELEY, fond sur des tudes cintiques trs dtailles [15]. Les deux moitis de la dinitrognase fonctionneraient indpendamment. Chaque cofacteur Fe-Mo sur apparat comme le site le plus probable de la rduction de lazote. Il est attach de faon assez lche la protine et comporte une cavit centrale qui pourrait tre gomtrie variable, formant une sorte de bote lastique dont lintrieur est tapiss par du fer et du molybdne. Lazote diatomique pourrait venir sy loger, mais cette hypothse est combattue par certains auteurs. Un fait essentiel est le couplage ncessaire entre la production dhydrogne et la rduction de N2. Il na jamais t possible dobserver une assimilation d'azote sans production de H2. Le rapport entre H2 form et N2 rduit est denviron 1 : 1, mais une incertitude subsiste. Lorsque le transfert des lectrons sur la protine Fe-Mo seffectue lentement, la tendance serait de librer davantage dhydrogne, comme une sorte de fuite dtournant le pouvoir rducteur de la production dammoniac. Lenzyme se comporte alors comme une hydrognase formant H2 dans des conditions spciales, puisquil y a en mme temps hydrolyse dATP. Il est donc peu prs certain que le couplage entre production dhydrogne et rduction de lazote ne se fait pas toujours dans un rapport rigoureux. Dans les conditions normales, la nitrognase molybdne utilise 75% des lectrons la rduction de N2. Pour les nitrognases vanadium, le rapport est de 50% environ, et il est encore plus bas pour les nitrognases Fe seul : 25-30% seulement. Les bactries devraient tirer un bnfice de l'hydrogne produit par la nitrognase. En effet lhydrogne est un excellent carburant, et son oxydation a un double intrt : rcuprer de lnergie dont la nitrognase est particulirement avide, ponger le cas chant les molcules doxygne qui tranent dans le secteur et risqueraient dinactiver la nitrognase. Les bactries qui acceptent dassimiler lazote malgr une certaine arobiose ont toujours des oxydations extrmement puissantes qui deviennent une vritable dtoxification d'O2, une mthode srement efficace puisque les Azotobacter peuvent encore fixer lazote sous une pression d'oxygne atmosphrique quasi normale. Dans le modle ractionnel accept provisoirement, lapparition de lhydrogne, aprs que la protine ait reu au moins 3 lectrons et probablement 4, prcderait l'entre de N2 sur le site. Le substrat serait donc reu par une protine partiellement rduite. Le schma est une interprtation simplifie o on voit que le noyau Fe-Mo serait rduit sur le molybdne puis sur le fer avant toute fixation et attaque de N2.
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2 e site vide MoVI Fe MoIV 2 H+ N H N H MoVI 2 e H N H MoIV N Fe 2 H+ H N MoVI N H Fe H N H H H N H H N Fe 2H

+
Fe
2 e
N H MoIV H Fe
N MoIV
Fe H2
H H
2 e 2 H+
Principe de la nitrognase
Le fer rduit forme un hydrure, et lazote se fixerait sur le complexe en chassant une molcule dhydrogne. Pour attaquer lazote et lui faire franchir la premire tape, qui est comme on le sait la plus difficile, la nitrognase devrait subir ainsi une sorte dactivation prliminaire lui permettant de traiter les substrats coriaces comme N2, et qui ne serait pas ncessaire pour dautres substrats comme lactylne, dont la rduction 2 lectrons en thylne ne produit pas dhydrogne. Deux lectrons suffisent galement pour transformer loxyde nitreux : N2 O + 2 H+ + 2 e N2 + H2O. Les protons sont oxyds dans cette raction mais ne produisent pas non plus dhydrogne. Dans le cas de lion cyanure, la raction observe est : CN + 7 H+ + 6 e CH4 + NH3. Le cyanure et HCN se lient lenzyme un stade plus prcoce que N2, et ne provoquent pas de libration dhydrogne. De faon gnrale la nitrognase admet comme substrats une gamme varie de composs faible masse molculaire caractriss par une liaison CC, CN, NN, NO ou CS double ou triple [16]. Seule dans cette srie de ractions, la rduction de lazote apparat comme une situation extrme qui se traduit par lmission supplmentaire de H2. La fixation de lazote est beaucoup plus rpandue dans lenvironnement que suppos initialement. On peut sen rendre compte laide de sondes nucliques reproduisant un consensus au niveau de la squence de la nitrognase rductase (NifH), car celle-ci prsente de grandes homologies dune espce lautre. Les expriences dhybridation molculaire ont permis de dtecter la prsence de la nitrognase dans un grand nombre de bactries du sol, avec des variantes dans le fonctionnement qui ne seront pas abordes ici. On se demande mme si de nombreuses espces bactriennes impliques dans des biodgradations, en particulier celles qui vivent de prfrence en anarobiose, ne sont pas en mme temps
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assimilatrices d'azote. Cette proprit a pu passer bien souvent inaperue, car elle ne se manifeste que dans des conditions dfinies, en particulier lorsqu'il n'existe aucune autre ressource azote.
5.4 - CONTRLE DE LASSIMILATION DE LAZOTE

Pour laborer une enzyme aussi perfectionne que la nitrognase, les bactries ont besoin dun nombre important de fonctions pour la synthse et linsertion des cofacteurs. Aussi l'assimilation du diazote est-elle dtermine par un grand nombre de gnes, une vingtaine au moins, qui sont les gnes nif pour l'enzyme molybdne. La gntique du systme nif a des cts spectaculaires. Chez Klebsiella pneumoniae, tous les gnes dont dpend lassimilation de lazote sont adjacents sur un mme segment dADN dune longueur de 23 kb. Ces gnes sont rpartis en 7 oprons au moins. Il existe des variantes. Chez Azotobacter, les gnes nif sont rpartis en deux ensembles. Des sries spares codent pour les nitrognases vanadium et fer, respectivement les gnes vnf et anf. Nous ne retiendrons que l'appareil nif. Un diagramme permet de se faire une ide sur la complexit de la machinerie mise en jeu, code par 29 kb d'ADN [17]. La nitrognase proprement dite est code par nifHDK, tandis que les autres gnes concernent la fabrication du cofacteur Mo et des noyaux fer-soufre. Les gnes nif d'Acetobacter diazotrophicus forment une seule unit, peut-tre la plus grande connue, d'une longueur de 30,5 kb [18]. Cette organisation gntique ne reste pas identique chez tous les cas de figure et peut prsenter des diffrences dans la disposition des gnes. Les homologies restent nanmoins fortes d'une espce l'autre et on en tire l'impression que l'arsenal gntique observ ici ou l trahit une origine volutive commune.
rductase chane chane synthse du cofacteur noyaux Fe-S activateur de rductase synthse du cofacteur flavodoxine
TY
N X
U S
WZ M
activateur de transcription rgulateur synthse du cofacteur NifA
Gnes nif d'Azotobacter vinelandii

L'opron nifHDK est repr en noir, les gnes dirigent des fonctions de service. Par exemple nifT et nifY sont transcrits en aval dans la mme unit. Le premier ne semble pas essentiel la fixation de lazote et sa fonction nest pas connue. Le second code pour une protine qui aide la maturation de la nitrognase [19]. Elle se lie lenzyme en cours dassemblage et sen dtache quand sa structure dfinitive est acquise. Plusieurs gnes sont impliqus dans la ralisation du cofacteur
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molybdne. Les protines NifU et NifS interviennent dans la synthse des noyaux fer-soufre. NifS, une soufre transfrase 3, tant charge de rcuprer le soufre dans la cystine pour le mettre la disposition des diffrents noyaux fer-soufre [20]. La protine NifV interviendrait dans la synthse de lhomocitrate. et NifWZ formerait un complexe exerant un effet protecteur sur la nitrognase contre loxygne [21]. Nous savons que la nitrognase est un outil coteux en nergie pour la cellule bactrienne. Elle est donc soumise un contrle trs strict deux niveaux, la transcription par induction et rpression, et l'activit enzymatique. Trois paramtres sont dterminants : labsence d'O2, la disponibilit de ressources nergtiques, un taux faible dazote ammoniacal. Ce problme a des aspects intressants qui mritent quelques explications. Chez les protobactries lexpression des gnes nif est en gnral sous la dpendance dun activateur spcialis, NifA, qui favorise lamorage dune transcription au niveau d'un type particulier de promoteur, reconnu par sigma-54*. En s'installant sur l'ADN, NifA vient en contact avec lARN-polymrase la faveur dune boucle de la double hlice et autorise lamorage en hydrolysant de lATP [22]. Chez les -protobactries assimilatrices de N2 comme Azotobacter vinelandii et Klebsiella pneumoniae, une seconde protine, NifL, inhibe lactivit de NifA en sassociant avec elle sans se lier directement lADN [23]. Une boucle dans lADN est donc ncessaire pour que NifA puisse se rapprocher du site damorage parce son lieu de fixation est assez loign en amont comme lindique le schma de la squence. La courbure est favorise par une protine supplmentaire, IHF, qui participe en quelque sorte au mcanisme rgulateur. C'est un problme que nous avons dj rencontr dans le chapitre prcdent. Il est assez caractristique des rgulations chez les procaryotes.
139 126
AAT TGTTCTGTTTCCCACA TTTGGTCGCCTTATTGTGCCGTTTTACGTCCTGCGCGGCGAC attachement de NifA 74 39
AAA TAACTAACTTCATAAAAATCATAAGAATACATAAC AGGCA attachement de IHF 27 15 +1 dbut de nifHDK
CGGCT GGTATGTTCCCTGC ACTTCTCTGCTGGCAAA promoteur reconnu par sigma-54
Squences reconnues par Nifa, IHF, sigma-54 (Klebsiella pneumoniae)

Les deux gnes des protines partenaires NifA et NifL sont sur un mme opron, comme on peut le voir sur la carte des gnes donne prcdemment. Chez Azotobacter, lopron nifAL est exprim en permanence (synthse constitutive).
3 - Une cystine dsulfurase, enzyme pyridoxal phosphate.
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ADP O2 NH4+
+ + +
NifL
NifA
La situation est un peu plus simple que chez Klebsiella o la synthse de NifA et NifL est elle-mme rgule par NtrC et GlnK.
+
transcription des gnes nif
Azotobacter
NifL canalise les rgulations, linhibition quelle exerce sur NifA est stimule par un niveau nergtique cellulaire bas (ADP > ATP), la prsence doxygne (redox lv) ou par un excs dazote ammoniacal. NifL intgre ces diffrents signaux et sa structure est faite de domaines articuls qui lui permet dtouffer laction de NifA ou de sen librer en fonction des signaux reus. Une vritable vanne de rglage. Lassimilation de N2 par la nitrognase nest quune opration particulire du mtabolisme azot en gnral, dont les rgulations dtailles ont t analyses en premier lieu chez Escherichia coli selon un mcanisme assez reprsentatif. On sait que la glutamine est lune des principales portes dentre de lazote ammoniacal dans les molcules organiques.
NtrB + GlnB
glutamine/2-oxoglutarate faible GlnD glutamine/2-oxoglutarate fort
GlnB + NtrB UMP NtrC
4
+
NifL NifA +
NH4+ O2 ADP expression des gnes nif
NtrC P
NtrA
( 54)
expression de nifA
Rgulation partielle chez Klebsiella pneumoniae

Lorsque la glutamine est taux faible, une triple cascade rgulatrice conduit : activer la synthse de la glutamine par la glutamine synthtase ; rendre fonctionnel un activateur de transcription, NtrC*, en NtrC-P ; transformer par uridylation un autre facteur rgulateur, GlnK, transform en GlnK-UMP, que nous retrouverons plus loin. Ces trois volets existent chez les assimilateurs dazote. Les circuits de rglage sont indiqus sur un tableau partiel de la cascade rgulatrice chez Klebsiella pneumoniae, une espce micro-arophile qui peut vivre avec ou sans dioxygne. Quatre niveaux daction ont t numrots sur le plan.Le niveau 1 concerne labondance de lazote dj fix sous forme organique, reprsente par la glutamine. Elle est dtecte par GlnD, qui est une enzyme fonctionnant comme uridylase ou dsuridylase (fixe ou enlve le nuclotide UMP). La cible est GlnB, ainsi quune deuxime protine qui nest pas reprsente dans un but de simplification , soit GlnK.
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Le niveau 2 est luridylation de GlnB en GlnB-UMP qui modifie lactivit de NtrB. Celle-ci est une protine kinase (avec ATP) ou au contraire une protine phosphatase (une enzyme PNLOPE qui fait et dfait) selon l'tat de GlnB. Au niveau 3, la protine NtrC est phosphoryle par NtrB, dphosphoryle par NtrB-UMP. En fonction de son tat ltape 2, NtrB phosphoryle NtrC ou la dphosphoryle. NtrC-P est un activateur de transcription qui va commander une cascade de transcriptions commenant par l'induction au niveau 4 de NtrA, appel aussi facteur sigma-54. Au niveau 5, NifA est l'activateur de transcription des gnes nif et autorgule sa propre synthse. NifL est un rgulateur contrl par l'ammonium, l'oxygne, et l'tat nergtique de la cellule. Quand celui-ci est bas, NifL freine l'activit de NifA et retarde l'expression des gnes nif (le fonctionnement de la nitrognase ne ferait qu'aggraver le dficit nergtique). Rsumons cette cascade. Un taux faible d'azote organique (glutamine/2-oxoglutarate faible) active la formation de GlnB-UMP, qui phosphoryle NtrC. Celle-ci active la synthse de NtrA, qui commande la sortie du couple rgulateur NifL/NifA. Cette dernire protine active l'expression des gnes nif. Il y a donc intgration de plusieurs paramtres, le taux d'azote organique, l'azote minral (l'ammonium), l'oxygne et l'tat nergtique de la cellule qui devient dfavorable quand le rapport ADP/ATP s'lve. Grce ce dispositif, la cellule peut assimiler le diazote seulement si elle en a besoin, pourvu quelle dispose dassez dnergie et que l'oxygne ne rduise pas ses efforts nant. On voit que cette cascade est rversible par ses effets et peut tre "allume" ou, "teinte" en fonction des conditions. La prsence des deux facteurs, la kinase NtrB et l'activateur de transcription NtrC, est une situation emblmatique dont la physiologie des procaryotes est friande (voir rgulations deux composants*). En outre il y a un effet amplificateur, car un signal faible au dpart suffit entraner une variation brutale de lexpression des gnes nif la sortie grce au robinet essentiel qui est NifA. Les deux protines NifA et NifL sont synthtises en quantits gales grce la structure de lopron qui associe les deux gnes [24]. Le subtil quilibre entre ces deux protines reprsente la vritable cl qui ouvre ou ferme les gnes nif chez les bactries qui assimilent lazote ltat libre comme Azotobacter et Klebsiella . La paire NifA/NifL est un systme d'asservissement qui permet de rgler l'expression des gnes nif dans une certain fourchette en fonction des besoins azots [25]. Comment la protine NifL intervient-elle ? C'est son niveau que se fait le rglage gnral en fonction de la prsence d'O2, de lADP et de l'ammonium. NifL est une flavoprotine portant du FAD dont l'tat doxydorduction est command par le niveau doxygne. Le cofacteur FAD se comporte de la mme faon que dans une oxydase, mais la protine est dpourvue dactivit enzymatique. Elle ne ragit que par ses changements de conformation. Cette protine serait charge de limiter les ardeurs de NifA, mais une petite simplification a t faite au tableau. NifL est sous le contrle la fois de NtrA et de GlnK. Celle-ci est soumise uridylation en fonction de labondance dazote fix (la glutamine), tout comme l'tait GlnB ci-dessus. GlnK a pour mission d'exercer un rglage fin supplmentaire sur NifL. Quand lazote de la glutamine est vraiment limitant, GlnK diminue leffet inhibiteur de NifL sur NifA, ce qui est physiologiquement logique puisque l'action activatrice de NifA sur la transcription des gnes nif sera renforce.
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Le principe des rglages prsents ici connat des variations dans le dtail en fonction des espces libres. Chez les phototrophes comme Rhodobacter capsulatus, un contrle supplmentaire est exerc par la photosynthse qui gnre l'nergie ncessaire la nitrognase. Les deux facteurs essentiels sont alors l'anarobiose et la lumire. Les espces symbiotiques comme Rhizobium ont des solutions diffrentes de celles de Klebsiella et adaptes aux conditions. Le principal facteur qui allume les gnes nif est alors la rarfaction de loxygne. Lentre en symbiose saccompagne dun arrt de croissance, dune diffrenciation dans un environnement microarobie et riche en molcules azotes comme la glutamine qui est fournie par la plante. Loutil essentiel chez R. meliloti est un systme classique deux composants du type NtB/NtrC, appel ici FixL/FixJ. La protine FixL est le capteur qui estime le taux d'oxygne, FixJ est un activateur de transcription favorisant l'apparition des nouveaux activateurs, NifA et FixK. La protine FixN reprsente une ferrdoxine [26].
FixJ FixL O2 P FixJ + fixK membrane FixK + fixNOQP nifA + NifA + nifHDK fixABCX nifN
Rgulation commande par FixL chez Rhizobium

Le capteur FixL est une protine kinase membranaire hminique contenant du fer(II). En labsence de O2 ou lorsque sa teneur descend au-dessous de 10 M, elle commence par sautophosphoryler, puis injecte son phosphate sur sa partenaire FixJ. En se liant l'ADN, celle-ci active la transcription des gnes nifA et fixK. Les protines correspondantes sont elles-mmes des activateurs pour les gnes nif et fix. FixK auto-limite sa propre production et celle de NifA. Loxygne inhibe toute la cascade en se fixant sur le fer du capteur. La structure de FixL est connue [27]. Son fonctionnement rappelle celui de lhmoglobine : la gomtrie du fer(II) est octadrique, mais incomplte. Quatre liaisons de coordinence sont au sein de la porphyrine, une cinquime est dans une direction orthogonale et se fait sur histidine. La sixime est libre et cest l que sinstalle loxygne. Loccupation de la sixime coordinence par O2 dclenche un petit changement de conformation qui se rpercute sur lactivit du domaine voisin comme kinase.
O2 N N N N hme de FixL His His N N N N
Dtection de l'oxygne par FixL
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La cascade commande par FixL pourrait ne pas s'arrter rapidement dans le cas d'un apport d'oxygne. L'activation des gnes placs en aval se poursuivrait intempestivement par la prsence de FixJ phosphoryle. Or celle-ci n'est pas stable et perd continuellement son phosphate dfaut d'tre recharge. Ce mcanisme permet l'arrt rapide de la cascade jusqu' une nouvelle phosphorylation dclenche par la disparition d'O2. L'activation tend cesser par dphosphorylation sponane de FixJ. La recharge en phosphate se fait continuellement en conditions de faible taux d'O2 et on s'explique aisment que l'effet activateur soit rversible. L'ajustement se fait par l'instabilit de la liaison du phosphate. Elle se dfait et se refait sans cesse. Une lgre variation du taux de phosphorylation commande par O2 suffit contrler l'effet activateur. Le modle de base prsent ici connat des variations avec les espces, souvent avec des contrles trs compliqus adapts la physiologie des cellules. Azorhizobium caulinodans peut assimiler l'azote aussi bien en croissance libre qu'en symbiose sur lgumineuses du genre Sesbania. Son assimilation de N2 est contrle la fois par le systme Ntr et par FixJ. Le travail de la nitrognase consomme toujours beaucoup d'nergie alors que les bactries doivent faire face un taux d'oxygne trs faible. Elles ont donc besoin de protines respiratoires adaptes codes par les gnes fix, en particulier une nouvelle oxydase terminale lie la membrane, de type cbb3, code par fixOQP. Toutes ces rgulations complexes sont lies au fait que la nitrognase est dcidment une enzyme coteuse pour la cellule, non seulement par le nombre de facteurs et de protines mis en jeu, mais par son fonctionnement assoiff dnergie. Les mcanismes d'induction et rpression des gnes sont efficaces mais lents. Dans la comptition vitale le facteur vitesse compte. Une nitrognase qui continuerait tourner quelques temps en conditions dfavorables consommerait inutilement de l'ATP. Il existe effectivement une rgulation rapide et rversible, qui consiste inhiber prcipitamment l'activit de lenzyme dans les conditions o elle nest pas ncessaire. Cette rgulation est base sur une ADP-ribosylation, catalyse par une ADP-ribosyltransfrase. Avec NAD+ comme donneur. L'opration inverse est faite par une glycohydrolase. Ces deux enzymes antagonistes, codes par draT et draG, exercent leur action sur la partie rductase de la nitrognase comme un interrupteur "ON/OFF". Ce mode de contrle est prsent surtout chez les phototrophes, absent chez dautres espces comme Klebsiella . En prsence dions ammonium ou dautres effecteurs, l' ADP-ribosylation inactive la rductase. Quand les conditions redeviennent favorables, le blocage est supprim par une enzyme dactivation qui limine llment ADP-ribose. Or cette "activase" est trs sensible O2 et lopration choue en cas darobiose, ce qui tombe bien puisqu'il ne convient pas de ractiver la nitrognase ! Cependant aucune solution n'est parfaite. Diverses espces gnes par l'arobiose modulent leur assimilation de l'azote par plusieurs rseaux de contrle, plusieurs nitrognases. Ainsi le phototrophe Rhodobacter capsulatus a deux nitrognases, une Mo, l'autre sans Mo ni mtal autre que le fer. L'activit de ces deux enzymes est contrle par un double circuit qui autorise certainement une meilleure optimisation dans toutes les conditions.
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Lassimilation de lazote repose donc sur une artillerie lourde faisant appel de nombreux cofacteurs, protines et mcanismes rgulateurs. Cette phase essentielle du cycle de lazote na pas de prix, car la recharge de la biosphre en azote organique, et par contrecoup toute l'activit de recyclage de la biosphre, en dpendent.
5.5 - LES VOIES DU NITRATE

La biosphre dispose de trois principaux rservoirs dazote minral sous forme de diazote, d'ammonium et de nitrate. Lactivit des organismes bactriens fait communiquer ces rservoirs, comme lindique un schma simplifi. On constate immdiatement que certaines tapes sont notes comme irrversibles. Il sagit de la rduction de N2 en ammonium et de celle du nitrate en N2 par le mcanisme appel dnitrification. Le cycle indiqu ne peut donc tourner que dans le sens inverse des aiguilles dune montre.
N2
fixation de l'azote diatomique
dnitrification
matires organiques azotes
NH4+
nitrification ammonification et assimilation
NO3
Grandes conversions de l'azote par les procaryotes

Les diffrents changes prtent parfois des confusions de terminologie. La rduction de N2 en ammonium engendre lazote ammoniacal directement utilisable par le mtabolisme cellulaire. Cest donc une assimilation. Le produit de lopration est l'azote ammoniacal et alimente les synthses de lorganisme. Lassimilation azote seffectue aussi massivement dans la nature aprs dcomposition des matires organiques et production dazote ammoniacal. Il existe aussi une rduction de lion nitrate qui fournit de lammonium assimilable mais produit de l'nergie et s'appelle ammonification. La dmarcation entre assimilation et dissimilation est parfois incertaine, voire arbitraire, mais le terme de dnitrification est gnralement utilis pour la rduction du nitrate dont le terme ultime est N2, non rcupr par la machinerie cellulaire et seulement limin. Sur le plan pratique, de nombreuses espces bactriennes du sol peuvent tre cultives sur nitrate qui est assimil comme seule source azote. Pour rsumer ces questions smantiques nous adopterons les conventions proposes par MORENO-VIVIAN et FERGUSON [28]. La respiration est une chane doxydorductions non assimilatrices couples la formation dun potentiel membranaire, autrement dit qui est productrice dnergie, c'est--dire lectrognique. La dnitrification sensu stricto est dans ce cas.
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Elle fonctionne en gnral lorsque loxygne est peu abondant ou absent (sauf dans certains cas [29]) et les enzymes concernes sont gnralement induites par lanarobiose. La prsence dammonium dans le milieu est en principe sans action [30]. La dissimilation offre un cadre diffrent. Elle fait passer ici le nitrate et le nitrite NH3, avec ou sans rcupration dnergie. L'ammonification entre dans ce cas de figure. En fait il existe un certain recouvrement entre respiration proprement dite et dissimilation, ne serait-ce que lors de la conversion du nitrate en nitrite. La dissimilation est caractrise par lexistence dune nitrite rductase spciale (distincte de celle qui fonctionne dans la dnitrification), car elle catalyse la rduction directe 6 lectrons du nitrite en ammoniac. Lassimilation est entirement tendue vers la production d'azote ammoniacal assimilable par le mtabolisme. Elle met en jeu des enzymes induites par le nitrate et rprimes par lammonium [31]. Revenons la dnitrification. Elle emploie le nitrate comme oxydant au mme titre que loxygne quand celui-ci fait dfaut et produit des oxydes dazote comme intermdiaires qui sont eux-mmes accepteurs d'lectrons respiratoires : l'ion nitrite (NO2), l'oxyde nitrique (NO) et l'oxyde nitreux (N2O). Les substrats initiaux sont de mme nature que ceux qui sont oxyds par respiration arobie et les transporteurs d'oxydorduction, quoique distincts, sont de mme nature. Certaines espces nont pas toutes les tapes de la dnitrification et ne sont pas considres comme de vritables dnitrifiants. Escherichia coli est dans ce cas mais peut cependant transformer le nitrate en nitrite et en tirer de lnergie. Lorsque le stade ultime (N2) nest pas atteint, il en rsulte en quelque sorte une dnitrification avorte, qui peut sarrter au stade nitrite, ou encore loxyde nitreux. Celui-ci est vacu dans latmosphre o il apporte sa contribution au fameux effet de serre. Diverses espces vont jusqu recycler le diazote qu'elles engendrent par dnitrification l'aide de leur nitrognase [32]. Il faut en dduire que la dnitrification est une source dnergie assez performante pour engendrer tout lATP dont la nitrognase a besoin. La dnitrification est galement commune chez les Rhizobium et autres bactries assimilatrices dazote qu'on trouve en symbiose avec des plantes. Le tableau rsume les diffrents niveaux d'oxydation de l'azote.
niveaux d'oxydation NO3 dnitrification NO2 NO N2O N2 +3 +2 +1 0 +5
ammonification
NH4+
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La dnitrification sobserve surtout parmi les protobactries, les archaebactries halophiles et hyperthermophiles. La plupart des organismes dnitrifiants sont des htrotrophes qui couplent la rduction des oxydes dazote loxydation d'une source organique, mais la dnitrification peut aussi s'exercer sur l'oxydation de divers composs soufrs, de lhydrogne ou du Fe(II) [33]. La dnitrification est donc un phnomne extrmement rpandu et vari dans lenvironnement. Elle alimente en nergie maintes biodgradations, mais peut rester incomplte en n'allant pas jusqu N2. Une vritable dnitrification va au-del du stade nitrite, et produit au moins NO ou N2O. En sarrtant au nitrite, les entrobactries avec Escherichia coli en tte ne font que le dbut du chemin. La dnitrification est au contraire complte dans le genre Pseudomonas. De nombreuses tudes ont t ralises avec P. stutzeri [34], dont lhabitat naturel est le sol, la boue, les eaux stagnantes et les djections animales. Comme les diffrentes tapes de la dnitrification oprent des potentiels doxydorduction moins levs que celui de la rduction de O2 en molcules deau, la dnitrification est toujours un peu moins efficace sur le plan nergtique quune oxydation respiratoire sur loxygne. Pour la rduction du nitrate en nitrite, le potentiel standard E'(NO3/NO2) est de + 430 mV. Du nitrite l'oxyde nitreux, le potentiel E'(NO2/NO) est de + 350 mV. Ces valeurs se comparent au potentiel de l'oxygne (+ 810 mV). Les bactries vivant en arobiose nont donc pas intrt utiliser du nitrate pour leurs oxydations, alors quelles tenteront de la faire en anarobiose. On sexplique ainsi pourquoi la dnitrification est dlaisse en prsence doxygne sauf quand il est taux trs faible, soit 1-5 M au lieu de 220-240 M saturation avec lair ambiant, conditions dites micro-arobies. Cependant la respiration sur nitrate peut supporter une certaine arobiose, et de nombreuses espces bactriennes du sol sont capables de mener de front la respiration arobie classique et la dnitrification [35]. Ce nest donc pas un choix de tout ou rien. Mais comme la respiration sur oxygne reste la solution la plus rentable, une rgulation au niveau gntique entrave plus ou moins la synthse des outils de la dnitrification en arobiose, et induit au contraire leur synthse aprs disparition d'O2. La transition supporte par les organismes dits arobies facultatifs saccompagne par un profond bouleversement de lexpression des gnes et de la carte mtabolique. Le phnomne a t tudi trs prcisment sur diverses souches de laboratoire, dont Escherichia coli o la situation, revue par COLE [36], apparat comme complexe. La prsence de nitrate permet donc une multitude despces microbiennes de se dvelopper dans les eaux ou les couches du sol o loxygne se fait rare, et autorise dans certains cas des recyclages efficaces par des voies distinctes de l'arobiose. Cela tombe bien : les nitrates souvent ajouts en excs aux cultures comme fertilisants encouragent en mme temps le nettoyage du sol ! Tournons-nous vers lammonification, qui est un passage du nitrate et du nitrite lammoniac avec production dnergie dans le passage du nitrate au nitrite. Cette opration rpond plusieurs objectifs. Le principal est la production de NH3 ou dions ammonium qui seront rcuprs par la cellule pour ses synthses, et correspond une assimilation. Mais lammonification produit de lammonium en excs sur les besoins rels de la cellule et correspond aussi une dtoxification. Elle contribue liminer les nitrites, composs trs toxiques, et permet de compenser
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lexcs de pouvoir rducteur dans certaines circonstances physiologiques, empchant ainsi le potentiel redox datteindre des valeurs trop basses qui sont mal supportes par beaucoup de micro-organismes. Les diffrents modes de rduction des nitrates et nitrites fonctionnent parfois simultanment, avec les mmes outils. On tendait autrefois opposer dissimilation et assimilation. La dissimilation dsignait tout ce qui ne produisait pas quelque chose que la cellule ne rcuprait pas comme substrat pour ses synthses. La dnitrification tait donc considre comme une dissimilation. Une bactrie trs commune que lon croyait autrefois strictement arobie, Bacillus subtilis, peut faire en anarobiose une respiration qui va du nitrate au nitrite (donc productrice dnergie), puis passe directement lammoniac par une nitrite rductase dissimilatrice facilement inactive par loxygne [37]. En fonction des diffrents impratifs de croissance, les bactries disposent de plusieurs botes outils, et cest sans doute pour cela que dans une mme espce on voit assez souvent des nitrate et nitrite rductases diffrentes prsentes en double ou en triple. Des enzymes varies rpondent toutes les situations. Ces rductases seront examines au Chapitre 6. La dnitrification contribue aux changes considrables entre les sols, les eaux et latmosphre terrestre. Rappelons que l'oxyde nitreux ou N2O (appel encore oxyde de diazote) est un gaz effet de serre. Malgr sa faible concentration de (0,3 ppmv), il reprsente prs dun cinquime de leffet produit par le dioxyde de carbone car son pouvoir rflchissant est 230 fois plus lev masse gale. Sa teneur est en lente augmentation (0,2 0,3% par an), peut-tre par suite de lusage accru des fertilisants azots. Il a dj t signal que le gaz N2O est accus d'accentuer les dommages faits la couche dozone par des contaminants halogns comme les fluorocarbones du type Fron. En somme la dnitrification suscite trois grands courants dintrt. Le premier est tout simplement la consommation en pure perte du nitrate ajout grand frais comme engrais par les fermiers, car il est la fois consomm par les micro-organismes et entran par l'eau avec la pollution des rivires que l'on sait. Le second thme de proccupation est la monte de leffet de serre, favoris par la dnitrification et encourag par la culture intensive. Le troisime sujet dintrt concerne laction bnfique de la dnitrification comme moteur de la destruction de certains polluants organiques en absence doxygne. La dnitrification est difficile mesurer avec prcision parce que tous les composs minraux azots sont facilement diffusibles comme gaz ou solubiliss par leau. NO et N2 O sont des tapes obligatoires de la dnitrification, mais apparaissent de faon fugitive car ils sont limins rapidement. Le premier est un radical qui s'oxyde spontanment en NO2 par loxygne selon une raction trimolculaire : 2 NO. + O2 2 NO2. Il en rsulte que sur le plan cintique la vitesse de cette oxydation dpend du carr de la concentration de NO. La raction est cependant lente dans les conditions de la dnitrification, o NO ne saccumule pas (il serait dailleurs toxique). La demi-vie de NO dans lair ne descend au-dessous dune heure que si sa concentration en ordre de grandeur dpasse 100 ppmv. La dnitrification, favorise en principe par lanarobiose, tolre la prsence d'O2 taux significatif chez diverses espces. Or la prsence de loxygne favorise loxydation en retour de lammoniac, de NO et NO2, avec comme stade ultime la
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formation de nitrate, travail ralis par les bactries nitrifiantes. Lorsque ces oxydations surviennent en mme temps que la dnitrification, elles compliquent forcment les mesures. Voici un exemple. Nitrosomonas eutropha est une espce nitrifiante : elle oxyde lammoniac avec O2, opration productrice d'nergie. Ce litho-autotrophe obligatoire est capable de produire N2O et mme N2 partir de nitrite. On a pu le dmontrer laide dexpriences de marquage par lazote-15 [38]. Pourtant lorsquelle est place en anarobiose, son mtabolisme se branche sur la dnitrification. Il se produit alors une chose intressante. En atmosphre contenant le dioxyde dazote (NO2), elle oxyde lammoniac en passant par lhydroxylamine (NH2OH), NO et le nitrite, et rcupre ces deux derniers comme accepteurs pour produire... N2O et N2. Il y a donc bien nitrification et dnitrification simultanes [39]. Cette espce est autotrophe, et se dveloppe efficacement en prsence de NH3, de NO2 et de CO2, ce qui est une faon de visiter tous les rteliers. Cette situation est sans doute assez rpandue dans lenvironnement. Dans le cas de Pseudomonas putida, un htrotrophe, loxydation de NH3 en hydroxylamine, nitrite et nitrate, est possible en anarobiose. Puis le nitrite et le nitrate sont utiliss leur tour comme accepteurs, et il se forme un peu de NO [40]. Un autre Pseudomonas, cultiv sur actate en prsence d'O2, oxyde lhydroxylamine comme source dnergie additionnelle. Il apparat du nitrite, ainsi que N2O qui est la marque dune dnitrification arobie [41]. Cette facult des bactries de jouer sur tous les tableaux fait que lapparition des oxydes dazote, NO et N2O, nest plus la marque dune activit anarobie, comme on avait pu le croire antrieurement. Lapparition de ces gaz en arobiose est lie en grande partie la nitrification par des germes comme Nitrosomonas, alors quen anarobiose les responsables sont plutt les dnitrifiants orthodoxes comme Pseudomonas et Alcaligenes [42]. Lextrapolation sur le terrain des observations de laboratoire semble valable. Des auteurs belges [43] ont montr que des boues dpuration limites en oxygne, dans les conditions dites OLAND*, oxydent lammoniac la fois en nitrite, nitrate et N2. Ce dernier emporte 40% de lazote initial. Il est suppos que les boues effectuent une nitrification qui est couple une dnitrification partielle : le nitrite et le NO forms conduiraient N2 en servant daccepteurs dlectrons. En conclusion, il existe un recouvrement assez large entre la dnitrification et les oxydations inverses dans une gamme tendue de situations. Ces relations sont reprsentes par un schma avec dsignation des enzymes responsables [44]. Le cycle indiqu par le tableau ci-contre met contribution plusieurs sortes dorganismes, avec des transferts de matires d'un biotope un autre dans les sols et les eaux, et offrant toutes les combinaisons possibles. La nitrognase (raction 6) est un maillon important de ce cycle approvisionn par trois grandes sources, qui sont latmosphre (raction 6), les dcompositions de matires organiques gnratrices dammoniac, et les nitrates apports par les engrais agricoles et l'oxydation de l'ammoniac. La raction 8 appartient lhydroxylamine oxydorductase. Elle fait fonction de NH2OH dshydrognase et produit la fois du nitrite et du diazote (N2). Le passage de lhydroxylamine au nitrite limine lui seul 4 lectrons. O vont-ils ? La nitrification est ncessairement arobie.
NO2 11 NO3 1 9 5 fertilisants NH2OH 7 NH3 NO2 2 NO 12 3 8 N2O 4 10 N2 6 8 matires organiques atmosphre
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123456-
Nitrate rductase Nitrite rductase Oxyde nitrique rductase Oxyde nitreux rductase Ferrdoxine-nitrite rductase 4 Assimilation de N2 (nitrognase)
7 - Ammoniac mono-oxygnase (AMO) 8 - Hydroxylamine oxydorductase 9 - Nitrite oxydase 10 - (incompltement caractrise) 11 - Oxydation spontane de NO par O2 12 - (incompltement caractrise)
Interconversions azotes
Sur les 4 lectrons, deux iront loxy-gne par une oxydase terminale selon : NH2OH + O2 NO2 + H+ + H2O O vont les deux autres lectrons ? Ils sont rcuprs par l'oxydation de lammoniac en hydroxylamine (raction 7) catalyse par l'ammoniac mono-oxygnase, qui a besoin la fois d'O2 et d'une source rductrice auxiliaire. Loxydation de lhydroxylamine produira de lnergie et fournira en mme temps ces lments rducteurs dont loxygnation de NH3 a besoin, selon : NH3 + O2 + 2e + 2 H+ NH2OH + H2O Les bactries peuvent se dvelopper en arobiose sur hydroxylamine [45]. L'tude a montr que ltape nergtique de la nitrification par Nitrosomonas europaea est bien loxydation de lhydroxylamine en nitrite et non pas la raction de loxygnase. Si un dficit en O2 survient, les bactries se tournent vers un mtabolisme de dnitrification o le nitrite prend la place d'O2 comme accepteur dlectrons. Dans ce chass-crois de ractions, l'analyse exprimentale a souvent recours des inhibiteurs spcifiques pour bloquer telle ou telle tape. C'est le cas de lactylne. Il bloque la fois ltape 4 de la dnitrification catalyse par N2O rductase, et la raction 7 de lammoniac mono-oxygnase (AMO). L'actylne est un outil pour valuer lintensit de la dnitrification sur le terrain et dans une culture, car il conduit une accumulation mesurable du gaz N2O. Un inhibiteur trs classique de lammoniac mono-oxygnase est la nitrapyrine. Cet inhibiteur est en fait un agent "multicarte" car il inhibe dautres activits enzymatiques*. On continue passer au crible dautres inhibiteurs potentiels [46]. La raction 1 1 seraitlgrement stimule par lactylne. Le dioxyde form (NO2) 5 est capable de fonctionner exprimentalement comme accepteur dlectrons au mme titre que le 4 - Lenzyme (EC 1.7.7.1) est assimilarice, elle a t tudie notamment chez les vgtaux. 5 - On peut obtenir le dioxyde par action de lacide nitrique dilu sur des copeaux de cuivre. Lacide agit ici comme oxydant, gnre NO qui soxyde son tour lair en NO2.
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nitrite ou le nitrate (tape 12). Le dioxyde dazote sous lclairement solaire ragit avec loxygne de lair et les vapeurs dhydrocarbures pour engendrer de lozone et diffrents produits irritants contribuant la pollution des villes et aux fameux smog au-dessus des grandes agglomrations. Nous laisserons de ct le ttraoxyde de diazote (N2O4) form par dimrisation de NO2, produit essentiellement par lactivit humaine. Il a des applications dans la fabrication de carburants pour fuses spatiales. On terminera cette section en signalant qu'il existe une dnitrification chez les champignons et levures. Elle est rvle par lmission de NO, N2O et N2, mais les connaissances sont plus rcentes. Il est possible que la rduction du nitrate dans les sols et sdiments corresponde un mtabolisme de secours lorsque loxygne est limitant ou absent. Elle est pratique par des Fusarium, Giberella, Penicillium, Aspergillus et autres [47]. Certaines espces vont jusquau stade N2. Contrairement une ide reue, la respiration des champignons ne se limite donc pas lemploi d'O2 comme accepteur, mais peut se tourner vers la dnitrification [48]. La production d'nergie chez les eucaryotes non photosynthtiques est tributaire de leurs mitochondries. Auraient-elles perdu leur ancien mtabolisme anarobie ? Cest possible, puisque les mitochondries de Fusarium oxysporum et Cylindrocarpon tonkinense sont capables de prendre en charge une vritable dnitrification sur malate ou pyruvate comme substrat, en faisant de l'ATP par couplage avec les transferts dlectrons [49]. Ces mitochondries "anarobies" sont peut-tre les vestiges dune situation ancestrale, car elles sont munies des enzymes ncessaires la rduction des diffrents oxydes dazote et fonctionnent avec des chanes doxydorduction standards sensibles aux inhibiteurs habituels du type antimycine ou rotnone. Lexistence de ces mitochondries spcialises agrandit notre vision de la biologie des milieux privs dair. Ce que lon croyait tre lapanage des procaryotes appartient aussi aux champignons et aux levures. On peut sattendre de leur part une grande diversit dans ce domaine et une intervention dans lenvironnement plus grande que prvue.
5.6 - LE PASSAGE LANAROBIOSE

Puisque loxygne molculaire est laccepteur respiratoire le plus favorable sur le plan nergtique, il remporte la prfrence sur tous les autres accepteurs possibles quand il est prsent. Sa disparition ncessite une rvision rapide du mtabolisme vers des respirations de remplacement, et nous savons que la dnitrification est lune des solutions possibles. Rappelons le principe gnral de cette conversion mtabolique. Une rgulation denvergure se fait au niveau de la transcription de lADN et se traduit par lexpression de nouvelles familles de gnes, alors que dautres sont mis en veilleuse. La transition se fait avec des modalits diverses selon les espces et ncessite typiquement deux mcanismes molculaires : la dtection du signal physiologique, qui est ici le taux doxygne ; lactivation de la transcription au niveau des gnes concerns en fonction de la valeur du signal.
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Pour simplifier lextrme : un capteur, un disjoncteur. Ces deux fonctions sont assures le plus souvent par deux protines distinctes, mais il arrive quune mme protine cumule les deux oprations. Un principe simple en apparence. Malheureusement nous serons vite confronts des situations plus compliques dont la recherche est loin davoir explor toutes les avenues. On sait que la transcription catalyse par lARN-polymrase dmarre au niveau d'un promoteur reconnu par un facteur damorage (ou facteur sigma). Lefficacit de lamorage est variable et dpend de la nature du promoteur ou dautres facteurs comme la conformation locale de la double hlice dADN. Souvent la triple association polymrase-sigma-ADN nest pas suffisante, et cest justement ce qui se passe pour la plupart des gnes du mtabolisme azot. Lapport dune protine supplmentaire est alors requis. Ce nouveau facteur est un activateur de transcription. Dans le cas le plus simple, lactivateur sinstalle sur lADN en amont immdiat du promoteur. Dans dautres cas lactivateur sassocie lADN une certaine distance en amont du promoteur, et entre en contact avec la polymrase la faveur dune dformation de la double hlice. Cest le principe dj entrevu et symbolis par un petit dessin :
activateur IHF ARN-polymrase
ADN
ADN
squences de liaison
facteur sigma
promoteur
amorage, transcription
Protines auxiliaires (principe)

De nombreux gnes du mtabolisme azot sont transcrits partir de promoteurs appartenant une mme famille et reconnus par un facteur sigma spcialis, sigma-54 ou RpoN. La squence consensus reconnue est TGGCACxxxxxTTGCA allant des positions 12 24 (les positions GG et GC places aux extrmits sont absolument ncessaires). Sigma-54 nest gnralement pas capable damorcer tout seul la transcription. Des activateurs supplmentaires sont ncessaires et se fixent en amont de la zone reconnue par sigma-54. Ils entrent en contact avec lARN-polymrase la faveur du repli de la double chane dADN sur elle-mme, favorise par la protine appele IHF. En somme la polymrase ne commence son vritable travail quaprs en avoir reu lautorisation. L'activateur fait office de disjoncteur qui allume ou teint lexpression des gnes que la polymrase est charge de transcrire. Ce disjoncteur reconnat lui-mme une condition physiologique particulire, ou ne le fait que par lintermdiaire dune protine fonctionnant comme capteur (ou dtecteur) sensible un signal spcifique. Le contrle seffectue alors par la collaboration de deux protines, un capteur et un activateur capable de se lier lADN. Examinons la dnitrification proprement dite. Lobjectif de base est de compenser par un oxyde dazote la disparition de loxygne comme accepteur respiratoire. Cest l quintervient la protine FNR. Cest une protine activatrice dont la
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fonction est de mettre en route lexpression dune foule de gnes concerns par la vie en anarobiose, ou inversement de les mettre en veilleuse aprs larrive de loxygne. Dans Escherichia coli o FNR a t dcouverte initialement, la rgulation globale dont elle est responsable ne commande pas moins de 125 gnes et on commence avoir une ide assez prcise de son fonctionnement [50]. FNR pratique le cumul des mandats, car elle est la fois capteur et activateur [51]. Au repos cest une protine monomrique avec deux zones essentielles. La partie N-terminale de la squence a un domaine fer-soufre jouant le rle de dtecteur, et la partie C-terminale possde une rgion responsable de lattachement lADN. La FNR de E. coli prsente de fortes similitudes structurales avec une autre protine activatrice qui est CRP* dans le domaine qui sattache lADN. La protine FNR est un peu larchtype dune famille de rgulateurs, dont font partie les protines FixK de la section prcdente. La mme architecture et des homologies de squence se retrouvent dans tous ces rgulateurs, ce qui ne veut pas dire que le mode de dtection du signal soit identique dans tous les cas. Comment la protine FNR saperoit-elle quil ny a plus doxygne ? Elle est prsente un taux faible mais pratiquement constant, que les cellules soient places en arobiose ou non. Elle ne sattache pas lADN sous forme monomrique. Elle devient activatrice sous forme dun dimre, par association symtrique de deux chanes identiques. La dtection se fait donc par une transformation qui affecte la structure de FNR elle-mme et non pas son abondance intracellulaire. La pice matresse est un noyau fer-soufre de type [4Fe-4S]2+ similaire celui quon trouve dans bon nombre de ferrdoxines. Il est li par 4 restes de cystine dont trois sont dans la partie la plus N-terminale. Dans une ferrdoxine, le fer-soufre est alternativement oxyd ou rduit entre les tats [4Fe-4S]2+ et [4Fe-4S]+, et li 4 cystines. Lattachement dans FNR ne se fait pas avec quatre cystines, mais sur un mode un peu diffrent. Le noyau sous forme oxyde, [4Fe-4S]2+, stabilise la protine sous sa forme dimrique, celle qui active la transcription. Elle se fixe lADN sur une squence palindromique consensus, TTGATnnnATCAA, centre environ 41 bases en amont du point de dpart de la transcription. La monte de loxygne va faire sauter cette association. Le noyau fer-soufre est fragile. Il est facilement dtruit par O2, et sa destruction rompt la forme dimrique de FNR, qui revenue l'tat monomrique est contrainte de quitter lADN. Un progrs majeur a t ralis aprs clonage du gne, surexpression pour en avoir une quantit suffisante et purification conduite strictement labri de lair. La protine est alors obtenue principalement sous forme de dimre, avec un fer-soufre par chane, et peut se lier lADN [52]. La spectroscopie MOSSBAUER [53] suggre que O2 dclenche la transformation des noyaux [4Fe-4S]2+ en [2Fe-2S]2+, mais le mode exact nest pas dfinitivement tabli. On a suppos aussi quil pouvait se faire en [3Fe-4S]+ et un ion Fe3+, une conversion qui correspondrait une oxydation avec perte de fer et provoquerait la dissociation du complexe FNR-ADN. La teneur en oxygne ncessaire pour supprimer de moiti le pouvoir activateur de FNR est trs basse, de lordre de 0,1 0,5% de la teneur normale en quilibre avec lair. La transformation de FNR parat rversible. La rcupration aprs puisement complet de loxygne suppose lintervention dun facteur enzymatique charg de remodeler le noyau fer-soufre, et du mme coup de restaurer la protine. On pense
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que cette fonction revient la protine NifS. Loxygne a dtach FNR de lADN et la protine NifS permet lopration inverse. Le schma est un modle provisoire symbolisant le passage dun tat lautre. Il y a peut-tre plusieurs formes non actives, [2Fe-2S] indique ici, [3Fe-4S] et une forme dpourvue de fer-soufre.
[2Fe-2S]2+ FNR non active
anarobiose 2 Fe2+, 2 S2 NifS Fe2+, S2 O2
[4Fe-2S]2+ FNR ADN active
NADH dshydognase cytochrome o diverses oxydations FNR
dnitrification fumarate rductase DMSO rductase formiate dshydrognase pyruvate-formiate lyase glycrol-3P dshydrognase oxydations diverses
FNR alterne entre deux tats

Parmi les facteurs de la dnitrification se trouvent des enzymes, des transporteurs, des systmes de capture de mtaux et de synthse des cofacteurs Les gnticiens diraient que la commande de tout cela correspond un rgulon*. Par exemple dans le systme deux composants NarX/NarL, lactivateur NarL, renseign par NarX, commande le rgulon de lutilisation du nitrate 6. Un autre rgulon commande lutilisation du nitrite et se voit lui-mme contrl en amont. Une supervision gnrale est effectue par FNR, qui contrle plusieurs rgulons lis la dnitrification, ainsi que dautres oprations qui lui sont trangres comme la rduction du fumarate, ou encore le fonctionnement de la pyruvate-formiate lyase. On dit que FNR est le rgulateur dun modulon ou systme de rgulation globale. Il existe donc une hirarchie entre niveaux de rgulation pour une optimisation des diffrentes voies. FNR est comparable un disjoncteur gnral contrlant un grand nombre de fonctions. Sur chaque ligne existent des disjoncteurs particuliers, sur lesquels sont branchs des circuits distincts. Voici quelques exemples de protines rgulatrices adoptant une structure comparable (en particulier dans la partie liant lADN). Certaines reconnaissent directement loxygne (cas de FNR), dautres sont actives au sein dun systme deux composants (type FixK).
6 - Comme dans un systme classique deux composants, NarX, qui reconnat le nitrate, active la protine NarL en la phosphorylant sur aspartate.
274 Rgulateur Espce bactrienne FNR ANR FnrA FnrP NNR FixK2 DNR AadR
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas stutzeri Paracoccus denitrificans Paracoccus denitrificans Bradyrhizobium japonicum Pseudomonas aeruginosa Rhodopseudomonas palustris
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Oprons cibles 7 nar, nap, fdr, nir nar, nir, nor,nos, arc arc, ccp nar, cco, ccp nir, nor nar, rpoN 8, fix nir, nor nar, nir Dtection par fer-soufre (O2) fer-soufre (O2) fer-soufre (O2) fer-soufre (O2) oxyde nitrique [54] FixJ/FixL (O2) nitrite fer-soufre (O2)
On connat actuellement une bonne cinquantaine de protines rgulatrices de la superfamille FNR-CRP. La comparaison des squences montre quil sagit dune diversification volutive partir de la mme solution ancestrale [55]. La plasticit structurale et volutive du modle qu'elles reprsentent est remarquable. Il a t possible par mutation dobliger CRP reconnatre des promoteurs activs par FNR, et rciproquement [56], ce qui ne semble possible que si les modes dattachement lADN sont pratiquement les mmes. cela sajoutent diverses fonctionnalits : allongement de la squence et modifications locales pour recevoir un noyau fer-soufre (FNR), cration dun site daffinit pour des oxydes dazote, ou un nuclotide (AMP cyclique), acquisition dun site phosphorylable (FixK), insertion dune porphyrine La reconnaissance de O2 comme effecteur apparat comme un cas particulier, elle nest effective que pour certains membres de cet ensemble. Se rattachent aussi cette grande famille dautres protines montrant une ressemblance structurale avec FNR, notamment NarL dont il sera question plus loin [57]. Le signal O2 est-il toujours reconnu par un noyau fer-soufre ? La rponse est ngative. Parmi les autres protines qui partagent avec la FNR du colibacille des ressemblances de squence et de structure, on distingue au moins deux groupes : le type FNR, dont le systme de reconnaissance est fond sur un noyau fer-soufre, et le type FixK utilisant une porphyrine. Dans le premier existe ce quon appelle une "signature" (un consensus) dans la partie N-terminale de la squence prsume recevoir le noyau fer-soufre : Cys-x2-Cys-x5-Cys (FNR, ANR) ou Cys-x2-3-Cys-x7-Cys (AadR). Cette signature est absente dans le deuxime groupe contenant les DNR et les FixK, apparemment dpourvues de fer-soufre, et prsentes dans les bactries fixatrices dazote. Elles reoivent leurs ordres dans un systme rgulateur deux composants : FixL/J. Nous avons dj rencontr FixL propos de la fixation de lazote. Rappelons que cette protine hminique fixe O2 sur le fer(II) de sa porphyrine. En oxygne absent ou faible, FixL phosphoryle FixJ, qui active son tour FixK2. Le vritable activateur est FixK2 [58].
7 - nar : nitrate rductase membranaire. nar : idem, priplasmique. fdr : fumarate rductase. nir : nitrite rductase. nor : NO rductase. nos : N2O rductase. arc : catabolisme de larginine. ccp : cytochrome c peroxydase. cco : cytochrome cbb oxydase. rpoN : expression des gnes fix (fixation de lazote) et nif (nitrognase). 8 - Appel aussi NtrA.
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Nous avons maintenant lhabitude des protines rgulatrices qui font office de disjoncteur sur lADN. Elles autorisent ou non le dmarrage dune transcription. Lassociation sur lADN prs du promoteur peut se faire en un site unique ou sur des sites secondaires. Les rgles dassociation sur lADN sont presque toujours du mme type. La squence reconnue est palindromique et obit des critres de dimension bien dfinis. La protine sinstalle sous forme dun dimre et lADN subit au cours de lassociation une courbure ou une dformation plus ou moins prononce qui est essentielle lorsque le site de liaison est loign du promoteur. Le processus a besoin de facteurs auxiliaires tels que IHF, qui facilitent la torsion de la double hlice. Les protines du type NtrA ou FNR ont-t-elles une valeur universelle ? On sait dj que non. Bacillus subtilis est une espce Gram-positive sporulante longtemps considre comme exclusivement arobie. L'intervention d'un rgulateur tel que FNR ne devrait pas tre ncessaire. En fait ces bactries ont galement une aptitude se dvelopper en anarobiose, notamment par rduction du nitrate. Elles assimilent l'azote ammoniacal uniquement par la glutamine synthtase, et celle-ci n'apparat pas rgule comme celle du colibacille. Le contrle s'exerce par au moins trois protines rgulatrices, TnrA, GlnR et CodY, qui ont chacune leur secteur d'influence sur les gnes du mtabolisme azot en fonction des conditions physiologiques [59]. CodY est un rpresseur dans les cellules en multiplication rapide sur des acides amins comme source azote, GlnR rprime en excs d'azote dans le milieu, TnrA active ou rprime quand les ressources en azote sont limites. Le plan directeur des rgulations est rendu complexe chez B. subtilis du fait que les enzymes de dgradation des acides amins servant de source d'azote ont un rle cl la fois au cours de la sporulation et de la germination des spores.
5.7 - UNE OPTIMISATION TRS POUSSE

Lalternance entre arobiose et anarobiose est chaque fois une vritable crise dans la vie cellulaire. Elle provoque un profond bouleversement dans l'expression de nombreux gnes, modifie des enzymes du mtabolisme et les chanes de transport d'lectrons. La protine FNR contribue grer cette crise. En fait elle n'est pas seule le faire. Si le nitrate et autres oxydes de lazote sont des accepteurs respiratoires, cest--dire des succdans de loxygne lorsque celui-ci fait dfaut, il existe d'autres accepteurs possibles en fonction des disponibilits. Nous les retrouverons par la suite : dimthyl-sulfoxyde, trimthylamine N-oxyde (TMMO), fumarate (chez le colibacille), et les trs importants ions sulfate chez les sulfatorducteurs. Ces diffrents accepteurs ne sont pas tous aussi favorables sur le plan thermodynamique. Cela dpend du potentiel doxydorduction de laccepteur et du mcanisme concern. Lorsque plusieurs possibilits soffrent simultanment, les bactries ont intrt privilgier un accepteur efficace plutt quun autre moins performant. Un bon accepteur est le nitrate, dont le potentiel est bien plus favorable que celui du fumarate. Encore faut-il quil y ait du nitrate, sinon la bactrie serait condamne gaspiller son nergie en fabriquant des enzymes inutiles. Il y a
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donc un choix qui est assez bien connu pour le colibacille. Lorsqu'il est plac en anarobiose, FNR donnera le feu vert pour une activation en bloc des gnes de la dnitrification, mais dautres rgulateurs vont ouvrir ou fermer les voies autorises par FNR en fonction des facteurs disponibles et de leur efficacit. Par exemple lutilisation du fumarate (notamment lopron frdABCD de la fumarate rductase) ne sera mise en route quen anarobiose et en absence de nitrate. Si ce dernier est disponible, la fumarate rductase sera au contraire rprime pour donner la prfrence la dnitrification. Le choix des diffrentes voies autorises par FNR ncessite donc des contrles secondaires. Une rgulation centrale de nombreux oprons par FNR, des rgulations satellites sur les oprons individuels. Voici comment sexerce le choix entre nitrate et fumarate. Le colibacille peut utiliser un deuxime rgulateur de transcription, qui est NarL. Cette protine fait partie dun systme deux composants, soit un capteur (NarX) et un activateur (NarL). NarX est charg de dtecter s'il y a du nitrate ou pas. Dans le premier cas, il agit sur NarL qui renforce lactivation des gnes de lutilisation du nitrate condition que lopration soit autorise par FNR (du nitrate, mais pas de O2). Mais voici le point important : la protine NarL, au lieu de favoriser lexpression des gnes du fumarate, fait exactement linverse, entrave leur expression et fonctionne comme rpresseur. Consquence : le nitrate sera rduit en priorit. Le nitrate une fois puis, NarL perdra son affinit pour lADN et cessera son action. En labsence de O2, FNR activera lexpression des gnes du fumarate sans que NarL n'y mette dentrave.
NarX priplasme cytoplasme N His ATP C nitrate rductases (narGHJI,napA) nitrite rductases (nirBDC, nrfABCDEFG) exportateur de nitrite (narK) formiate dshydrognase (fdnGHI) DMSO/TMNO rductase (dmsABC) fumarate rductase (frdABCD) alcool dshydrognase (adhE) pyruvate-formiate lyase (pfl) ADP C P His P Asp N NarL Asp NarX-P nitrate
+
NarL
NarX reconnat le signal nitrate et rgule NarL

La protine NarX est membranaire, elle comporte une partie qui dpasse dans le priplasme et reconnat la prsence du nitrate lextrieur, ainsi que le nitrite. Elle
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possde aussi un domaine cytoplasmique porteur de lactivit autokinase comme dans tous les systmes deux composants. Lautophosphorylation de NarX s'effectue en continu mme en l'absence du signal nitrate, elle est seulement acclre dans un rapport de 2 10 aprs arrive du nitrate. NarX phosphoryle NarL aprs stre phosphoryle elle-mme un taux suffisant. Lexistence dun taux de base permanent autorise peut-tre une plus grande rapidit de rponse larrive du signal. Par mutation de la squence qui dpasse dans le priplasme, on peut crer une situation o NarX sautophosphoryle au taux maximum et transmet le signal mme quand il ny a pas de nitrate (verrouillage ON), alors que dautres mutations ont leffet inverse (verrouillage OFF). La reconnaissance du nitrate est donc lorigine dun changement de conformation qui se transmet travers la membrane et agit sur le taux dautophosphorylation [60]. NarX devenu NarX-phosphate agit comme une kinase, elle transmet son phosphate NarL ( NarL-phosphate). Ces deux protines ont t caractrises dabord dans le colibacille, mais se retrouvent sous des formes voisines chez les diffrentes espces bactriennes dnitrifiantes tudies. Cette rgulation est en double chez le colibacille. Un systme NarQ/NarP est homologue du prcdent. Les deux systmes dtectent la fois le nitrate et le nitrite. Le partage des comptences relles entre les deux tandems rgulateurs, NarX/NarL et NarQ/NarP, nest pas clairement lucid. La rponse au nitrate est la plus vive, elle est dclenche pour un seuil de 5 M dans NarX (avec une phosphorylation 50% pour 35 M) contre des doses au moins 50 fois plus leves avec le nitrite [61]. Il y a probablement des diffrences daction sur plusieurs voies mtaboliques cellulaires, permettant un rglage fin de la machinerie gnrale. La liaison phosphate sur ces protines est labile, ce qui garantit qu'en cas de disparition du signal le systme retourne la case dpart. Sinon NarL-phosphate sassocie lADN sur un mode remarquable. La reconnaissance seffectue sur un site heptamrique (squence de 7 nuclotides), de type TACYNMT (Y est C ou T, M est A ou C, N est nimporte quel nuclotide). Or il y a plusieurs heptamres chelonns en amont du gne rgul. Ces heptamres se prsentent en motifs isols ou par paires. Par exemple en amont du gne narG, qui est celui de la nitrate rductase, il ny a pas moins de 8 sites heptamres allant des positions 57 208 9. La transcription en aval est donc le rsultat d'un jeu subtil de reconnaissance du promoteur, d'interaction avec lARN-polymrase, de l'intervention dautres protines (qui facilitent ou entravent les associations), d'une courbure de lADN (induite en particulier par IHF). Une illustration montre la disposition constate chez le colibacille en amont de lopron nir qui code pour une nitrite rductase cytoplasmique. Lactivation seffectue la fois par la disparition d'O2 (reconnue par FNR) et par la prsence de nitrite (NarL et NarQ). Ce systme a t tudi en dtail en Angleterre par le groupe de BUSBY (WU et coll [62]). De nombreuses mutations ont t introduites des positions comprises entre 150 et 11 en amont du dpart de la transcription, tout en faisant varier la distance entre les sites de FNR et de NarL. Lamorage par sigma-54 (RpoN) ne
9 - Positions repres par la technique des empreintes la Dnase I (footprinting).
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peut pas se faire sans lassociation lADN de NarL (ou de NarP) et de FNR. Les rglages sont complexes. FNR serait lactivateur principal de la transcription, mais son action serait contrecarre par une ou plusieurs protines se liant spcifiquement en amont du site de NarL et agissant comme rpresseurs. Lune de ces protines a t identifie (Fis) et se lie vers 140. Le rle de NarL serait dcarter ces gneurs et de dgager FNR de toute inhibition. Cette interprtation, qui nest probablement pas gnralisable dautres oprons, montre que lintervention des rgulateurs sur lexpression des gnes quils gouvernent peut obir des rgles varies et parfois compliques.
69,5
TACCCATTAAGGAGTA ATGGGTAATTCCTCAT
69,5 41,5
TACCCATTAAGGAGTATATGGATGTGAATTTGATTTACATCAAT
69,5 site NarL, NarP
41,5 site FNR
26 10 rgion reconnue par sigma-54
+1 dpart de la transcription
Rgion rgulatrice en amont de l'opron nar

En fonction de tout cela, on voit nouveau quil existe une hirarchie dans les protines rgulatrices. Aprs les rgulateurs comme FNR qui commandent des grandes options du mtabolisme, dautres protines modulent les dtails, et leurs organisation dpend de ladaptation physiologique des espces. Le colibacille, contient plus de cinquante protines rgulatrices et les rgions reconnues par elles sur lADN, non transcrites, correspondent une part importante du gnome total [63]. Le diagramme inspir de WALTER ZUMFT (1997) montre comment une dnitrification complte, symbolise par la zone dintersection ombre, est obtenue par le fonctionnement simultan de plusieurs rgulons, reprsents chacun par un cercle.
respiration nar (NarL) Dn.
respiration nir, nor (DNR)
Trois grandes tapes sont rgules par des protines diffrentes.
respiration nos (NosR)
nar nir, nor nos
rduction nitrate nitrite rduction nitrite NO N2 rduction N2O N2
Dnitrification complte (Dn.)
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La dnitrification est une fonction modulaire correspondant au moins trois respirations anarobies diffrentes qui sont ingalement reprsentes selon les espces. Par exemple, le passage de N2O N2 manque chez Escherichia coli. Malheureusement il est trs difficile de donner un plan absolument gnral. Le schma suivant, inspir nouveau de ZUMFT (1997), a le mrite de comparer trois solutions parmi celles qui sont possibles chez les Gram-ngatives, correspondant au tableau des protines type FNR rencontr plus haut. Ce sont seulement trois exemples, un chantillonnage srement insignifiant face lnorme diversit naturelle. Un rectangle du tableau correspond aux oprons activs par un mme rgulateur (flche).
DNR FnrD NirL NNR
nir nar
nor nos arc ANR 1
nir nar
nor nos arc, ccp NosR
nir nar
nor
cco, ccp FnrP 3
NarL 2
FnrA
Trois solutions
Ces quelques indications nous montrent la complexit des rgulations cellulaires en fonction de lespce et de la nature du milieu. Elles nont ici quune valeur dexemple. Ce que nous voyons est une optimisation pousse qui est le fruit dune longue volution. La population des micro-organismes dans les milieux naturels est le sige de comptitions o chaque forme sefforce doptimiser son mtabolisme. Il en rsulte une grande plasticit oprationnelle autorisant des biodgradations anarobies dans une gamme tendue de conditions diffrentes. Pour jeter un regard plus synthtique sur ces questions importantes o s'entrecroisent beaucoup de donnes, un rsum rassemblera les quatre mcanismes de base qui permettent aux cellules anarobies facultatives d'adapter leur mtabolisme en passant de l'arobiose l'anarobiose, et vice versa, ou encore de rsister la prsence de l'oxygne. Les deux premiers sont des modulons, ils concernent chacun une palette de fonctions diffrentes. Le troisime et le quatrime sont des rgulons, dont la vocation est plus spcialise. quelle teneur du milieu en O2 l'interconversion se fait-elle ? Elle est forcment variable avec les espces, mais rappelons que la limite se situe vers 0,1 0,5% du taux maximum de O2 en quilibre avec l'air.
280 Rgulateur Dtection

FNR Oxydation et destruction rversible de [4Fe-4S]2+ par O2.
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Fonction

Utilisation du nitrate, du nitrite et du fumarate comme accepteurs. Agit comme activateur ou rpresseur, interagit avec la sous-unit de l'ARN-polymrase. La plupart des oprons contrls le sont aussi par d'autres protines. Rprime le gne fnr, active arcA. ArcA phosphoryle en ArcA-P (systme deux composants), se lie l'ADN et rprime en gnral les gnes impliqus dans l'arobiose. Dphosphorylation par ArcB non phosphoryle. SoxR oxyde stimule l'amorage par l'ARNpolymrase et active la transcription de soxS. SoxS se lie aux promoteurs des gnes de dfense contre le superoxyde et y stabilise l'attachement de la polymrase OxyR autorgule sa propre expression, rgule 20-30 gnes concerns par la rsistance aux peroxydes.
ArcA
Phosphorylation de ArcB en ArcB-P stimule par divers mtabolites (lactate, pyruvate) et un potentiel redox bas. SoxR avec 2 [2Fe-2S]+ oxyds par superoxyde. Taux cellulaire constant. Li l'ADN. Oxydation de OxyR sur thiols en prsence de H2O2. Taux cellulaire constant.
SoxR,S
OxyR
CONCLUSION
La dnitrification pratique par les bactries apporte une solution puissante au recyclage des matires carbones en anarobiose tant que le nitrate est prsent. Cette activit donne lieu des rglages sophistiqus sur le plan de l'expression des gnes, car elle est tributaire de la production de nitrate par oxydation de l'ammoniac, et cette partie du cycle de l'azote fait intervenir une comptition avec les plantes et les champignons. Les bactries dnitrifiantes sont souvent capables d'effectuer en anarobiose de nombreuses biodgradations et se montrent capables d'utiliser des accepteurs de remplacement quand le nitrate fait dfaut. La dnitrification reste dans tous les cas un maillon quasi essentiel dans les biodgradations anarobies.
RFRENCES
[1] F A U R E G (1991) Principles and Applications of Inorganic Geochemistry, Macmillan Publishing Co., New York. [2] A B E R JD (1992) Trends in Ecology Evolution 7 : 220-223. [3] V I L L A R E A L TA, P I L S K A L N C , B R Z E Z I N S K I M, L I P S C H U L T Z F, D E N N E T T M & G A R D N E R G B (1999) Nature 397 : 423-425. [4] Z E H R JP, W A T E R B Y JB, T U R N E R PJ, M O N T O Y A JP, O M O R E G L E E, S T E W A R D G F , H A N S E N A & K A R L D M (2001) Nature 412 : 635-638.
5 AZOTE ET ANAROBIOSE [5] N E Y R A C , D B E R E I N E R J, L A L A N D E R & K N O W L E S R (1977) Can. J. Microbiol. 23 : 300-305 ; N E L S O N LM & K N O W L E S R (1977) Can. J. Microbiol. 24 : 1395-1403.
281
[6] Z H U L I N IB, B E S P A L O V VA, J O H N S O N MS & T A Y L O R BL (1996) J. Bacteriol. 178 : 5199-5204 ; M A R C H A L K, S U N J, K E I J E R S V, H A A K E R H & V A N D E R L E Y D E N J (1998) J. Bacteriol. 180 : 5689-5696. ]7] V A R G A S C , W U G , D E L G A D O MJ, P O O L E RK & D O W N I E JA (1996) Microbiology 142 : 41-46. [8] B A K E R D D & S C H W I N T Z E R C R (1990) Introduction, The biology of Frankia and Actinorhizal Plants, Academic Press : 1-13. [9] S I M O N E T P, N G U Y E N TL, T E S S I E R D U C R O S E & B A R D I N R (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 2500-2503. [10] P U P P O A, D I M I T R I J E V I C L & R I G A U D J (1989) Physiologia Plantarum 77 : 308-311. [11] L E V I N E A, T E N H A K E N R, D I X O N R & L A M B C (1994) Cell 79 : 583-593. [12] K I M J & D .C . R E E S (1992) Nature 360 : 553-560 ; K I M J & coll. (1993) Biochemistry 32 : 7104-7115. [13] S E E F E L D T LC , R A S C H E ME & E N S I G N S A (1995) Biochemistry 34 : 5382-5389. [14] S C H N E I D E R K, G O L L A N U, D R T T B O O M M, S E L S E M E I E R - V O I G T S & M L L E R A (1997) Eur. J. Biochem. 244 : 789-800. [15] L O W E D J & T H O R N E L E Y RN (1984) Biochem. J. 224 : 877-886 ; T H O R N E L E Y RN & L O W E D J (1984) Biochem. J. 224 : 887-894 ; L O W E D J & T H O R N E L E Y RN (1984) Biochem. J. 224 : 895-901. [16] S E E F E L D T LC , R A S C H E ME & E N S I G N S A (1995) Biochemistry 34 : 5382-5389 ; R A S C H E ME & S I E F E L D T LC (1997) Biochemistry 36 : 8574-8585. [17] J A C O B S O N MR, B R I G L E KE, B E N N E T T LT, S E T T E R Q U I S T RA, W I L S O N MS , C A S H VL, B E Y N O N J, N E W T O N W E & D E A N D R (1989) J. Bacteriol. 171 : 1017-1027 ; P A U RN (1989) Trends Biochem. Sci. 14 : 183-186. [18] L E E S , R E T H A, M E L E T Z U S D , S E V I L L A MV & K E N N E D Y C (2000) J. Bacteriol. 182 : 7088-7091. [19] H O M E R MJ, P A U S T I A N TD , S H A H VK & R O B E R T S G P (1993) J. Bacteriol. 175 : 4907-4910. [20] N I S H I O K & N A K A I M (2000) J. Biol. Chem. 275 : 22615-22618 ; L E I M K H L E R S & R A J A G O P A L A N KV (2001) J. Biol. Chem. 276 : 22024-22031. [21] L E E S H , P U L A K A T L, P A R K E R KC & G A V I N I N (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 244 : 498-504. [22] B A R R E T T J, R A Y P, S O B C Z Y K A, L I T T L E R & D I X O N R (2001) Mol. Microbiol. 39 : 480-493. [23] R E Y E S - R A M I R E Z F, L I T T L E R & D I X O N R (2001) J. Bacteriol. 183 : 3076-3082. [24] G O V A N T E S F, M O L I N A - L O P E Z JA & S A N T E R O E (1996) J. Bacteriol. 178 : 6817-6823. [25] D I X O N R (1998) Arch. Microbiol. 169 : 371-380 ; M O N E Y Y , B A R R E T T J, D I X O N R & A U S T I N S (2001) J. Bacteriol. 183 : 1359-1368. [26] E A R L C D , R O N S O N C W & A U S U B E L FM (1987) J. Bacteriol. 169 : 1127-1136. [27] G O N G W , H A O B, M A N S Y S S , G O N Z A L E Z G , G I L L E S - G O N Z A L E Z MA & C H A N MK (1998) Proc. Natl. Acad. Sci 95 : 15177-15182. [28] M O R E N O - V I V I A N C & F E R G U S O N S J (1998) Molec. Microbiology 29 : 664-666. [29] S A B A T Y M, G A G N O N J & V E R M E G L I O A (1994) Arch. Microbiol. 162 : 335-343. [30] S T E W A R T V (1988) Microbiol. Rev. 52 : 190-232 ; H O C H S T E I N LI & T O M L I N S O N G A (1988) Annu. Rev. 42 : 231-261.
282
[31 ] C R A W F O R D NM & A R S T J R . H N (1993) Annu. Rev. Genet. 27 : 115-146 ; L I N JT & S T E W A R T V (1998) Adv. Microb. Physiol. 39 : 1-30. [32] K R O T S K Y A & W E R N E R D (1987) Arch. microbiol. 147 : 48-57. [33] S T R A U B KL, B E N Z M, S C H I N K B & W I D D E L F (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 1458-1460. [34] C A R L S O N C A & I N G R A H A M JL (1983) Appl. Environ. Microbiol. 45 : 1247-1253 ; B R A U N C & Z U M F T W G (1992) J. Bacteriol. 174 : 2394-2397. [35] C A R T E R JP, H S A I O Y H , S P I R O S & R I C H A R S O N D J (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 2852-2858. [36] C O L E J (1996) FEMS Microbiol. Lett. 136 : 1-11. [37] H O F F M A N N T, F R A N K E N B E R G N, M A R I N O M & J A H N D (1998) J. Bacteriol. 180 : 186-189. [38] P O T H M & F O C H T D D (1985) Appl. Environ. Microbiol. 49 : 1134-1141 ; P O T H M (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52 : 957-959. [39] S C H M I D T I & B O C K E (1997) Arch. Microbiol. 167 : 106-111 ; Z A R T D , B O C K E (1998) Arch. Microbiol. 169 : 282-286. [40] D A U M M, Z I M M E R W , P A P E N H , K L O O S K, N A W R A T H K & B O T H E H (1998) Curr. Microbiol. 37 : 281-288. [41] J E T T E N MS , D E B R U I J N P & K U E N E N JG (1997) Antonie Van Leeuwenhoek 71 : 69-74. [42] A N D E R S O N IC , P O T H M, H O M S T E A D & J , B U R D I G E D (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3525-3533 ; Z A R T D & B O C K E (1998) Arch. Microbiol. 169 : 282-286. [43] K U A I L & V E R S T R A E T E W (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 4500-4506. [44} C O N R A D R (1996) Microbiological Rev. 60 : 609-640. [45] H Y M A N MR & A R P D J (1995) J. Bacteriol. 177 : 4974-4979. [46] K E E N E R W K, R U S S E L L S A & A R P D J (1998) Bichim. Biophys. Acta 1388 : 373-385. [47] B L E A K L E Y BH & T I E D J E JM (1982) Appl. Environ. Microbio. 44 : 1342-1348 ; B U R T H L, B E N C K I S E R G & O T T O JC G (1982) Naturwissenschaften 69 : 598-599 ; S H O U N H , K I M D H , U C H I Y A M A H & S U J I Y A M A J (1982) FEMS Microbiol. Lett. 94 : 277-281 ; N A K A H A R A K, T A N I M O T O T, H A T A N O K, U S U D A K & S H O U N H (1993) J. Biol. Chem. 268 : 8350-8355 ; U S U D A K, T O R I T S U K A N, M A T S U O Y , K I M D H & S H O U N H (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 883-889. [48] S H O U N H , K I M D H , U C H I Y A M A H & S U G I Y A M A J (1992) FEMS Microbiol. Lett. 73 : 277-281. [49] K O B A Y A S H I M, M A T S U O Y , T K I M O T O A, S U Z U K I S , M A R U O F & S H O U N H (1996) J. Biol. Chem. 271 : 16263-16267. [50] S A W E R S RG , Z E H E L E I N E & B C K A (1988) Arch. Microbiol. 149 : 240-244 ; K I L E Y PJ & B E I N E R T H (1999) FEMS Microbiol. Rev. 22 : 341-352. [51] S P I R O S & G U E S T JR (1990) FEMS Microbiol. Rev. 75 : 399-428 ; U N D E N G & S H I R A W S K I J (1997) Mol. Microbiol. 25 : 205-210. [52] L A Z A Z Z E R A BA, B E I N E R T H , K H O R O S H I L O V A N, K E N N E D Y MC & K I L E Y PJ (1996) J. Biol. Chem. 271 : 2762-2768. [53] P O P E S C U C V, B A T E S D M, B E I N E R T H , M N C K E & K I L E Y PJ (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 13431-13435 ; K I L E Y PJ & B E I N E R T H (1999) FEMS Microbiol. Rev. 22 : 341-352. [54] H A S E G A W A N, A R A I H & I G A R A S H I Y (1998) FEMS Microbiol. Lett. 166 : 213-217.
5 AZOTE ET ANAROBIOSE [55] F I S C H E R H M (1994) Microbiol. Rev. 58 : 352-386 ; V O L L A C K KU, H R T I G E, K R N E R H & Z U M F T W G (1999) Molec. Microbiol. 31 : 1681-1694. [56] S A W E R S G , K A I S E R M, S I R K O A & F R E U N D L I C H M (1997) Molec. Microbiol. 23 : 835-845. [57] B A I K A L O V L, S C H R D E R I, K A C Z O R - G R Z E S K O W I A K M, G R Z E S K O W I A K K, G U N S A L U S RP & D I C K E R S O N RE (1996) Biochemistry 35 : 11053-11061. [58] G I L L E S - G O N Z A L E Z MA, G O N Z A L E Z G & P E R U T Z MF (1995) Biochemistry 34 : 232-236. [59] F I S H E R S H (1999) Molecular Microbiol. 32 : 223-232. [60] C A V I C C H I O L I R, C H I A N G RC , K A L M A N LV & G U N S A L U S RP (1996) Molec. Microbiol. 21 : 901-911. [61] L E E AI, D E L G A D O A & G U N S A L U S RP (1999) J. Bacteriol. 181 : 5309-5316. [62] W U H C , T Y S O N KL, C O L E JA & B U S B Y S JB (1998) Molecul. Microbiol. 27 : 493-505. [63] T H I E F F R Y D , S A L G A D O H , H U E R T A AM & C O L L A D O - V I D E S J (1998) Bioinformatics 14 : 391-400.
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RDUCTION DES OXYDES D'AZOTE

Ce chapitre examine les enzymes qui transforment progressivement le nitrate en azote gazeux ou en ammoniac, par les tapes entrevues dans le chapitre prcdent. On s'intressera au mcanisme daction des diffrentes rductases qui participent la dnitrification, sans lesquelles, bien des biodgradations seraient impossibles. Les bactries n'en ont pas l'exclusivit, et l'intervention des champignons sera voque en fin de chapitre. 6.1 - Nitrate rductases et molybdne 6.2 - Nitrate rductases varies 6.3 - La rduction des nitrites 6.4 - Le passage direct du nitrite lammonium 6.5 - De loxyde nitrique loxyde nitreux 6.6 - De N2O au diazote 6.7 - Des champignons dnitrifient 287 290 293 301 303 307 309
CHAPITRE 6
6 RDUCTION DES OXYDES D'AZOTE

Le grand cycle de lazote dans la nature comporte un va-et-vient entre la forme la moins oxyde, qui est lammonium, et la plus oxyde, qui est le nitrate. Le chapitre prcdent nous a permis dentrevoir quelques tapes fondamentales, comme la raction de la nitrognase. Ce nouveau chapitre est surtout enzymologique. Il tente de dcrire le mcanisme daction des diffrentes rductases qui participent la dnitrification. En labsence de celle-ci, bien des biodgradations deviendraient impossibles. La dnitrification fait partie des grands agents moteurs de la biochimie de lenvironnement au mme titre que les oxydations effectues laide de loxygne.
6.1 - NITRATE RDUCTASES ET MOLYBDNE

de rares exceptions prs, la rduction biologique du nitrate, quelle soit respiratoire ou assimilatrice, a besoin de molybdne, un oligo-lment dont cest lune des contributions biologiques essentielles. Nous l'avons trouv dans la nitrognase, l'enzyme charge de rduire le diazote en ammoniac. Le molybdne sy rencontrait dans un noyau fer-soufre dun type particulier, mais la nitrognase est une exception parmi les enzymes molybdne. Dans tous les autres cas o il intervient, le molybdne est log dans un cofacteur nuclotidique. Les molybdo-enzymes sont nombreuses et varies. Le mtal oscille entre les stades Mo(VI) et Mo(IV). Ce n'est que le trente-cinquime lment par ordre dabondance dans la crote terrestre et son importance biologique n'attire pas toujours l'attention qu'elle mriterait. On trouvera la page suivante un petit tableau pour souligner le rle de Mo dans la nature, nitrognase exclue. Les ractions catalyses et des renseignements supplmentaires sont donns en glossaire. Il est noter que le molybdne a son double qui est le tungstne. Ce mtal a peut-tre particip au dveloppement de la vie ds les temps les plus anciens, car il se rencontre chez des bactries rputes hritires des formes les plus primitives. Le tungstate est volontiers un inhibiteur des enzymes molybdne, mais il est requis pour lactivit de certaines enzymes comme la formiate dshydrognase des archaebactries hyperthermophiles et des mthanognes (voir Tungstne*). Il existe donc des tungsto-enzymes, o le mtal est li un cofacteur organique de mme nature que celui qui renferme du molybdne [1]. Le cofacteur nuclotidique molybdne fut dcouvert lorigine dans un mutant nit-1 de Neurospora crassa. Sa nitrate rductase tait sans action mais un mlange de constituants faible masse
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molculaire pouvait la ractiver [2]. Les mutants de ce type ont souvent des dfauts multiples au niveau des diverses enzymes maintenant rpertories comme molybdo-enzymes. La nitrate rductase en fait partie. Labsence dune nitrate rductase fonctionnelle entrane une proprit caractristique, qui est la rsistance au chlorate (NaClO3). L'explication est la suivante : la nitrate rductase rduit le chlorate en produits hautement toxiques, comme lhypochlorite, et un dfaut de cette enzyme met le mutant labri de cet inconvnient.
Exemples Nitrate rductase Slniate rductase Arsniate rductase Formiate dshydrognase 2-oxocarboxylate rductase Sulfite rductase FormylMF* dshydrognase TMAO** rductase DMSO*** rductase Polysulfure rductase Aldhyde oxydorductase Sulfite oxydase Xanthine oxydase Aldhyde oxydase Fonction catalytique Rduction des nitrates en nitrites Rduction des slniates en slnites Rduction des arsniates en arsnites Oxydation du formiate en CO2 Rduction en (2R)-hydroxycarboxylate Rduction de lhydrosulfite en sulfure Oxydation du formylMF Rduction du TMAO en trimthylamine Rduction du DMSO en dimthylsulfure R. respiratoire du polysulfure en sulfure Conversion aldhyde/acide Oxydation du sulfite en sulfate Oxydation des purines en acide urique Oxydation des aldhydes en acides Localisation Procaryotes, vgtaux Bactries (Thauera) Bactries (Chrysiogenes) Procaryotes Bactries (P. vulgaris) Procaryotes, vg., an. Mthanognes Bactries Bactries Bactries (Wolinella) [3] Bactries (Desulfovibrio) Animaux Animaux, champignons Animaux
* Formylmthanofurane, ** Trimthylamine-N-oxyde, *** Dimthylsulfoxyde
La structure chimique du cofacteur indique ici est celle du molybdoptrine-guanine dinuclotide ou MGD, prsent dans Rhodobacter sphaeroides IL106 [4]. On reconnat facilement la position du molybdate Mo(VI), li deux atomes de soufre (thiolne), et droite la structure dun nuclotide guanine. Chez certaines espces la guanine est remplace par dautres bases. Les cofacteurs portant du molybdne forment une famille de produits. La moiti gauche de la formule montre ici comporte un cycle pyrane, qui est ferm par un atome doxygne. Le cycle peut tre ouvert (avec apparition dun OH) par un mcanisme doxydorduction rversible qui ferait partie du fonctionnement du cofacteur.
O O HN H2N H N N H S Mo S O P O P O CH2 N N N O O NH
NH2
HO
molybdoptrine
O O O O HO OH
Molybdoptrine-guanine dinuclotide (MGD)
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L'ensemble du MGD est donc une structure forme par deux nuclotides souds par leurs phosphates comme dans la structure du NAD ou du FAD. Les prcurseurs sont deux units indpendantes de GMP (guanosine-monophosphate). Lun de ces nuclotides est transform en molybdoptrine sous laction dune synthase, qui introduit les atomes de soufre et autorise ainsi la mise en place du molybdate. L'opration est suivie de la soudure des deux nuclotides. Le molybdate est la principale source de Mo dans les eaux et le sol, o son abondance est modeste, soit 0,04 0,2 ppm, bien moindre que celle du fer ou du manganse. Laccumulation des dbris vgtaux reprsente un rservoir de molybdne dans la biosphre. La teneur des tissus vgtaux est en moyenne de 0,8 5 ppm. Une carence en molybdne des plantes cultives est favorise par un sol acide. La synthse de ce cofacteur a t tudie en dtail dans E. coli et on suppose que son principe est gnralisable aux autres espces. Grce des systmes trs efficaces de capture et de transport, la rcupration de Mo par les bactries nest pas un problme physiologique majeur. La question a t examine en dtail chez plusieurs Gram-ngatifs. Le transport est de type ABC, dont le reprsentant le plus tudi dans la recherche est celui du maltose [5]. Cette dsignation fait allusion trois parties, une protine priplasmique trs haute affinit pour le compos piger (ici le molybdate), un transporteur log dans la membrane cytoplasmique, et une ATPase du ct interne. Ce mcanisme est trs rpandu chez les bactries et possde son quivalent chez les eucaryotes. Aprs capture du molybdate, celui-ci se voit donc transmis et concentr dans la cellule bactrienne avec laide dune hydrolyse dATP comme source dnergie 1. Les cellules disposent dune petite rserve de mtal grce une protine de stockage, qui a t dtecte dans un Gram-positif (Clostridium pasteurianum) l'aide de molybdate marqu [6]. La fonction de Mo dans certaines enzymes doxydorduction est maintenant assez bien connue. Une petite parenthse peut tre ouverte en citant la formiate dshydrognase-H (FDH-H) dEscherichia coli . Sa structure dtaille est connue. Le molybdne y est li non seulement au cofacteur MGD dcrit plus haut, mais au slnium de la slnocystine, et le mcanisme de la catalyse est maintenant assez bien cern [7]. La structure en dinuclotide du MGD ne se retrouve pas dans toutes les molybdoenzymes. Le cofacteur peut navoir que la partie molybdoptrine ou MPT, qui est dans le cadre gris de la formule prsente plus haut. Si le molybdne est gnralement indispensable la rduction biologique du nitrate, on connat tout de mme de petites exceptions. la fin de 1998, des auteurs russes ont fait tat de la dcouverte dun Pseudomonas (Ps. isachenkovii), dont la nitrate rductase tait dpourvue de molybdne et du cofacteur correspondant [8]. Lenzyme tait priplasmique et renfermait du vanadium. Une autre rductase tait membranaire et ne possdait ni molybdne, ni vanadium. La question se pose donc de savoir sil sagissait dun cas exceptionnel, ou dune situation plus commune qu'escompt,
1 - Au laboratoire, les cultures en milieu dfini peuvent exiger lintroduction de faibles quantits de molybdate. mais les impurets des produits commerciaux peuvent suffire, ainsi que l'acier inox des rcipients.
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qui aurait chapp aux investigations antrieures. La section suivante sintresse aux nitrate rductases bactriennes Mo, pices classiques de la dnitrification. Les nitrate rductases "courantes" se rpartissent grosso modo en trois plans structuraux. Lanalyse des squences montre quil y a de fortes homologies lintrieur de chacune des trois familles, dont la section suivante nous donnera les principaux caractres.
6.2 - NITRATE RDUCTASES VARIES

La multiplicit des nitrate rductases microbiennes a t rsume dans un tableau o apparaissent les sigles gntiques de base. Dans la premire colonne, larchtype de la nitrate rductase respiratoire et membranaire est le complexe NarGHI dEscherichia coli. Ce systme est rprim par O2. Il intervient dans la dnitrification. La colonne suivante cite la rductase NapAB loge dans le priplasme. Elle peut commander un mcanisme nergtique, donc une respiration de remplacement sur nitrate quand les conditions sont arobies. Si NapAB peut effectivement se substituer NarGHI en prsence dair, il s'agira d'une source nergtique d'appoint car la respiration sur O2, plus efficace sur le plan thermodynamique, conservera le rle prdominant. Fonction
Localisation Structure sous-units Sigle gntique Cytochromes Induction par nitrate Rpression par NH4+ Rpression par O2 Transport nitrate exig M sous-unit catalytique
Respiration sur nitrate [9]

Membrane 222 + narGHJI, narZYWV Type b (NarI) oui non oui oui 150 kDa (NarA)
Respiration ou contrle redox [10]

Priplasme + cytochr. membr. napABC Type c (NapB) oui non non non 90 kDa (NapA)
Assimilation du nitrate [11]

Cytoplasme nasA (aucun) oui oui non oui 92 kDa
NarGHI du colibacille est larchtype du complexe membranaire de la nitrate rductase respiratoire. Ce systme est rprim par O2. Dans la colonne du milieu, la rductase NapAB situe dans le priplasme peut donc commander une rduction du nitrate en arobiose comme il a t dit. NasA est une rductase soluble fonction assimilatrice qui ne participe pas une rcupration dnergie. Les lectrons prlevs sur nitrate par les rductases respiratoires sont capts par un ou plusieurs cytochromes. L'un d'eux est NarI qui fait partie intgrante du complexe NarGHI. Celui-ci est associ la membrane et participe la conservation dnergie sous forme d'un potentiel p. Les lectrons prlevs sur le nitrate par la rductase priplasmique NapAB parviennent aux chanes de transport dlectrons de la membrane sur sa face externe avec conservation dnergie. Toutes ces rductases ont un cofacteur molybdne et sont des protines fer-soufre. Lorsquelles rduisent le
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nitrate sur la face cytoplasmique de la membrane (NarGHI) ou dans le cytoplasme lui-mme (NasA), un mcanisme de transport des ions nitrite et nitrate est rendu ncessaire, car la membrane ne leur est pas directement permable. La NarGHI de E. coli fonctionne grce un antiporteur* : pour chaque nitrate qui rentre, il y a un nitrite qui sort. Cet antiporteur est cod par narK et inductible en mme temps que la rductase [12]. Dans le cas de la rductase cytoplasmique assimilatrice existe un transporteur spcial observ dans Klebsiella pneumoniae et un Synechococcus. La plupart des bactries dnitrifiantes semblent avoir au moins deux rductases, voire trois, et il existe mme plusieurs varits dans chaque catgorie ! Les nitrate rductases respiratoires ont fait lobjet dune attention particulire. ct de la rductase membranaire du colibacille qui est la mieux connue et code par l'opron narGHJI, existe un deuxime complexe cod par l'opron narZYWV. Celui-ci est fortement homologue du prcdent et dtermine une nitrate rductase dont les sousunits sont interchangeables avec la premire [13]. Cette situation est assez rpandue dans les espces dnitrifiantes, dont Pseudomonas aeruginosa, Ps. stutzeri, Paracoccus denitrificans, Bacillus subtilis, Staphylococcus carnosus et autres. Voici la composition du complexe NarGHJI du colibacille. Il possde sa chane d'oxydorduction interne avec NarH et NarI. La partie NarI contribue ancrer solidement l'difice molculaire la membrane : un chaperon molculaire particulier pour la nitrate rductase et linsertion du cofacteur molybdne dans la partie NarG [14]. Sous-units M(kDa) Cofacteur associ Fonction NarG NarH NarI NarJ
138,7 57,7 26,5 25,5 MGD [3Fe-4S], 3 [4Fe-4S] cytochrome b aucun Catalytique, rduit le nitrate Transfre les lectrons de NarJ NarG Ancre membranaire, rduit par mnaquinol Stabilisateur, agit comme chaperon molculaire
La sous-unit NarH a quatre centres fer-soufre numrots de 1 4. tudis par RPE et potentiomtrie, ils prsentent une cascade de potentiels doxydorduction diffrents, respectivement + 80, + 60, 200 et 400 mV. Le centre 2 est un [3Fe-4S]. Chose curieuse, lactivit rductase n'est pas supprime si le centre 1, dont le potentiel est le plus lev, est limin aprs mutation 2. Les lectrons sont probablement achemins au sein du complexe par le canal de ces noyaux fer-soufre dont la chane n'a pas besoin d'tre complte [15]. cette chane fait suite le dispositif de NarI, qui est un cytochrome b comportant deux hmes B [16] et possde deux potentiels diffrents, soit + 17 et + 122 mV. La structure du cytochrome deux fois hminique semble obir un schma courant observ dans les complexes bc1 comme celui qu'on trouve dans la mitochondrie. La nitrate rductase est donc un complexe macromolculaire amenant les lectrons petits pas vers le nitrate, lequel est rduit sur la face cytoplasmique de la membrane. D'o viennent les lments rducteurs ? Ils seraient fournis par un quinol respiratoire (quinone rduite) ou un mnaquinol.
2 - Les centres fer-soufre sont lis ordinairement la protine par des rsidus de cystine (Cys). Une mutation remplace un Cys par la srine ou lalanine et empche linsertion correcte du cofacteur.
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Contrairement lenzyme membranaire, la nitrate rductase priplasmique n e rduit pas le chlorate mais accepte une certaine arobiose. Cette rductase ou NapABC est btie sur un plan assez diffrent du prcdent d'aprs les tudes faites sur Ralstonia eutropha et lespce photosynthtique Rhodobacter sphaeroides [10] : Sous-units M(kDa) Cofacteur associ NapA NapB NapC NapD, NapE
93,3 18,9 27 25,5 MGD, [4Fe-4S] Cytochrome c dihme Cytochrome c ttrahme [4Fe-4S]
Fonction
Catalytique, rduit le nitrate Transfre les lectrons de NapC NapA Rduit NapB, insr dans la membrane Incompltement tudis, fonct. mal connue
En arobiose, lenzyme respiratoire NarGHJI est hors course, car il y a rpression de sa synthse, mais la rductase priplasmique peut prendre le relais et aurait une double fonction. Elle dissiperait lexcs de pouvoir rducteur, notamment dans les espces photosynthtiques comme Rhodobacter o il peut y avoir une sorte de "surchauffe" en clairement fort. Elle peut aussi faire du nitrite dont la dnitrification peut se poursuivre en prsence de O2. La rductase priplasmique pourrait aussi faciliter la transition au fonctionnement anarobie en cas dpuisement soudain en oxygne, laissant le temps au cellules de refaire leur stock en NarGHJI. Un diagramme rsume ce qui prcde. Une quinone respiratoire et sa forme quinol sont dsignes par Q et QH2. Sont figures la nitrate rductase respiratoire NarGHI et lenzyme priplasmique NapABC. La protine membranaire NarK est le transporteur.
NapABC NO2 priplasme (I) membrane NarK (H) Fe-S NO3 b (G) MGD QH2 Q (C) (A) MGD (B) QH2 Q
cytoplasme
NarGHI
Nitrate rductases
Les acteurs de la dnitrification ont donc une palette doutils de base pour faire face des besoins varis et fluctuants, mais il ne s'agit que du dbut du processus. Il nous reste examiner rapidement les systmes qui rduisent les nitrites, NO et N2O. Une mine de trouvailles a permis de comprendre un peu mieux un cycle biochimique dont les rpercussions sur lagronomie et la dfense de lenvironnement sont l'vidence essentielles.
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6.3 - LA RDUCTION DES NITRITES

Lion nitrite est le premier intermdiaire dans la rduction du nitrate. Il est rduit son tour par une nitrite rductase dans une raction nergtique : NO + 2 H+ + e NO. + H O (G = 76,2 kJ . mol1)
2 2
Ce sont des protines solubles. Un seul lectron est mis en jeu pour aboutir un radical, loxyde nitrique, dont la toxicit sexplique par les nombreuses ractions secondaires quil peut donner avec loxygne, le superoxyde, les mtaux de transition, les amines, les thiols et la tyrosine. Il est considr comme agent mutagne. Loxyde nitrique est pourtant un produit biologique important. Il est engendr par la NO synthase rpandue chez les eucaryotes, mais dcele aussi chez des bactries du genre Nocardia. La synthse de NO a lieu partir de larginine, exerce un contrle multidirectionnel, par exemple dans le mtabolisme du fer, la pression artrielle, ou comme neurorgulateur. Une surproduction de NO est lie au processus inflammatoire. Malgr ces tats de service, l'oxyde nitrique est bien un produit risque dans la nature. Cette question vaut bien une petite parenthse. Parmi les entits les plus toxiques lies au mtabolisme d'O2 et de lazote figurent le radical hydroxyle (OH) et lanion peroxynitrite (ONOO). Le premier est produit par la raction de FENTON*, le deuxime par raction de NO. sur le superoxyde. Le peroxynitrite ragit avec CO2 pour donner des intermdiaires instables qui contribuent son limination en se dcomposant nouveau pour donner du nitrate et librer nouveau CO2. La dcomposition du peroxynitrite dans l'eau pH 7 est rapide, avec une vie moyenne de l'ordre de la demi-seconde et le superoxyde est lui-mme encore plus instable. Mais la raction du peroxynitrite avec le superoxyde est beaucoup plus rapide et produit deux radicaux, hydroxyle (OH.) et dioxyde d'azote (NO2). Leur apparition peut crer une situation dangereuse dont les cellules se protgent en acclrant la disparition du superoxyde par la superoxyde dismutase. Existe-t-il galement une protection contre le peroxynitrite ? La rponse est affirmative d'aprs BRYK et coll [17]. L'intervention est due une enzyme, l'alkylperoxyde rductase, observe dans diverses espces bactriennes. L'enzyme AhpC est code par l'opron ahpCF de Salmonella typhimurium, conjointement avec une flavoprotine (AhpF). Cet opron est activ par la protine rgulatrice du stress oxydant OxyR* et intervient certainement dans la rsistance l'oxygne de nombreux micro-organismes, en particulier les formes micro-arophiles. Conclusion : le monoxyde d'azote est bien un produit potentiellement dangereux pour la vie cellulaire. Revenons la nitrite rductase et la dnitrification proprement dite. Il existe deux catgories denzymes compltement diffrentes, mais jamais prsentes ensemble dans les mmes cellules. Les premires sont des cytochromes 4 hmes, les cytochromes cd1. Les secondes ou CuNIR sont des protines contenant du cuivre. Le tableau en donne une comparaison sommaire :
294 Cytochrome cd1

Structure Localisation Cofacteur Donneur de Distribution Homodimre, environ 120 kDa Priplasmique 2 (hmes C et D1) Azurine, pseudo-azurine, cyt. c551 Prdominent : bactries du sol (Pseudomonas, Ralstonia)
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES CuNIR

Homotrimre (3), 85-110 kDa Priplasmique 2 Cu2+, types 1 et 2 3, par sous-unit Azurine, pseudo-azurine, cyt. c552, Alcaligenes, Bacillus, Rhodobacter, Achromobacter, Nitrosomonas
La rpartition des deux catgories dans lenvironnement ne fait pas bon mnage avec la taxonomie. Par exemple il y a des Pseudomonas munis de la rductase cuivre, dautres avec le cytochrome. Rhodobacter sphaeroides a lenzyme cuivre, Rhodobacter denitrificans a le cytochrome. Il y a des variantes intressantes. Par exemple une souche sulfato-rductrice appartenant l'espce Desulfovibrio desulfuricans possde une nitrite rductase cytochrome dote en mme temps d'une forte activit comme sulfite rductase [18]. Pourquoi ces deux solutions concurrentes ? Nous nen avons aucune ide, mais il est possible que la raction catalyser soit assez difficile pour appeler la slection de systmes trs particuliers, loigns des enzymes doxydorduction les plus courantes. La question se pose notamment pour le cytochrome cd1. En effet lenzyme a deux hmes distincts, C et D1 ; le second lie O2, CO, NO et NO2, a une formule particulire, et ncessite lui tout seul une voie de biosynthse spciale partir de luroporphyrinogne III*.
protine Cys H3C S COOH CH3 Cys S H3C N Fe N H3C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH N CH3 H3C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH N N CH3 H2C O N Fe N CH3 N CH3 O COOH CH2 CH3
Hme C
Hme D1
Le cytochrome cd1 est une enzyme intressante. Il a t dcouvert paradoxalement comme une cytochrome oxydase induite par le nitrate dans Pseudomonas aerugnosa [19], car il utilise un cytochrome c comme donneur et peut accessoirement rduire O2 en 2 molcules de H2O avec transfert de 4 lectrons comme 3 - Distinction explique dans le Glossaire, rubrique Cuivre*.
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dans une chane respiratoire arobie classique. Nanmoins la ractivit du cytochrome cd1 pour le nitrite est au moins cent fois plus grande que pour l'oxygne. Son fonctionnement comme oxydase est un peu particulier. La rduction de O2 se fait sur le fer de lhme D1 et non pas sur un centre bi-mtallique Fe-Cu comme dans loxydase mitochondriale. Il s'agit peut-tre dune triple adaptation : la nitrite rductase cd1 serait amene faciliter la dnitrification en prsence dun peu d'oxygne, contribuerait ponger ce dernier quand il est prsent au cours de la dnitrification, et servirait dtoxifier le nitrite au cours de larobiose. La nitrite rductase cd1 est un dimre symtrique, chaque sous-unit tant munie dun hme C et dun hme D1, que la figure ci-aprs compare entre eux. Le premier, gauche, a la structure classique de la molcule appele protoporphyrine IX, prsente dans lhmoglobine, mais il est attach la protine par des liens covalents sur cystine (Cys). Le second, droite, na pas de tels liens, et on devine que sa ralisation hors norme va ncessiter lintervention dans la cellule bactrienne des enzymes spcialises supplmentaires. La structure du cytochrome cd1 est connue grce lanalyse cristallographique faite Oxford [20]. Les noyaux porphyriques sont superposs dans la nitrite rductase comme lindique un schma montrant les deux sous-units identiques agences symtriquement par rapport un axe, et contenant au total 4 hmes figurs en trait paissi. Seule est reprsente la charpente de chaque polypeptide ou chane primaire, lexclusion des chanes latrales des acides amins qui sont au nombre de 567. La rduction de chaque molcule de NO saccompagne, daprs lanalyse structurale, dun va-et-vient entre deux conformations lgrement diffrentes, comme si le dimre palpitait dans son ensemble au cours de la catalyse.
hme C
hme D1
Structure du cytochrome cd1

Les lectrons venant un un dun donneur extrieur passeraient par lhme C. Un cheminement interne la protine ferait alors parvenir chaque lectron lhme D1 qui est assez proche et constitue le ple ractif sur lequel le nitrite ou loxygne sont rduits. Le cheminement serait donc : Donneur (azurine*) surface de la protine hme C chane interne hme D1
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Chacune des deux sous-units est donc structure pour faire marcher par ellemme la raction. Elle comporte deux "domaines", celui de lhme C en haut sur le croquis, et celui de lhme D1. Ce dernier est log dans une portion assez rigide, consolide par des barreaux bta* : la chane forme autour du D1 une sorte de couronne de ptales orients un peu comme les pales dune turbine. Le D1 est rendu accessible au substrat (le nitrite) par une ouverture dispose dans la partie infrieure telle que la molcule est oriente sur le dessin. Un autre croquis explicatif montre les traits suivants. droite est reprsente une sous-unit isole, la prsence du fer tant repre par les boules grises, et la portion charpente par des barreaux bta en trait paissi. gauche est indiqu lenvironnement du fer dans chaque hme. La cinquime coordinence est occupe par de lhistidine (avec numro dans la squence), la sixime par lhistidine dans lhme C. En ce qui concerne lhme D1 du site actif, la sixime coordinence est vide (ou faiblement occupe par une molcule deau retenue par deux histidines, non reprsentes). Cest l que viendra sinstaller lion nitrite, ou le cas chant une molcule de O2. La tyrosine-25 (Tyr-25) pourrait bien prendre la place, mais elle est facilement tire en arrire par le reste de la chane. Un petit dtail important comme nous allons le voir.
5e histidine-69
6e histidine-17
Fe
tyrosine-25 OH 5e histidine-200 6e N O
O nitrite
D1
Le dessin suivant montre lune des communications entre les deux hmes. Le premier est attach la protine par deux cystines. On observera la position de lhistidine-17 en sixime coordinence. La communication stablit ici par le segment His-17 Tyr-25 de la squence. La lettre N dsigne la position du nitrite. Quel est le principe de ce mcanisme ? Rappelons la raction : NO2 + 2 H+ + e NO + H2O. Il faut donc 2 protons et 1 lectron. On pense que les deux protons sont injects partir de His-345 et His-388 situs proximit de l'hme D1 et sont compenss partir du reste de la protine et par lextrieur. Chaque lectron arrive par le canal de lhme C jusqu lhme D1, suivant un cheminement qui emprunte la chane polypeptidique le long du segment His-17-Tyr-25.

His-69 Cys-65 Ala-66 Gly-67 Cys-68 Arg-20 Asp-22 Tyr-25 His-345 His-200 His-388 Thr-21 N D1 Tyr-25 His-345 His-388 Thr-19 His-17 Lys-18 Cys-68 Cys-65 C
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His-17
a - sans les porphyrines
b - avec les hmes en place
L'environnement des hmes

Voil le principe essentiel qui semble se profiler. La tyrosine-25 sintresse beaucoup au fer, mais la rduction du D1 provoque un petit changement de conformation de la protine qui la tire en arrire, dgageant du mme coup la sixime position sur le fer. Cest l que le nitrite vient sinstaller librement. La spectroscopie RPE suggre que son azote tablit la sixime coordinence et rtablit ainsi la symtrie autour du mtal. Les oprations peuvent se rsumer ainsi (en noir lhme D1 oxyd, en blanc lhme rduit) :
nitrite 2 H+ NO
D1
e
D1
D1
NO2
H2O
D1
NO+
D1
NO
D1
Il sest form une combinaison ractive : D1-Fe2+-NO+ . Le fer sefforce de cder un lectron, tandis que son ligand charg positivement ne demande qu en rcuprer un. Le passage de lun lautre conduit D1-Fe3+-NO, o le produit de la rduction de lion nitrite est NO qui reste li au fer. Lassociation de NO lhme est extrmement forte si le fer est rduit. dfaut de loxydation du fer, loxyde nitrique devrait rester bloqu en permanence sur sa position. Le passage du fer ltat Fe3+ et la prsence de la tyrosine-25 corrigent cet inconvnient. La tyrosine stait carte, mais la faveur du changement de conformation inverse du premier, elle revient sur le fer et contribue chasser NO. Ce dispositif spcial utilise donc une porphyrine modifie et un changement de conformation dans une molcule trs complexe, pour en fin de compte pouvoir chasser loxyde nitreux ! Le changement de conformation est ltape la plus lente de la raction (0,1 0,5 s1), mais nempche pas lenzyme de rester trs efficace dans la rduction de lion nitrite ! Ce phnomne intressant a t pass au peigne fin grce lanalyse structurale
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haute rsolution. Les cristaux se laissent assez facilement rduire 4, et on peut mme y faire diffuser le substrat. On sait maintenant que le cycle catalytique met en jeu un changement conformationnel global, qui modifie la distribution des liaisons hydrogne internes et implique Tyr-25. En outre la rduction de lhme C perturbe lenvironnement du fer et remplace His-17 par un rsidu voisin (Met-106) [21]. De tels rsultats sont extrmement importants sur un plan gnral pour comprendre le fonctionnement des transferts dlectrons intramolculaires et c'est pourquoi nous nous y sommes attards ici. L'enzyme est un outil performant slectionn en vue dliminer le plus vite possible le nitrite et NO, dont laccumulation dans lenvironnement aurait des effets dltres sur la microflore ! Lexistence intermdiaire dune entit trs ractive indique prcdemment est certainement responsable des ractions secondaires de la nitrite rductase observes sur les amines, lazoture (ou "azide") et lhydroxylamine. Ces ractions sont des nitrosations. Elles conduisent des produits trs toxiques, en particulier les nitrosamines. Cest peut-tre l'inconvnient majeur du nitrite qui peut se comporter comme un cancrigne. La nitrite rductase contenant du cuivre est compltement diffrente de la prcdente, n'ayant aucune homologie avec elle bien que la raction catalyse soit la mme. Rappelons-nous. Au sein de la nitrite rductase les lectrons provenant dun donneur (du type azurine ou cytochrome c) taient canaliss jusquau substrat par deux hmes successifs. Une autre solution conM 121 siste remplacer les hmes par 2 ions cuivre dans H 117 une tine darchitecture diffrente mais fonctionS nant de manire comparable.
HN N Cu S C 112 G 45 N NH
O C
CH NH
H 46
Le cuivre dans l'azurine
La prsence du mtal confre ces enzymes une couleur assez intense, bleue (595 nm) ou verte (plusieurs bandes vers 460, 590, 700 et 850 nm) et des signaux caractristiques en RPE. Les deux ions Cu2+ (I) et (II) ont une gomtrie de coordination diffrente dans les deux cas. Le cuivre de type I est coordonn par 4 rsidus dacide amin (2 His, Met, Cys) et confre la protine sa couleur bleue ou verte. Le dessin montre ce type de coordination dans l'azurine de Pseudomonas aeruginosa, qui change un lectron avec le cytochrome c551 [22]. Trois liaisons avec histidine et cystine dfinissent un plan, les deux autres avec mthionine et un carbonyle tant au-dessus et au-dessous.
4 - On ne peut pas faire cette rduction par le donneur dlectrons naturel, qui nentrerait pas dans le cristal. On utilise un rducteur artificiel, dithionite ou viologne rduit. Le cristal passe du brun au vert par rduction.
299
Cette structure subit une lgre dformation au cours de l'oxydorduction et la petite protine ragit de faon dynamique par un changement de structure au cours du transfert. Le cuivre de type II est li trois rsidus seulement (3 His), la quatrime coordination tant occupe par une molcule deau que le substrat vient bousculer. Les deux ions Cu oscillent entre les tats Cu+ et Cu2+, les lectrons cheminent dans le sens Type I Type II par un transfert intramolculaire [23]. Il existe une analogie du fonctionnement avec celui du cytochrome cd1 [24] :
2+ e nitrite + + 2 H+ + 2+ NO 2+
Cu
Cu
Cu
NO2
H2O
Cu
NO
Cu
NO
Cu
La structure dtaille de la nitrite rductase dAchromobacter cycloclastes est connue [25]. Lenzyme est un trimre de trois polypeptides identiques de 340 rsidus chacun. Chaque sous-unit est articule en deux domaines, dont lun porte les deux ions Cu essentiels. Un dessin tente de rsumer cette disposition. La coordinence du cuivre de type I avec la cystine, et la gomtrie ttradrique plus ou moins dforme autour du mtal a des effets sur le spectre dabsorption et dtermine la couleur bleue ou verte de lenzyme.
Tyr-134 His-95 Cu(I) Cu(II) Leu-94 His-135 Cys-136 His-145 substrat His-100 Cu(II) Met-150 Cu(I) Phe-99
Trp-144
His-306 appartenant la sous-unit d'en face
Nitrite rductase d'Achromobacter cycloclastes

La partie droite permet de constater trois lments intressants. Tout d'abord le cuivre de type I fait une coordinence avec latome de soufre de la cystine-136, qui jouxte lhistidine-135 dans la squence. Or ce dernier est li galement au cuivre de type II. Il y a donc un court cordon de communication entre les deux ions cuivre renforc par l'empilement des cycles de la tyrosine-134 et de la phnylalanine-99. On voit ensuite que la sphre de coordination du cuivre de type II est incomplte. Une case vacante est occupe par une molcule deau avec une interaction faible en position dattente. Elle est facilement remplaable par le substrat. Cest donc le ple ractionnel de la protine et il est suppos actuellement que lion nitrite
300
interagit avec le cuivre par lun de ses atomes doxygne [26]. Le troisime point considrer est la coordination du cuivre de type II par l'histidine-306 appartenant la sous-unit voisine. Le site catalytique est donc construit dans la surface de contact entre les deux parties symtriques du dimre. Toutes les nitrite rductases contenant du cuivre seraient bties sur ce modle sauf diffrences de dtail, et des lments de squence sont fortement conservs. Voici la ressemblance dune portion de squence entre trois espces au niveau de plusieurs rsidus coordonnant le Cu de type I (1) et le Cu de type II (2). Les trois espces bactriennes sont Pseudomonas aureofaciens (P.a), Achromobacter cycloclastes (A.c) et Alcaligenes faecalis (A.f). On repre facilement, par exemple, la succession YHC. L'histidine-306, non montre sur ce segment, est galement conserve.
1 2 21 1 1
P.a NSMP H NVDF H AATGALGG AGLTQVVPGQEVVL RFKA DRSGT FVY HC AP QGMVPW H VVSG M NGALMV A.c N T L L H NIDF H AATGALGG GALTQVNPGEETTL RFKA TKPGV FVY HC AP EGMVPW H VTSG M NGAIMV A.f NTLM H NIDF H AATGALGG GGLTEINPGEKTIL RFKA TKPGV FVY HC AP QGMVPW H VVSG M NGAIMV
Ces rductases sont-elles spcifiques du nitrite ? Il y a de petites diffrences parmi la douzaine de cas de figures examins dans la littrature. Souvent quelques pour cent de N2O sont produits en plus du NO. Parfois apparaissent un peu dhydroxylamine et dammoniac, mais ces ractions nont peut-tre pas dimportance physiologique [27]. Il arrive enfin que O2 soit rduit comme dans le cas du cytochrome cd1. Les donneurs dlectrons partenaires des nitrite rductases sont des protines, soit des cytochromes c, soit des cuprdoxines, c'est--dire des protines doxydorduction contenant du cuivre. Parmi ces dernires, lazurine et la pseudo azurine 5. Ce sont les donneurs prfrs des rductases cuivre, mais la rductase de Rhodobacter sphaeroides utilise plutt un cytochrome c2. Lazurine et la pseudoazurine ont une faible masse molculaire, un seul ion Cu, et ont des structures trs comparables. Le cuivre de lazurine est entour par Cys, Met et deux His comme le Cu de type I de la rductase. Lazurine travaille surtout avec les rductases bleues, la pseudo-azurine avec les vertes. Pourquoi cette slectivit ? Probablement pour une question de complmentarit de surface. Pour que deux protines entrent en change doxydorduction, il faut quelles saccolent dune certaine faon, et leur adhrence est ici facilite par la distribution des charges ioniques de leur priphrie. Autrement dit, la slectivit serait en grande partie une question de complmentarit ionique [28]. Quelle est la source dlectrons en amont de la cuprdoxine ? La chane respiratoire bactrienne joue ce rle, et utilise ici la nitrite rductase comme exutoire. La rduction du nitrite en NO au cours de la dnitrification ne participe pas directement la production dnergie. C'est tout 5 - La palette des petites protines dpourvues dactivit enzymatique et servant de transporteurs dlectrons dans la nature contient des lments varis: cuprdoxines (contenant du cuivre), des ferrdoxines (avec noyau fer-soufre), rubrdoxines (du fer, mais pas de soufre acido-labile), thiordoxines (avec deux thiols adjacents), flavodoxines (avec FMN), cytochromes de type c, et on en passe.
301
simplement la chane des transporteurs respiratoires dans la membrane qui assume cette fonction. Les nitrite rductases sont donc des enzymes intressantes sur le plan fondamental et en mme temps fort essentielles dans l'environnement. On s'attend les trouver dans de nombreuses espces du sol. Par exemple des actinomyctes sont capables de transformer le nitrate en nitrite et N2O, et on a mis en vidence rcemment chez Streptomyces thioluteus une nitrite rductase cuivre, fonctionnant avec une azurine comme donneur [29].
6.4 - LE PASSAGE DIRECT DU NITRITE LAMMONIUM

La rduction de lion nitrite peut se faire dans deux directions, soit vers la formation doxyde nitrique qui a retenu l'attention de la section prcdente, soit par conversion directe en NH4+. La premire fait partie de la dnitrification, la seconde fait partie de la voie appele ammonification : NO2 + 6 e + 8 H+ NH4+ + 2 H2O
Rappelons les faits. Cette conversion 6 lectrons peut donner lieu une rcupration dnergie par la cellule (dissimilation) ou la fabrication parallle de lazote ammoniacal ncessaire la synthse des produits azots (assimilation). Le potentiel correspondant au couple NO2/NH4+ est E = + 340 mV. Il nest pas trs diffrent de celui du couple NO2/NO (E = +350 mV), mais cette conversion est catalyse par une rductase distincte des nitrite rductases entrevues dans la section prcdente. Les vgtaux chlorophylliens, qui bnficient la lumire dune nergie bon march, se contentent de faire lassimilation du nitrate pour en tirer lammonium ncessaire leurs synthses et utilisent une stratgie particulire que nous n'aborderons pas ici. Un rcapitulatif trs succinct concernant le monde vgtal est donn en glossaire (voir Assimilation du nitrate*). Il ne sera question maintenant que des cytochrome c nitrite rductases dissimilatrices conduisant l'ammoniac. Elles forment une troisime famille d'enzymes rduisant le nitrite, diffrentes de celles que nous connaissons dj par la section prcdente et sans homologie avec elles. Ces nouvelles rductases sont hminiques. Le colibacille fait une enzyme de ce type en anarobiose et rduit le nitrite en utilisant le formiate comme donneur dlectrons. Elle est dsigne par NrfA et contient une ribambelle de noyaux hminiques de type C (soit 5 au total par sous unit) [30]. Linsertion des hmes est facilement reprable dans la squence par le motif caractristique Cys-x-x-Cys-His qui marque la position des liens covalents entre hme et protine. Ces liaisons sont sur cystine, et lhistidine est lun des ligands du fer, ce dispositif tant caractristique des cytochromes c. Lun des hmes fait exception, car il est li par un motif Cys-x-x-Cys-Lys. Ces enzymes multihminiques participant la dissimilation de lion nitrite sont attachs la membrane et reoivent apparemment leurs lectrons dun autre cytochrome c. Leur caractrisation dtaille a dj t faite dans plusieurs espces : Desulfovibrio desulfuricans [31], Wolinella succinogenes [32] et Sulfurospirillum deleyianum, avec dans ce cas la structure dtaille [33]. La nitrite rductase du S. deleyianum est un
302
dimre contenant au total dix galettes hminiques de type C places au voisinage les unes des autres. Dans chaque sous-unit, l'hme dont le fer est li la lysine au lieu de l'histidine est li aussi un ion sulfate et c'est son niveau que se fait la catalyse. Ce modle structural fond sur chane dhmes C n'a rien d'exceptionnel dans la nature et rpond des adaptations intressantes. Par exemple la nitrite rductase de Desulfovibrio desulfuricans a aussi une chane d'hmes et rduit galement le sulfite [34]. Cette rductase a une activit si forte sur le nitrite (1,05 millimole de NO2 rduit par minute et par mg pH 7) qu'elle a permis la conception d'un biocapteur [35]. L'arrangement des hmes C dans la cytochrome c nitrite rductase de Sulfurospirillum deleyianum est symbolis en a sur le dessin. Le site actif est l'hme n1, symbolis en b.
a
site actif 1 3 4
b
NO2 Gln Ca Tyr S 2 5 Cys Cys Lys His Fe
Cytochrome c nitrite rductase

Les trois rductions successives seffectueront ce niveau comme indiqu sur un schma. Loxyde nitreux et lhydroxylamine (H2NOH) sont des intermdiaires qui ne quittent pas l'enzyme. Au niveau de chaque hme C attach par liens covalents sur son consensus Cys-x-x-Cys-His, la liaison histidine-fer est perpendiculaire au plan de la porphyrine. Le rsidu d'histidine contracte une liaison de coordination sur le fer perpendiculairement la porphyrine.
Fe
III
Fe
III
Lys nitrite HO N Fe
III
Lys NH4+ O
O N
II
OH H2N Fe 2 e 3 H+
III
H3N Fe 2 e 2 H+ H2O
III
H+
Fe 2 e H+ H2O
Lys
Lys
Lys
Lys
Mcanisme de la rduction du nitrite
303
La lysine remplace l'histidine sur l'hme du site actif, et le sulfate (non figur) est li par un atome d'oxygne en sixime coordinence de l'autre ct du fer. Le substrat dplace le sulfate en s'installant sa place. Le site actif s'entoure de glutamine, histidine, tyrosine et quelques molcules d'eau. En outre au voisinage immdiat se trouve un ion calcium. Lexistence de lhydroxylamine est hypothtique mais considre comme trs probable, car lenzyme rduit aussi NO et lhydroxylamine si on lui offre ces drivs comme substrats. D'autre part elle prsente des analogies trs nettes avec une hydroxylamine oxydorductase dcrite chez Nitrosomonas europaea, bactrie du sol bien connue pour effectuer la raction inverse de l'oxydation de lammoniac en nitrite [36]. Chose intressante, lanalyse structurale a montr que lion nitrite accde au site par une ouverture comportant des charges positives, et que lammonium repart en direction oppose par un tunnel charg ngativement. Cette disposition facilite un courant unidirectionnel de llment azot en jouant sur la diffrence de charge entre le substrat et le produit de la raction. Ce courant sens unique travers la protine expliquerait la trs grande efficacit catalytique de lenzyme. Quant aux autres hmes C prsents, ils servent certainement acheminer des lectrons vers le site actif. Les porphyrines et leurs groupes latraux propioniques sont trs proches les uns des autres et formeraient une sorte de fil conducteur. Ce dispositif molculaire perfectionn contribue sans doute aussi la rapidit d'action de l'enzyme.
6.5 - DE LOXYDE NITRIQUE LOXYDE NITREUX

Nous tions passs du nitrite l'ammoniac. Cette section fait retour la dnitrification, dont le stade ultime nest pas NH3 mais N2. Elle devrait nous apporter quelques nouvelles surprises. Une dnitrification nest pas toujours complte et sarrte parfois au stade N2O chez diverses espces bactriennes qui sont dpourvues de N2O rductase. Cette situation existe notamment chez la plupart des carboxydotrophes [37]. En revanche certaines espces peuvent effectuer une respiration sur N2O sans pour autant utiliser le nitrate cet effet : Wolinella succinogenes. Ce germe peut crotre sur N2O et le rduit en N2 sans bnficier d'une NO rductase, en consquence de quoi il ne produit pas de N2 partir de nitrate. Celui-ci est rduit en nitrite puis en ammoniac pendant loxydation du formiate comme principale source carbone [38]. Il peut donc y avoir une respiration sur N2O qui fournit lnergie pour faire marcher tout le reste, y compris lutilisation de nitrate comme source dammoniac. Le tableau rsume quelques lments sur les enzymes concernes. Ce sont des critres moyens, les rsultats tant souvent discordants et parcellaires dune espce lautre. Aprs la dcouverte des bases de la dnitrification, il a fallu quelques annes avant que NO apparaisse comme un vritable intermdiaire. Il est difficile mesurer et se prte mal la croissance des bactries dnitrifiantes. En outre sa nature radicalaire est lorigine de ractions parasites.
304 NO rductase [39]

Raction Localisation Structure Masse molculaire Cofacteurs Donneur de Inhibiteurs
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES N2O rductase [40]
2 NO + 2e + 2 H+ N2O + H2O N2O + 2e + 2 H+ N2 + H2O Membranaire Priplasmique ? (NorB, NorC) 2 (NosZ) 170-180 kDa 120 kDa Hmes B, C + Fe (rapports 2:1:1) [41] 4 Cu par sous-unit Cyt. c, PMS, TMPD, ascorbate Cytochrome c Actylne, cyanure, azoture, Zn2+
Loxyde nitrique est produit dans le priplasme et capt sur place par la NO rductase. Bien que trs diffusible, il na pas le temps datteindre un niveau nocif dans le cytoplasme cellulaire. Quon juge aussi de limportance chimique de cette raction : avec la nitrognase, elle est la seule tablir la liaison trs stable entre deux atomes dazote. Elle est donc nergtique et la conversion de NO en N2O a un potentiel lev (E = + 1177 mV), comme dailleurs celle de N 2 O en N2 (+ 1352 mV). Lnergie libre standard mise en jeu est respectivement 306 et 399 kJ . mol1, plus importante que celle de la conversion du nitrate en nitrite. Il y a donc matire une vigoureuse production dnergie par la cellule bactrienne, contrairement la raction de la nitrognase qui est consommatrice 6. La NO rductase a deux atouts : elle est membranaire et possde des cytochromes b et c, quon a lhabitude de rencontrer comme intervenants dans les chanes respiratoires. Lexemple le plus clbre est le complexe bc1 de la membrane interne mitochondriale, connu comme site de conservation dnergie parce que la translocation de protons couple au passage des lectrons contribue btir le potentiel de membrane. En est-il de mme pour la NO rductase ? On pense actuellement que lenzyme na pas ce pouvoir. Elle reoit ses lments rducteurs dune chane respiratoire qui renferme le complexe bc1, qui serait le vritable site de conservation dnergie. L'tude de ce complexe dans Pseudomonas stutzeri montre qu'il collecte des lectrons provenant de plusieurs voies dont celle de la NO rductase. Une autre voie part du NADH, utilise le canal de la NADH dshydrognase membranaire et une quinone. C'est donc la fonction du bc1 de produire de l'nergie et d'envoyer les lectrons vers NO qui est un accepteur terminal. Les connaissances sur la NO rductase restent fragmentaires, mais un aspect intressant mrite dtre signal. La raction catalyse ressemble celle dune cytochrome c oxydase, soit O2 + 4 e + 4 H+ 2 H2O. Or il existe une ressemblance de squence entre la chane NorB de la NO rductase et la sous-unit I de la cytochrome c oxydase de Paracoccus denitrificans. La ressemblance est assez forte pour indiquer une structure similaire [42]. Rappelons que la structure minimale dune cytochrome c oxydase comporte des sous-units I, II et III dont la nature a t conserve au cours de lvolution (y compris dans les mitochondries). La sous-unit I de l'oxydase aa3 est la plus grosse et opre la rduction du dioxygne.
6 - Les valeurs sont prcises ltat standard qui est trs loign des conditions relles. La concentration de NO en rgime stationnaire est faible, et lnergie mise en jeu cette tape devrait tre infrieure.
305
Ses lments essentiels sont un hme A et un centre bi-mtallique (un second hme A3 et du cuivre). NorB offre une disposition comparable. La partie renfermant l'hme C (NorC) rduit un premier hme B, qui rduit son tour la partie bimtallique forme par le deuxime hme B et le fer non hminique. Voici un dessin imit de VAN DER OOST et coll. [43] :
C priplasme C H+ H+ H+
Q
B B B B A A B B
Type cbb (NO rductase) hme B ou A
Type cbb3 hme C
Type aa3 fer non hminique
Type bb3 cuivre
NO rductase et oxydases terminales

La NO rductase, gauche, du type cbb, est compare aux trois oxydases labores par Paracoccus denitrificans, considres comme des translocateurs de protons et figures dans un cadre [44]. Les trois sous-units NorB, NorC et NorE sont les parties fondamentales de la NO rductase imitant la structure de base de la cytochrome c oxydase mitochondriale. Elles sont homologues respectivement des sous-units I, II et III de loxydase. Le type aa3 reprsent ici est celui de la principale oxydase de Paracoccus ses heures arobies. Loxydase cbb3 intervient en oxygne limitant et la bb3 est une quinol oxydase. La NO rductase cbb est une quatrime machinerie produite au cours de la dnitrification. Les deux hmes B de la sous-unit principale (NorB) dans cette enzyme sont assez proches lun de lautre en tablissant une communication intramolculaire. Le premier hme reoit du cytochrome c (NorC) lunique lectron ncessaire la raction, et le deuxime hme tablit le noyau bi-mtallique avec le fer non hminique. Le passage des lectrons dans cet ordre est considr comme probable par comparaison avec les cytochrome oxydases. Dans le premier hme, le fer est hexacoordonn, sa gomtrie est complte et lui donne la proprit bas spin, au contraire du deuxime qui est un fer haut spin*. Les coordinations sont tablies par des rsidus dhistidine. Un court segment faisant partie dune hlice relie les deux premiers atomes de fer. C'est peut-tre le "fil lectrique" qui relie les deux, ainsi qu'un fil de traction comme dans le cd1. Le mcanisme exact de la soudure entre atomes d'azote reste problmatique. Une hypothse considre linstallation de deux molcules de NO cte cte entre les deux ions fer du site bi-mtallique avant formation de la liaison N=N. Lune de ces molcules est retenue par lhme rduit, avec une affinit extrmement forte qui a probablement pour effet dempcher toute "fuite" prmature. La deuxime molcule appele par le fer non hminique tablirait la combinaison transitoire ON=NO que postulent certains auteurs [45]. L'un des atomes d'oxygne serait alors emport dans une molcule d'eau.
306
His noyau bimtallique et site actif
1er hme B
Fe
His
His His Fe Fe His His 2e hme B
Les sites mtalliques de NorB

Le plus extraordinaire est que la NO rductase na pas lexclusivit de cette raction. Dautres protines sont capables de former un peu de N2O : la ribonuclotide rductase arobie, lhmocyanine et mme la cytochrome c oxydase [46], trois systmes qui bnificient d'un noyau bi-mtallique, respectivement Fe-Fe, Cu-Cu et Fe-Cu. Inversement on connat la NO rductase cbb de Paracoccus denitrificans qui est capable de rduire O2 [47]. Cette question amne invitablement des spculations sur l'histoire de la vie. On considre gnralement que la monte de loxygne dans latmosphre terrestre a t le rsultat de la photosynthse oxygnique, qui est lie la dissociation de leau. Les premiers anctres des cyanobactries actuelles auraient provoqu une lente rvolution plantaire dans la biochimie des organismes. Il a fallu sadapter un potentiel doxydorduction plus lev, rsister aux effets nocifs d'O2, ou mme lutiliser. Daprs certains auteurs tels que CASTRESANA, LUBBEN ET SARRASTE [48], le monde vivant aurait pu conserver un modle unique denzyme respiratoire utilisant NO ou loxygne. La NO rductase aurait prcd lapparition des cytochrome oxydases, puis des quinol oxydases. Elle pourrait correspondre une dnitrification primitive antrieure la photosynthse oxygnique. Les premires oxydases seraient apparues ensuite, antrieurement la sparation des eubactries et des archaebactries. Latmosphre terrestre primitive contenait sans doute de petites quantits doxygne et doxyde nitrique forms par des ractions photochimiques sur leau de la surface des ocans et sur lazote molculaire. La monte d'O2 aurait exig une adaptation et une diversification des outils dj disponibles. Lacquisition dune translocation de protons et de nouvelles rgulations aurait fait partie des nouvelles avances. La dnitrification est-elle la respiration la plus archaque ? Il y a beaucoup plus de suppositions que de certitudes dans ce domaine, qui offre nanmoins un terrain de rflexion fascinant.
307
6.6 - DE N2O AU DIAZOTE

Diverses espces bactriennes ne franchissent pas le stade N2O au cours de la dnitrification et librent celui-ci dans latmosphre. Au contraire dautres agents de dnitrification peuvent se dvelopper sur N2O comme seul accepteur respiratoire au cours de la dgradation de composs organiques tels que le benzne et des alkylbenznes [49]. Bien que loxyde nitreux rductase (NosZ) soit une enzyme priplasmique soluble, elle participerait une conservation dnergie [50]. Le bouclage du grand cycle de lazote plantaire se fait avec le concours du cuivre. Nous avons dj rencontr ce mtal plusieurs fois et nous le retrouvons dans la N2O rductase. Celle-ci catalyse la conversion N2O + 2 e + 2 H+ N2 + H2O, qui a un potentiel E de + 1350 mV, soit une variation dnergie libre de 339 kJ . mol1. Loxyde nitreux est donc un excellent oxydant potentiel quand il se dbarrasse de son atome doxygne. Lopration a pourtant besoin dun activateur qui est en gnral un mtal de transition. Sans cette activation, N2O est aussi inerte dans les conditions physiologiques que lest N2 lui-mme. Aussi la vie moyenne dune molcule doxyde nitreux dans latmosphre, estime 150 ans environ, fait de ce gaz un des acteurs de leffet de serre. Un mtal de transition not Mn facilite la scission de N2O par : Mn + N2O + 2 H+ N2 + H2O + Mn+2. La N2O rductase a donc recours un mtal qui est encore le cuivre. Le caractre indispensable de Cu dans la rduction de N2O a t mis en vidence indirectement dans Pseudomonas stutzeri, qui offrait un cadre favorable sa dtection. En effet cette espce utilise un cytochrome cd1 comme nitrite rductase et na pas de cuprdoxine, donc pas de cuivre "tranger" qui serait la source d'un bruit de fond. ZUMFT et coll. ont caractris lenzyme dans cette espce et d'autres comme Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter cycloclastes, Paracoccus denitrificans et Wolinella succinogenes [51]. Il y a gnralement deux sous-units identiques de 66 kDa environ, et 8 atomes de cuivre en tout par dimre. Chaque monomre renferme deux centres bi-mtalliques, un noyau CuA (dessin page suivante) contenant 2 Cu et donnant un signal en RPE, un second noyau Cu-Cu (CuZ) silencieux en RPE. Le site CuA est dsign ainsi parce quil ressemble au CuA prsent dans la sousunit II de la cytochrome oxydase. Autrefois on croyait que cette dernire avait un lment CuA mono-mtallique coordonn par des atomes de N et de S (2 His, 2 Cys). Le cuivre de la N2O rductase a servi de matriel favorable des tudes spectroscopiques pousses (optique, dichrosme, RPE, RAMAN, EXAFS) [52] qui ont conduit la structure indique par le schma o les deux atomes mtalliques partagent leur degr d'oxydation. La ressemblance de squence avec la sous-unit II a permis de se rendre compte que le CuA de la cytochrome oxydase tait bi-mtallique lui aussi. Une exprimentation volumineuse a t faite avec CuA, notamment par mutagense dirige afin de modifier les rsidus d'acides amins lis aux atomes mtalliques.
308
Cys His
Asp ?
N Cu1 Cu2
N S S
Met Cys His
Structure du noyau CuA

Une structure consensus entre N2O rductases provenant de six espces bactriennes diffrentes concerne la portion de squence liant CuA. Les rsidus portant Cu1 et Cu2 dans le schma sont reprs dans la squence par les chiffres 1 et 2. Les lettres en caractre gras notent les positions identiques dans la sous-unit II des cytochrome c oxydases de trois espces bactrienne, de la levure, du bl et de l'homme. Ces positions cls sont donc espaces de la mme manire et correspondent visiblement une architecture prcise autour du noyau bi-mtallique.
1 1 2 1 2 2 1
E D Vx H GFxxxxxxxxxxxx P QxTxxxxFxxxxP G xxWxY C xxF C HsL H xE M xxRMxVE
Squence consensus dans NosZ

La structure du second noyau bi-mtallique, CuZ, nest pas connue avec certitude, mais on le considre comme le site essentiel de la catalyse enzymatique. Lenzyme a des proprits assez complexes accompagnant des variations spectrales : un tat I violet (lenzyme prpare en labsence de O2), un tat II rose, et un tat III bleu (inactif). Son mcanisme consiste peut-tre lier la molcule de N2O (ou N=N=O) par les deux bouts, un azote sur un cuivre, un oxygne sur lautre. On peut imaginer que le pont ainsi form fragiliserait le substrat et arracherait latome doxygne. NO et lion cyanure se lient aussi CuZ et sont des inhibiteurs de la raction, ainsi que diffrentes molcules analogues du substrat qui sont N3, NCO et CNS. L'actylne est un autre inhibiteur. Les positions conserves suggrent que le noyau CuZ est coordonn par des rsidus dhistidine, mais il reste beaucoup faire pour connatre plus prcisment le fonctionnement dtaill de cette enzyme trange qui na cependant pas la stricte exclusivit de la rduction de loxyde nitreux en azote molculaire. La raction a t observe dans la nitrognase, la CO dshydrognase, la mthionine synthase et quelques mtalloprotines contenant Fe, Cu, Ni, Co ou Mo. Linhibition par lactylne est utile en pratique pour mesurer limportance de la dnitrification dans les sols. Lchantillon est brass en suspension pendant plusieurs heures dans un flacon ferm sous atmosphre inerte contenant 10% (en volume) dactylne. Le liquide contient du nitrate (1 mM) et
309
une source de carbone (glucose). Le N2O form (gazeux et dissous) est dos par chromatographie en phase gazeuse [53]. Cette mthodologie a souvent servi de base aux estimations de la dnitrification sur le terrain. Puisque nous en sommes rflchir sur la diversification des rductases au cours de lvolution, voici loccasion de faire un petit dtour vers la NO rductase de Fusarium oxysporum. Avant de quitter la NO rductase, il convient en effet de revenir sur les champignons dnitrifiants dont l'existence a t signale dans le chapitre prcdent. Ils ont une NO rductase qui na rien voir avec celle des bactries. La dnitrification chez eux ne va pas jusqu'au stade du diazote, et s'arrte l'oxyde nitreux. La section suivante est un aperu de cette question.
6.7 - DES CHAMPIGNONS DNITRIFIENT

Les bactries n'ont pas le monopole de la dnitrification. Les champignons la font aussi : cest la perspective importante laquelle nous revenons. Fusarium oxysporum plac en absence plus ou moins complte d'oxygne transforme le nitrate en N2 O [54], et renferme une nitrite rductase cuivre qui a t rcemment purifie [55]. F. oxysporum et Cylindrocarpum tonkinense ont ainsi une vritable dnitrification, qui est confirme par les observations montrant que la rduction du nitrate et du nitrite seffectuent au niveau des mitochondries. Il a t prouv dautre part que ces oprations sont couples une synthse nette dATP [56]. Les outils sont diffrents de ceux des bactries. Ils participeraient la fois la dtoxification du nitrite intermdiaire et la conservation dnergie par couplage avec les transporteurs respiratoires. Le fait marquant est la transformation de NO en N2O laide d'une NO rductase particulire. Bien que les champignons soient des eucaryotes, la NO rductase est ici soluble, monomrique (44 kDa) et ne fait pas partie des mitochondries. Ses proprits spectrales en absorption optique et RPE montrent que l'enzyme appartient la vaste famille des cytochromes P450, conclusion corrobore par des critres de structure et d'homologie de squence. Que sont ces P450 ? Nous les examinerons en dtail avec l'oxydation des hydrocarbures aliphatiques, mais on pourra s'en faire une ide rapide par le glossaire. Ces protines sont habituellement des mono-oxygnases hminiques utilisant comme substrats la fois O2 et une source dlectrons qui sont achemins par des lments auxiliaires tels qu'une rductase et une ferrdoxine. La NO rductase de Fusarium oxysporum est un cytochrome P450 soluble tout fait atypique, qui ne se comporte pas comme une mono-oxygnase la faon des P450 ordinaires. On dsigne ce systme par P450nor [57]. La raction globale est : 2 NO + NADH + H
+
N2O + NAD+ + H2O,
Lenzyme bas potentiel ( 307 mV) fixe NO sur son Fe3+. Comme lenzyme est monomrique et na quun seul hme lexclusion de tout autre cofacteur alors que la raction implique deux molcules de NO, on peut supposer quune premire molcule de NO se fixe sur le fer, puis ragit in situ avec la deuxime molcule aprs lapport de deux lectrons venant du NADH. Le mcanisme est diffrent de
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celui des NO rductases bactriennes. Contrairement aux autres cytochromes P450, celui de Fusarium nutilise pas O2. Il est donc inhabituel. En outre il emploie directement du NADH comme source dlectrons sans autre intermdiaire, ce qui rappelle certains P450 des vgtaux. Le P450nor est soluble comme ceux des bactries. Son absence d'intgration la membrane mitochondriale et lutilisation directe de NADH, si ces caractres sont confirms, laisseraient penser que la NO rductase de Fusarium ne constitue pas une tape de couplage nergtique. Une molcule de cette enzyme peut transformer plus de 1000 molcules de NO par seconde, tmoignant d'une activit trs forte. Certains auteurs pensent que sa fonction principale serait la dtoxification de NO. Un systme enzymatique similaire a t dcrit chez Cylindrocarpum tonkinense [58]. Le mcanisme utilis par le P450nor a fait lobjet dun examen dtaill par des auteurs japonais utilisant des techniques spectroscopiques et la cintique rapide [59]. Le mcanisme serait en gros le suivant : lenzyme fixerait une premire molcule de NO puis serait rduite par deux lectrons en formant un "complexe I" [Fe3+-NO]2, H+. Ce nouvel tat trs ractif recevrait la deuxime molcule de NO, provoquerait la soudure des deux atomes dazote et l'expulsion de N2O. Il y a donc une diffrence de principe avec les NO rductases bactriennes. L'vnement de dpart est la fixation de la premire molcule de substrat, avec un changement de ltat de spin du fer et une modification conformationnelle qui active lintervention de la source dlectrons. Le schma est celui de SHIRO et coll., et fait tat dun transfert de deux lectrons sous forme d'hydrure partir de NADH sans oxydorduction du fer. La rduction directe par NADH est une diffrence fondamentale avec les oxygnases P450 que nous trouverons par la suite, et rend impossible l'utilisation du dioxygne.
NO Fe3+ NO H2O + N2O NO NO
2
Fe3+
NADH + H+ NAD+ Fe3+ H+
Le cycle de la NO rductase de Fusarium

Les donnes cintiques et spectroscopiques sont en faveur de lexistence de lintermdiaire I, dont la charge se rpartit en fait entre le fer et la porphyrine. Il apparat en prsence d'une mole de NO par mole denzyme et aprs addition de NADH. Lintermdiaire I disparat rapidement aprs ajout dun excs de NO. Lexistence de cette NO rductase est doublement intressante. En premier lieu cette dnitrification fongique, dont lenzyme est une pice particulire, laisse entendre que limmense cohorte des champignons de la biosphre pourrait avoir des
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potentialits qui restent sous-estimes. Du fait de limportance des mcanismes anarobies dans les biodgradations, de nombreuses espces de champignons, moisissures, levures, apportent peut-tre une contribution capitale. On peut prvoir que le champ des recherches, qui a longtemps privilgi les bactries pour des raisons qui tiennent la commodit des exprimentations, va s'intresser davantage aux champignons du sol. Le deuxime ple dintrt concerne la ressemblance structurale avec les autres P450 et la question de leur origine volutive [60]. Le cytochrome P450 fongique pourrait tre lhritier lointain dune forme ancestrale dont auraient diverg galement les cytochromes P450 utilisateurs d'O2 et les mono-oxygnases actuelles places sur le devant de la scne. Le cytochrome P450 de Fusarium serait-il plus proche de l'origine ancestrale de toutes ces protines ? Cette question peut rserver des surprises dans le futur, et cest la raison pour laquelle elle a t un peu dveloppe ici.
EN GUISE DE CONCLUSION
Le grand rservoir dazote de la biosphre se trouve dans latmosphre, qui est constitue pour prs des quatre cinquimes par N2. La fixation biologique de cet azote en composs organiques ou minraux est norme, plus de 100 millions de tonnes par an, maintenant bien davantage par suite de lpandage des engrais, de la culture des lgumineuses et de rejets industriels. La fixation de lazote est uniquement procaryotique, et se fait aussi bien dans les sols continentaux que dans les ocans. Parmi les composs dont laccumulation risque davoir des effets nuisibles sur l'environnement sont les ions nitrate, loxyde nitrique (NO, peu abondant dans latmosphre) et loxyde nitreux (N2O). Les deux derniers sicles ont amen une forte augmentation du nitrate retenu dans les glaces du Groenland, tandis que la teneur de latmosphre en N2O augmentait rgulirement de 0,3% par an. Les nitrates ne sont pas toxiques par eux-mmes, mais leur ingestion excessive dans les eaux de boisson induit la production de nitrite et de nitrosamines cancrignes par la flore intestinale. L'oxyde nitrique diffuse dans le sang et ragit avec lhmoglobine pour faire une methmoglobine inactive, crant une situation risque connue en particulier chez les nourissons o la rduction du nitrate est favorise par un pH intestinal plus alcalin. La methmoglobine n'assure plus le transport d'O2. Chez l'enfant et l'adulte, le dfaut est heureusement rpar en grande partie par une rductase au sein des globules rouges, sinon les effets du nitrite seraient analogues ceux d'un empoisonnement par le monoxyde de carbone. Daprs la norme en vigueur, une eau cesse dtre potable quand la teneur en nitrate excde 50 mg par litre. Le nitrate en excs tend saccumuler dans les plantes et des accidents ont t observs chez les animaux dlevage par la consommation de certains fourrages. Un excs de nitrates se traduirait par une absorption d'eau accrue par les plantes jointe une baisse de leur teneur en facteurs importants tels que la vitamine C ou le fer. Les vgtaux sont la principale source de nitrites pour l'organisme humain tandis que le taux naturel du nitrate dans la viande est considr comme insignifiant. Ces inconvnients ont conduit
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limiter l'utilisation de nitrate pour la conservation des produits alimentaires (salaisons), et mme l'interdire dans plusieurs pays. Les nitrates sont des sels stables dans les sols ars, mais ils sont trs solubles et sont facilement entrans par les eaux, beaucoup plus facilement que les phosphates ajouts dans les fertilisants. En outre lion nitrate par sa charge ngative est beaucoup moins bien retenu par les argiles et composs humiques, eux-mmes porteurs de charges ngatives. On a dcouvert que lazote nitrique non consomm immdiatement par les plantes peut perdurer assez longtemps dans les sols jusqu' ce qu'il soit facilement entran dans les nappes phratiques aprs une priode de pluie. Ces caractres font que l'pandage en excs des fertilisants nitrats est une source de pollution pour les eaux. Les pratiques de la culture intensive ont t montres du doigt. Par exemple dans la culture du bl, un rendement de 60 quintaux lhectare tait considr autrefois comme correct. On dpasse maintenant 80 quintaux. Il faut alors apporter plus de 250 kg dazote lhectare, compte tenu des pertes. Daprs MARIOTTI [61], les pertes sadditionnent au cours des annes et peuvent conduire des accumulations considrables. La dnitrification naturelle vacue vers latmosphre des oxydes tels que N2O, mais comme celui-ci a un temps de rsidence trs long, il apporte une contribution croissante leffet de serre. Des rgions naturelles de savane, bien que pauvres en azote minraux, seraient nanmoins rendues trs fertiles avec suffisamment deau, car lazote y intervient en circuit ferm. Les matires vgtales mortes produisent de lammonium qui est facilement retenu grce sa charge positive par largile et lhumus. Cet azote ammoniacal nest pratiquement pas nitrifi et les plantes le rcuprent sur place avec un minimum de pertes. Les plantes adaptes auraient donc la capacit dutiliser efficacement NH3 sans dpendre de la nitrification dans le sol. L'agriculture intensive n'est pas seule responsable de la charge en nitrate des rivires et des eaux ctires dans les rgions o existent des levages industriels. Le rejet des lisiers a t incrimin, par exemple en Bretagne. Des mares vertes sont apparues le long du littoral. L'excdent de nitrate amen par les rivires y dclenche une prolifration d'algues et de phytoplancton. La Vilaine, la Rance, l'Elorn et la Loire dversent parfois dans la mer des eaux colores. La couverture des eaux par les ulves perturbe l'quilibre biologique sousjacent et encourage une prolifration intense de dinoflagells, Alexandrium minutum et Dinophysis, qui prsentent un risque toxique important. Ces organismes sont responsables des "eaux rouges", se concentrent dans les bivalves et les rendent impropres la consommation cause des toxines qu'ils scrtent. On a galement relev des teneurs anormales en pesticides, notamment dans plusieurs rivires bretonnes. Le problme a pris des dimensions proccupantes et parfois scandaleuses. Ces dernires annes en France, l'eau potable tait produite pour 60% partir des nappes souterraines par captage ou forage profond. Le reste tait pomp dans les fleuves, les rivires et les lacs et distribu aprs retraitement. Comment peut-on liminer les nitrates ? Un procd parmi d'autres consiste utiliser le pouvoir dnitrifiant des bactries en anarobiose, condition qu'elles puissent se dvelopper avec des ressources nutritives prsentes ou ajoutes dans l'eau pollue. Des minraux et une source carbone, qui sera dtruite au cours du traitement, permettent d'activer le dveloppement des germes. Voici pour
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illustration le principe d'une installation o une tape de dnitrification sans air (avec perfusion ventuelle d'azote) est suivie d'une puration par aration, et enfin d'une filtration.
dnitrifieur arateur unit de filtration
excs de boues eau brute
ozoniseur
source carbone et sels minraux
air
eau traite
La ncessit moderne de lutter contre l'excs de nitrate dans les eaux a stimul de gros efforts techniques. Des procds utilisent l'osmose inverse, l'change d'ions, l'lectrodialyse combine un bioracteur membrane, ou encore une filtration sur des membranes cramiques retenant les bactries dnitrifiantes, mais les quantits traiter et les prix de revient sont videmment des facteurs dterminants.
RFRENCES
[1] K R A F F T T, B O K R A N Z M, K L I M M E K O , S C H R O D E R I, F A H R E N H O L Z F, K O J R O E & K R O G E R A (1992) Eur. J. Biochem. 206 : 503-510. [2] J O H N S O N JL, R A J A G O P A L A N KV, M U K U N D S & A D A M S MW (1993) J. Biol. Chem. 268 : 4848-4852 ; K L E T Z I N A & A D A M S MW (1996) FEMS Microbiol. Rev. 18 : 5-63. [3] H I N T O N S M & D E A N D (1990) Crit. Rev. Microbiol. 17 :169-188. [4] J O H N S O N JL, B A S T I A N NR & R A J A G O P A L A N KV (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. US 87 : 3190-3194. [5] H I G G I N S C F (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8 : 67-113 ; E H R M A N N M, E H R L E R, H O F M A N N E, B O O S W & S C H L S S E R A (1998) Molecular Microbiol. 29 : 685-694. [6] H I N T O N S M & M O R T E N S E N LE (1985) J. Bacteriol. 162 : 485-493. [7] B O Y I N G T O N JC , G L A D Y S H E V VN, K H A N G U L O V S V, S T A D T M A N TC & S U N PD (1997) Science 275 : 1305-1308. [8] A N T I P O V AN, L Y A L I K O V A NN, K H I J N I A K TV & L V O V NP (1998) FEBS Lett. 44 : 257-260. [9] B L A S C O F, P O M M I E R J, A U G I E R V, C H I P P A U X M & G I O R D A N O G (1989) Mol. Microbiol. 6 : 221-230. [10] S I D D I Q U I RA, W A R N E C K E - E B E R T Z U, H E N G S B E R G E R A, S C H N E I D E R B, K O S T K A S & F R I E D R I C H B (1993) J. Bacteriol. 175 : 5867-5876 ; R E Y E S F, R O L D A N MD , K L I P P W , C A S T I L L O F & M O R E N O - V I V I A N C (1996) Molec. Microbiol. 19 : 1307-1318. [11] L I N JT, G O L D M A N BS & S T E W A R T V (1994) J. Bacteriol. 176 : 2551-25559. [12] D E M O S S JA & H S U PY (1991) J. Bacteriol. 173 : 3303-3310.
314
[13] B L A S C O F, N U N Z I F, P O M M I E R J, B R A S S E U R R, C H I P P A U X M & G I O R D A N O G (1992) Mol. Microbiol. 6 : 209-219. [14] L I U X, D E M O S S JA (1997) J. Biol. Chem. 272 : 24266-24271 ; B L A S C O F, D O S S A N T O S JP, M A G A O N A, F R I X O N C , G U I G L I A R E L L I B, S A N T I N I C L & G I O R D A N O G (1998) Mol. Microbiol. 28 : 435-447. [15] A U G I E R V, A S S O M, G U I G L I A R E L L I B, M O R E C , B E R T R A N D P, S A N T I N I C L, B L A S C O F, C H I P P A U X M & G I O R D A N O G (1993) Biochemistry 32 : 5099-5108. [16] M A G A L O N A, L E M E S L E - M E U N I E R D , R O T H E R Y RA, F R I X O N C , W E I N E R JH & B L A S C O F (1997) J. Biol. Chem. 272 : 25652-25658. [17] B R Y K R, G R I F F I N P & N A T H A N C (2000) Nature 407 : 211-215. [18] P E R E I R A IC , A B R E U IA, X A V I E R AV, L E G A L L J & T E I X E I R A M (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 224 : 611-618. [19] Y A M A N A K A T (1992) In "The Biochemistry of Bacterial Cytochromes", Springer Verlag KG, Berlin ; H E N R Y Y & B E S S I R E S P (1984) Biochimie 66 : 259-289 ; S I V E S T R I N I MC , G A L E O T T I L, G E R V A I S M, S C H I N I N E, B A R R A D , B O S S A A F & B R U N O R I M (1994) Biochimie 76 : 641-654. [20] F L P V, M O I R JW B , F E R G U S O N S J & H A J D U J (1995) Cell 81 : 369-377. [21] W I L L I A M S PA, F L O P V, G A R M A N EF, S A U N D E R S NFW , F E R G U S O N S J & H A J D U J (1997) Nature 389 : 406-412. [22] N A R H , M E S S E R S C H M I D T A, H U B E R R, V A N D E K A M P M & C A N T E R S G W (1991) J. Mol. Biol. 221 : 765-772. [23] F A R V E R O , E A D Y RR, A B R A H A M ZH & P E C H T I (1998) FEBS Lett. 436 : 239-242. [24] S U Z U K I S , Y O S H I M U R A T, K O Z H U M A T, S H I D A R A S , M A S U K O M, S A K U R A I T & I W A S A K I H (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 164 : 1366-1372 ; H U L S E C L, A V E R I L L BA & T I E D J E JM (1989) J. Amer. Chem. Soc. 111 : 2322-2323 ; H O W E S BD , A B R A H A M ZH L , L O W E D J, B R S E R T, E A D Y RR & S M I T H BE (1994) Biochemistry 33 : 3171-3177. [25] A D M A N ET, G O D D E N JW & T U R L E Y S (1995) J. Biol. Chem. 270 : 27458-27474. [26] M U R P H Y ME, T U R L E Y S & A D M A N ET (1997) J. Biol. Chem. 272 : 28455-28460. [27] M A S U K O M & I W A S A K I H (1984) Plant Cell. Physiol. 25 : 439-446 ; J A C K S O N MA, T I E D J E JM & A V E R I L L BA (1991) FEBS Lett. 291 : 41-44. [28] K U K I M O T O M, N I S H I Y A M A M, T A N O K U R A M, A D M A N ET & H O R I N O U C H I S (1996) J. Biol. Chem. 271 : 13680-13683 ; D O D D FE, V A N B E E U M E N J, E A D Y RR & H A S N A I N S S (1998) J. Mol. Biol. 282 : 369-382. [29] S H O U N H , K A N O M, B A B A I, T A Y A K A N, M A T S U O M (1998) J. Bacteriol. 180 : 4413-4415. [30] E A V E C D J, G R O V E J, S T A U D E N M A N N W , J A M E S P, P O O L E RK, W H I T E S A, G R I F F I T H S I & C O L E JA (1998) Molec. Microbiol. 28 : 205-216. [31] L I U MC & P E C K H D J (1981) J. Biol. Chem. 256 : 13159-13164. [32] B L A C K M O R E R, R O B E R T S O N A & B R I T T A I N T (1986) Biochem. J. 233 : 547-552. [33] S C H U M A C H E R W , H O L E U & K R O N E C K PMH (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 205 : 911-916 ; E I N S L E O , M E S S E R S C H M I D T A, S T A C H P, B O U R E N K O V G P, B A R T U N I K H D , H U B E R R & K R O N E C K PMH (1999) Nature 400 : 476-480.
6 RDUCTION DES OXYDES D'AZOTE [34] P E R E I R A IC , A B R E U IA, X A V I E R AV, L E G A L L J & T E I X E I R A M (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 224 : 611-618.
315
[35] M O R E N O C , C O S T A C , M O U R A I, L E G A L L J, L I U MY , P A Y N E W J & V A N D I J K C & M O U R A JJ. (1993) Eur. J. Biochem. 212 : 79-86. [36] I G A R A S H I N, M O R I Y A M A H , F U J I W A R A T, F U K U M O R I Y & T A N A K A N (1997) Nature Struct. Biol. 4 : 276-284. [37] F R U N Z K E K & M E Y E R O (1990) Arch. Microbiol. 154 : 168-174. [38] Y O S H I N A R I T (1980) Appl. Environ. Microbiol. 39 : 81-84 ; T E R A G U C H I S & H O L L O C H E R TC (1989) J. Biol. Chem. 264 : 1972-1979. [39] H E I S S B, F R U N Z K E K & Z U M F T W G (1989) J. Bacteriol. 171 : 3288-3297 ; J O N E S AM & H O L L O C H E R TC (1993) Biochim. Biophys. Acta 1144 : 359-366 ; Z U M F T W G , B R A U N C & C U Y P E R S H (1994) Eur. J. Biochem. 219 : 481-490 ; K A S T R A U D H W , H E I S S B, K R O N E C K PMH & Z U M F T W G (1994) Eur. J. 222 : 293-303 ; G I R S C H P & D E V R I E S S (1997) Biochim. Biophys. Acta 1318 : 202-216. [40] C O Y L E C , Z U M F T W G , K R O N E C K PMH , K R N E R H & J A K O B W (1985) Eur. J. Biochem. 153 : 459-467 ; R I E S T E R J, Z U M F T W G & K R O N E C K PMH (1989) Eur. J. Biochem. 178 : 751-762 ; S O O H O O C K & H O L L O C H E R TC (1991) J. Biol. Chem. 266 : 2203-2209 ; S O O H O O C K, H O L L O C H E R TC , K O L O D Z I E J AF, O R M E - J O H N S O N H & B U N K E R G (1991) J. Biol. Chem. 266 : 2210-2218. [41] G I R S C H P & D E V R I E S S (1997) Biochim. Biophys. Acta 1318 : 202-216. [42] Z U M F T W G , B R A U N C & C U Y P E R S H (1994) Eur. J. Biochem. 219 : 481-490. [43] V A N D E R O O S T J, D E B O E R AP, D E G I E R JW , Z U M F T W G , S T O U T H A M E R AH & V A N S P A N N I N G RJ (1994) FEMS Microbiol. Lett. 121 : 1-9. [44] D E G I E R JW , S C H E P P E R M, R E I J N D E R S W N, V A N D Y C K S J, S L O T B O O M D J, W A R N E A, S A R A S T E M, K R A B K, F I N E L M, S T O U T H A M E R AH , V A N S P A N N I N G RJ & V A N D E R O O S T J (1996) Mol. Microbiol. 20 : 1247-1260. [45] Y E RW , A V E R I L L BA & T I E D J E JM (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 1053-1058. [46] H A S K I N C J, R A V I N, L Y N C H JB, M N C K E & Q U E L (1995) Biochemistry 34 : 11090-11098 ; V E R P L A E T S E J, V A N T O R N O U T P, D E F R E Y N G , W I T T E R S R & L O N T I E R (1979) Eur. J. Biochem. 95 : 327-331 ; B R U D V I G G W , S T E V E N S TH & C H A N S I (1985) Biochemistry 19 : 5275-5285. [47] F U J I W A R A T & F U K U M O R I Y (1996) J. Bacteriol. 178 : 1866-1871. [48] C A S T R E S A N A J & S A R A S T E M (1995) Trends in Biochem. Sci. 20 : 443-448. [49] P I C H I N O T Y F, M A N D E L M, G R E E N W A Y B & G A R C I A J- L (1979) Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 128A : 75-87 ; H U T C H I N S S R (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 2403-2407. [50] K U N D U B & N I C H L A S D JD (1985) Arch. Microbiol. 140 : 358-364 ; P A R S O N A G E D , G R E E N F I E L D AJ & F E R G U S O N S J (1986) Arch. Microbiol. 145 :191-196 ; R I C H E R D S O N D J, B E L L LC , M C E W A N AG , J A C K S O N JB & F E R G U S O N S J (1991) Eur. J. Biochem. 199 : 677-683. [51] Z U M F T W G & M A T S U B A R A T (1982) FEBS Lett. 148 : 107-112 ; Z U M F T W G , D H L E R K, K R N E R S , L C H E L T S , V I E B R O C K A & F R U N Z K E K (1988) Arch. Microbiol. 149 : 492-498.
316
[52] K R O N E C K PMH , A N T H O L I N E W A, R I E S T E R J & Z U M F T W G (1988) FEBS Lett. 242 : 70-74 ; J I N H , T H O M A N N H , C O Y L E C L & Z U M F T W G (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 : 4262-4269. [53] T I E D J E JM (1994) In "Methods of Soil Analysis" part 2, W E A V E R RW , A N G L E JS & B O T T O M L E Y PJ eds, Soil Sci. Society of America, Madison, Wis. : 245-267. [54] S H O U N H & T A N I M O T O T (1991) J. Biol. Chem. 266 : 11078-11082. [55] K O B A Y A S H I M & S H O U N H (1995) J. Biol. Chem. 270 : 4146-4151. [56] K O B A Y A S H I M, M A T S U O Y , T A K I M O T O A, S U Z U K I S , M A R U O F & S H O U N H (1996) J . Biol. Chem. 271 : 16263-16267. [57] S H O U N H & T A N I M O T O T (1991) J. Biol. Chem. 266 : 11078-11082 ; S H I R O Y , F U J I I M, I S O G A I Y , A D A C H I S I, L I Z U K A T, O B A Y A S H I E, M A K I N O R, N A K A H A R A K & S H O U N H (1995) Biochemistry 34 : 9052-9058 ; N A K A H A R A K & S H O U N H (1996) J. Biochem. 120 : 1082-1087. [58] T O R I T S U K A N, S H O U N H , S I N G H UP, P A R K S Y , I Z U K A T & S H I R O Y (1997) Biochim. Biophys. Acta 1338 : 93-99. [59] S H I R O Y , F U J I I M, I I Z U K A T, A D A C H I S I, T S U K A M O T O K, N A K A H A R A K & S H O U N H (1995) J. Biol. Chem. 270 : 1617-1623. [60] O K A M O T O N, I M A I Y , S H O U N H & S H I R O Y (1998) Biochemistry 37 : 8839-8847. [61] M A R I O T T I A (1998) Pour La Science 249 : 60-65 ; M A R I O T T I A (1994) Hydrogologie 3 : 43-68.
CHAPITRE 7 OXYDATIONS ANAROBIES DIVERSES

Nous savons que le potentiel lectrochimique membranaire est une forme de stockage de l'nergie directement produite par les oxydorductions respiratoires. Quand l'oxygne fait dfaut, les respirations dites anarobies prennent le relais en utilisant des accepteurs de remplacement. La dnitrification est l'une des solutions. D'autres respirations sont tout aussi importantes et maintes biodgradations en sont tributaires. Dans ce chapitre sont examines quelques-unes de celles qui apparaissent comme les principales. Certaines sont surprenantes, comme l'intervention de l'humus du sol ou du fumarate. Mais la rduction du sulfate et des composs soufrs a une fonction majeure dans l'environnement partout o ils sont abondants. La rduction d'lments mtalliques, comme le fer et le manganse, est tout aussi importante et reprsente peut-tre un mcanisme nergtique trs ancien de l'histoire de la vie. Nous terminerons par une surprise que nous offrent les halorespirations, o les accepteurs sont des drivs chlors ou des oxydes de chlore, dont certains sont des produits polluants rpandus par l'industrie. La respiration anarobie est rserve essentiellement aux procaryotes et reste exceptionnelle chez l'norme majorit des eucaryotes dont le dveloppement normal est tributaire de l'oxygne. 7.1 - Des accepteurs varis et inattendus 7.2 - Du sulfate au sulfure 7.3 - Biochimie de la rduction du sulfate 7.4 - Le fer et le manganse comme accepteurs anarobies 7.5 - Dshalognation respiratoire - Oxyde de chlore 319 326 332 340 35 1
7 OXYDATIONS ANAROBIES DIVERSES

Le potentiel lectrochimique membranaire est une forme de stockage de l'nergie. Celle-ci est utilise directement, notamment pour des transports actifs ou la mobilit (rotation des flagelles), ou convertie secondairement en ATP par l'ATP synthase de type F0F1. Sa prsence inhibe le fonctionnement des autres formes de respiration, soit en bloquant indirectement l'expression des gnes concerns, soit en inhibant directement les enzymes qui participent. Les accepteurs de remplacement sont gnralement des produits abondants dans l'environnement, ou engendrs par voie biologique, mais leur utilisation des fins respiratoires est rserve aux procaryotes. La respiration anarobie n'est qu'exceptionnelle chez les eucaryotes qui restent tributaires de l'oxygne dans leur norme majorit pour tout dveloppement normal.
7.1 - DES ACCEPTEURS VARIS ET INATTENDUS

Les biotopes anarobies n'ont que l'embarras du choix pour remplacer l'oxygne, qui est l'accepteur au potentiel le plus lev. Nous avons dj rencontr les nitrates et autres oxydes d'azote. Dautres accepteurs respiratoires extrmement importants dans la nature sont divers composs soufrs dont le sulfate, des mtaux comme Fe(III), Mn(IV), une foule de composs organiques halogns ou non dont la liste ne cesse de sallonger, et mme certains constituants du sol. Parmi ces derniers, lhumus figure en bonne place. Un accepteur rpandu est le fumarate. Ce compos est un intermdiaire mtabolique des oxydations arobies dans le cycle de Krebs, o il est form partir du succinate. La raction inverse s'observe en anarobiose, o la rduction du succinate en fumarate voque une fermentation. Une vritable fermentation devrait conduire directement une formation d'ATP, mais dans bien des cas la rduction du fumarate ne correspond pas une fermentation, parce que la raction est couple avec une extrusion de protons travers la membrane et reprsente une respiration anarobie. D'autres mtabolismes respiratoires dcouverts rcemment utilisent des composs aromatiques et des drivs chlors. Enfin nous savons que la mthanisation est une respiration d'un genre particulier o le gaz carbonique servirait d'accepteur. L'nergie rcupre par respiration anarobie est d'autant plus grande que la diffrence de potentiel d'oxydorduction entre le donneur et l'accepteur est la plus grande. Comme aucun accepteur n'est aussi favorable que l'oxygne avec son
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potentiel de 810 mV, toutes les espces fonctionnant en anarobiose facultative ont des systmes rgulateurs leur permettant d'abandonner aussitt tout accepteur de remplacement aprs un retour l'oxygne. L'hydrogne molculaire n'est pas loin de l'autre extrmit de l'chelle, avec un potentiel standard de 2 H+/H2 gal 430 mV (pH 7) 1. Nous examinerons dans ce chapitre des respirations anarobies sur diffrents accepteurs autres que les oxydes dazote, comme le sulfate. D'autres sont moins vidents et nous allons commencer par quelques exemples naturels : l'humus, le fumarate et certains oxydes organiques. Le terme dhumus voque une matire du sol essentielle la croissance de beaucoup de plantes, l'me en quelque sorte de la terre des jardins, des champs et des forts. Il est constitu de nombreux lments htrognes, dont beaucoup sont rcalcitrants et ont par consquent une trs longue vie moyenne. Sa composition est un sujet complexe, et dpend normment du lieu, du climat, de la vgtation et de la nature du sol. Quelques dtails sur la composition de l'humus sont donns en glossaire. Les lments quinoniques de lhumus participent des oxydorductions biologiques parce que leur potentiel est situ dans la gamme physiologique de + 100 + 300 mV en fonction de l'environnement molculaire et de l'hydratation. Ils interviennent dans deux catgories de situations. Dans la premire, les lments humiques servent daccepteurs dlectrons dans des respirations anarobies effectues par des Geobacter et Shewanella, et sont rduits principalement sous forme hydroquinonique. Dans la deuxime, lhumus rduit est oxyd en anarobiose dans d'autres respirations qui l'oxyde par divers accepteurs d'lectrons comme l'ion nitrate ou le fer ferrique. La transformation intervient en deux temps. Lhumus est dabord rduit, principalement au niveau des sites quinoniques, puis il est oxyd nouveau par dautres accepteurs respiratoires potentiel plus lev. Surprenant ! Lanarobiose voit donc se drouler un cycle doxydorduction particulier concernant lhumus, dont certains composants peuvent osciller entre les tats oxyd et rduit. En servant dintermdiaire dans les changes dnergie du sol labri de lair, l'humus assume ainsi une fonction biologique importante dans lenvironnement. Il a aussi la fonction physicochimique d'une substance ballast capable de retenir l'eau et doue de proprits adsorbantes qui interviennent sur la rmanence et la mobilit des lments qui traversent le sol. Par exemple des produits polluants peuvent tre retenus et donner du temps la microflore du sol pour les dgrader, ou au contraire les abandonner un lessivage rapide conduisant la contamination des nappes phratiques et des rivires. Le coefficient de partage entre la fraction circulante dun produit dans le sol et la partie adsorbe sur les particules solides est dsign par Koc*, un paramtre qui intervient dans la vitesse des biodgradations. Cette respiration indite sur groupes quinoniques de l'humus oxyderait non slectivement une trs grande varit de substrats dans le sol. Les exemples courants sont le glucose issu de lhydrolyse de la cellulose, des acides amins et des produits de fermentation (actate, lactate, propionate, butyrate, thanol), sans omettre
1 - Le potentiel du couple protons-hydrogne peut s'lever facilement 350 mV dans la ralit, parce que le gaz hydrogne est toujours trs dilu dans les conditions naturelles.
321
lhydrogne. De lautre ct de la chane, les accepteurs potentiel plus lev qui roxydent lhumus sont principalement le nitrate, le fer et le fumarate. L'intervention du sulfate n'a pas t dmontre. Ces oprations alternes de rduction et d'oxydation sont effectues surtout par des bactries Gram-ngatives sans proche parent entre elles. Leur dtection est facilite par lemploi dun substrat artificiel imitant lhumus rduit, qui est l'AHDS*. Les recherches rcentes montrent donc que lhumus est loin dtre une rserve carbone relativement inerte dans le sol, mais a un rle dynamique considrable comme support biologique fondamental de fertilit et d'volution des sols. Le fumarate offre une autre situation originale, parce que c'est un intermdiaire bien connu du mtabolisme. La rduction du fumarate en succinate par la fumarate rductase est l'ultime tape de cette respiration et semble trs rpandue chez de nombreuses espces bactriennes. Elle est inverse de la raction de la succinate dshydrognase dans le cycle de KREBS (le complexe II mitochondrial) :
OOCCH=CHCOO + 2 e + 2 H+
OOCCH2CH2COO
Le remplacement de cette enzyme par la fumarate rductase s'effectue chez E. coli au cours du passage l'anarobiose. Chose curieuse, les deux enzymes se ressemblent par leur structure et leurs cofacteurs, ont toutes deux 4 sous-units dont deux sont insres dans la membrane. Les sous-units sont codes par deux oprons homologues, mais l'ordre des gnes diffre : frdABCD pour la rductase, sdhCDAB pour la dshydrognase 2. Les deux enzymes peuvent mme se remplacer mutuellement pour assurer la croissance dans des cas particuliers, et sont enchasses dans la membrane sous forme de dimres [1]. La fumarate rductase reoit les lectrons par une mnaquinone mobile au sein de la membrane. Les mnaquinones qui diffrent les unes des autres comme les ubiquinones par la longueur de leur chane latrale sont aussi lipophiles et fonctionnent de la mme faon. Elles sont prfres en anarobiose par leur potentiel plus bas. La structure de l'enzyme a t dtermine chez le colibacille [2], et Wolinella succinogenes [3]. Dans le premier cas les quatre sous-units forment un complexe de 121 kDa renfermant une flavoprotine (66 kDa) avec FAD li de faon covalente, une protine fer-soufre (27 kDa) et deux protines assez similaires loges dans la membrane (sous-units C et D). L'enzyme de Wolinella, n'a qu'une seule sous-unit membranaire qui remplace C et D dans le monomre et comporte 5 hlices transmembranaires. Elle est reprsente par la figure de la page suivante. L'ensemble renferme une chane de transporteurs d'lectrons qui part de la membrane sur sa face priplasmique, avec la mnaquinone rduite comme donneur. La partie membranaire a deux sites de liaison pour mnaquinone, dont l'un situ entre les deux sous-units dans un environnement hydrophobe. Ces deux sites sont assez distants et occupent grosso modo des positions opposes de part et d'autre de la membrane. On les dsigne respectivement par QD (distal) et QP (proximal). 2 - L' homologie se retrouve galement dans la succinate dshydrognase mitochondriale, qui est cependant plus complique avec des constituants supplmentaires. La dshydrognase et la rductase sont groupes sous le mme code EC 1.3.5.1 comme succinate : quinone oxydorductases.
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fumarate [2Fe-2S]
ct interne A FAD R
FAD
R'
[4Fe-4S] B Qp C [3Fe-4S] mnaquinone hme B Qd hme B ct priplasme mnaquinone
Fumarate rductase de Wolinella

Le site QP est au voisinage immdiat du noyau fer-soufre [3Fe-4S], de potentiel 70 mV, probablement le maillon suivant dans la chane. Il y a deux autres noyaux fer-soufre, un [4Fe-4S] de 320 mV et un [2Fe-2S] de 20 79 mV. Chez Wolinella deux hmes B superposs peu prs perpendiculaires au plan de la membrane sont situs entre les sites QP et QD comme dans un complexe bc1. La prsence de ces porphyrines est variable chez les autres espces (absentes dans le colibacille), mais l'organisation gnrale obirait au mme principe. Elle suggre l'existence d'un cycle Q dfini au premier chapitre, avec rduction et prlvement de deux protons du ct interne de la membrane la position QD , oxydation et libration de deux protons de l'autre ct en QP. Ces changes contribuent ainsi au potentiel membranaire dont le principe est indiqu par un dessin. Il n'y a cependant pas de preuve exprimentale d'une conservation d'nergie comparable chez toutes les espces et il n'existe peut-tre qu'un cycle quinonique ordinaire dans la respiration sur fumarate chez E. coli.
cytoplasme membrane priplasme
B C
2H Q 2 e 2 H+
NADH + H+ 2 H+
QH2
2 e 2 H+
NADH-dh I
Respiration sur fumarate
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La membrane cytoplasmique est impermable au passage des molcules ioniques comme le fumarate sans l'aide de transporteurs. Escherichia coli possde un antiporteur des acides dicarboxyliques 4 atomes de carbone (DcuA) qui fait l'change fumarate/aspartate, et un antiporteur fumarate/malate (DcuB). Ces outils vont de pair avec la fumarate rductase et sont bien connus surtout chez les Gram-ngatifs. Le caractre membranaire de la fumarate rductase connat des exceptions. Chez deux Shewanella, la raction est catalyse par un flavocytochrome du priplasme, mais avec une structure de site et un mcanisme au niveau du FAD qui restent comparables [4]. D'autres composs rcuprs de l'environnement fonctionnent comme accepteurs d'une faon similaire. On prendra comme exemples le dimthyl sulfoxyde (DMSO) et l'oxyde de trimthylamine (ou trimthylamine oxyde, TMAO), qui sont des produits naturels rpandus dans la biosphre. Leur rduction comme accepteurs terminaux d'une chane d'oxydorductions est la base d'un mcanisme respiratoire. Le DMSO est connu des chimistes comme un excellent solvant miscible l'eau, mais c'est aussi un produit naturel form par l'oxydation du dimthylsulfure provenant de la dcomposition des matires organiques et de l'activit du phytoplancton marin. La respiration sur DMSO a t tudie en dtail chez Escherichia coli [5]. La rductase terminale fait partie d'un complexe de trois lments DmsABC qui est produit par les bactries en absence d'oxygne et de nitrate. Il est caractristique de systmes appartenant une mme famille comprenant aussi la TMAO rductase. La rductase DmsA contient un cofacteur molybdne de type MGD comme celui de la nitrate rductase, mais il est ici un peu plus compliqu puisque le molybdne est li deux units dinuclotidiques au lieu d'une.
ribose adnine P P O S O HN H2N N H N N H S Mo S O O P P adnine ribose S O H N N H N NH2 NH O
Cofacteur bis (MGD)-Mo

Le composant DmsB agit la manire d'une ferrdoxine et comporte 4 noyaux [4Fe-4S] dont les potentiels s'chelonnent entre 50 et 330 mV. L' lment membranaire DmsC est ncessaire l'ancrage du dimre DmsA/DmsB la membrane du ct cytoplasmique et servirait aussi faciliter le transfert des lectrons de la mnaquinone rduite (MQH2) DmsB. Chez Rhodobacter capsulatus, un cytochrome spcial contenant 5 hmes de type C remplace la pice membranaire DmsC et sert de porte d'entre des lectrons partir des quinones [6].
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priplasme MQH2 E = 70 mV MQ DmsB 4 [4Fe4S] DmsA Mo DmsC membrane DMSO H3C E = + 160 mV H3C CH3 S CH3 S O
Complexe de la DMSO rductase

La spcificit de la DMSO rductase s'tend divers substrats analogues au DMSO, tels que des pyridine-oxydes et le TMAO, et prsente des similitudes remarquables avec la rductase du TMAO, qui est trs spcifique de son substrat [7]. La mutagense dirige permet de transformer assez facilement une DMSO rductase en TMAO rductase spcifique et vice versa. Ces recherches ont permis de renforcer l'ide qu'on se faisait des enzymes molybdne dans l'environnement, en dehors de la nitrate rductase. Le mcanisme chimique reprsent de faon simplifie est celui de GARTON et coll. [8]. Le molybdne, entour de 6 ou 5 coordinences dont l'une est sur un rsidu srine de la protine, change de degr d'oxydation lectron par lectron au cours du cycle catalytique. Celui-ci est en grande partie rversible.
Ser CH2 O Mo S S VI S S O
Ser S O S S CH2 O Mo IV S
DMS
e + H+
Ser CH2 HO S S O Mo V S
S Ser H2O DMSO CH2 H2O ? O S Mo S S IV S
e + H+
Catalyse avec molybdne

Une transformation intressante en anarobiose minralise le DMS en H2S et en CO2 ou en CH4. Cette opration est particulirement active en milieu lagunaire, o les mthanognes et les bactries sulfato-rductrices entrent en comptition. Ce sont en principe les plus grands utilisateurs de DMS, mais la part de mthane fait partir de celui-ci dans les sdiments peut atteindre 25%. Une autre
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transformation anarobie laquelle participent les mthanognes est l'laboration du sulfure de mthyle ou mthanethiol (CH3SH), qui est galement transform en sulfure de carbonyle (COS) par action photochimique. Le sulfure de mthyle apparat aussi dans l'intestin animal comme un produit de dtoxification de H2S (produit par la dcomposition des protines), un gaz extrmement toxique s'il venait s'accumuler. Il existe donc un cycle du DMS o le mtabolisme soufr est interconnect celui du groupe mthyle.
CH3 3 CH3SH 3 CH4 H2S CO2 2 CH3 S DMS 1 CH3SH mthanethiol
1 - DMS mono-oxygnase 2 - mthanethiol oxydase 3 - thiol-S-mthyltransfrase 4 - mthanognes
Cycle du dimthylsulfure
L'oxyde de trimthylamine ou TMAO est un constituant rpandu chez les invertbrs marins et les poissons, o il participe conjointement au glycrol et l'ure au maintien de la pression osmotique du milieu intrieur. Les systmes respiratoires utilisant le TMAO sont connus depuis longtemps dans E. coli, Rhodobacter, Shewanella et Vibri [9]. On y observe jusqu' prsent trois lments structuraux comprenant une rductase priplasmique molybdne (TorA), un cytochrome 5 hmes C attach la membrane (TorC) et une protine TorD considre comme stabilisatrice. Le complexe de E. coli est command par l'opron torCAD, rgul par un systme particulier deux composants, TorS/TorR. Le systme Tor de Shewanella renferme un lment supplmentaire, TorE de fonction mal connue, dont le gne fait partie d'un opron torECAD. La respiration sur TMAO se met en route sous l'effet de deux facteurs principaux : l'anarobiose et la prsence de TMAO. Les modalits diffrent selon les espces. Voici pour illustration l'unit gntique, longue de 9 kb, qui permet un Shewanella de respirer sur TMAO. ct de l'opron torECAD se trouvent des gnes codant pour des protines rgulatrices. La dtection du TMAO, agissant comme inducteur, se fait par TorS, l'anarobiose peut-tre par TorT. TorR est un activateur de transcription, reconnu en amont de l'opron ( gauche sur le plan) et stimulant sa transcription [10].
attachement de TorR promoteur
torE
torC
torA
torD
torS torT bloc rgulateur
torR
Gnes tor de Shewanella oneidensis
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Le tandem de protines TorS-TorR constitue un systme rgulateur deux composants sur le mode usuel. TorS est un capteur li la membrane, charg de fixer le TMAO prsent l'extrieur et agissant comme rcepteur. Il s'auto-phosphoryle sur histidine, et phosphoryle son tour un activateur de transcription, ici TorR. Un schma simplifi indique les domaines successifs de la squence d'acides amins.
+ domaine reconnaissant le TMAO P H443 D723 + H850 + D53 domaine de liaison l'ADN
activation de torECAD TorS TorR
Systme rgulateur TorS/TorR

La protine TorS, qui sert de capteur, est construite de faon modulaire, avec un domaine extrieur capable de lier le TMAO, des portions qui traversent la membrane (rectangles noirs), et les domaines cytoplasmiques phosphorylables sur histidine (H) ou sur aspartate (D). Les numros sont les positions dans la squence de 1100 acides amins. La premire phosphorylation est catalyse par TorS elle-mme (une autokinase) et se fait sur H443 partir de l'ATP. La protine TorS ainsi phosphoryle sur histidine en TorS-P n'active pas directement TorR. Il y a d'abord successivement deux transferts internes de phosphate sur D723 puis H850. C'est partir de cette position que TorR est phosphoryle son tour. La protine TorR phosphoryle sur aspartate (TorR-P) se lie en un site spcifique sur l'ADN et active la transcription de torECAD. La cascade de transferts successifs par ricochets (flches avec le signe +) est la particularit essentielle. Il y a un autre dtail remarquable. Quand le TMAO disparat du milieu, l'expression des gnes tor est rapidement mise en veilleuse. L'aspartate phosphoryl sur TorR (D53) active l'enlvement du phosphate sur H850, puis D723 (flches avec le signe ). Il y a donc deux cascades antagonistes en quilibre dynamique l'une avec l'autre et la respiration sur TMAO ne fonctionne strictement que lorsque les conditions sont adquates. Il est possible que ce type de rgulation ne soit que la partie connue d'un maillage plus complexe de contrles au sein de la cellule, o le systme cod par torSTR agirait en mme temps sur d'autres mtabolismes. Il a t observ par exemple que le TMAO, qui induit la rductase correspondante, provoque la rpression de la fumarate rductase dans Shewanella, peut-tre par l'intermdiaire de TorR. Quitte choisir entre fumarate et TMAO, la prfrence est apparemment pour le second.
7.2 - DU SULFATE AU SULFURE

Les sulfates ocaniques constituent le plus grand rservoir de soufre de la biosphre. Son accumulation peut s'expliquer par les missions volcaniques et leur oxydation tout au long de l'histoire de la terre. Elle rsulte aussi de l'activit des
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tres vivants. L'entre du soufre dans les synthses biologiques ne se fait qu' l'tat le plus rduit, c'est--dire au niveau d'oxydation de l'ion sulfure. On le retrouve principalement dans la cystine et la mthionine, ainsi que dans divers produits moins abondants. En fonction de cette contrainte, les organismes ne peuvent utiliser le sulfate qu'aprs rduction raison de 8 lectrons par mole. Ces rductions sont pratiques deux fins. La premire est une assimilation, qui prpare le soufre sous une forme directement utilisable par le mtabolisme cellulaire. La seconde est une dissimilation, o l'ion sulfate ou des entits intermdiaires font office d'accepteurs d'lectrons dans une respiration anarobie. Parmi les organismes les plus importants dans ce contexte sont les sulfato-rducteurs. Les bactries sulfo-rductrices sont celles qui utilisent le soufre lmentaire (S0) comme accepteur l'exclusion du sulfate. Les Desulfuromonas utilisent obligatoirement le soufre en oxydant le succinate et l'actate en CO2. D'autres n'ont pas une exigence absolue en soufre et peuvent le remplacer par du fumarate ou du malate. Tous ces germes cohabitent avec les sulfato-rducteurs proprement dits. Leurs comptiteurs sont les mthanognes, qui sont de mauvais utilisateurs de sulfate, mais rduisent facilement le soufre et d'autres composs soufrs, dont les polysulfures par une polysulfure rductase* membranaire molybdne. La dissimilation du sulfate ne remplit son rle que si des quantits importantes de composs soufrs sont transformes, bien au-del de ce qui devrait tre assimil dans les matriaux cellulaires. Elle est fondamentalement anarobie, et son bilan nergtique est trs infrieur celui des oxydations avec O2. La rduction du sulfate dans les milieux marins ou ctiers a une importance majeure dans le cycle naturel du soufre et actionne un recyclage non ngligeable de la matire organique. Dans les milieux continentaux et en eau douce, le sulfate tant plus rare, les organismes sulfato-rducteurs sont en comptition avec d'autres espces anarobies, notamment avec les actognes et les mthanognes. L'accumulation d'hydrosulfure et de sulfure peut cependant atteindre des taux considrables, notamment dans les cavits naturelles en relation avec des sources thermales. Un exemple connu est la Cueva de Villa Luz (Mexique), rendue dangereuse par le gaz H2S. Une autre grotte du mme type se trouve prs de Mangalia (Roumanie). Dans les espaces plus conventionnels o les sulfures sont produits en abondance par l'activit microbienne, le gaz H2S est facilement libr dans l'atmosphre et signale par son odeur les dcompositions de matire organique. Il semble que la rduction biologique du sulfate remonte aux priodes les plus lointaines pour lesquelles on a des traces laisses par des tres vivants. On a trouv au Nord-Ouest de l'Australie des indices de sulfure et de carbone organique dans des veines de barytine (formes l'origine partir de gypse) [11]. Ces dpts seraient vieux de 3,47 milliards d'annes 3. Ils ont pu se mlanger avec des sulfures d'origine volcanique, mais l'intervention d'organismes vivants dj complexes est atteste par un dficit en soufre-34. Les formes bactriennes modernes effectuent un fractionnement isotopique comparable. On connat de nombreuses espces bactriennes dissimilatrices de sulfate. Parmi les archaebactries, les 3 - Par examen gochronologique uranium-plomb.
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sulfato-rducteurs sont des hyperthermophiles vivant plus de 80C (Archaeoglobus). Il existe aussi des sulfato-rducteurs hyperthermophiles qui n'appartiennent pas aux archaebactries. Ce sont des Thermodesulfobacterium, dtachs des autres lignes bactriennes une priode trs ancienne de l'arbre volutif. Ces organismes font partie des nombreux thermophiles prsents auprs des sources chaudes du fond des ocans et dans les rgions volcaniques. L'exploration de cette diversit biologique a bnfici de la construction des plates-formes ptrolires. La plupart des autres rducteurs de sulfate vivent au-dessous de 70 et sont des -protobactries, des Gram-positifs et des formes du groupe Nitrospira 4. Certaines formes sont autotrophes et assimilent CO2 grce l'nergie produite par l'oxydation de l'hydrogne avec le sulfate, selon le bilan : SO42 + 4 H2 + 2 H+ H2S + 4 H2O Ces chimio-autotrophes s'accommodent volontiers de conditions trs frustes. Leur mtabolisme assimile ventuellement le monoxyde de carbone, le formiate ou l'thanol, une proprit qui existe aussi chez les actognes. L'archtype classique des sulfato-rducteurs vivant en eau douce est Desulfovibrio desulfuricans. Ce germe peut utiliser toute une srie d'accepteurs respiratoires, sulfate, sulfite, thiosulfate, nitrate, nitrite. Il peut crotre sur sulfate et lactate, lequel est oxyd en actate. L'oxydation fournit de l'nergie ncessaire la vie en autotrophie. Quand le substrat oxyd est H2, la source de carbone est le gaz carbonique du milieu (formes hydrognotrophes). Une autotrophie spciale s'observe sur formiate, dont l'oxydation produit la fois le CO2 utilis comme source de carbone et l'nergie ncessaire son assimilation. Les chimio-htrotrophes offrent galement une grande varit d'adaptations physiologiques. Certains autotrophes (Desulfovibrio baarsii, certains Desulfonema, Desulfosarcina) peuvent vivre en htrotrophie par l'assimilation de sources carbones diverses o figurent des acides gras chane plus ou moins longue. D'autres formes sont strictement htrotrophes. L'utilisation des sources carbones permet de distinguer schmatiquement deux groupes I et II. Les sulfato-rducteurs du groupe I oxydent incompltement jusqu' l'actate des sources organiques comme le lactate ou l'thanol. L'actate n'est pas utilis. Des exemples sont Desulfovibrio desulfuricans , D. vulgaris, D. salexigens, Desulfomonas et une espce formant des endospores, Desulfotomaculum nigrificans. Ces germes constituent la majorit des sulfato-rducteurs totaux prsents dans certains sdiments [12]. Les sulfato-rducteurs du groupe II font des oxydations compltes conduisant au CO2, lequel est assimil ou non. Desulfovibrio baarsii, Desulfobacterium autotrophicum (une espce marine), Desulfonema, Desulfobacter sont des exemples reprsentatifs. Ces bactries oxydent l'actate par le sulfate et sont dites actoclastiques.
4 - Un rameau trs ancien dtach lors de la sparation des Gram-positifs et ngatifs. Des Nitrospira oxydent les nitrites.
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Nous retrouvons donc l'actate comme maillon fondamental des transformations de l'environnement. Il est libr en amont par les actognes partir de produits de fermentation. Certains sulfato-rducteurs le rcuprent, mais sont en comptition avec les mthanognes qui le transforment en mthane. D'autres sulfatorducteurs au contraire produisent de l'actate par leurs oxydations incompltes (groupe I). La comptition se mue alors en collaboration avec les mthanognes, qui prennent facilement le dessus dans les fonds aquatiques et sdiments continentaux, lorsque le sulfate est peu abondant. Les sulfato-rducteurs ont cependant l'avantage sur les mthanognes de tolrer de petites quantits d'O2 et sont micro-arophiles. La plupart de ces espces ont un grand pouvoir d'adaptation et peuvent tirer leur ATP de deux faons, soit par potentiel membranaire gnr directement par la respiration sur sulfate, soit par couplage direct au niveau du substrat par oxydation d'thanol, de lactate et divers substrats. En somme ils peuvent combiner fermentation et respiration anarobie. En cas de rarfaction du sulfate ou de tout accepteur, les lectrons provenant des oxydations sont vacus sous forme de H2. Aussi les sulfato-rducteurs contiennent-ils invariablement une ou plusieurs hydrognases servant de soupapes de scurit pour quilibrer le mtabolisme. Parmi les sulfato-rducteurs se trouvent de nombreuses espces flagelles. D'autres se dplacent par glissement (Desulfonema). Le genre Desulfotomaculum est caractris par la facult de faire des endospores. Tous les organismes que nous venons de citer n'ont pas l'exclusivit de l'emploi du sulfate comme accepteur. Cette proprit se retrouve l'tat dispers dans divers groupes taxonomiques. Elle existe chez les Spirillum, Wollinella succinogenes et Campylobacter [13]. Enfin il est courant de voir certaines espces dlaisser le sulfate comme accepteur d'lectrons, et se tourner vers d'autres composs soufrs : sulfite, thiosulfate, ttrathionate et mme le soufre. L'utilisation de thiosulfate par des bactries incapables de rduire le sulfate s'observe chez certains Clostridium connus pour prendre part la formation d'hydrogne sulfur dans les rizires. Les bactries rductrices du sulfate en milieu marin supportent souvent des concentrations en NaCl pouvant atteindre 2-3% et sont considres alors comme halotolrantes. Certaines espces ont absolument besoin de sel, soit 0,6 5% de NaCl pour Desulfovibrio salexigens, 2% pour Desulfuromonas acetoxidans. La source de sulfate tant inpuisable dans l'eau de mer, tous ces germes sont donc bien adapts pour y prolifrer, et acceptent facilement de se dvelopper dans les milieux lagunaires sals ou dans la vase des estuaires o les apports organiques sont gnreux. Comme le taux de sulfate dans les eaux douces est gnralement bien plus faible qu'en milieu marin, les bactries ont alors besoin d'un transport actif pour s'imbiber de sulfate. Les formes d'eau douce comme Desulfovibrio desulfuricans ou Desulfobulbus propionicus concentrent le sulfate partir de leur milieu sous l'action du potentiel de membrane (p). Comme la face interne de la membrane est charge ngativement par rapport l'extrieur, elle exerce une rpulsion sur l'entre des ions sulfate. Cet inconvnient est contrebalanc par le passage simultan et dans le mme sens d'au moins deux cations, vraisemblablement trois, de faon tirer le sulfate vers l'intrieur. Les protons font office de cations. Ce systme symporteur est donc actionn par la diffrence de charge des deux cts de la membrane. Les ions sulfate et les protons en excdent sont attirs
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globalement vers l'intrieur. Chose curieuse, les bactries sulfato-rductrices marines ont galement un transport actif de sulfate, alors qu'elles ne devraient pas en avoir besoin. Un symporteur y commande aussi l'entre du sulfate, mais utilise des ions sodium la place des protons [14]. Une diffrence importante qui peut s'expliquer ainsi : les bactries marines doivent rsister la teneur leve en ion Na+ de l'eau de mer (0,5 M environ), ce qui les oblige pomper continuellement du sodium de l'intrieur vers l'extrieur. L'change Na+/H+, trs banal dans les cellules bactriennes, permet d'expulser le sodium en utilisant la force protonmotrice p qui tend pousser les protons vers l'intrieur. Les protons entrent en change avec les ions sodium qui sortent. En utilisant des ions sodium la place des protons pour l'entre des ions sulfate, les bactries viteraient l'inconvnient d'une acidification excessive de leur pH intracellulaire [15]. Les bactries sulfato-rductrices des eaux douces ont t particulirement tudies dans les rizires o elles peuvent avoir des incidences conomiques [16]. En terrain inond s'tablissent rapidement des conditions anarobies, partiellement rompues au niveau de la rhizosphre des plantes par suite des petites quantits d'oxygne mises par les racines. Pourtant les sulfato-rducteurs forment des populations nombreuses et varies au contact des racines et profitent, soit de leur tolrance O2, soit de conditions anarobies pisodiques. L aussi entrent en comptition (ou collaborent ventuellement) des sulfato-rducteurs et des mthanognes. Dans ces deux catgories existent paralllement des hydrognotrophes qui s'emparent de H2, et des formes dites actoclastiques qui vivent principalement aux dpens de l'acide actique. Dans un milieu aussi complexe que le sol, diffrents accepteurs sont d'emble disponibles pour une respiration anarobie (nitrate, sulfate, CO2). Il s'tablit ncessairement une hirarchie entre espces en fonction de l'importance des ressources nergtiques, mais les rapports sont variables dans le temps. Ainsi le nitrate, par son potentiel d'oxydorduction relativement lev, est en principe consomm en priorit. Les mthanognes, plus lents et en grande partie tributaires de l'actate, de l'hydrogne et de CO2, n'entrent en scne que plus tardivement. De nombreuses tentatives ont t faites pour reproduire au laboratoire les conditions naturelles. Les graphiques de la page suivante sont tirs de travaux du groupe allemand de CONRAD [17]. Les mesures ont port sur un chantillon de sol. Les premiers constituants disparatre sont les nitrates et les nitrites (en moins de 48 h), puis le sulfate. La vague d'actate est le rsultat du travail des actognes et des sulfato-rducteurs, mais leur activit se double de celle des organismes fermenteurs qui en produisent aussi, en y ajoutant du propionate, de l'hydrogne et du gaz carbonique. Les auteurs cits ont montr aussi que Fe(III), qui est aussi un accepteur respiratoire, disparat au profit Fe(II) peu prs la mme vitesse que le sulfate. Mais le principal rsultat de cette tude a t de montrer que l'un des effets des organismes rducteurs du nitrate, du fer et du sulfate est de retarder les fermentations et de contrecarrer la mthanognse. Ils dtournent l'actate vers la production de CO2, consomment les premiers le glucose prsent dans le sol 5, mais librent ventuellement des produits toxiques comme du nitrite, NO ou N2O.
5 - Abondant dans le sol de rizire partir de la cellulose des dbris vgtaux.

concentration (mM) CH4, CO2 (mol/g)
2,5 30
331
hydrogne (Pa)
sulfate nitrate
2
actate
1,5
CO2
20
20
H2 CH4
10
propionate
0,5
10
10
20
30
40
10
20
30
40
temps (jours)
temps (jours)
Evolution d'un sol anarobie au cours du temps

Voici une association assez curieuse qui s'effectue en anarobiose entre archaebactries et des bactries du genre Beggiatoa. Celles-ci se comportent en mthanotrophes en l'absence d'oxygne, ce qui peut paratre totalement paradoxal, d'autant plus que ce type de bactrie se rencontre plutt dans les milieux arobies o s'effectue l'oxydation du sulfure. La situation indite a t dcouverte au large de l'Oregon une profondeur de 600-800 m au-dessus d'une faille d'origine tectonique d'o se produit un dgagement continuel de mthane [18]. Le sdiment ocanique est tapiss de Beggiatoa formant des agrgats avec des organismes identifis comme mthanognes par des techniques utilisant des sondes nucliques fluorescentes. L o s'entassent ces agrgats se produit une intense rduction de sulfate en sulfure, comme si les Beggiatoa fonctionnaient en sens inverse de leur activit normale. Ni agrgats ni rduction du sulfate n'taient visibles dans les rgions dpourvues de mthane. Force fut de constater que les bactries oxydaient le mthane selon la raction globale : CH4 + SO42 HCO3 + HS + H2O L'nergie libre de cette raction ramene aux conditions du fond de la mer, et en tenant compte de la concentration du mthane, est estime G = 30 kJ par mole de mthane. Le bilan nergtique est donc positif. Le bicarbonate produit partir du mthane prcipite sous forme d'pais dpts de calcaire. L'emploi du mthane comme source carbone est prouve par le dficit du calcaire en 13C sur le 12 C, un effet connu comme la signature d'une mthanognse. On retrouvait ce caractre dans un certain nombre d'hydrocarbures des sdiments et dans les acides gras bactriens. Les granules taient de taille trs variable et les Beggiatoa prsumes entouraient troitement les bactries du mthane dans un rapport peu diffrent de 1/1. L'emploi du mthane comme substrat de croissance et d'nergie en l'absence d'oxygne va l'encontre des schmas classiques. La physiologie de
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cette association reste dterminer avec prcision, mais l'hypothse la plus plausible fait appel : une oxydation du mthane par le sulfate, une raction inverse de la mthanognse formant de l'actate avec libration simultane de H2. Le principe est expliqu par le schma.
profondeur dans le sdiment (cm)
0
maximum des granules mthanogne CH4 + 2 H2O CO2 + CH4 5 m sulfato-rducteur H+ + 4 H2 + SO42
SO42
15
HS
CO2 + 4 H2 CH3COO + H+ HS + 4 H2O
CH4 concentrations
granule
Le diagramme montre la dcroissance du taux de sulfate, l'augmentation conjointe du sulfure et du mthane quand on s'enfonce dans le sdiment. Le taux de sulfure plus de 15 cm de la surface peut atteindre des valeurs leves proches de 20 mM (l'eau de mer est environ 28 mM en sulfate). Le mthane y atteint 6 mM. Les granules se dveloppent surtout dans la zone o se croisent les deux courbes. Il n'y a pour ainsi dire pas de granules en l'absence de sulfate. droite est reprsente l'interprtation. Le mthanogne fait de l'hydrogne par mthanognse inverse (la ligne du haut), opration possible si l'hydrogne est consomm au fur et mesure par les bactries qui l'oxydent par le sulfate. Mme principe pour l'apparition de l'actate, mais encore non dmontre. Ce type d'association en sdiment marin profond s'annonce dj comme rpandu de nombreux endroits du globe, partout o des manations sous-marines de mthane sont abondantes [19]. Les sulfato-rducteurs participent donc activement un tourbillon de transformations o intervient une microflore varie. Le sulfate continental est produit rgulirement par l'oxydation des sulfures, eux-mmes librs par les dcompositions de matires animales ou vgtales. Le sulfate n'est donc presque jamais absent, les bactries sulfato-rductrices non plus. Elles actionnent un maillon essentiel du cycle du soufre. La varit remarquable des espces et des adaptations physiologiques leur permettent de coloniser de nombreux milieux, ce qui est parfois dommage pour nos industries par les corrosions qu'elles provoquent, leur habitude de favoriser la formation de biofilms et de dpts acides dans les canalisations. Elles ne sont pas trangres aux manations malodorantes produites partir des matires organiques dans les vases et sdiments des rivires et des tangs.
7.3 - BIOCHIMIE DE LA RDUCTION DU SULFATE

Les composs soufrs minraux d'intrt biologique occupent plusieurs niveaux d'oxydorduction rsums dans un tableau. Des formes intermdiaires sont le thiosulfate et les polythionates, parmi lesquels seul le ttrathionate a t reprsent. Le sulfite est au mme niveau que le bisulfite ou sulfite acide HSO32. Le mtabi-
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sulfite utilis en nologie est le terme usuel dsignant la poudre blanche obtenue par vaporation de la solution de NaHSO3, et correspond Na2S2O5.
sulfate 2 e sulfite SO32 2 4 e 2 e 2 e S0 SSO32 thiosulfate soufre 2 e sulfure S2 e O3SS2SO3 ttrathionate
2
SO42
Niveaux d'oxydation du soufre

L'ion thiosulfate comporte deux atomes de soufre trs diffrents. L'un forme un groupe sulfone, o le soufre est li plusieurs atomes d'oxygne qui sont quivalents par dlocalisation lectronique (les charges tant rparties entre eux par hybridation). Le second, qui fait figure de satellite, est un sulfane. Le niveau d'oxydation du premier correspond au sulfite, alors que celui du deuxime est au niveau du soufre lmentaire S0. Le degr global d'oxydation du soufre dans le thiosulfate est donc intermdiaire. On peut voir aussi que le ttrathionate correspond deux thiosulfates lis par leur sulfane, et cette liaison supplmentaire correspond une oxydation deux lectrons.
(sulfane) O S O O O
:
O O
S S O
O O
O S O
S O
S O
O S O
Sulfate
Sulfite
Thiosulfate
Ttrathionate
Le ttrathionate fait partie des polythionates au nombre variable d'atomes de soufre sulfane, le plus simple tant le trithionate, o il n'y en a qu'un seul. Chaque oxydorduction du tableau correspond un potentiel standard qui servira de point de repre [20]. Le cycle du soufre dans la nature fait alterner des phases d'oxydation et de rduction. Il est considr ici en ne retenant que les tapes les plus importantes. RSH dsigne le soufre organique, les flches noires paissies soulignent la dissimilation du sulfate et du soufre dont il sera plus particulirement question ici. La transformation directe de l'ion sulfate en sulfure ncessite un apport de 8 lectrons et comporte au moins 3 tapes, la rduction en hydrosulfite, le passage au soufre lmentaire, puis au sulfure. La plus difficile est la premire, parce que le potentiel d'oxydorduction du couple SO42/HSO32 est particulirement bas
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( 516 mV). Le "bisulfite" est d'ailleurs un rducteur usuel. La transformation du sulfate devrait donc ncessiter l'emploi d'un rducteur trs puissant inhabituel en biologie.
oxydation chimique et biologique des composs soufrs S0 O2 RSH O2
as
AROBIOSE ANAROBIOSE sulfate thiosulfate polythionates
si
n tio ila
a ti o rad d g
n
dis
si m
il a t
La stratgie naturelle consiste ramener ce potentiel une valeur plus raisonnable, de l'ordre de 60 mV, moyennant un apport nergtique reprsent par l'ATP. Le sulfate est activ en APS (adnosine-phosphosulfate), ou en PAPS (phospho-adnosine-phosphosulfate), et la rduction porte leur niveau. L'APS fait partie de la dissimilation du sulfate, tandis que le PAPS intervient de prfrence dans son assimilation.
ATP SO4 H2 2 e 2 H+ ADP APS ATP ADP PAPS NADPH, H+
s as
im
ion
S0 oxydation par les phototrophes
n tio ila
RSH dgradation H 2S
O O P O O
O P O O
O
O O P O O O P O O O P O
adnine
O HO
O OH
adnine
ATP AMP SO3 SO3 6 e APS PAP NADP+
S O O
O HO
O OH
adnine
3 H2
6 e 6 H+
S O
O O O P
O OH O
PAPS H2S dissimilation H2S assimilation
335
La rduction de l'APS est couple l'oxydation de H2 par une hydrognase. La premire raction engendre l'APS par l'ATP sulfurylase (EC 2.7.7.4). Le vritable accepteur respiratoire des bactries sulfato-rductrices est donc l'APS. La deuxime raction impliquant l'ATP, catalyse par l'APS kinase, est le dpart de la voie assimilatrice qui conduira l'entre du soufre dans le mtabolisme au niveau de la cystine. Ce mcanisme n'est pas gnral dans la nature, car les plantes et les algues s'approvisionnent en soufre partir du sulfate sans faire le crochet par le PAPS, mais rduisent directement l'APS l'aide du glutathion comme source d'lectrons [21], une particularit du monde vgtal que nous laisserons de ct. Le passage du sulfite au soufre lmentaire ncessite 6 lectrons par mole. La sulfite rductase catalyse d'un seul coup cette oxydorduction. Il en existe deux formes, selon qu'il s'agit d'une assimilation ou d'une dissimilation vocation nergtique. Dans la rduction dissimilatrice du sulfite observe dans la respiration sur sulfate, le saut de potentiel est remplac par un potentiel lectrochimique membranaire ( p). La rductase associe la membrane a t caractrise chez une archaebactrie (Archaeoglobus fulgidus) [22] et plusieurs protobactries [23]. On lui a donn plusieurs noms sur des bases spectroscopiques : dsulfoviridine (Desulfovibrio vulgaris), dsulforubidine (Desulfovibrio desulfuricans), dsulfofuscidine (Thermodesulfovibrio yellowstonii). Dans leur structure du type 22 ou 222, les sous-units sont flaviniques, tandis que les sont munies de noyaux fer-soufre et de sirohmes*. Squences et structure dtaille [24] montrent que toutes ces protines correspondent une super-famille structurale englobant aussi les rductases assimilatrices des bactries et des plantes, ainsi que d'autres enzymes catalysant la raction inverse dans Thiobacillus, Clostridium pasteurianum et des phototrophes comme Chromatium vinosum. Dans le fonctionnement de la sulfite rductase, la partie flavinique amne les lectrons sur le tandem [4Fe-4S]-sirohme. Le soufre du substrat SO32 se lie axialement au sirohme sur le fer(II), et reste cette position au cours des rductions successives. Des coupures rductrices 2 lectrons rompent successivement les 3 liaisons SO, puis en dernier lieu librent le sulfure. Les atomes d'oxygne sont limins sous forme d'hydroxyle [25]. Les sulfato-rducteurs montrent une varit intressante d'enzymes d'oxydorduction associes d'autres constituants cellulaires par l'intermdiaire d'une palette de transporteurs non hminiques (ferrdoxines, rubrdoxines, rubrrythrines) ou hminiques (cytochromes). La nature et le nombre de ces composants sont variables d'une espce l'autre. Les rductases assimilatrices sont les mieux connues car elles sont solubles et un peu plus simples [26]. Le motif essentiel l'activit de transfert des six lectrons est l'association [4Fe-4S]-sirohme. Une sulfite rductase monomrique plus petite de Desulfovibrio vulgaris fonctionne aussi comme nitrite rductase et ressemble des enzymes trouves chez des archaebactries. Cette plthore de protines polyvalentes permet sans doute une
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adaptation aux multiples cas de figure rencontrs par ces organismes. Les rductases se seraient diversifies partir d'un modle commun plus ancien que la sparation des archaebactries et des autres procaryotes [27]. Les sulfato-rducteurs tirent leur nergie de l'oxydation de diffrents substrats par le sulfate et le sulfite. Un des substrats les plus courants est l'hydrogne. Son emploi comme donneur d'lectrons fait appel une hydrognase couple avec un systme accepteur par cytochromes interposs. La sulfite rductase est l'un de ces accepteurs. Le lien s'effectue par cytochromes c3. Les bactries du genre Desulfovibrio ont plusieurs hydrognases, et plusieurs cytochromes c. Il est probable que la multiplicit de tous ces intermdiaires correspond tout un ventail d'adaptations particulires. Voici un schma de principe, o on peut voir que l'hydrogne est utilis du ct priplasmique, alors que la sulfite rductase est dans le compartiment oppos. Les transporteurs respiratoires de la membrane sont dsigns par TR.
priplasme 2 H+ hydrognases H2 e e
c3
membrane
cytoplasme
+ + +
c3 TR

HSO3 + 6 H+ e e e ferrdoxine e e HS + 3 H2O e
Hydrognases et potentiel membranaire

L'examen du dispositif permet de voir deux actions susceptibles de favoriser l'apparition d'un potentiel membranaire. Les hydrognases situes dans l'espace priplasmique scindent l'hydrogne en librant des protons. Inversement la sulfite rductase svissant du ct cytoplasmique en consomme. Il y a donc un excdent de charges positives d'un ct et de charges ngatives de l'autre. Ce dsquilibre permet en soi une rcupration d'nergie partir de l'oxydation de l'hydrogne par le sulfite, et cet effet s'ajoute la translocation de protons au niveau des transporteurs d'lectrons comme le cytochrome bc1 dans la membrane (TR). Les outils des bactries du sulfate sont donc la fois performants et varis. Des hydrognases et des cytochromes c font partie des outils utiliss par les bactries du genre Desulfovibrio et autres sulfato-rducteurs. Les hydrognases ont toutes des noyaux [4Fe-4S] et nous en connaissons les caractristiques essentielles. Rappelons les trois grandes classes en fonction du contenu mtallique : les hydrognases fer seul ([Fe]), les hydrognases fer et nickel ([NiFe]), et celles qui ont la fois du fer, du nickel et du slnium ([NiFeSe]). Chez les sulfatorducteurs, ces enzymes sont le plus souvent priplasmiques ou associes la membrane, mais il en existe aussi dans la fraction cytoplasmique [28]. Les hydrognases [Fe] fonctionnent aussi bien dans la production d'hydrogne que dans sa consommation, mais n'existent pas chez tous les sulfato-rducteurs. Les hydrognases [NiFe] sont prsentes chez toutes les espces de Desulfovibrio tandis que
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les [NiFeSe] sont un peu moins communes, le nickel tant li au slnium de la slnocystine. Nous avons vu que leur construction met en jeu une cohorte de gnes et d'enzymes augmente, lorsqu'il y a du slnium, par les facteurs ncessaires formation de la slnocystine. Les cytochromes c3 sont assez caractristiques des sulfato-rducteurs, en particulier du genre Desulfovibrio. Ils sont priplasmiques ou souds la face interne de la membrane cytoplasmique et rcuprent les lectrons de l'hydrogne capts par l'hydrognase priplasmique. Le fer des diffrents hmes est hexa-coordonn. Les cytochromes c3 priplasmiques 4 hmes C (environ 13 kDa) sont invariablement prsents dans le genre Desulfovibrio et ont un bas potentiel. Malgr de faibles homologies de squence, ils sont tous btis sur le mme plan d'organisation structurale, avec des rsidus d'histidine de part et d'autre du plan des porphyrines. Les cytochromes c3 sont nombreux et varis chez les sulfato-rducteurs, qui en contiennent le plus souvent plusieurs, et appartiennent tous la classe III des cytochromes c*. Des cytochromes masse molculaire plus leve coexistent avec les prcdents dans la majorit des sulfato-rducteurs. Ils correspondent grosso modo la rptition de la structure des c3, soit un dimre de 26 kDa avec 8 hmes et un constituant 16 hmes ou Hmc (high molecular weight). La rpartition des cytochromes varie selon les souches. Par exemple Desulfovibrio desulfuricans possde la fois un cytochrome c3 4 hmes, un c3 8 hmes et un cc3 16 hmes. Une autre souche a un cytochrome c553 un seul hme appartenant la classe I (les ligands du fer sont His et Met), un cc3 8 hmes et un Hmp 16 hmes [29]. Les rgles structurales communes sont les liens entre hme et protine par deux atomes de S (liaisons thio-ther avec la cystine), et chez tous les cytochromes c3 de la classe III le fer des porphyrines est reli de l'histidine comme dj prcis.
Cytochrome c3 de Desulfovibrio vulgaris (vues stroscopiques)

On dispose de la structure dtaille de plusieurs de ces cytochromes [30]. Les hmes sont caractriss par leurs bas potentiels, qui s'chelonnent dans les c3 de 220 370 mV. Comme on peut le voir sur les croquis stros, les 4 hmes sont assez proches les uns des autres mais ne sont pas coplanaires. Un c3 peut thoriquement stocker 4 lectrons quand il est pleinement rduit et sa structure est remarquablement conserve. Le cc3 dtenteur de 8 hmes (36 kDa) est cons-
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titu de deux sous-units identiques trs similaires au c3 13 kDa, lies chez D. gigas par deux ponts disulfures [31]. Les liaisons covalentes entre hmes et polypeptide se font toujours par cystine interpose dans les squences consensus C-x-x-C-H ou C-x-x-x-x-C-H. Une question restant sans rponse est la fonction physiologique de cette multiplicit de cytochromes. Ils servent de courroie de transmission partir des hydrognases, mais ne se retrouvent pas ncessairement chez les sulfato rducteurs autres que Desulfovibrio . On a mme dout de l'intervention dans la rduction du sulfate du c3 4 hmes, le plus petit de la famille. Pourtant il interagit in vitro avec une varit de donneurs et d'accepteurs d'lectrons. Une application extraordinaire a mme t trouve. Le cytochrome c3 de Desulfovibrio vulgaris est capable de rduire l'uranium(VI) in vitro et permet aux bactries de rduire ce mtal en mme temps que le sulfate [32], une perspective intressante pour les dcontaminations. Lorsque le cytochrome c3 est mobile dans le priplasme, on suppose qu'il transmet les lectrons des cytochromes c de plus grande masse molculaire et finalement la sulfite rductase par l'intermdiaire des petites protines transporteurs d'lectrons (ferrdoxines, rubrdoxines et flavodoxines). En amont il y aurait l'hydrognase et des enzymes qui oxydent le lactate et le pyruvate. Desulfovibrio desulfuricans crot avec le sulfate sans source d'hydrogne externe sur l'un ou l'autre de ces substrats. Pourtant cette espce dispose d'hydrognases la fois l'intrieur et l'extrieur du cytoplasme. Comment interviennent-elles ? Voici comment peut s'interprter la situation l'aide du cycle de l'hydrogne [33]. Le schma montre le couplage de deux processus : la rduction de l'ion sulfate en hydrosulfite, l'oxydation du lactate en actate et CO2 avec le pyruvate comme intermdiaire. SO42 + 8 e + 9 H+ 2 lactate + 2 H2O SO42 + 2 lactate + H+
priplasme SO42 cc3 8H
+
HS + 4 H2O 2 actate + 2 CO2 + 8 e + 8 H+ HS + 2 actate + 2 CO2 + 2 H2
membrane
cytoplasme SO42 8 e HS 9 H+ 2 CoA + 4 H2O 2 ADP + 2 Pi 4 H2 H.ase 4 e + 4 H+ 4 e + 4 H+ 2 pyruvate 2 H2O 2 actyl-CoA + 2 CO2 2 CoA 2 actate 2 ATP
c3
4 H2
H.ase
+ + + +
2 lactate
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Le mtabolisme nergtique des bactries est cens fonctionner par oxydation du lactate avec le sulfate. Nous constatons d'aprs ce modle que l'hydrogne est produit dans le cytoplasme par une premire hydrognase (H.ase), export dans le priplasme o il est oxyd nouveau par une deuxime hydrognase, les lectrons tant rcuprs par une chane cytochromes c3. Ces oxydorductions s'accompagnent d'un trafic de protons. Il est vident que le cycle comporte un prlvement de protons l'intrieur de la cellule, alors qu'il s'en produit l'extrieur, et conduit tablir une p gnratrice d'ATP par l'ATP synthase. Mais un ATP supplmentaire est form partir de l'actyl-CoA comme le ferait une fermentation. La cellule fait donc son ATP par deux voies diffrentes. Elle est arme pour subvenir ses besoins carbons, soit en dtournant un peu de pyruvate ou d'actate pour ses synthses, soit en consommant d'autres molcules carbones, et c'est bien ce qu'on espre les voir faire quand on leur demande d'attaquer des substances xnobiotiques prsentes dans le milieu. Les hydrognases et cytochromes c3 de D. desulfuricans donnent lieu des observations curieuses. En supprimant par mutation la production de telle ou telle hydrognase, la croissance des bactries s'en ressent mais n'est pas abolie. Mme observation aprs abolition du cytochrome c3 4 hmes [34]. Dans ce dernier cas, les bactries continuent crotre presque normalement sur sulfate et lactate. Leur dveloppement est cependant contrari lorsqu'on remplace le lactate par le pyruvate, ce qui est surprenant puisque celui-ci est un produit d'oxydation du premier. De l'hydrogne est produit mais n'est pas recycl. Le c3 serait davantage ncessaire la croissance sur pyruvate que sur lactate, et le modle du schma est sans doute trop simple pour expliquer les faits. On a l'impression que les hydrognases et cytochromes forment plusieurs circuits capables de fonctionner simultanment ou en remplacement les uns des autres, et ceci ne fait qu'augmenter l'intrt port ces tranges bactries. Le soufre lmentaire (S0) n'apparat pas au cours de la rduction du sulfate. Il est cependant dvers localement dans l'environnement par l'activit volcanique. Il donne lieu une respiration sur soufre. Deux sortes d'organismes l'utilisent, selon que le soufre est l'accepteur oblig ou non. Les Desulforomonas font partie du premier cas et se servent obligatoirement du soufre. Ce sont les bactries sulfo-rductrices. Exemples : Desulfuromonas acetoxidans, D. succinoxidans, qui oxydent l'actate ou le succinate jusqu'au CO2. L'exigence en soufre comme accepteur n'est pourtant pas absolue, car il est parfois remplaable par du fumarate ou du malate, au moins chez une espce marine [35]. La deuxime catgorie de germes englobe les rducteurs facultatifs du soufre. Celui-ci n'est utilis qu'en absence de sulfate, de sulfite ou de nitrate. La rduction du soufre lmentaire est commune parmi les archaebactries, en particulier chez les mthanognes. Ils sont gnralement de mauvais utilisateurs de sulfate, mais ils mtabolisent souvent le soufre, quelquefois le thiosulfate ou le sulfite. Les mthanognes en culture arrivent faire une dissimilation active de S0 en prsence d'hydrogne, jusqu' rejeter des quantits considrables de sulfure pouvant dpasser 5 mM. Methanosarcina barkeri prsente une sulfite rductase assimilatrice faible masse molculaire ou P590, renfermant un sirohme et un centre fer-soufre, assez analogue la sulfite rductase de Desulfuromonas acetoxidans [36]. Une autre enzyme clbre est la rhodanse* qui
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existe chez les mthanognes comme Methanobacterium thermoautotrophicum [37]. La rhodanse est une transfrase qui scinde le thiosulfate pour cder du soufre un accepteur dsign par A, dans S2O32 + A SO32 + AS. La respiration sur soufre est galement commune, voire obligatoire, parmi les archaebactries thermophiles et thermophiles extrmes, isoles de sources volcaniques riches en soufre collodal et en composs rduits du soufre. Ainsi les Sulfolobus sont des archaebactries strictement anarobies et tout fait remarquables. Elles se dveloppent entre 55 et 87C avec un optimum entre 70 et 80C, supportent un pH particulirement acide (de 1 5,9), l'optimum tant 2,5. Le soufre est indispensable leur croissance. Elles s'en servent en autotrophie comme accepteur respiratoire en prsence de H2 aussi bien qu'en htrotrophie. Desulfurolobus ambivalens est un autre organisme du mme type la fois thermophile et acidophile, isol dans les solfatares d'Islande et poussant entre 70 et 87. Il n'est pas htrotrophe et supporte O2 la diffrence de Sulfolobus, renfermant alors une oxygnase/rductase spciale [38] qui fabrique simultanment du sulfite, du thiosulfate et H2S partir du soufre. Tout comme les Desulfovibrio rencontrs antrieurement, Desulfuromonas acetoxidans possde au moins une hydrognase [NiFe] dans son priplasme [39] On y rencontre aussi divers cytochromes, dont le cytochrome c7, appel aussi cytochrome c551.1. Il ne fait que 9,1 kDa avec 68 acides amins et contient 3 hmes. Squence et structure rvlent qu'il ressemble un cytochrome c3 qui aurait perdu un segment d'une vingtaine d'acides amins et un de ses 4 hmes [40]. Le potentiel des hmes est de 102 mV pour l'un et 177 mV pour les autres. D'autres cytochromes renferment respectivement 1,4 et 8 hmes avec toute une gamme de potentiels, comme chez les bactries rductrices du sulfate. On rpertorie sans cesse de nouvelles espces vivant de la rduction du soufre prs des sources chaudes et des solfatares. Ces bactries sont frquemment des thermophiles et adoptent une biochimie particulire. Leur importance dans les biodgradations de la plante est sans doute moindre que celle des sulfato-rductrices les plus communes, car elles vivent dans des biotopes spcialiss et peu rpandus en proportion. Elles apportent cependant des renseignements prcieux en biochimie fondamentale. D'autre part les thermophiles sont recherchs pour des applications biotechnologiques et la prparation d'enzymes stables la chaleur.
7.4 - LE FER ET LE MANGANSE

COMME ACCEPTEURS ANAROBIES
Les oxydes de fer et de manganse font partie des accepteurs respiratoires de la biosphre. Le potentiel standard du couple Fe3+/Fe2+ est +770 mV, plus lev que celui du couple nitrate/nitrite. Celle du couple MnO2/Mn2+ est de l'ordre de + 380 mV pH neutre. Ce sont des valeurs trs thoriques nanmoins, car la plus grande partie du mtal est chaque fois sous forme doxydes insolubles dans des conditions trs loignes de ltat standard.
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Malgr cela les oxydes de Fe(III) et de Mn(IV) fonctionnent comme accepteurs respiratoires dans la nature. On croyait initialement que la rduction du fer et du manganse dans les sols et sdiments taient dorigine spontane. Il a fallu raliser que les micro-organismes avaient l une fonction essentielle dans des environnements varis et pouvaient mme participer la dpollution au mme titre que les dnitrifiants [41]. La liste des accepteurs s'est mme allonge avec le chromate, larsenic, le cobalt, le slniate et luranium, que nous laisserons de ct ici. La rduction du fer et du manganse libre des ions Fe2+ et Mn2 + sous forme de sels beaucoup plus solubles que les oxydes de dpart. Elle mobilise ces mtaux, qui sont alors facilement entrans dans les eaux circulantes, parviennent aux rivires o ils subissent une oxydation secondaire. Le phnomne observ est une dissimilation productrice dnergie, en superposition avec lassimilation proprement dite, qui consiste incorporer le mtal dans des molcules biologiques telles que les cytochromes pour le fer et le photosystme 2 de la photosynthse pour le manganse. Nous ne retiendrons que le volet dissimilation. La comptition vitale tant svre, les bactries ont intrt utiliser un accepteur dot dun potentiel favorable et suffisamment abondant. Le type de respiration est choisi en fonction de larsenal enzymatique disponible, lui-mme rgl au niveau de lexpression des gnes. Les bactries qui respirent en anarobiose ont gnralement la possibilit de sadapter plusieurs accepteurs, et sont donc le sige de mcanismes rgulateurs perfectionns dont lillustration nous a t donne par la dnitrification. Les germes vont donc se rpartir dans les sols en zones successives. Plus prs de la surface peut se drouler la dnitrification, qui nest pas trop sensible la prsence de faibles quantits doxygne. loppos se situent les mthanognes, dont la phobie pour loxygne est totale. Les bactries qui rduisent le fer ou le sulfate sont entre les deux. Cette zonation fait penser une grande ville, o on voit souvent les habitants se rpartir ingalement en fonction de critres bass sur les revenus, le prix des loyers et les habitudes culturelles, ce qui les amne vivre dans diffrents quartiers ayant chacun une individualit, non sans des interpntrations. C'est ce que lon observe dans les sols o il ny a pas de limites tranches entre les diffrentes zones, mais plutt des niveaux spars par des transitions progressives. Ces niveaux sont fluctuants en fonction des conditions locales, du taux dazote, de lafflux des matires organiques et de la texture des sdiments. Une autre cause de variabilit est labondance du sulfate qui est forte dans les sdiments marins, beaucoup plus faible voire marginale en milieu lacustre ou terrestre. Des interfrences avec l'humus du sol sont possibles et mme probables. Dans les conditions o le fer est biologiquement rduit, les quinones humiques peuvent galement fonctionner comme accepteurs et leur action vient se superposer celle de Fe(III) [42]. Les tudes reposent sur la dtermination des concentrations mtalliques en phase soluble. La mesure se fait couramment par spectroscopie dabsorption atomique. La gamme de dtection est de lordre de 10-100 g . L1, mais peut sabaisser 1 g avec des perfectionnements techniques ou par spectroscopie dmission de plasma. Le fer ferreux est dos colorimtriquement par complexation avec le ferrozine ou la 1,10-phnanthroline. Les dosages de fer ferreux ncessite videmment des prcautions pour viter sa roxydation, qui est trs rapide en prsence de dioxygne.
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Lisolement des premires souches bactriennes montrant clairement la dissimilation des oxydes mtalliques a t une grande perce sur le sujet. Il revient des auteurs russes davoir attir lattention les premiers sur une bactrie du type Pseudomonas, qui rduisait Fe3+ avec H2 en absence doxygne et de nitrate [43]. Aprs une srie dtudes, ces bactries ont t rebaptises Shewanella frigidimarina [44]. La rduction des oxydes du manganse a t dmontre par MYERS et NEALSON [45] dans un Geobacter metallireducens. Il a t vite ralis que des bactries rductrices du fer et du manganse existaient dans des environnements varis, et pouvaient abonder aussi bien dans les sdiments lacustres que dans les fonds marins comme ceux de la Mer Noire ou de la Baltique. Les bactries tudies montrent une grande souplesse dans lutilisation des accepteurs. Les espces du groupe Shewanella peuvent vivre en arobiose. En absence d'O2, elles peuvent se rabattre sur Fe(III), Mn(IV), oxyde duranium U(VI), nitrate, nitrite, thiosulfate, soufre lmentaire, trimthylamine, dimthyl sulfoxyde, et fumarate ! Un ventail presque ingal. Geobacter est strictement anarobie, mais peut aussi utiliser le Fe(III), le Mn(IV) et le nitrate. Il a t dmontr que Geobacter metallireducens pouvait effectuer une respiration sur nitrate dans un milieu pauvre en fer pourvu que celui-ci soit prsent [46]. La respiration sur fer n'est donc pas incompatible avec l'emploi d'autres accepteurs. La respiration anarobie sur oxyde mtallique est directement dmontrable. Les bactries cultives sur fumarate sont laves et resuspendues dans un tampon dilu sous atmosphre inerte (N2), puis mise en prsence de fumarate, de fer ou manganse. La petite acidification qui en rsulte chaque fois est enregistre par un pH-mtre sensible et indique lexpulsion de protons par les bactries, donc la formation dune p. Linhibition du phnomne par un agent dcouplant permet de confirmer cette conclusion. Les Shewanella oxydent des substrats carbons varis : lactate, pyruvate, acides amins, ainsi que divers composs aromatiques (phnol, tolune, frulate). Lactate est utilis en arobiose, le formiate en anarobiose seulement. Autre substrat oxyd : lhydrogne [47]. Geobacter peut utiliser en anarobiose lactate, qui est visiblement un grand carrefour chimique des cycles naturels. La liste des souches bactriennes capables de faire la dissimilation du fer ou du manganse ne cesse de sallonger. Des sulfato-rducteurs du type Desulfovibrio en font partie [48]. Les recherches restent encore peu avances dans ce domaine, mais on en attend beaucoup cause de la possibilit offerte de coupler la rduction des oxydes mtalliques avec la biodgradation de substances polluantes. On saperoit en somme que les bactries comptentes appartiennent aux groupes taxonomiques les plus varis, anarobies facultatives ou strictes selon les cas, et gnralement dotes dun grand pouvoir dadaptation. Des Vibrio, Clostridium et Bacillus peuvent faire ces rductions, mais savent mener en parallle des ractions de fermentation quelles vont privilgier ou non en fonction du gain nergtique. Les conditions ncessaires pour cela paraissent assez communment ralises, en particulier dans tous les milieux anoxiques o se sont dposs les oxydes de fer insolubles. Pour certaines espces, la rduction dun sel ferrique amliore la vitesse de croissance, mais reste une source nergtique dappoint, alors que dautres comme Shewanella peuvent oxyder un substrat organique en nutilisant que le fer comme accepteur. Lanalyse du problme sur le plan exprimental peut savrer
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complique, la suite des multiples interfrences entre constituants en prsence. Par exemple le dioxyde de manganse (MnO2) est rduit spontanment par les sulfures ou par les ions ferreux. Il y a donc un chass-crois dactions enzymatiques et non enzymatiques, comme le rsume ce schma simplifi :
ion du imilat iss
sulfate
SO42
2 Fe2+
MnIV
sulfure
sulfite
Fe rductase 2 Fe3+ Mn2+
Mn rductase S0
thiosulfate rductase S2O32
Fer et manganse
La figure suggre que les bactries sulfato-rductrices sont capables de rduire les oxydes de fer et de manganse de manire indirecte par les ions sulfure ou hydrosulfure produits : MnO2 + HS + 3H+ Mn2 + + S0 + 2H2O Cette opration peut les aider se dbarrasser de lexcdant du sulfure qui est toxique forte dose, mais cest la rduction des ions sulfate qui leur apporte lnergie. Au contraire une espce telle que Shewanella frigidimarina peut se dvelopper en utilisant exclusivement Fe2O3 ou MnO2 comme accepteurs, grce des rductases dont il sera question plus loin. La difficult est donc de doser avec prcision les divers intervenants mtalliques, dautant plus que les oxydes Fe2O3 et MnO2 sont insolubles, interagissent avec dautres lments mtalliques, forment des complexes hydrats plus ou moins htroclites avec leau. Leur potentiel doxydorduction varie avec le pH, qui tend augmenter par rduction du manganse : MnO2 + 2e + 4 H+ Mn2 + + 2H2O Imaginons un afflux de matires organiques ou de produits de fermentation comme lactate dans un milieu anoxique riche en oxydes mtalliques, mais pauvre en nitrate ou en sulfate. Les bactries vont effectuer quand mme des biodgradations importantes dans ce type de milieu, do lintrt quon porte de plus en plus cette biologie particulire. Les spculations vont bon train sur lhistoire de la vie primitive au cours de limmense priode, peut-tre 3 milliards dannes, qui a prcd le Cambrien. Les plus anciennes formes vivantes taient certainement des procaryotes, et leur mode de vie tait anarobie. L'atmosphre devait contenir outre la vapeur deau, HCl, CO, CO2, N2, ainsi que du mthane, de lammoniac et de lacide cyanhydrique. Un milieu qui aurait t peu hospitalier pour nous ! Le dioxyde de carbone tait produit par le volcanisme, ainsi quune partie du mthane. Il rgnait des conditions trs rductrices. On a donc des raisons de penser que le fer, trs abondant, tait
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essentiellement ltat ferreux et combin au soufre. Des hyperthermophiles comme Thermotoga maritima ont un mtabolisme trs fruste du fer et du soufre et sont peut-tre des reliques vivantes de formes trs primitives qui ont t isoles Vulcano dans des sdiments marins surchauffs 80C. Elles utilisent du glucose et autres sucres comme sources de carbone. Leur anciennet volutive est clairement indique par les tudes de squence d'ARN 16S et les prsence de gnes archaebactriens, montrant que le rameau Thermotoga s'est individualis trs tt, avant l'individualisation des eucaryotes. Cette espce peut se dvelopper anarobiquement sur Fe(III), un indice montrant quun tel mtabolisme a pu avoir lieu aux priodes les plus recules [49]. On voit difficilement comment lassimilation massive du carbone par les premiers tres vivants aurait pu se passer de la photosynthse, et il est tentant de supposer que le fer a fonctionn dans les temps primitifs comme donneur dlectrons. Lide dune photosynthse archaque non productrice doxygne et fonde sur loxydation du fer ferreux a t propose par WALKER [50]. La photosynthse oxygnique ne serait venue quensuite. Des organismes analogues aux cyanobactries vivaient depuis plus de 3 milliards d'annes, et ont produit les stromatolites fossiles. La photosynthse cyanobactrienne a entran ainsi une monte du potentiel redox environnant et un bouleversement adaptatif considrable des organismes vivant au contact de latmosphre. Elle a provoqu aussi loxydation massive du fer, qui a form des oxydes insolubles se dposant en couches encore visibles dans certains terrains archens. Inversement le fer ferrique devenait un accepteur efficace pour les oxydations nergtiques pratiques chez les tres non photosynthtiques. Les Shewanella et Geobacter utiliseraient donc une mthode trs ancienne. Incidemment, la monte d'O2 a probablement favoris lclosion des premiers eucaryotes, de la formation des mtazoaires, de lapparition des animaux. Songeons qu la base du Cambrien (570 millions dannes), alors que stait dj drouls les quatre cinquimes de lhistoire de la vie jusqu nos jours, la base de toutes les grandes lignes animales tait dj en place. Lvolution des animaux avait sans doute dj diverg de celle des plantes un milliard dannes auparavant. Cette question fascinante provoque une rue de recherches et de spculations. En effet la priode prcambrienne semble avoir connu des bouleversements climatiques rptition sur des millions dannes, avec des alternances de priodes chaudes et froides accompagnes de fortes oscillations du dioxyde de carbone atmosphrique, du dveloppement des formes vivantes et probablement de nombreuses extinctions. Ce domaine scientifique est stimul par les proccupations modernes sur leffet de serre et la drive du climat. Le calcium et le magnsium librs par lrosion des silicates ont provoqu la formation de carbonates. En examinant des terrains anciens dans des falaises de Namibie, des chercheurs amricains ont suppos que la terre avait t recouverte par les glaces pendant une priode de prs de 100 millions dannes dbutant avant le Cambrien [51], avec un rchauffement conscutif une accumulation du CO2 dorigine volcanique, une fonte des glaces et le dveloppement dune vie intense. Cette la snow-ball hypothesis d'une priode "boule de neige" (la terre aurait t recouverte de glace jusqu'aux basses latitudes) est encore trs discute.
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Il y aurait pour le fer un fractionnement isotopique par les tres vivants comme pour le carbone. Une mobilisation plus intense du fer puis sa roxydation en fer ferrique provoque des dpts doxydes. Or le fer libr des roches ignes a un rapport 56 Fe/54Fe de lordre de 15,7, avec des carts trs faibles, et la mme valeur a t trouve dans les roches lunaires. Il sagit sans doute dun rapport fix au moment de la naissance du systme solaire et on tente de le vrifier sur Mars. Le mtabolisme bactrien modifie trs lgrement ce rapport en faveur du fer-54 [52]. Un appauvrissement en fer-56 dans un dpt sdimentaire traduirait donc une origine biologique. Un enrichissement montrerait au contraire que du fer a t soustrait par lactivit biologique et transport ailleurs. Lanalyse des strates ferrugineuses anciennes semble tre rvlatrice de cette activit, avec la possibilit de discerner des cycles dactivit biologique plus ou moins grande. Limportance gochimique la fois actuelle et ancienne des bactries du fer ne fait pratiquement plus aucun doute. La rduction du fer par les bactries serait responsable de la disparition de plus de la moiti des matires organiques dans les sdiments anarobies. Les espces comptentes peuvent sadapter des sources carbones varies. On peut donc esprer les utiliser pour le nettoyage des terrains contamins par les usines et les dcharges [53]. Il existe inversement des bactries capables d'oxyder le fer ferreux en fer ferrique, dcrites au chapitre 3. Le fer est donc l'objet d'un cycle naturel important, dont nous n'examinons ici qu'une seule facette. Quelles sont les caractres gnraux des diverses bactries rductrices du fer ? Les espces cultives exprimentalement en anarobiose sur Fe(III) comme accepteur ne reprsentent quun chantillonnage restreint des potentialits relles dans la nature. Les donnes restent partielles ou provisoires. La rduction du fer est-elle compatible avec la prsence d'O2 ? En principe non. La rduction est galement inhibe par la prsence de nitrate ou de nitrite [54]. La rduction du fer peut devenir vigoureuse et atteindre 200 moles par minutes en ordre de grandeur. Le taux de croissance de Shewanella frigidimarina (appel antrieurement Shewanella putrefaciens) est alors aussi lev que celui dun organisme dnitrifiant classique cultiv sur nitrate comme Paracoccus denitrificans. Ces deux espces sont anarobies facultatives, la premire tant rpandue dans les eaux douces. Quels sont les substrats mtaboliss ? Ils sont communment le pyruvate, le lactate, lactate, le formiate et le glycrol-3-phosphate [55]. Lhydrogne est galement une souce dlectrons permettant aux bactries de se dvelopper en chimiotrophie. Certaines espces peuvent coupler la rduction du mtal avec l'oxydation du benzne, du tolune et d'autres substrats aromatiques comme le phnol et le p-crsol. L'espce Shewanella MR-1 prsente une plasticit tonnante. Elle est capable de remplacer O2 par le N-oxyde (TMAO), le thiosulfate, le dimethylsulfoxide (DMSO), le citrate ferrique, le manganse(IV) et le nitrate ! La rduction dissimilatrice des mtaux est relativement commune dans la nature. En dehors des espces Gram-ngatives cites, elle s'observe galement chez divers sulfato-rducteurs (Desulfovibrio), et des formes comme Geobacter metallireducens. Les bactries rductrices peuvent s'emparer du fer chlat par des molcules organiques ou prsents dans des minraux insolubles tels que la
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goethite (FeO-OH), des oxydes et hydroxydes. On a dcouvert des applications intressantes. Geobacter sulfurreducens est une espce rductrice du fer qui peut coupler l'oxydation de l'hydrogne la rduction des formes oxydes du technecium-99. Cet lment est un produit de fission de l'uranium, a t rpandu pendant les essais nuclaires l'air libre et t dtect comme contaminant des eaux, notamment dans les effluents des stations de retraitement . La rduction du Tc(VII) sous forme de TcO4 entrane la formation de Tc(IV) dans l'oxyde TcO2 trs insoluble, qui prcipite et se voit immobilis. Le mcanisme est double. Le technecium est rduit d'une part par l'activit microbienne directe, d'autre part avec le Fe(II) engendr par la rduction du fer ferrique. Laction des bactries est donc la fois directe et indirecte. Quelle est la chane de transporteurs d'lectrons utilise par la rduction dissimilatrice du fer ? Elle comporte une mnaquinone, des cytochromes b et c et une Fe(III)-rductase, avec des variations en fonction de lespce et des conditions de croissance. Par exemple S. frigidimarina carence en fer perd ses cytochromes c et sa rductase, et les cellules rose-orang blanchissent. Ces bactries ont en effet une teneur leve en cytochromes c, tous dans le priplasme ou lis la membrane. Une pice essentielle de la chane de rduction du fer chez S. frigidimarina est un cytochrome c 4 hmes [56], dsigne par CymA. Le fer ou le manganse ne sont gnralement pas accepteurs obligatoires. S. frigidimarina peut les remplacer par divers produits comme ceux qui ont t noncs plus haut, et mme par le soufre (S0). Une proprit banale des bactries rductrices du fer est d'oxyder des constituants de l'humus du sol avec le nitrate ou le fumarate comme accepteur [57]. Comment les bactries peuvent-elles ingrer des oxydes insolubles ? Elles n'ont pas besoin de le faire, et utilisent les oxydes de fer par contact direct. Si elles en sont spares exprimentalement par une membrane dialyse, il ny a pas de rduction. Cela expliquerait pourquoi la rduction du fer semble s'effectuer sur la membrane externe de Shewanella putrefaciens MR-1 [58], avec nanmoins une participation de la membrane cytoplasmique au dispositif [59]. La membrane externe de Shewanella porte une protine exceptionnelle de 85 kDa (OmcA) purifie rcemment [60]. Son gne indique la prsence dune dizaine de noyaux hminiques C bas potentiel, de 243 324 mV et elle serait associe la face externe de la membrane externe, une disposition trs rare pour une protine de ce type chez les Gram-ngatifs. Une autre protine 10 hmes, CymA, est localise dans la membrane interne. Toute une srie de 7 gnes concerns par la rduction du fer sont groups avec celui de OmcA sur un segment d'ADN de 13 kb : mtrDEF-omcA-mtrCAB. Il en rsulte un vritable arsenal de cytochromes contenant 10 hmes de type C, tous bas potentiel, soit dans la membrane externe en plus de OmcA avec MtrF, soit dans le priplasme avec MtrA, MtrD et MtrE. Si on fait le compte des cytochromes 10 hmes, en ajoutant celui qui est dans la membrane interne, cela ferait 60 hmes de type C communiquant avec l'intrieur de la cellule ! Il y a mme en plus un cytochrome c plus petit 4 hmes comme les c3 des sulfato-rducteurs. Seules MtrE et MtrB n'appartiennent pas au club des cytochromes c. Le challenge futur sera de dterminer la disposition plus prcise de toutes ces protines, et de voir si elles ne forment pas un complexe multiprotique.
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Le fer est peut-tre capt par MtrB. Cette protine associe la priphrie cellulaire sur la membrane externe est ncessaire la respiration sur fer [58]. Elle n'est pas utile quand les cellules utilisent un autre accepteur d'lectrons, par exemple le fumarate. Or l'examen de la squence rvle une homologie convaincante avec une protine du colibacille (FepA) qui est un rcepteur. Quelle est sa fonction ? Ce rcepteur capterait les sidrophores*, constituants organiques mis dans le milieu et capables de piger le fer avec une haute affinit. Nous avons donc toutes les pices qui permettent de se faire une ide du mcanisme de rduction du fer. Les cytochromes prsents sur la membrane externe, lorsqu'ils sont rduits, sont roxyds d'emble par Fe3+. Il est vraisemblable que la fonction d'OmcA est bien celle d'une fer rductase, recevant le fer de MtrB. Ce dispositif reoit les lectrons partir de la membrane interne, aprs avoir t canalyss par un complexe bc1, un quinol, la protine 10 hmes CymA, puis travers le priplasme par plusieurs cytochromes jusqu' la rductase. Le mcanisme a besoin d'tre prcis par l'observation de mutants et les analyses biochimiques. En somme la rductase agit prs de la surface bactrienne. Elle reoit le mtal pig du ct extrieur, et les lectrons par une chane de transferts venant de la membrane interne par CymA et constitue de nombreux hmes C. Comme le fer disponible dans la nature en milieu neutre existe gnralement sous forme doxydes trs insolubles, lexistence dun appareil rducteur la priphrie de la cellule semble satisfaisante pour lesprit. Ltrange mtabolisme qui consiste utiliser le fer comme substitut de loxygne pour une respiration nest connu que depuis peu dannes, et l'imprcision des connaissances sur le mcanisme reste frustrante. Peut-on extrapoler ce qui est connu par Shewanella d'autres espces ? Chez Geobacter sulfurreductens, lenzyme faisant office de rductase est aussi attache la surface externe de la membrane externe, et peut sen librer facilement sous leffet dune solution saline [61]. Elle est donc facilement solubilisable sans destruction de la cellule, mais ne peut fonctionner qu laide dune source dlectrons. Son activit peut tre teste en solution par un apport d'un cytochrome c rduit 6. Dans certains cas, lenzyme attache la surface cellulaire prendrait livraison du fer apport par un sidrophore, dans d'autres les cellules viendraient se plaquer sur des particules insolubles d'oxyde et d'hydroxyde de fer. En somme deux tactiques seraient utilises : entrer directement en contact avec les oxydes de fer ou aller le piger distance par des sidrophores et le ramener vers la cellule. On estime que la rduction du fer dans les sdiments pauvres en oxygne offre une perspective intressante pour la dcontamination des sols pollus par des hydrocarbures ou autres composs organiques. La rduction du fer est stimule par des agents chlateurs, sans doute en amliorant le contact du mtal avec la surface des cellules. On peut s'en rendre compte exprimentalement en imitant la nature chimique de l'humus par le 2,6-anthraquinone-disulfonate (AQDS). Ce produit est rduit en AHQDS (l'hydroquinone) et peut servir lui aussi d'intermdiaire. Il a t observ que l'humus stimulait la destruction des polluants ptroliers en prsence d'oxydes de fer.
6 - Cytochrome c de cheval, qui est la source commerciale usuelle pour ce genre dexprience.
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humus rduit
FeII
humus oxyd composs humiques
FeIII oxydes de fer
L'humus servirait d'intermdiaire par un cycle o il passerait alternativement d'un tat oxyd un tat rduit [62]. L'humus oxyd est alors un accepteur respiratoire pour divers germes du sol comme signal au dbut de ce chapitre. Il l'est aussi par les rducteurs du fer comme Shewanella alga ou Geobacter metallireducens qui viennent en contact avec les substances humiques. L'utilisation du manganse est-elle calque sur le mme principe ? C'est vraisemblable puisque la rductase du fer chez Shewanella rduit aussi Mn(IV). La multiplication des bactries en flacon ferm contenant du dioxyde de manganse en suspension dans le milieu s'accompagne d'une disparition spectaculaire de la couleur brune. Le manganse est un lment abondant de la crote terrestre dont il reprsente environ 0,1%. Laltration des roches magmatiques et mtamorphiques par les eaux acides le mobilise facilement sous forme d'ions Mn2+ soit Mn(II), qui soxyde plus ou moins en surface pour donner une grande varit de minraux (une trentaine !). La rhodochrosite est un carbonate (MnCO3), une forme partiellement oxyde est la manganite ou MnO(OH). La pyrolusite est un dioxyde de manganse (MnO2) qui est le plus abondant. Il est form par laltration des carbonates et silicates de Mn, et c'est le principal minerai exploit depuis les temps les plus anciens jusqu lpoque moderne (industrie du verre, de lacier et des piles).
S0, SO42 dissimilation XH2
2 Fe2+ Fe(III) rductase
(MnO2) Mn(IV) X Mn(IV) rductase XH2
X H2S SO32 thiosulfate rductase S0 S2O32
2 Fe3+
Mn2+
Fer, manganse, sulfate

Dans les zones marines o prolifrent les sulfato-rducteurs, des interactions complexes s'tablissent entre le mtabolisme des composs soufrs et celui des mtaux. Les bactries sulfato-rductrices des milieux marins apparaissent comme des rducteurs indirects du manganse et du fer par les sulfures qu'elles
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produisent. Le dioxyde de manganse (MnO2 ) est rductible spontanment par Fe(II) et les sulfures (H2S) comme l'indique la figure inspire de NEALSON et MYERS [63]. On s'explique donc facilement le pouvoir qu'ont les bactries rductrices du fer d'utiliser paralllement le dioxyde de manganse. La source d'lectrons est symbolise par XH2 Dans de vastes rgions des fonds marins existent des sphrules brun-noir ou nodules (taille moyenne 4 cm) renfermant avec le manganse dautres lments (fer, quartz, argiles, carbonate). On pense que la formation de ces nodules pourrait tre autocatalytique. Loxydation de Mn en surface produirait MnO2 qui faciliterait ladsorption et loxydation de Mn(II) en dioxyde supplmentaire selon un mcanisme qui se perptuerait de lui-mme. Viendraient sy associer les oxydes de fer. Les particules insolubles iraient se dposer sur le fond en devenant lentement de plus en plus grosses pour former les nodules. Ces derniers rsulteraient aussi de lactivit hydrothermale [64]. Leur croissance est considre comme extrmement lente (1 10 mm par million dannes). Le fer de ces nodules prsente un lger dficit en fer-56 par rapport au fer-54. Cette dviation du rapport isotopique dj cite suggre que Fe(III) a t rduit par des bactries, puis sest roxyd nouveau. Il y aurait donc de fortes chances pour que lactivit biologique ait facilit la formation des nodules. De faon gnrale lanalyse minralogique des sdiments marins fournit maintenant de prcieux renseignements sur le pass, concernant le climat, la circulation ocanique et laction des tres vivants. L'examen des nodules apporte des renseignements par les lments quils incorporent, le rapport isotopique du bryllium et le rapport entre thorium et uranium tant utiliss comme marqueurs de datation. Lexploitation des nodules attire des convoitises par leur aptitude adsorber dautres lments mtalliques comme du cuivre, du nickel, du cobalt et autres lments intressants. Le manganse immobilis sous forme doxyde dans le sol et le fond des rivires (birnessite) retient des mtaux lourds, des radionuclides (rejets radioactifs). Il oxyde le slnium(IV) en Se(VI), le chrome(III) en Cr(VI), larsenic(III) en As(V). Le dioxyde de manganse se comporte comme un excellent changeur de cations aussi efficace que les argiles, en particulier au pH lgrement suprieur 8 qui est celui de leau de mer. Nous mentionnerons la fin de cette section le cas trange des bactries magntotactiques qui nagent en sorientant sur le champ magntique terrestre. Elles ont t dcouvertes ds 1970 par BLAKEMORE partir de sdiments deau douce [65], et il a fallu constater au cours des annes qui ont suivi que ces germes taient non seulement nombreux dans des localisations prcises, mais faciles isoler. Les cellules mobiles par flagelles se dplacent dans le sens du champ magntique terrestre, vers le Nord dans lhmisphre Nord, en sens contraire dans lautre hmisphre. Leurs mouvements sont observables sous le microscope, et la direction de leur nage est la mme pour toutes, une vitesse de lordre de 40 m la seconde. Linversion du champ par l'approche dun aimant leur fait faire un demitour avec un ensemble remarquable. Depuis leur dcouverte initiale, de nombreuses espces de bactries, dites magntotactiques, ont t trouves. La premire isole par BLAKEMORE et rebaptise Magnetospirillum magnetotacticum a servi aux tudes les plus dtailles.
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Les cellules ragissent au champ magntique par la prsence dans leur cytoplasme d'un chapelet de minuscules particules de mme taille (35 120 nm) et constitues par un minral ferromagntique, la magntite Fe3O4. Les granules aligns sont entours dune membrane commune au sein d'un magntosome [66]. La fonction physiologique de cette membrane nest pas connue avec certitude. Les grains doxyde correspondent autant de domaines magntiques individuels qui sont tous orients dans le mme sens dans le magntosome. Lorsque des grains de magntite trouvs dans les sdiments ont ces caractres, ils sont suspects comme tant dorigine biologique.
N
Aquaspirillum magnetotacticum
Le moment magntique rsultant imprim par les particules du magntosome est suffisant pour aligner de faon passive la cellule paralllement au champ. Aucun autre mcanisme nergtique ne prside cette orientation. La bactrie nage donc dans la direction qui lui est impose par laimantation de son magntosome. On a dcouvert que les magntosomes ne contenaient pas obligatoirement de la magntite, qui est remplace chez des espces marines par un sulfure quivalent sous forme de greigite (Fe3S4), ou encore de pyrrhotite (Fe7S8), qui ont aussi des proprits ferromagntiques [67]. On a reconnu galement la prsence de pyrite FeS2, non magntique. Certains sulfato-rducteurs produisent de la magntite intracellulaire et forment des sulfures magntiques extracellulaires [68]. Les espces magntotactiques dj rpertories ne reprsentent srement quune petite proportion de la ralit. Une grande varit de formes semble exister. Le magntisme des sdiments ferrugineux est considr comme le tmoin de lactivit bactrienne travers les ges et sert de marqueur pour les gophysiciens. La finesse et l'homognit des micro-grains de magntite retiennent l'attention pour diverses biotechnologies. Dans quels milieux trouve-t-on ces bactries et quelle interprtation donner cet trange comportement ? Elles se concentrent dans les zones o la pression partielle du dioxygne est faible. Dans une mare modrment charge en matires organiques, la zone favorable peut se trouver quelques centimtres au-dessus du sdiment. Dans les lacs et tangs, elle peut se trouver plusieurs mtres du fond. Il y a ventuellement un gradient dcroissant de la teneur en oxygne partir de la surface, et un gradient croissant du taux de sulfure partir du fond. Enfin elles sont prsentes galement grande profondeur dans les ocans et dans le sol. Quel est le rle du champ magntique dans tout cela ? On observe gnralement que limportant nest pas tellement la direction du nord magntique que la composante verticale du champ terrestre. Les lignes de forces ne sont pas parallles la surface, mais plongent avec une forte dclinaison en direction du nord. La nage en fonction de ces lignes de force est pour les bactries le moyen de senfoncer vers la zone favorable. Le mouvement de ces bactries pose encore des nigmes non entirement rsolues.
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Comment le mtal est-il collect pour confectionner les granules aligns dans le magntosome ? Le fer du milieu est sous forme doxydes ferriques hydrats et insolubles. Lexprience montre que les bactries rduisent le fer plus ou moins vite en fonction de son tat physique. En rgle gnrale les oxydes amorphes sont plus rapidement utiliss que les formes cristallises. Pour la capture du fer, Magnetospirillum magnetotacticum utilise comme les autres Gram-ngatives des sidrophores, qui sont ici du type hydroxamate [69]. Un mcanisme de transport recueille Fe3+ et lui permet de gagner le cytoplasme aprs rduction partielle en Fe2+. Le dtail des oprations reste obscur, mais parat diffrent de celui des Shewanella. Les bactries ont une fer rductase FMN de 36 kDa qui semble utiliser NADH sur la face cytoplasmique de la membrane [70]. On ne sait pas si elle fonctionne dans les deux directions : la dissimilation du fer, cest--dire une respiration de sources telles que lactate ou lhydrogne avec le fer comme accepteur, et la synthse des magntosomes. La magntite, Fe3O4, correspond Fe2O3 + FeO, soit 2 Fe3+ + Fe2+, ce qui implique une rduction partielle du mtal 7. La physiologie mtabolique des bactries magntotactiques est encore peu documente malgr des progrs rapides [71]. Or leffet du champ magntique attire la fois une vive curiosit et des projets dapplications biotechnologiques. Tenir en laisse avec un aimant des bactries capables de faire des biodgradations utiles peut sembler une ide attrayante [72]. En dehors de ce cas particulier, nous retiendrons le rle capital des oxydes de fer en milieu anoxique, autorisant l'oxydation respiratoire de divers substrats et venant en complment des autres actions telles que la rduction du nitrate, du sulfate et autres accepteurs. La section suivante nous fera quitter ces accepteurs minraux et nous dirigera vers d'autres solutions naturelles indites.
7.5 - DSHALOGNATION RESPIRATOIRE - OXYDE DE CHLORE

Les composs organiques halogns sont devenus beaucoup plus abondants autour de nous depuis que l'industrie humaine en dverse dans l'environnement, volontairement ou non. Leur biodgradation est facilite en arobiose et nous aurons l'occasion de la dcrire. Heureusement, elle s'effectue aussi dans les milieux privs d'oxygne, o cohabitent de nombreuses formes bactriennes qui changent leurs comptences. C'est en tudiant la dgradation du 3-chlorobenzoate en milieu anarobie que DOLFING et TIEDJE ont obtenu une association stable trois entre un sulfato-rducteur, dsign comme Desulfomonile tiedjei, un actogne et un mthanogne [73]. Le premier est normalement capable de pousser en autotrophie sur CO2 et hydrogne ou formiate. L'accepteur est en principe le sulfate ou le thiosulfate. Il est remplac ici par le 3-chlorobenzoate :
7 - Le mlange de dosage contient un tampon phosphate, NADH, FMN et du citrate ferrique. La rduction du fer est mesure colorimtriquement 562 nm par ferrozine.
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COO
COO
+ H2
Cl 3-chlorobenzoate
Cl
+ H+
(1)
benzoate
L'limination biologique du chlore se fait toujours sous forme d'ion chlorure. Elle quivaut ici une rduction 2 lectrons. En effet elle est l'inverse d'une substitution lectrophile sur le cycle aromatique par une entit cationique, qui serait Cl+. L'hydrogne apporte les lectrons ncessaires pour la rduction en Cl. Le rsultat est l'oxydation de l'hydrogne par le 3-chlorobenzoate jouant le rle d'accepteur et une production d'nergie. Le deuxime partenaire de l'association est un actogne dsign par BZ-2. Il utilise le benzoate produit par la premire souche pour en faire de l'actate par une raction de fermentation, elle aussi productrice d'nergie pourvu que la raction soit tire vers la droite par la consommation au fur et mesure de l'actate et de l'hydrogne. Benzoate + 6 H2O 3 H2 + 3 actate + 2 H+ + CO2 (2)
Le mthanogne, un Methanospirillum, vient parachever les transformations en produisant du mthane, soit partir de CO2 + H2, soit partir de l'actate : CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O Actate + H+ CH4 + CO2 (3) (4)
La premire raction (3) permet d'ponger l'excs de H2 produit par l'actogne dans la raction (2). Les trois ractions (1), (2) et (3) se combinent pour donner le bilan gnral : 2 (3-Chlorobenzoate) + 10 H2O 6 actate + 6 H+ + CH4 + CO2 + 2 Cl (5) La raction (4) est une mthanognse actoclastique. Si elle remplace la raction (3), H2 apparat dans le nouveau bilan : 2 (3-chlorobenzoate) + 10 H2O 6 CH4 + 6 CO2 + 2 Cl + H2 (6)
Le mthanogne de l'association est essentiellement hydrognotrophe (il fait son mthane par rduction de CO2), et les mesures de mthane par chromatographie en phase gazeuse ont vrifi qu'il se formait une molcule d'hydrogne pour 2 molcules de chlorobenzoate consommes par la population mixte. La raction actoclastique (4) seule conduirait un excdant d'hydrogne. Or la souche actogne BZ-2 ne pourrait pas tirer une nergie suffisante de la raction (2) si l'hydrogne devenait trop abondant. Toute la communaut en dpend et la concenration d'hydrogne doit rester trs faible, infrieure 40-80 nM. L'hydrogne joue donc un rle critique dans l'conomie gnrale. Il y a une comptition pour ce gaz entre le Desulfomonile et le mthanogne, mais le premier ne peut pas se passer du
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second, et vice-versa. L'activit gnrale du systme se maintient grce la trs forte activit dchlorante de la premire souche, seule produire un flux de benzoate suffisant pour que les deux autres germes puissent se dvelopper. Le schma rsume de faon simplifie les changes essentiels entre les trois partenaires de l'association :
3-chlorobenzoate sulfato-rducteur Desulfomonile tiedjei H2 H2 mthanogne Methanospirillum CH4
benzoate CI
actogne Bz-2
CO2 actate
Revenons D. tiedjei. Ces bactries ont donc une dshalognase dont elles se servent pour rduire le 3-chlorobenzoate avec un substrat simple, comme l'hydrogne ou le formiate. L'enzyme appartient la membrane cytoplasmique et a t purifie aprs solubilisation par un dtergent [74], mais on ne peut alors la faire fonctionner qu'avec un donneur d'lectrons artificiel comme le mthylviologne rduit, sans doute parce que la chane de transporteurs naturels a t rompue. La dshalognase est colore en jaune. Elle est compose de deux sous-units (64 et 37 kDa) et prsente les caractres d'une protine hminique capable de lier CO, avec des proprits spectrales proches de celles d'un cytochrome c. Les indications exprimentales suggrent fortement l'intervention de cette dshalognase comme la pice inductible essentielle d'une respiration sur 3-chlorobenzoate [75], qui fait partie de ce qu'on appelle une halorespiration. Ce processus est inhib par le HQNO, dpend d'une mnaquinone membranaire, fonctionne concurremment avec la respiration sur sulfate, sulfite ou thiosulfate [76], qui est constitutive chez D. tiedje. On a pu relier la dshalognation du 3-chlorobenzoate une force protonmotrice p, qui serait btie essentiellement selon le schma hypothtique d LOUIE et MOHN :
2 H+, CO2 n H+ FDH formiate c H2 H.ase 2 e 2 H+ 2 H+ Q 2 H+ HS QH2 2 dshalognase e
cytoplasme ATPase SO42 ATP n H+ ADP + Pi
CI COOH COOH CI
rductases du sulfate
Dshalognation du 3-chlorobenzoate
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Les transferts d'lectrons sont simplifis, et la rduction du sulfate exerce dans le cytoplasme par les rductases (APS rductase et dsulfoviridine) est indique pour mmoire sans ses connections. Au niveau de la membrane ont t symbolises : l'ATPase/ATP synthase, qui utilise la force protonmotrice pour engendrer de l'ATP (ou inversement qui peut hydrolyser de l'ATP pour produire un p) ; la formiate dshydrognase (FDH) ; un cytochrome c priplasmique ; une hydrognase (H.ase) ; une naphtoquinone respiratoire au sein de la membrane (Q/QH2) ; la dshalognase. Le potentiel p apparat essentiellement par l'excdent de protons ralis du ct priplasmique. L'aller et retour de la quinone entre sa forme oxyde (Q) et sa forme rduite (QH2) fait partie du cycle des quinones, le mcanisme classique qui prlve des protons du ct cytoplasmique pour exporter l'quivalent vers l'extrieur. La dshalognation respiratoire d'un halobenzoate est l'origine de deux surprises intressantes. La premire est de constater que cette proprit est relativement rpandue dans la nature. Une dshalognation a t mise en vidence dans diverses souches, souvent rebaptises pour la circonstance : Dehalobacter restrictus, Dehalospirillum multivorans et autres [77]. La deuxime surprise est la dshalognation exerce facilement sur les solvants chlors auxquels les bactries n'ont pas t exposes antrieurement, c'est--dire le pentachlorophnol (PCP), l'hexachlorobenzne, le ttrachlorothylne, des biphnyles polyhalogns (PCB) Ces dshalognations anarobies sont videmment des plus utiles, mais vont plus ou moins loin selon les souches. Ainsi le ttrachlorothylne peut tre transform en trichlorothylne, en dichlorothylne, et jusqu'au stade chlorure de vinyle. Ces oprations ont un caractre fortuit et seraient dues la spcificit trs large des enzymes de dchloration. L'limination de l'halogne partir d'un aromatique se fait en position mta pour le chlore, toutes les positions pour le brome et l'iode. Nous savons que D. tiedjei possde le pouvoir constitutif de rduire le sulfate et autres oxyanions. La prsence de plusieurs systmes respiratoires dans un mme germe est peut-tre commune. Des rgulations permettent d'orienter le mtabolisme vers l'accepteur respiratoire le plus avantageux sur le plan nergtique. Comme beaucoup de sulfato-rducteurs, D. tiedjei peut raliser une fermentation du pyruvate en actate, qui est le seul produit form en prsence de CO2. Or un cinquime de l'actate form dans ces conditions provient du CO2. L'explication est venue de la dcouverte d'une CO dshydrognase (actyl-CoA synthase) comme celle qu'on trouve chez les actognes [78]. La dchloration de substrats halogns xnobiotiques offre deux cas de figure. Dans le premier, l'enlvement de l'halogne est un comtabolisme caractre plus ou moins fortuit : la croissance cellulaire s'appuie alors sur d'autres oxydations. Un exemple typique est la dchloration du ttra-chlorothylne pratique par des sulfato-rducteurs [79], des mthanognes [80] ou des actognes [81]. La diversit des potentialits dployes par les bactries prsentes dans la vase et sdiments est certainement suffisante pour offrir de nombreuses possibilits de ce genre. Le deuxime cas est celui o les bactries tirent toute leur nergie de la
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dchloration de composs aliphatiques ou aromatiques halogns faisant office d'accepteurs d'lectrons. Comme la croissance des bactries dpend alors de la dchloration, celle-ci a des chances d'tre plus rapide et plus complte. La distinction entre ces deux situations est fonde sur des critres thermodynamiques. Le travail de LFFLER et coll. [82] fait appel des cultures anarobies de plusieurs souches dshalognantes en utilisant : l'actate comme source de carbone; l'hydrogne comme source d'lectrons; divers drivs halogns comme accepteurs. Ce sont le trichlorothylne, le 1,2-dichloropropane, le chlorure de vinyle et divers phnols chlors. L'ide est la suivante. Les lectrons mis par la source, qui est H2, sont utiliss dans deux directions, soit vers le driv halogn fonctionnant comme accepteur pour une part qu'on dsignera par Fen (pour nergie), soit vers les synthses organiques pour une autre part Fsyn, avec Fen + Fsyn = 1. Le potentiel physiologique standard E' des halodrivs est dans la gamme de + 300 + 550 mV. Il est beaucoup plus lev que celui des accepteurs dans l'actognse, la mthanognse ou la rduction du sulfate. Le saut nergtique correspondant l'oxydation de H2 par le chlorodriv n'en est donc que plus important. Or la consommation de H2 carte celui-ci de l'tat standard. En consquence son potentiel rel E' ne fait que remonter au fur et mesure que sa concentration diminue, jusqu' atteindre des valeurs positives quand le taux d'hydrogne est trs faible. Si le potentiel de l'hydrogne devient trop lev, son oxydation par le chlorodriv devrait s'arrter. On peut prdire qu'il y a un seuil d'hydrogne au-dessous duquel il n'est plus oxyd. La valeur de ce seuil dpend du potentiel de l'accepteur. Il est plus bas pour un halodriv, dont le potentiel est relativement lev, que pour les autres accepteurs. Le graphique, repris de LFFLER et coll., montre la concentration de H2 au cours du temps dans une culture anarobie sur actate et 2-chlorophnol (0,2 mM). Le taux d'hydrogne s'abaisse ef fectivement des valeurs trs basses. En comparant la disparition de H2, l'accroissement de la biomasse, et la disparition du 2-chlorophnol, il a t possible d'valuer la part des lectrons consacrs la chlororespiration, soit une fraction Fen de 0,6-0,7. Cette fraction a t trouve nettement plus faible (0,012) dans une culture mixte mthanogne pratiquant le comtabolisme d'un chlorophnol.
H2 (ppmv)
104
1
102
2 3 4
1 - phase prparatoire sur actate et 2-chlorophnol (2-CP) 2 - ajout d'hydrogne 100 ppmv 3 - puisement du milieu en 2-CP 4 - nouvelle addition de 2-CP
100
102 0 50 100
jours 25C
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La chlororespiration est donc une ralit intressante qui permet d'esprer la dpollution efficace de certains drivs chlors. Cette possibilit figure actuellement dans de nombreux projets de financement de la recherche. En effet nombreux sont les sites anarobies contamins. La dshalognation rductrice offre de bonnes pers COO pectives pour le nettoyage des aquifres et OH CH2 des sdiments.
Cl Cl OH Cl-OHPA Cl 2,3-dichlorophnol
La dcouverte de la dshalognase du 3-chlorobenzoate de D. tiedjei, voque plus haut, a dclench des recherches vigoureuses conduisant la dcouverte de systme bactriens varis s'attaquant, soit des aromatiques, soit au ttrachlorothylne (TeCE). Parmi les substrats aromatiques on trouve le 3-chloro-4-hydroxyphnylactate (Cl-OHPA) [83], le penta-chlorophnol [84], le 2,3-dichlorophnol. La dshalognation la mieux caractrise est cependant celle du TeCE. Les dshalognases sont testes l'aide d'un colorant accepteur du type viologne. Toutes sont membranaires et prsumes fonctionner dans une respiration anarobie. Chose curieuse, l'enzyme de D. tiejei contenant un hme C fait figure de systme atypique, parce que toutes les autres qui ont t examines renferment un cofacteur corrinode. La dshalognase rductrice du TeCE a t purifie partir d'un Desulfitobacterium cultiv sur pyruvate et fumarate [85]. L'enzyme monomrique de 65 kDa contient deux noyaux [4Fe-4S] et un corrinode sensible l'inhibition par le cyanure et le sulfite. Des enzymes similaires ont t trouves chez d'autres espces. Une seule a t trouve l'tat soluble (Dehalospirillum multivorans) malgr son intervention dans un mtabolisme respiratoire [86]. Le potentiel du couple TeCE/TCE (trichlorothylne) est E' = + 580 mV. Celui du couple TCE/DCE 8 est E' = + 540 mV. Ces valeurs sont donc fortement positives. Pourtant la dshalognation requiert un bas potentiel, infrieur 360 mV, justifiant probablement la prsence du corrinode et des centres [4Fe-4S] dont le potentiel est proche de 480 mV. L'intervention du cobalt permet de faire plusieurs prvisions. Le bas potentiel requis suggre que Co(I) est l'entit rductrice. D'autre part le cobalt doit participer comme dans les autres corrinodes une oxydorduction entre Co(I) et Co(III), ce dernier pouvant tablir une liaison covalente transitoire avec le carbone. Les observations et des considrations thoriques suggrent que le mcanisme pourrait tre radicalaire comme indiqu sur le schma [87] avec les diffrents tats dsigns par base-off pour Co(I) et base-on pour Co(II) et Co(III) dfinis en glossaire.
8 - Dichlorothylne.

CI CI CoII E'0 < 350 mV 1 e E'0 > 0 mV CI 1 e H+ CoIII CI C CI TCE C H CI CI C CoIII CI C CI CoI CI TeCE C C CI CI C C CI CI CI
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CoII CI C C
CI CI
Dshalognation du ttrachlorothylne
Les dshalognases des aromatiques fonctionneraient sur le mme principe, mais l'intervention d'un hme dans l'enzyme du 3-chlorobenzoate reste inexplique. Des mesures et calculs thoriques ont eu lieu pour comparer l'nergie produite et le rendement de croissance, qui reste faible. La variation d'nergie libre G'0 de la dchloration du TeCE en dichlorothylne est de 189 kJ par mole d'hydrogne utilis comme donneur. La formation d'un ATP en conditions relles requiert de l'ordre de 70 kJ par mole. Le gradient de protons engendr ne serait que 2 H+ par mole de H2, alors qu'il en faudrait au moins 3 pour la synthse d'une molcule d'ATP. Le rendement mdiocre explique la lenteur de croissance de Dehalospirillum multivorans et la faible biomasse obtenue. Malgr cela les synthses fonctionnent tout de mme. Dans la nature, on sait parfois vivre petitement. Nous en arrivons considrer les oxydes de chlore. Leur contamination des milieux aquatiques et du sol est une pollution essentiellement artificielle ne de l'emploi des herbicides, du blanchiment des ptes industrielles papetires obtenues par le procd KRAFT*, de l'industrie des carburants pour fuses (perchlorate d'ammonium) et de l'activit des arsenaux militaires, notamment aux Etats-Unis o le problme est devenu proccupant dans certaines rgions. Il s'agit du perchlorate (ClO4), du chlorate (ClO3), du dioxyde de chlore (ClO2), du chlorite (ClO2), et enfin de l'hypochlorite (ClO) popularis par l'eau de Javel. Le chlorate de sodium reste souvent utilis comme dsherbant total des chemins et voies ferres, ainsi que pour la destruction des souches. Les sources naturelles de ces oxydes sont sans doute minimes, ne peuvent s'envisager que par l'activit des peroxydases. Tous ces produits sont potentiellement dangereux pour la sant. Le perchlorate affecte la glande thyrode et provoque des atteintes de la moelle osseuse, le chlorite faible taux provoque des anmies hmolytiques chez les animaux de laboratoire. Le chlorate mlang d'autres matriaux facilement oxydables peut se transformer en explosif, et il est gnralement fourni dans le commerce en association avec un autre matriau servant de ballast et destin diminuer ce risque.
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Le chlore et ses oxydes (ClO2, ClO2, ClO) ont t largement utiliss dans le traitement des eaux. L'hypochlorite de calcium, Ca(ClO)2, vendu en galets, sert la dsinfection des piscines pH 7,2-7,6. Le chlore inject dans l'eau engendre de l'hypochlorite par une raction de dismutation : Cl2 + H2O HCl + HOCl. Le chlorite de sodium ragit avec l'hypochlorite en milieu acide pour donner du dioxyde de chlore et du NaCl. L'hypochlorite de sodium contenu dans l'eau de Javel donne lieu une dismutation qui engendre chlorate et NaCl : 3 NaClO NaClO3 + 2 NaCl. Le chlorure mis part, ces diffrents produits sont tous de source artificielle 9, sont susceptibles d'avoir des effets pervers, et se livrent entre eux des ractions de dismutation. On comprend donc que leur emploi dans le traitement des eaux ncessite une certaine attention. La rduction du chlorate en chlorite par les microorganismes est commune. La raction apparat comme une comptition dj mentionne avec la rduction du nitrate par la nitrate rductase. Certaines espces vont plus loin et utilisent le chlorate ou le perchlorate comme un accepteur d'lectrons dans un processus dissimilateur. Citons un Dechloromonas souche CKB [88], Ideonella dechloratans et Wolinella succinogenes [89]. Une douzaine de dissimilateurs du chlorate ont t isols partir de divers milieux par COATES et coll. [90]. L'existence d'une respiration sur chlorate est donc pratiquement certaine. Ces bactries sont toutes des protobactries , et , btonnets mobiles se comportant en anarobies facultatifs. Toutes peuvent oxyder totalement l'actate en prsence de chlorate 10 mM : 3 CH3COO + 4 ClO3 + 3 H+ 6 CO2 + 4 Cl + 6 H2O Quelques-unes taient aussi des dnitrifiants, mais aucune ne rduisait le sulfate. Divers acides organiques courte chane (propionate, butyrate) sont oxyds, ainsi parfois que Fe(II). Le glucose et H2 ne sont pas utiliss comme donneurs. Au cours de la rduction six lectrons du chlorate en chlorure, aucun intermdiaire tel que le chlorite n'est dtect. Ce caractre est peut-tre en rapport avec la prsence caractristique d'une chlorite dismutase, enzyme transformant le chlorite en chlore et dioxygne. Les auteurs ont not que la raction tait si puissante en prsence de 10 mM de chlorite qu'un dgagement gazeux important se produisait dans une suspension cellulaire. Le chlorite tait consomm plus rapidement que le chlorate, ce qui expliquait pourquoi on ne l'avait pas dtect comme intermdiaire. La dismutase purifie chez Dechlorimonas, est un homottramre de 120 kDa. Le dgagement d'oxygne est en rapport avec la possibilit de vivre en arobiose, et montre que ces bactries ne peuvent pas tre des anarobies strictes. Tous ces germes sont incapables de fermenter. Leur mtabolisme est donc essentiellement respiratoire, l'accepteur tant O2, le chlorate, le perchlorate et parfois le nitrate. Sulfate, fumarate et Fe(III) ne sont pas accepteurs. Les cellules contiennent un cytochrome c, mais l'analyse dtaille des transporteurs reste faire. La rduction du chlorate est une tranget. Il s'agit peut-tre d'un dtournement de l'activit de la nitrate rductase chez les dnitrifiants. Divers organismes, dont Proteus mirabilis
9 - A l'exception des quantits minimes d'hypochlorite produites par les polynuclaires neutrophiles au cours du processus inflammatoire, sous la dpendance de la myloperoxydase.
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et les Rhodobacter peuvent rduire le chlorate en chlorite sans pouvoir pour autant utiliser cette capacit pour leur croissance. En outre P. mirabilis fait une chlorate rductase spcifique qui n'agit pas sur le nitrate. Parce que le chlorate n'est pas un ingrdient trs courant dans la nature, l'origine d'une respiration spcifique du chlorate devrait avoir rsult de l'volution d'un systme pr-existant.
CONCLUSION SOMMAIRE
Les respirations anarobies sont donc extraordinairement riches et varies dans lenvironnement. Elles utilisent comme accepteurs d'lectrons des produits du mtabolisme (fumarate), les oxydes du soufre et le soufre lui-mme, des mtaux, et chose tonnante des composs artificiels chlors. cela s'ajoutent bien sr les oxydes de l'azote. Il est possible que beaucoup de systmes plus ou moins tranges restent rpertorier. Certains mtabolismes demeurent inexpliqus. Ils tmoignent cependant du formidable pouvoir d'adaptation de la microflore dans son ensemble face l'apparition de polluants gnrs par l'homme et de la mise en service de nombreux mcanismes encore incompltement analyss.
RFRENCES
[1] M A K L A S H I N A E, B E R T H O L D D K & C E C C H I N I G (1998) J. Bacteriol. 180 : 5989-5996. [2] I V E R S O N TM, L U N A - C H A V E Z C , C E C C H I N I G & R E E S DC (1999) Science 284 : 1961-1966. [3] L A N C A S T E R C RD , K R G E R A, A U E R M & M I C H E L H (1999) Nature 402 : 377-385. [4] R E I D G A, M I L E S C S , M O Y S E Y RK, P A N K H U R S T KL & C H A P M A N S K (2000) Biochim. Biophys. Acta 1459 : 310-315. [5] R O T H E R Y RA, T R I E B E R C A & W E I N E R JH (1999) J. Biol. Chem. 274 : 13002-13009. [6] S H A W AL, H O C H K O E P P L E R A, B O N O R A P, Z A N N O N I P, H A N S O N G R & M A C E W A N AG (1999) J. Biol. Chem. 274 : 9911-9914. [7] C Z J Z E K M, D O S S A N T O S JP, P O M M I E R J, G I O R D A N O G , M E J E A N VV & H A S E R R (1998) J. Mol. Biol. 284 : 435-447 ; J O H N S O N KE & R A J A G O P A L A N KV (2001) J. Biol. Chem. 276 : 13178-13185. [8] G A R T O N S D , H I L T O N JC , O K U H , C R O U S E BR, R A J A G O P A L A N K V & J O H N S O N MK (1997) J. Am. Chem. Soc. 119 : 12906-12916. [9] M J E A N V, I O B B I - N I V O L C , L E P E L L E T I E R M, G I O R D A N O G , C H I P P A U X M & P A S C A L MC (1994) Mol. Microbiol. 11 : 1169-1179 ; U J I I Y E T, Y A M A M O T O I, N A K A M A H , O K U B O A, Y A M A Z A K I S & S A T O H T (1996) Biochim. Biophys. Acta 1353 : 1-5 ; D O S S A N T O S JP, I O B B I - N I V O L C , C O U I L L A U L T C , G I O R D A N O G & M J E A N V (1998) J. Mol. Biol. 284 : 421-433.
360
[10] A N S A L D I M, J O U R L I N - C A S T E L L I C , L E P E L L E T I E R M, T H R A U L A Z L & M J E A N V (2001) J. Bacteriol. 183 : 2691-2695. [11] S H E N Y , B U I C K R, C A N F I E L D D E (2001) Nature 410 : 77-81. [12] B A K F & P F E N N I G N (1991) FEMS Microbiol. Ecol. 85 : 43-52. [13] W I D D E L F (1988) In "Biology of Anaerobic microorganisms", Z E H N D E R AJB ed., John Wiley & Sons : 469-585. [14] S T A H L M A N N J & coll. (1991) Arch. Microbiol. 155 : 554-558. [15] L A N Y I JK (1979) Biochim. Biophys. Acta 559 : 377-397. [16] W I N D T, S T U B N E R S & C O N R A D R (1999) Syst. Appl. Microbiol. 22 : 269-279. [17] C H I D T H A I S O N G A & C O N R A D R (2000) FEMS Microbiol. Ecology 31 : 73-86. [18] B O E T I U S A & coll. (2000) Nature 407 : 623-626. [19] O R P H A N VJ, H I N R I C H S K- U , U S S L E R III W , P A U L L C K, T A Y L O R LT, S Y L V A S P, H A Y E S JM & D E L O N G EF (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 1922-1934. [20] B I T T E R E R H , cit par B R U N E D C (1989) Biochim. Biophys. Acta 975 : 189-221. [21] B I C K JA & L E U S T E K C (1998) Curr. Opinion Plant Biol. 1 : 240-244. [22] D A H L C , K R E D I C H NM, D E U T Z M A N N R, T R P E R H G (1993) J. Gen. Microbiol. 139 : 1817-1828. [23] H A T C H I K I A N EC & Z E I K U S JG (1983) J. Bacteriol. 153 : 1211-1220 ; A R E N D S E N AF, V E R H A G E N MFJ M, W O L B E R T RBG , P I E R I K AJ, S T A M S AJM , J E T T E N MS M & H A G E N W R (1993) Biochemistry 32 : 10323-10330. [24] C R A N E BR, S I E G E L LM & G E T Z O F F ED (1995) Science 270 : 59-67. [25] T A N J & C O W A N JA (1991) Biochemistry 30 : 8910-8917. [26] M A R R I T T MJ & H A G E N W F (1996) Eur. J. Biochem. 238 : 724-727 ; Z E G H O U F M, F O N T E C A V E M & C O V S J (2000) J. Biol. Chem. 275 : 37651-37656. [27] W A G N E R M, R O G E R AJ, F L A X JL, B R U S S E A U G A & S T A H L D A (1998) J. Bacteriol. 180 : 2975-2982. [28] T E I X E I R A M, F A U Q U E G , M O U R A I, L E S P I N A T PA, B E R L I E R Y , P R I C K R I L B, P E C K H D , X A V I E R AV, L E G A L L J & M O U R A JJ (1987) Eur. J. Biochem. 167 : 47-58 ; T E I X E I R A M, M O U R A I, F A U Q U E G , D E R V A R T A N I A N D V, L E G A L L J, P E C K H D , M O U R A JJ & H U Y N H BH (1990) Eur. J. Biochem. 189 : 381-386. [29] C Z J Z E K M, G U E R L E S Q U I N F, B R U S C H I M & H A S E R R (1996) Structure 15 : 395-404 ; A U B E R T C , L E R O Y G , B I A N C O P, F O R E S T E, B R U S C H I M & D O L L A A (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 242 : 213-218. [30] M O R A I S J, P A L M A PN, F R A Z A O C , C A L D E I R A J, L E G A L L J, M O U R A I, M O U R A JJ & C A R R O N D O MA (1995) Biochemistry 34 : 12830-12841 ; B R E N N A N L, T U R N E R D L, M E S S I A S AC , T E O D O R O ML, L E G A L L J, S A N T O S H & X A V I E R AV (2000) J. Mol. Biol. 298 : 61-82. [31] A U B E R T C , L E R O Y G , B R U S C H I M, W A L L JD & D O L L A A (1997) J. Biol. Chem. 272 : 15128-15134. [32] L O V L E Y D R & P H I L L I P S EJP (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 850-856. ; L O V L E Y D R, W I D M A N PK, W O O D W A R K JC & P H I L L I P S EJP (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3572-3576. [33] P E C K H D (1993) In "Bioenergetic strategies of the sulfate-reducing bacteria", O D O M JM & S I N G L E T O N R eds, Springer-Verlag, New York : 41-76.
7 OXYDATIONS ANAROBIES DIVERSES [34] R A P P - G I L E S BJ, C A S A L O T L, E N G L I S H RS , R I N G B A U E R JA, D O L L A A & W A L L JD (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 671-677. [35] H E I J T H U I J S E N JH F G & H A N S E N TA (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 965-969. [36] M O U R A I, L I N O AR, M O U R A JJ, X A V I E R AV, F A U Q U E G , P E C K H D & L E G A L L J (1986) Biochem Biophys. Res. Commun. 141 : 1032-1041. [37] I D E N O A, Y O S H I D A T, F U R U T A N I M & M A R U Y A M A T (2000) Eur. J. Biochem 267 : 3139-3149. [38] K L E T Z I N A (1989) J.Bacteriol 171 : 1638-1643 ; K L E T Z I N A (1992) J. Bacteriol. 174 : 5854-5859. [39] B R U G N A M, N I T S C H K E W , T O C I R, B R U S C H I M & G U I D I C I - O R T I C O N I M (1999) J. Bacteriol. 181 : 5505-5508. [40] B A N C I L, B E R T I N I I, B R U S C H I M, S O M P O R N P I S U T P & T U R A N O P (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 14396-14400. [41] L O V L E Y D R (1991) Microbiol. Rev 55 : 259-287. [42] L O V L E Y D R & B L U N T - H A R R I S EL (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4252-4254. [43] B A L A S H O V A VV & Z A V A R Z I N G A (1980) Microbiology 48 : 635-639. [44] S E M P L E K & W E S T L A K E D (1987) Canad. J. Microbiol. 33 : 366-371 ; M A C D O N E L L MT & C O L W E L L RR (1985) Syst. Appl. Microbiol. 6 : 171-182. [45] M Y E R S C R & N E A L S O N KH (1988) Science 240 : 1309-1321. [46] S E N K O JM & S T O L Z JF (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 3750-3752. [47] L O V L E Y D R (1993) Annu. Rev. Microbiol. 47 : 263-290 ; N E A L S O N KH & S A F F A R I N I D (1994) Annu. Rev. Microbiol. 48 : 311-343. [48] C O L E M A N MLH E D R I C K D B, L O V L E Y D R, W H I T E D C & P Y E K (1993) Nature 361 :436-438. [49] V A R G A S M, K A S H E F I K, B L U N T - H A R R I S EL & L O V L E Y D R (1998) Nature 395 : 65-67. [50] W A L K E R JC G (1987) Nature 329 : 710-712. [51] H O F F M A N PF, K A U F M A N AJ, H A L V E R S O N G P & S C H R A G D P (1998) Science 281 : 1342-1346. [52] B E A R D BL, J O H N S O N C M, C O X L, S U N H , N E A L S O N KH & A G U I L A R C (1999) Science 285 : 1889-1892. [53] R U G G E K, B E R G PL & C H R I S T E N S E N PL (1995) Environ Sci. Technol. 29 : 1395-1400. [54] D I C H R I S T I N A D J (1992) J. Bacteriol. 174 : 1891-1896. [55] L A S C E L L E S J & B U R K E K (1978) J. Bacteriol. 134 : 585-595 ; L O V L E Y D R, P H I L L I P S EJP & L O N E R G A N D J (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 700-706. [56] M Y E R S C R & M Y E R S JM (1997) J. Bacteriol. 179 : 1143-1152. [57] L O V L E Y D R, F R A G A JL, C O A T E S JD & B L U N T - H A R R I S EL (1999) Environ. Microbiol. 1 : 89-98. [58] B E L I A E V AS & S A F F A R I N I D A (1998) J. Bacteriol. 180 : 6292-6297. [59] M Y E R S C & M Y E R S J (1993) FEMS Microbiol. Lett. 108 : 15-22. [60] F I E L D S J, D O B B I N PS , C H E E S M A N MR, M A T M O U G H NJ, T H O M P S O AJ & R I C H A R D S O N D J (2000) J. Biol. Chem. 275 : 8515-8522. [61] G A S P A R D S , V A S Q U E Z F & H O L L I G E R C (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 3188-3194. [62] L O V L E Y D R (1997) FEMS Microbiol. Reviews 20 : 305-313. [63] N E A L S O N KH & C .R. M Y E R S C R (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 439-443.
361
362 [64] K A S T N E R M (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 3380-3387. [65] B L A K E M O R E RP (1982) Annu. Rev. Microbiol. 36 : 217-238.
[66] B A L K W I L L D L, M A R A T E A D & B L A K E M O R E RP(1980) J. Bacteriol. 141 : 1399-1408. [67] M A N N S , S P A R K S NH C , F R A N K E L RB, B A Z Y L I N S K I D A & J A N N A S C H H W (1990) Nature 343 : 258-261 ; F A R I N A M, M O T T A S , E S Q U I V E L S & L I N S D E B A R R O S H G P (1990) Nature 343 : 256-258. [68] S A K A G U C H I T, B U R G E S S JG & M A T S U N A G A T (1993) Nature 365 : 47-49. [69] P A O L E T T I L C & B L A K E M O R E RP (1986) J. Bacteriol. 167 : 73-76 ; P A O L E T T I L C & B L A K E M O R E RP (1988) Curr. Microbiol. 17 : 339-342. [70] N O G U C H I Y , F U J I W A R A T, Y O S H I M A T S U K & F U K U M O R I Y (1999) J. Bacteriol. 181 : 2142-2147. [71] S C H L E R D (1999) J. Mol. Biotechnol. 1 : 79-86. [72] S C H L E R D & F R A N K E L RB (1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 52 : 464-473. [73] D O L F I N G J & T I E D J E JM (1991) FEMS Microbiol. Ecol. 86 : 25-32. [74] N I S , F R E D E R I C K S O N JK & X U N L (1995) J. Bacteriol. 177 : 5135-5139. [75] L O U I E TM & M O H N W W (1999) J. Bacteriol. 181 : 40-46. [76] T O W N S E N D G T & S U F L I T A JM (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 : 3594-3599. [77] S C H O L Z - M U R A M A T S U H , N E U M A N N A, M E B M E R M, M O O R E E & D I E K E R T G (1995) Arch. Microbiol. 163 : 48-56 ; M A Y M O - G A T E L L X, C H I E N Y T, G O S S E T T JM & Z I N D E R S H (1997) Science 276 : 1568-1571 ; H O L L I G E R C , H A H N D , H A R M S E N H , L U D W I G W , S C H U M A C H E R W , T I N D A L L B, V A S Q U E Z F, W E I S S N & Z E H N D E R AJB (1998) Arch. Microbiology 169 : 313-321. [78] M O H N W W & T I E D J E JM (1990) J. Bacteriol. 172 : 2065-2070. [79] C O L E JR, C A S C A R E L L I JL, M O H N W W & T I E D J E JM (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 3536-3542. [80] J A B L O N S K I PE & F E R R Y JG (1992) FEMS Microbiol. Lett. 96 : 55-60. [81] T E R Z E N B A C H D P & B L A U T M (1994) FEMS Microbiol. Lett. 123 : 213-218. [82] L F F L E R FE, T I E D J E JM & S A N F O R D RA (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4049-4056. [83] C H R I S T I A N S E N N, A H R I N G BK, W O H L F A R T H G & D I E K E R T G (1998) FEBS Lett. 436 : 159-162. [84] C H R I S T I A N S E N N & A H R I N G BK (1996) Int. J. Syst. Bacteriol. 46 : 442-448. [85] M I L L E R E, W O H L F A R T H G & D I E K E R T G (1997) Arch. Microbiol. 168 : 513-519 ; M I L L E R E, W O H L F A R T H G & D I E K E R T G (1998) Arch. Microbiol. 169 : 497-502. [86] N E U M A N N A, W O H L F A R T H G & D I E K E R T G (1996) J. Biol. Chem. 271 : 16515-16519. [87] H O L L I G E R C , W O H L F A R T H G & D I E K E R T G (1999) FEMS Microbiol. Reviews 22 : 383-398. [88] B R U C E RA, A C H E N B A C H LA & C O A T E S JD (1999) Environ. Microbiol. 1 : 319-331. [89] M A L M Q V I S T A, W E L A N D E R T, M O O R E E, T E R N S T R O M A, M O L I N G & S T E N S T R O M L- M (1994) Syst. Appl. Microbiol. 17 : 58-64 ; W A L L A C E W , W A R D T, B R E E N A & A T T A W A Y H (1996) J. Ind. Microbiol. 16 : 68-72. [90] C O A T E S JD , M I C H A E L I D O U U, B R U C E RA, O ' C O N N O R S M, C R E S P I JN & A C H E N B A C H LA (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 5234-5241.
CHAPITRE 8 L'OXYGNATION DES AROMATIQUES

Les cycles dsigns par les chimistes comme aromatiques existent en nombre immense dans l'environnement, dverss massivement en majorit par les vgtaux, mais aussi par les activits humaines. Un prlude leur dgradation par les micro-organismes du sol et des eaux au contact de l'air est une oxygnation qui rend le cycle plus fragile une attaque ultrieure. Dans ce chapitre sont examines les transformations initiales des hydrocarbures simples comme le benzne, le tolune et le naphtalne, ainsi que la nature des enzymes responsables. Sont examines ensuite les voies d'attaque de drivs simples, hydroxyls, nitrs, chlors ou fluors. 8.1 - Introduction 8.2 - Loxygnation du benzne 8.3 - Lattaque du tolune et du styrne 8.4 - Des oxygnases aux cibles nombreuses et varies 8.5 - La naphtalne dioxygnase 8.6 - Labondance naturelle des phnols 8.7 - Drivs nitrs 8.8 - Haloaromatiques 8.9 - Le benzoate et les halobenzoates 8.10 - Aromatiques fluors 365 366 368 373 377 382 386 394 398 404
8 LOXYGNATION DES AROMATIQUES
8.1 - INTRODUCTION
Les composs aromatiques taient dj prsents dans la biosphre depuis les temps les plus anciens puisquils sont prsents dans le ptrole et dans la houille. Ils ont t dtects dans de nombreux sdiments gologiques antrieurs au Cambrien. Leur varit dans la nature est immense, et l'activit humaine en a rpandu de nombreuses espces nouvelles. Le benzne est la molcule modle la plus simple. Les molcules aromatiques ont au moins un cycle insatur dont les aspects fondamentaux sont rappels en glossaire. Les htrocycles aromatiques ne contiennent pas que du carbone, les htro-atomes tant le plus souvent O, N et S. Le noyau benznique (radical phnyle) tire son origine de l'rythrose-4-phosphate form partir du glucose dans la voie des pentoses, mais n'est assembl de novo que par les vgtaux et de nombreuses espces bactriennes, autotrophes ou non. Sa prsence la plus importante est dans les protines au sein de trois acides amins (phnylalanine, tyrosine et tryptophane) et dans les produits du rgne vgtal comme la lignine. La raction de la phnylalanine-ammoniac lyase (PAL) commande la gense de nombreux produits secondaires et apparat comme une des plus importantes dans la biosphre.
H4N+ COO H PAL actyl-CoA trans-cinnamate calchones flavonodes authocyanes tannins tannins coumarine phnols COO coumarate frulate cafate sinapate lignine
hydroxylations mthylations
NH3 L-phnylalanine
Le monde vivant est habitu recycler une grande partie des composs aromatiques naturels. Lindustrie humaine a engendr des produits nouveaux, chlors, nitrs, azots, ou autres, retrouvs dans la composition de nombreux ingrdients de la vie pratique : drivs ptroliers, solvants, matires plastiques, peintures et vernis, mdicaments, herbicides, insecticides, etc. Ils sont souvent sources de
366
pollution pour l'environnement et nombreux sont ceux qui sont toxiques pour la faune et la flore. On compte sur les micro-organismes des sols et des eaux pour les recycler. Quelquefois le nettoyage marche tout seul. Dans d'autres cas, il faut l'aider. Heureusement pour nous la flexibilit gntique des agents biologiques et la gamme daction de leurs enzymes permettent dliminer maints composs artificiels. Linsaturation des hydrocarbures aromatiques leur donne un caractre polarisable et une petite solubilit dans leau qui est plus accentue que celle des aliphatiques. Cette proprit est importante dans le cas du benzne dont la solubilit 25C est de 22,9 mM, contre 6,29 pour le tolune, 2,02 pour lo-xylne, 1,27 pour lthylbenzne et 0,80 pour le naphtalne. Le caractre polaire du phnol lui confre une plus grande solubilit dans leau, qui atteint 872 mM pH 7 et augmente avec le pH (le pKa de la fonction phnolique est proche de 10). Les cycles aromatiques isols ou condenss sont des entits stables dont le mtabolisme ncessite quelques dtours. Nous constaterons deux phases. La premire est une prparation du cycle et de ses dpendances, oxydations qui ont pour effet de fragiliser la cible lattaque ultrieure. Le cheminement suivant procde par ouverture du cycle aromatique et par des remaniements qui vont engendrer des produits du mtabolisme intermdiaire, comme le succinate, lactyl-CoA, le malate et autres intermdiaires de base. La mme tactique est observe dans dautres mtabolismes. Par exemple la dgradation bien connue du glucose dans la glycolyse, dont le principe est trs diffrent, prsente aussi une phase de prparation par des phosphorylations, aboutissant au fructose-bisphosphate. La deuxime phase sempresse de scinder ce dernier et aboutira lactyl-CoA. Le substrat est donc fragilis avant lcroulement de sa structure. Ce chapitre ne concerne que les toutes premires ractions doxydation, cest-dire la phase de prparation. Laction des oxygnases va fragiliser le cycle lattaque ultrieure, quitte le dbarrasser en mme temps de substituants latraux ou les remplacer. Le dmantlement complet du cycle est une seconde phase qui fera lobjet des chapitres suivants.
8.2 - LOXYGNATION DU BENZNE

Le cycle benznique est fortement stabilis par son nergie de rsonance rsultant de la dlocalisation uniforme des lectrons dans le noyau. Son oxydation en chimie ncessite des conditions drastiques 1, comme si un ractif plac en face dun cycle totalement symtrique ne savait pas, tel lne de Buridan, par quel ct commencer. Aussi les cycles aromatiques sont-ils en principe trs solides et leur chimie est trs diffrente de celle des olfines conjugues comme le butadine ou l'isoprne. Le cycle est fragilis par l'introduction dun ou deux substituants oxygns. Le caractre biodgradable du benzne a t pressenti en Allemagne ds 1913, mais le mcanisme mis en jeu tait inconnu. L'existence de nombreuses espces
1 - Par exemple loxygne et loxyde de vanadium 450C, avec formation danhydride malique.
8 - LOXYGNATION DES AROMATIQUES
367
capables d'attaquer le benzne en arobiose a t une bonne surprise, car il s'agit d'une pollution ptrolire qu'on supposait coriace. Les Pseudomonas abondent dans cette opration, mais ne sont pas les seuls agents comptents. Loxydation du benzne en catchol par Nocardia corallina a t montre pour la premire fois la fin des annes cinquante avant d'tre confirme chez un Aerobacter [1]. La formation dun diol intermdiaire na t tablie quen 1968 par GIBSON et coll. [2]. Le principe est le suivant : il y a double hydroxylation par une dioxygnase, qui introduit les deux atomes doxygne d'O2 sur des carbones adjacents.
NADH + H+ NAD+ H OH OH benzne O2 H cis-diol NAD+ NADH + H+ OH OH catchol
Dioxygnation du benzne
Ce systme enzymatique exige une source dlectrons, la diffrence dautres dioxygnases rencontres plus loin. Elle catalyse la premire raction du schma, la seconde tant ralise par une dshydrognase. On peut constater quil ny a aucun gain net en NAD+ ou NADH lissue de ces deux ractions. Le caractre aromatique est momentanment perdu dans lintermdiaire form qui est un cis-dihydrodiol o les deux hydroxyles sont ports du mme ct du plan. Le produit est ici le cis-benzne dihydrodiol 2. La vrification rigoureuse d'une oxygnation consiste utiliser du dioxygne enrichi en oxygne-18 et constater l'incorporation de l'isotope dans le produit de la raction [3]. Un mutant priv de la dshydrognase accumule le dihydrodiol en prsence de benzne sans pouvoir le mtaboliser. La benzne dioxygnase (EC 1.14.12.3), appele quelquefois benzne hydroxylase, a des caractres fondamentaux importants. C'est un complexe associant trois protines, soit une rductase flavinique de 81 kDa oxydant le NADH, une ferrdoxine spciale appartenant la famille des protines de RIESKE* et la benzne dioxygnase proprement dite (215 kDa).
NADH + H+ H OH OH H
FAD rductase
Fdred
Enzox dioxygnase
NAD+
FADH2
Fdox
Enzred
+ O2
La benzne dioxygnase
2 - Exactement le cis-2,3-dihydroxy-cyclohxa-4,6-dine.
368
Celle-ci est un trimre de structure 3 3 contenant des sous-units (54 kDa) et (23 kDa). Chaque dtient un centre [2Fe-2S], du type quon trouve dans la ferrdoxine des chloroplastes vgtaux, et un ion Fe. Le complexe t analys pour la premire fois par GEARY et coll. laide dune souche de Pseudomonas putida cultive sur benzne comme seule source de carbone et dnergie [4]. Un petit diagramme symbolise la chane des oxydorductions. La flavine rcupre 2 lectrons, les cde un un la ferrdoxine (Fd) qui na quun seul noyau fer-soufre. La ferrdoxine transmet les lectrons aux centres fer-soufre de la dioxygnase. Ce modle est caractristique des oxygnases qui dpendent d'un apport d'lments rducteurs. Les sources d'lectrons les plus banales sont NADH ou NADPH qui ne sont utiliss qu'avec l'aide d'une protine flavinique comportant ventuellement des lments fer-soufre, et catalogue comme rductase. Elle transmet les lectrons la dioxygnase par le canal de la ferrdoxine. Le complexe form par les trois protines peut tre dissoci exprimentalement en ses lments, puis reconstitu en dioxygnase active condition dajouter des ions Fe2+. En effet lenzyme terminale qui est la dioxygnase proprement dite, a besoin de ces ions pour fonctionner. Chaque site actif renfermerait un centre mono-mtallique reprsent par le fer. La protine contient un motif consensus DExRH quon retrouve dans dautres enzymes de la mme famille. L'oxygnation de nombreux composs aromatiques un ou plusieurs cycles se fait sur le mme principe que celle du benzne et engendre un cis,cis-dihydrodiol. Il existe une grande famille denzymes de ce type, les arne dioxygnases (EC 1.14.12.x), qui prsentent des diffrences de dtail mais une organisation commune [5]. Le complexe trois composants contient une rductase fer-soufre FAD, une ferrdoxine centre [2Fe-2S] et la partie oxygnase proprement dite. Celle-ci est multimrique de type 33, contient en nombre gal des sous-units de 50-55 kDa et des sous-units de 20-25 kDa. Cette partie du complexe est parfois dsigne comme ISP (iron-sulfur protein). Chaque chane possde un centre [2Fe-2S] qui est toujours de type RIESKE*, et du fer, dont la prsence est indispensable. Nous constaterons que ce modle enzymatique s'applique de nombreux substrats, malgr quelques divergences. Le centre mtallique contiendra deux Fe ou nen possdera quun seul (comme dans le cas de lenzyme du benzne). Des diffrences sobserveront sur le mode daction. L'hydroxylation pourra se faire sur le noyau ou sur un groupe latral, tre double (dioxygnase) ou simple (mono-oxygnase). Toutes ces oxygnases ont besoin dune source auxiiaire dlectrons.
8.3 - LATTAQUE DU TOLUNE ET DU STYRNE

L'oxydation du tolune (mthylbenzne) ou du styrne (vinylbenzne) illustre la varit des procds mis en jeu. Ces entits sont prsentes dans le ptrole et divers vgtaux. Il nexiste pas moins de cinq voies pour attaquer le tolune en arobiose. L'une d'elles se fait sur le principe de la dioxygnase du benzne. Elle est rcapitule par un schma. Parmi les germes arobies les plus performants pour
369
se dvelopper sur ces aromatiques figurent presque toujours en premire ligne les Pseudomonas et apparents. Les hydroxylations ont t notes par un numro, et les dshydrognations sont indiques par les flches en pointill.
CH3 OH OH CH3 CH2OH CH3 8 1 2 3 4 COOH tolune CH3 7 OH CH2OH 7 COOH OH 6 CH3 5 3-mthylcatchol CH3 OH OH
acide benzoque
OH
OH
OH
N 1 2+5 3+6 4 7 8
Oxygnase Tolune 2,3-dioxygnase [6] Tolune-2-mono-oxygnase [7] Tolune-3-mono-oxygnase [8] Tolune-4-mono-oxygnase [9] 4-Crsol mthyl-hydroxylase [10] Xylne mono-oxygnase [11]
Organisme (exemple) Pseudomonas putida F1 Burkholderia cepacia, B. JS150 Pseudomonas pickett Pseudomonas mendocina (pWWO, pTOL, KR1) Pseudomonas mendocina, P. putida Pseudomonas putida mt-2 (pWWO, pTOL)
Les voies du tolune

Plusieurs informations intressantes sont noter : La tolune dioxygnase de la raction 1 forme un cis-dihydrodiol 3 et ressemble au complexe de la benzne dioxygnase avec rductase, ferrdoxine et enzyme fer-soufre. Cette dernire est souvent dsigne par ISPTOL. La source dlectrons est NADH ou NADPH. L'action de ce systme ne se limite pas au tolune, mais s'exerce sur une gamme tendue de substrats et nous aurons loccasion dy revenir. Le tolune est aussi la cible de plusieurs mono-oxygnases, qui s'attaquent au cycle en ortho, mta ou para (positions 2, 3 ou 4), ou au mthyle (raction 8) en laissant le cycle intact. Loxydation engendre alors lalcool benzylique, qui sera transform par deux dshydrognations successives en acide benzoque. Le nom de lenzyme fait rfrence aux xylnes (o-, m- ou p-dimthylbenzne) car cest le premier mode dattaque de ces produits. La transformation du tolune en acide
3 - Le (+)-cis-1S,2R-dihydroxy-3-mthylcyclohexa-3,5-dine.
370
benzoque est code par le plasmide TOL rendu clbre par la recherche gntique et biochimique, et que nous retrouverons au chapitre 10. Les oxygnases concernes sont peu slectives, et peuvent sattaquer des substrats varis, notamment aux aromatiques chlors et polychlors. On les voit parfois effectuer deux hydroxylations successives, comme dans les ractions 2 et 5, 3 et 6 qui sont l'origine du 3-mthylcatchol. Ces diffrentes mono-oxygnases sont aussi construites sur le mme plan que la dioxygnase du benzne. Par exemple la 4-mono-oxygnase (raction 4) est sparable en trois lments, puis reconstitue en rcuprant alors son activit en prsence dions fer. Un noyau bi-mtallique essentiel est prsent. Le mcanisme est similaire malgr l'introduction dun seul hydroxyle sur le cycle, mais une protine spciale prend le relais pour la deuxime hydroxylation. La raction 7 offre un cadre particulier. Lhydroxylation sur le mthyle du p-crsol (ou p-mthylphnol) engendre lalcool p-hydroxybenzylique, puis le p-hydroxybenzaldhyde. L'enzyme est rpertorie comme mthylhydroxylase mais c'est en fait une dshydrognase. Pourquoi ? L'hydroxylation diffre totalement des prcdentes par son mcanisme. La prsence de lhydroxyle en para sur le cycle renforce la susceptibilit du mthyle loxydation, et lenzyme est un flavocytochrome priplasmique de structure 2 2 . Les sous-units de 49 kDa contiennent chacune du FAD attach par liaison covalente, et chaque chane (9 kDa) est un cytochrome c. La raction est de type radicalaire et comporte une dshydrognation [12]. Elle est suivie de laddition dune molcule deau. L'atome d'oxygne est donc fourni par le solvant et l'enzyme peut se passer compltement du dioxygne 4. C'est en quelque sorte une hydroxylation de type anarobie. La dshydrognation de l'alcool 4-hydroxybenzylique en l'aldhyde est catalyse dans la foule. Revenons la double hydroxylation du cycle catalyse par les dioxygnases du benzne et du tolune. Lorientation cis du diol a t dmontre sans ambigut et reprsente une stratgie dattaque purement bactrienne. Le procd utilis par les champignons et les animaux n'est pas le mme. La mono-oxygnase introduit ici un seul atome doxygne sur le cycle et conduit poxyde. L'hydratation de celui-ci donne lisomre trans-diol la place du cis-diol. Cette opration s'observe dans le foie animal, o de nombreux composs sont dtoxifis par oxygnation 5. Les catalyseurs sont des cytochromes P450*. Malgr cela le rsultat final est le mme, c'est--dire un catchol. Le naufrage en 2000 dans la Manche d'un navire transportant du styrne est venue attirer l'attention sur les risques de pollution par ce produit. Le styrne peut s'vaporer en partie dans l'atmosphre, mais une polymrisation radicalaire en composs plus ou moins biologiquement inertes est dclenche par une lvation de temprature, l'action de la lumire ou la prsence d'un peroxyde. 4 - Une survivance volutive ancienne a t suggre, le mtabolisme des aromatiques tant antrieur la monte de loxygne atmosphrique. 5 - Les poxydes sont ventuellement cancrignes plus dangereux que le compos de dpart. Ce phnomne est l'origine de la toxicit particulire du benzne.

NADH + H+ NAD+ H2O O O2 benzne H2O H OH OH H (trans-dihydrodiol)
catchol
371
(poxyde)
La mthode des champignons et des mammifres

Bactries et champignons peuvent heureusement contribuer l'limination du styrne dans certaines limites de concentration (10-500 M). Peu soluble, il est introduit dans les cultures de laboratoire sous forme vapeur par barbotage, ou en solution sature. Le styrne est donc peu rmanent dans l'eau, avec une vie moyenne de l'ordre de 2 jours, mais on le souponne d'avoir des effets nfastes sur la flore et la faune, et d'tre cancrigne. Il y a deux cas de figure comme pour le tolune, selon que l'attaque commence sur la chane latrale ou sur le cycle.
CH2OH CHOH CH2 CH O2 (NDO) O CH2 CH styrne
La chane vinylique est elle-mme oxyde de deux faons, soit par dioxygnase conduisant un glycol, soit par mono-oxygnation donnant un poxyde. Dans le premier cas, l'enzyme est la naphtalne dioxygnase (NDO) de Pseudomonas NCIB [13], qui est trs peu slective. Nous la retrouverons plus loin. Dans le second cas se forme le cycle triangulaire d'un poxyde. L'enzyme est la mono-oxygnase flavinique d'une autre souche de Pseudomonas et exprime dans le colibacille 6. L'oxygnation ne produit qu'un seul des deux nantiomres [14]. Ces transformations du styrne prsentent de petites variantes naturelles. Une levure, Exophiala jeanselmei, fait galement un poxyde sur la chane latrale vinylique, mais l'enzyme est un cytochrome P450 coupl une rductase flavinique [15]. Cette levure dgrade ensuite l'poxyde en phnylactate puis en homogentisate. La deuxime stratgie repose sur la dioxygnase du cycle et une dshydrognation comme pour le benzne ou le tolune.
6 - Le mtabolisme est command par des gnes groups sur un plasmide. Il se poursuit par formation de phnylactaldhyde, phnylactate, phnylactyl-CoA. Le colibacille muni du plasmide peut crotre sur styrne comme seule source de carbone.
372
La source d'lectrons est NADH qui est recycl de la mme manire. Cette voie a t examine notamment chez un Rhodococcus rhodocrous capable de crotre sur styrne, tolune, thylbenzne et benzne [16].
CH2 CH NADH O2 H+ CH2 CH H OH OH H NAD+ CH2 CH 1 OH 2 OH NADH+
styrne
NAD H2 O
La scission ultrieure du 3-vinylcatchol se fera par dioxygnase, soit la position 1 (ouverture mta), soit la position 2 (ouverture ortho). Le germe tudi avait les deux types de dioxygnase. Seule la voie mta permettait Rhodococcus de dgrader entirement le styrne, car la dioxygnase ortho produisait un vinylmuconate rfractaire et rejet dans le milieu. Voici pour finir une application clbre de la styrne mono-oxygnase, l'origine d'une magnifique couleur bleue sur milieu de culture glos en prsence d'indole. Deux souches de Pseudomonas putida transforment l'indole en indigo 7. Les enzymes responsables sont la mono-oxygnase et l'isomrase qui prend le relais. Le styrne est le meilleur inducteur de l'enzyme [17]. Le tableau montre la transformation conjointe du styrne, de l'indne et de l'indole. L'indigo provient de la dimrisation spontane de l'indoxyle.
O styrne O indne O N H indole N H N H O O indoxyl (3-oxindole) O N H indigo O H N O phnylactaldhyde
2-indanone
Synthse de l'indigo partir de l'indole

7 - Le colorant vgtal est tir des feuilles et des tiges d'un arbuste cultiv dans les pays chauds, Indigofera tinctoria. Synthtis industriellement partir de l'aniline. Le pourpre antique est un driv dibrom de l'indigo.
373
L'examen des mutants appropris a montr que la mono-oxygnation produisait un poxyde intermdiaire. La formation de l'indigo est une proprit qui avait fait sensation en 1983 aprs avoir t dcouverte chez un colibacille [18] porteur d'un fragment du plasmide NAH7. Celui-ci dtermine les enzymes de dgradation du naphtalne, en particulier la naphtalne dioxygnase que nous rencontrerons plus loin. Elle est trs peu spcifique et oxyde aussi l'indole. Que venait faire l'indole ? L'enzyme du colibacille appele tryptophanase gnre de l'indole partir du tryptophane. Cette proprit est caractristique de la bactrie quand elle crot en prsence de l'acide amin. L'indole form est excrt dans le milieu. La souche modifie gntiquement avec NAH7 rcupre cet indole et en fait de l'indigo. Cette proprit a t reprise sur le plan pratique. La couleur bleue rvle que le gne de l'oxygnase est prsent et qu'il est transcrit. On s'arrange pour qu'il soit soud en tandem d'autres gnes dont la rgulation est tudie. Toute expression des protines correspondantes sur un milieu contenant du tryptophane s'accompagne de celle de la dioxygnase et se traduit par une couleur bleue. Cette mthode permet donc de passer au crible un grand nombre de colonies bactriennes sur bote et de reprer celles qui expriment les protines examines. Les sections suivantes vont souligner l'importance considrable des oxygnases dans les biodgradations en milieu oxygn.
8.4 - DES OXYGNASES AUX CIBLES NOMBREUSES ET VARIES

Les enzymes qui prennent le tolune pour cible sont capables de dgrader des substrats trs diffrents, voire non aromatiques comme le trichlorthylne [19]. Une souche de Pseudomonas putida se sert de sa tolune dioxygnase pour oxyder une belle panoplie de substrats dont le phnol, les chlorophnols, certains dichlorophnols, le naphtalne, divers hydrocarbures aromatiques et lincontournable trichlorthylne [20] ! Une autre souche utilise la dioxygnase contre des alcnes chlors de longueur variable [21]. Le complexe de la tolune 2,3-dioxygnase n'est gure diffrent dans son principe de celui de la benzne dioxygnase. Il est cod par quatre gnes, todA, todB, todC1 et todC2.
CH3
NADH + H+ FAD rductase (TodA) NAD+ FADH2 (TodB) Fdox Fdred Enzox ISPTOL (TodC1) Enzred CH3 + O2 OH OH
La tolune dioxygnase
374
Les deux derniers codent pour la dioxygnase proprement dite dsigne dans la littrature par ISPTOL, de structure 33. Ce sont les chanes (TodC1) dotes chacune d'un site catalytique, d'un centre [2Fe-2S] de type RIESKE, et ici d'un seul ion Fe2+. Le centre mono-mtallique est considr comme le lieu dactivation du dioxygne selon un mcanisme qui comporte un transfert des lectrons au mtal par le canal du noyau [2Fe-2S]. Il caractrise une vaste famille denzymes distinctes de celle de la benzne dioxygnase de Pseudomonas putida F1. 0n lui connaissait dj en 2002 plus de 25 enzymes diffrentes dont la plupart taient des dioxygnases bactriennes fonctionnant sur des substrats aromatiques. Cette famille renferme aussi une benzne dioxygnase de Pseudomonas putida, mais dans une souche diffrente de la prcdente (BE-81 [22]). Toutes ces dioxygnases catalysent la formation dun cis-dihydrodiol sur le cycle aromatique et sont donc associs une rductase et une ferrdoxine. Mais elles appartiennent deux ensembles qui se distinguent par la squence et la nature de leur noyau mtallique. Dans lune delles se trouvent deux ions Fe ponts par un oxygne, dans lautre un seul ion Fe. Toutes sont en gnral peu slectives. Les ractions catalyses vont de la monooxygnation la dsalkylation, la dsaturation des liaisons carbone-carbone et lenlvement dun atome dhalogne sur des substrats varis. La tolune 2,3-dioxygnase et la naphtalne dioxygnase (section suivante) sont caractristiques de cette catgorie d'enzymes trs polyvalentes. La similitude d'organisation structurale entre les enzymes dune mme famille se traduit par la conservation de certains motifs de squence. Un diagramme symbolise la squence dune chane de la tolune dioxygnase, o se rencontrent le segment qui lie le noyau fer-soufre et celui qui porte le fer [23].
119 214 228 266 450 96 1
C H C H [2Fe-2S]
ED YH H Fe 2+
ToDC1
Le consensus CxHx18CxxH est typique dun noyau fer-soufre de type RIESKE. Un autre consensus li la coordination du fer est : ExxxxDxYHxxxxHx37Y. Il reste quasi identique dans tous les termes de la famille. Lanalyse de la squence est donc primordiale. Il permet de se faire une ide sur la structure de lenzyme avant mme que ltude biochimique dtaille ait t ralise. Lintrt pratique li aux tudes portant sur la tolune 2,3-dioxygnase vient de lextraordinaire souplesse daction de cette enzyme qui ne se contente pas de dioxygner le tolune, mais transforme une multitude de substrats aromatiques ou non, soit par dioxygnation, soit par mono-oxygnation. Elle peut dsalkyler lanisole, le phnatole et autres substrats [24], effectuer des sulfoxydations [25], oxyder les nitrotolunes (section 7), hydroxyler le phnol et le 2,5-dichlorophnol [26], faire sauter enfin le chlore du trichlorthylne [27]. Au point que l'on peut se demander si la dioxygnase ne sest pas tourne vers le tolune par hasard alors quelle tait initialement prvue dans la nature pour dautres usages. Cette multiplicit de comptences provient
375
probablement du mode daction, qui consiste exacerber la ractivit de loxygne en contact avec le fer dans une poche plus ou moins hydrophobe au sein du site actif. L'oxygne ainsi mis en place reoit la cible dans une cavit dont la gomtrie peut saccommoder de larrive de substrats aux formes varies. Un thme de recherche consiste modifier le site par mutagense dirige, de faon crer de nouvelles oxygnases actives contre d'autres substrats ! La mthode dapproche par mutagense a t pratique sur la tolune 4-monooxygnase de Pseudomonas mendocina KR1. Cette enzyme (212 kDa), de structure 222, est loge comme d'habitude dans un complexe multi-protique et porte un centre Fe bi-mtallique sur chaque chane . Elle peut hydroxyler, soit le cycle aromatique du tolune et des o- et m-xylnes, soit un mthyle latral dans le p-xylne. Les transformations indiques par les flches sont les ractions dominantes observes [28].
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
tolune
o-xylne
m-xylne
p-xylne
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3
CH2OH
OH CH3 p-xylnol
CH3 OH p-crsol OH OH CH3
alcool p-mthylbenzylique
La 4-mono-oxygnase sur tolune et xylne

Des mutations ponctuelles ralises au voisinage du noyau bi-mtallique provoquent une dviation dans les orientations prfrentielles. La figure montre lune delles par la flche en pointill. Le remplacement dune glutamine proche de lun des atomes de fer par une cystine dvie la transformation en faveur de lhydroxylation du cycle (p-xylnol). La mme opration sur une phnylalanine voisine oblige lenzyme faire du xylnol et de lalcool mthylbenzylique parts presque gales. Les sites transforms ne lient pas directement le fer, mais contribuent faonner la poche du site actif. On en tire deux enseignements. Tout d'abord l'enzyme peut aussi bien hydroxyler le cycle quun mthyle latral. Cette proprit est rpandue parmi ces oxygnases et parat assez extraordinaire, car la ractivit d'un mthyle latral ne devrait pas ressembler celle des positions carbones du cycle. Le deuxime facteur important est le positionnement du substrat au voisinage de loxygne activ selon une orientation impose par la gomtrie du site. La tolune 3-mono-oxygenase de Pseudomonas puckettii PKO1 appartient la mme famille que la 4-mono-oxygnase. Elle a t dcrite lorigine comme une phnol hydroxylase car issue d'une souche qui peut se dvelopper sur phnol
376
comme seule source de carbone et dnergie. Elle a t la premire enzyme trouve comme capable dhydroxyler le tolune en mta. Des substrats multiples sont utiliss l aussi, notamment les trois crsols transforms en un mthylcatchol, le benzne et lthylbenzne transforms en phnol et thylphnol [29]. Enfin la 2-mono-oxygnase de Burkholderia cepacia G4 appartient la mme veine avec ses trois composants (222, 211 kDa). Les chanes ont un centre bi-mtallique. Elle transforme le tolune successivement en o-crsol et 3-mthylcatchol. Un alignement de squences partielles est tir de quatre mono-oxygnases o sigent des centres bi-mtalliques [30], soit : 1 - la tolune 3-mono-oxygnase de Burkholderia pickettii pKO1, 2 - la tolune 4-mono-oxygnase de Pseudomonas mendocina KR1, 3 - la phnol hydroxylase de Pseudomonas putida CF600, 4 - la mono-oxygnase de Methylosinus trichosporium.
132
1 2 3 4
: : : :
T3m L T4m M Ph.hyd Q A CH4m L
D D D D
E E E E
N L L I
R R R R
H H H H
G G V T
Q Q Q H
L L T Q
Q Q Q C
L L V A
Y Y H F
F F A I
P P M N
H H S H
D E H Y
Y Y Y Y
C C
// // // //
A A W W
I I L K
1 2 3 4
: : : :
A S A G
A V A M
R P K K
S K H R
T S F V
F Y F F
D M D A
D D D D
L D I G
F A I F
M R T I
S T G S
R A R R
S G D D
A P A A
I F I V
D E S E
I F V C
A L A S
I T I V
M A M N
L V L L
T S T Q
F F F L
A S S V
F F F G
E E E D
T Y T T
G V G C
F L F F
T T T T
N N N N
M L L P
237
Q L Q L
1 2 3 4
: : : :
F F F I
V L L V
P G G A
F L L V
M A A T
S A A E
G D D A
A A A I
A A A G
Y E E N
N A A G
G G G D
D D D E
M F Y I
A T T T
T F F P
V A A T
T S N V
F L L F
G I I
F S S L
S S S S
A I I V
Q Q Q E
S T T T
D D D D
E E E E
A S S L
R R R R
H H H H
A A
M Q Q M
Exemple d'homologie entre 4 mono-oxygnases

L'alignement permet de reprer la position des deux motifs DExRH qui lient le centre bi-mtallique dans la chane . Outre les rsidus identiques encadrs, il y a des remplacements d'une squence l'autre par des rsidus de mme nature (D et E, S et T, F et Y, L et V). Les 3- et 4-mono-oxygnases sont presque identiques sur un segment dune trentaine dacides amins. La recette des oxygnations par noyau bi-mtallique semble avoir connu un certain succs au cours de lvolution, et ne se limite pas au seul cycle aromatique ou au mthane. Il y a tout lieu de penser qu'elle est rpandue. On la retrouve par exemple dans l'alcne mono-oxygnase d'un Xanthobacter avec des caractres qui rappellent en tout point les enzymes prcites [31]. En somme ces diffrentes oxygnases montrent des potentialits tendues tout fait remarquables par leur souplesse de fonctionnement, bien illustre dans la section suivante. Leur site catalytique renferme un noyau monomtallique (tolune 2,3-dioxygnase) ou bi-mtallique (mono-oxygnases), mais il est clair que toutes ces protines sont pourtant construites sur un thme structural commun.
377
8.5 - LA NAPHTALNE DIOXYGNASE

Le naphtalne 8 fait partie des hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP, abondants dans les produits ptroliers et dans les gaz dchappement. La dioxygnase bactrienne du naphtalne rappelle tout fait celle du benzne et engendre un cis-dihydrodiol. Mais la naphtalne dioxygnase (EC 1.14.12.12) prsente des capacits poustouflantes par la varit des substrats exposs sa vindicte, et va encore plus loin que la tolune dioxygnase. On lui connat le pouvoir de catalyser au moins 75 ractions ! En outre lenzyme est stro-slective, c'est--dire que les produits forms sont des nantiomres dtermins. Une proprit susceptible de faciliter la prparation d'intermdiaires asymtriques dans la synthse de molcules pharmaceutiques. Nous savons que la dioxygnase hydroxyle lindole et conduit la formation d'indigo [32], et cette proprit sert de base un test colorimtrique trs commode pour les dosages de lenzyme. La naphtalne dioxygnase fait partie des nombreuses protines du mme type aujourdhui caractrises, sans compter celles dont la prsence a t dtecte par le squenage des gnes (plus de 40 sur la base des homologies). Rappelons ses caractres essentiels. Loxygnation est ralise par un ensemble de trois protines formant une courte chane doxydorduction entre le NAD(P)H et loxygnase proprement dite, comme pour la dioxygnase du tolune. Loxygnase terminale (ISP) est un homo-multimre plusieurs sous-units identiques ou un htro-multimre de sous-units et en nombre gal. Chaque chane renferme un noyau fer-soufre de type RIESKE et un site actif monomtallique contenant du fer. La naphtalne dioxygnase dun Pseudomonas est un hexamre 33, et sa structure dtaille est maintenant disponible [33]. La plupart des dioxygnases de ce type ont une spcificit lastique et sont stroslectives. Elles fonctionnent volontiers la fois comme dioxygnases du cycle aromatique ou comme mono-oxygnases. On spargnera le catalogue fastidieux de toutes les ractions catalyses par la naphtalne dioxygnase, pour ne retenir que des exemples caractristiques. Pour faciliter le cas chant les recherches, les substrats connus pour chaque mode ractionnel sont lists en note. Dioxygnase dhydrocarbures aromatiques 9 Le substrat phare est videmment le naphtalne. Loxydation seffectue le plus souvent sur un cycle, parfois sur un substituant latral [34]. Lenzyme attaque aussi le 1,2-dihydronaphtalne, avec obtention de diffrents nantiomres selon les souches [35]. Nous retrouvons ici l'attaque du styrne entrevue antrieurement. 8 - Lorthographe anglo-saxonne tant naphthalene. 9 - Exemples de substrats : acnaphtylne ; anthracne ; benzocyclohept-1-ne ; biphnyl ; 9,10-dihydroanthracne ; dihydronaphtalne ; 9,10-dihydrophnanthrne ; 2,6- ou 2,3-dimthylnaphtalne ; fluorne ; indne ; indnol ; 2-mthoxynaphtalne ; naphtalne ; naphtoque (acide) ; 2-nitronaphtalne ; phnanthrne ; styrne. Les produits forms partir des substrats reprsents sont : cis-(1R,2S)-dihydroxy-1,2-dihydronaphtalne, cis-(1R,2S)-indanediol, (2R,3S)-dihydro-2,3-dihydroxybiphenyl, cis-(1R,2S)-dihydroxy-1,2-dihydroanthracne, (R)-1-phnyl-1,2-thanediol.
378
naphtalne
indne
biphnyl
anthracne
styrne
OH OH
OH
OH
OH
OH
OH OH
CH2OH OH
Dioxygnase de composs htrocycliques 10 Lindole est lun de ceux-l. Le dihydrodiol form se dshydrate et soxyde lair pour donner lindigo. Le dibenzothiophne est un xnobiotique quaucun organisme connu narrive seul dgrader. La dibenzo-1,4-dioxine est le noyau de base des dioxines polychlores sur lesquelles nous reviendrons plus tard. Laction de la dioxygnase symbolise ici nest pas le seul mode dattaque sur cette dioxine [32,36].
OH OH N H indole OH OH O O dibenzo-1,4-dioxine O O N H N H oxydation et dimrisation N H H 2O OH O H N
O indigo OH OH
S dibenzothiophne
Mono-oxygnations (nombreuses) 11 Parmi les substrats, nous retrouvons le tolune qui est transform en alcool benzylique [37]. Lenzyme catalyse plusieurs ractions la suite sur lthylbenzne, conduisant lactophnone comme intermdiaire 12. On voit que la mono-oxygnation porte volontiers sur un carbone satur.
10 - Dibenzo-1,4-dioxine ; dibenzofurane ; indole. Les produits forms (ligne du bas) sont le cis-(1R,2S)-dihydroxy1,2-dihydrodibenzothiophne et le cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydrodibenzo[1,4]dioxane. 11 - acnaphtne ; acnaphtne-1-ol ; benzocyclobutne ; carbazole ; 9,10-dihydrophnanthrne ; indane ; indne ; 1- ou 2-indanone ; thylbenzne ; tolune ; 1,2,4-trimthylbenzne. 12 -Le passage du 1-phnthylalcool lactophnone nest pas catalys par une dshydrognase, ce quon pourrait penser a priori, mais par la dioxygnase, selon un mcanisme discut par LEE et GIBSON (1996). Un phnomne du mme genre a t aperu dans le cas de la tolune dioxygnase.

CH3 CH2OH C2H5 CH3 OH O CH3 O CH3
379
OH
tolune CH2OH CH3
thylbenzne
actophnone
CH2OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 CH2OH CH2OH OH 9-fluornol fluorne
CH3 1,2,4-trimthylbenzne
CH2OH
Ractions de dsaturation et O- ou N-dsalkylation sur divers composs 13 Lanisole et le phntole sont transforms en phnol, lthylbenzne est transform en styrne [38]. Celui-ci est oxyd son tour par oxygnation de la double liaison vinylique.
CH3 CH2
OCH3 anisole
OH phnol
OC2H5 phntole thylbenzne styrne
Des sulfoxydations 14 Un atome doxygne est fix au soufre [39]. La dimthylsulfure est un compos naturel et son oxydation en dimthylsulfoxyde intervient dans lenvironnement. Loxydation concerne ici des sulfures varis dont voici seulement trois exemples.
CH3 S CH3 S O S dibenzothiophne S O O2N mthyl-phnyl-sulfure O2N mthyl-p-nitrophnyl-sulfure CH3 S CH3 S O
13 - Sur anisole 1,2-dihydroxynaphtalne, N,N-dimthylaniline, thylbenzne, indanol ; indane, N-mthylaniline ; N-mthylindole, phntole. 14 - Dibenzothiophne ; thyl-phnylsulfure ; 2-mthylbenzo-1,3-dithiole ; mthyl-phnylsulfure ; mthylp-nitrophnylsulfure ; mthyl-p-tolylsulfure. Transforms en sulfoxydes correspondants.
380
Revenons la structure de la naphtalne dioxygnase. Rappelons que lenzyme est un hexamre 3 3, avec un site actif et un fer-soufre sur chaque sous-unit . Voici la squence des 409 acides amins de ces sous-units dans lenzyme de Pseudomonas aeruginosa.
MNYKNKNLVS VDEVIVSRQN KELYGEALDK ELIGPPGKVI QMTSKYGSGM FPNNSFLTCS DDNDNMETVS GAHISSSSWA ESGLTQKHLI DGSIRAFLNV KCMGLKEVAR IKANWKAPAE GVLWDGYSGV GVFKVWHPID QNAKKYQSRD EFEDVSKNWH HGDEELFQRE CRHRGKTLVH VESFHGFIYG NFTGDAYHVG HSADLVPELM ANTTEVWTYA GDLVSNLGFG TELAKTTDR LETIFARNWL AEAGNAKGFV CFDEEAPSLK WTHASSLRSG AFGGAKQERL MVEKDMPEDL GDVYGDEVYP FLTHDSLIPS CSYHGWGFGA DYMGDAGWYL QSVFSSLAGN NKEIGEVRAR KRRLVDAVQR GIVGKSAIGE PGDYVTAKMG (60) NGELQSVPFE (120) EPMFKHSGGL (180) AALPPEGAGL (240) IYRSHLNCTV (300) TFGPAGFWES (360) TSYRGFYRAY (420) (449)
Huit positions ont t soulignes et concernent linstallation de trois Fe dans la chane polypeptidique : un noyau [2Fe-2S] du type RIESKE (avec 2 chanes de cystine, deux dhistidine) rvl par une squence consensus, et un ion Fe au centre actif. La disposition est schmatise par un dessin inspir de PARALES et coll. (1999), les boules noires tant les ions mtalliques. Loxygnase reoit les lectrons un un par un noyau fer-soufre sur une sous-unit , qui les communique au site actif dune sous-unit voisine, probablement par la connexion histidineaspartate (H104-D205) suggre par des expriences de mutagense [40]. La ligne courbe transversale symbolise la surface de contact entre les deux sous-units. Le fer du site actif est coordonn par H208, H213, D362, et une molcule deau. Il est possible que celle-ci soit assez mobile pour tre dplace par larrive du substrat et d'O2.
C81 S H S H83 N N N H208 N O O D205 N N OH H S H104 O S H C101
D362 H213 O N N
Site actif de la naphtalne dioxygnase et transfert dlectrons

Dans la structure 33 de lenzyme les chanes (50 kDa) forment une association triangulaire visible sur le dessin, ainsi que la position du fer (boules noires). On vrifie que chaque fer-soufre est proche du site actif appartenant la sous-unit voisine. Un autre dessin montre le triangle form par les trois sous-units .
381
Chacune est reprsente par sa chane principale et ses trois atomes de fer associs (boules noires). Les chanes (20 kDa) ne sont pas figures.
[2Fe-2S] de 2
site actif de 1
Le squelette de la chane 1 est en trait paissi pour montrer le rapprochement entre son site actif et la paire dions Fe du centre fer-soufre de la sous-unit voisine. Le fer-soufre de chaque sous-unit est ainsi port par une sorte de prolongement qui vient embrasser la chane voisine (en face des petites flches du dessin). La formation de bras structuraux mis par les replis de la chane, certainement indispensables ici au transfert interne des lectrons, nest pas rare dans les protines oligomriques en gnral. Elle facilite lancrage des chanes polypeptidiques les unes aux autres et consolide lensemble (voir structure quaternaire*). Les recherches sur cette protine devront lucider le cheminement des lectrons en provenance de lextrieur en amont, dterminer plus prcisment le mode dinsertion des diffrents substrats et le mcanisme chimique de la raction. On envisage dj de modifier par mutation la cavit du site de faon faciliter lattaque de nouveaux substrats, et cest donc une affaire suivre. Les bactries n'ont pas l'exclusivit de la premire attaque du naphtalne et analogues. Les champignons sont de la partie mais adoptent une stratgie diffrente. Une mono-oxygnation forme un poxyde partir du naphtalne chez Cunninghamella elegans, suivie d'une ouverture en naphtol (majoritairement le 1-naphtol). Le
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mtabolisme ultrieur reprsente un mode doxydation qui rappelle celui qui est pratiqu dans le foie des mammifres [41]. Le passage du naphtalne au 1-naphtol est assez commun dans la nature. Il est rpandu chez les algues vertes, les diatomes, mais existe aussi chez certains procaryotes (Bacillus cereus) [42].
H H2O H O H trans-diol OH naphtalne (poxyde) OH H OH OH OH
1,2-dihydroxynaphtalne O
1-naphtol
H OH 4-hydroxy-1-ttralone
Attaque du naphtalne par les champignons

La configuration trans du dihydrodiol est caractristique l encore des eucaryotes. Il ne renferme quun seul atome doxygne provenant d'O2, car une mono-oxygnase (souvent un cytochrome P450) produit un poxyde, et le deuxime atome doxygne est apport par une molcule deau. Le mcanisme chimique observ implique un dplacement NIH (NIH-shift*). La formation du 1-naphtol a t observe aussi chez des cyanobactries. Elle mrite ici une mention, car cest un produit toxique dans lenvironnement dont lapparition fortuite est possible dans diverses biodgradations. Les champignons sont susceptibles de loxyder par une laccase, dont leffet est dentraner la formation de polymres bruntres. Une sorte de dtoxification effectue par le champignon.
8.6 - LABONDANCE NATURELLE DES PHNOLS

Les phnols sont souvent des produits polluants peu apptissants pour nous, leur limination facile est gnralement souhaitable. Le phnol ordinaire ou hydroxybenzne est un produit majeur de la grande industrie en servant de prcurseur pour la fabrication de nombreux ingrdients de la vie moderne. Sa synthse est ralise plus de 90% par peroxydation du cumne et engendre en mme temps de lactone. Le phnol est aussi un xnobiotique et un polluant toxique faible taux pour les tres vivants. Il devient dangereux dans leau des rivires ds que sa teneur atteint 1 mg/L. La nature ralise pourtant une grande varit d'ingrdients phnoliques, dont le premier d'entre eux est la L-tyrosine. Les composs phnoliques sont particulirement nombreux dans le rgne vgtal, et appartiennent la chimie de la lignine, des tannins et des flavonodes. On les trouve aussi dans les lichens et les champignons. Ils font souvent office d'agents protecteurs en aidant les vgtaux se dfendre contre les bactries et les champignons.
383
Depuis des temps immmoriaux, les organismes arobies se sont habitus synthtiser, modifier et dgrader les composs phnoliques naturels l'aide de stratgies performantes. Larrive des xnobiotiques rpandus dans lenvironnement au cours de lre industrielle na pas ncessairement cr de "surprise chimique", car les enzymes existantes taient parfois capables de les prendre pour cible quand leur spcificit tait assez lastique. Grce une forte slection et des remaniements gntiques, la microflore a pu sadapter dans de nombreux cas, et cest heureux pour nous car sans cela la plupart des phnols artificiels ne seraient pas biodgradables. Lun des procds dattaque observs consiste introduire un deuxime hydroxyle adjacent au premier sur le noyau aromatique, faisant apparatre ainsi la structure dun catchol. Cette opration est du ressort des oxygnases. Une seule hydroxylation transforme le phnol ordinaire en catchol 15. Dans dautres cas, les chanes latrales au noyau sont attaques et raccourcies par oxydation pour tre remplaces par un hydroxyle. Loxygne rgne en matre dans toute cette affaire, comme dans cet exemple de conversion du 4-hydroxybenzoate en protocatchuate (3,4-dihydroxy-benzoate) :
COO NADPH + H+ NADP+ COO
OH OH 4-hydroxybenzoate O2 H 2O OH protocatchuate
Raction de la 4-hydroxybenzoate hydroxylase

Le substrat mono-phnolique a t transform en un driv du catchol. Le noyau aromatique a subi une mono-oxygnation, qui correspond ici son hydroxylation. Nous retrouvons le principe des mono-oxygnations ordinaires o la source dlectrons auxiliaire, ici NADPH, sert rduire lun des deux atomes de la molcule O2. Dans lexemple suivant le passage une structure de type catchol est un peu plus compliqu et concerne la mono-oxygnation du vanillate sur son mthoxyle (OCH3). Les deux atomes d'O2 devraient se rpartir entre une molcule d'eau et le formaldhyde, mais celui-ci peut tre pris en charge par le ttrahydrofolate (FH4) l'aide d'une mthyltransfrase [43].
COO NADH + H+ NAD+ COO FH4 H2O mthnyl-FH4 formiate
+
OCH3 OH vanillate O2 H2O OH protocatchuate OH
H H ATP
formaldhyde
Du vanillate au protocatchuate
15 - Appel encore parfois pyrocatchol, obtenu par distillation du cachou, lui-mme tir dun Acacia dAsie mridionale. Le catchol est un rvlateur photographique. Les catchols en gnral sont facilement oxydables l'air et complexent facilement des mtaux. Ils entrent dans diverses ractions de polymrisation.
384
La dmthylation d'un groupe mthoxyle sur ce principe cre une nouvelle fonction phnolique [44]. Cest un mcanisme important dans la nature, car il intervient dans la biodgradation de la lignine et ses drivs, qui sont gnralement trs mthoxyls. Quant au protocatchuate, nous le retrouverons comme intermdiaire extrmement courant dans de nombreuses transformations. Lapparition du motif catchol sur le cycle aromatique a un triple effet. Le premier est de former une structure qui pige efficacement les mtaux. Le second est de rendre le cycle beaucoup plus fragile loxydation. Le troisime est d'accrotre le caractre hydrophile, donc la solubilit dans l'eau. cela s'ajoute un quatrime effet : loxygne dissous en solution aqueuse ragit spontanment avec les catchols pour donner des quinones ou des radicaux intermdiaires qui tendent se polymriser en donnant des produits colors. Cette raction lente en milieu acide devient trs rapide au-dessus de la neutralit 16.
COOH OH CH3 OH OH 5 4 CH3 3 catchol 2 1 11 10 CH3 CH3 OH OH 9 6 7 8 COOH CHOH COOH NH2 COOH
NH
Prcurseur : 1 - Benzne ; 2 - Naphtalne ; 3 - Tolune ; 4 - Phnol ; 5 - o-Crsol ; 6 - Acide salicylique ; 7 - Acide anthranilique ; 8 - Acide benzoque ; 9 - Acide mandlique ; 10 - o-Xylne ; 11 - Indole.
Le carrefour du catchol
16 - Le catchol en solution brunit rapidement pH suprieur 7. Lentit oxydable est probablement lanion form par la perte dun premier proton. Les deux fonctions phnoliques ont comme pKa 9,45 et 12. La prsence de groupes attracteurs d'lectrons sur le cycle, par exemple de un ou plusieurs atomes dhalogne, tend abaisser le premier pKa et rend le phnomne dautant plus rapide.
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Les catchols sont les cibles des dioxygnases, enzymes qui vont introduire ici deux nouveaux atomes doxygne dans la molcule et provoquer louverture du cycle. La figure ci-dessus souligne de faon simplifie le rle de carrefour du catchol dans la dgradation de maints composs phnoliques et non-phnoliques. Dautres molcules sont attaques pour donner des catchols substitus, comme nous en verrons des exemples. Les catchols ne sont pas les intermdiaires obligatoires du mtabolisme des phnols. Par exemple lacide salicylique indiqu ci-dessus peut aussi tre hydroxyl en acide gentisique [45]. Le salicylate est un intermdiaire de la dgradation du naphtalne, du m-crsol et du 3-hydroxybenzoate [46]. Le salicylate est hydroxylable deux endroits diffrents et les voies de transformation divergent en fonction des espces et des conditions de croissance.
COO OH HO salicylate O2 H2O gentisate NADH + H+ NAD+ COO OH
Raction de la salicylate 5-hydroxylase

Le protocatchuate est un autre carrefour mtabolique engendr partir du phnanthrne dans un Pseudomonas [47]. Cet hydrocarbure fait partie des PAH, sigle anglo-saxon souvent utilis dans la littrature internationale pour dsigner les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP en franais). Des bactries attaquant le phnanthrne peuvent tre isoles des sols souills par du carburant pour diesel. L encore existent au moins deux voies de transformation, lune conduisant au catchol et l'autre au gentisate.
OH COO COO COO OH phnanthrne 1-hydroxy-2-naphtoate OH protocatchuate COO
o-phtalate
L'une des voies du phnanthrne

Nous voyons que les cycles sont entirement dtruits les uns aprs les autres. L'attaque des hydrocarbures aromatiques polycycliques conduit un nombre restreint dintermdiaires cls, dont les plus importants appartiennent aux familles du catchol, du gentisate et du protocatchuate. La destruction de ces hydrocarbures converge gnralement vers des voies relativement simples malgr l'norme diversit des composs de dpart. Les grandes lignes de ces mtabolismes ont t lucides aprs les annes soixante, et les chapitres suivants permettront de sen faire une ide.
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8.7 - DRIVS NITRS

Lespoir des dfenseurs de lenvironnement est de voir liminer le plus rapidement possible les pollutions par divers xnobiotiques, et lexistence denzymes capables de faire le mnage dans plusieurs directions fait dresser loreille. Les composs nitrs naturels sont rares sauf dans certains antibiotiques. Les nitro-aromatiques de l'environnement proviennent en majorit de l'activit humaine. La combustion incomplte des carburants en libre. Les nitrotolunes et nitrophnols sont utiliss comme solvants dans lindustrie des colorants et des pesticides, et dans la fabrication dexplosifs du type trinitrotolune (TNT). Les premiers progrs sur cette question ont d'ailleurs t raliss par J.C. SPAIN et coll. dans le laboratoire d'une base arienne militaire en Floride (Tyndall). Le nitrobenzne est une matire premire pour la fabrication de l'aniline. Heureusement l'limination biologique de ces composs est possible et des souches capables de se dvelopper sur eux ont t isoles. Les hydrocarbures aromatiques nitro-substitus ont t longtemps considrs comme rfractaires lattaque lectrophile des oxygnases par suite du caractre attracteur dlectrons du groupe nitro, qui appauvrit le cycle. Par contre ces mmes produits, lorsquils sont porteurs en plus dun substituant polaire, comme dans les nitrophnols ou les nitrobenzoates, sont connus comme facilement biodgradables [48]. La dgradation biologique des nitrodrivs suit au moins quatre stratgies diffrentes. La premire est l'limination du groupe nitro en nitrite par une mono-oxygnase. La seconde consiste insrer sur le cycle deux hydroxyles par dioxygnase avec limination du groupe nitro. Un troisime procd est la rduction du groupe NO2 en hydroxylamine et amine, facilite par la prsence de plusieurs substituants nitro. La dernire enfin est une rduction partielle du cycle qui le dsaromatise et facilite le dpart du groupe nitro 17. Le 2-nitrotolune est un exemple de xnobiotique auquel la nature sest adapte, quitte dtourner des enzymes existantes ou en faire de nouvelles. Nous retrouvons ici la tolune 2,3-dioxygnase de Pseudomonas putida F1. Sa souplesse d'action lui fait oxyder tantt le cycle dans le cas du tolune et du 4-nitrotolune, tantt le groupe mthyle du 2- ou du 3-nitrotolune. Dans le premier cas cest une dioxygnase, alors quelle fonctionne comme mono-oxygnase dans le second. La figure rsume la situation [49]. On voit tout de suite que le groupe nitro est ici prserv. Il sera ventuellement limin en aval aprs ouverture du cycle. Le mthyle des 2- et 3-nitrotolunes (2NT, 3NT) est oxyd. La situation reprsente nest ni unique, ni gnrale. Par exemple la tolune mono-oxygnase dite xylne mono-oxygnase mentionne plus haut (celle qui oxyde le mthyle du tolune) noxyde pas le 2-nitrotolune, mais attaque les 3NT et 4NT [50].
17 - Une premire rduction du cycle fait un driv cyclo-dine appel en chimie complexe MEISENHEIMER.

CH3 CH3 NO2 NO2 2 NT 3 NT 4 NT NO2 CH3 CH3
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tolune
CH3 OH OH
CH2 OH NO2
CH2OH
CH3 OH
NO2 NO2
OH
CH3 OH OH
COOH
CH3 OH NO2 NO2
CH3 OH OH NO2
Oxydation du tolune et des nitrotolunes

Le 2-nitrophnol (2NP) figure au menu dune oxygnase qui a t purifie partir dun Pseudomonas putida (souche B2) cultiv sur o-nitrophnol comme seule source de carbone et dazote [51]. Le substrat est transform en catchol et nitrite par une oxygnase flavinique de 65 kDa, utilisant NADPH comme source d'lectrons, et qui est stimule par les ions Mg2+, Mn2+ et Ca2+. La possibilit quont les bactries dhydroxyler dautres substrats porteurs de substituants supplmentaires ne signifie pas quelles peuvent sen contenter pour leur croissance, car leur mtabolisme est souvent bloqu en aval en conduisant une impasse. Le produit terminal est alors vacu dans le milieu o il s'accumule. Ce problme est souvent crucial dans les biodgradations. Il faut non seulement que les enzymes comptentes soient prsentes, mais que les intermdiaires forms puissent tre traits. dfaut apparat un mtabolisme en cul-de-sac, avec blocage denzymes et accumulation d'intermdiaires aux effets toxiques. Quelques entits comme le 2,4-dinitrophnol sont inhibiteurs dentre de jeu avant mme d'tre transforms.
OH NO2 OH NO2 OH NO2 OH NO2 OH NO2
CH3 substrats
Cl
CHO
NO2 (inhibiteur)
Substrats et inhibiteur de l'o-nitrophnol mono oxygnase
388
La mono-oxygnase du 2-nitrophnol a la particularit dtre une flavoprotine, de conception trs diffrente de celle des oxygnases de la section prcdente. Lenzyme na quune seule chane et son cofacteur FAD se charge de tout, c'est--dire de rcuprer les lectrons du NADPH, dactiver loxygne et doxyder la source. Une solution apparemment simple se retrouve dans la mono-oxygnase du 4-nitrophnol. Certaines espces (Arthrobacter JS443 et un Moraxella) sont capables de se dvelopper sur 4-nitrophnol comme seule source de carbone [52]. Cest encore une oxygnase qui se charge de la premire tape ; lhydroxylation se fait ct du groupe nitro ou son niveau. Le rsultat est la p-benzoquinone ou le 4-nitrocatchol. Une figure explique loxydation du p-nitrophnol selon ces deux possibilits, car elles sont assez reprsentatives de ce qui s'observe sur ce type de substrat.
H2O NO2 NAD+ O2 NADH OH O benzoquinone OH hydroquinone O 2 H+ +2 e OH
OH NO2 O2 NADH, H+ OH
O NO2
OH OH
H2O NAD+
NO2 O2 NADH NO2
O H2O NAD+ 2H +2e

+
OH 1,2,4-THB
Oxydation du p-nitrophnol
Plusieurs observations importantes sont en tirer : Les deux modes utilisent une mono-oxygnase pour liminer le substituant azot sous forme de nitrite (NO2). Les oxygnases du nitrophnol ou du nitrocatchol sont de nature flavinique. Elles sont gnralement monomriques avec une masse de lordre de 65 kDa, contiennent du FAD, et utilisent NADH ou NADPH comme source dlectrons. Le mthimazole, un antithyrodien, est un inhibiteur. Ces enzymes catalysent parfois plusieurs ractions successives comme chez un Bacillus, o le p-nitrophnol est transform en 1,2,4-THB [53]. Le dpart du substituant nitro correspond la rduction du groupe azot. Pourquoi ? On peut le comprendre en revenant aux proprits du noyau aromatique. La nitration du cycle seffectue presque toujours comme les autres substitutions par une attaque lectrophile, ici par lacide nitrique en prsence dacide sulfurique. Ce dernier agit en quelque sorte comme un dshydratant selon : H2SO4 + HNO3 HSO4 + H2O + NO2+
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Lentit attaquante thorique est donc NO2+ ou ion nitronium 18. Lexpulsion de celui-ci partir dun nitro-aromatique est assez dfavorable sur le plan thermodynamique, car il y a prfrence pour la raction inverse. Par contre la sortie du nitrite, qui correspond thoriquement la rduction de lion nitronium, est beaucoup plus favorable. Consquence : le substrat de loxygnase est la fois hydroxyl, rduit sur lazote et oxyd sur le cycle pour devenir une quinone. Le compte est bon ! La quinone est considre comme un intermdiaire mme lorsquelle na pas t formellement isole. Sa rduction facile aux potentiels redox physiologiques produit une hydroquinone, soit ici le 1,2,4-trihydroxybenzne (1,2,4-THB) [54]. Le cycle d'une hydroquinone est en gnral facilement rompu par dioxygnase. Dans tous les cas, lhydroxylation et le dpart du groupe nitro rendent lattaque ultrieure beaucoup plus facile. Le fait essentiel concernant llimination du groupe nitro est sa rduction en ion nitrite. D'autres substituants seront galement soumis rduction, tel le chlore, qui sera vacu sous forme de chlorure. Le dessin montre la dioxygnase du 2-nitrotolune en catchol par un Pseudomonas (JS42). Par comparaison avec la mme raction sur le benzne, il est facile de voir que l'expulsion du nitrite rend inutile l'intervention d'une dshydrognase [55].
CH3 NO2 O2 NADH NO2 (instable) CH3 NO2 OH OH NO2 CH3 OH spontane OH
2 NT
2-nitrotolune dioxygnase
Quant au 2,4,6-trinitrotolune ou TNT, un solide jaune bien connu, c'est un parfait xnobiotique fabriqu par lhomme et qui nest malheureusement pas utilis uniquement pour les travaux publics.
CH3 O2N NO2 CH3 TNT NO2 HO OH I II NO2 III IV NH2 V NO2 NO2 O2N O2N CH3 NHOH CH3 NH2 NO2 O2N CH3 NH2 CH3 NH2
Trinitrotolune et drivs
18 - Lacide nitrique concentr est un mauvais agent de nitration parce quil y a trs peu de nitronium libre. Le contrle du taux de cet ion en solution rgle la vitesse des nitrations. Dans lacide sulfurique 95% la scission de lacide nitrique est quasi complte.
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Il contamine accidentellement les sites de fabrication (arsenaux militaires, usines travaillant pour la Dfense).Il est toxique pour les algues et les invertbrs, dangereux pour la sant des humains o il peut induire des altrations de la fonction hpatique, des anmies, des irritations de la peau et des effets cancrignes (en dehors d'autres actions collatrales bien connues !). En fonction de ce qui prcde, on pourrait penser que la destruction biologique du TNT devrait seffectuer par oxygnations successives faisant partir les groupes nitro sous forme de nitrite. Un Pseudomonas sest montr capable dattaquer le 2,4-dinitrotolune [56]. Une premire transformation catalyse par une dioxygnase trois composants fait du 4-mthyl-5-nitrocatchol (l'quivalent du compos I sans l'hydroxyle) et libre du nitrite. Le deuxime substituant nitro est enlev par une mono-oxygnase. Ces deux tapes sont gouvernes par des gnes plasmidiques autorisant la destruction complte du cycle aromatique. Pour le TNT, cest autre chose. La dgradation du TNT en arobiose est souvent plus difficile et moins complte quen anarobiose, et aucune souche bactrienne pure na t isole comme capable de minraliser entirement le substrat. Lattaque commence gnralement par la rduction de lun des groupes nitro l'aide de nitrorductases NAD(P)H encore mal caractrises et peu spcifiques. La rduction du groupe nitro se fait deux lectrons en nitroso, puis hydroxylamino (RN=O, RNHOH), donnant des intermdiaires ractifs qui sont susceptibles de donner des effets toxiques. Ces rductions sont favorises dans le cas des nitro-aromatiques, parce que la rsonance entre le groupe nitro et le cycle rend l'atome d'azote lectrophile. Or le cycle lui-mme est lobjet dattaques lectrophiles qui peuvent tre renforces par un groupe donneur comme un mthyle, ce qui est le cas du tolune. Un mthyle comme celui du tolune est donneur et renforce lattaque lectrophile sur le cycle. Un substituant amin uvre dans le mme sens. Une situation de conflit oppose donc la rduction du groupe nitro et la dioxygnase du cycle. Lorsque le groupe nitro est seul, il n'arrive pas faire le poids face un mthyle, et nous avons vu que l'attaque du 2-nitrotolune commence effectivement par une dioxygnase. Le dpart du groupe azot en nitrite est une raction secondaire. Par contre lorsque plusieurs groupes nitro sont prsents, lunion fait la force. Dans le TNT qui en a trois, la rduction du premier groupe en fonction amine tend tre trs rapide et fait du 2-amino-4,6-dinitrotolune(III). La deuxime rduction conduisant au 2,4-diamino-6-nitrotolune(V) est un peu plus difficile, d'autant que le nouveau substituant amin tire en sens inverse, et la rduction exigera un potentiel redox plus bas, largement infrieur 200 mV. Parmi les germes actifs sont des souches de Pseudomonas (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. savastanoi 19), des Bacillus, Staphylococcus et autres [57]. Les bactries arobies parviennent rduire deux des trois groupes nitro du TNT, la rduction du troisime requiert des anarobies. La minralisation du TNT peut soprer par compostage et en prsence dune population bactrienne composite. Les nitrorductases* sont extrmement rpandues dans les populations bactriennes et catalysent l'tape initiale de l'attaque arobie des nitro-aromatiques.
19 - Un phytopathogne sur haricot.
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Ces enzymes sont souvent flaviniques et utilisent NADH ou NADPH comme source d'lectrons. Dans d'autres cas interviennent un cytochrome P450, un cytochrome b5, la xanthine dshydrognase ou la quinone rductase. Les nitrorductases diffrent les unes des autres par leur mcanisme et leur sensibilit l'oxygne atmosphrique [58]. Leur importance pratique dans les biodgradations vient de la nature de leur activit. La rduction des groupes nitrs engendre des intermdiaires radicalaires hautement mutagnes ou toxiques. Ces transformations peuvent se produire dans le tube digestif par la flore intestinale, et c'est pourquoi l'ingestion accidentelle de nitro-aromatiques prsente un risque pour la sant. On connat aussi une dnitration sans oxygnation (par attaque nuclophile avec un hydrure) qui transforme par exemple le TNT en 2,4-dinitrotolune, ou une rduction sur lazote conduisant aux composs II, III et V, ou encore une dnitration avec rduction conduisant IV 20. En rsum, il existe deux faons d'liminer les groupes nitro. La premire utilise des oxygnases, qui font partir l'azote sous forme de nitrite. La seconde est l'uvre des nitrorductases, qui engendrent des groupes amins sur le cycle. Elle est commune en anarobiose. Qu'en est-il des amines aromatiques ?
NH2 O2 H2N OH OH H OH OH
aniline
NADH
NH3
Celles-ci sont gnralement biodgradables, en particulier le premier terme qui est l'aniline. Dans le cas d'une attaque par dioxygnase, l'aniline est transforme en catchol, dont le mtabolisme se fait par des voies classiques examines dans les chapitres suivants. De multiples souches capables de dgrader l'aniline ont t dcrites dans la littrature. Cette proprit est invariablement inductible et dtermine en principe par des plasmides [59]. Elle peut se montrer extraordinairement efficace puisqu'une souche de Delftia isole de boues d'puration a t vue se dvelopper sur l'aniline 5 g/L [60] ! L'aniline dioxygnase fonctionne sur le mme principe que les enzymes du benzne et du tolune, avec deux sous-units et en association avec une rductase et une ferrdoxine. L'ammoniac n'est pas libr tel quel mais pris en charge par une protine qui est induite en mme temps que la dioxygnase. Ce qui est intressant dans le cas de ces plasmides de biodgradation de l'aniline, c'est qu'on trouve entre eux la fois des ressemblances trs nettes alors que les espces bactriennes sont elles-mmes trs diffrentes. En outre on dtecte des lments d'insertion, et l'on a mme reconnu dans un cas le gne de ce qui semble tre une transposase. Autrement dit, on a l'impression que les gnes de l'aniline ont t largement rpandus par transferts gntiques horizontaux entre des
20 - 2-hydroxylamino-4,6-dinitrotolune (II), 2-amino-4,6-dinitrotolune (III), 2-amino-4-nitrotolune (IV), 2,4-diamino-6-nitrotolune (V).
392
bactries appartenant des espces distinctes [61]. C'est un mcanisme qui apparat de plus en plus comme banal. La biodgradation des drivs azoques mrite un dtour. Le plus simple dans la srie aromatique est l'azobenzne ou C6H5N=NC6H5, dcouvert en 1834 par MITSCHERLICH. C'tait l'amorce de ce qui devait se dvelopper aprs 1858 (Peter GRIESS) comme l'norme industrie des colorants d'aniline ou colorants azoques. Un thme bien connu de chimie classique. Il y a d'abord diazotation en sel d'une amine aromatique ou htrocyclique par un nitrite en milieu acide, et formation d'un diazonium. Celui-ci ragit son tour comme lectrophile sur un cycle aromatique (gnralement en position para si le cycle est substitu), la raction tant dite de copulation. Il y a actuellement prs de 3 000 colorants commercialiss dont plus de la moiti sont des azoques souvent porteurs de substituants halogns ou de type nitro et amino. Il n'est donc pas tonnant que ces produits se retrouvent dans l'environnement, o ils sont dtruits par la microflore ou par des ractions photochimiques. La scission de dpart des azoques est une rduction anarobie de la liaison entre atomes d'azote. Relativement non spcifique, elle peut s'appuyer sur des flavines rduites. Ainsi des bactries du genre Desulfovibrio utilisent le TNT comme source d'azote. Les trois substituants sont alors rduits successivement en amines, la premire rduction tant la plus rapide, la dernire la plus lente. Le produit form est le triaminotolune. Au contraire la destruction des produits de rupture qui sont des amines aromatiques, est faite de prfrence en milieu oxygn [62]. En somme le cadre le plus favorable l'limination des azoques est une puration par anarobiose suivie d'oxygnation. Cette opration peut dmarrer dans une installation de type UASB*, o s'oprent une mthanisation et diffrentes actions anarobies. Les mthanognes collaborent au dmarrage du processus, mais il convient de prciser que leur action est gne par les nitrodrivs. Un aromatique nitr est environ 500 fois plus toxique dose gale que le produit amin correspondant dans les mmes conditions. L'limination des groupes nitro est donc cruciale. Ils ne doivent pas excder 0,1 mM en ordre de grandeur. Les meilleurs rsultats ont t obtenus sur granules mthanognes supplments avec une source d'lectrons comme le glucose. On sait que la mthanisation de composs organiques varis, voire des xnobiotiques, est favorise en population mixte comportant des mthanognes, des actognes et autres germes anrobies. Un schma propose le mtabolisme probable d'un colorant, le Mordant Orange 1.
O2N N N HO COOH Mordant Orange 1 (red.) O2N NH2 4-nitroaniline NH2 HO COOH acide 5-aminosalicylique (red.) mthanisation (red.) H2N NH2 p-phnylnediamine CO2 CH4 NH4+
Dgradation d'un azoque
393
L'exprience a montr que la minralisation de l'un des intermdiaires, l'acide 5-aminosalicylique, tait ralise dans les conditions de la mthanisation. Cette proprit est bienvenue, car le 5-aminosalicylate est prcisment rpertori comme polluant des eaux en zone industrielle. L'limination de la p-phnylne diamine en milieu anarobie reste problmatique. Sa dgradation doit se poursuivre en arobiose. Tous ces diffrents produits sont fortement indsirables dans l'eau de consommation cause de leurs potentialits plus ou moins cancrignes. Un mtabolisme de colorants azoques a t observ seulement en arobiose. Un grand nombre d'essais ont t publis dans la littrature. Par exemple, le p-amino-azobenzne a t dgrad par une culture mixte de Bacillus subtilis et Stenotrophomonas (Pseudomonas) maltophilia [63]. Revenons au cas gnral des drivs nitrs. Le choix entre oxygnation ou rduction d'un groupe nitro dpend de la nature des substituants sur le cycle. Dans les drivs nitrs du tolune, la ractivit du cycle est influence par le groupe mthyle. Dans les nitrophnols, la rduction d'un groupe nitro isol est facilite par la prsence de chlore et d'hydroxyle, qui agissent en sens contraire d'un mthyle. Les trois composs suivants sont alors rduits, consomms et minraliss comme seule source de carbone, d'azote et d'nergie par diffrents germes :
OH O2N Cl OH NO2 O2N NO2 I Cl II III OH Cl
I - 2-chloro-4,6-dinitrophnol par Rhodococcus erythropolis [64] II - 4-chloro-2-nitrophnol par Pseudomonas N31 (souche construite) [65] III - 2-chloro-5-nitrophnol par Ralstonia eutropha JMP134 [66]
Les champignons oprent diffremment. Des tudes ont t conduites en Belgique avec Phlebia radiata, un basidiomycte lignolytique de la pourriture blanche* [67]. Ltape initiale est une rduction par des rductases intracellulaires ne faisant pas partie de lappareil lignolytique 21, mais la dgradation ultrieure sopre par le jeu dune peroxydase extracellulaire dite MnP qui ncessite des ions manganse, et dtruit rapidement les drivs amins ns du TNT ou du dinitrotolune. Il se forme des quinones. Le principe sapplique aussi dautres espces lignolytiques comme Phanerochaete chrysosporium. Cette perspective est offerte par les champignons l o les bactries semblent perdre un peu leur latin. Le mcanisme de ces peroxydases sera aperu la fin du chapitre 13. En conclusion, l'attaque des nitrodrivs n'est pas l'affaire exclusive des organismes arobies. L'azote est limin sous forme de nitrite ou rduit en amine. La disparition des nitrodrivs est donc ralise surtout par des populations microbiennes mixtes ou au cours d'une succession d'actions enclenches initialement par des anarobies. Plusieurs solutions mtaboliques plus ou moins complexes semblent exister en anarobiose et n'ont pas toutes t rpertories. 21 - C'est--dire qui permet l'attaque de la lignine, essentiellement fonde sur des peroxydases extracellulaires.
394
8.8 - HALOAROMATIQUES
Les drivs aromatiques porteurs dun ou plusieurs atomes dhalogne sont en gnral des xnobiotiques, donc des entits pouvant tre rcalcitrantes. Heureusement l encore, lintervention initiale dune oxygnase facilite la tche. L'accent sera mis sur laction des bactries. Une oxygnation effectue la premire attaque. Il y a deux possibilits, La premire est une oxygnation du cycle ct de lhalogne, qui sera ventuellement limin au cours des tapes ultrieures. Un deuxime mode consiste liminer directement le chlore en ion chlorure par oxygnation. La prsence dun halogne sur le cycle aromatique tend augmenter la polarit de la molcule, value par la mesure du coefficient de partage P entre les phases n-octanol/eau. Compos
Benzne Fluorobenzne Chlorobenzne Bromobenzne Iodobenzne
log P Compos
2,13 2,27 2,84 2,99 3,25 1,4-Dichlorobenzne Hexachlorobenzne Aniline Ac. benzoque Ac. phnoxyactique
log P Compos
3,38 6,18 0,98 1,87 1,26 Biphnyle Phnol 4-Chlorophnol 2,4-Dichlorophnol Pentachlorophnol
log P
3,86 1,46 2,39 3,08 5,01
Nous choisirons ici la dgradation des produits chlors. Les deux possibilits sont compares par des exemples. Un dichlorobenzne est transform en dichlorocatchol, et le ttrachlorobenzne est chang en trichlorocatchol avec dpart de chlorure.
NADH, H+ O2 NAD+ H2O OH Cl Cl 1,2-dichlorobenzne Cl Cl Cl Cl 1,2,4,5-ttrachlorobenzne Cl Cl (instable) NADH, H+ O2 NAD+ H2O Cl Cl Cl OH OH Cl Cl OH Cl Cl 3,4-dichlorocatchol Cl OH Cl Cl 3,4,6-trichlorocatchol OH NAD+ NADH, H+ OH OH
H+
Dioxygnation du cycle aromatique halogn
395
La diffrence saute aux yeux tout de suite. La dioxygnase sans dchloration fabrique un cis-dihydrodiol classique. Une dshydrognase complte laction et rtablit laromaticit en formant un catchol, dont le cycle sera rompu ultrieurement. Dans le deuxime cas, une dshydrognase est inutile car une paire d'lectrons permet de librer l'ion chlorure. Or toute rduction du chlore appelle en compensation une oxydation ailleurs. Llimination de lhalogne est assimilable une dismutation interne de la molcule : une partie soxyde (le cycle), lautre reoit les lectrons (l'halogne). La premire dioxygnase est pratique sur mono- ou dichlorobenznes par la souche P51 dun Pseudomonas qui est capable de se dvelopper sur ces produits [68]. Cette proprit est confre par un plasmide transmissible (pP51) qui contient un opron tcbAB capable de diriger la transformation des chlorobenznes en un catchol. Un deuxime opron tcbCDEF et un gne rgulateur tcbR concernent le mtabolisme du catchol en aval et nous le laisserons de ct. Dans le premier opron (tcbAB), la partie tcbA est constitue en fait de quatre gnes. Les deux premiers codent pour les deux sous-units de la dioxygnase (une grosse sousunit qui contient le site actif et une plus petite), un troisime code pour une ferrdoxine et le quatrime pour une rductase active sur NADH. Chose intressante, le premier opron est plac sur le plasmide dans un transposon dont voici la disposition entre deux IS*. On remarque la disposition de tcbAB (tcbA tant subdivis en quatre gnes), avec les diffrentes parties qui dirigent la transformation aboutissant au catchol.
IS Aa Ab Ac Ad B IS
oxygnase
ferrdoxine
rductase
dshydrognase
Lacquisition du plasmide par ce Pseudomonas et l'insertion du transposon ont t visiblement dterminantes. La proprit de crotre sur le dichlorobenzne est typiquement le rsultat d'un transfert gntique horizontal. Lensemble a t clon chez un colibacille. Loxygnase sattaque galement au tolune, au naphtalne et au biphnyle. Le deuxime exemple est celui de Burkholderia PS12 capable de dchlorer un ttrachlorobenzne [69]. La biodgradation arobie dun aromatique chlor est en principe dautant plus difficile quil y a davantage d'atomes de chlore sur le noyau. Les composs trs chargs en chlore peuvent donc tre rcalcitrants et persister longtemps dans lenvironnement. Lattaque est base ici sur une dioxygnase qui dchlore partiellement le 1,2,4,5-ttrachlorobenzne [70]. On ne connat actuellement aucune oxygnase active sur le penta- ou hexachlorobenzne, qu'on peut donc souponner d'tre particulirement rmanents. L'hexachlorobenzne a derrire lui une sinistre rputation. Ce fongicide utilis pour les bls de semence a caus entre 1956 et 1961 de graves accidents en Turquie, et plus tard en Arabie. Le produit trs rmanent et concentr par la chane alimentaire s'tait retrouv dans le pain, et une grave intoxication a provoqu la mort de plusieurs centaines de
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personnes par atteinte cutane et neurologique. Le produit passait dans le lait des jeunes enfants, et laissait de graves squelles chez les survivants. Revenons la souche P51 dont la dioxygnase transforme le chlorobenzne en dihydrodiol intermdiaire sans dchloration. Ce systme ressemble celui de la tolune dioxygnase. Les gnes sont groups et codent pour l'habituelle trilogie rductase-ferrdoxine-dioxygnase. Le complexe contient un cation mtallique Fe2+ et son action n'est pas trs slective, car des aromatiques mthyls comme le tolune sont galement transforms. De faon gnrale, ces dioxygnases sont varies dans la nature et forment quatre sous-classes en fonction des homologies de squences et de lordre des gnes. Cette situation a conduit des auteurs sinterroger sur lvolution de ces enzymes et faire une recherche systmatique pour celles qui ont telle ou telle spcificit. Une mthode astucieuse est celle de JOO et coll. [71]. Elle consiste examiner laction des oxygnases exprimes par diffrents mutants, et chaque produit hydroxyl form partir dun substrat aromatique est trait par une peroxydase qui a pour effet de crer des entits colores ou fluorescentes dotes chaque fois d'un spectre caractristique. On devrait donc disposer rapidement dune importante masse de donnes. Puisque ces diffrentes dioxygnases semblent fonctionner peu prs sur le mme modle tout en admettant une gamme diffrente de substrats, la question qui se pose est celle du mcanisme qui oriente l'attaque sur tel ou tel aromatique, par exemple pourquoi un chlorobenzne est oxyd et non pas le tolune et vice-versa. Ce dterminisme est forcment rgl par la squence. Ltude de BEIL et coll. sur la dgradation du tetrachlorobenzne apporte un clairage nouveau [72]. La dioxygnase TecA de Burkholderia prsente une forte homologie avec la tolune dioxygnase (TodC) de Pseudomonas putida. La premire oxyde comme on sait des benznes chlors, mais nattaque pas le benzne. La seconde est active sur tolune et benzne, mais son activit sur chlorobenzne est quasi nulle. Les squences correspondantes sont recombines par gnie gntique, de faon remplacer un morceau dune squence par le fragment homologue venant de lautre squence. Les gnes obtenus sont donc des patchworks partir de deux origines. Ils ont t clons et exprims dans E. coli. La protine obtenue est une chimre conservant lactivit dune dioxygnase, et la gamme des substrats utiliss est analyse. Le rsultat dpend du fragment qui a t remplac. Tantt lenzyme continue se comporter comme la TecA de dpart, tantt cest une tolune dioxygnase. Il existe donc une portion critique pour rgler la spcificit. Elle est situe au niveau de la portion qui lie le fer et nous y avons dj fait allusion. Voici lalignement local entre 4 squences. TcbA est lenzyme de Pseudomonas P51 qui attaque le chlorobenzne et le dichlorobenzne. TecA et TodC sont les protines dont les gnes ont t recombins avec celui de Burkholderia PS12, comme expliqu ici. BphA est la biphnyle dioxygnase dun Rhodococcus [73]. Les substrats attaqus sont indiqus droite. TecA attaque le chlorobenzne, alors que TodC dgrade le tolune et le benzne. Lexamen de plus dune trentaine de chimres et des remplacements dacides amins dtermins dans TodC ont rvl laction dterminante dune position dans la rgion indique.
397
alanine
TcbA TecA TodC BphA
F L F F
A A A A
A A A A
E E E E
Q Q Q Q
F F F F
CS CW CS CS
D D D D
AY AY MY MY
H H H H
A A A A
G G G G
T T T T
T T T T
S A S S
H H H H
chlorobenzne chlorobenzne tolune, benzne biphnyl
mthionine
Une position dterminante

Cette position est donc dans la rgion qui lie le fer. Les acides amins essentiels, E, D, H, sont conservs et entours dun cadre. Entre D et H le remplacement de lalanine par un rsidu plus encombrant, qui est la mthionine, supprime lactivit sur benznes chlors. Inversement le remplacement de la mthionine par lalanine dans TodC cre une nouvelle enzyme dont laction va du tolune au benzne (ce que ne fait pas le TodC dorigine) et va jusqu'au ttrachlorobenzne. Le conservatisme de ce petit morceau de squence enroul autour du fer obit trs certainement des critres structuraux trs stricts qui doivent veiller en particulier lier simultanment le substrat et O2. On voit que le remplacement de la srine (S) par un tryptophane (W) beaucoup plus encombrant ne tire pas consquence. Or la prsence dun tryptophane sera importante pour les tudes futures par sa fluorescence, en servant de rvlateur des changements structuraux dans l'enzyme au cours du cycle catalytique. Des effets un peu plus compliqus sobservent quand on touche dautres portions de la squence, mais concernent probablement lorganisation structurale de la protine. Les rsultats les plus intressants sont les effets d'une modification mme minime dans la rgion du site actif sur la slectivit du systme. En somme l'tude de ces diffrentes protines apporte des donnes utiles sur deux fronts, pour nous aider liminer de l'environnement des produits gnants et pour mieux comprendre les critres structuraux qui rglent l'activit catalytique. Le gnie gntique permet d'obtenir de nombreuses mutations la demande, mais la microflore du sol et des eaux est le sige de transferts gntiques horizontaux par plasmides et transposons qui facilitent lapparition au hasard de souches adaptes.
398
8.9 - LE BENZOATE ET LES HALOBENZOATES

Lacide benzoque a de multiples applications chimiques dans lindustrie et s'utilise parfois comme agent protecteur des denres alimentaires pour retarder la croissance des micro-organismes. Il est cependant un excellent substrat de croissance pour une foule de germes. Par exemple Ralstonia eutropha se dveloppe vigoureusement sur benzoate, tout en ignorant le glucose (il lui prfre le gluconate). Cette espce Gram-ngative du sol est un arobie rustique dont l'optimum de temprature est vers 30C, qui peut aussi oxyder lhydrogne et crotre en autotrophie, donc sur CO2. C'est donc un chimio-litho-autotrophe. La biodgradation de maints aromatiques porteurs dun substituant carbon se fait par oxydation latrale et apparition d'un carboxyle. Le benzoate est alors un intermdiaire extrmement important dans la nature. Nous savons dj que lacide benzoque rsulte de l'oxydation du tolune sur son groupe mthyle. Il est engendr aussi par la biodgradation du biphnyle et des biphnyles chlors, ingrdients dont l'limination dans l'environnement peut poser un problme pineux. Tout dpend du nombre datomes de chlore de la molcule et leur rpartition. Commenons par le plus simple avec le benzoate et ses drivs. Que devient le benzoate ? Il est attaqu de deux faons diffrentes. La premire est une mono-oxygnation du cycle en ortho, mta ou para, et le 4-hydroxybenzoate est oxygn son tour en protocatchuate. La seconde est une dioxygnation donnant un cis-dihydrodiol, qui sera dcarboxyl par la suite : c'est la dgradation la plus commune des halobenzoates.
COO NADH NADPH O2 COO
OOC
COO HO OOC pyruvate oxaloactate
COO O2
OH OH OH 4-hydroxybenzoate protocatchuate
OOC OH
benzoate O2 NADH
OH
CO2
OH OH O2 catchol
COO COO
COO COO
cis,cis-muconate
3-oxoadipate
Les deux voies du benzoate

Ces deux voies sont connues depuis longtemps et peuvent coexister dans le mme germe bactrien [74]. La dioxygnation la plus commune est reprsente par la ligne du bas conduisant au catchol. Les transformations sont gnralement toutes inductibles. Par exemple le benzoate prsent dans le milieu induit les enzymes de sa propre transformation, mais un intermdiaire comme le cis,cis-muconate peut tre le vritable inducteur. Cette question sera explique dans le chapitre suivant. La formation d'un cis-dihydrodiol et la raromatisation par une dshydrognase est
399
donc la stratgie banale qui est celle de l'attaque du benzne. Nous la retrouvons avec le o-phtalate et le trphtalate. Le premier est un agent plastifiant trs rpandu, le second est utilis pour la confection de matires plastiques appeles PET (notamment dans les bouteilles plastiques). Le protocatchuate est dans les deux cas l'intermdiaire cl dont le mtabolisme sera dtaill au chapitre 9.
4 5 COO COO HO O2 NADH HO COO COO COO NAD+ HO HO COO CO2 COO
o-phtalate HO O2 NADH
OOC
2
OOC
COO
NAD+ CO2
HO HO
COO
HO
trphtalate
protocatchuate
Les phtalates
Les analogies avec les mtabolismes du benzne, du naphtalne et du benzoate s'expliquent facilement parce que les outils sont similaires. La 4,5-phtalate dioxygnase de Pseudomonas cepacia reoit ses lectrons d'une rductase FMN comportant un noyau [2Fe-2S] classique [75], et la dioxygnase proprement dite a un noyau [2Fe-2S] de type RIESKE, dans un environnement rappellant celui de la naphtalne dioxygnase [76]. Nous passons un mcanisme diffrent qui est aussi une transformation importante dans la nature. Elle est reprsente par lhydroxylation du 4-hydroxybenzoate. Il y a deux modes dont un seul sera reprsent pour simplifier. L'enzyme la plus connue est flavinique. Elle diffre par consquent des oxygnases complexes deux ou trois composants, car une seule protine monomrique se charge ici d'oxyder la fois le NAD(P)H et le substrat. L'hydroxylation conduit au protocatchuate. On connat la structure dtaille de la 4-hydroxybenzoate hydroxylase de Pseudomonas fluorescens ainsi que son mcanisme ractionnel probable [77]. L'enzyme est trs spcifique, utilise NADPH et catalyse loxygnation par sa flavine (FAD). Chose curieuse, une levure, Candida parapsilosis, utilise aussi une hydroxylase flavinique pour traiter le 4-hydroxybenzoate, mais le mcanisme est diffrent car le nouvel hydroxyle est greff la place du carboxyle et produit du 1,4-dihydroxybenzne ou hydroquinone [78]. Lenzyme est beaucoup moins spcifique que la prcdente et fonctionne au mieux avec NADH. La 4-hydroxybenzoate hydroxylase de Pseudomonas fluorescens a une seule chane de 391 acides amins et une molcule de FAD. Le substrat se loge dans une poche troite contre la flavine. En a, modle "fil de fer" de la molcule o sont reprsentes toutes les liaisons autres que celles qui portent les atomes d'hydrogne. En b n'ont t conserves que les liaisons de la chane principale. Les positions du FAD et du substrat (4OHB) sont indiques en trait paissi.
400
b
N-ter
FAD
C-ter site du NADPH
4OHB
Cette enzyme a permis dlucider une mine de questions fondamentales. La premire est : pourquoi lenzyme est-elle spcifique de NADPH et non pas de NADH ? Cette discrimination est commune dans les dshydrognases et rductases, et s'appuie gnralement sur le groupe phosphate supplmentaire en 2 sur le ribose, une position anionique et encombrante. Lanalyse structurale permet de prvoir quels sont les rsidus impliqus, les conclusions ont t vrifies par mutagense par EPPINK et coll. [79].
substrat COO H H162 Y38 R42 OH 4-OHB H38 S212 2 H+ COO HOO OH . FADH OO 2 H+ FADH2 D159 COO R269 FAD OH HO . FADH H O dpart FADH
R33
R166
a d
H2O2
OH NADPH, H+ NADP+ COO
b
OH
Site actif et cycle de la 4-hydroxybenzoate hydroxylase
401
Les rsidus Y33, Y38 et R42, indiqus sur le croquis, sont la fois exposs au solvant et proches du phosphate en 2' du NADP. Le remplacement de ces positions a permis de montrer que lenzyme pouvait fonctionner alors de prfrence avec NADH. La flavine est encastre dans la protine et son verrouillage en place est assur par un segment de squence allant de 159 162. Une autre question fondamentale porte sur loxydorduction entre NADPH et FAD, et le fonctionnement de la flavine dans loxygnation, puisque l'enzyme est une mono-oxygnase faisant tout par elle-mme sans rductase ni ferrdoxine. gauche est symbolis le FAD dans son environnement au sein du site actif. Le substrat (4-OHB) s'installe au contact direct de la flavine. Le cycle, droite, montre que l'enzyme munie de FAD (Eox) reoit le substrat, deux lectrons et l'oxygne, dans cet ordre. Apparat alors un stade peroxyde (O22), qui prcde la scission de la liaison OO, avec hydroxylation du substrat en protocatchuate. L'oxygne restant est li la flavine, qui s'en dbarrasse sous forme d'une molcule d'eau. Les flavines sont des cofacteurs extraordinaires, capables d'intervenir dans des oxydorductions varies un ou deux lectrons, et de participer la chimie du dioxygne. Nous avons ici l'occasion de nous faire une ide sur le principe de leur intervention. La partie active du cofacteur est le noyau isoalloxazine reprsent en dtail, la lettre R symbolisant la chane latrale (ribityl-adnosine-pyrophosphate) du FAD. Les lettres a, b, c et d dsignent les 4 tapes du cycle. Le stade essentiel de cette chimie particulire, symbolise de faon simplifie par le cycle du FAD, est l'hydroperoxyde en c. Le FAD, rduit en FADH2 (b), rduit son tour O2 en O22, pour donner thoriquement l'quivalent de FADH0-O2H, qui est l'hydroperoxyde. La capacit des flavines rduites de se lier l'oxygne, la position dsigne par 4a selon la nomenclature internationale, est une proprit caractristique des flavines dans les oxydases et oxygnases.
R N R N N H N 4a O NH N H R N N O H N 4a O NH R N N O
4a NH N H OH O
4a NH N H O O OH
(hydroperoxyde)
Cycle simplifi du FAD

Les donnes actuelles suggrent que les populations microbiennes sadaptent assez bien la dgradation des halobenzoates. Cette adaptation se fait l encore la faveur de modifications d'enzymes existantes par mutation, recombinaison et transferts gntiques horizontaux. Le systme tudi par le groupe de Lingens est un exemple significatif. Il sagit dune 2-halobenzoate-1,2-dioxygnase de Pseudomonas cepacia 2CBS et P. aeruginosa [80]. Une figure indique la raction, o X dsigne un halogne.
402
O2 NADH X O O C OH OH
COO
NAD+
CO2
OH X OH
(spontane) 2-halobenzoate catchol
2-Halobenzoate dioxygnase
Le diol intermdiaire indiqu na pas t isol et sa structure est donc hypothtique. Nous savons qu'aucune dshydrognase nest ncessaire pour refaire le cycle aromatique du catchol puisque le chlore est spontanment expuls en chlorure. Dans le cas du benzoate qui est galement substrat (X remplac par H), le produit est un diol et le passage au catchol exige une dshydrognation. Lenzyme accepte une gamme tendue de substrats. Sur le tableau suivant les exemples ont t tirs de larticle de FETZNER et coll. Les cercles reprsentent la fonction carboxylate. La hauteur des rectangles permet de comparer lactivit obtenue avec celle qui est mesure sur le 2-chlorobenzoate (rectangle noir). Les substrats porteurs dun seul substituant en ortho sont dioxygns en catchol lexception du 2-mthylbenzoate qui est transform en o-crsol. Les auteurs nont pas caractris tous les produits qui rsultent toutes les fois dune dioxygnation. Fait exception le cas du 4-hydroxybenzoate, qui est transform en hydroquinone.
Br

Cl
F Cl
Cl
OCH3

benzoate
Cl
F OH Cl
CH3

OH NH2 Cl
Cl
NH2 Cl
Spcificit de lhalobenzoate dioxygnase de P. cepacia

Cette enzyme est avec la benzoate 1,2-dioxygnase de Pseudomonas arvilla le chef de file dune famille dhydroxylases contenant seulement deux composants, et non pas trois comme la dioxygnase du benzne, du tolune et du naphtalne. Les deux composants sont une rductase FMN ou FAD avec un centre [2Fe-2S], et une oxygnase de type 2 2 ou 3 3 fonctionnant avec Fe(II). Il n'y a pas de ferrdoxine. En fait cest comme si la rductase avait incorpor celle-ci dans sa structure. Il y a une ressemblance intressante entre cette 2-halobenzoate dioxygnase peu slective et la dioxygnase spcifique du benzoate. La ressemblance porte sur
403
la squence et sur les proprits. Lenzyme du benzoate na que 11% dactivit relative avec un chlore en ortho, 1% seulement avec un mthoxyle, 25% lorsque cest une fonction amine (anthranilate). Le tableau prcdent indique des rapports trs diffrents. lvidence la dioxygnase des halobenzoates accepte plus facilement un atome ou un groupe encombrant la position ortho. On peut imaginer que cest une adaptation rsultant d'une mutation. La slection naturelle dans les sols aurait pu porter sur les bactries armes pour consommer le mthoxybenzoate, qui est proche des produits de dgradation de la lignine. La protine fait partie de celles qui sont suffisamment complaisantes pour s'intresser par hasard nos xnobiotiques. Les enzymes peu clectiques sont videmment les armes recherches de la bioremdiation ! Sagit-il dun modle gnral pour lattaque des benzoates halogns ? La rponse est ngative. ROMANOV et HAUSINGER ont tudi chez Pseudomonas aeruginosa [80] souche 142 une dioxygnase trois composants (la ferrdoxine est l'tat spar). Nous retombons sur larchitecture de la tolune dioxygnase. L encore la spcificit est largie une gamme de substrats reprsents par un nouveau tableau avec les mmes conventions que plus haut. On voit que le 2-iodobenzoate est ici un excellent substrat. Il est dommage que les auteurs naient pas test les mmes composs que dans l'tude prcdente, notamment les drivs fluors.
Cl Cl
Cl

NH2
Cl NH2
benzoate
Cl
Cl
Cl
Cl Cl
NH2 Cl
Br
Cl
Cl
Cl Cl
Br
Cl
Cl
NO2
Spcificit de lhalobenzoate dioxygnase de P. aeruginosa

En rsum toutes ces dioxygnases contribuent au nettoyage de l'environnement par une trs grande diversit et leur facult d'attaquer une gamme plus ou moins tendue de substrats, mais il s'en dgage nanmoins quelques rgles communes simples qui laissent penser qu'elles drivent toute d'un modle commun. C'est le manque de slectivit de ces enzymes, certainement prsentes depuis des millions d'annes pour recycler des composs naturels, qui leur permet de s'accommoder des xnobiotiques ns de l'activit humaine.
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8.10 - AROMATIQUES FLUORS

Le fluor est un lment abondant dans la nature o il entre dans la composition de divers minraux, dont la fluorine (CaF2), la cryolithe et l'apatite. part sa prsence dans les squelettes et les dents, le fluor est peu utilis par les tres vivants et ne se rencontre gure que dans une dizaine de constituants, comme le fluoroactate, des acides gras fluors, la 4-fluorothronine. Sans doute la nature vite-t-elle le plus ractif de tous les lments, qui ne fut dcouvert qu'en 1886 par MOISSAN. La prsence des organofluors dans l'environnement vient principalement de l'industrie humaine qui a engendr une immense varit de composs carbons contenant du fluor, comme agents thrapeutiques ou agrochimiques, dans les revtements protecteurs, les lubrifiants, les solvants et liquides rfrigrants. La liaison carbone-fluor est particulirement stable par suite de son nergie leve (466 kJ . mol1), mais le fluor en place dans une molcule organique est assez inerte chimiquement et difficile dloger par les ractions biologiques courantes. Les composs perfluors comme les perfluoroalcanes fabriqus aprs 1970 sont rfractaires toute biodgradation. L'opinion publique a commenc s'mouvoir quand il fut constat l'action nfaste des gaz fluors volatils du type fron sur la couche d'ozone. La prsence d'un atome de fluor sur un cycle aromatique engendre un encombrement strique plus faible que celui d'un autre halogne comme le chlore, mais reste plus volumineux qu'un hydrogne et ressemble davantage un hydroxyle. Les mcanismes de dshalognation des fluoroaromatiques ressemblent ceux que nous avons rencontrs dans le cas du chlore, mais avec des caractres particuliers dus aux proprits de l'halogne. Les cas les plus tudis concernent les drivs monofluors du benzoate. L'enlvement du fluor se fait toujours sous forme d'ion fluorure, soit pendant l'ouverture du cycle, soit ultrieurement. Le cas le plus simple est celui du 4-fluorobenzoate trait par un Aureobacter. Une dshalognase remplace le fluor par un hydroxyle, et la 4-hydroxybenzoate hydroxylase gnre le protocatchuate [81]. Le substrat induit toute la srie des enzymes qui mtabolisent le benzoate. On peut supposer logiquement qu'il est transform selon la mme voie que le benzoate, mis part la dshalognase initiale.
COO H2O COO O2 NADPH, H+ COO voie ortho HF F 4-fluorobenzoate OH NADP+ H2O OH OH
Nous savons qu'il y a deux modes de dgradation du benzoate. L'un d'eux engendre du 4-hydroxybenzoate comme ici, le second dcarboxyle et produit du catchol.
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Si ce mme principe tait appliqu au 4-fluorobenzoate, le produit form serait du 4-fluorocatchol. L'limination immdiate de l'halogne vite cet inconvnient.
COO
OOC
OH OH
CO2
OH OH
F 4-fluorocatchol
Pourquoi ? Les catchols sont oxydables spontanment en prsence d'oxygne de l'air. Cette auto-oxydation gnre des radicaux libres toxiques pour les cellules. Elle est d'autant plus rapide que le cycle porte des substituants attracteurs d'lectrons, et elle s'acclre pH alcalin. Le phnomne est particulirement accus en prsence de substituant fluor. La dgradation biologique d'un substrat est parfois voue l'chec quand les transformations conduisent un intermdiaire ractif toxique dont l'effet est d'inhiber ou de bloquer totalement toute transformation ultrieure. Nous en avons un exemple avec le 3-fluorobenzoate. La dioxygnase classique du cycle benznique offre deux possibilits, c'est--dire l'apparition transitoire de deux cis-dihydrodiols diffrents conduisant aux deux directions a et b du schma suivant. Dans la voie a aprs dcarboxylation et raromatisation se forme du 3-fluorocatchol. La proximit du fluor avec la fonction catchol favorise le mode d'ouverture appel mta. La nouvelle dioxygnase provoque la formation d'un fluorure d'acide ractif qui se soude avec le site actif de l'enzyme et provoque son inactivation dfinitive. C'est donc un cas d'inhibition "suicide". Dans la voie b, le 4-fluorocatchol form ne produit pas un inhibiteur suicide, mais sa dgradation n'interviendra que si l'enlvement ultrieur de l'halogne est ralisable.
OOC
OH OH CO2
OH OH F
OH COO CF O OH COO CH O
HF
OH COO C O (blocage) (voie mta ou blocage) Enz
COO
F HO COO
OH HO
F 3-fluorobenzoate
HO
CO2 F F
Que ce soit en a ou en b, une dfluoration initiale au cours de la premire dioxygnase n'a pas lieu. Peut-elle s'observer dans d'autres cas ? La rponse est oui si la fonction carboxylique est remplace par un mthyle. Le substrat est alors le 3-fluorotolune. Un Pseudomonas, souche T12, se dveloppe sur 3-fluorotolune comme seule source de carbone et d'nergie [82]. L'enzyme catalysant la dioxygnase n'est autre que la tolune dioxygnase. Le taux de la dfluoration initiale
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dpend du substituant qui est en ortho par rapport au fluor. Il est de 90% avec un fluor (1,2-difluorobenzne), moindre avec un brome ou un iode. Le rsultat dpend probablement de l'orientation du substrat dans le site de la tolune dioxygnase et de l'effet strique du substituant en ortho du fluor. Dans le cas du 3-fluorobenzoate, le carboxyle est encombrant et le taux de dfluoration initiale tombe 0%.
CH3 tolune di-oxygnase F 3-fluorotolune 100% CH3 OH H F OH CH3 OH H O CH3 OH OH 3-mthylcachol
Cette dualit, dfluoration immdiate ou diffre, existe aussi pour le 2-fluorobenzoate, mais la solution prfre 75-95% chez Pseudomonas B13 est celle-ci :
COO F
OCC
OH OH F
CO2
OH OH 3-oxoadipate
2-fluorobenzoate
HF
La 2-halobenzoate dioxygnase aperue dans le cas du chlore, rend ais le mtabolisme du substrat car l'halogne est enlev ds le dpart. Dans le cas contraire un cis,cis-2-fluoromuconate rfractaire l'action de la cyclo-isomrase peut se former et devenir un point de blocage. En conclusion, le mtabolisme des fluorobenzoates se rvle alternativement trs facile ou trs difficile en fonction des souches, des proprits enzymatiques et des principes utiliss. Les considrations thoriques ne permettent pas de toujours de prvoir le caractre biodgradable de ces composs, et comme presque toujours c'est l'exprience et les ttonnements qui apportent le dernier mot.
CONCLUSION
Avant la seconde moiti du vingtime sicle, le cycle du benzne et de ses drivs paraissait solide comme le roc, parce que son oxydation ncessitait au laboratoire des actions nergiques. La nature effectue cette opration en douceur en s'aidant des oxygnases. La varit de ces enzymes et leurs performances tendues laissent esprer qu'elles peuvent commencer la biodgradation l'air de presque n'importe quelle substance aromatique, et amorcer des voies mtaboliques qui seront examines dans les deux chapitres suivants.
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RFRENCES
[1] W I E L A N D T, G R I S S G & H A C C I U S B (1958) Arch. Microbiol. 28 : 383-393 ; A Y E N G A R PK, H A Y A S H I O , N A K A J I M A M & T O M I D A I (1959) Biochim. Biophys. Acta. 33 : 111. [2] G I B S O N D T, K O C H JR & K A L L I O RE (1968) Biochemistry 7 : 2653-2662. [3] G I B S O N D T, H E N S L E Y M, Y O S H I O K A H & M A B R Y TJ (1970) Biochemistry 9 : 1626-1630 ; H G N T & J A E N I C K E L (1972) Eur. J. Biochem. 30 : 369-375. [4] A X C E L L BC & G E A R Y PJ (1975) Biochem. J. 146 : 173-183 ; C R U T C H E R S E, G E A R Y PJ (1979) Biochem. J. 177 : 393-400 ; G E A R Y PJ & D I C K S O N PE (1981) Biochem. J. 195 : 199-203 ; G E A R Y PJ, S A B O O W A L L A F, P A T I L D & C A M M A C K R (1984) Biochem. J. 217 : 667-673 ; G E A R Y PJ, M A S O N JR & J O A N N O U C L (1990) Methods Enzymol. 188 : 52-60. [5] B U T L E R C S & M A S O N JR (1997) Adv. Microb. Physiol. 38 : 47-84. [6] Y E H W K, G I B S O N D T & L I U TN (1977) Biochem. Biophys. Res. Comm. 78 : 401-410 ; J I A N G H , P A R A L E S RE, L Y N C H NA & G I B S O N D T (1996) J. Bacteriol. 178 : 3133-3139. [7] J O H N S O N G R & O L S E N RH (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 3336-3346 et (1997) 63 : 4047-4052. [8] O L S E N RH , K U K O R JJ & K A P H A M M E R B (1994) J. Bacteriol. 176 : 3749-3756. [9] W H I T E D G M & G I B S O N D T. (1991) J. Bacteriol. 173 : 3010-3016 ; P I K U S JD , S T U D T S JM, A C H I M C , K A U F F M A N N KE, M U N C K E, S T E F F A N RJ, M C C L A Y K & F O X BG (1996) Biochemistry 35 : 9106-9119. [10] H O P P E R D J, J O N E S MR & C A U S E R MJ (1985) FEBS Lett. 182 : 485-488 ; M A T H E W S FS , C H E N ZW , B E L L A M Y H D & M C I N T I R E W S (1991) Biochemistry 30 : 238-247 ; C U N A N E LM, C H E N ZW , S H A M A L A N, M A T H E W S FS , C R O N I N C N & M C I N T I R E W S (2000) J. Mol. Biol. 295 : 357-374. [11] S P O O N E R RA, L I N D S A Y K & F R A N K L I N FC H .(1986) J. Gen. Microbiol. 132 : 1347-1358 ; S H A W JP & H A R A Y A M A S (1991) Eur. J. Biochem. 209 : 51-61 ; M A T H E W S FS , C H E N ZW , B E L L A M Y H D & M C I N T I R E W S (1991) Biochemistry 30 : 238-247. [12] M C I N T I R E W , H O P P E R D J & S I N G E R TP (1985) Biochem. J. 228 : 325-335. [13] L E E K & G I B S O N D T (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 3101-3106. [14] V E L A S C O A, A L O N S O S , G A R C I A JL, P E R E R A J & D I A Z E (1998) J. Bacteriol. 180 : 1063-1071 ; P A N K E S , W U B B O L T S MG , S C H M I D A & W I T H O L T B (2000) Biotechnol. Bioeng. 69 : 91-100. [15] C O X H H J , F A B E R BW , V A N H E I N I N G E N W NM , R A D H O E H , D O D D E M A H J & H A R D E R W (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 1471-1474. [16] W A R H U R S T AM, C L A R K E KF, H I L L RA, H O L T RA & F E W S O N C A (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 1137-1145. [17] O ' C O N N O R KE, D O B S O N AD W & H A R T M A N S S (1997) Applied Environ. Microbiol. 63 : 4287-4291. [18] E N S L E Y BD , R A T Z K I N BJ, O S S U L U N D TD , S I M O N MJ, W A C K E T T LP & G I B S O N D T (1983) Science 222 : 167-169. [19] L E A H Y JG , B Y R N E AM & O L S E N RH (1996) Applied Environ.Microbiol. 62 : 825-833. [20] H E A L D S C & J E N K I N S RO (1996) Appl. Environ. Microbiol. 45 : 56-62. [21] L A N G E C C & W A C K E T T LP (1997) J. Bacteriol. 179 : 3858-3865.
408
[22] Z Y L S T R A G J & G I B S O N D T (1989) J. Biol. Chem. 264 : 14940-14946. [23] J I A N G H , P A R A L E S RE, L Y N C H NA & G I B S O N D T (1996) J. Bacteriol. 178 : 3133-3139. [24] R E S N I C K S M & G I B S O N D T (1993) J. Biodeg. 4 : 195-203. [25] L E E K, B R A N D JM & G I B S O N D T(1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 212 : 9-15. [26] S P A I N JC , Z Y L S T R A G J, B L A K E C K & G I B S O N D T (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2648-2652. [27] W A C K E T T L P & G I B S O N D T (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 1703-1708. [28] P I K U S JD , S T U D T S JM, M C C L A Y K, S T E F F A N RJ & F O X BG (1997) Biochemistry 36 : 9283-9289. [29] B Y R N E AM, K U K O R JJ & O L S E N RH (1995) Gene 154 : 65-70. [30] J O H N S O N G R & O L S E N RH (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 3336-3346. [31] Z H O U NY , J E N K I N S A, C H A N K W O C H I O N C K & L E A K D J (1998) FEBS Lett.430 : 181-185. [32] E N S L E Y BD , R A T Z K I N BJ, O S S L U N D TD & S I M O N MJ (1983) Science 222 : 167-169. [33] K A U P P I B, L E E K, C A R R E D A N O E, P A R A L E S RE, G I B S O N D T, E K L U N D H & R A M A S W A M Y S (1998) Structure 6 : 571-586. [34] J E F F R E Y AM, Y E H H J, J E R I N A D M, P A T E L TR, D A V E Y JF & G I B S O N D T (1975) Biochemistry 14 : 575-584 ; G I B S O N D T, R E S N I C K S M, L E E K, B R A N D JM, T O R O K D S , W A C K E T T LP, S C H O C K E N MJ & H A I G L E R BE (1995) J. Bacteriol. 177 : 2615-2621 ; R E S N I C K S M, L E E K, G I B S O N D T (1996) J. Ind. Microbiol. 17 : 438-457 ; J E R I N A D M, S E L A N D E R H , Y A G I H , W E L L S MC , D A V E Y JF, M A H A D E V A N V & G I B S O N D T (1976) J. Am. Chem. Soc. 98 : 5988-5996. [35] T O R O K D S , S M R E S N I C K , J M B R A N D & D L C R U D E N & D T G I B S O N (1995) J. Bacteriol. 177 : 5799-5805. [36] R E S N I C K S M & G I B S O N D T (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 4073-4080 ; K L E C K A G M & G I B S O N D T (1979) Biochem. J. 180 : 639-645. [37] L E E K & G I B S O N D T (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 3101-3106 ; S E L I F O N O V S A, G R I F O L L M, E A T O N RW & C H A P M A N PJ (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 507-514. [38] R E S N I C K S M & G I B S O N D T (1993) Biodegradation 4 : 195-203. [39] L E E K, B R A N D JM & G I B S O N D T (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 212 : 9-15 ; R E S N I C K S M & G I B S O N D T (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 4073-4080. [40] P A R A L E S RE, P A R A L E S JV & G I B S O N D T (1999) J. Bacteriol. 181 : 1831-1837 ; P A R A L E S RE, L E E K, R E S N I C K S M, J I A N G H , L E S S N E R D J & G I B S O N D T (2000) J. Bacteriol. : 182 : 1641-1649. [41] C E R N I G L I A C E & G I B S O N D T (1977) Appl. Environ. Microbiol. 34 : 363-370. [42] C E R N I G L I A C E, G I B S O N D T & V A N B A A L E N C (1980) J. Gen. Microbiol. 116 : 495-500 ; C E R N I G L I A C E, F R E E M A N & E V A N S FE(1984) Arch. Microbiol. 138 : 283-286. [43] B E R M A N MH & F R A Z E R AC (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 925-931. [44] G U R U J E Y A L A K S H M I G & M A H A D E V A N A.(1987) Current Microbiol. 16 : 69-73. [45] Y E N K- W & S E R D A R C M. (1988) CRC Critical Rev. Microbiol. 15 : 247-268. [46] H O P P E R D J & T A Y L O R D G . (1975) J. Bacteriol. 122 : 1-6 ; P O H C L & B A Y L Y RC (1980) J. Bacteriol.143 : 59-69 ; G R U N D E, D E N E C K E B & E I C H E N L A U B R(1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 1874-1877.
8 - LOXYGNATION DES AROMATIQUES [47] K I Y O H A R A H , N A G A O K & N O M I R (1976) Agric. Biol. Chem. 40 : 1075-1082. [48] C A R T W R I G H T NJ & C A I N RB (1959) J. Biochem. 71 : 248-261 ; S P A I N JC & D T G I B S O N (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 812-819 ; S P A I N JC (1995) Annu. Rev. Microbiol. 49 : 523-555 ; JA I N RK, J H D R E I S B A C H & J C S P A I N (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 3030-3032.
409
[49] R O B E R T S O N JB, S P A I N JC , H A D D O C K & G I B S O N D T (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 2643-2648. [50] D E L G A D O A, W U B B O L T S MG , A B R I L MA & R A M O S JL (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 415-417. [51] Z E Y E R J, K O C H E R H P, T I M M I S KN (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52 : 334-339 ; Z E Y E R J & K O C H E R H P(1988) J. Bacteriol. 170 : 1789-1794. [52] S P A I N JC & G I B S O N D T (1991) Appl. Env. Microbiol. 57 : 812-819 ; J A I N RK, D R E I S B A C H JH & J C S P A I N (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 3030-3032. [53] K A D I Y A L A V & S P A I N JC (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2479-2484. [54] J A I N RK, D R E I S B A C H JH & S P A I N JC (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 3030-3032. [55] A N D , G I B S O N D T & S P A I N JC (1994) J. Bacteriol. 176 : 7462-7467. [56] S U E N W C & S P A I N JC (1993) J. Bacteriol. 175 : 1831-1837. [57] V A N D E R B E R G LA, P E R R Y JJ & U N K E F E R PJ (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43 : 937-945 ; A L V A R E Z MA, K I T T S C L, B O T S F O R D JL & U N K E F E R PJ (1995) Can. J. Microbiol. 41 : 984-991 ; M A R T I N JL, C O M F O R T S D , S H E A PJ, K O K J O H N TA & D R I J B E R RA (1997) Can. J. Microbiol. 43 : 447-455 ; K A L A F U T T, W A L E S ME, R A S T O G I VK, N A U M O V A RP, Z A R I P O V A S K & W I L D JR (1998) Curr. Microbiol. 36 : 45-54. [58] W A T A N A B E M, N I S H I N O T, T A K I O K, N O H M I T (1998) J. Biol. Chem. 273 : 23922-23928. [59 F U J I I T, T A K E O M, M A E D A Y (1997) Microbiology 143( Pt 1) : 93-99 ; F U K U M O R I F & S A I N T C P (1997) J. Bacteriol. 179 : 399-408 ; S A I N T C P, M C C L U R E NC , & V E N A B L E S W A (1990) J. Gen. Microbiol. 136 : 615-625. [60] L I U Z, Y A N G H , H U A N G Z, Z H O U P & L I U S J (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 58 : 679-682. [61] B O O N N, G O R I S J, D E V O S P, V E R S T R A E T E W & T O P EM (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 1107-1115. [62] D O N O N B, R A Z O - F L O R E S E, L U I J T E N M, S W A R T S H , L E T T I N G A G & F I E L D G (1997) Arch. Microbiol. Biotechnol. 47 : 83-90. [63] Z I S S I U & L Y B E R A T O S G (2001) Biotechnol. Bioeng. 72 : 49-54. [64] L E N K E H & K N A C K M U S S H J (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 784-790. [65] B R U H N C , B A Y L Y RC & K N A C K M U S S H J (1988) Arch. Microbiol. 150 : 171-177. [66] S C H E N Z L E A, L E N K E H , S P A I N JC & K N A C K M U S S JC (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 2317-2323. [67] V A N A K E N B, H O F R I C H T E R M, S C H E I B N E R K, H A T A K K A AI, N A V E A U H & A G A T H O S S N (1999) Biodegradation 10 : 83-91. [68] W E R L E N C , K O H L E R Y - P E & V A N D E R M E E R JR (1995) J. Biol. Chem. 271 : 4009-4016. [69] B E I L S , T I M M I S KN & P I E P E R D H (1999) J. Bacteriol. 181 : 341-346. [70] B E I L S , H A P P E K, T I M M I S N & P I E P E R D H (1997) Eur. J. Biochem. 247 : 190-199. [71] J O O H , A R I S A W A A, L I N Z & A R N O L D FH (1999) Chem.Biol. 6 : 699-706. [72] B E I L S , M A S O N JR, T I M M I S KN & P I E P E R D H (1998) J. Bacteriol. 180 : 5520-5528.
410 [73] A S T U R I A S JA, D I A Z E & T I M M I S KN (1995) Gene 156 : 11-18.
[74] J O H N S O N BF & S T A N I E R RY (1971) J. Bacteriol. 107 : 476-485 ; H A R D I S S O N C , S A L A - T R E P A T JM & S T A N I E R RY (1969) J. Gen. Microbiol. 59 : 1-11. [75] C O R R E L L C C , B A T I E C J, B A L L O U D P & L U D W I G ML (1992) Science 258 : 1604-1610. [76] C O U L T E R ED , M O O N N, B A T I E C J, D U N H A M W R & B A L L O U D P (1999) Biochemistry 38 : 11062-11072. [77] H U S A I N M & M A S S E Y V (1979) J. Biol. Chem. 254 : 6657-6666 ; W I E R E N G A RK, D R E N T H J & S C H U L T Z G E (1983) J. Mol. Biol. 167 : 725-740 ; L A H MS , P A L F E Y BA, S C H R E U D E R H A & L U D W I G ML (1994) Biochemistry 33 : 1555-1564. [78] E P P I N K MH , B O E R E N S A, V E R V O O R T J & V A N B E R K E L W J (1997) J. Bacteriol. 179 : 6680-6687. [79] E P P I N K MH , O V E R K A M P KM, S C H R E U D E R H A & V A N B E R K E L W J (1999) J. Mol. Biol. 292 : 87-96. [80] F E T Z N E R S , M L L E R R & L I N G E N S F (1992) J. Bacteriol. 174 : 279-290 ; R O M A N O V V & H A U S I N G E R RP (1994) J. Bacteriol. 176 : 3368-3374. [81] O L T M A N N S RH , M U L L E R R, O T T O MK & L I N G E N S F (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2499-2501. [82] R E N G A N A T H A N V & J O H N S T O N JB (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 : 419-424 ; R E N G A N A T H A N V (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 330-334.
CHAPITRE 9 OUVERTURE INTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE

L'ouverture du cycle aromatique se fait de prfrence aprs une double hydroxylation conduisant au catchol ou d'autres drivs comme le protocatchuate, le gentisate, l'homogentisate ou l'hydroquinone. Elle est facilement ralise si le noyau porte au moins deux hydroxyles, parfois trois dans le cas du 1,2,4-trihydroxybenzne. Les voies dcrites dans ce chapitre sont parmi les plus importantes du recyclage de la matire organique dans la biosphre. Grce elles, des substances quon aurait pu supposer indigestes pour les tres vivants sont rapidement transformes en composs simples directement assimilables par le mtabolisme intermdiaire des cellules, selon des voies dont on apercevra les dtails. Ce chapitre permettra de faire connaissance avec diffrents systmes enzymatiques essentiels, dioxygnases, isomrases, hydrolases, ainsi qu'avec les problmes poss par les drivs halogns qui sont produits en nombre par l'activit industrielle. 9.1 - Rupture arobie du cycle 9.2 - Voies ortho 9.3 - Rgulateurs 9.4 - Voies ortho modifies 9.5 - Les dioxygnases ortho 9.6 - Dshalognation arobie avec ouverture du cycle 9.7 - Les cyclo-isomrases 9.8 - Hydrolases et rductases des voies ortho 9.9 - Dshalognation arobie aprs ouverture du cycle 413 414 422 424 429 435 439 443 445
9 OUVERTURE INTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE

L'ouverture du cycle aromatique non halogn se fait de prfrence aprs une double hydroxylation conduisant au catchol ou d'autres drivs tels que le protocatchuate, le gentisate, l'homogentisate ou l'hydroquinone. Elle est facilement ralise si le noyau porte au moins deux hydroxyles, parfois trois dans le cas du 1,2,4-trihydroxybenzne [1]. Les voies dcrites dans ce chapitre sont parmi les plus importantes du recyclage de la matire organique dans la biosphre. Grce elles, des substances quon aurait pu supposer indigestes pour les tres vivants sont rapidement transformes en composs simples directement assimilables par le mtabolisme intermdiaire des cellules.
9.1 - RUPTURE AROBIE DU CYCLE

Nous savons que la dgradation arobie d'un compos aromatique s'effectue typiquement en deux temps. La premire phase fragilise le cycle par oxygnation selon les modalits dcrites dans le chapitre prcdent. La seconde phase consacre l'ouverture du cycle et les transformations successives qui conduisent au mtabolisme cellulaire central (cycle de KREBS). Lorsque le substrat de dpart contient plusieurs cycles aromatiques, une rgle assez gnrale veut que l'un d'eux soit dgrad entirement avant que le reste de la molcule soit entam. La rupture du cycle aromatique survient aprs une dioxygnation, lorsque la molcule comporte deux hydroxyles situs en ortho (catchol) ou en para (gentisate) l'un par rapport l'autre. Lintroduction des atomes doxygne sur le cycle se fait sans faire appel une source dlectrons extrieure. Les enzymes utilises sont donc totalement distinctes des dioxygnases dcrites dans le chapitre prcdent et appartenant la famille des arne dioxygnases. La scission ortho du cycle s'effectue entre deux hydroxyles adjacents, contrairement au cas mta. Les deux modes sont raliss par des dioxygnases diffrentes. Une dioxygnase ortho est dsigne dans la littrature comme dioxygnase "intradiol", tandis quune enzyme mta est "extradiol". La rupture du gentisate est un cas particulier. Les trois substrats emblmatiques, catchol, protocatchuate et gentisate, ont t crs par hydroxylation du noyau aromatique et sont de frquents intermdiaires des voies de biodgradation : Ces diffrentes voies oprent en prsence d'oxygne molculaire chez les procaryotes et les eucaryotes.
414
COO 1 OH 2 OH catchol ortho mta O COO COO CH COO OH
OOC
COO 2 OH OH 4 OH protocatchuate ortho mta O COO COO
OOC
HO 5 gentisate
O CH COO OH HO C
COO COO
Elles offrent des variantes selon les substrats et les espces, et canalisent les transformations de presque toutes les molcules aromatiques biodgradables, naturelles ou artificielles, en librant des produits ordinaires du mtabolisme central. Par exemple la voie ortho du catchol conduit au 3-oxoadipate (ou -ctoadipate), OOCCH2CO(CH2)2COO, qui sera scind en succinate et actyl-coenzyme A. Ce mtabolisme est souvent dsign comme la voie du 3-oxoadipate. Chez les bactries, les gnes concerns sont gnralement localiss sur le chromosome, mais peuvent tre situs sur un plasmide. Les gnes mta sont communment logs sur des "plasmides de dgradation" et codent pour des enzymes aux spcificits largies et diversifies. On les trouve impliques dans la dgradation complte d'aromatiques varis comme le phnol, le tolune et le naphtalne. Les modes d'ouverture ortho et mta du noyau aromatique sont connus depuis les annes cinquante. Parmi les pionniers furent DAGLEY, EVANS, HAYASHI, ORNSTON, STANIER et beaucoup d'autres. Ces premiers travaux ont montr que les potentialits naturelles d'limination des composs organiques comme les aromatiques taient plus vastes qu'escomptes, une poque o les proccupations sur la protection de l'environnement commenaient faire surface dans le panorama politique.
9.2 - VOIES ORTHO

L'ouverture intradiol du catchol et de ses drivs est trs rpandue chez les microorganismes associs aux racines des plantes. Cela s'explique facilement par les nombreux changes au sein de la rhizosphre et l'mission de composs phnoliques varis par la plante. En outre la dgradation de la lignine libre des aromatiques faible masse molculaire qui sont dmthyls et transforms en protocatchuate. La prsence d'une protocatchuate 3,4-dioxygnase dans un germe signale qu'il possde une voie ortho fonctionnelle, dite voie du 3-oxoadipate. Une catchol 1,2-dioxygnase offre un indice similaire. Elle est particulirement active dans les espces utilisatrices du benzoate. Celui-ci est mtabolis par la voie ortho
415
avec le catchol comme intermdiaire. Les souches bactriennes capables de se multiplier sur benzoate comme seule source de carbone et d'nergie sont lgion dans le sol, en particulier parmi les actinomyctes appartenant aux genres Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus et Streptomyces [2]. Dans la plupart des cas, les dioxygnases concernes sont inductibles et soumises une rpression catabolique. Elles n'apparaissent donc pas si le milieu contient une source glucidique comme le glucose. Le schma de base de la voie ortho ou voie du 3-oxoadipate est peu prs toujours le mme, malgr de petites diffrences entre bactries et eucaryotes [3]. Le tableau de la page suivante rsume l'ensemble. Les diffrentes ractions sont signales par un numro. Ainsi les tapes 1 et 2 sont catalyses respectivement par la protocatchuate 3,4-dioxygnase et la catchol 1,2-dioxygnase. Le muconate form aprs l'ouverture du cycle possde une configuration dtermine au niveau des deux liaisons doubles, et correspond au cis,cis-muconate 1. On doit en grande partie au travail remarquable d'ORNSTON la premire identification des diffrentes tapes [4] ! Les codes EC et les noms des diffrentes protines ont t ajouts dans un tableau pour faciliter les recherches par mot cl. Rsumons quelques observations gnrales. Une premire constatation trs importante est la convergence des deux branches du protocatchuate et du catchol. Elle se fait en amont de l'oxoadipate chez les bactries, ou son niveau chez les eucaryotes. Des enzymes spares catalysent ces deux voies ds leur dpart : il y a deux dioxygnases distinctes (1 et 2), des cyclo-isomrases diffrentes (3 et 4) agissant sur les diacides forms, et ainsi de suite. Le tableau se complique un peu quand on passe d'une espce l'autre. Un mme jeu d'enzymes devrait participer la fois au mtabolisme du protocatchuate comme celui du catchol au-del du point de convergence (ractions 8, 9 et 10). C'est ce qu'on observe chez les Pseudomonas, mais pas chez les Acinetobacter. Ces derniers ont deux sries d'enzymes distinctes mais de mme spcificit, d'un ct PcaD, PcaIJ, PcaF, et de l'autre CatD, CatI, CatF. Les enzymes faites en double sont dites iso-fonctionnelles ou encore iso-enzymes. Pourquoi ce luxe ? Les impratifs des rgulations en sont peut-tre responsables, chaque srie de gnes affects la dgradation du substrat initial tant exprime ou rprime en bloc selon les conditions du milieu. Deuxime observation : les 9 enzymes qui transforment le catchol et le protocatchuate en succinate et actyl-CoA sont l'outillage de base du mtabolisme ortho. Elles ont t purifies pour la premire fois chez Pseudomonas putida. Ce mtabolisme est fort commun chez les organismes Gram-positifs ou ngatifs. Plus d'une douzaine d'espces bactriennes ont fait l'objet d'tudes dtailles, ainsi que des levures, des champignons ascomyctes et basidiomyctes 2.
1 - Pour la commodit, la notation cis/trans utilise dans la littrature biochimique est conserve ici, plutt que la notation chimique Z/E qui serait en principe la plus correcte. 2 - Pour les Gram-positifs : Bacillus, Arthrobacter, Rhodococcus, Nocardia. Pour les ngatifs : Acinetobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Burkholderia, Comamonas, Enterobacter, Pseudomonas, Ralstonia (Alcaligenes), Rhizobium. Chez les eucaryotes : Aspergillus, Rhodotorula, Trichosporon cutaneum, Neurospora crassa.
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Bactries
OOC
Eucaryotes
OH OH catchol 2 COO COO -carboxymuconate 3 COO COO muconate 4 COO C O COO C O
OOC
OH OH
OOC
OH OH
OH OH catchol 2 COO COO muconate 4
protocatchuate 1
protocatchuate 1 OOC COO COO -carboxymuconate 3' C O O
OOC
OOC O
COO C O
COO
-carboxymuconolactone 5 O
muconolactone 7 COO C O
-carboxymuconolactone
muconolactone 7
6 O
COO C O
3-oxoadipate nol-lactone 8 O COO COO 3-oxoadipate O 9 8 O C SCoA
3-oxoadipate nol-lactone
succinyl-CoA 10 actyl-CoA
COO 3-oxoadipyl-CoA
N 1 2 3 3' 4 5 6 7 8 9 10
Enzyme PcaGH (PcaA) CatA PcaB CatB PcaC CatC PcaD, CatD PcaIJ, CatIJ PcaF, CatF
N EC 1.13.11.3 1.13.11.1 5.5.1.2 5.5.1.5 5.5.1.1 4.1.1.44 3.1.1.5.3.3.4 3.1.1.24 2.8.3.6 2.3.1.-
Nom de l'enzyme protocatchuate 3,4-dioxygnase catchol 1,2-dioxygnase -carboxy-muconate cyclo-isomrase (lactonisante) -carboxy-muconate cyclo-isomrase (eucaryotes) muconate cyclo-isomrase (lactonisante) -carboxymuconolactone dcarboxylase -carboxymuconolactone hydrolase (eucaryotes) muconolactone isomrase 3-oxoadipate nol-lactone hydrolase 3-oxoadipate : succinyl-CoA transfrase 3-oxoadipyl-CoA thiolase
417
Malgr cette distribution visiblement tendue, les germes comptents sont la plupart du temps des habitants du sol et des rhizosphres 3. Une autre observation importante est d'ordre gntique. Les gnes des voies ortho sont gnralement regroups en oprons sur le chromosome, et soumis induction et rpression. En somme les cellules ne fabriquent les enzymes correspondantes que si elles en ont besoin. Il existe cependant de grandes divergences d'une espce l'autre en ce qui concerne la disposition des gnes et leur rgulation. Citons l'exemple de Acinetobacter calcoaceticus [5].
OOC
H C OH
OOC
OH C H HO
COO
HO
COO
racmase
OOC
O C R-mandlate
OH OH shikimate QuiA COO
HO OH quinate
OH
QuiA HO COO
CHO
CO2
HO
O OH QuiC
HO OH QuiB QuiC COO
COO CO2 BenABC benzoate catchol BenD OH OH
COO
PobA OH OH protocatchuate OH 4-hydroxybenzoate
CatA PcaGH (vers 3-oxoadipate)
Cette espce utilise ses voies ortho pour transformer divers composs cycliques dont quelques-uns ont t reprsents ci-dessus. On y trouve le mandlate qui aboutit au benzoate et au catchol. Le shikimate et le quinate 4 sont transforms
3 - La dcouverte des voies de dgradation des aromatiques a mis sur la sellette des genres tels que les Bacillus, Pseudomonas et autres formes isoles du sol, dtrnant la suprmatie des colibacilles au laboratoire. La microbiologie de l'environnement est alors apparue plus que jamais dans son immense diversit et ses nombreuses surprises. 4 - L'acide quinique (pour simplifier, la stroisomrie exacte n'a pas t prcise sur la formule) est un produit naturel abondant dans l'corce de quinquina, les feuilles de tabac et de carottes, et les fruits tels que les
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en protocatchuate, qui est atteint aussi partir du 4-hydroxybenzoate. Des symboles conventionnels dsignent les enzymes. Dans le signe BenABC de la benzoate dioxygnase, les lettres A, B et C dsignent les trois gnes distincts codant pour le complexe de trois composants correspondant cette enzyme [6]. Quant la 4-hydroxybenzoate hydroxylase, que nous connaissons aussi, son unique chane polypeptidique est dsigne par PobA. Le schma suivant montre les diffrents gnes d'Acinetobacter calcoaceticus regroups en deux ensembles. Le premier dirige l'apparition du protocatchuate (gnes qui, pob), et son mtabolisme (gnes pca). La protine QuiA est une dshydrognase membranaire PQQ* active la fois sur le kinate et le shikimate. La protocatchuate 3,4-dioxygnase correspond PcaHG. Elle est constitue de deux chanes de squences homologues. Le second ensemble s'adresse au catchol (ben, cat). La catchol 1,2-dioxygnase (CatA) n'a qu'une seule sorte de chane.
gnes pca U I J F B D K C H G B C gnes qui X gnes cat C D E A X Y M B C I J F D A gnes pob S R A
gnes ben K M A B
Organisation des gnes chez Acinetobacter calcoaeticus

Cet Acinetobacter a t choisi parce quil est dot d'une collection assez complte de gnes qui sont regroups grosso modo par fonction. Une telle organisation facilite certainement le contrle rigoureux de leur transcription par blocs spars en fonction des conditions physiologiques. Il n'y a pas que des enzymes dans les produits dexpression. Les protines CatB, CatM, PobR, PobS et BenM sont rgulatrices. Le facteur QuiX est considr comme une porine, tandis que PcaK et BenK seraient des transporteurs. Les flches dsignent les portions gnomiques qui sont transcrites d'un seul tenant par un mme ARN messager. Chose curieuse, l'ordre des gnes, leur nombre et leur disposition varient considrablement d'une espce l'autre. Sans doute chaque germe gre-t-il la marche de son mtabolisme sa faon. Malgr la diversit constate dans la disposition des gnes, le squenage d'ADN met en relief des homologies trs nettes suggrant une origine ancestrale commune pour plusieurs segments des voies ortho. Comment l'expression des diffrents gnes est-elle rgule ? la diversit des cartes gnomiques correspond une varit de modes. L'inducteur est soit le substrat initial, soit un intermdiaire. Chez Acinetobacter, le protocatchuate et le catchol sont traits par des sries d'enzymes indpendantes malgr la convergence des deux voies en aval. Des enzymes sont en double comme nous l'avons remarqu, PcaIJ et Cat IJ (9 du tableau antrieur), PcaF et CatF (10 du tableau) [7]. Au contraire, une seule enzyme au lieu de deux catalyse chacune de ces ractions poires avant maturit. L'acide shikimique est un intermdiaire important de la synthse du noyau aromatique (vgtaux, bactries).
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chez Pseudomonas putida. Lorsque les enzymes sont en double comme dans Acinetobacter, chacune est induite avec la srie laquelle elle appartient. Le protocatchuate induit les protines PcaIJ et PcaF ainsi que toutes les protines Pca, mais reste sans action sur la srie Cat [8]. Pour agir ainsi, le protocatchuate est reconnu par PcaU, qui fonctionne comme activateur de transcription. Dans la srie du catchol les choses sont diffrentes. L'inducteur est le cis,cis-muconate, le produit intermdiaire fait partir du catchol par la dioxygnase CatA. Il est reconnu par CatB. En outre CatA est aussi induite par le benzoate, ce qui est logique puisque Acinetobacter convertit le benzoate en catchol. En induisant la synthse de la catchol dioxygnase, le benzoate favorise l'apparition du muconate, qui induit son tour le reste des enzymes de la voie. Ces diffrentes inductions sont donc dclenches en cascade. L'examen exprimental de ces rgulations offre un spectacle intressant. L'induction de la voie ortho par le substrat de dpart semble assez logique. Ainsi le protocatchuate dclenche sa propre dgradation. Le substrat tant prsent, le robinet s'ouvre pour sa transformation. Le substrat ayant disparu, il y a fermeture du dispositif. L'inducteur gnral est assez souvent un produit intermdiaire, comme ici le muconate (ou son analogue carboxyl dans la branche du protocatchuate). Situ plus loin en aval, le 3-oxoadipate induit une grande partie de la branche du protocatchuate chez diverses espces tudies (Pseudomonas putida, Azotobacter et Nocardia). La branche du catchol est galement induite par le 3-oxoadipate dans Nocardia. On pourrait y voir un cercle vicieux. Si le 3-oxoadipate inducteur dclenche sa propre formation en stimulant la synthse de la dioxygnase, il faut quil en existe un taux suffisant pour amorcer la pompe. Encore faut-il que la voie en amont soit elle-mme induite, faute de quoi il n'y aurait pas assez dinducteur pour lancer la machine. Comment sortir de cette situation de blocage ? Dans la ralit, les rgulations bactriennes ne sont presque jamais des commandes de tout ou rien, et les protines sont tout de mme produites taux rduit en absence d'induction. L'oxygnation du catchol a lieu au ralenti en conditions non induites et fait un peu de muconate. En somme la nature sarrange pour maintenir une petite fuite de produit mme quand le robinet est ferm. Si pour une raison quelconque le mtabolisme du catchol s'acclre, il en rsulte une bouffe supplmentaire de muconate et d'oxoadipate qui vont atteindre un niveau suffisant pour acclrer la production des diffrentes enzymes de la voie. Il en rsulte une acclration brusque et importante du mtabolisme. Le mme mcanisme fonctionne pour le protocatchuate. Il s'agit donc d'un phnomne d'amplification dans une zone troite de conditions. Un petit changement des facteurs du milieu suffit dclencher une forte rponse dans un sens ou dans l'autre. D'autre part certains mtabolites apparus au cours de cette biodgradation sont toxiques pour la cellule. Au-dessus de la neutralit, le catchol et ses drivs substitus sur le noyau s'oxydent facilement l'air et engendrent des radicaux. Le catchol concentration faible (moins de 10 ppm) est un inhibiteur de croissance pour de nombreux germes et squestre facilement les mtaux comme le fer 5.
5 - Ainsi le protocatchuate donne avec le fer une coloration violette. Dans les cultures faites sur protocatchuate, la disparition de la coloration permet de se rendre compte de la consommation du substrat.
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Dans le mme ordre d'ide, un Acinetobacter est un bon exemple de l'articulation de ces rglages [9]. Ce germe se dveloppe sur benzoate comme seule source de carbone et d'nergie. Le benzoate est reconnu par le produit du gne benM, qui induit l'opron benABCD dirigeant le passage du benzoate au catchol. Un schma explique le dispositif.
benABCDE benM catA (ORF1, 2) catM catBCIJFD 1 kb
+ COO COO COO benzoate muconate
COO COO muconate
Gnes du benzoate et du catchol

Les gnes ben et cat dterminent la transformation complte du benzoate par l'intermdiaire du catchol, du cis,cis-muconate et de la voie ortho. Ils sont chelonns sur un segment d'ADN de 20 kb environ. Les gnes benM et catM en sont des gnes rgulateurs. Leur transcription en sens contraire de celui des oprons est tout fait caractristique. Le produit de benM, (BenM), reconnat le benzoate ou le muconate et active la transformation du benzoate en catchol. De mme la protine rgulatrice CatM reconnat le cis,cis-muconate, active la fois la production de CatA (la catchol dioxygnase) et la sortie de toutes les enzymes de la voie ortho. La catchol 1,2-dioxygnase (CatA) occupe une position intressante car c'est elle qui engendre le muconate, et son induction spare par deux actions indpendantes semble avantageuse. La premire enzyme de la voie ortho est CatB, c'est--dire la muconate cyclo-isomrase. Les mutants rgulateur BenM altr ne peuvent plus crotre sur benzoate, car les enzymes correspondantes ne sont produites qu' taux trop faible pour tre compatible avec la croissance. Une deuxime mutation compense en partie ce dfaut. Elle est facile slectionner, car les bactries se dveloppent nouveau sur benzoate. Elle se situe de prfrence dans catB qui est le gne de la muconate cycloisomrase. Cette enzyme n'est pas supprime, seulement faite sous une forme un peu moins active. Les auteurs ont vrifi que le taux de muconate dans ces doubles mutants tendait s'lever, car il tait moins rapidement transform au fur et mesure de sa formation. Or le muconate est inducteur et son taux plus lev devrait renforcer son action. On voit pourtant sur le schma que le muconate n'est pas cens induire l'utilisation du benzoate. Comment expliquer ce paradoxe ? Le mcanisme probable est celui-ci. Les deux protines rgulatrices, CatM et BenM, se ressemblent normment par leur squence, font partie des activateurs
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de la famille de LysR* et ont des proprits comparables. CatM est seule en lice dans les doubles mutants et ne reconnat pas le benzoate, mais peut remplacer partiellement BenM en prsence d'un taux lev de muconate. Le systme s'autoentretient parce que le fonctionnement de l'opron ben renforce la production de muconate, qui active toute la voie. Toute augmentation du taux de muconate facilite l'utilisation du benzoate, toute chute du muconate pour une raison ou pour une autre ayant l'effet inverse. Le comportement mtabolique d'une souche bactrienne dpend donc de son outillage en enzymes et en rgulateurs, et chaque espce gre le problme sa faon. Les transporteurs font galement partie des facteurs ncessaires une biodgradation toutes les fois que les substrats doivent pntrer dans la cellule. L'importation des substrats et inducteurs travers la membrane cytoplasmique est souvent une tape limitante de tout le mtabolisme. Le chimiotactisme vient souvent en renfort dans les espces mobiles. Acinetobacter n'est pas un germe mobile, mais les protines PcaK et BenK indiques prcdemment seraient des transporteurs du 4-hydroxybenzoate et du benzoate respectivement [10]. Le transporteur PcaK a t reconnu comme important chez Pseudomonas putida, qui est une espce mobile. Cette protine ressemble d'autres transporteurs membranaires. Exprime dans le colibacille, elle dtermine spcifiquement l'accumulation du 4-hydroxybenzoate l'intrieur de la bactrie. La saturation intervient taux relativement bas (70 M). dfaut de ce transporteur, Ps. putida n'accumule plus le substrat et sa croissance est ralentie. En mme temps la protine PcaK ferait office de rcepteur chimiotactique, permettant aux cellules de se diriger vers la source [11]. La mme espce est aussi capable d'accumuler le 3-oxoadipate par un transport qui est sous la dpendance de PcaT (absent chez Acinetobacter). Nous savons que loxoadipate est un inducteur de la voie ortho. Le transporteur PcaT favorise donc sa propre induction. Chose curieuse, l'induction de PcaT par l'oxoadipate est plus faible que celle des autres protines Pca. Pourquoi ? Les auteurs pensent que c'est une adaptation qui permet aux bactries de ne pas se charger intempestivement en adipate, un analogue structural du substrat normal [12]. L'adipate est l'anion du diacide de formule HOOC(CH2)4COOH. Or l'adipate est prsent dans l'environnement o il est consomm par d'autres espces, notamment par Pseudomonas aeruginosa [13]. Comme l'adipate est galement pomp par PcaT, Ps. putida n'aurait pas intrt le faire entrer en excs au risque de drgler l'induction de sa voie ortho. Ces donnes succinctes peuvent sembler assez compliques, mais illustrent la multiplicit des facteurs et des conditions respecter pour qu'un organisme donn puisse se dvelopper en utilisant une voie comme celle de l'oxoadipate. Une croissance quilibre est le rsultat d'une srie de rglages et de compromis qui posent parfois un casse-tte l'analyse exprimentale, mais constitue un asservissement perfectionn aux conditions physiologiques.
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9.3 - RGULATEURS
Les flux mtaboliques sont souvent rgls par des activateurs de transcription. L'activateur CatM d'Acinetobacter calcoaceticus dclenche l'expression des gnes cat en prsence du cis,cis-muconate. Une protine trs tudie est CatR 6 de Pseudomonas putida et appartient au mme type. Sous l'effet du muconate, elle active l'expression de l'opron catBC (muconate cyclo-isomrase et muconolactone isomrase, ractions 4 et 7) ainsi que catA (catchol 1,2-dioxygnase). La protine a t purifie et il a t possible d'examiner ses relations avec l'ADN [14]. CatR fait partie de limportante famille des rgulateurs de type LysR*, protines diverses par leur fonction mais toutes bties sur le mme modle structural qui tmoigne d'une origine volutive commune [15].
association avec lADN H2N 6-66 95-173 196-206 227-253 reconnaissance de linducteur association protine-ADN et protine-protine COOH
Domaines d'un rgulateur LysR

Pour savoir comment fonctionne CatR sur l'ADN, on dispose d'un certain nombre de techniques prouves : mutagense, protection de l'ADN la Dnase I, attachement des polynuclotides synthtiques En l'absence d'inducteur, CatR se lie sous forme d'un dimre l'ADN en amont de l'opron catBC sur une rgion appele RBS (repression binding site). Cette portion comporte deux bases G et A spares par 11 nuclotides, soit G-n11-A, et prsente une symtrie imparfaite. Ces caractres se retrouvent gnralement sur les sites de liaison des rgulateurs LysR (le consensus tant plus souvent T-n11-A) [16]. En prsence du muconate 100 M comme inducteur, la protine CatR subit un lger changement de conformation qui lui permet de s'attacher un site supplmentaire appel ABS (activation binding site) qui chevauche en partie le promoteur. La squence de cette rgion et la position de ces sites sont indiques par un schma, o les barres places au-dessus notent les rgions protges de la Dnase 1 lorsqu'elles sont recouvertes par les protines spcifiques (dans le test utilis). La ligne de squence du haut se lit de gauche droite et prcde les gnes catBCA. C'est donc le brin d'ADN dit signifiant (limage positive de cet opron, le brin den face tant son ngatif). On y observe les sites RBS, ABS et le promoteur* avec ses botes* 35 et 10. Les lettres marques d'une astrisque sont les positions G et A qui sont caractristiques des rgulateurs du type LysR. La ligne du dessous est le brin complmentaire (le ngatif). Il se lit de droite en gauche. C'est le brin signifiant pour le gne catR. Celui-ci est donc transcrit de droite gauche partir d'un promoteur situ en amont.
6 - Des sigles diffrents ont t choisis par hasard, alors que CatM et CatR sont en quelque sorte synonymes.

Opron catBCA R B C A
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dbut de l'opron catBCA promoteur de catBCA bote 35 site ABS bote 10
*
site RBS
GCTCCATCAGACCTCCAGGGTATGGTGGGAGATTCATTCGATATTGGACGGCTATCAGGGTCTCGCGCAATCCTTGAACAAG CGAGGTAGTCTGGAGGTCCCATACCACCCTCTAAGTAAGCTATAACCTGCCGATAGTCCCAGAGCGCGTTAGGAACTTGTTC dbut de catR
promoteur de catR
Gnes chomosomiques de Pseudomonas putida

Deux promoteurs sont superposs ainsi sur le mme segment d'ADN et commandent la transcription dans des directions opposes. Cette situation a ses rpercussions. Quand la protine CatR est installe sur l'ADN, elle perturbe l'expression de son propre gne catR et agit donc sur lui comme un rpresseur. Si la protine vient s'carter, l'inhibition s'efface et la transcription peut reprendre. Ce dispositif garantit une synthse de catR juste suffisante sa fonction rgulatrice, sinon les molcules CatR en trop risqueraient de bloquer la machine. Le dtail de l'action rgulatrice de CatR est en partie connu. En l'absence du muconate inducteur, un dimre de CatR s'attache sur le site RBS, et un deuxime dimre viendrait s'entasser au-dessus du premier, le complexe ainsi form faisant office de rpresseur expliquant lauto-limitation que CatR impose sa propre synthse puisque son gne situ un peu plus loin est encombr. En mme temps la protine CatR na quune affinit faible pour la zone marque ABS, avec un chevauchement partiel du promoteur. Cela suffit encombrer la zone d'ADN o lARN-polymrase doit s'installer et amorcer la transcription vers la droite de l'opron catBC. Il en rsulte un quilibre subtil o CatR entrave la fois sa propre synthse et l'expression de l'opron catBC, tout en tant activatrice de cette dernire ! Le dpart pur et simple de CatR, qui nest pas fortement li lADN, narrangerait donc rien. On croit connatre la vritable raison pour laquelle CatR en place sur l'ADN empche la transcription de catBC. Une dformation importante de l'ADN entre les deux sites RBS et ABS a t dcele, la position 50 du schma marque d'une flche et d'un "V". Le coude formant un angle assez ferm de 35 40 dans l'ADN cette position, a t repr par sa grande sensibilit la Dnase 1. La sensibilit de la zone de flexion la Dnase 1 est exacerbe, et permet de la caractriser. Cette distorsion est considre comme le principal obstacle au dmarrage de la transcription en absence d'inducteur. Il est trs important de se rappeler que les effets rgulateurs ne sont pas seulement ds l'association physique entre protines et portions spcifiquement reconnues sur l'ADN, mais aux distorsions imposes la structure de la double hlice. Que fait l'inducteur ? Le cis,cis-muconate est reconnu par CatR, qui change de conformation et tend se dtacher du site ABS sans perdre tout contact avec l'ARN-polymrase. En mme temps l'angle form dans l'ADN s'ouvre lgrement. Par des relations structurales encore mal lucides, des contacts entre
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l'ARN-polymrase et CatR faciliterait l'amorage. Ces relations ne sont pas les seules s'tablir. Un troisime site de fixation pour CatR nomm IBS (internal binding site) a t identifi en aval dans le gne de CatC entre les positions 167 et 194. En prsence d'inducteur, CatR se lie cooprativement sur RBS, ABS et IBS, donc trois endroits diffrents. * *
162 site IBS 194
catB
CCATGAGCAGCAGACCCTGGTGGTATTGCGTGTTCG GGTACTCGTCGTCTGGGACCACCATAACGCACAAGC
Il y a un troisime site de fixation de CatR en aval dans le gne catB

L'intervention du site IBS reste obscure, mais elle a t mise en vidence par plusieurs techniques in vitro et par mutagense. Par exemple la position 171 (astrisque), CHUGANI & coll. ont montr que le remplacement de G par A engendre une symtrie presque parfaite et un motif T-n11-A trs favorable la fixation d'un rgulateur de la famille LysR dont CatR fait partie. L'exprience montre alors que CatR s'associe en effet plus troitement IBS et exerce une certaine rpression sur l'expression des gnes catBC. Inversement une autre mutation dtruisant la symtrie a l'effet contraire (deuxime astrisque). La fonction de ce site interne est peut-tre de modifier la courbure de l'ADN dans la rgion du promoteur. Mais le rglage exerc ici apparat bien comme la conjonction d'influences nes la fois de l'interaction des protines sur l'ADN et de la dformation de celui-ci. Le principe de ces rglages est probablement rpandu dans les espces bactriennes. Des faits similaires ont t observs chez Acinetobacter calcoaceticus o l'quivalent de CatR s'appelle CatM et fonctionnerait aussi comme rpresseur et activateur [17]. En conclusion, cette section nous a montr comment une mme biodgradation, concernant ici le benzoate par la voie ortho, ne peut se contenter de la batterie des catalyseurs ncessaires, mais doit s'appuyer sur des facteurs rgulateurs capables de dtecter la prsence du substrat et d'intermdiaires ractionnels, sans oublier les transporteurs. Le sujet abord ici est mieux connu chez les bactries que chez les eucaryotes o les recherches sur les rgulations des voies ortho sont encore peu avances. Chez les champignons o elles ont t tudies, il apparat d'ores et dj que le modle bactrien n'y est gure directement extrapolable. Les voies de loxoadipate ont volu indpendamment dans les deux grands groupes vers des solutions convergentes.
9.4 - VOIES ORTHO MODIFIES

Le catchol est plac la convergence de biodgradations concernant de nombreux composs aromatiques, mais l'usage intensif des produits chlors comme pesticides, herbicides, solvants, et isolants cre des contraintes d'environnement nouvelles. Dans les cas les plus favorables, les substrats chlors sont transforms comme leurs homologues non-chlors avec la mme srie d'enzymes. Deux cas
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sont possibles. Le premier est l'limination du chlore avant destruction du cycle aromatique, faisant apparatre un catchol facilement mtabolisable. La transformation du 2-chlorobenzoate en catchol en est un exemple parmi d'autres. Deuxime cas : le chlore n'est pas limin et se retrouve dans un chlorocatchol. Le dpart de l'halogne sera ralis ventuellement au cours des ractions ultrieures si le cycle ne comporte pas plus de deux ou trois atomes de chlore. La mme remarque sapplique aux drivs aromatiques fluors, broms et iods, mais les tudes portant sur les substrats chlors ont t de loin les plus dtailles. Les chlorocatchols sont dgrads le plus souvent selon le schma ortho. Lorsque le point de dpart est du catchol non substitu, les enzymes ncessaires sont gnralement incapables de transformer efficacement les drivs chlors correspondants, soit parce que l'halogne cre un encombrement strique qui entrave l'accs au site actif de l'enzyme, soit parce que l'halogne exerce un effet attracteur des lectrons qui modifie la ractivit du substrat. Les transformations conduisent alors une impasse se traduisant par le rejet de sous-produits dans le milieu. Ces composs peuvent rester inertes ou s'oxyder sous l'action de peroxydases avant de se polymriser en pigments, un phnomne constat chez Pseudomonas fluorescens [18]. Cependant de nombreuses espces bactriennes sont capables de mtaboliser les chlorocatchols par la voie ortho, et ont gnralement deux sries parallles d'enzymes, une pour le catchol, une autre pour les drivs chlors. Dans la premire, les enzymes sont plus ou moins spcifiques et n'ont quune activit rduite ou nulle sur les substrats analogues chlors. Dans la seconde, le spectre d'action est plus large, les enzymes pouvant traiter avec une efficacit variable aussi bien les substrats non chlors que chlors. Ce principe a t dcouvert initialement dans la souche B13 d'un Pseudomonas utilisant le 3-chlorobenzoate comme seule source de carbone et d'nergie [19]. Les transformations de dpart se font selon un principe connu et le 3-chlorobenzoate engendre deux catchols monochlors.
HO COO (dioxygnase) Cl 3-chlorobenzoate COO H OH Cl HO HO H Cl CO2 Cl COO (dshydrognase) HO OH OH CO2 OH Cl
Oxygnation initiale du 3-chlorobenzoate

En croissance sur 3-chlorobenzoate, la souche induit une chlorocatchol 1,2-dioxygnase (ClcA) distincte de la dioxygnase standard active sur le catchol (CatA) [20]. De nombreux travaux ont montr qu'une biodgradation sur ce principe tait finalement fort rpandue [21]. Le tableau compare la transformation en 3-oxoadipate du catchol, du 3-chlorocatchol, du 4-chlorocatchol et du 2,4-dichlorocatchol. Les chlorocatchols sont traits par une voie ortho modifie permettant ici le dpart de un ou deux ions chlorure.
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La diffrence la plus importante est au niveau de la cyclisation du muconate chlor ou dichlor. La cyclo-isomrase est note ici ClcB. Elle catalyse la fois une lactonisation et l'limination du chlorure, ce que ne sait pas faire CatB (la cycloisomrase standard). L'autre diffrence essentielle porte sur la prsence d'une dine hydrolase (ClcD) dont le substrat a deux liaisons C=C.
catchol OH OH Cl OH OH 2-,3-,4-chlorocatchols Cl OH OH Cl OH OH Cl ClcA (type II)
CatA (type I)
ClcA (type II) Cl
ClcA (type II)
COO COO CatB COO O O
COO COO
Cl
COO COO
Cl
COO COO Cl
ClcB Cl
ClcB Cl
ClcB Cl
CatC COO O O COO O O
OOC
OOC
hydrolase O
CatD, PcaD COO COO O
hydrolase ClcD m. rductase COO m. rductase O
Cl ClcD COO COO Cl Cl
3-oxoadipate
COO PcaIJ malyl-actate CatIJ PcaF CatF cycle de KREBS
La voie de l'oxoadipate dite "modifie" consacre la transformation des chlorocatchols est code invariablement par des plasmides, l'exception de la malylactate rductase [22]. Les donnes les plus nombreuses proviennent des plasmides pJP4 (Ralstonia) [23], pAC27 [24], pP51 [25] et pB13 ou pWR1 (Pseudomonas) 7.
7 - Le pJP4 code pour la dgradation de l'herbicide 2,4-dichlorophenoxyactate dans R. eutropha JMP134, le pP51 concerne le catabolisme du trichlorobenzne, le pAC27 est celui de la dgradation du 3-chlorobenzoate dans Pseudomonas putida AC866 (comme dans le pB13 qui lui est pratiquement identique).
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De fortes homologies existent d'une voie l'autre entre dioxygnases et cycloisomrases catalysant les deux premires tapes. La conversion des dinelactones 8 diffre davantage de celle de l'nol-lactone (voie du catchol). On considre habituellement que la voie des chlorocatchols s'est diversifie partir de celle du catchol une priode ancienne qui est bien antrieure la pollution de l're industrielle.
O COO COO Cl NADH NAD+ O COO COO malyl-actate NADH, H+ NAD+ O COO COO 3-oxoadipate
Cl 2-chloro-malyl-actate
Raction de la mallyl-actate rductase

COO O O
OOC OOC
COO O O F O O
3-oxoadipate-nol-lactone
cis-dine-lactone
trans-dine-lactone
4-fluoro-muconolactone
Les lactones, substrats des hydrolases

Le particularisme le plus accus de la voie modifie se prsente au niveau des hydrolases qui ouvrent le cycle des lactones en formant un diacide. Les diffrentes enzymes examines diffrent par leur spcificit et les auteurs les ont classes en type I, II et III qui seront dfinis dans la section 9.8. Pourquoi introduire ici la fluoro-muconolactone ? La question mrite une explication. On sait dj que l'attaque du benzoate conduit au catchol avec une seule tape intermdiaire. Les souches bactriennes capables de se dvelopper sur benzoate sont trs communes dans l'environnement. Celles qui dgradent le 4-fluorobenzoate le sont probablement aussi. Cette proprit a t observe dans diverses souches de Ralstonia, Alcaligenes et Pseudomonas, qui croissent sur ce substrat fluor comme seule source de carbone et d'nergie. Assez curieusement, la plupart des bactries mentionnes ne se dveloppent pas sur les drivs chlors du benzoate. Pendant leur croissance sur 4-fluorobenzoate, elles induisent la voie ortho du catchol, mais font aussi l'hydrolase et la rductase qui transforment les dinelactones dans la voie ortho modifie. Autrement dit la fin de cette voie alternative est prsente, alors que son dbut est absent. Il devient alors vident que la voie "standard" du catchol (non halogn) suffit dgrader le 3-fluorocatchol et le 3-fluoromuconate. Mais comment le fluor est-il limin ? Il semble qu'un dpart de fluorure s'effectue spontanment au stade de la fluorolactone, soit au cours de drolyse, soit par passage la cis-dinelactone. Celle-ci est alors facilement traite par hydrolase et rductase. La transformation du 4-fluorobenzoate est illustre par une figure. 8 - Dsignation abrge pour cis- et trans-4-carboxymethylenebut-2-en-4-olides.
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O COO OH F OH F
COO COO
OOC F
F O O
COO COO
F 4-fluorobenzoate
O OOC O
Attaque du 4-fluorobenzoate
La prsence d'enzymes de la voie ortho modifie chez des germes qui n'en ont pas rellement besoin laisse imaginer que ces enzymes ont une autre fonction qui reste inconnue. La question se pose de l'apparition de ces voies dans l'volution et de leur diversification dans les espces comptentes. Un passage au crible exhaustif de toutes les proprits gntiques, du rpertoire des plasmides et des proprits physiologiques des souches peut apporter des lments de rponse. Pour la majorit des auteurs, la voie modifie de l'oxoadipate s'est individualise une priode trs ancienne aprs une duplication des gnes de la voie standard, suivie de mutations dans des directions indpendantes. La pression slective exerce par les pollutions modernes a pu acclrer ce processus en multipliant les recombinaisons et propagations par transposons ou plasmides. Les homologies de squence ne sont pas les seuls indices de parent puisque la disposition des gnes dans les oprons est un autre critre de comparaison. La disposition relative des gnes rvle des analogies entre oprons chromosomiques (Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida) et plasmidiques (pAC27, pP51 et pJP4).
catA A. calc. catR Ps. putida clcR
pAC27 4 kb
catM
catB catB
catC catC
catIJF catA
catD
clcA tcbC tfdC
clcB ORF tcbD ORF tfdD tfdE
clcD tcbE tfdF

1 kb
tcbR
pP51
tcbF
tfdT
pJP4
Fonctions enzymatiques Protines rgulatrices Catchol ou chlorocatchol 1,2-dioxygnase Cyclo-isomrase Muconolactone isomrase Enol-lactone, ou dinelactone hydrolase (voie modifie) Transfrase, thiolase Malyl rductase
Produits des gnes CatM, CatR, ClcR, TcbR, TfdT CatA, ClcA, TcbC, TfdC CatB, ClcB, TcbD, TfdD CatC (absente de la voie ortho modifie) CatD, ClcD, TcbE, TfdE CatI, CatJ, CatF TcbF, TfdF
Gnes de dgradation du catchol et des chlorocatcols
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Le maintien de lordre darrangement des gnes est un argument assez fort en faveur d'une diversification faite partir d'une trame commune. Plusieurs auteurs considrent que les plasmides ne font pas qu'acclrer la transmission des gnes d'une bactrie une autre, mais favorisent l'accumulation de mutations. Au sein d'une population bactrienne, les cellules qui ont tir le bon numro obtiennent un avantage slectif. En se divisant plus vite, elles prennent le pas sur les autres et rpandent les gnes appropris. Le sigle ORF est expliqu en glossaire. On voit que la nomenclature des gnes est htrogne, notamment au niveau des plasmides. Elle n'est dtaille ici que pour faciliter les recherches de documentation. On notera nouveau l'orientation caractristique des gnes rgulateurs souligns en noir par rapport aux oprons qu'ils commandent. Certaines flches du schma figurant les gnes semblent mordre lgrement sur la flche suivante. Ce dtail correspond une situation relle, o il y a un petit chevauchement entre squences codantes. La traduction du premier gne s'interrompt, puis reprend lgrement en arrire avec un cadre de lecture distinct. Cette particularit n'est pas rare dans les gnomes bactriens. L'apparition de voies modifies partir d'un thme de base commun permet aux micro-organismes de collecter le flux mtabolique en provenance de sources organiques varies, et d'tendre la gamme des biodgradations qu'ils peuvent effectuer.
9.5 - LES DIOXYGNASES ORTHO

L'ouverture du cycle aromatique par une dioxygnase occupe une place essentielle dans la biodgradation de nombreuses molcules aromatiques. Rappelons que la dioxygnation dite intradiol prpare la voie ortho, contrairement la coupure extradiol relative la voie mta tudie au Chapitre 10. La raction est la seule exiger l'intervention du dioxygne jusqu' l'entre dans le mtabolisme intermdiaire. Elle est souvent l'tape limitante. Toutes les dioxygnases ortho et mta contiennent du fer non hminique comme cofacteur essentiel, mais il y a des diffrences profondes entre les deux catgories. Une dioxygnase intradiol fonctionne avec Fe(III). Elle est code en gnral par le chromosome et se montre le plus souvent assez spcifique. Le dioxygne ne se lie pas directement au mtal, mais c'est le substrat qui le fait et devient plus ractif, donc plus fragile. Dans le cas de l'enzyme extradiol au contraire, le fer est l'tat de Fe(II), pouvant lier la fois le substrat et O2 cte cte. Elle est souvent plasmidique et dote d'une spcificit beaucoup plus tendue que dans le cas intradiol. Les archtypes de dioxygnases intradiol sont la catchol 1,2-dioxygnase, qui sera dsigne comme catcholase, et la protocatchuate 3,4 dioxygnase ou PCase. Ces enzymes ont leurs chanes bties sur le mme modle et renferment du fer(III). La catchol 1,2-dioxygnase d'Acinetobacter calcoaceticus a deux protomres identiques et sa formule structurale est (Fe)2. Chez d'autres espces les protomres sont de type Fe et peuvent tre au nombre de quatre ou davantage. Le dosage quantitatif de ces enzymes par mesure de la consommation d'O2 est assez simple,
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mais il est souvent plus commode d'utiliser l'absorption vers 260-270 nm de l'acide muconique et de ses drivs, qui est beaucoup plus forte que celle du substrat de dpart. Toutes les PCases connues sont constitues de protomres Fe, en nombre variable d'une espce l'autre. Il y a deux chanes distinctes dans le protomre, correspondant aux gnes pcaH et pcaG. L'enzyme de Brevibacterium fuscum a cinq protomres, contre 12 dans celle de Pseudomonas putida. La structure dtaille de celle-ci comme celle de P. aeruginosa a t publie pour la premire fois en 1988 [26]. Les 12 protomres sont disposs selon la gomtrie du ttradre rgulier avec trois axes de symtrie d'ordre 2 et quatre axes d'ordre 3 formant ainsi une boule creuse, soit 12 sites catalytiques rpartis dans une masse totale de 587 kDa ! Les chanes (22,3 kDa) et (26,6 kDa) prsentent la fois une homologie de squence et une similitude d'organisation dans l'espace. Le fer est li seulement par les chanes . La dtermination de la structure dtaille de cette enzyme a t un progrs des connaissances tout fait remarquable dans le domaine des dioxygnases.
1 P I E L L P E T P SQ T A G P Y V H I G L A L E A A GN P T R PA QDNSR F V I RDRNWHPKA L T P DYKTS I A R S P RQ A L V S I P QS I S E T T GPN F SH L G F G A HDHD L L L 1 DQ E I WNR L A K P D A P G E H I L L L GG V Y DGDGH L V RDS F L E V WQ A D A DG E Y Q D A Y N L E N A F NS F G N F NN GG L P I G E R I I V A GR V V DQ Y GK P V P N T L E VMWQ A N A GGR Y RHKNDR Y L A P L D P N F GG
R T A T T F D A G E W T L H T V K P G V V NN A A G V PMA P H I N I S L F A RG I N I H L H T R L Y F DD E A Q A N A K C V GR C L T DSDG Y Y S F R T I K PG P Y P WRNG P NDWR P A H I H F G I SG P S I A I K L I T Q L Y F E GD P L I PM C 200 239
P V L N L I E Q P QR R E T L I A K R C E V GG K T A Y R F D I R I QG E G E T V F F D F P I V K S I A N P E A V QQ L I A K L DMNN A N PMNC L A Y R F D I V L RGQR K T H F E NCW
Alignement des squences a et b de la Pcase (P. aeruginosa)

Les flches verticales sous les squences indiquent les 4 sites de liaison avec le fer : Y108, Y147, H160 et H162. Les sites en gras sont des positions conserves entre catchol dioxygnases et Pcases. On voit que les chanes sont un peu plus longues dans la rgion N-terminale, car elles forment une sorte de bras mis par le protomre pour enlacer un protomre voisin. Un dessin de l'agencement gnral des deux chanes partenaires dans un protomre suggre qu'elles se ressemblent. Elles ont une armature centrale de 9 barreaux (reprsents par des flches paissies), bords par de courtes hlices. Chose curieuse, le site actif renfermant un ion Fe3+ associ la sous-unit trouve son quivalent au niveau de la chane , mais sans le fer, comme si le site de chaque avait son image sur la chane d'en face. Ces donnes sont peut-tre gnralisables d'autres Pcases puisqu'un Acinetobacter a donn lieu des observations similaires [27].
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Fe3+

Fe3+
Dissociation d'une paire ab de la PCase

Le fer est pentacoordonn selon une gomtrie bipyramidale base triangulaire 9.Les ligands essentiels dj cits dans la squence sont deux tyrosines (Y118, Y147) et deux histidines (H160, H162), la cinquime coordinence tant tablie avec une molcule d'eau [28]. Dans le site quivalent mais dpourvu de fer des , une tyrosine est remplace par une valine, une histidine par une asparagine. L'origine d'un tel "pseudo-site" pose sur le plan de l'volution un problme non rsolu. Si la divergence des deux types de chanes partir d'une origine commune ne fait aucun doute, il est possible que les chanes aient perdu secondairement un ancien site catalytique pour ne garder qu'une fonction stabilisatrice. Le fer n'est pas entirement satisfait par sa sphre de coordinence, qui est gnralement plus stable quand elle est complte par une sixime liaison. L'difice met contribution une molcule d'eau, mais c'est un ligand faible et il en rsulte autour du mtal un environnement asymtrique qui ne fait qu'augmenter sa ractivit.
9 - Comme deux pyramides soudes par leur base triangulaire, formant un hexadre 5 sommets. Lorsque le fer est hexacoordonn, comme souvent dans les protines hminiques, les deux pyramides ont une base carre, et le polydre form, un octadre, possde 6 sommets.
432
Tyr108
Tyr147 OH O H Fe Arg157 + HO H N His162 His160

OOC
OH substrat O H HO O H N
Fe
Le fer dans la PCase

Simplifions par une image. Le mtal va chercher remplacer la molcule d'eau par un donneur organique (le substrat) et s'adjoindre une sixime liaison de coordinence, le tout accompagn par un changement local de conformation dans la protine. Le protocatchuate est maintenu en place par une charge positive (arginine) et contracte une liaison avec le fer haut spin par l'un de ses deux hydroxyles. Les travaux de recherche trs importants mens sur cette enzyme ont mis contribution des mthodes spectroscopiques : RPE, RMN, MSBAUER. Par lemploi de l'oxygne 17 et de la RPE, ORVILLE et LIPSCOMB ont pu dmontrer que le substrat entrait en comptition avec H2O pour se lier au mtal. Ils en ont dduit un modle ractionnel [29]. Le mtal resterait ferrique tout au long du cycle et fonctionnerait sur le principe suivant : il commencerait par lier le substrat en le rendant plus ractif l'oxygne, dont larrive aboutirait la formation transitoire d'un peroxyde sur le substrat. En dsignant ce dernier par S :
E+S
ES
O2
ESO2
E + produit
Le peroxyde se dcompose en un anhydride intermdiaire, qui s'hydrolyse en carboxymuconate emportant les deux atomes d'oxygne. Le modle hypothtique reprsent reste trs schmatique. Le principal aspect est l'activation du substrat par sa liaison avec le fer sur une seule des fonctions phnoliques (attachement dit monodentate) 10, et la combinaison ainsi forme devient capable de ragir avec l'oxygne [30]. La Pcase est inactive sur le catchol et se rvle comme une enzyme troitement spcifique, ne transformant que le protocatchuate et beaucoup plus faiblement l'homoprotocatchuate (ou 3,4 phnylactate). Porteur d'un seul hydroxyle, le 4-hydroxybenzoate est un inhibiteur comptitif. On a utilis cette proprit pour faire cristaliser la protine avec ce ligand en place et cartographier ainsi le site actif. L'utilisation des inhibiteurs en enzymologie apporte trs souvent des renseignements sur le mcanisme enzymatique.
10 - Par opposition une disposition bidentate o il y a deux liaisons sur atomes doxygne.

protocatchuate OH Fe BEnz (site accepteur de proton) H2O COO O2 COO H 2O O O Fe O O O O O O Fe COO
433
OOC
O+ HBEnz
O Fe
COO COO carboxymuconate
+HBEnz
+HBEnz
Le modle hypothtique
On peut citer ici un driv de l'acide isonicotinique ou HINNO (acide 2-hydroxy-isonicotinique N-oxyde). Ce compos se lie fortement la Pcase (le Ki est vers 107 M), la liaison avec le fer provoquant un changement de spectre d'absorption autorisant une vritable titration de l'enzyme [31]. Le dessin interprte cela par la similitude des tats intermdiaires et suggre que le HINNO est un analogue de l'tat de transition 11.
OOC N
+
OH O O N
+
protocatchuate
HINNO

OOC
O OOC
OOC
O O Fe
OOC N
O O Fe
O Fe
O Fe
Analogie entre protocatchuate et HINNO

Les rapports de la PCase avec des ligands varis a servi de bon terrain d'tude. Ainsi chez Acinetobacter, l'enzyme ne reconnat pas le catchol. Le groupe carboxylique est donc ncessaire. L'enzyme modifie par mutation se met transformer le catchol. La mutation permet aux bactries de crotre sur benzoate mme si la catchol dioxygnase est inactive [32]. La modification ncessaire de la Pcase est relativement mineure et laisse deviner comment des mutations survenues dans les populations microbiennes permettent celles-ci de s'adapter des substrats nouveaux. 11 - Voir ventuellement en glossaire des rappels sur "tat de transition" et "inhibiteur comptitif".
434
Qu'en est-il de la catchol 1,2-dioxygnase (ou catcholase), qui est trs rpandue dans la nature car le catchol est un carrefour mtabolique important. Elle est gnralement sans activit notable sur le protocatchuate, mais elle fonctionne sur le mme principe que la Pcase. La question est de savoir comment la catcholase peut s'accommoder de la prsence de substituants du type halogne sur le cycle aromatique. Ils peuvent affecter la catalyse enzymatique de deux manires, soit en modifiant l'affinit de la protine pour le substrat (changement de coefficient Km), soit en perturbant la vitesse du mcanisme (changement de la constante kcat). Dans le premier cas, l'affinit pour le substrat peut s'effondrer verticalement lorsque les substituants sont trop encombrants pour autoriser laccs au site catalytique, ou au contraire tre renforce si des liaisons supplmentaires sont contractes avec la protine. Dans ce dernier cas, la prsence d'un substituant change l'quilibre lectronique du cycle aromatique et modifie sa ractivit. Il en rsulte des effets ventuellement contradictoires allant de l'inhibition l'activation. La catcholase produite en abondance par Pseudomonas B13 ou Ralstonia eutropha B9 cultivs sur benzoate a offert un cadre favorable l'analyse [33]. La situation est en gros la suivante. Pour attaquer des substrats chlors, les bactries ont leur disposition deux dioxygnases I et II (des iso-enzymes). La catcholase I est assez troitement spcifique, et attaque beaucoup plus efficacement le catchol que ses drivs. Au contraire la catcholase II est peu exigeante et s'accommode volontiers des catchols substitus, tout en ayant une action plus lente que celle de la catcholase I. En somme la contrepartie dune slectivit plus tendue est une activit catalytique moins efficace. La nature et la position des substituants sur le cycle ont donc une influence dterminante sur la vitesse de dioxygnation. Le mcanisme est fond sur l'attaque du cycle aromatique par O2 lorsque le substrat est dj li au fer. Lattaque est lectrophile 12, elle sera affaiblie si le substituant est attracteur d'lectrons, ou au contraire facilite dans le cas d'un groupe donneur. Les chimistes tentent de prvoir l'action d'un substituant par la fonction de HAMMETT, dont une ide succincte est donne en glossaire. Chaque type de substituant se voit affecter une constante de HAMMETT note , un paramtre destin faire un pronostic sur la ractivit de la molcule. En gros le chlore, qui a un caractre attracteur, correspond un positif, car il rend le cycle moins ractif une attaque lectrophile par O2. Les valeurs ngatives correspondent un substituant donneur, dont un exemple est le groupe mthyle. La constante de Hammett n'est gnralement utile que lorsqu'il faut comparer la ractivit de composs de mme structure, mais porteurs de substituants diffrents : 3-mthylphnol, 3 -chlorophnol, 3-hydroxyphnol (rsorcinol). L'influence des substituants sur la ractivit du noyau aromatique est en gnral largement traite dans les ouvrages de chimie organique. Voici quelques exemples concernant la catcholase II de Pseudomonas B13. L'enzyme a contrairement la catcholase I une spcificit largie. L'activit sur le catchol et quelques drivs est compare l'aide des coefficients cintiques Vm et Km.
12 - Le substrat joue le rle de base de LEWIS, le fer celui de l'acide.

OH OH OH OH OH Cl OH OH Cl OH OH CH3 Cl Cl OH OH CH3 OH Cl OH Cl OH catchol Vm
435
3-chlorocatchol 4-chlorocatchol 3-bromocatchol 3,4-dichlorocatchol 3,5-dichlorocatchol 3-mthylcatchol 4-mthylcatchol

0 100 200 300
Vm/Km
La valeur de Vm est indique sur le diagramme par les barres blanches. Elle correspond la vitesse maxima atteinte value en units arbitraires qui dpendent des conditions opratoires. On lui donne la valeur de rfrence 100 dans le cas du catchol (voir Vm, Km, MICHAELIS*). Nous voyons qu'en apparence il n'est pas le meilleur substrat puisque les valeurs pour les drivs mthyls sont au moins triples. En apparence seulement. Pour comparer valablement l'efficacit de l'enzyme sur les divers substrats, il faut aussi faire intervenir le coefficient Km, qui indique si la protine pige fortement son substrat ou non. L'affinit de liaison est gnralement d'autant plus forte que le Km est plus faible. Une enzyme peut donc lier fortement un substrat mais le transformer lentement (Vm faible), ou au contraire avoir un pouvoir catalytique considrable mais s'avrer peu efficace car son coefficient Km est lev (faible affinit apparente). Le Km de la catcholase II pour le catchol est 15,6 M, alors qu'il est seulement de 0,7 M pour le bromocatchol, par exemple. Consquence : celui-ci est mieux retenu par l'enzyme que le catchol. Il en est de mme pour les 3- et 4-chlorocatchols. Les meilleures comparaisons s'effectuent donc par le rapport Vm/Km (barres noires du graphique). Vus sous cet angle, les catchols halogns, l'exception du 3,4-dichlorocatchol o la valeur de Vm est peu prs nulle, sont de meilleurs substrats que le catchol ou ses deux drivs mthyls. Cependant l'tude complte et rigoureuse d'un tel systme ncessite en gnral une exprimentation assez lourde o il faut faire intervenir le pH, la cintique, l'inhibition par les produits de la raction.
9.6 - DSHALOGNATION AROBIE AVEC OUVERTURE DU CYCLE

La rupture de la liaison carbone-halogne est une phase critique de la dgradation des haloaromatiques. On observe deux stratgies diffrentes. Le premier cas sera le seul abord dans cette section et concerne le remplacement de latome dhalogne sur le cycle par un hydroxyle ou un atome dhydrogne. Dans le second cas, la dshalognation naura lieu quaprs louverture du cycle au cours d'une tape ultrieure du mtabolisme.
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Nous prendrons deux exemples. Le premier est celui du 2-chlorophnol. Il est attaqu fortuitement par la salicylate hydroxylase de Pseudomonas putida [34]. Lenzyme est une mono-oxygnase flavinique fonctionnant de la mme faon que la 4-hydroxybenzoate hydroxylase entrevue dans le chapitre antrieur (section 6). Le salicylate est un produit banal du monde vgtal, et il est remplaable ici par le 2-chlorophnol. Il se forme dans les deux cas du catchol comme produit de la raction.
OH COO H+ O2 H2O OH OH H2O O2 OH Cl
salicylate
NADPH H+
NADP+ CO2
2 NADP+ Cl
2 NADPH 2 H+
2-chlorophnol
Ractions de la salicylate hydroxylase

Pourquoi deux molcules de NADPH sont-elles ncessaires quand le 2-chlorophnol est substrat ? L'explication tient l'apparition de l'ion chlorure. Le chlore fix au noyau benznique remplace thoriquement un proton et devrait quitter les lieux au degr d'oxydation + 1 (Cl+). La formation du chlorure correspond donc une rduction supplmentaire deux lectrons. La raction se ferait en deux temps. La premire tape serait l'hydroxylation proprement dite et conduirait un intermdiaire cationique porteur de deux hydroxyles o l'halogne est encore sur le noyau. La deuxime se droulerait sans intervention d'O2 comme le ferait une rductase : le cycle hydroxyl perd l'quivalent de Cl+ en devenant du catchol, et l'halogne est rduit en ion chlorure par la deuxime paire d'lectrons. Le deuxime exemple est plus compliqu car il s'agit de la biodgradation du pentachlorophnol ou PCP, un ingrdient bactricide et fongicide. Ce composant a t produit en quantit norme comme agent protecteur du bois, conjointement la crosote et aux arsenicaux. Le PCP est inject sous pression au bois destin rsister aux agents extrieurs (poteaux tlgraphiques, traverses de chemin de fer, charpentes). Il est lgrement volatil, insoluble dans leau, mais son sel de sodium est soluble. Malheureusement il est toxique, slimine lentement de lenvironnement et contient des dioxines comme impurets. La combustion du bois trait libre davantage de dioxines. Ces dfauts ont conduit l'arrt de sa production dans la communaut europenne et des limites svres imposes son usage. De nombreux sites industriels et anciennes dcharges sont encore lourdement contamins. Or les aromatiques multi chlors sont gnralement les plus difficilement biodgradables. Bien que le PCP soit totalement artificiel et apparu seulement depuis 1936, la flore bactrienne de l'environnement a pu sy adapter. Certaines souches pratiquent la dchloration partielle du noyau, dautres vont jusqu la minralisation complte [35]. La dgradation arobie du PCP la mieux connue a t analyse chez Sphingomonas chlorophenolica. Son principe est le suivant [36] :

OH CI CI CI PCP CI CI 1 Cl CI CI OH Tetra CHQ CI COOH O CI OH CI CI 2 Cl CI CI OH 3 OH CI OH CI 2 OH Cl CI OH CI
437
CI COOH O
OH
Il est constat que trois atomes de chlore sur cinq sont limins en chlorure sans quil y ait ouverture du cycle. La raction 1 est celle de la PCP hydroxylase : PCP + 2 NADPH + O2 TtraCHQ (ttrachlorohydroquinone) + 2 NADP+ + Cl + H2O Lapparition transitoire dune p-hydroquinone est caractristique de la dgradation des phnols poly-halogns. Il faut 2 NADPH pour effectuer cette premire conversion comme dans l'exemple prcdent. Lenzyme est l aussi une flavoprotine. Lhydroxylase de Flavobacterium est peu spcifique, et peut agir sur des substrats o un halogne port par le cycle est remplac par un atome dhydrogne, un hydroxyle ou dautres substituants, tels que des groupes nitro, amino et cyano [37]. Au lieu d'enlever un ion halognure, la raction limine respectivement un proton, un ion nitrite, lhydroxylamine (NH2OH), ou un ion cyanure. Il faut 2 NADPH pour chaque hydroxylation, sauf pour le groupe amino et lhydrogne. Le 2-iodophnol est galement substrat de lenzyme, et deux molcules de NADPH sont oxydes par mole de substrat. Une premire oxydation du cycle engendre une benzoquinone tandis que liode est ject sous forme diodure. La deuxime phase rduit nouveau la benzoquinone, dont la prsence transitoire a t dtecte. La raction de l'hydroxylase est relativement lente et constitue le goulot dtranglement du mtabolisme des phnols halogns. Le PCP en est peut-tre un substrat accidentel de l'enzyme, dont les substrats naturels n'ont pas t formellement identifis. Un dtournement contre des produits artificiels, en quelque sorte. Les deux tapes suivantes (2 sur le schma) sont catalyses par la ttrachloro-hydroquinone (TCHQ) dshalognase. Ltape 3 est celle de la 2,6-dichloro-hydroquinone dioxygnase. Le principe est tout fait diffrent et suggre l aussi un dtournement denzyme prexistante. Les deux tapes 2 font appel au glutathion (GSH) comme cofacteur.
glutathion SH Cl Cl H+ glutathion SH
S S
Dshalognation rductrice par glutathion
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Une dshalognation rductrice, qui remplace Cl par H, est rare chez les organismes arobies, et se prsente surtout chez les anarobies. La fonction gnrale du glutathion est rappele en glossaire. Toutes les protines qui l'utilisent ont des ressemblances au niveau du site actif et sont prsumes fonctionner de la mme manire. Le dpart du chlorure fait intervenir ici successivement deux molcules de glutathion. Le mme principe se retrouvera dans l'limination de certains herbicides. La glutathion S-transfrase est rpandue chez les bactries, les champignons et les mammifres. Elle participe au mtabolisme de la tyrosine ou du phnylactate :
tyrosine COO CH2 COO CH2 OH HO homogentisate H2C O COO COO H2C O COO H2C H3C phnylactate O actoactate COO
OOC
fumarate COO
COO
Isomrisation et scission
La TCHQ dshalognase de Sphingomonas peut catalyser lisomrisation du produit intermdiaire, le malylactoactate, qui est indique par le cadre rectangulaire. C'est un autre argument pour supposer que la dgradation du PCP aurait t "mise au point" par slection partir de voies mtaboliques dj existantes. La premire pice est lhydroxylase, une enzyme peu spcifique et catalysant l'tape limitante, peut-tre initialement prvue pour attaquer le 2,6-dichlorophnol. La suppression de lenzyme aprs mutation fragilise normment les bactries au PCP. La contamination du sol par cet ingrdient a d crer une forte pression slective permettant aux bactries de se dbarasser du compos toxique. Lhydroxylase est induite par le PCP et probablement par dautres phnols. La deuxime pice est la ttraHQ dshalognase glutathion, visiblement rcupre du mtabolisme des acides amins aromatiques. Elle est constitutive, une situation juge peu conomique car en absence de substrat lenzyme est fabrique en pure perte. Elle serait ne par adaptation dune protine normale du mtabolisme sans avoir eu le temps de se faire accompagner dun systme rgulateur. La dioxygnase terminale, qui scinde la dichloro-hydroquinone forme, est induite par le PCP et possde aussi ses bases naturelles, car lhydroquinone halogne est analogue des produits forms par des champignons basidiomyctes au cours de la dgradation de la lignine. En somme les trois pices matresses, lhydroxylase, la dshalognase rductrice et la dioxygnase, auraient t recrutes aprs modification et slection, permettant aux bactries de rsister un compos toxique entirement artificiel et de le dgrader compltement, au point de pouvoir se dvelopper sur lui comme seule source de carbone et dnergie !
439
9.7 - LES CYCLO-ISOMRASES

La cyclo-isomrisation du cis,cis-muconate est une tape essentielle de la voie ortho du catchol. La cyclo-isomrase de Ralstonia eutropha pJP4 (ou muconatase, CatB) a t cartographie par rayons X 3 de rsolution [38], et celle de Pseudomonas putida 1,85 seulement [39]. Laction catalytique dpend dun ion manganse dans chacune des 8 sous-units identiques que la protine renferme. La raction de cyclisation est essentielle toute la voie ortho. Le modle ractionnel considr comme plausible est celui de GERLT et GASSMAN et conduit une muconolactone [40]. Les chimistes trouveront dans l'article de ces auteurs un traitement en profondeur de l'enlvement d'un proton au voisinage d'une fonction carboxylique, conduisant ce que les enzymologistes appellent une bta-limination.
+H
:B O O O
HB+ O O O Mn2+ O H rapide A Mn2+ O H lent A H H
:B
O O
O Mn2+
O H A
Mcanisme de la lactonisation du muconate

Le cis,cis-muconate gauche du schma est porteur de deux fonctions carboxyliques disposes symtriquement. La structure gnrale est plane par suite de la dlocalisation des lectrons dans la molcule. Le muconate charg ses deux extrmits est tendu entre deux charges positives portes sur lysine (non reprsentes). La transformation du muconate ncessite l'apport d'un proton sur un site accepteur basique ": B", et la prsence d'un site "AH" donneur de proton. La muconolactone, droite, offre une situation diffrente o le groupe mthylne (CH2) qui relie la fonction acide au cycle possde un carbone ttradrique. Quand la raction s'effectue, l'acquisition d'un proton supplmentaire ne se fait pas sur n'importe quelle face du plan. Le ct o cette addition s'effectue est impos par la gomtrie du site enzymatique. L'opration engendre un coude dans la structure molculaire et fait basculer le carboxyle au-dehors du plan. Ce n'est pas tout. Comme la fermeture du cycle lactone supprime une charge ngative, elle efface du mme coup un pont salin, et rend ttradrique une deuxime position carbone. Il en rsulte une torsion supplmentaire par rapport la position d'origine. La perte d'une charge ngative et la disparition d'un pont salin est susceptible d'amoindrir l'efficacit du verrouillage de la petite molcule dans le site catalytique. C'est peuttre la raison pour laquelle la muconolactone est lie moins efficacement par l'enzyme que le muconate, ce qui a pour effet de faciliter son dpart et de dplacer l'quilibre ractionnel en sa faveur.
440
Cette discussion a fait tat d'un apport de proton selon une direction rigoureusement dtermine. Elle se fait d'aprs les rgles de nomenclature en direction syn (4S), et ce petit dtail a son importance car l'orientation est conserve par les diffrentes cyclo-isomrases bactriennes manganse examines. Une volution aurait pu se faire partir d'un mme modle ancestral auquel appartiendrait aussi la mandlate racmase [41]. Celle-ci fonctionne avec un cation divalent occupant une position comparable, et sa structure ressemble de faon surprenante celle des cyclo-isomrases. En somme le mme modle aurait servi au cours de l'volution pour produire des enzymes catalysant des ractions diffrentes tout en conservant le mcanisme de base.
O muconate cyclo-isomrase et H mandlate racmase O OH O O O O O OH H O O O O H H O
Deux enzymes apparentes par leur structure et leur mcanisme

Grce au modle molculaire dtaill de la cyclo-isomrase chez un Pseudomonas, il a t possible d'identifier la position prcise des sites impliqus dans la catalyse. Le groupe acide AH est un glutamate (E327), maintenu fermement en place par des ponts ioniques. Le site basique : B est une lysine (K169). Cette lysine, une fois protone, dcharge un proton perpendiculairement au plan initial du muconate, et explique l'addition strospcifique syn de ce proton qu'on avait dj dcele avant parution de l'analyse cristallographique. premire vue, les bactries n'ont pas l'exclusivit de ce type d'enzyme. Des champignons capables de mtaboliser des phnols et catchols (Aspergillus niger, Neurospora crassa, Trichosporon cutaneum) utilisent des cyclo-isomrases dotes de la mme strospcificit. Un mme modle aurait-il exist pour les eucaryotes ? L'examen de la muconatase de T. cutaneum suggre qu'il n'en est rien [42]. Les enzymes eucaryotiques n'ont pas besoin de mtal et leur squence ne rvle apparemment aucune similitude convaincante avec celles des cyclo-isomrases bactriennes. Il s'agit d'une volution convergente. La raction globale de la cyclo-isomrase tant rversible, l'enzyme peut thoriquement repartir de la lactone pour faire du muconate. Mais la rtention de la muconolactone est plus faible comme il a t dj signal, ce qui freine sa conversion inverse en muconate. La transformation de celui-ci en muconolactone est donc unidirectionnelle en apparence, indpendamment de la constante d'quilibre entre ces deux formes. Que fait le manganse ? En principe un ion mtallique au sein d'une protine peut avoir quatre fonctions majeures : servir comme donneur ou accepteur d'lectron dans une oxydorduction, participer directement la catalyse comme acide de
441
LEWIS, faciliter la fixation du substrat dans le site enzymatique par une ou plusieurs coordinences, ou tout simplement participer la stabilit gnrale de l'difice protique. La premire utilisation attire tout de suite l'attention car le manganse* peut changer de degr d'oxydation, mais elle semble carter ici car la raction catalyse par l'isomrase n'est pas une oxydorduction. Les ions Mn2+ sont connus par ailleurs comme cofacteurs de diverses enzymes, parfois remplaables par d'autres ions comme Mg2+, Co2+ ou Zn2+. Au cours du cycle catalytique, ces ions sont placs au contact du substrat et y dstabilisent certaines liaisons. Cette fonction est carter dans le cas de la muconate cyclo-isomrase, parce que l'analyse structurale et les proprits spectrales du manganse montrent qu'il est situ trop loin du lieu de la catalyse. Son rle apparat comme essentiellement stabilisateur : il consisterait consolider la formation d'une poche hydrophile dote de la gomtrie requise.
E250 D249 D249
K273
Mn E224 D198 Mn(II) K167
Mn E224 D198
E327
molcule d'eau + NH3+
atome d'oxygne
L'environnement du manganse
Le manganse de la muconate cyclo-isomrase est encastr dans une fissure hydrophile proximit immdiate du site catalytique, l'intrieur d'une structure dite en barillet. L'ion mtallique a une gomtrie de coordination octadrique (6 sommets) voque par le dessin. Trois liaisons seulement sur six sont tablies avec des molcules d'eau. Les autres liaisons le sont avec des fonctions carboxyliques (D198, E224, D249). Dans cet environnement polaire, le glutamate E327 joue un essentiel et correspond l'acide AH de la figure du mcanisme. Sa position est certainement cruciale et serait stabilise en partie par le mtal, lequel maintient l'existence d'une rgion hydrophile consolide par un rseau important de liaisons polaires. Le manganse tablirait autour de lui une architecture hydrophile rigide essentielle au mcanisme catalytique. Sans sa prsence, le site hydrophile aurait tendance se retourner comme un doigt de gant vers le solvant. La cyclo-isomrase prsente donc un cas assez rare o le manganse n'aurait essentiellement qu'une fonction stabilisatrice alors qu'on l'attendait plutt comme un ple ractif participant la catalyse [43]. Une autre surprise vient confirmer cette faon de voir. La situation apparat comme diffrente dans l'enzyme de lactonisation du carboxy-cis,cis-muconate (PcaB) intervenant dans la transformation du protocatchuate. Pour s'y retrouver rapidement :
442 Substrat initial Produit

Catchol muconate
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Lactonis par

"muconatase" (CatB)
Produit
Muconolactone Carboxy-muconolactone
Protocatchuate 3-carboxy-muconate "carboxy-muconatase" (PcaB)
Bien que les deux cyclo-isomrases catalysent des ractions trs similaires au carboxyle prs, il s'est avr qu'elles sont profondment diffrentes chez Pseudomonas putida dans leur mcanisme [44]. La muconatase effectue une addition "syn", alors que la carboxy-muconatase fait une addition "anti". En outre il n'existe aucune homologie significative entre les squences de ces deux protines.
H Addition syn C O H O O C H
OOC
H C C COO H H enzyme O O
COO H H
muconolactone
O C C COO H H enzyme
O O
OOC
Addition anti
COO H H
carboxy-muconolactone
La lactonisation : les deux orientations

La strochimie lie la catalyse des enzymes est gnralement fort stricte et tient videmment la disposition des lments du site actif dans l'espace. Lorsqu'une diffrence est constate comme ici, on peut affirmer pratiquement coup sr que les deux protines du mme organisme sont trangres l'une l'autre sur le plan structural, mme si les mcanismes ractionnels sont les mmes. La cyclo-isomrase PcaB de P. putida aurait t recrute d'une famile d'enzymes contenant la fumarase [45], dont la mission est de catalyser l'interconversion du fumarate et du malate dans le cycle de KREBS. Le passage du fumarate au malate est galement une addition anti sur la double liaison, lhydroxyle venant d'une molcule d'eau tant apport d'un ct, un proton de l'autre. Or il existe un grand conservatisme de squence pour cette protine. La muconate cyclo-isomrase de la voie du catchol, aurait suivi une volution diffrente au sein de la famille de la mandlate racmase, qui avait adopt le mcanisme syn plutt que la solution anti. La voie ortho est aussi prsente chez les champignons et levures. La carboxy-muconate cyclo-isomrase a t tudie chez Neurospora crassa, Aspergillus niger et une levure (Trichosporum cutaneum) [46]. Dpourvue de mtal, l'enzyme de Neurospora fonctionne nanmoins comme la muconatase bactrienne, c'est--dire en utilisant un mcanisme syn. Pourtant il n'y a pas d'homologie avec cette protine. Il n'y a pas d'indication claire d'une quelconque parent entre les voies ortho des procaryotes et des eucaryotes.
443
La dichotomie syn/anti dont il a t question intrigue beaucoup les enzymologistes. On en vient l'ide que la vaste diversification des modles enzymatiques s'est faite l'origine sur un trs petit nombre de structures de base conservant une orientation asymtrique impose. La voie ortho est certainement trs ancienne. Les diffrentes protines comme celles que nous avons examines semblent avoir t recrutes partir de modles pr-existants. Cette opration a pu se produire plusieurs fois partir de sources diffrentes. La nouvelle protine aurait emport chaque fois l'empreinte structurale de la protine mre, en conservant son mcanisme et ses orientations fondamentales. Le recrutement a pu se raliser par duplication de gne. Les deux exemplaires aurait volu sparment pour leur propre compte au gr des mutations et de la pression slective. L'une des lignes aurait conserv la mme fonction dans la voie mtabolique d'origine, la seconde aurait t dtourne vers une fonction nouvelle.
9.8 - HYDROLASES ET RDUCTASES DES VOIES ORTHO

Une tape importante des voies conduisant au 3-oxoadipate est catalyse par une hydrolase. Dans le mtabolisme du catchol, l'hydrolase est CatD et engendre directement le 3-oxoadipate. Dans la dgradation des chlorocatchols intervient ClcD, qui ne produit pas l'oxoadipate mais un malylactate (il y a une double liaison en plus). Il faut une raction supplmentaire catalyse par une rductase pour atteindre l'objectif. Les substrats des hydrolases sont de nature diffrente dans la voie normale et la voie modifie, puisque CatD attaque une nol-lactone, au lieu dune dinelactone pour ClcD.
catchol chlorocatchol dichlorocatchol
3-oxoadipate-nol-lactone
dine-lactone
chlorodine-lactone
hydrolases
3-oxoadipate
malylactate
2chloro-malylactate
rductase mtabolisme central

O Substrats de CatD
O O O OOC 4-fluoromuconolactone
OOC 3-oxoadipate-nol-lactone
OOC
O O
OOC
O O
Substrats de ClcD
trans-dinelactone
cis-dinelactone
444
Un analogue fluor de la 3-oxoadipate-nol-lactone (ou muconolactone) a t signal ici, car il permet de tester les proprits des hydrolases produites par diffrentes espces. La 4-fluoromuconolactone 13 est produite par Ralstonia partir du 4-fluorobenzoate, qui se voit transform en 3-fluorocatchol, puis en 3-fluoromuconate [47]. Cette voie est une parenthse intressante ici, car nous avons vu que l'halogne tait limin par lactonisation dans le cas du chlore, du brome et de l'iode. Le fluor est donc un cas particulier. Certaines dinelactone hydrolases peuvent tre diffrencies par leur spcificit en types I, II et III, comme lindique le tableau. Le signe + signale une forte activit, le signe une activit ngligeable ou nulle.
Enzyme et source (d'aprs SCHLMAN) [48] 3-Oxoadipate nollactone hydrolase (a) Dinelactone hydrolase, type I (b) Dinelactone hydrolase, type II (c) Dinelactone hydrolase, type III (d) Dinelactone hydrolase, de Rh. er. (e) Substrats convertis
3-oxoadipate transcis4-fluoronol-lactone dinelactone dinelactone muconolactone
Inhibe par 14
pCMB EDTA
+ +
+ +
+ + +
+ + +
+ + + + +
Organismes : (a) Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida, pJP4

(b) Ralstonia eutropha 335, H16 et plasmide JMP222 (c) Burkholderia (Pseudomonas) cepacia (d) Pseudomonas sp. B13, plasmides pAC27 (e) Rhodococcus erythropolis (un actinomycte)
Nous avons vu que les mtabolismes du catchol et de ses drivs halogns suivent deux voies parallles. La parent entre les hydrolases des nol-lactones et dinelactones, si elle n'est pas exclue, apparat beaucoup plus lointaine que dans le cas des dioxygnases et cyclo-isomrases. Si la dinelactone hydrolase n'a pas de parent vidente avec l'hydrolase de la voie ortho "normale" se pose alors la question de son origine dans l'optique qui voudrait voir le mtabolisme des chlorocatchols comme l'adaptation d'une voie dj existante. Une possibilit est l'emprunt d'un gne d'une source compltement indpendante, codant pour une protine non prvue pour participer la dgradation des halo-aromatiques. Cependant la dinelactone hydrolase est prsente dans des souches inaptes crotre sur chloro-aromatiques, comme Burkholderia cepacia dans le tableau prcdent. Il existe donc des bactries qui possdent l'hydrolase sans tre capables de dgrader le chlorocatchol. La question reste non rsolue. Les lactones sont des esters
13 - Exactement la (+)-4-carboxymthyl -4-fluoro-but-2-ne-4-olide. 14 - pCMB : para-chloromercuribenzoate (ractif des thiols) ; EDTA : thylne diamine ttraactate (complexant des ions mtalliques divalents).
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cycliques internes. Les hydrolases qui les attaquent sont donc des estrases, groupe trs important o se rencontrent par exemple les protases srine. Les dinelactone hydrolases sont aussi des estrases srine, mais ne montrent aucune parent avec ces protases. Les enzymes bactriennes de la voie ortho modifie jusqu' l'hydrolase incluse sont gnralement codes par un plasmide. Par contre la rduction du malylactate en oxoadipate dpend du chromosome. Contrairement ce qu'on pourrait penser, le malylactate est un mtabolite important dans la nature et n'a rien de marginal. Les champignons en font au cours de la destruction de la lignine. Plusieurs voies convergent vers le 1,2,4-trihydroxybenzne (catchol avec un OH supplmentaire). Une dioxygnase intradiol le transforme directement en malylactate dont la rduction en 3-oxoadipate est une tape cl commune aux bactries et aux champignons. Les enzymes concernes ne prsentent aucune parent. La malylactate rductase bactrienne a t purifie de plusieurs sources, dont Ralstonia eutropha pJP4 [49]. L'enzyme utilise NADH comme rducteur favori, rduit aussi et dchlore le 2-chloro-malylactate (en utilisant 2 NADH par mole). Elle a t purifie et caractrise aussi chez une levure, Trichosporon cutaneum , o elle apparat comme un dimre de sous-units de 40 kDa [50].
9.9 - DSHALOGNATION AROBIE APRS OUVERTURE DU CYCLE

Un cycle aromatique halogn est susceptible d'tre ouvert par dioxygnation, pourvu que lenzyme qui la catalyse puisse sen accommoder. Il existe de nombreux cas particuliers. Les substrats les plus faciles attaquer ne comportent pas plus de deux atomes dhalogne qui peuvent se voir limins au cours dune tape ultrieure.
OH Cl 2-CP OH OH OH Cl 3-CP Cl OH 4-CP Cl Cl (hydroxylation) Cl (ouverture du cycle) OH OH COO COO
OOC
Cl COO COO Cl forme trans
OOC
O O
O O forme cis Cl (lactonisation)
Phnols monochlors
446
Dans le cas contraire se forment des intermdiaires halogns rcalcitrants susceptibles de saccumuler dans le milieu environnant lorsquils ne peuvent pas tre attaqus par une autre voie. Contrairement aux phnols fortement polyhalogns comme le PCP, o les atomes dhalogne sont enlevs un un par hydroxylation ou par rduction, les mono- et dichlorophnols sont transforms en un catchol, et le chlore n'est limin qu'aprs ouverture du cycle. Les trois monochlorophnols de la figure sont dabord hydroxyls en 3- et 4-chlorocatchols [51]. Ce mcanisme est prsent dans Pseudomonas B13, le 3-chlorophnol (3-CP) tant hydroxyl en deux chlorocatchols distincts. Les Nocardia et Rhodococcus ne font que le 4-chlorocatchol (ligne du bas) [52]. Chez certains Pseudomonas, lhydroxylation des chlorophnols se fait par leur tolune dioxygnase [53]. De faon gnrale lhydroxylation des chlorophnols se fait selon des modalits varies avec les espces en utilisant une ou plusieurs hydroxylases plus ou moins slectives. La coupure du chlorocatchol form est une tape critique et donne un chloromuconate. La grande majorit des organismes capables dentamer un chlorocatchol le font ainsi par la voie ortho. La coupure mta, catalyse par une catchol 2,3-dioxygnase, existe aussi, mais conduit en gnral la formation dun chlorure dacide qui est inhibiteur en bloquant le site de l'enzyme par acylation. La cyclo-isomrisation du chloromuconate (ou lactonisation) limine le substituant chlor pour donner, selon la nomenclature officielle rbarbative le 4-carboxymthylnebut-2-ne-4-olide. Il y deux isomres, cis et trans, comme dj aperus dans la voie ortho modifie. Cette tape est cruciale et mrite un petit rappel. Le croquis indique la transformation du catchol (non chlor) en cis,cis-muconate, puis en muconolactone.
COO COO H+ catchol

H OOC
COO OOC cis,cis-muconate
H+ (4S)-muconolactone
La formule du muconate a t reprsente de deux faons diffrentes 15. La fermeture en lactone catalyse par la cyclo-isomrase ou muconatase (EC 5.5.1.1) est strospcifique comme indiqu. Quant au 2-chloro-cis,cis-muconate issu de louverture du 2-chlorocatchol, la raction est catalyse par une cyclo-isomrase distincte de la prcdente (EC 5.5.1.7) [54].
15 - La formule "tire" du muconate est en principe la plus correcte, les deux fonctions anioniques ayant tendance se repousser mutuellement. Le produit est peu stable et a tendance sisomriser en milieu acide. Il doit tre synthtis au laboratoire en utilisant du catchol et la dioxygnase purifie.

Cl
OOC
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a b b
a COO H+ H+ H O
H+ H+ Cl H H a O
2-chloro-cis,cis-muconate
OOC
Cl
H+
OOC
OOC
5-chloromuconolactone
Cl 2-chloromuconolactone O
trans-dinelactone
Les lettres a et b servent reprer les points de fermeture du cycle selon deux modes diffrents. Les flches paissies correspondent aux ractions observes la fois chez des espces Gram-positives et ngatives, les autres chez les Gram-ngatives seulement. La dchloration du 3-chloromuconate est plus simple, et seffectue irrversiblement en une seule tape. Le fluor occupe une place spciale parmi les halognes. L'atome de fluor est trs lectrongatif, et peine plus gros qu'un atome d'hydrogne sur un cycle aromatique, sa liaison avec le carbone y tant trs stable. Il exerce volontiers une influence comme donneur sur le cycle par suite d'un effet de rsonance qui l'emporte sur le pouvoir attracteur d'lectrons du fluor. Cette particularit contribue faire la difffrence au point de vue biodgradation. La catcholase II de B13 et la dioxygnase de Ralstonia eutropha attaquent facilement les 3- et 4-fluorocatchols. On pourrait donc penser que ces aromatiques fluors sont biodgradables dans tous les cas, mais il n'en est rien. L'halogne tant confortablement install sur le cycle, son limination implique gnralement la dsaromatisation de la molcule, et ne peut se faire que dans une tape ultrieure du mtabolisme. Dans le cas contraire s'accumule un intermdiaire fluor rcalcitrant qui peut ventuellement avoir des effets toxiques sur les cellules. La prsence d'un ou plusieurs atomes de fluor dans une molcule organique est un atout de poids pour l'tude de sa biodgradation grce la RMN du fluor-19. L'emploi de la RMN sur le plan gnral est souvent rendu dlicat par son manque de sensibilit, en particulier en RMN du proton. Le trac des spectres ncessite alors une forte concentration de substance examiner, ou exige de longues priodes d'accumulation du signal pour le faire ressortir au-dessus du bruit de fond. Le fluor a l'avantage d'avoir un large dplacement chimique de l'ordre de 500 ppm, contre 250 pour le carbone-13 et seulement 15 ppm pour le proton. Les spectres obtenus avec le fluor sont plus simples, beaucoup moins entachs de bruit de fond, et permettent une bonne sensibilit pour les tudes de biodgradation. Il est alors possible de suivre la dgradation du produit au cours du temps, et de dceler tous les intermdiaires forms en partant d'une concentration de substrat infrieure 1 mM, proche des conditions physiologiques acceptables.
448
Cette technique a t exploite avec succs par plusieurs quipes de chercheurs. Des auteurs nerlandais et russes ont suivi ainsi la biodgradation de divers phnols fluors par 4 espces de Rhodococcus [55]. On sait que ces actinomyctes sont remarquables par leur polyvalence. Les germes ont tous t isols partir de terrains contamins par des rsidus ptroliers et pouvaient attaquer des hydrocarbures ou se dvelopper sur phnol 1 mM. Les phnols mono-, di- et trifluors taient attaqus ingalement selon la position des atomes de fluor et selon les souches, par une hydroxylation, puis par scission intradiol. Ce travail a montr les excellentes perspectives offertes par la RMN du fluor-19, mais n'a pas encore permis de fixer des rgles systmatiques pour la dgradation des divers phnols fluors. Nous constatons en conclusion que la dshalognation effectue au cours de la voie de dgradation ortho est une opration cruciale du recyclage des aromatiques halogns, mais qu'elle comporte de trs nombreux cas particuliers et ne parvient pas toujours son terme. Heureusement, les micro-organismes de la biosphre se dveloppent en populations mixtes qui mettent en commun bon an mal an leurs comptences.
CONCLUSION
Les voies dcrites dans ce chapitre sont communes dans la nature et reprsentent peut-tre les plus primitives, rgles par des gnes appartenant le plus souvent au chromosome bactrien, assez souples pour accepter de mtaboliser certains xnobiotiques comme des drivs halogns. L'atome d'halogne est limin au cours de la premire tape ou plus tardivement. Le procd intradiol reste souvent assez slectif et ne sapplique pas de nombreux aromatiques substitus. Il est heureusement complt par d'autres mcanismes qui seront vus dans le chapitre suivant, plus facilement acquis par transferts gntiques horizontaux, et dous d'une plasticit plus grande.
RFRENCES
[1] B A Y L Y RC & B A R B O U R MG (1984) In "Microbial Degradation of Microbial Compounds", G I B S O N D T ed., Marcel Dekker, New York : 253-294. [2] D O R N E & K N A C K M U S S H J (1978) Biochem. J. 174 : 85-94 ; R E I N E K E W , K N A C K M U S S H J (1978) Biochim. Biophys. Acta 542 : 412-423 ; S C H L M A N N M, S C H M I D T E & K N A C K M U S S H - J (1990) J. Bacteriol 172 : 5112-5118 ; H A M M A N N R & K U T Z N E R H J (1998) J. Basic Microbiol. 38 : 207-220. [3] H A R W O O D C S & P A R A L E S RE (1996) Annu. Rev. Microbiol. 50 : 553-590. [4] O R N S T O N LN (1966) J. Biol. Chem. 241 : 3787-3794, 3795-3799,3800-3810 ; O R N S T O N LN & S T A N I E R RY (1966) J. Biol. Chem. 241 : 3776-3786.
9 OUVERTURE INTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE [5] E L S E M O R E D A & O R N S T O N LN (1994) J. Bacteriol. 176 : 7659-7666 ; E L S E M O R E D A & O R N S T O N LN (1995) J. Bacteriol. 177 : 5971-5978. [6] N E I D L E EL, H A R T N E T T C , O R N S T O N LN, B A I R O C H A, R E K I K M & H A R A Y A M A S (1991) J. Bacteriol. 173 : 5385-5395. [7] S H A N L E Y MS , H A R R I S O N A, P A R A L E S RE, K O W A L C H U K G , M I T C H E L L D J & O R N S T O N D L (1994) Gene 138 : 59-65. [8] C A N O V A S JL & S T A N I E R RY (1967) J. Biochem. 1 : 289-300; S T A N I E R RY & O R N S T O N LN (1973) Adv. Microbiol. Physiol. 9 : 89-151. [9] C O S P E R NJ, C O L L I E R LS , C L A R K TJ, S C O T T RA & N E I D L E EL (2000) J. Bacteriol. 182 : 7044-7052. [10] K O W A L C H U K G A, H A R T N E T T G B, B E N S O N A, H O U G H T O N JE, N G A I K- L & O R N S T O N LN (1994) Gene 146 : 23-30.
449
[11] H A R W O O D C S , N I C H O L S NN, K I M M- K , D I T T Y JL & P A R A L E S RE (1994) J. Bacteriol. 176 : 6479-6488. [12] P A R K E D & O R N S T O N LN (1976) J. Bacteriol. 126 : 272-281 ; H A R W O O D C L & O R N S T O N LN (1988) J. Gen. Microbiol. 134 : 2421-2427. [13] S T A N I E R RY , P A L L E R O N I NJ & D O U D O R O F F M (1966) J. Gen. Microbiol. 43 : 159-271. [14] P A R S E K MR, M C F A L L S M, S H I N A B A R G E R D L & C H A K R A B A R T Y AM (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 12393-12397 ; C H U G A N I S A, P A R S E K MR & C H A K R A B A R T Y AM (1998) J. Bacteriol. 180 : 2367-2372. [15] S C H E L L MA (1993) Annu. Rev. Microbiol. 47 : 597-626. [16] G O E T H A L S K V A N M O N T A G U M & H O L S T E R S M (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 1646-1650. [17] N E I D L E EL, H A R T N E T T C & O R N S T O N LN (1989) J. Bacteriol. 171 : 5410-5421. [18] F A V A F, D I G I O I A D , R O M A G N O L I C , M A R C H E T T I L & M A R E S D (1993) Arch. Microbiol. 160(5) : 350-357. [19] K N A C K M U S S H - J & H E L L W I G M (1978) Arch. Microbiol. 117 : 1-7. [20] D O R N E & K N A C K M U S S H J (1978) Biochem. J. 174 : 73-84 et 85-94. [21] S P A I N JC & G I B S O N D T(1987) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 1399-1404 ; P I E P E R D H , R E I N E K E W , E N G E S S E R KH & K N A C K M U S S H J (1988) Arch. Microbiol. 150 : 95-102 ; V A N D E R M E E R JR, V A N N E E R V E N ARW , D E V R I E S EJ, D E V O S W M & Z E H N D E R AJB (1991) J. Bacteriol. 173 : 6-15 ; V A N D E R M E E R JR (1997) Antonie Van Leeuwenhoek 71(1-2) : 159-178. [22] V O L L M E R MD , S T A D L E R - F R I T Z S C H E K & S C H L M A N N M (1993) Arch. Microbiol. 159 : 182-188; S E I B E R T V, S T A D L E R - F R I Z S C H E K & S C H L M A N N M (1993) J. Bacteriol. 175 : 6745-6754. [23] D O N RH & P E M B E R T O N JM (1985) J. Bacteriol. 161 : 466-468. [24] C H A T T E R J E E D K & C H A K R A B A R T Y AM (1984) Gene 27 : 173-181. [25] V A N D E R M E E R JR, F R I J T E R S AC J , L E V E A U JH J , E G G E N RIL , Z E H N D E R AJB & D E V O S W M (1991) J. Bacteriol. 173 : 3700-3708. [26] O H L E N D O R F D H , L I P S C O M B JD & W E B E R PC (1988) Nature 336 : 403-405 ; O H L E N D O R F D H , O R V I L L E AM & L I P S C O M B JD (1994) J. Biol. Chem. 244 : 586-608. [27] V E T T I N G MW , D ' A R G E N I O D A, O R N S T O N LN & O H L E N D O R F D H (2000) Biochemistry 39 : 7943-7955. [28] W H I T T A K E R JW & L I P S C O M B JD (1984) J. Biol. Chem. 259 : 4487-4495. [29] O R V I L L E AM & L I P S C O M B JD (1989) J. Biol. Chem. 264 : 8791-8801.
450 [30] B R O D E R I C K JB (1999) Essays Biochem. 34 : 173-189.
[31] M A Y S W , O L D H A M C D , M U E L L E R PW , P A D G E T T E S R & S O W E L L AL (1982) J. Biol. Chem. 257 : 12746-12751. [32] V E T T I N G MW , E A R H A R T C A & O H L E N D O R F D H (1994) J. Mom. Biol. 236 : 372-373 ; D ' A R G E N I O D A, V E T T I N G MW , O H L E N D O R F D H & O R N S T O N LN (1999) J. Bacteriol. 181 : 6478-6487. [33] D O R N E & K N A C K M U S S H J (1978) Biochem. J. 174 : 85-94. [34] S U Z U K I K, T G O M I , T K A I D O H & E I T A G A K I (1991) J. of Biochemistry 109 : 348-353 ; S U Z U K I K, G O M I T & I T A G A K I E. (1991) J. Biochem. (Tokyo) 109 : 791-797. [35] C H U JP, K I R S C H EJ. (1972) Appl. Microbiol. 23 : 1033-1035 ; S A B E R D L & C R A W F O R D RL. (1985) Appl. Environ. Microbiol. 50 : 1512-1518 ; S C H E N K T, M L L E R R & L I N G E N S F. (1990) J. Bacteriol. 172 : 7272-7274 ; T O M A S I I., I. A R T A U D , Y . B E R T H E A U & D . M A N S U Y (1995) J. Bacteriol. 177 : 307-311 ; X U N L, E. Y O U N G LY & H G G B L O M MM (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2 : 429-435; T O P P & C . S . O R S E R (1992) J. Bacteriol. 174 : 2898-2902. [36] E D E R E R MM, C R A W F O R D RL, H E R W I G RP & O R S E R C S (1997) Mol. Ecol. 6 : 39-49 ; C O P L E Y S D (2000) Trends Biochem. Sci. 25 : 261-265. [37] X U N L, T O P P E, O R S E R C S (1992) J. Bacteriol. 174 : 2898-2902 ; M C C A R T H Y D L, C L A U D E AA & C O P L E Y S D (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 : 1883-1888. [38] H O I E R H , S C H L M A N N M, H A M M E R A, G L U S K E R JP, C A R R E L L H L, G O L D M A N JJ, S T E Z O W S K I JJ & H E I N E M A N N U (1994) Acta Crystallogr. D50 : 75-84. [39] H E L I N S , K A H N PC , G U H A BL, M A L L O W S D G & G O L D M A N A (195) J. Mol. Biol. 254 : 918-941. [40] J.A . G E R L T & P .G . G A S S M A N (1992) J. Am. Chem. Soc. 114 : 5928-5934. [41] N E I D H A R T D J, K E N Y O N G L , G E R L T JA & P E T S K O G A (1990) Nature 347, 692-694 ; G E R L T JA & G A S S M A N PG (1992) J. Am. Chem. Soc. 114 : 5928-5934. [42] M A Z U R P, P I E K E N W A, B U D I H A S S R, W I L L I A M S S E, W O N G S & K O Z A R I C H JW (1994) Biochemistry 33 : 1961-1970. [43] N G A I KL, O R N S T O N N, K A L L E N RG . (1983) Biochem. 22 : 5223-5230. [44] C H A R I RVJ , W H I T M A N C P, K O Z A R I C H JW , N G A I K- L & O R N S T O N LN (1987) J. Amer. Chem. Soc. 109 : 5514-5519. [45] W I L L I A M S S E, W O O L R I D G E EM , R A N S O M S C , L A N D R O JA, B A B B I T T PC & K O Z A R I C H JW (1992) Biochemistry 31 : 9768-9776. [46] M A Z U R P, H E N Z E L W J, M A T O O S & K O Z A R I C H JW (1994) J. Bacteriol. 176 : 1718-1728 ; P O W L O W S K I JB, I N G E B R A N D J & D A G L E Y S (1985) J. Bacteriol. 163 : 1136-1141 ; T H A T C H E R D R & C A I N RB (1975) Eur. J. Biochem. 56 : 193-204. [47] S C H L M A N N M, F I S C H E R P, S C H M I D T E & K N A C K M U S S H J (1990) J. Bacteriol. 172 : 5119-5129. [48] S C H L M A N N M (1994) Biodegradation 5 : 301-321. [49] S E I B E R T V, S T A D L E R - F R I Z S C H E K & S C H L M A N N M. (1993) J. Bacteriol. 175 : 6745-6754. [50] G A A L A & N E U J A H R H Y . (1980) Biochem. J. 185 : 783-786. [51] S C H M I D T E & K N A C K M U S S H J. (1980) Biochem. J. 192 : 339-347.
9 OUVERTURE INTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE [52] J A N K E D , A L - M O F A R J I T, S T R A U B E G , S C H U M A N N P & P R A U S E R H .(1988) J. Basic Microbiol. 28 : 509-518 ; J A N K E D , I H N W & T R E S S E L T D (1989) J. Basic Microbiol. 29 : 305-314. [53] S P A I N JC , G I B S O N D T. (1987) Appl. Envir. Microbiol. 54 : 1399-1404 ; S P A I N JC , Z Y L S T R A G J, B L A K E C K, G I B S O N D T. S T R U I J S J & R O G E R S JE. (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2648-2652 ; H E A L D S C & J E N K I N S RO (1996) Appl. Environ. Microbiol. 45 : 56-62. [54] V O L L M E R MD & S C H L M A N M (1995) J. Bacteriol. 177 : 2938-2941. [55] B O N D A R VS , B O E R S M A MG , G L O V L E V EL, V E R V O O R T J, V A N B E R K E L W JH , F I N K E L S T E I N ZI, S O L Y A N I K O V A IP, G L O V L E V A LA & R I E T J E N S IMC M (1998) Biodegradation 9 : 475-486.
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CHAPITRE 10 OUVERTURE EXTRADIOL - VOIE DU GENTISATE

L'ouverture extradiol ou mta des catchols s'effectue immdiatement ct des deux hydroxyles adjacents. Le rsultat est un acide carboxylique portant l'autre extrmit de la chane une fonction aldhydique ou ctonique. La multiplicit des ractions de type extradiol rend la question un peu difficile, mais elle complte les voies donnes dans le chapitre prcdent en autorisant avec une plus grande souplesse la dgradation d'une gamme trs tendue de produits. Nous ferons connaissance avec des plasmides de dgradation, avec l'limination de polluants classiques comme les hydrocarbures polycycliques, le biphnyle et ses drivs, diffrents composs azots et les dioxines. Nous examinerons aussi une variante mtabolique ou voie du gentisate. 10.1 - Rupture extradiol du cycle aromatique 10.2 - Le plasmide TOL 10.3 - Naphtalne et salicylate 10.4 - Les polycycliques 10.5 - Biphnyle et PCB 10.6 - Dioxygnases de l'ouverture extradiol 10.7 - Aromatiques azots 10.8 - Dioxines ! 10.9 - Voie du gentisate 455 458 464 467 470 476 482 485 490
10 OUVERTURE EXTRADIOL - VOIE DU GENTISATE

L'ouverture extradiol ou mta des catchols s'effectue immdiatement ct des deux hydroxyles adjacents. Le rsultat est un acide carboxylique portant l'autre extrmit de la chane une fonction aldhydique ou ctonique. La multiplicit des ractions de type extradiol rend la question un peu difficile. Il a t choisi d'en donner quelques dtails, afin de faciliter la navigation dans la masse considrable de donnes disponibles.
10.1 - RUPTURE EXTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE

La rupture extradiol du cycle aromatique intervient dans une grande diversit de substrats, et les dioxygnases responsables ont une gamme de spcificit gnralement plus large que celle des dioxygnases ortho, et n'ont aucune parent structurale avec elles. Leur chef de file est la catchol 2,3-dioxygnase. Ces enzymes renferment du fer(II) et leurs gnes sont gnralement plasmidiques. Les produits forms prsentent une forte bande d'absorption dans la rgion 390 nm du spectre. Sur bote glose contenant un substrat de croissance aromatique, les colonies bactriennes catalysant l'ouverture mta s'entourent d'une coloration jaune qui facilite leur reprage. Lorsque le cycle est porteur d'un substituant, la coupure la plus frquente se fait entre lui et l'hydroxyle le plus proche. La premire figure de la page suivante montre le passage du tolune au 3-mthylcatchol. L'oxygnation du cycle se fait en principe en ortho ou en mta par rapport au mthyle. Le lune est transform par des voies multiples. La coupure extradiol est la raction 4. Des souches de Pseudomonas [1] hbergeant un plasmide ont servi de matriel d'tude. La deuxime figure montre comment le catchol et le 3-mthylcatchol, produits respectivement partir du phnol et du tolune, sont attaqus par la voie mta [2]. Les modalits de l'ouverture extradiol du cycle aromatique sont nombreuses et s'appliquent des substrats trs varis. On en donnera seulement quelques exemples reprsentatifs. Cette voie conduit ici au pyruvate et l'actaldhyde l'aide d'une aldolase (raction 8 de la deuxime figure). L'actaldhyde est ractif et toxique pour la cellule et ne s'accumule pas, car il est rapidement rduit, ou encore oxyd en acide actique comme suggr ici. L'oxydation par une dshydrognase fera intervenir le coenzyme A pour donner de l'actyl-CoA.
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CH3 OH CH3 1 2 tolune CH3
o-crsol
CH3
1 3
OH 4 OH 3-mthylcatchol
CH3 O COO OH 2-hydroxy-6-oxo-2,4-heptadinoate (aprs ouverture mta)
OH m-crsol
Enzyme 1 - Tolune-2-mono-oxygnase, Burkholderia cepacia G4 (catalyse les deux hydroxylations [3]) 2 - Tolune-3-mono-oxygnase, Pseudomonas pickettii, galement active sur benzne, thylbenzne, xylnes [4] 3 - Phnol hydroxylase de large spcificit [5], et enzymes incompltement caractrises [6] 4 - 3-Mthylcatchol dioxygnase, Ps. putida mt-2 (TodE) [7]
Observations Complexe, flavoprotine + prot. de liaison + oxygnase 222. Inductible par les divers substrats aromatiques Transformation commune, peut produire le 4-mthylcatchol Ouverture extradiol
Hydroxylation du tolune en 3-mthylcatchol

H OH 1 OH catchol CH3 OH 1 OH 3-mthylcatchol CH3 O COO OH CH3 COO 6 CH2 COO O 7 HO CH3 COO O 8 actaldhyde pyruvate O COO OH 3 HCOO 2 COO COO OH CO2 5 4 COO COO O
1 - Catchol 2,3-dioxygnase 2 - 2-Hydroxymuconate-semialdhyde dshydrognase 3 - 2-Hydroxymuconate-semialdhyde hydrolase 4 - 4-Oxalocrotonate isomrase
5 - 4-Oxalocrotonate dcarboxylase 6 - 2-Hydroxy-6-oxohepta-2,4-dinoate hydrolase 7 - 2-Oxopenta-4-noate hydratase 8 - 4-Hydroxy-2-oxo-valrate aldolase
Voie mta
Chez Pseudomonas CF600, l'aldolase et la dshydrognase ont t trouves troitement associes dans une sorte de complexe qui catalyse successivement les deux ractions [8]. Habituellement, le regroupement de plusieurs protines dans un mme complexe est interprt comme une adaptation favorable sur le plan
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physiologique, car elle est cense apporter une meilleure efficacit dans la chane de ractions. L'aldhyde intermdiaire entre l'alcool et l'acide serait alors oxyd au fur et mesure de sa formation sans quitter le complexe enzymatique, et son action dltre serait ainsi vite. On ignore si cette solution existe dans toutes les voies mta. Un autre exemple citer est celui du protocatchuate, un produit qui nous est familier comme substrat de la dioxygnase (Pcase) ortho. Ici l'ouverture du cycle est soumise deux dioxygnases mta, les protocatchuate 2,3- et 4,5-dioxygnases.
OOC
COO COO CHO
PC
OOC
- di -3,4
se na oxyg O2 ) ho (ort
2 3 4 5
OH OH
PC-2,3-dioxygnase O2
OOC
COO OH OH COO CHO
protocatchuate (PC)
PC-4,5-dioxygnase O2
Les trois dioxygnations du protocatchuate

La protocatchuate 2,3-dioxygnase a t caractrise pour la premire fois chez Bacillus macerans [9], mais l'ouverture se fait plus souvent entre 4 et 5, la dioxygnase correspondante ayant t purifie ds 1968 partir de Comomonas testosteroni [10]. Le produit form est le 2-hydroxy-4-carboxymuconate semialdhyde. Trois tapes le transforment en pyruvate par une hydrolase, une hydratase et une aldolase :
protocatchuate HCOO
2 pyruvate
OOC
OH CHO COO H2O
OOC CH2
O COO H2O
OOC OH CH2
O COO
Protocatchuate 4,5-dioxygnase
Il y a dpart de formiate (HCOO) et scission en deux molcules de pyruvate par une aldolase 1. Nous savons que l'assimilation de ces produits est des plus banales dans la nature. La dioxygnation extradiol du cycle aromatique dpend le plus souvent dun mtal qui est Fe(II). Le mcanisme est trs diffrent de celui des enzymes ortho. On admet que le fer lie la fois O2 et le substrat. Loxygne tant rendu plus ractif par sa liaison avec le fer attaquerait directement le substrat, sans que le fer ne
1 - Le substrat est le 4-carboxy-4-hydroxy-2-oxovalrate.
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change de niveau doxydation au cours de la raction. Nous aurons loccasion dentrevoir ce mcanisme plus en dtail dans le cas de la dioxygnation du 2,3-dihydroxybiphnyle la section 5. La catchol 2,3-dioxygnase a fait lobjet de nombreuses tudes. Lenzyme de Pseudomonas mt-2 a rvl une structure de type 4. Chaque monomre est constitu de deux domaines homologues qui pourrait reflter une duplication ancienne du gne. Lun de ces domaines porte le Fe(II) avec une gomtrie ttradrique dforme o trois des ligands sont deux rsidus dhistidine et un de glutamate [11]. La plupart des nombreuses enzymes de ce type dj rpertories semblent appartenir une mme famille o se rencontre la protocatchuate 4,5-dioxygnase de Pseudomonas paucimobilis [12]. Il existe cependant plusieurs sous-ensembles. Rhodococcus globerulus possde une dioxygnase plus petite (21 kDa), qui est active sur biphnyles polychlors et na quun seul domaine [13], cette question tant plus dtaille la section 6. Le sujet se complique actuellement par lexistence des dioxygnases de type extradiol o le manganse remplace le fer [14].
10.2 - LE PLASMIDE TOL

Revenons au tolune et ses homologues suprieurs directs, les xylnes. Un des modes d'attaque du tolune consiste hydroxyler le noyau en 3-mthylcatchol. Inversement un autre mode est de s'en prendre au mthyle sans toucher au noyau et de l'oxyder en aldhyde puis en acide. L'intermdiaire cl obtenu est le benzoate, dont l'oxydation complte se fait par la voie mta en actaldhyde, pyruvate et deux molcules de CO2. Tous les gnes codant pour ces oprations sont regroups sur un mme plasmide dsign par TOL. L'archtype de plasmide TOL est le pWW0, dcrit pour la premire fois chez Pseudomonas putida mt-2 par WILLIAMS et MURRAY [15]. Les auteurs avaient remarqu la prsence de deux oxygnases diffrentes actives sur le benzoate, dont une prcisment avait une spcificit tendue et provenait d'un grand plasmide. Le pWW0 a 117 kb. Les gnes de dgradation du tolune en occupent environ 40 kb, soit plus du tiers [16]. Le tolune n'est pas le seul substrat utilis : le m-xylne est galement transform en m-toluate, le p-xylne en p-toluate, d'o le sigle conventionnel xyl utilis pour l'ensemble des gnes. Les bactries munies du pWW0 croissent aussi sur m-thyl-tolune et sur 1,2,4-trimthylbenzne. Le dispositif gntique est assez extraordinaire parce que toute la portion plasmidique comptente est loge dans un vaste transposon de 56 kb (Tn4651), lui-mme encastr dans un transposon plus grand Tn4563) [17]. On a isol et dcrit dans la littrature au moins une vingtaine de plasmides de structure et proprits trs voisines. Ces plasmides sont propres aux Pseudomonas fluorescents, mais existent plus rarement dans d'autres espces, comme Ralstonia eutropha et des entrobactries. Voici une carte simplifie de pWW0 montrant la disposition des deux transposons embots et les gnes xyl. Le sigle tnpA dsigne le gne de la transposase commun aux deux transposons.

Tn4653 Tn4651
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tnpA
pWWO
tnpA xyl
R (gnes rgulateurs) S H KI Q J (voie basse) GF
U W C (voie haute) MA
BN
xyl
DL T E
Deux sries de ractions transforment le tolune et les xylnes. La premire, ou voie haute, est reprsente par l'opron xylUWCMABN et commande l'oxydation du mthyle jusqu' au stade de l'acide, soit le benzoate partir du tolune. La seconde, ou voie aval, correspond xylXYZLTEGFJQKIH, l'opron codant pour la totalit de la voie mta jusqu'aux produits terminaux (actyl-coenzyme A et pyruvate partir du benzoate) [18]. La voie haute, qui transforme le tolune en benzoate, ou les xylnes en toluates, correspond ceci :
CH3 R xylMA R' m-xylne R=H R' = CH3 R CH2OH xylB R' R CHO xylC R' R COO
R'
tolune R=H R' = H
p-xylne R = CH3 R' = H
La voie haute
Il est facile de voir que xylMA code pour une mono-oxygnase, alors que xylB et xylC dterminent deux dshydrognases successives. Que font les autres gnes : xylU, xylW et xylN ? La fonction des deux premiers reste obscure. En effet leur altration par mutation n'a aucun effet sur le mtabolisme du tolune et des autres substrats. La protine XylW pourrait tre une dshydrognase active sur un substrat non identifi [19]. On connat par contre la fonction de xylN. Ce gne coderait pour une porine utilise dans le passage du xylne travers la membrane externe [20]. Au dbut n'avaient t reconnus dans la voie haute que les gnes A, B et C, mais on dcouvrit rapidement que la structure gntique de cet ensemble tait plus complique. L'oxygnase avait deux sous-units (d'o le gne M supplmentaire) et d'autres gnes furent trouvs. L'opron est en fait xylUWCMABN ! XylU et XylW ne
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sont pas ncessaires la dgradation du tolune et drivs. Leur fonction doit s'exercer ailleurs dans le mtabolisme. XylW rappelle par sa squence une dshydrognase contenant du zinc. La voie aval est de type mta comme entrevu antrieurement.
COO R xyl XYZ R' R COO OH OH R' H CO2 xyl L OH R OH R' xyl E R OH COO O xyl G OH 8 tapes pour le mtabolisme du benzoate et du p-toluate, 6 tapes pour celui du m-toluate xyl F R CH2COCoA R xyl H O R'COO R xyl I HO xyl K R O COO xyl J R O COO CO2 COO COO COO COO
R'
CoA
xyl Q
R CH2CHO CH3COCOO
Gne Enzyme XYZ L T E G H Xylne dioxygnase Dine-carboxylate dshydrognase 2 Ferrdoxine Catchol 2,3-dioxygnase
Gne Enzyme I J K Q 4-Oxocrotonate dcarboxylase Hydratase 3 4-Hydroxy-2-oxovalrate aldolase Actaldhyde dshydrognase 4-OH-muconic semialdhyde hydrolase
4-OH-muconic semialdhyde dshydrog. F 4-Oxocrotonate tautomrase
La voie aval
La dioxygnase XylXYZ (dsigne antrieurement par XylD) na que deux composants, o XylZ est une partie rductase, et XylXY la partie dioxygnase [21]. La dioxygnase XylE est instable en prsence doxygne, mais reste ractivable par la protine XylT, une ferrdoxine [2Fe-2S] faite en faible abondance et dont le type se retrouve dans dautres oprons codant pour une voie mta [22]. Cette protine serait le membre dune famille de ferrdoxines dtectes dans dautres systmes de biodgradation, notamment pour le naphtalne et les crsols [23]. Une petite 2 - 1,2-dihydrocyclohexa-3,5-dine-carboxylate dshydrognase. 3 - 2-Hydroxypent-2,4-dinoate hydratase.
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drivation s'observe au niveau de XylF dans la dgradation du m-toluate provenant du m-xylne. Deux chemins divergent avant de converger nouveau. L'hydrolase XylF a t purifie et soumise un examen dtaill par DUGGLEBY et coll. [24]. Cet ensemble gntique a t la cible d'une somme considrable de recherches, car il fallait comprendre comment l'expression des deux oprons tait rgule en fonction du substrat de dpart. Les pices essentielles sont les deux gnes rgulateurs, xylR et xylS. Ils sont prsents dans tous les plasmides de la mme famille. Ils occupent, comme dans pWWO, une position caractristique et sont transcrits de faon divergente par rapport aux oprons qu'ils gouvernent. Leur contribution est essentielle l'expression coordonne des deux oprons. Il y a quatre modes d'asservissement. Le premier est command par XylR et rgle la production de XylS. Le second est le rglage par XylR de sa propre production. Le troisime est le contrle de la voie mta par XylS. Enfin le dernier est l'action de XylR sur l'expression de la voie haute. Le schma est adapt de RAMOS et coll [25]. On distingue les quatre units de transcription, commandes chacune par un promoteur : la voie haute par Pu, la voie mta par Pm, xylS par Ps1 et Ps2 (promoteur double), xylR par Pr. C'est au niveau de ces promoteurs que la transcription des gnes situs en leur aval est facilite ou inhibe.
3-mthyl-benzoate
Pu
xyl UWCMABN
Pm
xyl XYZLTEGFJQKIH
xylS
Ps2,1
Pr xyl R
+
benzoate S S S S S S S R
+ + +
activation de transcription
R xylne tolune
inhibition de transcription
Rgulations de pWWO
Le rgulateur XylR entrave la transcription de son propre gne. Ce dispositif est classique et permet de maintenir la protine rgulatrice un taux faible et constant. XylR intervient au niveau de la rgion Pr (constitue de deux promoteurs en tandem, Pr1 et Pr2). En prsence d'un inducteur, XylR subit un changement de conformation qui modifie ses proprits et le dtourne en partie vers les autres promoteurs Pu et Ps1, lesquels sont activs. La liste des inducteurs possibles comprend des substrats comme le xylne, le tolune, divers produits comme l'alcool benzylique, le p-chlorobenzaldhyde et le m-amino-tolune. XylR est donc le premier robinet qui ouvre le fonctionnement de la voie haute tout en commandant la synthse du deuxime rgulateur, XylS.
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En prsence d'un inducteur, la protine XylR donne le feu vert la transcription, par interaction avec l'ARN-polymrase au niveau d'un promoteur. La polymrase s'y installe normalement grce un facteur d'amorage appel facteur sigma. Il y a plusieurs types de promoteurs correspondant chacun un facteur sigma dtermin. Ici Pu et Ps1 sont des promoteurs d'un type spcial. Ils sont reconnus par le facteur sigma-54 (appel aussi NtrA ou RpoN), spcialis dans la reconnaissance de ces promoteurs. C'est l qu'intervient une situation paradoxale mais classique. XylR devrait se lier l'ADN trs prs du promoteur, pour venir en contact avec la polymrase. En fait il se lie un peu plus loin en amont. Pour que l'amorage de la transcription soit ralis, un complexe ternaire polymrase/sigma-54/XylR doit se former. Cette condition est ralise par une flexion de l'ADN. Elle est facilite par un quatrime facteur capable d'y former un coude : la protine IHF* dans le cas de Pu, HU pour Ps1. Le mcanisme est donc similaire celui qui est mis en jeu dans la dnitrification. Le dessin suivant est une reprsentation nave de cette situation. L'activateur XylR reconnat sur l'ADN une ou plusieurs squences spcifiques, les UAS. L'installation est multiple et cooprative 4. Elle est dclenche par un inducteur. En se liant au tolune, XylR acquiert de nouvelles proprits, s'attache l'ADN sur les UAS et fixe aussi de l'ATP.
XylR ADN
XylR ADN UAS UAS attachement de XylR site IHF 5'-TGGCnnnnnnnTTGCTA-3' promoteur reconnu par sigma-54 xyl UWC...
ARN-polymrase xyl UWC...
La courbure de l'ADN facilite le rapprochement de l'activateur XylR avec la polymrase

Rsumons simplement les diffrentes tapes : Le sigma reconnat le promoteur et le tandem polymrase + sigma attend au feu rouge. En liant un inducteur, XylR a une affinit accrue pour l'ADN sur les sites UAS. Le facteur IHF s'accroche aussi l'ADN et le dforme, mettant XylR en contact avec la polymrase. L'association gnrale ainsi forme remet le feu au vert : la transcription de l'opron peut commencer et dclencher une cascade d'vnements. En effet, la voie haute ainsi induite par le tolune, le xylne et leurs analogues, libre du benzoate ou des drivs benzoques, et ces derniers vont dclencher leur tour le lancement de la voie mta par le promoteur Pm. 4 - L'installation d'une premire unit facilite celle d'une deuxime, et ainsi de suite. La cooprativit de l'association sur l'ADN permet le passage brusque d'un tat o il n'y a rien l'tat o tout est li.
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Que fait la protine XylS ? Son fonctionnement comme activateur ressemble celui de XylR. Elle est produite continuellement partir du promoteur Ps2, mais sa sortie est acclre par XylR sur Ps1 comme indiqu sur le schma. L encore se trouvent des UAS reconnues par XylR. Le coude dans l'ADN n'est pas fait par IHF mais par HU sur le mme principe. XylS seule active faiblement en continu la voie mta et entretient un petit niveau de base des enzymes de la voie aval avant que leur synthse soit fortement augmente quand XylS lie du benzoate. Or celui-ci est engendr par la voie haute. Ce systme d'activation gnrale en deux temps vise l'conomie. Il n'autorise la sortie des enzymes mta en prsence de tolune que si la voie haute a fonctionn, c'est--dire si le benzoate a dj fait son apparition. Que se passe-t-il si le milieu est dpourvu de tolune mais contient du benzoate ? La machine pourrait se bloquer dans la mesure o la production de XylS est rgle par XylR, qui a besoin du tolune pour jouer pleinement son rle. La nature a tout prvu. Nous savons que XylS est form en continu au ralenti, et la voie mta peut tout de mme fonctionner. La prsence de 3-mthylbenzoate peut aussi dclencher l'activation. Nous avons vu que ce compos est transform par une voie mta modifie faisant appel l'enzyme XylF. Celle-ci est produite en mme temps que les autres. Des rglages plus compliqus semblent intervenir. Le promoteur Pm plac l'origine de l'opron mta, n'est pas reconnu par sigma-54, mais par sigma-70, le facteur d'amorage de transcription le plus banal dans la machinerie cellulaire. L'activateur XylS se lie dans la mme rgion un peu en amont, avec un recouvrement partiel des zones d'attachement : il y a peut-tre une comptition entre XylS et le sigma-70 selon un quilibre qui serait dplac dans un sens ou dans l'autre selon qu'il y a du benzoate ou non. Une vaste littrature a t consacre ces rglages, car le plasmide pWW0 et les autres plasmides TOL ont un ct exemplaire. Une bactrie peut acqurir un ensemble gntique sophistiqu et accder ainsi au mtabolisme de composs exotiques dont l'utilisation est rgule. L'origine des plasmides TOL est encore nigmatique. Plus d'une dizaine de plasmides pWW ont t rpertoris et montrent de grandes analogies avec pWW0. Ils ont tous la mme organisation en deux oprons, voie haute et voie aval, avec la mme disposition des gnes dans chacun d'eux. Seuls varient l'ordre des oprons l'un par rapport l'autre, leur orientation et leur distance. On peut y rencontrer des duplications crant une deuxime copie de chaque opron. Celle-ci peut tre est complte ou partielle [26]. Pourtant les plasmides isols dans diffrentes parties du monde conservent de fortes ressemblances. Les voies mtaboliques ont sans doute t assembles de longue date sous forme de plusieurs units gntiques qui ont t transmises et associes par conjugaison, transposition et recombinaison, puis rigoureusement slectionnes. Certains gnes ont des ressemblances marques avec ceux de la voie du naphtalne que nous trouverons dans la section suivante. On a tout lieu de croire que l'organisation des plasmides TOL est le modle d'une situation rpandue dans la nature, par laquelle des orgnismes ont acquis d'un seul coup la possibilit de dgrader des substrats nouveaux.
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10.3 - NAPHTALNE ET SALICYLATE

Le naphtalne est le plus simple des hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP (polycyclic aromatic hydrocarbons, ou PAH) dont il existe une grande diversit dans le ptrole brut. L'environnement en contient en faible quantit mais on en connat mal l'origine. Des hydrocarbures de cette catgorie apparaissent par pyrolyse au cours des feux de fort ou par combution des produits ptroliers. Les HAP ne devraient prsenter par eux-mmes qu'un risque trs faible pour la sant, mais leur transformation en produits cancrignes par le foie en fait des polluants relativement dangereux. Le cas du benzo(a)pyrne est cet gard bien document. Le naphtalne et les HAP faible masse molculaire sont volatils, facilement adsorbs par les lments du sol, et soumis biodgradation par les bactries et les champignons. Les composs suivants ont t dtects dans l'environnement et reconnus comme biodgradables :
naphtalne
anthracne
fluorne
phnanthrne
benzo(a)pyrne
pyrne
La dgradation la mieux connue est celle du naphtalne, dont la transformation en salicylate est spcifie par les plasmides NAH. Les plasmides SAL ont les gnes pour hydroxyler le salicylate en catchol et le minraliser entirement par la voie mta. Certains plasmides NAH ont aussi les gnes de la voie mta et peuvent dgrader compltement le naphtalne. Il est donc de coutume d'appeler "voie haute" la transformation du naphtalne en salicylate et "voie basse" la suite des oprations [27]. Le plasmide NAH7 de Pseudomonas putida est le plus tudi. Les gnes sont groups en deux oprons, nahABCDEF (voie haute) et nahGTHIJKL (voie aval). Le gne rgulateur nahR contrle positivement l'expression des deux oprons. La filiation volutive de ces diffrents plasmides est mal connue. NAH7 et SAL1 sont presque identiques, mais le second ne permet l'utilisation que du salicylate. Il contient pourtant l'opron de la voie haute, mais l'expression de celui-ci est bloqu par l'insertion d'un lment IS [28]. Les diffrents plasmides de ces catgories semblent tous apparents entre eux. La coupure mta catalyse par la dioxygnase l'tape C est assez particulire. Le cycle form est le rsultat d'une cyclisation spontane du produit form [29]. La transformation du naphtalne en salicylate est code par l'opron nahABFCED.

OH O2 OH OH OH
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A
naphtalne COO C O CH3 pyruvate OH COO salicylate OH
B C
O2
COO OH
D
OH COO O
CHO salicylaldhyde
E
D 2-Hydroxycromne-2-carboxylate isomrase E 2-Hydroxybenzaldhyde aldolase F Salicylaldhyde dshydrognase
A Naphtalne dioxygnase B Naphtalne-cis-dihydrodiol dshydrognase C 1,2-Dihydroxynaphtalne dioxygnase
Voie haute
Dans les tapes A et B, nous retrouvons le mcanisme de dioxygnation du benzne. La raction A correspond la naphtalne dioxygnase. peu prs partout o cette enzyme a t tudie se retrouve la mme organisation de base trois composants. La partie hydroxylase proprement dite est un hexamre 3 3 contenant trois sous-units fer-soufre de type RIESKE et trois petites sous-units associes par lesquelles transitent les lectrons. Les deux autres protines partenaires sont une rductase flavinique et une ferrdoxine. La source d'lectrons est NADH. Le locus gntique nahA est donc composite : nahAa (une partie de la rductase), nahAb (la ferrdoxine), nahAc (la partie fer-soufre) et nahAd. L'tape C est une ouverture du cycle en mta selon un mcanisme moins vident que dans les cas dj rencontrs. Elle produit en effet un intermdiaire instable qui se cyclise nouveau. Il y a donc deux oxygnations dans le parcours A-C. La premire utilise en A une source d'lectrons (NADH). La seconde en C est une dioxygnase mta n'utilisant pas de source rductrice. L'opron nahGTHINLKJ de la voie aval (ou opron SAL) intervient ensuite : L encore oprent deux oxygnations, en G et H, dont la premire, catalyse par la salicylate hydroxylase, utilise NADH comme source rductrice. Cette enzyme est une flavoprotine FAD, dont le cycle catalytique fonctionne comme celui de la 4-hydroxybenzoate hydroxylase 5. Les deux oprons sont orients dans le mme sens sur le plasmide NAH7, ports comme dans le cas de pWW0 par un vaste transposon (Tn4655) [30]. L'ensemble du dispositif, induit par le naphtalne, coexiste avec une voie ortho, code par des gnes chromosomiques et induite par le benzoate ou le salicylate [31].Entre les deux oprons de NAH7 et orient comme d'habitude en sens inverse, se trouve le gne rgulateur nahR. 5 - Fixation du substrat en premier, rduction du complexe form, fixation de l'oxygne diatomique, libration du (des) produit(s). Voir la description du cycle au Chapitre 8.
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CO2
(voie ortho) OH OH catchol HCOO HO O CH3 COO O CO2 O COO COO O2 OH
OH COO salicylate
O2
CHO
COO
I J
OH COO COO
pyruvate actaldhyde
CH2
COO
G T H I
Salicylate hydroxylase Ferrdoxine du mme type que XylT [32] Catchol 2,3-dioxygnase 2-Hydroxymuconate semialdhyde dshydrognase
J K L M
2-Hydroxymuconate tautomrase Oxalocrotonate dcarboxylase 2-Oxopent-4-noate hydratase 2-Oxo-4-hydroxypentanoate aldolase
Voie basse
De profondes ressemblances d'organisation et de squences entre les oprons du naphtalne sur NAH7 et ceux du tolune sur TOL ont t remarques par plusieurs auteurs, pouvant indiquer une relation volutive entre les deux systmes de dgradation [33]. La capacit de dgrader le tolune semble extrmement commune dans la nature, et au cours d'une recherche systmatique plus de 100 souches ont t isoles partir de sdiments marins ou de terrains pollus, toutes capables de crotre sur naphtalne comme seule source de C. Elles taient pour la plupart des Pseudomonas. Aucune de ces souches n'avait la catchol 1,2-dioxygnase caractristique de la voie ortho, mais toutes ouvraient le noyau aromatique en mta par une catchol 2,3-dioxygnase [34]. L'impression qui prvaut gnralement est qu'un certain nombre de gnes reprsentant des modles catalytiques anciens ont t remanis, juxtaposs, souvent par groupes entiers, pour se retrouver dans des plasmides transmissibles. Ces derniers ont permis l'adaptation rapide des cellules qui les hbergeaient. Les regroupements ont pu se constituer au hasard. En gardant l'esprit qu'ils se sont effectus dans des populations composes de milliards et de milliards de cellules, celles qui se sont trouves avoir tir le bon numro ont t vigoureusement slectionnes. Elles ont t l'origine des souches nouvelles dont les techniques d'isolement des laboratoires ont rvl l'existence. La mthodologie employe par les bactries porteuses d'un plasmide NAH pour oxyder le naphtalne n'est pas seule tre mise en pratique dans la nature. Les eucaryotes, des champignons aux mammifres, oprent diffremment. Un naphtol (le 1-naphtol ou -naphtol prdomine) ou une naphtoquinone sont forms comme intermdiaires, selon une procdure observe l'origine chez un champignon filamenteux, Cunninghamella elegans [35]. Une mono-oxygnation forme un poxyde qui se r-aromatise en naphtol ou s'hydrate en diol [36]. Le dtail remarquer sur la gauche de la figure est la nature du diol form. Dans un mtabolisme bactrien, le cycle aromatique serait oxygn en un cis-diol. Le produit obtenu ici est le trans-1,2-dihydroxy-1,2-dihydronaphtalne, en bref un diol trans.

H O H
467
OH
naphtalne H OH
poxyde OH OH H 1-naphtol
2-naphtol
transdiol
O O
OH OH
1,2-naphtoquinone
1,2-dihydroxynaphtalne
O 1,4-naphtoquinone
H OH 4-hydroxy-1-ttralone
Le mode eucaryote
Un mcanisme compltement diffrent est l'origine de cet isomre. La formation de l'poxyde intermdiaire est le fait d'une mono-oxygnase identifie comme un cytochrome P450 peu spcifique, agissant non seulement sur les naphtalnes mais sur d'autres hydrocarbures polycycliques. La mme stratgie est utilise par les enzymes P450 du foie des mammifres. Les P450 forment une vaste famille d'oxygnases aux nombreuses potentialits, agissant souvent comme des hydroxylases. Plus d'une centaine de squences sont connues. L'action d'un P450 porte typiquement sur des substrats caractre hydrophobe. Il est intressant de voir que ce modle d'attaque a t largement privilgi chez les eucaryotes, plutt que le schma standard des dioxygnases bactriennes actives sur le cycle aromatique.
10.4 - LES POLYCYCLIQUES

La famille des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) commence par le naphtalne, et peut comporter un nombre plus ou moins lev de cycles. Ce sont des constituants naturels du ptrole brut. Leur libration dans l'environnement se fait par des voies multiples : combustion incomplte des carburants, pollution par des activits de raffinage, abrasion de l'asphalte des routes. Il y en a dans la fume de tabac. Ils contaminent facilement les plantes et les aliments. Le danger vient surtout de leur caractre cancrigne partir de 4 ou 5 cycles dans la molcule. Ce sont donc les membres comportant plus de trois cycles dont la pollution est la plus proccupante [37] lors des mares noires (Erika) ou aprs pandage du crosote utilis pour la conservation du bois. La lgislation restreint maintenant son emploi.
468
Les polycycliques sont traits par les bactries et les champignons sur le mme principe que le naphtalne. Ces hydrocarbures sont rendus peu mobilisables cause de leur caractre hydrophobe. Ils ont un coefficient KOC lev. Leur attaque est d'autant plus lente qu'il y a davantage de cycles dans la formule. L'oxygnation peut s'exercer plusieurs endroits de la molcule et conduire un mlange de produits dont certains sont excrts dans le milieu extracellulaire. La vie moyenne de ces composs dans les sols contamins peut atteindre des mois, voire des annes. Comme la dgradation est souvent incomplte et se fait le plus souvent par comtabolisme, elle peut conduire l'accumulation de composs oxygns rcalcitrants. Pourtant une croissance bactrienne utilisant un poly-aromatique comme seule source de carbone et d'nergie reste possible. Des travaux remontant plus d'une dizaine d'annes en ont fait la dmonstration en cultivant un Pseudomonas paucimobilis sur fluoranthne [38]. Une srie d'autres composs tels que naphtalne, fluorne, anthracne et divers drivs taient galement mtaboliss. Des observations rcentes ont rvl que diverses espces appartenant au genre Sphingomonas ont une aptitude particulire dgrader les polycycliques [39]. Les techniques utilises dans ces tudes ont recours la mesure du CO2 radioactif libr partir de substrats marqus, des changements d'absorption dans l'ultraviolet, et l'identification des intermdiaires par spectromtrie de masse. Les croissances obtenues sont parfois trs lentes, avec un temps de gnration de l'ordre de 12 35 h 30C et pH neutre. La biodgradation des polycycliques par les bactries dbute presque toujours de la mme faon. L'un des cycles est doublement hydroxyl avant d'tre gnralement ouvert en mta, puis entirement dtruit avant que dmarre l'oxydation d'un autre cycle. Voici un schma pour donner une ide de la dgradation du fluoranthne par Pseudomonas, Alcaligenes denitrificans et Mycobacterium [40] :
OH HO
HO OH fluoranthne
OOC
OH O
HOC
OOC
OH
OOC
H O O
Dgradation du fluoranthne
469
La dgradation du pyrne, de l'anthracne et du benzo(a)pyrne (BaP) a retenu beaucoup d'attention. Les intermdiaires de l'attaque du BaP par un Mycobacterium ont t identifis par SCHNEIDER et coll. Le substrat s'effectue par comtabolisme dans un milieu organique complexe. Un premier cycle est ouvert par dioxygnation qui est, selon les cas, de type mta ou ortho.
10 9 8 7 5 6 benzo(a)pyrne 4
OOC
OH O
OOC
COO COO cis-4,5-BaP-dihydrodiol cis-9,10-BaP-dihydrodiol
O HO cis-7,8-BaP-dihydrodiol
OOC
OOC
7,8-dihydropyrne-7-carboxylate
7,8-dihydropyrne-8-carboxylate
Attaque du BaP par Mycobacterium

Ces schmas sont prsents titre indicatif et montrent des variantes selon les espces [41]. On tire de tout cela l'impression que les polycycliques sont effectivement biodgradables, au moins dans une certaine mesure et le plus souvent par comtabolisme. En cas de pollution des eaux et des sols, la disparition de ces produits reste lente, et souvent problmatique. On peut l'acclrer par addition d'agents mouillants dont la fonction est de disperser et de solubiliser le polluant. Il est fait galement recours l'pandage de bactries comptentes. Dans le cas des grosses pollutions comme les mares noires de l'Erika et du Prestige, le traitement biologique des hydrocarbures prsents dans les produits lourds dverss ne semblait pas praticable dans un dlai raisonnable. Restaient la pelle, la brouette et l'huile de coude, et dans cette situation malheureuse, c'est ce qu'il a fallu faire en priorit !
470
10.5 - BIPHNYLE ET PCB

Aprs les poly-aromatiques, nous voici sur de nouvelles douceurs polluantes ! Le biphnyle, renfermant deux cycles benzniques relis par une liaison carbone-carbone, et les PCB, ou polychloro-biphnyles, sont substitus par 1 10 atomes de chlore.
3 2 6' 5' 4 5 6 2' 3' 4'
Biphnyle
Tous ces produits sont artificiels, mais leur premire synthse remonte plus de cent ans. Ils se sont rpandus sur le march grce leur stabilit, leur rsistance aux acides et bases, leur bonne conductibilit thermique. On les rencontre aussi dans les encres, les pesticides. Leurs applications sont varies. La popularit industrielle des PCB est aide par la simplicit de leur synthse, obtenue par passage de chlore gazeux sur le biphnyle 150C avec du chlorure ferrique comme catalyseur. Le rsultat est un mlange trs htrogne de produits plus ou moins chlors appels des congnres 6. Les diverses prparations commercialises ont reu des noms diffrents en fonction du fabricant : Aroclor (Monsanto), Kaneclor (Kanefugli), Clophen (Bayer), Pyralne (Rhne-Poulenc) 7, Fenclor (Caffaro). Les composs ne contenant qu'un seul atome de chlore, comme dans l'Aroclor 1221, ont une certaine solubilit dans l'eau, de l'ordre de 1,5 mg/L. La solubilit diminue avec l'augmentation du nombre de chlores. Par exemple l'Aroclor 1242 et le Pyralne 3000 ont en moyenne 3 atomes de chlore par molcule 8, et leur solubilit est infrieure 0,5 mg/L. Elle devient trs faible partir de 5-6 Cl. Les PCB sont devenus un sujet de proccupation n de leur accumulation dans l'environnement, de leur rmanence (en particulier celle des congnres les plus chlors), et de leur toxicit 9. Aussi la production et la vente des PCB ont-elles t bannies dans de nombreux pays. En outre le danger des pyralnes a t soulign en France la suite d'incendies mettant en cause des transformateurs, car ils ont t considrs comme sources potentielles de dioxines. Les risques rels sont cependant controverss. De gros efforts sont encore dploys pour venir bout des PCB contaminants du sol, o ils restent fortement adsorbs sur la matire organique. 6 - Et non pas des isomres, puisque les constituants du mlange n'ont pas la mme formule brute. 7 - Les pyralnes contenant 4 5 atomes de chlore par molcule ont t utiliss comme excellents dilectriques dans les transformateurs de forte puissance. 8 - La nomenclature des Aroclor traduit la composition. Les deux premiers chiffres donnent le nombre d'atomes de C (12 dans les PCB), les deux autres donnent le pourcentage de Cl en poids, soit 42% pour l'Aroclor 1242, qui a en moyenne 3,2 Cl par molcule. 9 - Les PCB peuvent s'accumuler en petites quantits dans l'organisme humain, y engendrer des effets toxiques dont des migraines, douleurs articulaires, hypertension.
471
La biodgradation des PCB est la fois arobie ou anarobie. Il est assez facile d'obtenir des souches bactriennes arobies cultivables sur biphnyle comme seule source de carbone et d'nergie [42]. Parmi ces germes : Comomonas testosteroni, Pseudomonas cepacia, Ps. putida, Ralstonia eutropha, divers Moraxella, Alcaligenes, Acinetobacter. Des espces bactriennes Gram-positives, comme Nocardia, Arthrobacter ou Rhodococcus ont des potentialits nombreuses [43]. Toutes ces espces sont communes dans les sols. Nous laisserons de ct l'attaque des PCB l'abri de l'air, observe dans les sdiments o s'tablit une dchloration rductrice. Voici quelques principes gnraux de la biodgradation arobie : Les PCB contenant un ou deux atomes de chlore sont ventuellement supports de croissance en prsence de dioxygne. Les congnres contenant davantage de chlore sont gnralement attaqus par comtabolisme [44]. Les PCB sont d'autant moins biodgradables que la molcule contient davantage de chlore. Les congnres porteurs de plus de 5 Cl tendent tre rcalcitrants toute attaque biologique. Les congnres porteurs de deux atomes de chlore en ortho (2,2') tendent tre rcalcitrants, mais sont attaqus par Pseudomonas LB400. Il y a des diffrences marques entre souches. Les PCB porteurs de chlore sur les deux cycles sont moins facilement biodgradables que ceux qui ont un cycle non chlor. L'attaque commence par dioxygnation sur le cycle non chlor ou le moins chlor. L'existence de deux positions adjacentes libres en ortho et mta facilite cette dioxygnation. La minralisation du biphnyle non halogn dbute comme l'indique le schma.
CH3 CHOH OH OH O2 OH OH O2 O OH COO 2 H2O CH2 C=O COO (OHP) COO
A
(A,E,F,G)
(benzoate)
Substrat de croissance
Les lettres A, B, C et D dsignent les quatre tapes codes par les oprons plasmidiques bphABCD prsents dans plusieurs espces, notamment chez un Pseudomonas putida [45]. La double hydroxylation d'un noyau par dioxygnase et dshydrognase obit au schma classique dj rencontr (benzne, tolune : ici tapes A et B). L'tape note A est commande par les gnes bphA. Elle est catalyse par un complexe de trois protines du type habituel associant BphAE, qui est la dioxygnase proprement dite avec ses deux sous-units A et E,
472
la rductase BphG (fonctionnant avec NADH) et la ferrdoxine BphF [46]. Ltape A utilise donc plusieurs gnes A, E, F et G comme il est indiqu 10. L'tape B est celle d'une dshydrognase. En C, une deuxime dioxygnase, code par bphC, ouvre le cycle en mta, avant la double hydratation en benzoate et 2-oxo-4-hydroxypentanoate (OHP). Le mtabolisme ultrieur de benzoate se fait par une voie similaire celle de la "voie aval" du plasmide TOL. En observant avec attention celle-ci, on dcouvre qu'une deuxime molcule d'OHP est forme partir du biphnyl. L'OHP est ensuite scind en actaldhyde et pyruvate par une aldolase, et rcupr ainsi par le mtabolisme intermdiaire.
COO O2 OH OH O2 dioxygnation mta du catchol CH3 HCOO
CO2
CHOH CH2 C=O COO (OHP)
Mtabolisme du benzoate
La situation se complique dans le cas des PCB puisque la prsence d'atomes de chlore peut bloquer la dioxygnation ou accompagner l'apparition d'un chlorobenzoate difficile mtaboliser. Le chlore, lorsqu'il est limin, l'est toujours sous forme d'ion chlorure. Voici comment une souche croissant sur biphnyle comme seule source de carbone et d'nergie entame le 4,4'-dichlorobiphnyl par co-mtabolisme [47].
Cl 4 3 2 1 O2 (BphA) Cl OH OH Cl 3 2 1 OH OH O O2 Cl OH COO 2 H2O CH3 CHOH CHCl C=O COO COO
(BphA)
4 Cl
Cl
Cl
Cl Cl (4-chlorobenzoate)
Substrat comtabolis
10 - Ces dtails sont explicits ici, au risque d'tre indigestes, parce que selon les auteurs le terme "dioxygnase" s'applique l'ensemble du complexe qui transforme le substrat en un cis-diol, alors qu'ailleurs ce mme terme est associ la partie BphAE (une grosse sous-unit, une petite) ou ISP, qui est le vrai catalyseur de l'opration comme dans la double hydroxylation du benzne et du tolune. Les facteurs BphE et BphG sont des protines accessoires acheminant les lectrons de la source NADH vers ISP. Donc dans le premier cas BphA dsigne en bloc tout le complexe, tandis que dans l'autre il ne dsigne que l'une des parties de l'ISP. Pour corser la situation, les sites A, E, F et G sont aussi appels A1, A2, A3 et A4. Do quelquefois des confusions dun article lautre.
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Le premier noyau attaqu est entirement dtruit aprs hydroxylation, ouverture prfrentielle en mta (extradiol) et transformation en un chlorobenzoate. Le principe est donc le mme que celui qui s'applique au biphnyle non chlor. Les diffrentes enzymes dtermines par bphA, bphB et bphC sont galement actives sur les PCB quand le cycle a des positions 2 et 3 non halognes. Nanmoins l'limination du chlore par hydroxylation ce niveau reste possible si la spcificit de la dioxygnase le permet. Cette situation a t examine en dtail chez Burkholderia LB400 [48]. Le tableau montre une srie de congnres contenant 2 5 atomes de chlore, signals par les points noirs. La ligne du bas reprsente les benzoates chlors obtenus aprs les 4 ractions A, B, C et D 11. Ce sont les produits qui posent problme bien souvent, lorsque leur transformation ultrieure est bloque par la prsence de l'halogne.
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
On vrifie sur ces exemples le principe qui veut qu'un des deux cycles soit entirement dtruit avant le second. La premire raction est celle de BphA, la biphnyle2,3-dioxygnase. Il existe une certaine variabilit en fonction des souches, mais la double hydroxylation est tout de mme possible en 2 et 3 du cycle lorsqu'un atome de chlore est prsent dans cette partie, surtout s'il est plac en 2 (ortho). La coupure ultrieure du cycle est gnralement de type mta, soit entre les carbones 1 et 2 comme indiqu prcdemment. Le substrat de dpart ne peut pas assurer la croissance si les intermdiaires chlors ne sont pas transforms jusqu'au bout. Il s'agit alors d'une impasse et un comtabolisme avec un substrat de croissance est ncessaire. Cette situation n'est pas gnrale. Un Acinetobacter peut transformer le 4-chlorobenzoate par dchloration et transformation en protocatchuate. Celui-ci est son tour mtabolis la fois par les voies ortho et mta [49]. En effectuant une culture mixte o ces bactries sont mlanges avec une souche attaquant le chlorobiphnyle, la minralisation complte du substrat de dpart devient possible [50]. L encore, les biodgradations les plus performantes sont ralises par un mlange de souches,
11 - Cette tude a t ralise avec des congnres purifis, non pas avec un mlange de type Aroclor. Il s'agit d'examiner la conversion de chaque substrat individuel, en utilisant la chromatographie et la spectromtrie de masse. Ce type de recherche a donc un ct coteux et laborieux, mais c'est la seule faon d'y voir clair dans l'influence de la position et le nombre des atomes de chlore dans la molcule sur la transformation obtenue.
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la situation normale dans la nature. L'limination des PCB se fait rarement l'aide d'une seule espce de micro-organisme, et une dgradation anarobie peut venir en renfort de l'attaque faite en prsence d'oxygne de l'air. Il existe pourtant une alternative la ralisation de cultures mixtes. Des croisements gntiques entre deux souches de comptences diffrentes engendre des bactries dont les potentialits sont tendues. Ces nouvelles souches dites "construites" sont alors capables d'attaquer une gamme plus vaste de congnres [51]. Une des principales difficults s'opposant la minralisation complte des PCB vient de la multiplicit des congnres en mlange et l'apparition de sousproduits chlors, notamment des chloro-catchols, qui ont des effets toxiques lorsqu'ils ne sont pas immdiatement dtruits. Un blocage peut se produire si la dgradation engendre un chlorobenzoate, lequel n'est pas dgrad plus avant. La souche BN10 de Pseudomonas putida offre cette situation. Elle est capable de se dvelopper sur biphnyle (non chlor) comme substrat de croissance [52]. L'Aroclor 1221 n'a qu'un seul atome de chlore par molcule en moyenne, et la souche ne le dgrade que partiellement en attaquant le cycle non halogn avant de librer dans le milieu le composant rsiduel.
Cl Cl Cl minralisation complte produits accumuls : Cl Cl COO Cl OH OH COO
Biphnyl et Aroclor 1221

Pseudomonas B13 est capable d'attaquer le 4-chlorobenzoate et une gamme assez large de catchols chlors. Une construction gntique partir de cette souche tourne en partie la difficult, mais le 2-chlorobenzoate libr n'est pas attaqu. Une souche performante doit donc regrouper deux sries de potentialits. La premire consiste dgrader l'un des cycles en laissant un chloro- ou polychlorobenzoate comme produit rsiduel. La deuxime achve le travail. Il n'est pas rare que la biormdiation d'un sol contamin par un polluant, lorsqu'elle est incomplte, amne des difficults imprvues, illustres ici par le cas des PCB. Ces derniers sont facilement immobiliss par leur caractre insoluble et leur adsorption sur les particules du sol. Leur attaque incomplte peut engendrer un benzoate halogn, beaucoup plus soluble, qui est susceptible de se voir
475
entraner dans les eaux circulantes o il peut avoir des effets pervers suprieurs ceux du compos de dpart. L'opron phbABC est typique de toutes les souches bactriennes actives sur les PCB. Dans le mtabolisme du biphnyle, l'ouverture mta produit un intermdiaire 12 qui sera scind par une hydrolase avec apparition d'acide benzoque. Lorsqu'il est chlor, cet intermdiaire peut s'avrer rcalcitrant et conduire au blocage. Ces transformations donnent souvent lieu des situations compliques. Pour en donner une ide, voici l'attaque du 4-chlorobiphnyle par plusieurs espces bactriennes (Alcaligenes, Comomonas testosteroni, Pseudomonas putida) [53]. partir du premier intermdiaire form apparaissent d'autres produits ns de la transformation de la chane latrale par rduction, hydrolyse, dcarboxylation. Les ractions n'ont pas toutes t caractrises.
OH O voie meta COO O H COO O OH COO COO O
Cl O O COO
Cl
Cl COO O
Cl COO
Cl
COO
Cl
Cl
Cl
Cl
Une possibilit similaire s'offre en introduisant xylD, le gne qui code pour une toluate dioxygnase. La tendance est donc de faire face ces diffrents problmes par la cration de souches reconstitues avec des gnes de diffrentes origines. Malheureusement les souches construites s'avrent souvent fragiles et peu comptitives quand elles sont rpandues dans l'environnement, ce qui rend leur survie problmatique. Nous retrouverons trs brivement les PCB dans un chapitre ultrieur consacr la destruction d'herbicides. La dchloration des PCB est galement possible en anarobiose. La dgradation anarobie a l'avantage de concerner des congnres plus fortement halogns que ceux qui sont exposs au dioxygne.
12 -2-Hydroxy-6-oxo-6-phnylhexa-2,4-dinoate.
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10.6 - DIOXYGNASES DE L'OUVERTURE EXTRADIOL

Une tape cl de la dgradation du biphnyle et des PCB est donc l'ouverture de l'un des cycles par dioxygnation aprs double hydroxylation, le plus souvent aux positions 2 et 3 (ortho et mta), avant d'tre transform en un catchol. L'ouverture n'a pas lieu entre les deux hydroxyles, comme dans le cas des dioxygnases ortho, mais entre les carbones 1 et 2. Cette rupture "extradiol" est catalyse par la 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase 13, qui n'est autre que BphC. L'enzyme de Burkholderia LB400 offre un cadre favorable l'tude structurale, parce qu'elle est capable d'attaquer une collection de drivs chlors comme signal antrieurement. Sa structure dtaille obtenue par cristallographie [54] a t publie en 1995. Une autre analyse sur la BphC d'un autre germe, Pseudomonas KKS102, a permis de visualiser le substrat en place sur la protine [55]. Les diffrences fondamentales de ces enzymes avec les dioxygnases ortho ont t signales au dbut de ce chapitre. Ces tudes ont permis de prciser la structure du site actif avec une remarquable prcision et ont servi de modle pour les enzymes de la mme famille.
Fe
Le dessin reprsente chane primaire ou charpente polypeptidique (sans les chanes latrales des diffrents acides amins), dans une sous-unit (ou monomre) de la 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase (BphC). Il y a un ion Fe(II) par monomre. Les extrmits de la chane, qui comporte 289 rsidus d'acides amins, sont notes par N et C (N- et C-terminales). Des hlices et des barreaux sont reprs. L'enzyme complte a 8 sous-units et recle donc 8 fois cette structure, les 13 - EC 1.13.11.39.
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monomres formant un arrangement rgulier referm en boule creuse d'environ 250 kDa, dont le diamtre est de 95 angstrms. En examinant cette structure, on ralise facilement qu'il existe une certaine symtrie entre deux domaines, contenant respectivement les extrmits N et C. Un caractre que nous avions dj signal pour la catchol 3,4-dioxygnase. Le fer fait entorse cette symtrie, puisqu'il n'est prsent que d'un seul ct. Il s'agit de deux parties articules de taille et de structures similaires, tout en prsentant entre elles une homologie de squences faible. Cette ressemblance structurale est renforce par l'examen des structures secondaires, c'est--dire des hlices et barreaux le long de la squence. Ce petit diagramme l'explique :
premier domaine deuxime domaine
C motif
Structures secondaires de la catchol 3,4-dioxygnase

Les flches dsignent des barreaux , c'est--dire des segments lis un autre barreau par des ponts hydrogne. Les rectangles sont des hlices . La succession de ces structures dans les replis d'une chane peptidique sont gnralement caractristiques d'une protine donne et sert caractriser les grandes familles de protines dont les membres sont gnralement lis, soit par une mme filiation volutive, soit par une convergence*. On peut remarquer la similitude entre les deux domaines, ainsi que la rptition, quatre fois dans la chane entire, de la succession (en faisant abstraction d'une hlice et d'un barreau intercalaires). Cest pourquoi on suppose quil y a eu duplication d'une squence gntique initiale l'origine d'un premier domaine, puis une nouvelle duplication engendrant les deux domaines successifs. Le mtal n'est prsent que dans le deuxime domaine. Il est possible que le premier domaine ait contenu aussi du fer. Il l'aurait perdu par mutation modifiant la cavit initialement prvue pour le recueillir. Or le fer est dans un environnement caractristique dans le site catalytique. Dans l'enzyme dpourvue de son substrat, le mtal a une sphre de coordinence constitue de cinq lments comme la dioxygnase du catchol, deux rsidus d'histidine, un rsidu de glutamate et deux molcules d'eau, disposs peu prs comme les sommets d'une pyramide base carre. La gomtrie de l'ensemble est rigidifie par un rseau de ponts hydrogne internes la molcule. L'entre du substrat (2,3-dihydro-biphnyl) apporte deux hydroxyles, qui remplacent deux molcules d'eau et entranent une petite distorsion de gomtrie 14 :
14 - Elle devient trigonale bipyramidale (deux pyramides soudes par leur base triangulaire).
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H HO His N N
H OH
HO 2,3-DHB His N 2 H2O His OH N
N His N
O Glu
N N
O Glu
Le fer du site catalytique

Le fer est l'tat rduit Fe(II) et son oxydation l'tat ferrique rend l'enzyme inactive. Cette proprit rend les dioxygnases mta fragiles toute oxydation 15. Comment cette petite mcanique fonctionne-t-elle ? Le fer de chaque monomre est accessible la fois par une ouverture en forme d'entonnoir dirige vers l'extrieur de l'octamre, et par une autre ouverture plus petite tourne vers l'intrieur. L'enzyme, qui est une boule creuse porteuse de 8 sites catalytiques, recevrait donc les molcules de substrat par l'extrieur. Les molcules de dioxygne, plus rapidement diffusibles, arriveraient par l'intrieur. Chaque molcule de substrat se lie un ion mtallique en expulsant deux molcules d'eau et en formant avec celui-ci deux coordinences, le complexe nomm "bidentate" dans la littrature. Dans cette opration, le fer grce son tat rduit tend cder un lectron au substrat 16, et c'est la raison pour laquelle le mtal doit rester ferreux tout au long du cycle [56]. La cavit de chaque site catalytique permet l'enzyme d'accommoder divers biphnyles mono- et dichlors ou des catchols substitus, comme le 3-mthylcatchol. Par contre le catchol lui-mme n'est attaqu qu' taux trs faible. Tous ces caractres se retrouvent dans d'autres dioxygnases de type mta formant une famille indpendante de celle des dioxygnases ortho comme il a t prcis. Les archtypes de cet ensemble sont la catchol-2,3-dioxygnase (par exemple XylE code par le plasmide TOL) [57], la protocatchuate 4,5-dioxygnase [58], et la protocatchuate 2,3-dioxygnase [59]. On y trouve aussi les dioxygnases mta actives dans le mtabolisme du naphtalne, du phnanthrne et autres entits [60].
15 - La position du substrat dans le site actif est dtermine en le faisant pntrer dans le cristal. Habituellement on utilise un analogue non transformable du substrat rel, de faon viter sa destruction au cours de l'analyse. Dans le travail de SENDA et coll., on a tout de mme utilis le 2,3-dihydro-biphnyl, qui est substrat, car entre temps le fer s'tait oxyd dans le cristal, et l'enzyme tait devenu inactive sans modification (espre-t-on) de sa structure initiale. 16 - Le substrat se comporte alors comme un acide de LEWIS, et la situation est inverse de celle qu'on observe dans les dioxygnases de type intradiol.

Glu HOH Fe HOH II O His substrat O Fe Glu II O His O O2 Glu O
479
Glu Fe O II His
His OH COO O
His
O Cl
His
Cl
Fe O O O+ Cl
II
His
His
Cl
Dioxygnation mta d'un 2,3-dihydroxy-chlorobiphnyle

Au vu de ces donnes, il convient de rsumer les proprits des deux familles de dioxygnases scindant le cycle aromatique et contenant du fer non hminique : Dioxygnases orth (ouverture intradiol) [61] Dioxygnases mta (ouverture extradiol)
Enzyme code le plus souvent sur chromosome, spcifique du substrat, transform en un acide muconique. Le fer est l'tat Fe(III). La protine a une coloration rouge. Enzyme souvent code sur plasmide, transforme une gamme largie de substrats en un acide-alcool carbonyl (color en jaune). Le fer est l'tat Fe(II). L'enzyme est facilement inactive par oxydation, par les complexants de Fe(II) : 2,2'-bipyridyl, o-phnanthroline. Fer pentacoordonn haut-spin, avec His, His, Glu, 2 H2O, parfois avec d'autres rsidus. Structure 4 ou 8, avec monomres de 21 ou 35 kDa contenant chacun Fe, ou 22 avec de 35 kDa contenant Fe, de 17 39 kDa. Monomre de 140 rsidus un seul domaine ou 280-300 rsidus en 2-domaines similaires, 4 motifs . Plusieurs familles. Activation d'O2 par liaison au mtal, le substrat se comporte comme un acide de LEWIS.
Fer pentacoordonn : 2 Tyr, 2 His, H2O haut-spin. Nombre variable de monomres identiques contenant chacun du fer, ou appartenant en nombre gal deux types similaires (Pcase), le fer tant prsent dans l'un d'eux. Monomres constitus de 200-250 acides amins, essentiellement en barreaux . Une seule famille structurale. Activation du substrat li au fer, ragit avec O2, se comporte comme une base de LEWIS.
Ce n'est pas tout. La nature n'est pas avare de cas particuliers. Une dioxygnase de l'homoprotocatchuate chez Bacillus brevis ne fonctionne pas avec du fer, mais avec du manganse Mn(II) [62] comme dj signal. Une enzyme similaire a t dcrite chez Arthrobacter globiformis (MndD), et le manganse y est coordonn par le mme dispositif que les enzymes contenant du fer, savoir une pentacoordination avec la participation de deux rsidus d'histidine et un de glutamate. L'enzyme attaque aussi le 3,4-dihydroxyphnyl-lactate [63]. Ces enzymes se distinguent des dioxygnases Fe(II) par leur rsistance H2O2.
480
Il est clair qu'une ligne volutive importante a mis en place les nombreuses dioxygnases mta dj recenses dans l'environnement. Ces enzymes forment un ensemble plus htrogne que les dioxygnases ortho, mais prsentent des similitudes de COO COO squences et d'organisation autour du site CH2 CH2 actif [64]. O2
4 2 3
CHO
OH
COO OH
OH
Dioxygnation de l'homoprotocatchuate
Le problme sera mieux clairci quand la cristallographie nous aura livr davantage de rsultats. Nanmoins la comparaison dtaille de plus de 30 squences permet de se faire une ide sur l'volution de ces enzymes [65]. ELTIS et BOLIN (1996) distinguent une classe principale, la classe I, comportant plusieurs sous-familles, et une classe II moins nombreuse et atypique. Ces dtails sont donns ici pour permettre de se faire une ide des problmes actuels poss par les familles d'enzymes, et par l'importance du sujet dans le cadre de l'environnement. Classe I - la chane est organise en un seul domaine catalytique, ou en deux domaines dont un seul, du ct C-terminal, est catalytique. La comparaison des squences contenant le site actif permet de dgager une structure consensus symbolise par un diagramme. Ont t indiqus les deux domaines du monomre catalytique, la numrotation tant celle de la BphC de Pseudomonas L400. Les flches noires dsignent les barreaux bta, les rectangles sont les hlices alpha. Les positions conserves (une ou plusieurs possibilits) dans une longue liste de dioxygnases (23 au total) sont indiques : elles sont essentielles la structure de l'enzyme ou son activit (ou aux deux). Trois positions interviennent dans la liaison du fer. Enfin le cadre repre la rgion de la squence qui est plus particulirement implique dans la construction du site actif.
1 28 G domaine N-terminal 111 109 P H T N domaine C-terminal 160 LG D Q N 195 H 209 H G E N Q 141
145 142 H
250 241 254 239 260 GH Y N T I V DP G E E P N T A
298
Fe"
Consensus structural
10 OUVERTURE EXTRADIOL - VOIE DU GENTISATE On distingue plusieurs sous-classes :
481
La sous-classe I.1 comprend des dioxygnases masse molculaire plus faible (21 kDa) qui ne renferment qu'un seul domaine. Ce sont en quelque sorte des enzymes o manque toute la partie N-terminale. L'analyse laisse prvoir que ces enzymes sont volutivement les plus anciennes. On y trouve la BphC de Rhodococcus globerulus P6. Assez curieusement, l'espce considre fait trois dioxygnases diffrentes de ce type [66], sans que l'on en comprenne exactement lavantage physiologique 17. Toutes les autres sous-classes ont des chanes domaine double. Ces deux parties ont une parent commune. On pense que la trs ancienne duplication de gnes prcdant leur volution a quelque peu brouill les ressemblances de squence tout en conservant l'allure gnrale, comme on a pu le voir l'examen des structures secondaires de BphC. La sous-classe I.2 renferme des dioxygnases actives de prfrence sur des substrats ne comportant qu'un seul cycle aromatique, comme les catchol 2,3-dioxygnases d'un certain nombre d'espces. Toutes ces enzymes semblent former une mme branche volutive. La classe I.3 est une branche diffrente. Elle renferme des enzymes actives principalement (mais pas exclusivement) sur des substrats deux cycles aromatiques. On y rencontre les BPhC, des dioxygnases du naphtalne et du tolune. Les sous-classes I.4 et I.5 permettent de loger chacune quelques enzymes qui ont diverg quelque peu des prcdentes. Dans la sous-classe I.5 vient se ranger l'enzyme manganse MndD d'Arthrobacter, cite prcdemment : malgr l'importante diffrence du mtal, cette enzyme appartient donc au mme courant volutif. Classe II - elle contient la catchol 2,3-dioxygnase de Ralstonia eutropha, la 2,3-DHPP 18 1,2-dioxygnase de E. coli, et la protocatchuate 4,5-dioxygnase de Pseudomonas paucimobilis. Ce sont des enzymes dont l'analogie avec les prcdentes est plus lointaine. Leur chane a galement deux domaines apparents. C'est le N-terminal qui construit le site actif, mais le consensus est un peu diffrent. Leur origine volutive reste problmatique. Parmi ces trois ensembles de dioxygnases, deux sont plus proches l'un de l'autre (I.1 et I.2), que du deuxime (II). Certains auteurs les classent par I, II et III. Les ressemblances dans chaque ensemble sont confirmes par des comparaisons de squence utilisant des mthodes d'alignement diffrentes. La molcule de certaines di-oxygenases renferment deux types de sous-units ncessaires l'activit, d'autres n'ont qu'un seul type de chane. Ces rsultats restent cependant provisoires. On dcouvre une grande multiplicit de ces enzymes, qui occupent visiblement un crneau majeur au sein des biodgradations.
17 - Le germe a t rebaptis plusieurs fois. C'est la difficult de travailler avec les actinomyctes et apparentes, bactries du sol aux potentialits puissantes, mais peu faciles caractriser et sujettes des "fantaisies" gntiques compliques. 18 - 2,3-dihydroxy-phnylpropionate.
482
Il n'y a pas de ligne de dmarcation nette dans l'emploi des dioxygnases ortho et mta malgr leurs diffrence de structure, de mcanisme et d'volution. Les enzymes des deux types collaborent assez souvent dans une mme voie mtabolique et dans un mme germe, parfois avec des circuits rgulateurs complexes. Cette situation est connue depuis plusieurs dcennies [67]. La participation de plusieurs dioxygnases un mme mtabolisme sera illustre sur un exemple de la section suivante. L'intervention des dioxygnases extradiol dans la biodgradation des aromatiques est donc bien un sujet aussi important que compliqu.
10.7 - AROMATIQUES AZOTS

La fabrication de l'aniline et l'industrie des colorants utilisent en grande quantit le nitrobenzne, un compos gnrateur de produits mutagnes dont l'pandage dans l'environnement est estim plusieurs millions de tonnes par an. La biodgradation des nitro-aromatiques dans son tape initiale a t voque antrieurement dans le cas des nitrotolunes et nitrophnols. Il y a deux faons d'attaquer le groupe azot : le faire sauter sous forme d'ion nitrite sous l'action d'une dioxygnase, ou le rduire en amine par une rductase. On pourra se reporter aux lments antrieurs sur la dgradation des nitrodrivs. Le nitrobenzne nous permettra de faire de nouvelles observations, et de constater l'intervention de l'ouverture mta. Nous retrouvons donc ce nitrodriv entrevu au Chapitre 8, en lexaminant sous un angle plus enzymologique. Ce compos est utilisable comme seule source de carbone, d'azote et d'nergie pour la croissance d'un Pseudomonas pseudoalcaligenes et d'un Comomonas, avec des stratgies diffrentes. Dans le premier cas [68], le nitrobenzne est rduit en 2-aminophnol, qui est son tour pris en charge par une dioxygnase. Un mcanisme similaire a t dmontr dans la dgradation du 1-chloro-4-nitrobenzne [69], considr comme un polluant dangereux. Dans le second cas, le nitrobenzne est oxyd en catchol par une nitrobenzne 1,2-dioxygnase 19. La raction 1, catalyse par la nitrobenzne nitrorductase, est une transformation en deux tapes passant par un stade nitroso fugitif [70]. L'enzyme n'est pas totalement spcifique, accepte aussi le 2-amino-4-chlorophnol, les 2- et 6-aminom-crsols (un mthyle en plus sur le substrat normal). Les recherches sur les nitrorductases ont t stimules par leur prsence dans la flore intestinale (classe II, sensibles O2, voir glossaire). et la possibilit d'apparition de radicaux toxiques. En effet leur spcificit largie (Clostridium, Eubacterium) leur permet de fonctionner comme azorductases [71].
19 - Le chlore est en para par rapport au groupe nitro. Ce compos est une matire premire importante pour des synthses chimiques dans la fabrication de mdicaments, de pesticides et de colorants. La production mondiale a atteint 120 000 tonnes par an. Il est cancrigne et oxyde l'hmoglobine du sang. La lutte contre sa pollution a t dclare comme prioritaire par la CEE.
10 OUVERTURE EXTRADIOL - VOIE DU GENTISATE Elles dcolorent ainsi un certain nombre de colorants diazoques 20.
483
La raction 2 est une isomrisation. Mais l'tape qui nous concerne principalement ici est la 3, car c'est une ouverture mta, o la fonction azote remplace un hydroxyle. La 2-aminophnol 1,6-dioxygnase, de structure 2 2, contient Fe(II) comme seul cofacteur et prsente des analogies avec les dioxygnases mta dj cites [72]. Elle se rattache la classe II dfinie plus haut. Aussi le mcanisme doit-il ressembler assez troitement celui des autres dioxygnases mta en dpit de la prsence du groupe amin. Le semi-aldhyde form est oxyd ensuite en 2-aminomuconate, puis dsamin et transform en intermdiaires du mtabolisme central (cycle de KREBS).
NO2 HNOH [2H] 1 H2O NADH O2 4 NAD+ NO2 OH OH COO N picolinate [2H] 1 2 2-aminophnol 5 6 MC NH2 OH O2 3 NH2 COO CHO
catchol
Enzyme ou raction
1 - Nitrobenzne nitro-rductase 4 - Nitrobenzne 1,2-dioxygnase 2 - Hydroxyl-aminobenzne mutase 5 - Raction spontane 21 3 - 2-Aminophnol 1,6-dioxygnase 6 - Vers mtabolisme central (MC)
Mtabolisme du nitrobenzne
Tout ce dispositif dans Pseudomonas putida HS12 est sous la dpendance de gnes qui sont rpartis sur deux plasmides diffrents (pNB1 et pNB2) [73]. Ce sont les gnes nbzABCDE. L'un d'eux, NbzA est la nitrobenzne rductase, et son gne est transcrit contrecourant de l'opron nbzCDE (2-aminophnol 1,6-dioxygnase, dshydrognase et dsaminase). Le gne nbzB est tout seul. Il code pour la mutase et sa transcription 20 - Ce qui facilite leur dosage. Voir Diazoques. Ces enzymes flaviniques rduisent le Nitrobleu de ttrazolium incolore en le rendant color. Le test colorimtrique est inhib par divers nitrodrivs par un effet de comptition. 21 - Le cycle se ferme par raction de l'aldhyde sur l'amine primaire, formant une sorte de base de SCHIFF. Pour empcher cette cyclisation avant de caractriser le produit, la fonction amine est bloque par du mthylchlorocarbonate et l'aldhyde par pentafluorophnylhydrazine. Le driv est purifi par chromatographie en phase gazeuse et caractris par spectromtrie de masse. Ce genre de difficult n'est pas rare quand le produit d'une raction enzymatique est instable. La mthode serait trs laborieuse pour les tests enzymatiques. On se contente ici de suivre au spectrophotomtre la disparition de l'absorbance du substrat, soit 282 nm pour le 2-aminophnol.
484
A
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES est abondante, ce qui est sans doute utile physiologiquement parce que son substrat, le dihydroxy-aminobenzne, doit tre limin rapidement pour viter des effets toxiques.
C B
pNB1 (59,1 kb)
pNB2 (43,8 kb)
Nous observons ici trois faits caractristiques. Le premier est le regroupement en oprons cataboliques hbergs sur plasmide. Il est ici imparfait si on compare avec le plasmide TOL. Le deuxime est l'existence de rgulations spares pour NbzA et NbzB. En fait ces deux protines sont produites de manire plus ou moins constitutive, la premire tant la nitrobenzne rductase et elle est faite en abondance. La transcription de l'opron nbzCDE, par contre, est induite par le nitrobenzne et dpend aussi d'un activateur fait par l'autre plasmide (pNB2). Enfin le gne nbzB sur le plus petit des deux plasmides se trouve au voisinage de gnes identifiables comme ceux d'une rsolvase et d'une transposase. Le gne nbzB aurait donc t introduit la faveur d'un transposon dont la structure exacte n'a pas encore t dmonte, ou qui n'est plus fonctionnel. Cette situation voque nouveau la possibilit d'un vritable bricolage gntique, les souches ayant acquis de nouvelles potentialits en rcuprant ici ou l une collection de gnes de diffrentes origines, arrivant constituer au hasard un ensemble fonctionnel cohrent. Ce que nous observons chappe souvent notre propre logique. La multiplication des solutions dans la nature et l'absence d'un schma universel suggre que les plasmides de biodgradation ont t assembls maintes reprises partir d'un petit nombre de pices communes, le principal critre de leur maintien tant bas sur la slection naturelle. La raction 4 du schma est celle d'une dioxygnase qui transforme directement le nitrobenzne en catchol et fait partir l'azote sous forme d'ion nitrite. Nous avons dj rencontr cette situation propos du nitrotolune. Pour finir voici une petite incursion dans le mtabolisme du carbazole. Ce produit rput cancrigne et longtemps considr comme rcalcitrant provient des fumes et goudrons de houille, conjointement avec d'autres produits similaires o l'azote est remplac soit par du soufre (dibenzothiophne), soit par de l'oxygne (dibenzofurane, section suivante), ou simplement par un atome de carbone (fluorne). L encore, il existe heureusement des bactries pour s'accommoder de ces ingrdients. Elles ont mme donn lieu des tudes dtailles [74]. La transformation du carbazole en anthranilate met contribution deux dioxygnases successives, la CarA (carbazole 1,9a-dioxygnase), CarB (2'aminobiphnyl-2,3-diol 1,2-dioxygnase) et une hydrolase (CarC). On observera quun atome doxygne est introduit sur un carbone adjacent lhtro-atome. Il en rsulte une structure instable qui entrane louverture spontane du cycle. Ce mcanisme diffre de la double hydroxylation classique dite latrale qui est observe dans la dioxygnation du benzne ou du naphtalne. Le mode particulier observ ici est dsign comme dioxygnation angulaire [75].

NH2 CarA N H carbazole N H
485
OH
OH
HO CarB NH2
OH
NH2 COO anthranilate
CarC O
OOC
OH
Dioxygnation du carbazole
On la dcouvre dans lattaque de divers composs comportant deux cycles aromatiques, htrocycliques ou non, comme le fluorne, le dibenzofurane, le diphnyl-ther et la dibenzo-p-dioxine (section suivante). La protine CarA est une dioxygnase 3 composants qui a t purifie et caractrise [76]. L'anthranilate est ensuite converti en catchol, qui est oxyd son tour par la voie ortho. Il y a donc une similitude avec le mtabolisme du biphnyle. D'ailleurs CarB possde une activit sur le 2,3-dihydroxybiphnyle.
10.8 - DIOXINES !
L'vocation des dioxines s'accompagne gnralement d'une certaine frayeur, car on sait qu'il peut s'agir de substances trs toxiques dose infime, facilement rpandues dans l'environnement par l'activit humaine. L'attention a t attire par l'accident survenu le 10 juillet 1976 dans une usine de Seveso, en Italie : la surchauffe et l'explosion d'un racteur utilis pour la fabrication de 2,4,5-trichlorophnol provoqua la dispersion de 1 5 kg de dioxine et une trs grave pollution 22. Clbre galement sont les mfaits de l'Agent Orange, utilis par l'arme amricaine au Vietnam comme dfoliant. Ce produit rpandu par tonnes tait un mlange parts gales de deux herbicides, le 2,4-D et le 2,4,5-T. Ce dernier contenait des dioxines en impurets. Les consquences dramatiques sur les gens et l'environnement se prolongrent bien au-del de l'arrt de la guerre, et sont encore perceptibles maintenant 23. Les dioxines sont engendres naturellement en 22 - Accident survenu dans une filiale du groupe Roche, ncessitant l'vacuation d'une zone tendue. Les rsidus contamins furent collects dans 41 barils, quittrent l'Italie par Vintimille et disparurent mystrieusement, avant d'tre retrouvs seulement en 1983 dans un abattoir dsaffect du nord de la France. Le contenu fut formellement identifi et l'affaire fit scandale. Les produits furent finalement dtruits dans un incinrateur haute temprature par Ciba Ble. 23 - Et ne sont pas les mfaits les plus graves, cyniquement appels collatraux, au cours des conflits arms!
486
quantits rduites par les incendies de fort, mais la principale source de contamination reste d'origine industrielle : usines d'incinration (combustion du bois trait par PCP ou crosote), fabrication de produits organiques chlors, notamment des herbicides, blanchiment du papier par le dioxyde de chlore. Les dioxines sont galement des contaminants occasionnels du PCP et des polychlorobiphnyls. Elles apparaissent comme des produits accidentels dans les gaz de combution des carburants. Les sources sont multiples et souvent difficiles cerner prcisment. Des normes svres sont maintenant appliques aux usines d'incinration pour limiter les mission de dioxines. Les dioxines proprement dites reprsentent une famille de composs dont les chefs de file sont la dibenzo-p-dioxine, et le dibenzofurane. Leurs drivs contenant du chlore, les polychloro-dibenzo-p-dioxines et polychloro-dibenzofuranes, sont les "dioxines" proprement dites. Il y a 75 formes possibles dans le premier cas, 135 dans le second, soit autant de congnres. Parmi eux, seuls sont toxiques ceux qui ont 4 8 atomes de chlore dans leur molcule, avec l'halogne prsent aux positions 2, 3, 7 et 8. Les congnres ayant moins de 4 atomes de chlore sont peu toxiques. Dans le langage courant, le terme "dioxine" dsigne parfois l'isomre 2,3,7,8-TCDD 24 (ou TCDD), mais correspond gnralement un mlange de congnres. La toxicit de chacun d'eux est compare celle de TCDD comme rfrence et exprime en TEF. La toxicit du mlange est mesure en units TEQ (voir la signification de TEF et TEQ*).
Cl Cl
1 2 3 4
9 8 7
Cl Cl
Cl Cl
9 2 3 4 8 7
Cl Cl
2,3,7,8-ttrachloro-dibenzo-p-dioxine TCDD
2,3,7,8-ttrachloro-dibenzofurane TDF
Les dioxines
La toxicit propre chacun des diffrents congnres est donc trs diffrente selon le nombre et la position des atomes de chlore. On voit sur ce petit tableau que certaines dioxines n'ont aucune toxicit comparable celle du TCDD : Congnre
Mono-, di-, tri-dibenzo-p-dioxines 2,3,7,8-ttra-dibenzo-p-dioxine Autres ttra-dibenzo-p-dioxines 2,3,4,7,8-penta-dibenzo-p-dioxine 1,2,3,4,7,8,9-hepta-dibenzo-p-dioxine
TEF
0 1 0 0,5 0,01
Congnre
octa-dibenzo-p-dioxine 2,3,7,8-ttra-dibenzo-furane Autres ttra-dibenzo-furanes 2,3,4,7,8-penta-dibenzo-furane Autres penta-dibenzo-furanes
TEF
0,001 0,1 0 0,5 0
Ces produits sont trs stables, mais peu solubles dans l'eau et facilement entrans par les particules du sol et les matires organiques. cause de leur caractre lipophile, ils se concentrent facilement dans les tissus adipeux de l'organisme, o 24 - Donc la 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxine.
487
les mthodes d'analyse permettent de les dtecter avec une trs grande sensibilit, qui est de l'ordre de quelques picogrammes par kg 25. Ce taux peut paratre extravagant par sa faiblesse, mais on estime qu'il est tout de mme suffisant pour produire des effets sur la sant. Les dioxines peuvent s'accumuler dans les graisses animales (poisson, poulet) et la principale source de contamination chez l'homme est l'alimentation. Des tudes faites aux Etats-Unis ont montr qu'un homme de 65 kg pouvait ingrer entre 18 et 192 g TEQ par jour [77], la limite tolrable tant estime 650 pg PEQ (10 pg PEQ . kg1) par l'Organisation Mondiale de la Sant [78]. La dcouverte dans une rivire allemande d'un organisme bactrien capable de se dvelopper sur dibenzo-p-dioxine ou dibenzofurane comme seule source de carbone (Sphingomonas RW1), a procur un certain soulagement puisqu'il apparaissait que les dioxines non chlores pouvaient tre biodgradables, ainsi que certains de leurs drivs chlors [79].
OH O O OH OH voies ortho et mta O dibenzo-p-dioxine HO OH
L'attaque faite sur la dibenzo-dioxine et le dibenzo-furane produit dans un premier cas un driv 2,2',3-trihydroxyl du diphnylther, du biphnyle dans le second. Le catchol apparat comme intermdiaire et sa dgradation peut emprunter plusieurs voies (surtout la voie mta). Lorsque le Sphigomonas RW1 est confront dans le sol avec ces dibenzo-contaminants, se pose le problme de son efficacit relle et de sa survie. En effet des intermdiaires toxiques sont librs et se comportent comme bactricides. Pour valuer la survie, une astuce consiste introduire dans le Sphingomonas le gne d'une catchol 2,3-dioxygnase (lenzyme mta) [80]. En talant des chantillons de sol sur bote, on peut reprer rapidement le RW1 parmi les autres germes, car en ajoutant un peu d'une solution de catchol ses colonies se colorent en jaune. La plupart des recherches ont commenc avec la situation la plus simple possible, faisant appel des produits non chlors comme la dibenzodioxine et le dibenzofurane (lequel ressemble par sa structure au carbazole de la section prcdente). Ces composants apparaissent maintenant comme facilement biodgradables, soit par des bactries, soit par des champignons et levures. L'ennui est qu'il s'agit de contaminants non toxiques ou peu dangereux par eux-mmes, alors que leurs drivs polychlors le sont bien davantage.
25 - L'exposition humaine est surtout d'origine alimentaire, la valeur moyenne en France tant estime 1,2 picogramme par kg de masse corporelle et par jour. Il faut une dose un million de fois plus leve de 2,3,7,8-ttrachloro-dibenzodioxine pour avoir des effets toxiques aigus et immdiats ou long terme.
488
Il y a en gros deux stratgies dans la nature pour liminer les dibenzodioxines, dibenzofuranes et apparents (fluorne, dibenzothiophne). La premire repose sur l'oxygnation productrice de drivs hydroxyls faciles scinder par la suite. Elle est pratique par des enzymes qui ont ventuellement une large spcificit, comme la naphtalne dioxygnase [81], et se rencontre aussi bien chez les bactries que chez les levures [82]. La deuxime mthode consiste dtruire en vrac une grande diversit de liaisons chimiques l'aide d'une peroxydase. Elle est pratique par les champignons de la pourriture du bois. C'est probablement la plus efficace, car elle peut s'attaquer des substrats chargs davantage en chlore [83]. La dcouverte de Sphingomonas RW1 a certainement permis de faire avancer le sujet, grce l'analyse de la dibenzofurane-4,4a-dioxygnase [84]. La raction fait un dine-diol qui se raromatise spontanment en 2,2'3-trihydroxybiphnyle. La dibenzo-p-dioxine est galement substrat, et on pourra comparer avec la dgradation du carbazole (p. 485). Nous retrouvons un cas de dioxygnation angulaire.
NADH + H NAD
+
[2Fe2S] FAD A 2e B 2e C [2Fe2S] Fe2+
+ O2
OH
O dibenzofurane
OH
H OH
HO OH 2,2,3-trihydroxybiphnyle
Attaque du dibenzofurane
L'enzyme est encore un systme trois composants, rductase (A) fonctionnant avec NADH, ferrdoxine (B), et dioxygnase proprement dite (C) avec deux sousunits diffrentes contenant des noyaux [2Fe-2S] de type RIESKE et du fer ferreux. En fait cet appareil est redondant chez Sphingomonas. Il y a au moins deux rductases diffrentes (A1, A2) et trois ferrdoxines noyau [2Fe-2S] [85] trs similaires par leur squence et leur structure la putidardoxine 26. La raison de cette multiplicit n'est pas connue, mais on peut penser qu'elle correspond une adaptation permettant de faire face davantage de conditions l'aide d'une meilleure palette d'outils. On connat maintenant diverses souches bactriennes comptentes, par exemple un Terrabacter, Gram-positif capable de crotre sur dibenzofurane comme seule source de carbone, pouvant comtaboliser la dibenzo-p-dioxine ainsi que des drivs porteurs de 1 3 atomes de chlore [86]. Le caractre biodgradable de la dibenzo-p-dioxine, du dibenzofurane et de quelques drivs chlors ne prjuge pas de la situation environnementale du TCDD et
26 - Revoir au besoin en glossaire putidardoxine, terprdoxine, RIESKE.
489
du TDF, qui sont de loin les poisons les plus dangereux. Or leur rmanence dans le sol et les eaux est inquitante, avec un temps moyen de l'ordre d'une anne ! La dgradation bactrienne du TCDD est particulirement lente [87]. Le facteur temps mis part, plusieurs stratgies possibles peuvent conduire la dgradation du DCDD, toutes l'aide d'enzymes dont la spcificit est large trs large.
Cl O Cl O Cl A OH OH Cl OH O 1,2,3-TCDD Seul le cycle A non chlor est facilement attaqu O B Cl Cl OH OH OH OH OH OH Cl Cl Cl Cl Cl
Attaque d'une dioxine

La premire est en arobiose. Elle est pratique ventuellement par les champignons basidiomyctes de la pourriture blanche du bois, les Phanerochaete. Ces derniers, P. chrysosporium et P. sordida, attaquent la lignine en conditions de carence en azote. Les enzymes sont des peroxydases et oprent par un mcanisme radicalaire. Une voie dtaille a t dtermine dans le cas de la 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxine en utilisant des extraits cellulaires. Elle comporte des ractions d'oxydation, rduction et mthylation avec limination de chlorure. Le 1,2,4-trihydroxybenzne apparat comme intermdiaire cl de cette voie, avant d'tre converti par un mcanisme ortho en 3-oxoadipate [88]. Deux enzymes interviennent dans cette attaque, LiP et MnP, la seconde tant une peroxydase utilisant des ions manganse. Chose curieuse, en tout cas utile, l'attaque est d'autant plus rapide que le substrat est davantage chlor (contrairement au cas des PCB, par exemple). Des auteurs japonais ont trouv des conditions o P. sordida dgradait le TCDD 50% en quelques semaines [89], ce qui peut paratre bien lent mais reste tout de mme encourageant. Nous reviendrons ultrieurement sur cet aspect particulier. Une seconde voie est celle des bactries qui oxydent le mthane. Elle utilise le trs large spectre d'action de la mthane oxygnase, capable d'hydroxyler de nombreux substrats. Nanmoins les rsultats exprimentaux ne semblent pas avoir t trs convaincants. La dchloration rductrice en anarobiose est une troisime voie intressante, car elle remplace un un les atomes de chlore par des atomes d'hydrogne. L'avantage est de transformer les drivs les plus toxiques, comme le TCDD, en dioxines moins charges en halognes et inoffensives. Des observations faites pendant plusieurs mois dans les sdiments d'une rivire amricaine pollue ont montr une dchloration progressive des drivs fortement chlors (octa-CDD, hepta-CDD) par une population bactrienne complexe contenant des mthanognes. Chose curieuse la mthanognse tait significative au dbut du processus, et cessait avec l'apparition des produits de moins en moins chlors, jusqu'au
490
stade des 1- et 2-monoCDD. L'volution d'un tel systme est probablement complexe et met contribution la fois des agents biologiques et des ractions chimiques causes par des mtaux, polyphnols et transporteurs d'lectrons membranaires [90].
10.9 - VOIE DU GENTISATE

Le gentisate ou 2,5-dihydroxybenzoate est un intermdiaire cl dans le mtabolisme de substrats aromatiques varis, un rle dj vu pour le catchol et le protocatchuate. Le gentisate nat de la dgradation du m-crsol, du 3-hydroxybenzoate, du salicylate, de l'anthranilate, et d'une varit d'autres produits. Il fait partie des produits de transformation arobie du benzoate, comme le rappelle un plan simplifi :
COO tolune biphnyle COO OH COO voies ortho meta OH OH OH OH benzoate voies ortho meta COO COO OH OH 3-hydroxybenzoate COO OH HO gentisate voie du gentisate voie meta
OH OH protocatchuate
COO
catchol
naphtalne
salicylate
Transformation du benzoate et du naphtalne

Le chemin utilis dpend videmment des espces. Le passage du 3-hydroxybenzoate au gentisate apparat communment chez les actinomyctes [91]. Ce substrat est consomm exclusivement par la voie du gentisate chez Pseudomonas acidovorans alors que Comomonas testosteroni utilise aussi le passage par le protocatchuate et une voie mta. L'utilisation du gentisate est trs simple dans la nature, car il suffit d'une dioxygnation pour rompre le cycle et former un intermdiaire facile transformer en pyruvate et fumarate. La voie du gentisate peut se reprsenter ainsi :

COO OH HO gentisate COO O O2 HO COO O COO COO O H3C pyruvate
OOC
491
COO
OOC
malate
HO
COO
COO fumarate
Transformation du gentisate
La raction essentielle est catalyse par la gentisate 1,2-dioxygnase. Elle produit du malylactate. La naissance du fumarate ne peut se faire qu'aprs une isomrisation autour de la double liaison, produite avant ou aprs scission du malylactate par une hydrolase. Cette isomrisation est cruciale, car sans elle natrait du malate non assimilable. Elle a besoin bien souvent d'un cofacteur qui est le glutathion (GSH), mais ce caractre ne serait pas gnral. La dioxygnase (EC 1.13.11.4) a t identifie et purifie dans un certain nombre d'espces bactriennes [92], o elle se prsente le plus souvent comme un homottramre de 140-150 kDa contenant Fe(II), ou encore comme un dimre chez Pseudomonas putida et Ps. alcaligenes [93]. Elle reste encore moins bien connue que les dioxygnases ortho ou mta. L'enzyme accepte en gnral divers drivs du gentisate, et celle de Sphingomonas peut accepter quelques substrats de remplacement comme le 5-aminosalicylate ou le 3-mthylgentisate. D'aprs les tudes spectroscopiques, notamment en RPE, on suppose provisoirement que le mcanisme catalytique ressemble celui des dioxygnases mta tout en formant une famille de protines tout fait distincte sur le plan de l'volution. Le passage par le gentisate est-il commun dans l'environnement ? Probablement, car on observe cette voie chez une grande varit de micro-organismes o elle fournit une alternative aux voies ortho et mta. Nous prendrons deux exemples, le mtabolisme du naphtalne et celui d'un pesticide, le Carbaryl. Nous savons que la dgradation du naphtalne conduit classiquement au salicylate comme intermdiaire. Elle est dclenche de deux faons. La premire fait appel la naphtalne 1,2-dioxygnase peu slective.
NADH, H+ O2 H OH OH H
naphtalne
NAD+ H 2O
Oxygnation du naphtalne
492
La seconde repose sur la salicylate 5-hydroxylase. Dans le cas du plasmide NAH7 de Pseudomonas putida, le naphtalne tait transform en salicylate (voie haute, opron nahABCDEF), qui tait mtabolis son tour en pyruvate et actaldhyde (voie aval, opron nahGHIJK), les deux parties tant rgles par un gne rgulateur nahR [94]. L'tape cl initiale catalyse par la naphtalne dioxygnase forme un cis-diol sur l'un des cycles aromatiques du naphtalne et substrats similaires. Cette dioxygnation est complte par une dshydrognation et une ouverture mta. Le salicylate intermdiaire est transform en catchol. Un Pseudomonas U2 isol partir d'un champ contamin par du ptrole [95], peut se dvelopper sur naphtalne et possde une naphtalne dioxygnase du type que nous connaissons, code par le site nahA, qui correspond en fait plusieurs gnes, car c'est une enzyme complexe construite sur le modle courant : l'hydroxylase (NahAc + NahAd), la rductase (NahAa) et la ferrdoxine (NahAb). Ce qui est nouveau ici est le passage du salicylate au gentisate par la salicylate 5-hydroxylase, alors que le mtabolisme rencontr antrieurement convertit le salicylate en catchol, celui du naphtalne prsente une bifurcation dans deux directions au niveau du salicylate, vers le catchol ou le gentisate.
COO
1 2 5
OH
NADH, 2 H+ O2 NAD+ H2O CO2
OH OH
5
COO
1 2
OH
NADH, 2 H+ O2 NAD+ HO H2O
COO OH
salicylate
catchol
salicylate
gentisate
Salicylate 1-hydroxylase
Salicylate 5-hydroxylase
Les deux hydroxylases sont des mono-oxygnases, elles utilisent NADH comme source d'lectrons mais sont distinctes. La premire, celle qui fait du catchol, est une flavoprotine catalysant toutes les oprations par elle-mme. La deuxime est une enzyme complexe construite sur le mme principe que la naphtalne dioxygnase ! Elle est code comme elle par deux gnes et contient deux sous-units de taille diffrente, la plus grosse tant de type RIESKE. L'enzyme fonctionne aussi en association avec une rductase et une ferrdoxine. Nous sommes donc en prsence de deux modles de mono-oxygnases attaquant le salicylate. Le premier est flavinique, dcarboxyle et hydroxyle le substrat. Le second est un complexe construit comme les hydroxylases qui greffent deux hydroxyles sur le noyau aromatique : benzne, naphtalne et autres. Le Carbaryl est un pesticide de la famille des carbamates 27, et sa biodegradation illustre l'intervention de la voie du gentisate. L'usage du Carbaryl est trs rpandu
27 - Introduit l'origine par l'Union Carbide. la suite du dsastre de Bhopal, en Inde, la fabrication avait t reprise par Rhne-Poulenc. Comme beaucoup d'insecticides, c'est un inhibiteur de l'actylcholine estrase du systme nerveux. Il est prsent dans plus d'une centaine de prparations commerciales en combinaison avec
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dans la protection des cultures contre les insectes mais il est susceptible de nuire l'environnement 28. Son caractre biodgradable par diverses espces microbiennes (Achromobacter, Blastobacter, Arthrobacter et Pseudomonas) est connu depuis 1972 [96] : leur pouvoir dpend de plasmides qui pourraient avoir t acquis au cours d'une phase rcente de slection. Le mtabolisme du Carbaryl est greff sur celui du naphtalne par l'intermdiaire du 1-naphtol.
pRC1 OCONHCH3 OH OH CHO H2O carbaryl + CH3NH2 + CO2 OH COO OH COO pRC2
1-naphtol
salicylate H2O + CO2
OH gentisate
Dgradation du carbaryl
L'tape initiale est une hydrolyse librant du dioxyde de carbone et de la mthylamine. Chez Arthrobacter RC100, qui crot sur Carbaryl comme seule source de carbone [97], les enzymes responsables de la transformation en gentisate sont codes par deux plasmides diffrents pRC1 et pCR2. Le reste de la voie qui mtabolise entirement le gentisate dpend de gnes chromosomiques. Une opration similaire a t trouve chez un Pseudomonas et d'autres espces. Le 1-naphtol est gnralement trait par la voie du gentisate. On peut se rendre compte l'heure actuelle que ces proprits sont le plus souvent portes par des plasmides transmissibles. Mentionnons pour finir un cousin du gentisate qui est l'homogentisate, avec son atome de carbone supplmentaire. Il est engendr partir de la tyrosine. Ce mtabolisme trs classique comporte une transamination en 4-hydroxyphnylpyruvate (4-HPPA), qui est transform en homogentisate par la 4-HPPA-dioxygnase. Cette transformation arobie diffre profondment de celle qui est pratique par les organismes dnitrifiants. La raction a une particularit qui saute aux yeux. La chane carboxylique s'est dplace d'un cran sur le cycle aromatique par dioxygnation. Le mcanisme est interprt comme similaire un dplacement NIH ou NIH-shift*. L'emploi de dioxygne marqu par 18O a rvl que les deux atomes d'oxygne taient effectivement incorpors dans la molcule produite, un critre essentiel pour dfinir une dioxygnase.
d'autres produits, apparat comme relativement toxique; on suspecte un pouvoir cancrigne et son pandage ncessite des prcautions. 28 - Et en particulier la destruction des abeilles !
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COO C=O CH2 CO2 O2 OH 4-HPPA OH homogentisate OH COO CH2 O2 O COO O COO
COO isom. O O
OOC
H2C
COO
CH3 O actoactate COO OOC fumarate
En particulier l'oxygne marqu n'tait pas prsent dans le CO2 n de la dcarboxylation. La chane latrale tait transporte en bloc sans modification. La preuve est venue de l'emploi du deutrium. En incorporant cet isotope la place de l'un des deux atomes d'hydrogne du groupe mthylne (CH2) dans le 4-HPPA, on rend la molcule chirale. On constate alors que la raction s'accompagne d'une rtention de configuration, trahissant l'absence de toute modification ce niveau. En effet ce marquage a des consquences directes sur le spectre RMN et toute inversion de configuration ou substitution serait facilement dtecte. Cette raction, connue en dtail chez les mammifres [98], est prsente chez les vgtaux et les procaryotes. La structure de la dioxygnase de Pseudomonas fluorescens a t dtermine par cristallographie une rsolution de 2,4 [99]. Chaque sous-unit de l'enzyme, un homottramre, a deux domaines comportant la rptition de modules structuraux rappelant l'organisation de la dioxygnase mta dj dcrite dans ce chapitre (4-hydroxy-chlorobiphnyl dioxygnase). La catchol 2,3-dioxygnase est btie sur le mme principe. Toutes les protines de la mme famille fonctionnent avec du fer non hminique et utilisent probablement le mme mcanisme. Le dessin montre une des voies mtaboliques partant de l'homogentisate chez les Pseudomonas. Elle aboutit rapidement au mtabolisme central. On remarquera l'isomrisation par une isomrase du compos intermdiaire, le 4-malylactoactate, et cest encore une opration tout fait classique. La dgradation de la tyrosine est essentielle chez les plantes et les bactries photosynthtiques, car elle est ncessaire la synthse des pigments chlorophylliens comme celle des quinones et tocophrols. Lorsque l'homogentisate n'est pas rapidement transform, son accumulation provoque une polymrisation en un pigment soluble rougebrun, la pyomlanine, encore appele alkapton 29. La production de pigments de ce type semble banale chez de nombreuses espces bactriennes. On l'a mise en
29 - En franais, on crirait plutt alcapton. L'alcaptonurie, maladie hrditaire rare (urine fonce, atteintes articulaires) vient d'un dfaut au niveau de l'homogentisate 1,2-dioxygnase. Le mdecin britannique A. GARROD a identifi le premier la substance responsable du noircissement de l'urine, lacide homogentisique, et reconnu le caractre hrditaire du dsordre. Le gne humain responsable n'a t localis qu'en 1996 par des chercheurs espagnols, soit 98 ans plus tard, grce une sonde nuclique fabrique en fonction du gne de la dioxygnase du champignon Aspergillus niger.
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vidence chez Vibrio cholerae et Shewanella colwiellana, ainsi que dans des espces marines. La signification physiologique reste mal connue. Il pourrait s'agir d'une raction de stress, d'une rsistance aux mtaux, ou d'un facteur de virulence pour les espces pathognes. On a envisag aussi un rle dans la consolidation des biofims par inhibition des enzymes attaquant les polysaccaharides.
CONCLUSION
L'ouverture extradiol du noyau aromatique possde l'vidence une remarquable souplesse pour attaquer des xnobiotiques de structure plus ou moins complique et porteurs de substituants comme le chlore. Il est vraisemblable que dans la nature des procds nouveaux ont t "invents" ou adapts partir de schmas anciens l'arrive de produits artificiels. Sur le plan de l'volution, l'tude s'avre passionnante. La mutagnse dirige qui permet de modifier le site actif des enzymes dont on connat la structure, permet sans doute d'aller vite et de crer des souches plus performantes. Vont-elles entrer dans les discussions sur les OGM ?
RFRENCES
[1] K U K O R JJ & O L S E N RH (1991) J. Bacteriol. 173 : 4587-4594. [2] B A Y L Y RC & B A R B O U R MG (1984) In "Microbial Degradation of Organic Compounds" , G I B S O N D T ed., Mar c el D e k k er : 253-294. [3] N E W M A N LP & W A C K E T T LM (1995) Biochemistry 34 : 14066-14076. [4] O L S E N RH , K U K O R JJ & K A P H A M M E R B (1994) J. Bacteriol. 176 : 3749-3756. [5] K U K O R JJ & O L S E N RH (1992) J. Bacteriol. 174 : 6518-6526. [6] Hopper DJ & Taylor DG (1975) J. Bacteriol. 122 : 1-6 ; B U S W E L L JA (1995) J. Bacteriol. 124 : 1077-1083. [7] Z Y L S T R A G J, M C C O M B I E W R, G I B S O N D T, F I N E T T E BA (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 1498-1503. [8] P O W L O W S K I J, S A H L M A N L & S H I N G L E R V (1993) J. Bacteriol. 175 : 377-385. [9] W O L G E L S A, D E G E JE, P E R K I N S - O L S O N PE, J U A R E Z - G A R C I A C H , C R A W F O R D RL, M N C K E & L I P S C O M B JD . (1993) J. Bacteriol. 175 : 4414-4426. [10] D A G L E Y S , G E A R Y PJ & W O O D JM (1968) Biochem. J. 109 : 559-568. [11] K I T A A, K I T A S , F U J I S A W A I, I N A K A K, I S H I D A T, H O R I I K E K, N O Z A K I M & M I K I K (1999) Structure Fold Des. 15 : 25-34. [12] N O D A Y , N I S H I K A W A K, S H I O Z U K A I, K A D O K U R A H , N A K A J I M A H , Y O D A K, K A T A Y A M A Y , M O R O H O S H I N, H A R A G U C H I T & Y A M A S A K I M (1990) J. Bacteriol. 172 : 2704-2709. [13] H A N S , E L T I S LD , T I M M I S KN, M U C H M O R E S W & B O L I N JT (1995) Science 270 : 976-980.
496
[14] H A T T A T, M U K E R J E E - D H A R G , D A M B O R S K Y J, K I Y O H A R A H & K I M B A R A K (2003) J. Biol. Chem. 278 : 21483-21492 ; R E Y N O L D S MF, C O S T A S M, I T O M, J O D H , T I P T O N AA, W H I T I N G AK & Q U E L (2003) J. Biol. Inorg. Chem . 8 : 263-272. [15] W I L L I A M S PA & M U R R A Y K. (1974) J. Bacteriol. 120 : 416-423. [16] B U R L A G E RS , H O O P E R S W & S A Y L E R G S (1989) Appl. Env. Microbiol. 55 : 1323-1328. [17] T S U D A M & I I N O T (1988) Mol. Gen. Genet. 213 : 72-77. [18] M A R Q U S S & R A M O S JL (1993) Molec. Microbiol. 9 : 923-929. [19] W I L L I A M S PA, S H A W LM, P I T T C W & V R E C L M (1997) Microbiology 143 : 101-107. [20] K A S A I Y , I N O U E J & H A R A Y A M A S (2001) J. Bacteriol. 183 : 6662-6666. [21] H A R A Y A M A S & R E K I K M (1990) Mol. Gen. Genet. 221 : 113-120 ; W O L F E MD , A L T I E R D J, S T U B N A A, P O P E S C U C V, M U N C K E & L I P S C O M B JD (2000) Biochemistry 41 : 9611-9626. [22] H U G O N, A R M E N G A U D J, G A I L L A R D J, T I M M I S KN & J O U A N N E A U Y (1998) J. Biol. Chem. 273 : 9622-9629. [23] H U G O N, M E Y E R C , A R M E N G A U D J, G A I L L A R D J, T I M M I S KN & J O U A N N E A U Y (2001) J. Bacteriol. 182 : 5580-5585. [24] D U G G L E B Y C J & W I L L I A M S PA (1986) J. Gen. Microbiol. 132 : 717-726. [25] R A M O S JL, M A R Q U S S , T I M M I S KN (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51 : 341-373. [26] O ' D O N N E L L KJ & W I L L I A M S PA (1991) J. Gen. Microbiol. 137 : 2831-2838 ; A E M P R A P A S & W I L L I A M S PA (1998) Microbiology 144 : 1387-1396. [27] Y E N KM & G U N S A L U S IC (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 874-878. [28] Y E N KM , S U L L I V A N M & G U N S A L U S IC (1983) Plasmid 9 : 105-111. [29] E A T O N RW & C H A P M A N PJ (1992) J. Bacteriol. 174 : 7542-7554. [30] Y O U IS , G H O S A D & G U N S A L U S IC (1991) Biochemistry 30 : 1635-1641. [31] C A N E P & W I L L I A M S PA (1986) J. Gen. Microbiol. 132 : 2919-2929 ; T S U D A , M & I I N E T (1990) Mol. Gen. Genet. 223 : 33-39. [32] W I L L I A M S PA, C A T T E R A L L FA & M U R R A Y K (1975) J. Bacteriol. 124 : 679-685. [33] A S S I N D E R S J & W I L L I A M S PA (1988) J. Gen. Microbiol. 134 : 2769-2777 ; E A T O N RW (1994) J. Bacteriol. 176 : 7757-7762. [34] G A R C I A - V A L D E S E, C O Z A R E, R O T G E R R, L A L U C A T J, U R S I N G J (1988) Appl. Env. Microbiol. 54 : 2478-2485. [35] C E R N I G L I A C E & G I B S O N D T (1977) Appl. Environ. Microbiol. 34 : 363-370 ; C E R N I G L I A C E & G I B S O N D T (1978) Arch. Biochem. Biophys. 187 : 121-127. [36] C E R N I G L I A C E & G I B S O N D T (1980) J. Biol. Chem. 255 : 5159-5163. [37] K A N A L Y RA & H A R A Y A M A S (2000) J. Bacteriol. 182 : 2059-2067. [38] M U E L L E R JG , C H A P M A N PJ, B L A T T M A N N BO & P R I T C H A R D PH (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 : 1079-1086. [39] S T O R Y P, P A R K E R H , H A Y A S A K A S S , R I L E Y MB & K L I N E EL (2001) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26 : 369-382 ; P I N Y A K O N G O , H A B E H & O M O R I T (2003) J. Appl. Microbiol. 49 : 1-19.
497
[40] W E I S S E N F E L S W D , B E Y E R M, K L E I N & R H M H J (1991) Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 : 528-535 ; K E L L E Y I, F R E E M E N JP, E V A N S FE & C E R N I G L I A C E (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 800-806. [41] V A N H E R W I J N E N R, W A T T I A U P, B A S T I A E N S L, D A A L L, J O N K E R L, S P R I N G A E L D , G O V E R S H A & P A R S O N S JR (2003) Res. Microbiol. 154 : 199-206. [42] G I B S O N D T, R O B E R T S RL, W E L L S MC & K O B A L VM (1973) Biochem. Biophys. Res. Comm. 50 : 211-219 ; C A T E L A N I D , C O L O M B I A, S O R L I N I C & T R E C C A N I V (1973) Biochem. J. 134 : 1063-1066 ; F U R U K A W A K, S I M O N JR & C H A K R A B A R T Y AM. (1983) J. Bacteriol. 154 : 1356-1362 ; B E D A R D D L, U N T E R M A N R, B O P P LH , B R E N N A N MJ, H A B E R ML & J O H N S O N C (186) Appl. Environ. Microbiol. 51 : 761-768. [43] F I N N E R T Y W R (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46 : 193-218; A S T U R I A S JA & T I M M I S KN (1993) J. Bacteriol. 175 : 4631-4640. [44] S Y L V E S T R E M, M A S S R, A Y O T T E C , M E S S I E R F, F A U T E A U X J (1985) Appl. Microbiol. Biotechnol. 21 : 192-195 ; S H I E L D S MS , H O O P E R S W & S A Y L E R G S (1985) J. Bacteriol. 163 : 882-889 , B E D A R D D L, W A G N E R RE, B R E N N A N MJ, H A B E R L ML & B R O W N JF (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53 : 1094-1102. [45] H A Y A S E N, T A I R A K & F U R U K A W A K (1990) . J. Bacteriol, 172 : 1160-l164. [46] H A D D O C K JD , LM N A D I M & D T G I B S O N (1993) J. Bacteriol. 175 : 395-400. [47] F U R U K A W A K, T O M I Z U K A N & K A M I B A Y A S H I A (1979) Appl. Environ. Microbiol. 38 : 301-310 ; F U R U K A W A K, & M I Y A Z A K I T (1986) J. Bacteriol. 166 : 392-398 ; F U R U K A W A K, H I R O S E J, S U Y A M A A, Z A I K I T & H A Y A S H I D A S (1993) J. Bacteriol. 175 : 5224-5232. [48] S E E G E R M, Z I E L I N S K I M, T I M M I S KN & H O F E R B (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 3614-3621. [49] A D R I A E N S P & F O C H T D D (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 173-179. [50] S Y L V E S T R E M, M A S S R, A Y O T T E C , M E S S I E R F & F A U T E A U X J (1985) Appl. Microbiol. Biotechnol. 21 : 192-195. [51] H A V E L J. & R E I N E K E W (1991) FEMS Microbiol. Lett. 62 : 163-169. [52] M O K R O S S H , S C H M I D T E & R E I N E K E W (1990) FEMS Microbiol. Lett. 71 : 179-186. [53] A H M A D D , S Y L V E S T R E M, S O N D O S S I M & M A S S R (1991) J. Gen. Microbiol. 137 : 1375-1385. [54] H A N S , E L T I S LD , T I M M I S KN, M U C H M O R E S W & B O L I N JT (1995) Science 270 : 976-980. [55] S E N D A T, S U G I Y A M A K, N A R I T A H , Y A M A M O T O T, K I M B A R A K, F U K U D A M, S A T O M, Y A N O K & M I T S U I Y (1996) J. Mol. Biol. 255 : 735-752. [56] B R O D E R I C K JB (1999) Essays Biochem . 34 : 173-189. [57] L E E J, O H J, M I N KR, K I M C K, M I N KH , L E E KS , K I M Y C , L I M JY & K I M Y (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun . 224 : 831-836 ; O H JM, K A N G E, M I N KR, K I M C K, K I M Y C , L I M JY , L E E KS , M I N KH & K I M Y (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 29 : 578-581. [58] A R C I E R O D M & L I P S C O M B JD (1986) J. Biol. Chem. 261 : 2170-2178. [59] W O L G E L S A, D E G E JE, P E R K I N S - O L S O N PE, J A U R E Z - G A R C I A C H , C R A W F O R D RL, M U N C K E & L I P S C O M B JD (1993) J. Bacteriol. 175 : 4414-4426.
498
[60] D E N O M E S A, S T A N L E Y D C , O L S O N ES & Y O U N G KD (1993) J. Bacteriol. 175 : 6890-6901 ; T A K I Z A W A N, K A I D A N, T O R I G O E S , M O R I T A N I T, S A W A D A T, S A T O H S & K I Y O H A R A H (1994) J. Bacteriol. 176 : 2444-2449. [61] Que L. (1989) The catechol dioxygenases, In "Iron carriers and iron proteins" , L O E H R T ed., VCH, New York : 469-524. [62] Q U E L, W I D O M J & C R A W F O R D RL( 1981) J. Biol. Chem. 256 : 10941-10944. [63] W H I T I N G AK, B O L D T Y R, H E N D R I C H MP, W A C K E T T LP & Q U E L (1996) Biochemistry 35 : 160-170 ; B O L D T Y R, W H I T I N G AK, W A G N E R ML, S A D O W S K Y MJ, Q U E L J R & W A C K E T T LP (1997) Biochemistry 36 : 2147-2153. [64] S P E N C E EL, K A W A M U K A I M, S A N V O I S I N J, B R A V E N H & B U G G TD H (1996) J. Bact. 178 : 5249-5256. [65] E L T I S LD & B O L I N JT (1996) J. Bact. 178 : 5930-5937. [66] A S T U R I A S JA & T I M M I S KN (1993) J. Bacteriol. 175 : 4631-4640. [67] F A R R D R & C A I N RB (1968) Biochem. J. 106 : 879-885. [68] L E N D E N M A N N U & S P A I N JC (1996) J. Bacteriol. 178 : 6227-6232. [69] K A T S I V E L A E, W R A Y V, P I E P E R D H & W I T T I C H R- M (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1405-1412. [70] S O M E R V I L L E C C , N I S H I N O S F & S P A I N JC (1995) J. Bacteriol. 177 : 3837-3842. [71] R A F I I F & C E R N I G L I A C E (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 1731-1734 ; R A F I I F & C E R N I G L I A C E (1995) Environmental Health Perspectives 103 , Suppl. 5 ; R A F I I F & C O L E M A N T (1999) J. Basic Microbiol. 39 : 29-35. [72] T A K E N A K A S , M U R A K A M I S , S H I N K E R, H A T A K E Y A M A K, Y U K A W A H & A O K I K (1997) J. Biol. Chem. 272 : 14727-14732. [73] Park H-S & Kim H-S (2000) J. Bacteriol. 182 : 573-580. [74] S A T O S - I , O U C H I Y A M A N, K I M U R A T, N O J I R I H , Y A M A N E H & O M O R I T (1997) J. Bacteriol. 179 : 4841-4849. [75] N O J I R I H , H A B E H & O M O R I T (2001) J. Gen. Appl. Microbiol. 47 : 279-305. [76] N A M J- W , N O J I R I H , N O G U C H I H , U C H I M U R A H , Y O S H I D A T, H A B E H , Y A M A N E H & O M O T (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68 : 5882-5890. [77] S T A N L E Y JS & coll. (1990) Chemosphere 20 : 895-901 ; H A R D I S S O N C , S A L A - T R E P A T JM & S T A N I E R RY (1969) J. Gen. Microbiol. 59 : 1-11 ; O R N S T O N MK & O R N S T O N LN (1972) J. Gen. Microbiol. 73 : 455-464 ; N A K A Z A W A T & Y O K O T A T (1973) J. Bacteriol. 115 : 262-267 ; D A G L E Y S . (1986) In "The Bacteria" , G U N S A L U S IC , S O K A T C H JR & O R N S T O N LN eds, vol. 10 : 527-555. [78] V A N L E E U W E N FX, F E E L E Y M, S C H R E N K D , L A R S E N JC , F A R L A N D W & Y O U N E S M (2000) Chemosphere 40 : 1095-1101. [79] W I T T I C H R- M , W I L K E S H , S I N N W E L L V, F R A N C K E W & F O R T N A G E L P (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 1005-1010 ; W I L K E S H , W I T T I C H R- M , T I M M I S KN, F O R T N A G E L P & F R A N C K E W (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 367-371.
10 OUVERTURE EXTRADIOL - VOIE DU GENTISATE [80] H A L D E N RU, H A L D E N BG & D W Y E R D F (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 2246-2249. [81] R E S N I C K S M & G I B S O N D T (1996) ) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 4073-4080. [82] H A M M E R E, K R O W A S D , S C H F E R A, S P E C H T M, F R A N C K E W & S C H A U E R F (1998) ) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2215-2219. [83] T A K A D A S , N A K A M U R A M, M A T S U E D A T, K O N D O R & S A K A I K (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 4323-4328. [84] B U N Z PV & C O O K AM (1993) J. Bacteriol. 175 : 6467-6475 ; H A B E H , C H U N G J- S , L E E J- H , K A S U G A K, Y O S H I D A T, N O J I R I H & O M O R I T (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 : 3610-3617. [85] A R M E N G A U D J, G A I L L A R D J & T I M M I S KN (2000) J. Bacteriol. 182 : 2238-2244. [86] M O N N A L, O M O R I T & K O D A M A T (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 285-289. [87] M A T S U M U R A F, Q U E N S E N J & T S U S H I M O T O G (1983) Environ. Sci. Res. 26 : 191-219; P A R S O N S JR & S T O R M S MC M (1989) Chemosphere 19 : 885-892. [88] H A M M E L KE, K A L Y A N A R A M A N B & K I R K TK (1986) J. Biol. Chem. 261 : 16948-16952 ; V A L L I K, W A R I I S H I H & G O L D MH (1992) J. Bacteriol. 174 : 2131-2137. [89] T A K A D A S , N A K A M U R A M, M A T S U E D A T, K O N D O R & S A K A I K (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 4323-4328. [90] A D R I A E N S P, C H A N G PR & B A R K O V S K I I AL (1996) Chemosphere 32 : 433-441. [91] H A M M A N N R & K U T Z N E R H J (1998) J. Basic Microbiol. 38 : 207-220. [92] C R A W F O R D RL, H U T T O N S W & C H A P M A N PJ (1975 ) J. Bacteriol. 121 : 794-799 ; H A R P E L MR & L I P S C O M B JD (1990) J. Biol. Chem. 265 : 6301-6311 ; S U A R E Z M, F E R R E E & M A R T I N M (1996) FEMS Microbiol. Lett. 143 : 89-95 ; W E R W A T H J, A R F M A N N H A, P I E P E R D H , T I M M I S KN & W I T T I C H RM (1998) J. Bacteriol. 180 : 4171-4176. [93] F E N G Y , K H O O H E & P O H C L (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 946-950. [94] Y E N KM & S A R D A R C M (1988) Crit. Rev. Microbiol. 15 : 247-268. [95] F U E N M A Y O R S , W I L D M, B O Y E S AL & W I L L I A M S PA (1998) J. Bacteriol. 180 : 2522-2530. [96] S U D RK, S U D AK & G U P K A KG (1972) Arch. Microbiol. 87 : 353-358 ; C H A P A L A M A D U G U S & C H A U D H R Y G R (1991) Appl. Env. Microbiol. 57 : 744-750 ; H A Y A T S U M & N A G A T A T (1993) Appl. Env. Microbiol. 59 : 2121-2125. [97] H A Y A T S U M, H I R A N O M & N A G A T A T (1999) Appl. Env. Microbiol. 65 : 1015-1019. [98] L E I N B E R G E R R, H U L L W E, S I M O N H & R T E Y J (1981) Eur. J. Biochem. 117 : 311-318. [99] S E R R E L, S A I L L A N D A, S Y D , B O U D E C P, R O L L A N D A, P E B A Y - P E R O U L A E & C O H E N - A D D A D C (1999) Structure Fold 15 : 977-988.
499
CHAPITRE 11 LES AROMATIQUES L'ABRI DE L'OXYGNE

Il n'a t question jusqu' prsent que de l'attaque arobie des aromatiques. Heureusement la prsence de l'oxygne de l'air n'est pas indispensable pour dgrader ces lments dans la nature, car sinon ils risqueraient de s'accumuler indfiniment dans les sdiments et profondeurs du sol. Heureusement leur mtabolisme est activement poursuivi l'abri de l'air, mais fait appel des solutions originales comme la voie du benzylsuccinate. Nous dcouvrirons que le coenzyme A est bien souvent un cofacteur essentiel de ces transformations. 11.1 - Attaque anarobie par les dnitrifiants 11.2 - Benzne - tolune - thylbenzne - crsol 11.3 - La voie du benzylsuccinate 11.4 - La dshydroxylation du cycle aromatique 11.5 - Les voies anarobies du benzoyl-coenzyme A 11.6 - Dshalognations arobies utilisant le coenzyme A 503 507 512 516 520 523
11 LES AROMATIQUES L'ABRI DE L'OXYGNE

Il n'a t question jusqu' prsent que de l'attaque arobie des aromatiques. Heureusement la prsence de l'oxygne de l'air n'est pas indispensable pour dgrader ces lments dans la nature, car sinon ils risqueraient de s'accumuler indfiniment dans les sdiments et profondeurs du sol. Le mtabolisme anarobie pour les recycler est lui aussi trs actif.
11.1 - ATTAQUE ANAROBIE PAR LES DNITRIFIANTS

Le cycle aromatique serait rsistant toute atteinte en l'absence d'oxygne molculaire s'il n'existait des mtabolismes de remplacement dont font partie la dnitrification et autres respirations anarobies. Les organismes capables d'utiliser le nitrate et autres oxydes dazote comme accepteurs d'lectrons sont extrmement rpandus dans les eaux et les sols et cohabitent facilement avec des espces arobies proprement dites. Les composs aromatiques sont trs abondants dans la nature et souvent massivement enfouis l'cart du dioxygne. Ils ne sont pas uniquement des polluants librs par l'activit humaine comme le benzne ou le phnol, mais de trs nombreux produits naturels de transformation des acides amins aromatiques (phnylalanine, tyrosine, tryptophane), et notamment l'norme masse de drivs varis issus de la chimie de la lignine. La dnitrification autorise leur dcomposition, mais utilise des voies distinctes du mtabolisme arobie et ce sera le sujet de cette partie. Les premires avances ont t faites avec deux espces dnitrifiantes proches l'une de l'autre, Thauera aromatica et Azoarcus evansii, et avec un phototrophe (Rhodopseudomonas palustris). Dans la majeure partie des cas, la transformation des aromatiques commence par les chanes latrales aliphatiques qui sont rognes par oxydation. Ainsi la tyrosine (I) est dsamine et transforme en drivs para-hydroxyls de lacide phnylpropionique (II), de lacide phnylactique (III) et de lacide benzoque (IV). Ce mtabolisme aboutit au p-crsol (V) et au phnol (VI) [1]. L'acide p-hydroxyphnylactique (III) est galement une source d'acide homogentisique, et le tryptophane (VII) conduira au scatole (VIII), lindole (IX) et lacide salicylique (X), lui-mme trs rpandu en chimie vgtale 1. 1 - Possde une action hormonale dans les ractions de dfense des plantes au cours dun stress; tir de lcorce de saule (Salix), a conduit linvention de laspirine.
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COOH H2N CH CH2 COOH CH2 CH3 COOH CH2
COOH
CH3
OH I
OH II
OH III
OH IV
OH V
OH VI
De la tyrosine au phnol
Il convient dajouter ces constituants naturels les produits ptroliers devenus avec leurs drivs des causes de pollution depuis plus dun sicle. Ils entrent dans la catgorie des "BTEX".
COOH H2N CH CH2 CH3 COOH N H IX X NH2
N H VII VIII
N H
Du tryptophane l'acide salicylique

On peut se consoler en considrant que le ptrole est aussi un produit naturel, assimilable une roche liquide. La Bible fait mention du bitume propos de la construction de la tour de Babel. Il a t employ depuis des temps trs anciens comme liant dans les constructions en briques. Le ptrole tait connu depuis lAntiquit, utilis dans la pharmacope et pour lclairage, connu en Chine et plusieurs pays dorient depuis plusieurs millnaires. Plus rcemment, le bitume a t utilis par les peintres pour produire une couleur brune. Le bitume de Jude a servi aux premiers essais de photographie par Nicphore NIEPCE, qui utilisa laction de la lumire sur cette matire. Lentre du ptrole dans lre industrielle date de 1859 quand le colonel DRAKE a fait jaillir le ptrole du premier forage en Pennsylvanie. Le ptrole brut est trs htrogne en fonction de son lieu dextraction et contient un mlange complexe de nombreux hydrocarbures dont les composants moins de 4 ou 5 atomes de carbone existent aussi mlangs au mthane dans le gaz naturel. Lorigine du ptrole est une question passionnante, mais qui sort de notre sujet. Les gologues considrent gnralement le ptrole comme une roche liquide mtamorphique recuite au cours de millions dannes grande profondeur entre 100 et 300C, partir dune substance dorigine organique appele krogne. Certains spcialistes continuent nanmoins donner au ptrole une origine tellurique au moins partielle. L'un des principaux dfenseur de cette thorie est Thomas GOLD [2] et la somme des arguments rend plausible une double origine, la fois biogne et des profondeurs de l'corce terrestre.
505
Des infiltrations naturelles de ptrole ou de bitume ont lieu en plusieurs lieux du globe depuis des milliers dannes, par exemple dans le Golfe du Mexique. Plus de 600 points ont t reprs par le programme EarthSat, car de petites quantits de ptrole suintent des sdiments et remontent la surface en formant des nappes extrmement fines et indcelables lil nu. Trois litres de ce ptrole suffiraient pour staler sur plus de 2 kilomtres carrs avant dtre dtruits par les bactries et laction photochimique ( R . MITCHELL, programme EarthSat, Janvier 2000). Les suintements sont dtects par radar partir de satellites, car le ptrole rpandu sur leau modifie la tension superficielle, aplanit un peu les vagues et modifie lcho radar. On a tent destimer le tonnage de ces panchements de ptrole : prs de 80 000 tonnes de produit seraient ainsi rpandues sur les ocans chaque anne. Cette pollution est sans doute bien tolre par lenvironnement car elle est trs progressive et faite dans des conditions o l'action biologique peut s'exercer. Les conditions sont bien diffrentes de celles des mares noires. Les hydrocarbures aromatiques ou polyaromatiques ne sont qu'une part relativement minoritaire du ptrole brut, mais ce sont les plus redouts cause de leurs proprits cancrignes. La pollution massive par le ptrole brut rsulte le plus souvent des naufrages maritimes ou de conflits arms (guerre du Golfe). Les missions partir des raffineries et des circuits de distribution sont gnralement des hydrocarbures profondment modifis par ptrochimie. Heureusement, comme les hydrocarbures taient prsents dans lenvironnement bien avant lindustrie humaine, la nature tait prpare depuis longtemps traiter ce genre de composs. Il nous reste en exploiter les possibilits ! La dnitrification en anarobiose facilite llimination dun foule de constituants dont la liste est assez longue pour les seuls aromatiques : tolune, thylbenzne, xylnes [3], 4-chlorobenzoate [4], 4-hydroxyphnylactate, phnylactate [5], 4-hydroxybenzoate, phtalate [6], crsols [7], acnaphtne et naphtalne [8]. Nous reviendrons ultrieurement sur le cas des monoterpnes [9], du cyclohexanol [10], des produits saturs et des hydrocarbures aliphatiques, tous transformables par dnitrification. Le phnylactate est libr en abondance dans l'environnement, en grande partie par l'action des micro-organismes. Un mtabolisme en milieu ar pourrait comporter l'ouverture du cycle comme pour le tolune et autres aromatiques, une ouverture du cycle sous l'action de mono- et dioxygnases. L'action de ces enzymes est impossible en anarobiose. Les stratgies utilises comportent des oxydations par des accepteurs de remplacement comme le nitrate, ou des rductions du cycle provoquant la perte de son caractre aromatique. Le trait dominant de l'attaque anarobie des acides aromatiques est l'intervention initiale du coenzyme A, beaucoup plus frquente ici qu'en milieu ar. Le coenzyme A (CoA ou HSCoA) tablit avec les acides carboxyliques une liaison thioester qui est gnralement indispensable leur mtabolisme. Un court rappel des proprits du coenzyme A se trouve en glossaire. Des Pseudomonas dnitrifiants attaquent le phnylactate (PA) et le 4-hydroxyphnylactate (4HPA) en anarobiose. Les Pseudomonas ont une taxonomie souvent incertaine, mais ont une importance immense dans les biodgradations de l'envi-
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ronnement. On les a longtemps considrs comme des arobies mtabolisme respiratoire et capables d'oxyder un nombre important de composs organiques. En fait la facult de dnitrifier a t reconnue chez de nombreuses espces qui participent des associations de micro-organismes dans les sols et les eaux. Une quipe allemande a mis en vidence l'oxydation du phnylactate et du 4HPA par un Pseudomonas sp. [11]. L'attaque dbute par la formation d'un thioester avec le coenzyme A sous l'effet d'une ligase, et se poursuit par un mcanisme particulier qui est la-oxydation. Le rsultat est le benzoyl-CoA. Les trois premires ractions comportent des oxydations couples la rduction du nitrate en nitrite, sans intervention du dioxygne. Elles sont rsumes par un schma :
O COO H+ CH2 C CH2 O SCoA COO C CO2 SCoA O C CO2 OH 4-hydroxybenzoyl-CoA + 2 e H+
1
OH ATP HSCoA OH AMP PPi H2O
2
OH HSCoA + 4 e 3 H+ HSCoA
a-oxydation du 4-hydroxyphnylactate
La premire raction 1 est typiquement celle dune ligase. Le phnylactyl-CoA est un intermdiaire normal du mtabolisme de la phnylalanine par Thauera aromatica [12]. La deuxime (2) met en jeu 4 lectrons, car elle quivaut la mise en place dun hydroxyle puis d'une oxydation en ctone. Les marquages par 18O montrent que loxygne insr provient de leau et parvient au phnylglyoxylate. Le mcanisme propos pour cette -oxydation fait tat d'un intermdiaire nol comme l'indique la figure [13] :
O C H C H SCoA
O C
SCoA H+ OH
SCoA C C OH COO C O
H+
H C
phnylactyl-CoA
nol
H++ 2 e HSCoA
phnylglyoxylate
Mcanisme de l'oxydation en a
Il y aurait donc bien deux oxydations successives 2 lectrons chacune, la premire tant le dpart dun ion hydrure (H). Le coenzyme A et le cycle aromatique adjacents faciliteraient lattaque nuclophile des ions OH, qui ne feraient que remplacer lhydrure pour former lnol. Ce systme enzymatique est inductible et li la membrane. L'enzyme est facile doser par colorimtrie laide de DCIP comme
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beaucoup de systmes flaviniques, et les accepteurs naturels seraient les quinones respiratoires. La dernire tape (raction 3) ressemble la dcarboxylation et oxydation du pyruvate et forme le 4-hydroxybenzoyl-CoA (encadr). Les dcarboxylations de ce type en milieu anarobie se font habituellement l'aide d'une ferrdoxine comme accepteur. Cette voie est lapplication dune opration banale dans la nature, consacre la dgradation anarobie des acides amins aromatiques. Le mme principe s'observe au cours de lattaque d'assez nombreux substrats aromatiques et cest en cela quil est important. Ainsi la phnylalanine est mtabolise par dsamination et oxydation en phnylglyoxylate par une oxydorductase 4 lectrons. Cette enzyme membranaire est induite en prsence de phnylalanine ou de phnylactate dans les conditions dnitrifiantes. La dnitrification na pas lexclusivit de cette -oxydation 4 lectrons. Elle ne fait quutiliser un mcanisme quon voit aussi dans les fermentations propioniques et glutamiques. On s'attend trouver une famille denzymes toutes spcialises dans des hydroxylations anarobies de ce type. Leur origine volutive est suppose trs ancienne. Les oxygnases seraient venues les dtrner au cours de la monte de l'oxygne molculaire dans la biosphre.
11.2 - BENZNE - TOLUNE - THYLBENZNE - CRSOL

la liste des composs aromatiques susceptibles d'tre attaqus par les dnitrifiants s'ajoute le benzne, un contaminant important cause de sa prsence dans les produits ptroliers, son emploi dans l'industrie des solvants, et la facilit avec laquelle il se rpand dans les nappes phratiques. Il accompagne volontiers le tolune, l'thylbenzne et les xylnes pour former en abrg les BTEX. La solubilit de ces produits dans l'eau n'est pas ngligeable. Elle atteint 1,8 g/L pour le benzne. Il existe des bactries dnitrifiantes capables de minraliser le benzne en anarobiose. Les Dechloromonas isols par COATES et coll. [14] sont des Gram-ngatifs anarobies facultatifs, capables d'oxyder une gamme tendue de substrats aromatiques dont le 4-chlorobenzoate, de substances humiques (AHDS) et d'acides organiques varis. L'accepteur d'lectrons est le nitrate ou le chlorate, et la minralisation complte du benzne correspond : C6H6 + 6 NO3 + 6 H+ 6 CO2 + 3 N2 + 6 H2O
Deux exemples dhydrocarbures permettent de se faire une ide sur les stratgies mises en jeu au cours de la dnitrification. Lthylbenzne et le tolune sont assez facilement biodgradables, que le dioxygne soit prsent ou non. Lattaque en milieu arobie ferait appel des oxygnases prenant pour cible la chane latrale, oxyde en carboxylate, ou le noyau lui-mme en donnant un catchol. La dnitrification utilise une voie diffrente en deux grandes phases. La premire consiste modifier le noyau aromatique de manire crer lacide benzoque, qui est ensuite condens avec le coenzyme A en benzoyl-CoA . La deuxime phase consiste
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transformer celui-ci par un mtabolisme rductif que nous examinerons dans la section suivante. Retenons deux faits majeurs. 1. l'oxydation du substituant latral en acide carboxylique, acide benzoque ou homologue, 2. la liaison thioester avec le coenzyme A. Par exemple, lthylbenzne et le tolune conduisent au benzoyl-CoA, le p-crsol au p-hydroxybenzoyl-CoA, et ainsi de suite en ce qui concerne les substrats aromatiques. La transformation de lthylbenzne lie la dnitrification commence par deux dshydrognations successives pendant lesquelles un atome doxygne venant de l'eau est introduit. Une carboxylation et une ligation conduisent au benzoyl-actate, puis au benzoyl-CoA et l'actyl-CoA [15].
COOH CH3 CH2 CH3 CHOH CH3 C O CH2 C O ligase COSCoA CH2 C O benzoyl-CoA CH3CO-SCoA actyl-CoA HSCoA COSCoA
ATP NAD+ NAD+ CO2 HSCoA
De l'thylbenzne au benzoyl-coenzyme A
La premire intervention du coenzyme A est catalyse par une ligase*. LATP est hydrolys en AMP et pyrophosphate, et sert de source dnergie. La deuxime intervention est une thiolyse oprant la scission du benzoyl-actate-CoA comme indiqu par le pointill. Les bactries dnitrifiantes proches de Thauera selenatis poursuivent la minralisation jusquau stade CO2 et obtiennent une nergie globale estime 4,15 kJ par mole partir des valeurs standard. Une valeur modeste qui autorise tout de mme le dveloppement de ces bactries en l'absence d'une forte concurrence. Presque une misre ! Mais dans la nature on a tout le temps, surtout quand on est seul savoir effectuer lopration. Ces mmes bactries peuvent crotre lentement par dnitrification sur ptrole brut ! Un autre exemple est celui d'un Pseudomonas cultiv en conditions dnitrifiantes sur le tolune ou sur p-crsol comme seul substrat de croissance [16]. La multiplication sur tolune tait lente (un seul doublement par 24 h), mais avec un excellent rendement de croissance, soit 57 g de biomasse (poids sec) par mole de substrat (92 g). Les calculs ont montr quune grande partie du tolune oxyd des fins nergtiques tait minralise jusquau stade CO2. Comment ? Les bactries adaptes au tolune consommaient aussi le benzoate ainsi que lalcool et laldhyde correspondants. L'acide benzoque serait produit par oxydation du mthyle prsent dans le tolune, mais les diffrences avec le mtabolisme arobie sont trs importantes. La premire tape est une hydroxylation du groupe mthyle. Lenzyme responsable ne peut pas tre une oxygnase, mais une hydroxylase particulire (remplace H par OH) qui effectue en mme temps une oxydation o latome doxygne est introduit partir du solvant. Le coenzyme A intervient en aval et conduit au benzoyl-CoA.

CH3 H2O CH2OH CHO COOH HSCoA
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COSCoA
tolune
2 e + 2 H+
2 e + 2 H+
2 e + 2 H+
ATP
benzoyl-CoA
Oxydation du mthyle par la mthylhydrolase

Le mme principe s'appliquerait la dgradation de divers substrats : 4-hydroxybenzoate, p-crsol, m-xylne. L'existence d'une oxydation directe sur le mthyle en conditions dnitrifiantes a t confirme dans un Pseudomonas qui fait apparatre du benzaldhyde et du benzoate [17]. La mthylhydroxylase du p-crsol est facile doser par rduction du DCIP et a t bien caractrise [18]. La transformation en aval passe par le p-hydroxy-benzoyl-CoA [19].
CH3 H2O COOH COSCoA COSCoA
HSCoA
OH p-crsol
2 e + 2 H+ 2 e + 2 H+ mthylhydrolase
OH
ATP
OH 2 e + 2 H+
H2O
benzoyl-CoA
4-hydroxybenzoyl-CoA rductase
Dgradation du p-crsol
La mthylhydrolase catalyse dun seul coup les deux oxydations successives comme dans le cas du tolune, mais on assiste ici la disparition de la fonction phnolique. Elle se fait au cours de la rduction du 4-hydroxybenzoyl-CoA (4HBC) en benzoyl-CoA. Cette raction est remarquable, car elle chasse l'hydroxyle du cycle aromatique par rduction dans des conditions physiologiques, alors qu'en chimie organique des conditions brutales seraient ncessaires. Lenzyme a fait lobjet dun examen dtaill [20]. Ce scnario n'explique pas lexistence dune minralisation anarobie du benzne. Puisque le noyau ne comporte pas de substituant carbon, le passage par un stade benzoyl-CoA semblerait improbable. Pourtant cette minralisation en anarobiose a t constate dans des populations microbiennes mixtes tires de divers sdiments. Elle peut s'accommoder d'accepteurs d'lectrons varis. L'emploi de benzne marqu a prouv la formation de phnol et de benzoate comme intermdiaires, mais l'tude en culture pure s'est avre difficile. Deux souches de Dechloromonas ont t isoles comme capables d'oxyder le benzne en CO2 et H2O avec le nitrate comme accepteur [21]. La voie utilise restait problmatique. Le marquage a rvl que le carbone carboxylique du benzoate provenait du cycle. Il y aurait intervention d'un corrinode, suggrant la prsence d'une mthyle transfrase qui utilise habituellement ce type de cofacteur. Le benzne serait mthyl en tolune, celui-ci tant oxyd en benzoate [22]. Mais l'origine du mthyle provenant du cycle benznique reste obscure.
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Lacide benzoque par sa fonction carboxylique est donc conduit jouer un rle central. Les carboxyles semblent vus par le mtabolisme cellulaire comme des groupes encombrants et trop facilement ionisables qu'il faut modifier aussitt. Leur transformation peut intervenir dans plusieurs directions, les principales tant la dcarboxylation, l'estrification et la thio-estrification. Le coenzyme A est le principal acteur de la troisime solution. La liaison thioester forme avec le carboxyle conduit un acyl-CoA et s'tablit sous l'action d'une ligase. Rappelons qu'une ligase hydrolyse lATP en AMP et pyrophosphate. Elle a pour effet de bloquer la ractivit du carboxyle dans l'acyl-CoA et les transformations peuvent alors se drouler ailleurs sans entrave dans la molcule. Les ligases ont une fonction capitale dans le mtabolisme anarobie du benzoate et de ses drivs, le benzoyl-CoA tant un point de convergence des voies mtaboliques utilisant une foule de substrats aromatiques [23]. La benzoate ligase est stable l'air et facile doser [24]. Les acides aromatiques sont communment prsents en faible quantit dans les sols [25]. Les bactries comptentes sont armes pour rcolter ces substrats mme lorsquils sont prsents ltat de traces, et de les concentrer dans leur cytoplasme. L'intervention d'une ligase reprsente presque toujours l'tape centrale dans lutilisation anarobie de ces produits. Par exemple le phototrophe Rhodopseudomonas palustris na pas moins de trois ligases capables de traiter le benzoate [26]. Lenzyme principale est une benzoate-CoA ligase entoure par deux autres enzymes spcifiques du p-hydroxybenzoate. Ces dernires acceptent galement le benzoate. La mme espce labore deux ligases supplmentaires actives sur le cinnamate [27]. Force est de constater que les ligases sont lgion dans la nature et largement exploites en anarobiose. Leur pH optimum est le plus souvent du ct alcalin (pH 8,2-9,3). La reconnaissance spcifique du benzoate par une ligase se fait avec une affinit apparente leve (Km de 1 10 M), et il en est souvent de mme pour les autres substrats. La plupart sont inductibles, non seulement par leurs substrats habituels, mais par des composs divers appartenant la mme famille chimique [28]. En somme quand les bactries rencontrent ces substrats, elles se htent de se munir des ligases appropries, la prcaution ncessaire afin de pouvoir les utiliser ! Les ligases ont des similitudes structurales rendues perceptibles par l'examen des squences. Ces enzymes se rvlent comme des outils fondamentaux dont l'emploi date certainement des ges les plus lointains de l'volution. Leur mcanisme rvle des dtails intressants. Toutes possdent dans leur site catalytique une fonction thiol qui est charge d'tablir avec le substrat, une liaison covalente transitoire de type thioester. L'tape suivante du cycle catalytique consiste basculer le substrat de cette fonction thiol une autre, en l'occurence celle du coenzyme A. Les donnes sont nanmoins encore parcellaires. Revenons maintenant au devenir du benzoyl-CoA. La liaison thioester avec le coenzyme A favorise l'tape suivante qui est une rduction du cycle conduisant la perte de son aromaticit.

O C SCoA 2 e + 2 H+ O C SCoA
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COO
ATP
AMP + PPi
benzoate
HSCoA
2 ATP
2 ADP + 2Pi
dinoyl-CoA
Dsaromatisation du benzoate
Pourquoi la liaison thioester est-elle essentielle ? En son absence, la raction sur le cycle du benzoate de dpart se heurterait un potentiel si bas qu'elle serait impossible utiliser dans les conditions physiologiques. La liaison thioester a pour effet de remonter le potentiel, qui reste tout de mme encore trs bas, de l'ordre de 1300 mV. En outre la rduction du benzoate n'est possible quaprs franchissement dune barrire dactivation trs leve (plus de 120 kJ/mole), et la liaison thioester a pour effet de l'amoindrir [29]. La rduction du benzoyl-CoA apparat tout de mme sous un jour peu favorable. La difficult est donc contourne par un apport d'nergie supplmentaire et l'opration est tire par l'apport nergtique de deux molcules d'ATP qui sont hydrolyses en 2 ADP et 2 ions phosphate. Les deux lectrons sont donc ajouts au cycle aromatique qui est dsaromatis en un dinoyl-CoA (soit le cyclohex-1,5-dine-1-carboxy-CoA). Les interventions successives de la ligase et de la rductase sont donc relativement coteuses en nergie puisqu'elles consomment au total 3 ATP par mole de benzoate. Cependant la ligase libre du pyrophosphate dont l'hydrolyse par une pyrophosphatase dplace l'quilibre ractionnel en faveur du thioester. On admet que l'tape de rduction s'excute par les apports spars des deux lectrons, en alternance avec des protons. Chaque ATP hydrolys correspondrait l'injection d'un lectron, la manire du principe similaire aperu dans la nitrognase, une enzyme gourmande en nergie. L'hydrolyse de chaque ATP produirait un changement structural qui faciliterait l'injection d'un lectron sur la cible. C'est sans aucun doute ce prix que la dsaromatisation peut avoir lieu. La rductase possde 4 sousunits, qui travaillent peut-tre deux par deux en alternance. Aprs une premire rduction du benzoyl-CoA, la suite du mtabolisme devient plus aise car la stabilit intrinsque du noyau aromatique est perdue. En conclusion, l'examen rapide de cette question nous a montr le rle central du benzoyl-CoA dans le mtabolisme anarobie des aromatiques, l'importance des ligases et de la rduction du cycle. Celle-ci tant forte consommatrice d'nergie, il est concevable que les cellules doivent disposer de moyens suffisants pour y faire face. C'est pourquoi les bactries tirant leur nergie de la dnitrification sont communment rencontres dans ce type d'activit. Une espce utilisant lnergie d'une fermentation sera davantage handicape pour mtaboliser le benzoate. Il faut se rappeler nanmoins que la microflore des sols et des eaux fonctionne en communauts complexes o les diffrents partenaires changent des substrats. La faiblesse des moyens d'une espce anarobie donne pour transformer les aromatiques n'est donc pas a priori rdhibitoire, puisquelle peut bnficier de lactivit complmentaire dautres organismes.
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11.3 - LA VOIE DU BENZYLSUCCINATE

Les connaissances concernant la destruction anarobie de composs aromatiques comme le tolune sont assez rcentes. Le passage du tolune au benzoate a t rencontr prcdemment et mettait en jeu une mthylhydrolase. Les premires souches capables de mtaboliser le tolune en anarobiose sont apparues dans la littrature la fin des annes quatre-vingt, et il fut reconnu que l'introduction dun atome doxygne dans le substrat se faisait partir de leau. Ce mcanisme a donc soulev une grande curiosit. Une voie distincte et originale transforme le tolune en faisant intervenir du fumarate dans un cycle ractionnel important qui retiendra l'attention ici. La benzylsuccinate synthase catalyse la premire tape [30]. Le benzylsuccinate a t identifi chez Thauera aromatica et un Pseudomonas (souche T) comme produit d'addition du groupe mthyle sur la double liaison du fumarate. Lo-xylne est trait par un cycle comparable dont le principe gnral est le suivant [31] :
COO CH3 BSS tolune COO AMP PPi COSCoA COSCoA
COO
COO
COO H2O COSCoA
HSCoA ATP
+2
H+ 2 e + 2 H+
HO COO
COO fumarate cycle de KREBS O COSCoA COSCoA
COSCoA
COO
+
COO HSCoA
Cycle du fumarate
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Il convient de faire les observations suivantes : Le cycle aromatique n'est pas attaqu dans ce cycle que la prsence d'un mthyle contribue stabiliser, et une rduction directe serait encore plus difficile que celle du benzoate. L'tape essentielle de dpart est celle de la benzylsuccinate synthase (BSS) catalysant une raction d'addition sur la double liaison du fumarate. Les tapes successives imitent une b -oxydation* similaire celle d'un acide gras. Deux oxydations se succdent et deux molcules de coenzyme A interviennent. La deuxime rompt le substrat par thiolyse. La voie aboutit au benzoyl-CoA et au succinyl-CoA. Ce dernier fait retour au fumarate par le cycle de Krebs en deux ractions. La participation cyclique du fumarate un cycle en alternance avec le succinyl-CoA ou le succinate nest pas unique dans la chimie cellulaire. Les manuels courants dcrivent le cycle de lure et la biognse des purines, o on peut observer des ractions similaires. La nature utilise ce qu'elle sait faire pour la solution de problmes varis ! La benzylsuccinate synthase nest pas totalement spcifique, car elle agit aussi sur lo-xylne. Celui-ci ne peut pas servir de substrat de croissance pour les bactries tudies car ses transformations en aval sont bloques. Reste savoir si le mcanisme aperu ici avec le tolune est banal dans la nature. C'est possible. La synthase a t examine en dtail dans le dnitrifiant T. aromatica et d'autres espces parmi lesquelles des phototrophes, des rducteurs du sulfate et des mthanognes [32]. Le dnitrifiant Azoarcus sp. est capable de minraliser entirement le tolune et le m-xylne. La benzylsuccinate synthase est inactive par loxygne en quelques secondes de manire irrversible. La transcription des gnes correspondants na lieu quen anarobiose. Lenzyme est flavinique et possde une structure 2 2 2 vrifie par spectromtrie de masse. Elle est dtermine par 4 gnes formant un opron d'une longueur denviron 4,5 kb.
1 kb
bssD
bssC
bssA
bssB
L'opron bssABCD (Thauera aromatica)

Les 4 gnes sont donc transcrits dun seul tenant. Les sous-units (92 kDa) sont codes par bssA, les par bssB (12 kDa) et les par bssC (10 kDa). Le polypeptide correspondant bssD ne fait pas partie de lenzyme. Cest une protine annexe dont la fonction est dactiver la benzylsuccinate synthase. Comment ? Lanalyse des squences et les recherches sur l'enzyme permettent de btir une hypothse cohrente. Elle aurait pour fonction de stabiliser un radical. Dans l'illustration reprise de LEUTHNER et coll., un fragment de squence de la benzoyl-succinate synthase (sous-unit , Thauera aromatica) est align avec dautres fragments appartenant dune part des pyruvate-formiate lyases (Ecp, Hip, Cpp) et une ribonuclotide rductase (des informations succinctes sont donnes en glossaire).
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bss : D H V Q F N N V V S T E E MK A A Q R E P E K H Q D D L L I V Ecp : Q H I Q F N N V V N A D T L R E A Q Q R P Q D Y A G G L L V V Hlp : Q H L N V N N V L N R E M L L D A M E N P D K Y P Q Q L L T I Cpp : H H L N V N N V MN R E T L I D A MN N P D K Y P T T L L T I ndr : T G E F E C C T S K G F T P C K C G N H D A S R V S S V V T R RV RV RV RV RV S A S S C
G F SAR F VD I P T YGQNT I I A R NE G Y S A F F V E L S K E I Q DD I I R R T A G Y A V R F NR L T K E Q Q QD V I T R T F G Y A V N F NS L S KDH Q K E V I S R T F G Y L GS P D A R P F N A GK Q E E V KR R V K
bss - Benzylsuccinate synthase A de T. aromatica Ecp - Pyruvate-formiate lyase dE. coli HIp - Pyruv. formiate lyase dHaemophilus influenzae
Cpp - Pyruvate-formiate lyase de Clostridium pasteurianum nrd - Nuclotide rductase dE. coli
Comparaison de squences avec un fragment de benzylsuccinate synthase (bss)

Pourquoi le choix de ces protines ? Parce que ces enzymes sont connues pour avoir un fonctionnement radicalaire. La chane de synthase longue d'environ 850 acides amins porte la position 825 un reste essentiel de glycine-(G) qui est transform en radical par une rduction un lectron. Les positions identiques entre les 5 protines ont t encadres. Dautres similitudes existent ailleurs dans les 5 squences lorsque des acides amins de mme nature (hydrophobes, ioniques) sont placs au mme endroit. Les ressemblances les plus nettes sont avec les pyruvate-formiate lyases, qui sont des protines caractristiques du mtabolisme anarobie. Voici un bref rappel de leur importance. La dcarboxylation du pyruvate nest pas une oxydorduction, contrairement ce qui se passe en arobiose. titre de comparaison : En prsence de O2 : Pyruvate + Coenzyme A En anarobiose : Pyruvate + Coenzyme A Actyl-coenzyme A + CO2 + 2 e + 2 H+. Actyl-coenzyme A + HCOOH.
La premire raction est catalyse par un complexe enzymatique connu classiquement et dcrit dans tous les manuels. Il intervient comme pyruvate dshydrognase (arobie), renferme du TPP et de lacide lipoque. Les lectrons sont rcuprs par la partie flavinique et apparaissent en NADH. La deuxime ligne correspond la pyruvate-formiate lyase : au lieu de librer du CO2, elle produit de lacide formique qui quivaut du CO2 emportant avec lui les deux lectrons. Le complexe enzymatique et son mcanisme sont entirement diffrents du premier, il renferme des noyaux fer-soufre et fonctionne avec une ferrdoxine. Lacide formique ou formiate ( pH 7) est souvent limin comme produit de fermentation, scind en CO2 + H2 par la formiate hydrogne lyase*, ou utilis comme donneur dlectrons dans la dnitrification. Cette lyase fonctionne comme la benzylsuccinate synthase avec un radical port sur glycine. Les ribonuclotide rductases* ont aussi un tel radical. Revenons la synthase. La prsence d'un radical glycyle dans la protine a t confirme par spectroscopie RPE [33] et l'enzyme a besoin dune activase, enzyme code par bssD, qui est le premier gne de lopron aperu plus haut. L'activase BssD prsente des analogies avec d'autres activases spcialises sur des lyases et rductases radicalaires. Lactivase aurait pour rle de stabiliser le radical glycyle par un mcanisme mal lucid. Au cours du cycle catalytique de la benzylsuccinate synthase, le radical glycyle fixerait un atome d'hydrogne sur un
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site cystine voisin, transform son tour en radical cystyle. Celui-ci attaquerait le mthyle du substrat pour en faire un radical ractif sur le fumarate : en somme, une succession de radicaux par ricochets. On voit sur le schma que la raction engendre un radical benzylsuccinyle. Ce dernier reprend l'enzyme un atome d'hydrogne qui est repr en caractre gras. Son addition pour former un mthylne (CH2) a t dmontre comme strospcifique par les expriences faites partir de tolune o tous les atomes d'hydrogne sont remplacs par le deutrium (D).
CH3 CH2
H tolune
COO C C
OOC H fumarate
COO HC CH2 C HH COO
enzyme
enzyme H
COO HC CH2 C H COO
benzylsuccinate
Synthase radicalaire
L'enzyme prend au tolune un atome de deutrium qui se retrouve dans le produit de la raction et cre un carbone asymtrique (CHD). Sa chiralit est parfaitement dtectable en RMN et occupe une orientation prcise. Pourquoi la benzylsuccinate synthase est-elle immdiatement inactive par O2? On l'explique par la rupture de la chane polypeptidique au niveau du radical glycyle. Le dessin est une hypothse de travail avance par WAGNER et coll. [34]. On voit qu'O2 ragit directement avec le radical. La rupture de la chane fait tomber le fragment C-terminal restant.
O N H N H H N O O O O N H N H O O H N H2O C O2 + H+ N H
O O
H N O C
NH2
+ O
Inactivation de la synthase par l'oxygne
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Lorsque la synthase a t inactive par loxygne, une seule chane est ainsi trononne, et la formule de lenzyme complte passe de 222 22 . On en dduit que lenzyme ne porte un radical que sur une seule chane. La sensibilit de lenzyme O2 illustre l'incompatibilit entre certaines biodgradations et la prsence du dioxygne. La benzylsuccinnate synthase pourrait reprsenter le modle des alkylsuccinate synthases, enzymes d'une porte plus gnrale, peut-tre essentielles pour la dgradation des hydrocarbures aliphatiques en anarobiose. L'thylcyclopentane, par exemple, serait mtabolis par ce procd [35].
11.4 - LA DSHYDROXYLATION DU CYCLE AROMATIQUE

Le phnol nest pas seulement un polluant industriel, mais le premier terme dune srie de composs phnoliques exsuds faible dose par les racines des plantes ou faisant partie de la chimie du bois. Aussi nest-il pas trs tonnant que la flore microbienne se soit adapte depuis le fond des ges leur dgradation. Le phnol lui-mme a des vertus antiseptiques et inhibe fortement le dveloppement de la microflore 1-20 ppm, ce qui rend dangereux comme contaminant. Cette section tente de dcrire des oprations biologiques inhabituelles et un peu difficiles. Nous savons que le phnol est biodgradable en arobiose. Il l'est aussi fort heureusement l'abri de l'oxygne molculaire. Il est converti en 4-hydroxybenzoate et son mtabolisme converge avec celui du tolune et du p -crsol dcrit dans la section prcdente. La biodgradation du phnol au cours de la dnitrification a t dcouverte en 1977. Elle est ralise notamment par des -protobactries du genre Azoarcus [36].
COOH ATP CO2
OH
ADP
Pi
OH
Carboxylation du phnol
Le phnol est pris en charge par la 4-hydroxybenzoate dcarboxylase (EC 4.1.1.61), ou carboxylyase, selon une raction rversible, mais l'quilibre thermodynamique est en faveur du phnol. Chez Thauera aromatica, cest un peu plus compliqu. Le phnol est dabord phosphoryl en phnylphosphate partir d'ATP par une kinase avant dtre carboxyl (avec dpart du phosphate) par une dcarboxylase distincte de la prcdente 2.
2 - La carboxylation du phnol est connue en chimie sous le nom de synthse de KOLBE, et s'oriente surtout en ortho pour faire l'acide salicylique. La carboxylation chaud en para en prsence de potasse s'appelle raction de KOLBE-SCHMITT.
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La carboxylation du phnol demande de l'ATP comme apport d'nergie. Une tape intermdiaire fait du phnylphosphate. La carboxylation est extrmement sensible l'oxygne et ncessite des ions manganse. La raction inverse transforme le 4-hydroxybenzoate en phnol et CO2 et s'observe dans Clostridium hydroxylbenzoicum, une espce des sdiments d'eau douce spcialise dans des fermentations. Cette espce ne transforme le 4-hydroxybenzoate et le 3,4-dihydroxybenzoate (protocatchuate) que par dcarboxylation avec deux enzymes spares trs sensibles l'oxygne [37]. Le phnol et le catchol respectivement forms ne sont pas mtaboliss leur tour. Ces enzymes catalysent aussi la raction inverse de carboxylation. On peut s'interroger sur la signification de ces conversions en aller et retour, puisque les bactries ne devraient en tirer aucun bnfice net pour leur croissance. L'explication est sans doute trouver par des changes de mtabolites au sein de populations mixtes, o chaque partenaire fournit des substrats utiles aux espces associes tout en tirant profit en retour d'autres produits de transformation. En somme la politique du troc. Une ligase spcifique lie le 4-hydroxybenzoate au coenzyme A pour faire un thioester. La 4-hydroxybenzoyl-CoA rductase (ou 4HB-CoA rductase) de Thauera aromatica est une protine fer-soufre oligomrique (260 kDa, 2 2 2) contenant plusieurs cofacteurs fonctionnant trs bas potentiel ( 350 mV) et son dosage sopre avec un viologne rduit comme donneur dlectrons. Lenzyme n'est induite strictement quen anarobiose et correspond un systme assez commun dans lattaque des phnols labri de lair. Une enzyme similaire active sur le 3-hydroxybenzoyl-CoA (lisomre mta) a t trouve. La squence de lenzyme se retrouve sous une forme homologue chez un phototrophe, Rhodopseudomonas palustris [38]. Il y a des analogies avec la xanthine oxydase et plusieurs protines de la mme famille, ainsi qu'avec la CODH flavinique*. Il y a cependant une diffrence importante. Les protines de cette famille oxydent en gnral leur substrat en y introduisant un hydroxyle ou une fonction oxygne, alors quici la rductase fonctionne dans lautre sens. La 4HB-CoA rductase a deux parties symtriques de composition renfermant chacune du molybdne, deux noyaux [2Fe-2S], un [4Fe-4S] et FAD. Le molybdne est dans un cofacteur appel molybdoptrine mononuclotide du mme type que trouv dans la nitrate rductase. Lensemble forme une chane de transport dlectrons interne lenzyme, allant du fer-soufre au molybdne. Tous les lments ont un trs bas potentiel, comme l'indique le petit tableau, o la flavine passe par un intermdiaire radicalaire, et le molybdne par un intermdiaire Mo(V). Couple redox [2Fe-2S]+2/[2Fe-2S]+1 [2Fe-2S] /[2Fe-2S] [4Fe-4S] /[4Fe-4S]
2+ +2 +1 1+
E (mV) 255 205 465
Couple redox FAD/FADH0 FADH /FADH2 Mo(VI) /Mo(V) Mo(V) /Mo(IV)

0
E (mV) 250 470 380 500
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Il est clair que tous les potentiels indiqus sont trop bas pour tre compatibles avec l'arobiose. La vritable force de frappe pour effectuer la difficile rduction de la fonction phnol est le molybdne (IV). Son potentiel est un des plus bas connus dans le monde biologique hormis le cas de la photosynthse. La rduction dun phnol nest d'ailleurs pas aise en chimie. Elle ncessite des rducteurs efficaces comme la poudre de zinc, et la rduction peut aller jusqu'au stade cyclohexane. Pourtant la rduction biologique du phnol par l'hydrogne molculaire est favorable nergtiquement, car le passage du 4-hydroxybenzoate au benzoate et leau par H2 produit 59 kJ/mole. Les bactries sont donc dans la situation paradoxale de disposer d'une source d'nergie relativement riche, mais qui fait intervenir une raction trs difficile. Le mcanisme de la rductase par le modle de BOLL, FUCHS et coll. (2001) reste hypothtique. Il est corrobor par les donnes spectroscopiques et par les analogies avec d'autres enzymes molybdne de la famille de la xanthine oxydase. Le molybdne va de Mo(VI) Mo(IV) au cours des oxydations faites par ces enzymes, le cheminement inverse de Mo(IV) Mo(VI) tant observ ici. On distingue 5 tapes dans ce modle.
O IV SH OH O
V SH OH
4-HB-SCoA
O S Mo S H2O IV SH
Mo S
Mo S
1
H2O
C O SCoA O S OH H C O SCoA C O SCoA
C O SCoA
5
2 e 2 H+ S S O Mo VI S OH
Mo S
Mcanisme hypothtique de la 4-HB-CoA rductase

Le substrat se lie par son hydroxyle sur Mo(IV) en expulsant une molcule deau (1). Il est obligatoirement sous forme de thioester avec le coenzyme A, puis un transfert de charge du Mo au substrat cre un anion radical (2), et le mtal est oxyd en Mo(V). Le cofacteur transmet alors un proton la position para du substrat. Le cycle est temporairement dsaromatis et engendre un radical stabilis par la liaison thioester avec le coenzyme A (3).
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La liaison carbone-oxygne se rompt, le cycle est r-aromatis avec apport d'un deuxime lectron aux dpens du mtal (4), qui passe l'tat Mo(VI). Finalement une rduction deux lectrons (5) renvoie le molybdne la case dpart, soit Mo(IV). D'o viennent les lectrons rducteurs la cinquime tape ? Le donneur est une ferrdoxine rduite comportant 2 noyaux [4Fe-4S] travaillant des potentiels extrmement bas, de 435 mV et 580 mV. Cette ferrdoxine a des caractres inhabituels et n'est qu'une tranget de plus dans ce mtabolisme anarobie [39]. En fait le vritable donneur d'lectrons est l'hydrogne substrat d'une hydrognase, et la ferrdoxine sert de transporteur intermdiaire. La flavine (FAD.), elle-mme trs bas potentiel, serait une porte d'entre d'un cheminement lectron par lectron selon le canal : FAD. premier [2Fe-2S] deuxime [2Fe-2S] Mo. Mais l'enzyme comporte galement un noyau [4Fe-4S] de 465 mV. Il est log dans une extension de la chane qui n'existe pas dans les autres protines de la mme famille, et se trouve trs proche de la flavine. Ce serait donc peut-tre la vritable porte d'entre. Cette enzyme extraordinaire a visiblement un haut degr de sophistication et achemine par petits pas les lectrons ncessaires la difficile rduction du substrat. Rhodopseudomonas palustris possde une rductase qui ressemble celle de Thauera. Cette espce phototrophe appartient au groupe des pourpres non-sulfureuses. Elle peut crotre la lumire et en anarobiose, ou inversement l'obscurit avec aration. En prsence de 4-hydroxybenzoate dans le milieu de culture, l'anarobiose induit la ligase (qui fait la soudure au coenzyme A) et la 4HB-CoA rductase. Il y a expression de 4 gnes, dont un pour la ligase et trois pour les trois chanes de la rductase, placs ensemble sous le contrle de la protine HbaR.
hbaA hbaB hbaC hbaD hbaR
ligase
rductase
"FNR-like"
Gnes de R. palustris
La ncessit physiologique d'une rgulation semble vidente, puisque le mtabolisme du 4HB-CoA par sa rductase ne se fait qu' trs bas potentiel et ncessite une batterie de facteurs coteux. Sa mise en place en prsence de dioxygne ne se ferait qu'en pure perte. D'autre part les gnes concerns ne doivent s'exprimer que si le substrat 4HB-CoA est prsent. La protine HbaR est donc charge de superviser les oprations. L'intrt de cette protine vient de ce qu'elle fait partie de la super-famille de rgulateurs dont FNR* et CRP* sont les chefs de file. Ces protines ont certaines analogies structurales, sont des rgulateurs positifs des gnes impliqus dans l'anarobiose, comme ceux de la dnitrification (FNR), ou de la mobilisation de ressources nergtiques (CRP). La protine FNR est sensible aux conditions oxydorductrices, alors que CRP rgule un catabolisme en fonction de l'AMP cyclique. Le travail de EGLAND et HARWOOD [40] montre que HbaR
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ne dtecte pas l'anarobiose, mais la prsence du substrat, en consquence de quoi elle est inductrice des autres gnes hbaA et hbaBCD. Quel est le facteur charg de surveiller la prsence d'O2 ? C'est un deuxime activateur appartenant la mme super-famille : AadR. L'induction des deux enzymes (ligase, rductase) est donc soumise une double autorisation. Le facteur HbaR reconnat la prsence du substrat et AadR constate que les conditions sont anarobies. Cette situation est typique du dclenchement des inductions par l'anarobiose. Il est ralis en prsence du substrat (ce qui est logique) et ds que la prsence nuisible de l'oxygne est carte. La dgradation rductrice anarobie des benzoates hydroxyls n'est pas rserve au driv para. Le driv mta ou 3-hydroxybenzoate est galement attaqu par Thauera aromatica. Les bactries dveloppes sur ce substrat peuvent crotre aussi sur benzoate, mais pas sur le driv para. Inversement les bactries cultives sur celui-ci n'attaquent pas le driv mta. Il y a donc induction d'enzymes distinctes dans les deux cas [41]. Ici encore le 3-hydroxybenzoate est coupl au coenzyme A par une ligase, puis rduit par une enzyme qui n'est autre que la benzoate rductase. La suite des oprations prsente une diffrence importante avec le cas prcdent, puisque le cycle est rduit avant dshydroxylation, pour former un dinyl-CoA hydroxyl non aromatique. Cette section nous a donc montr que la rduction anarobie de la fonction phnol contourne la difficult de la raction par l'emploi de systmes sophistiqus adapts chaque cas.
11.5 - LES VOIES ANAROBIES DU BENZOYL-COENZYME A

Revenons au benzoate comme point de convergence dans la transformation de divers substrats aromatiques au cours de lanarobiose. Le plan directeur a t publi notamment par HARWOOD et GIBSON [42] et comporte quatre stades fondamentaux : une rduction du noyau aromatique ; une hydratation suivie dune dshydrognation ; louverture du cycle ; une -oxydation rappelant le mtabolisme des acides gras et aboutissant lactyl-coenzyme A. La trs grande importance de ce type de dgradation dans la nature vaut qu'on la dtaille un peu. La benzoyl-CoA rductase, qui catalyse comme on le sait la premire opration, est la perle de tout le dispositif, parce que la rduction du noyau benznique conduisant sa dsaromatisation nest pas chose aise. La raction est considre comme radicalaire (deux lectrons apports sparment lun aprs lautre). On a une ide de sa structure chez le dnitrifiant Thauera aromatica [43]. Lenzyme a une structure de type , pour une masse totale de 170 kDa. On y observe plusieurs centres fer-soufre, une flavine et du zinc. Sa purification se conduit sous atmosphre sans oxygne parce que celui-ci linactive. Le rducteur naturel est une ferr-
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doxine rduite dote de 2 noyaux [4Fe-4S] trs bas potentiel ( 450 mV). Elle est remplaable exprimentalement par du citrate de titane(III) ou du mthylviologne. L'enzyme a besoin d'ATP quelle hydrolyse en ADP et phosphate : benzoyl-CoA + 2 Ti(III) + 2 ATP(Mg) dinyl-CoA cyclique + 2 Ti(IV) + 2 ADP + 2 Pi
O CSCoA
O CSCoA OH hydratase O
O CSCoA 2 ATP CSCoA
O CSCoA OH
O CSCoA O
dshydrognase O HO CSCoA COOH O O CSCoA COOH HSCoA O C SCoA COOH O C CH3 SCoA
CSCoA O
O C O
SCoA CH3 SCoA C CH3
O C
SCoA
O C
SCoA
CO2
COOH
Du benzoyl-CoA l'actyl-CoA
Le tableau ractionnel est valable pour Thauera aromatica, Rhodopseudomonas palustris et Syntrophus gentianae. Il est incomplet, car il existe des variantes. On peut observer les analogies avec une -oxydation o l'actyl-coenzyme A est aussi le produit final. La benzoyl-CoA rductase utilisatrice d'ATP n'est pas trs spcifique puisqu'elle accepte de rduire des analogues, hydroxyls, amins, fluors ou mthyls du benzoyl-CoA (la raction est plus lente), ainsi que lhydroxylamine et lazoture. Lenzyme dpourvue de substrat et mise en prsence dATP hydrolyse celui-ci comme le ferait une ATPase qui serait inhibe par loxygne. En effet le couplage entre lhydrolyse dATP et la rduction du substrat n'est pas obligatoire. Une molcule d'ATP devrait tre hydrolyse pour chaque lectron trans-mis. En fait le couplage semble draper de temps en temps et provoque une consommation accrue dATP. Il en rsulte un surcot physiologique. La cellule pourrait tre amene gaspiller son ATP en faisant tourner son hydrolyse vide. Do limportance, une fois de plus, des mcanismes de rgulation. Il convient de mettre hors circuit ou de bloquer la synthse dun systme enzymatique lorsquen absence
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de substrat ou en prsence doxygne, il viendrait dilapider l'ATP. Un problme similaire existait dans le cas de la nitrognase. Le dine engendr par la rduction du benzoyl-CoA peut voluer dans deux directions (flches noires en sens oppos). L'hydratase de Thauera aromatica a t purifie [44]. L'autre voie, catalyse par une dshydrognase, prpare la saturation complte du cycle carbon. Le mtabolisme indiqu sur le schma suivant comporte trois ractions : une rduction par dshydrognase (1), une hydratation (2), suivie dune dshydrognation de la fonction alcool (3). Cet enchanement est tout fait habituel dans la nature, et remplace une double liaison par une fonction ctonique comme dans la trs classique -oxydation des acides gras. Les flches en pointill dsignent les ractions incompltement caractrises. On pense que cette voie est connecte la dgradation du cyclohexane carboxylate, tudie chez R. palustris [45].
O C O 1 2 e + 2 H+ C H2O 2 O 2 e + 2 H+ C cyclohexane-carboxylate + CoA SCoA SCoA O C OH SCoA NAD+ NADH, 3 O H+ C O SCoA SCoA
Formation du 2-ctocyclohexane-1-carboxyl-CoA
Les troisime et quatrime parties de ce mtabolisme conduisent lactyl-CoA, aprs rupture du cycle et apparition de pimlyl-CoA comme intermdiaire 3. Le passage lactyl-CoA comme produit final ressemble l aussi une -oxydation. La succession de ces ractions au cours de la dnitrification ne fait pratiquement aucun doute, au moins chez Thauera aromatica [46]. La rupture du cycle seffectue par une hydrolase.
O C O H2O 2-cto-cyclohexane-1-carboxyl-CoA pimlyl-CoA SCoA O C COOH SCoA
L'ouverture du cycle par une hydrolase

3 - Rappel de nomenclature usuelle des diacides aliphatiques. En ajoutant chaque fois un carbone aprs l'acide oxalique (HOOCCOOH), acide malonique, succinique, glutarique, adipique, pimlique.
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Le coenzyme A intervient deux fois par thiolyse. Nous assistons donc un retour au mtabolisme intermdiaire, avec la production de trois molcules dactyl-CoA. Si nous examinons le bilan gnral, nous voyons que les transformations du benzoyl-CoA aboutissent finalement 3 molcules dactyl-CoA. La respiration anarobie sur nitrate fournira lnergie ncessaire la rduction initiale et prendra en charge le NADH produit par les oxydations successives. Ce schma gnral est dduit des tudes faites aussi bien avec Rhodopseudomonas quavec Thauera, et pourrait sappliquer de nombreux cas danarobiose trangers la photosynthse ou la dnitrification. Il a tout de mme un caractre provisoire, car toutes les enzymes nont pas encore t totalement purifies ni caractrises [47]. Mais cette section nous a montr la grande importance de l'acide benzoque comme carrefour mtabolique dans un environnement anarobie.
O C COOH NADH H2O + H+ O SCoA O C COOH thiolyse O C HSCoA H2O HSCoA O C thiolyse O NADH + SCoA SCoA C CH3 CO2 NAD+ H+ NAD+ NADH + H+ SCoA O C SCoA CH3 SCoA COOH
NAD+ O C CH3 O SCoA
NAD+
NADH + H+
Du pimtyl-CoA l'actyl-CoA
11.6 - DSHALOGNATIONS AROBIES UTILISANT LE COENZYME A

Les sections prcdentes ont mis en lumire l'intervention du coenzyme A dans la destruction de substrats aromatiques, et les mcanismes dcrits taient surtout le fait d'organismes placs en anarobiose et pratiquant la dnitrification. Il n'y a cependant aucune barrire tranche avec l'arobiose, et les mmes outils sont parfois rencontrs en prsence d'oxygne. L'attaque des aromatiques chlors nous en apporte la preuve. Les chlorobenzoates apparaissent facilement au cours de la dgradation de substrats chlors comme les PCB et se comportent ventuellement comme des produits rcalcitrants. Nous savons la suite d'un chapitre antrieur que leur mtabolisme arobie est fond ventuellement sur l'action d'une halobenzoate dioxygnase. Mais chose curieuse, les intermdiaires benzoques tendent tre transforms plus facilement par les organismes dnitrifiants. Cette partie montrera qu'une dshalognation peut fonctionner en arobiose sans l'intervention
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des oxygnases. Les modes utiliss sont le dpart de l'halogne par hydrolyse ou par rduction, le coenzyme A tant nouveau un acteur privilgi. Dans le premier cas, une transformation arobie du 4-chlorobenzoate (4CB) en 4-hydroxybenzoate (4HB) est pratique par un Pseudomonas CBS3. La substitution de l'atome de chlore par un hydroxyle s'effectue avec l'aide transitoire du coenzyme A. Ce mcanisme particulier comporte trois tapes : la synthse du 4CB-CoA par une ligase ; l'intervention d'une dshalognase par une raction complexe ; une thiolyse sparant le produit (4HB) du coenzyme A [48]. La 4-chlorobenzoyl-CoA dshalognase catalyse une opration chimiquement difficile. Elle sexplique plus facilement depuis que l'enzyme a t cristallise haute rsolution en prsence de 4HB-CoA. L'enzyme est un trimre de sous-units identiques. Il y a trois sites catalytiques constitus par l'association des monomres deux deux. La partie gauche du schma reprsente la charpente du trimre, l'exclusion des chanes latrales d'acides amins. La structure est riche en hlices . Un monomre isol est figur droite. On peut voir que chaque monomre possde deux prolongements qui contribuent chacun la constitution d'un site catalytique tout en facilitant la cohsion du trimre.
site actif chane A chane B chane B
site actif
chane C Trimre Monomre
4-Chlorobenzoyl-CoA dshalognase
Les deux grandes tapes sont la formation d'une liaison covalente entre le substrat et l'enzyme, suivie d'une hydrolyse [49]. La premire est une attaque nuclophile sur le substrat par le site catalytique (aspartate-145). L'intermdiaire fugace form se raromatise avec expulsion d'un ion chlorure et formation d'aryl-enzyme dont l'existence est confirme par l'emploi de 4-hydroxybenzoyl-CoA marqu [50].

CoAS C O CoAS C O CoAS C O
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Cl enzyme Asp-145 C O O
enzyme Asp-145
O O
Cl
enzyme Asp-145
O O
Cl
Premire raction sur la dshalognase

L'hydrolyse de l'intermdiaire covalent est alors facilite par l'histidine-90 du site actif, en passant par un intermdiaire ttradrique qui est un tat de transition reprsent dans la formule entre crochets. L'atome d'oxygne de l'hydroxyle emport par le cycle aromatique provient en majeure partie de l'eau.
CoAS CO CoAS CO CoAS CO enzyme Asp-145 C H OH O
N enzyme Asp-145 C O O O H H N N H His-90 enzyme Asp-145 O OH O OH 4-HB-CoA
His-90
Deuxime phase : l'hydrolyse

La catalyse est rendue possible par une organisation structurale trs prcise, o la pice principale, l'aspartate-145, dirige son carboxyle en direction orthogonale par rapport au noyau aromatique du substrat, un peu plus de 2 du carbone en para. Le schma simplifi montre la disposition du 4HB-CoA (le produit de la dshalognation), la conformation replie du coenzyme A, l'entourage de rsidus essentiels (Asp-145, His-90), la prsence de rsidus hydrophobes autour du 4HB-CoA (leucine, phnylalanine, tryptophane). L'analyse structurale a montr que l'ensemble tait verrouill par un rseau de liaisons non-covalentes, notamment des liaisons hydrogne. La plus importante est entre Asp-145 et His-90.
His-90 O HO Trp-89 Phe-64 Leu-66 Asp-145 O O S Gly-114
4HB
CoA
Environnement du 4HB-CoA dans le site actif
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L'tude de cette enzyme est un bon terrain d'exercice pour comprendre le mcanisme de la raction. Mutations et modlisations par ordinateur permettent de s'en faire une ide. On voit par exemple que la deuxime phase, qui est une hydrolyse, utilise un cheminement des molcules d'eau jusqu'au cur du site catalytique. L'aspartate-145, indispensable la dshalognation, intervient aussi dans cette phase d'hydrolyse en captant la molcule d'eau ncessaire avec une liaison hydrogne. La dchloration hydrolytique selon ce procd se passe de l'intervention de l'oxygne et engendre un produit beaucoup plus facilement mtabolisable, le 4-hydroxybenzoate. La dchloration peut aussi s'effectuer par rduction et c'est le deuxime procd que nous avons envisag. Un Corynebacterium sepedonicum (KZ-4) a t isol l'origine comme pouvant se multiplier en arobiose sur 4-chlorobenzoate (4CB) et 2,4-dichlorobenzoate (2,4DCB) comme seule source de carbone et d'nergie, mais les premiers stades du mtabolisme n'avaient pas besoin d'oxygne. Une ligation par le coenzyme A est l encore ncessaire. Le 2,4DCB perd son chlore en ortho par une dshalognase rductrice utilisant le NADPH comme source d'lectrons [51]. La transformation du 2,4DCB par C. sepedonicum implique deux dshalognations successives, rductrice puis hydrolytique. La voie propose fait intervenir ensuite une mono-oxygnation et une dioxygnation. L'intermdiaire cl est l'acide protocatchuique (encadr) dont la transformation est poursuivie par la voie du 3-oxoadipate ou voie ortho.
O C Cl OH O C Cl H2O Cl HSCoA AMP ATP PPi COOH voie ortho Cl NADPH O O2 C OH O2 NADP+ Cl H2O H+ O C HSCoA OH OH NAD+ NADH H+ OH OH SCoA
Cl Cl
O C
SCoA
Cl
O C
SCoA
OH
COOH COOH
Dshalognations et oxygnations
La souche tudie est relativement spcifique du 4CB et du 24DCB. Elle utilise lentement le 2-chloro-4-fluorobenzoate et le benzoate lui-mme, mais reste sans action sur le 4-fluorobenzoate et le 2-iodobenzoate. Les principales enzymes responsables sont inductibles. Nous voyons ici une runion remarquable de plusieurs outils naturels dans la dgradation de substrats prsums rcalcitrants. Ce principe a t observ dans Alcaligenes denitrificans et il est peut-tre fort rpandu [52]. Nous allons observer ensuite une attaque anarobie similaire des aromatiques halogns ou mthyls aboutissant des produits non toxiques pour l'environnement.
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Une souche dnitrifiante appele T1 est capable de se dvelopper sur tolune, 4-hydroxybenzoate ou benzoate. On voudrait la voir crotre aussi sur 4-chlorobenzoate. Or le passage de celui-ci au 4-hydroxybenzoate se fait par une dshalognase, un complexe enzymatique qui enlve hydrolytiquement le chlore et le remplace par un hydroxyle. Ce systme existe dans une souche de laboratoire, Pseudomonas CBS3, et na pas besoin d'O2. L'enlvement d'un atome d'halogne sur une molcule organique, aliphatique ou aromatique, s'effectue toujours dans la nature sous forme d'anion halognure (Cl, Br, I). Plusieurs stratgies existent dont les plus classiques sont rcapitules ainsi [53] : La dshalognation dite par oxygnolyse a recours une oxygnase. Elle a besoin d'oxygne molculaire et sera laisse ici de ct. Une limination par une dshydrohalognase fait une double liaison aprs dpart de HCl, en remplaant > C(H)C(Cl) < par > C=C < , mais intervient surtout sur des composs non aromatiques. Ce sera par exemple le cas du Lindane (chapitre 13). Une halidohydrolase catalyse une substitution qui remplace l'halogne par un hydroxyle (OH). Le mcanisme est gnralement une hydrolyse, mais peut tre plus complexe avec lintervention de glutathion ou de substitutions intramolculaires. C'est un mode de dshalognation assez commun. Dans le cas particulier du chloroforme, de CH3Cl et des halomthanes, le transfert d'un mthyle se fait sur le ttrahydrofolate (FH4) ou la ttrahydromthanoptrine. Cette question a t examine au chapitre 4 (pages 209, 222, 224). Ces ractions font intervenir des germes arobies ou des mthanognes. Une dshalognation rductrice remplace l'halogne par un atome d'hydrogne. Elle est ralise en gnral dans un comtabolisme ou par une respiration anarobie o le driv halogn sert d'accepteur d'lectrons. L'intervention de l'halidohydrolase concerne le 4-chlorobenzoate. Le laboratoire de YOUNG a clon les gnes de cette dshalognase et les a introduit dans l'espce dnitrifiante T1 [54]. Les bactries, transformes gntiquement et places labri d'O2 en prsence de nitrate, se sont mises dgrader le 4-chlorobenzoate en mme temps que le tolune et le 4-bromobenzoate. Les possibilits de traitement des substrats halogns par dnitrification existent donc bien. Une recherche systmatique de souches dnitrifiantes dans des sols et sdiments varis a montr que des associations bactriennes recyclaient assez facilement les trois benzoates monochlors [55]. La dnitrification na pas lexclusivit des diverses dgradations anarobies, mais son excellent rendement nergtique compar celui dautres modes anarobies permet dacclrer le processus comme il a dj t remarqu. La palette des enzymes utilises en anarobiose est tout fait distincte de larsenal des enzymes travaillant en prsence de dioxygne et c'est toute une biochimie mtabolique particulire qui apparat. Dans les espces anarobies facultatives, O2 est toujours l'accepteur dlectrons le plus avantageux et sert de signal rgulateur pour dterminer quelles seront les protines synthtises et celles dont la synthse sera mise en veilleuse. Nous savons que la
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fonction essentielle des rgulateurs tels que FNR est d'ouvrir ou de fermer les vannes en fonction du taux d'O2. La recherche systmatique de souches aux potentialits nouvelles peut rvler des situations intressantes. Certaines bactries savent se dvelopper sur 3-chlorobenzoate en milieu micro-arobie (< 3 M O2), mais ne le font pas en anarobiose complte. C'est le cas d'Alcaligenes L6, qui s'en sort apparemment par un mtabolisme greff sur le dioxygne mme quand celui-ci est trs faible concentration. Par contre un phototrophe, Rhodopseudomonas palustris DCP3, peut jouer sur les deux tableaux, avec ou sans O2. Dans le premier cas, la photosynthse est arrte, et les bactries peuvent tirer leur nergie d'oxydations ordinaires sur des substrats organiques comme le succinate. Le 3-chlorobenzoate n'est pas dgrad dans ces conditions. Il l'est par contre la lumire et en prsence d'oxygne pourvu que son taux soit assez faible pour rester compatible avec la photosynthse. Le substrat n'est pas utilis comme source d'nergie, sinon il serait attaqu par arobiose. L'intervention ncessaire de la lumire montre que l'attaque du 3-chlorobenzoate a besoin d'nergie, peut-tre pour l'activation avec coenzyme A en prsence de ligase [56]. Cette dgradation est facilement value par l'apparition des ions chlorure dans le milieu, mais le mcanisme reste malheureusement analyser. Les lments dcrits dans ce chapitre montrent la varit des procds utiliss dans la nature pour traiter le mtabolisme des aromatiques l'abri de l'air. Les mmes outils sont utiliss parfois en arobiose conjointement aux oxygnases. Les organismes les plus performants en anarobiose sont souvent des dnitrifiants obligs ou facultatifs. Leur dnombrement dans les sdiments et les rivires est encore trs incomplet et l'tude microbiologique du problme est rendue difficile par l'existence de communauts bactriennes interactives dont les potentialits relles sont brises artificiellement par l'tude en culture pure.
CONCLUSION
La biodgradation des composs aromatiques s'effectue en anarobiose par des procds trs diffrents de ceux des chapitres prcdents, comme il fallait s'y attendre. On observe l'application de stratgies classiques du mtabolisme courant comme la -oxydation, le rle du coenzyme A, la voie importante du benzoyl-succinate et divers modes de rduction. L'limination des aromatiques halogns est galement possible en anarobiose.
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RFRENCES
[1] S E Y F R I E D B, T S C H E C H A & F U C H S G (1991) Archiv. Microbiol. 155 : 249-255. [2] G O L D T (1992) The deep, hot biosphere. Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 6045-6049. [3] E V A N S PJ, L I N G W , G O L D S C H M I D T B, R I T T E R ER & Y O U N G LY (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 496-501 ; S E Y F R I E D B, G L O D G , S C H O C H E R R, T S C H E C H A & Z E Y E R J (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 4047-4052 ; R A B U S R & W I D D E L F (1995) Arch. Microbiol. 163 : 96-103. [4] C O S C H I G A N O PW , H G G B L O M MM & Y O U N G LY (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 989-995. [5] S E Y F R I E D B, T S C H E C H A & F U C H S G (1993) Arch. Microbiol. 155 : 249-255 ; M O H A M E D M E L - S , S E Y F R I E D B, T S C H E C H A & F U C H S G (1993) Arch. Microbiol. 159 : 563-573. [6] N O Z A W A T & M A R U Y A M A Y (1988) J. Bacteriol. 170 : 5778-5784. [7] B O S S E R T ID & Y O U N G LY (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52 : 1117-1122 ; B O S S E R T ID , W H I T E D G , G I B S O N D T & Y O U N G LY (1989) J. Bacteriol. 171 : 2956-2962. [8] M I L H E L C I C JR & L U T H Y RG (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 1188-1198. [9] H A R D E R J & P R O B I A N C (1995) Appl. Environ. Microbiol . 61 : 3804-3808. [10] D A N G E L W , T S C H E C H A & F U C H S G ( 1988) Arch. Microbiol. 150 : 358-362. [11] M O H A M E D ME, S E Y F R I E D B, T S C H E C H A, F U C H S G (1993) 159 : 563-573. [12] S C H N E I D E R S & F U C H S G (1998) Arch. Microbiol. 169 : 509-516. [13] K U R T Z LC , S A U R A B H S , C R A N E BR, D O N A L D LJ, D U C K W O R T H H & D R Y S D A L E G R (1992) Biochemistry 31 : 7899-7907. [14] C O A T E S JD , C H A K R A B O R T Y R, L A C K JG , O ' C O N N O R S M, C O L E KA, B E N D E R KS & A C H E N B A C H LA (2001) Nature 411 : 1039-1043. [15] R A B U S R & W I D D E L (1995) Arch. Microbiol. 163 : 96-103 ; B A L L H A, J O H N S O N H A, R E I N H A R D M & S P O R M A N N AM (1996) J. Bacteriol. 178 : 5755-5761. 16] A L T E N S C H M I D T U & F U C H S G (1991) Arch. Microbiol. 156 : 152-158. 17] S E Y F R I E D B, G L O D G , S C H O C H E R R, T S C H E C H A & Z E Y E R J. (1994) Applied Environ. Microbiol. 60 : 4047-4052. [18] R U D O L P H I A, T S C H E C H A, F U C H S G (1991) Arch. Microbiol. 155 : 238-248. [19] B O S S E R T ID , Y O U N G LY (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52 : 1117-1122 ; B O S S E R T ID , W H I T E D G , G I B S O N D T, Y O U N G LY . (1989) J. Bacteriol. 171 : 2956-2962. [20] B R A C K M A N N R & F U C H S G (1993) Eur. J. Biochem. 213 : 563-571 ; E L K A S M I A, B R A C K M A N N R, F U C H S G & R A G S D A L E S W (1995) Biochemistry 34 : 11668-11677 ; B O L L M, F U C H S G , M E I E R C , T R A U T W E I N A, E L K A S M I A, R A G S D A L E S W , B U C H A N A N G & L O W E D J (2001) J. Biol. Chem . 276 : 47853-47862. [21] C O A T E S JD , C H A K R A B O R T Y R, L A C K JG , O ' C O N N O R S M, C O L E KA, B E N D E R KS & A C H E N B A C H LA (2001) Nature 411 : 1039-1043. [22] C O A T E S JD , C H A K R A B O R T Y R & M C I N E R N E Y MJ (2002) Res. Microbiol. 153 : 621-628.
530
[23] K O C H J, E I S E N R E I C H W , B A C H E R A & F U C H S G (1993) Eur. J. Biochem. 211 : 649-661 ; B O L L M & F U C H G (1995) Eur. J. Biochem. 234 : 921-933 ; H A R W O O D C & G I B S O N J (1997) J. Bacteriol. 179 : 301-309. [24] G I B S O N J, G E I S S L E R JF & H A R W O O D C S (1990) Methods Enzymol. 188 : 154-159. [25] W H I T E H E A D D C (1964) Nature 202 : 417-418 ; W H I T E H E A D D C , D I B B H & H A R T L E Y RD (1982) J. App. Ecol. 19 : 579-588. [26] E G L A N D PG , G I B S O N J & H A R W O O D C S (1995) J. Bacteriol. 177 : 6545-6551. [27] E L D E R D JE , M O R G A N P & K E L L Y D J (1992) FEMS Microbiol. Lett. 98 : 255-260. [28] V I L L E M U R R (1995) Can. J. Microbiol. 41 : 855-861. [29] B U C K E L W & K E E S E R (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34 : 1502-1506. [30] A C H O N G G R, R O D R I G U E Z AM & S P O R M A N N AM (2001) J. Bacteriol. 183 : 6763-6770. [31] S E Y F R I E D B, G L O D G , S C H O C H E R R, T S C H E C H A & Z E Y E R J (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 4047-4052 ; B I E G E R T T, F U C H S G & H E I D E R J (1996) Eur. J. Biochem. 238 : 661-668 ; L E U T W E I N C & H E I D E R J (2002) Arch. Microbiol. 178 : 517-524. [32] L E U T H N E R B, L E U T W E I N C , S C H U L T Z H , H R T H P, H A E H N E L W , S C H I L T Z E, S C H G G E R H , H E I D E R J (1998) Molec. Microbiol. 28 : 615-628 ; B E L L E R H R & S P O R M A N N (1998) J. Bacteriol. 180 : 5454-5457 ; A C H O N G G R, R O D R I G U E Z AM & S P O R M A N N AM (2001) J. Bacteriol. 183 : 6763-6770 ; B E L L E R H R & E D W A R D S EA (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 5503-5505. [33] K R I E G E R C J, R O S E B O O M W , A L L B R A C H T S PJ & S P O R M A N N AM (2001) J. Biol. Chem. 276 : 12924-12927. [34] W A G N E R AFV , F R E Y M, N E U G E B A U E R FA, S C H F E R W & K N A P P E J (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 996-1000. [35] R I O S - H E R N A N D E Z LA, G I E G LM & S U F L I T A JM (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69 : 434-443. [36] B A K K E R G (1977) FEMS Microbiol. Lett. 1 : 103-108 ; T S C H E C H A & F U C H S G (1989) Arch. Microbiol. 148 : 594-599 ; V A N S C H I E PM & Y O U N G LY (1998) Appl. Env. Microbiol. 64 : 2432-2438. [37] H E Z & W I E G E L J (1995) Eur. J. Biochem. 229 : 77-82 ; H E Z & W I E G E L J (1996) J. Bacteriol. 178 : 3539-3543. [38] G I B S O N J, D I S P E N S A M & H A R W O O D C S (1997) J. Bacteriol. 179 : 634-642. [39] B O L L M, F U C H S G , T I L L E Y G , A R M S T R O N G FA & L O W E D J (2000) Biochemistry 39 : 4929-4938. [40] E G L A N D PG & H A R W O O D C S (2000) J. Bacteriol. 182 : 100-106. [41] L A E M P E D , J A H N M, B R E E S E K, S C H G G E R H & F U C H S G (2001) J. Bacteriol. 183 : 968-979. [42] H A R W O O D C S & G I B S O N J (1997) J. Bacteriol. 179 : 301-309 ; H A R W O O D C S , B U R C H H A R D T G , H E R R M A N N H & F U C H S G (1999) FEMS Microbiol. Rev. 22 : 439-458. [43] B O L L M & F U C H S G (1995) Eur. J. Biochem. 234 : 921-933. [44] B O L L M, L A E M P E D , E I S E N R E I C H W , B A C H E R A, M I T T E L B E R G E R T, H E I N Z E J & F U C H S G (2000) J. Biol. Chem. 275 : 21889-21895.
11 LES AROMATIQUES L'ABRI DE L'OXYGNE [45] H U T B E R G N & R I B B O N S D W (1983) J. Gen. Microbiol. 129 : 2413-2420 ; K V E R J, X U Y & G I B S O N J (1995) Arch. Microbiol. 164 : 337-345. [46] G A L L U S C , S C H I N K B (1994) Microbiology 140 : 409-416. [47] B L A K L E Y ER (1978) Can. J. Microbiol. 24 : 847-855 ; H R T E L U, E C K E L E, K O C H J, F U C H S G , L I N D E R D & B U C K E L W (1993) Arch. Microbiol. 159 : 174-181 ; P E R R O T T A JA & H A R W O O D C S (1994) Applied Environ. Microbiol. 60 : 1775-1782 ; K V E R J, X U Y & G I B S O N J (1995) dj cits ; [48] L F F L E R F, L I N G E N S F & M L L E R R (1995) Biodegradation 6 : 203-212. [49] L A U E & B R U I C E TC (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98 : 9527-9532. [50] Y A N G G , L I A N G PH & D U N A W A Y - M A R I A N O D (1994) Biochemistry 33 8527-31 [51] R O M A N O V V & H A U S I N G E R RP (1996) J. Baceriol. 178 : 2656-2661. [52] V A N D E N T W E E L W JJ , K O K JB & D E B O N T JAM (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53 : 810-815. [53] F E T Z N E R S (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 50 : 633-657. [54] C O S C H I G A N O PW , H G G B L O M MM & Y O U N G LY (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 989-995. [55] H A G G B L O M MM, R I V I E R A MD & Y O U N G LY (1996) FEMS Microbiol. Lett. 144 : 213-219. [56] K R O O N E M A N J, V A N D E N A C K K E R S , P E D R O G O M E S TM, F O R N E Y LJ & G O T T S C H A L JC (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 131-137.
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ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS
Les cycles dsigns comme aromatiques par les chimistes existent en nombre immense dans l'environnement, dverss massivement en majorit par les vgtaux, mais aussi par les activits humaines. Les oxygnations du cycle le rendent plus fragile et sont gnralement le prlude l'attaque ultrieure. Dans ce chapitre sont examines les transformations initiales des hydrocarbures simples comme le benzne, le tolune et le naphtalne, ainsi que la nature des enzymes responsables. L'attention se portera ensuite sur le catabolisme de quelques drivs simples, hydroxyls, nitrs, chlors ou fluors. 12.1 - Les tristes mares noires 12.2 - Bactries et levures sur aliphatiques 12.3 - L'intervention des bactries 12.4 - Alicycliques et terpnes 12.5 - Le cytochrome P450 du camphre 12.6 - Dgradation anarobie des aliphatiques 12.7 - Dcontamination de solvants chlors 12.8 - La dshalognation et ses divers modes 12.9 - Dshalognation hydrolytique des haloalcanes 12.10 - Le cas des 2-haloacides 535 537 542 547 550 560 563 568 571 575
CHAPITRE 12
12 ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS
Ce chapitre nous confirmera la puissance de la microflore bactrienne pour liminer des hydrocarbures ptroliers ou des composs chlors ns de l'industrie. En fait elle a su s'adapter des polluants nouveaux l'aide d'outils dont elle disposait dj pour recycler des composs naturels. Nous quittons ici lunivers spcifique des aromatiques.
12.1 - LES TRISTES MARES NOIRES

Les hydrocarbures voquent gnralement des produits rbarbatifs pour les organismes vivants et l'on pense gnralement aux produits ptroliers. Ils sont cependant courants en petite quantit dans la nature. Si on omet le mthane, ils proviennent parfois d'aldhydes longue chane dcarbonyls par des algues marines l'aide d'une enzyme cobalt [1]. La cuticule des insectes et des plantes renferme des alcnes masse molculaire leve comme protection contre la perte d'eau. Ils tirent leur origine de la dcarboxylation d'acides gras insaturs ou de l'oxygnation d'aldhydes avec limination de CO2, un procd observ chez la mouche domestique [2]. Les isoprnodes, carotnodes et terpnes sont trs rpandus dans la nature et se rattachent cette vaste famille. La nature a toujours connu des panchements de ptrole, mais en des localits prcises et par petites quantits. Revenons sur le fait que les suintements dhydrocarbures ont t remarqus depuis la plus haute antiquit. Par exemple dans les ruines de Suse, dtruite par ASSURBANIPAL en 640 av. J.C. on a retrouv des objets antrieurs au premier millnaire av. J.C. et mouls en mastic de bitume mlang des dbris vgtaux, du sable et de la calcite. Ils sont exposs au muse du Louvre. Ces petits panchements continuels n'ont rien voir avec les pollutions de la vie moderne, dont les pires sont causes par des accidents maritimes rptition. Le premier en date sur les ctes bretonnes a t celui du Torrey Canyon en mars 1967 avant la cration en France d'un Ministre de l'Environnement (1971). Le naufrage de lAmocco Cadiz le 16 mars 1978 a rpandu nouveau sur les ctes bretonnes quelques 220 000 tonnes de ptrole. Un autre accident majeur fut lchouage de lExxon Valdez sur les ctes de lAlaska, le 24 mars 1989, rpandant dans une zone protge au moins 37 000 tonnes de ptrole brut. Il a servi de terrain d'essai une des plus grandes campagnes de nettoyage des dernires annes, notamment pour une puration biologique. Les dgts sur la faune et la flore
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du littoral ont t normes, et il en a rsult une forte prise de conscience. Les moyens mcaniques habituels de collecte du polluant et de son limination se sont avrs insuffisants ou trop lents, et l'on s'est efforc de favoriser la multiplication de micro-organismes capables de solubiliser ou de dgrader compltement les hydrocarbures [3]. Pour cela ont t utilises principalement deux catgories dingrdients, des fertilisants comme le Customblen 1, et lInipol EAP22, fabriqu par Elf Aquitaine et achemin par avion. LInipol est un mlange de laurylphosphate, dure, d'un tensioactif (2-butoxythanol) et dacide olique. Les essais effectus sur le terrain et en laboratoire ont montr que ces fertilisants avaient un effet bnfique, permettant dacclrer le processus biologique et dliminer les hydrocarbures plus profondment dans les sols souills que par les lavages mcaniques. Les pollutions les plus redoutables manent des fiouls lourds, formant des goudrons et des gommes rcalcitrants comme lors du naufrage de l'Erika, le 11 Dcembre 1999 au sud du Finistre, ou encore celui du Prestige au large des ctes espagnoles la fin de 2002 qui a t particulirement catastrophique en venant souiller plus de 1000 km de littoral. Les composants les plus lgers ont en effet une meilleure tendance svaporer dans latmosphre. Ces affaires ont rvl des prises de risque particulirement scandaleuses et montr du doigt les nombreux "navires poubelles" qui sillonnent les ocans. Les accidents maritimes ne sont pas les seuls responsables de la souillure des mers car ils interviennent pour moins de 10% de la pollution par le ptrole, mais leur gravit vient du caractre massif des pandages et des effets dommageables spectaculaires sur lenvironnement. Une grande partie de la pollution des mers vient du rinage des cuves et du dversement des eaux de ballast effectu au mpris des rgles internationales. D'autres pollutions mal contrles rsultent des activits industrielles ou d'une mauvaise gestion des dchets. Deux facteurs essentiels viennent limiter ou ralentir laction des micro-organismes sur les hydrocarbures : leur faible solubilit dans leau et leurs effets toxiques sur les cellules vivantes. Dans le premier cas intervient un problme daccessibilit. Les substrats hydrophobes ont tendance former une phase distincte, et la faible vitesse de leur diffusion en milieu aqueux retarde leur biodgradation. Cet inconvnient est amoindri par dispersion en mulsion. Certains germes comme Pseudomonas aeruginosa mettent des agents mouillants (faisant office de dtergent) qui acclrent la vitesse du transfert en mulsionnant les hydrocarbures. Il en rsulte une croissance plus rapide du germe qui peut se dvelopper sur lheptane comme seule source de carbone et dnergie [4]. Le caractre lipophile des hydrocarbures est la principale source des effets toxiques en provoquant des altrations de la structure membranaire [5]. Les aliphatiques courte chane et les aromatiques lgers sont plus diffusibles et sont plus toxiques pour la faune et la flore que le ptrole lui-mme. En consquence l'essence ordinaire reste indemne de toute corruption par les micro-organismes, tandis que le fond des rservoirs de krosne ou de gazole hberge volontiers des germes formant des mulsions et des gommes.
1 - Mlange de phosphate et nitrate dammonium, phosphate de calcium.
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La dcouverte d'agents biologiques assimilateurs d'hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques est un tableau de chasse rassurant pour la bioremdiation des produits ptroliers, dont l'puration biologique est en principe possible. Malheureusement on ne peut pas laisser les nettoyeurs naturels se dbrouiller tout seuls, car leur action est souvent trop lente pour interdire les consquences dsastreuses que lon sait sur la pche, la faune, le tourisme, et l'on en passe. La pelle et le nettoyage mcanique sont encore ncessaires pour dbarrasser les plages de cette pollution. Nous avons eu loccasion de mentionner lexistence de suintements naturels de produits ptroliers partir des sdiments marins. La dispersion annuelle des hydrocarbures sur toute la surface des ocans se chiffrerait par milliers de tonnes. Conclusion : les mers ont depuis fort longtemps lhabitude de cette pollution discrte. La vie sy est donc prpare loisir, et les organismes consommateurs dhydrocarbures ont t slectionns bien avant l'arrive des pandages dorigine humaine. Dans un article de l't 2002 du magazine scientifique La Recherche, L. LAUBIER et C. ALZIEU [6] se voulaient rassurants, en montrant la capacit de la mer, sous le climat breton, effacer en moins de 10 ans les traces d'une mare noire. Citons : "La mare noire est l'archtype de la pollution accidentelle, localise et temporaire. Lorsqu'il est dvers, le ptrole est plus ou moins toxique en fonction des hydrocarbures aromatiques qu'il contient. Mais son vieillissement, sa dispersion et sa biodgradation font que, peu peu, il n'a sur les peuplements qu'une action comparable celle d'un excs de matire organique." On peut dire que toute contamination par des hydrocarbures est destine se rsorber peu peu, mais la lenteur des processus naturels, les dgts considrables causs aussitt la flore et la faune marines, l'industrie touristique, la scurit sanitaire, font qu'en gnral on ne peut pas se permettre de laisser la pollution s'vacuer toute seule sans rien faire.
12.2 - BACTRIES ET LEVURES SUR ALIPHATIQUES

Quels sont les organismes capables doxyder les hydrocarbures aliphatiques ? Ce sont essentiellement des bactries et diverses levures. Parmi les premires se rencontrent les invitables Pseudomonas, des Vibrio, Achromonas, ainsi que des genres abondants dans les sols : Actinomyces, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia. On doit ajouter ces exemples des espces capables doxyder le mthane comme substrat de croissance essentiel. Lattaque des alcanes 2 et autres hydrocarbures nest alors qu'une activit secondaire rsultant dun comtabolisme. Parmi les levures citons les genres Candida, Hansenula, Torulopsis (une quinzaine de genres sont concerns) [7]. La capacit des levures dattaquer les hydrocarbures est connue depuis le XIXe sicle. Tout chantillon de sol renferme en abondance des
2 - Mot cl pour les bases de donnes : alkane (en anglais).
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organismes capables de dgrader des hydrocarbures et il en est de mme pour le milieu marin. croire que ces "ptrolivores" sont des constituants banals du sol. Il n'y a rien dtonnant cela. En dehors des composs aromatiques communs en biochimie vgtale existent profusion des terpnes et des hydrocarbures saturs ou non, produits du mtabolisme secondaire pour des fonctions dexcrtion, de dfense ou de rserve carbone. Quil nous suffise de penser au caoutchouc naturel, produit par Hevea brasilensis, et aux constituants trouvs dans le latex de nombreuses plantes. Les exemples sont nombreux. Le plus simple des alcnes, lthylne, est produit par les plantes suprieures comme hormone dans le mrissement des fruits. Des alcnes longue chane font partie de la cuticule des insectes et des plantes, servent de signaux de communication et de protection contre la dessicative. Les carotnodes et les terpnes* forment une vaste famille apparente celle des hydrocarbures mme si leurs molcules renferment parfois de l'oxygne (vitamine A). On ne connat pas de micro-organisme utilisateur de nimporte quel hydrocarbure dans nimporte quel milieu. Chaque espce a des exigences spcifiques : longueur de chane, ramifications, insaturation. Dans leur diversit se dgagent quelques principes de base : Lattaque des hydrocarbures aliphatiques est surtout arobie et dbute par laction dune mono-oxygnase formant un alcool, qui est oxyd son tour jusquau stade de lacide. Il existe aussi une dgradation anarobie, moins bien connue, qui sobserve chez certains sulfato-rducteurs et ne fonctionne bien que s'il y a au moins 6 atomes de carbone dans la molcule. Il en sera question dans la section suivante. Les hydrocarbures saturs chane droite sont les plus exposs. Les chanes ramifies sont moins facilement attaques, et leur caractre rcalcitrant augmente avec le nombre de ramifications. Par contre les hydrocarbures ramifis sont plus susceptibles aux oxydations photochimiques non-enzymatiques et la prsence de radicaux libres. Les alcanes longue chane sont plus facilement assimils que les composs chane courte. Loptimum est dans la gamme entre C10 et C18, aussi bien chez des Pseudomonas que chez les levures Candida. Les alcanes plus courts que C9 sont oxyds facilement mais plus rarement assimils. Les effets toxiques des hydrocarbures courte chane s'expliquent par leur plus grande solubilit dans leau et la dsorganisation des lipides membranaires. Les meilleurs rsultats en culture exprimentale sur n-hexane sont obtenus par petites additions successives de substrat ou par son apport en phase vapeur. L'utilisation des alcanes courte chane (butane, pentane) est commune dans un groupe de Gram-positifs : Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus. La non-miscibilit des hydrocarbures dans leau se traduit par un log Koc* lev. Leur biodgradation dpend normment de leur tat physique (mulsion, adsorption, dispersion micellaire), et de l'tat des cellules, selon quelles sont disperses, loges dans un biofilm ou adhrentes un substrat.
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La dgradation du ptrole brut, qui contient la fois des alcanes et des aromatiques, peut s'effectuer l'aide de communauts bactriennes organises en dpts ou en biofilms, o se rencontrent des cyanobactries, mlanges un cocktail d'espces comme Rhodococcus, Arthrobacter, Streptomyces, Pseudomonas et divers champignons [8] : une mise en commun des ressources biologiques pour dgrader un met peu apptissant ! La dispersion des hydrocarbures dans leau par agitation cre des microglobules en suspension qui se recouvrent de bactries, de levures et de champignons et forment des floculats. Les dgradeurs les plus performants, bactries ou levures, mobilisent les molcules de substrat par des agents tensioactifs assez tonnants. Par exemple Pseudomonas aeruginosa fait en abondance un mulsifiant constitu dun rhamnolipide et dune protine activatrice [9]. Les bactries ont besoin de ce rhamnolipide pour assimiler lhexadcane [10]. Il existe plusieurs solutions pour "mouiller" les hydrocarbures. Bacillus licheniformis se sert dacides gras en C16 - C18, et de lipopeptides contenant des acides gras hydroxyls en C14 - C15 attachs des chanons peptidiques de 7 acides amins en majorit hydrophobes [11]. Ces produits sont des tensioactifs puissants et fond dune pierre deux coups, car ils ont en mme temps une action antibiotique contre dautres espces. Un Acinetobacter utilise une stratgie peine diffrente et englobe lhydrocarbure dans de minuscules vsicules (20-50 nm) entoures par une membrane de composition similaire celle de la membrane cellulaire externe par ses phospholipides, lipopolysaccharides et protines. On suppose que la coalescence des vsicules avec la surface cellulaire facilite linternalisation du contenu [12]. De nombreuses biotechnologies ont t proposes pour dcontaminer les lieux souills par des hydrocarbures ou traiter les rservoirs. On fait souvent appel des injections dair ou doxygne. Le trithylphosphate est utilis comme source de phosphore, car il est suffisamment volatil pour tre entran par les gaz injects dans le sol. Les micro-organismes le scindent en librant le phosphate. Chaque cas ncessite une technique particulire. Hlas, en ce qui concerne la pollution des plages par les goudrons de lErika et du Prestige, les procds les plus rapides taient encore la pelle et la petite cuillre ! Quel est le principe de la dgradation arobie des aliphatiques ? La voie la plus commune est loxydation dun mthyle terminal selon un principe trs simple. Une mono-oxygnase y introduit un atome doxygne et engendre un alcool, qui est ensuite oxyd en aldhyde puis en acide gras. Il y a trois indications exprimentales : un peu dacide ayant la mme chane carbone que le substrat initial apparat dans le milieu, et l'on peut isoler un ester entre lacide et lalcool correspondants. Dautre part loxygne-18 apport par O2 enrichi en cet isotope est bien introduit dans lacide. Enfin la mono-oxygnase a pu tre isole et purifie partir de plusieurs sources. Le mtabolisme de lacide gras se fait par le mcanisme classique appel b-oxydation*. Ce procd auquel il a dj t fait allusion a t mis en vidence depuis plus de quarante ans dans les mitochondries, les bactries, les levures et champignons filamenteux. Une deuxime oxydation lautre bout de la chane, ou -oxydation, conduit ventuellement un diacide.
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CH3 n-alcane CH2OH CHO O2, NAD(P)H
CH2 O C ester O
COOH acide gras -oxydation
Les levures les plus tudies pour lattaque des alcanes sont Candida tropicalis et C. maltosa. Le ttradcane et les hydrocarbures plus longs induisent la machinerie, lhydroxylase et les deux dshydrognases ncessaires [13]. L'outil principal est une batterie de cytochromes P450 membranaires localiss dans les microsomes et non pas dans les peroxysomes [14]. Ils ont besoin dune source dlectrons (NADPH). Aussi travaillent-ils en association avec une rductase flavinique. Les cytochromes P450 sont des protines tonnantes, dont nous retrouverons plus loin les caractristiques essentielles avec le cytochrome P450 bactrien li loxydation du camphre (section 5). Le schma de base du fonctionnement d'un P450 membranaire associ sa rductase est :
NADPH, H
+
rductase ox.
P-450 Fe(II)
R-CH2OH H 2O O2 R-CH3
phospholipides NADP
+
rductase red.
P-450 Fe(III)
Ces P450 ne font-ils que transformer un alcane en alcool primaire ? D'aprs une tude portant sur Candida maltosa, la rponse est non. L'une de ces protines a t purifie, puis associe in vitro avec sa rductase et utilise sur hexadcane [15]. Le dessin suivant montre les diffrentes molcules obtenues partir de l'hexadcane linaire. Le rapport Vmax/Km est donn entre parenthse pour donner une ide de l'efficacit relative de l'enzyme sur les diffrentes ractions 3. Les phases les plus actives sont notes par une flche paissie. D'autres ractions ont lieu dans les peroxysomes* et n'utilisent pas de P450. Elles s'effectuent par dshydrognation (dH). Les cellules de levure induites dgrader les hydrocarbures subissent un certain nombre de modifications au niveau de leur arsenal enzymatique, dans leurs peroxysomes et leur surface [16]. Elles adhrent aux gouttelettes de substrat et les absorbent sous forme dinclusions laide dagents de transport.
3 - Vmax est la vitesse maxima (mmoles par minute). Les vitesses sont relativement lentes, car les substrats sont peu solubles et la vitesse de diffusion vers le site catalytique est probablement limitante.
rticulum peroxysomes
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CH3 H3C hexadcane P450 (0,50)
CH2OH H3C hexadcanol-1 P450 (0,80) HOCH2 P450 CH2OH (0,13) COOH HOCH2 P450 (0,04) COOH HOOC P450 (0,10) H3C acide gras CHO H3C P450 (1,03) COOH
H3C dH
CH2OH
H3C dH
CHO
COOH H3C
-oxydation
actyl-CoA
Oxydation de l'hexadcane chez Candida maltosa

La prolifration des peroxysomes dans les cellules leur apporte un concentr denzymes consacres au mtabolisme lipidique 4, les membranes intracellulaires augmentent leur surface pour hberger un plus grand nombre de molcules dhydroxylase [17]. Il en rsulte tout un remue-mnage cellulaire et plusieurs enzymes apparaissent sous des formes multiples lgrement diffrentes les unes des autres (iso-enzymes) [18]. Ce sujet est le prtexte dvoquer une question de fond concernant les biodgradations. La levure est dj une cellule trs complique, avec noyau, mitochondries, rticulum endoplasmique, peroxysomes, soit autant de compartiments communiquant entre eux travers des barrires membranaires. Se nourrir dalcanes consiste utiliser des ressources carbones trs dsquilibres pour articuler entre eux les diffrents chemins mtaboliques. Par exemple les voies de transformation et de synthse des acides gras doivent maintenir une balance avec celles du mvalonate*. La levure doit aussi refaire des sucres et des acides amins. La confection des isoenzymes catalysant toutes les mmes ractions est une rponse au problme, chacune d'elles tant optimise pour fonctionner dans une voie donne et dans un compartiment cellulaire donn. En outre les substrats de croissance forment un mlange complexe d'hydrocarbures qui ne sont pas tous aussi facilement hydroxylables. C'est sans doute pour cela que Candida maltosa fabrique une multiplicit de cytochromes P450 adapts individuellement une gamme de 4 - Pour les lecteurs familiers de ces questions : catalase, acyL-CoA oxydase, acetyltransfrase, acetoactyL-CoA thiolase, 3-ctoacyL-CoA, carnitine, isocitrate lyase, thiolase, malate synthase.
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substrats [19]. Par exemple un P450 donn fonctionnera mieux sur ttradcane, un autre sur hexadcane. Aux difficults poses par lhtrognit des hydrocarbures se dresse celle des ramifications de chane. Le pouvoir des levures est gnralement trs sensible lexistence des branchements, notamment vers lextrmit de la chane dite ante-iso [20]. D'autres organismes fongiques contribuent dgrader les hydrocarbures ainsi que des bactries. Certains champignons filamenteux tels que Cladosporium resinae sont susceptibles d'attaquer les produits ptroliers leur interface avec l'eau, et leur dveloppement est gnant dans les rservoirs de carburant pour moteur Diesel ou pour l'aviation. Il est mme surprenant de constater quel point diverses espces peuvent contaminer le krosne, rendant ncessaire le nettoyage des carburants pour les avions. Ce problme est bien moindre pour l'essence automobile, qui s'avre plus toxique pour les micro-organismes. On se rappelle sans doute que des projets ont t mis en uvre il y a plus dune quarantaine dannes pour produire industriellement des protines consommables en cultivant des levures sur produits ptroliers. Des usines ont t construites la Jamaque et ailleurs, en France Lavera dans le golfe de Fos. On escomptait une production de quelques 16000 tonnes de protines par an. Une insuffisance des dbouchs commerciaux et le premier choc ptrolier de 1973 ont entran larrt de cette exprience industrielle.
12.3 - L'INTERVENTION DES BACTRIES

Le systme bactrien le plus tudi depuis les annes soixante est celui d'une espce msophile, Pseudomonas oleovorans, reprsentative dune srie de germes actifs sur les alcanes. Le mode d'action ressemble celui de la section prcdente, mais les outils sont diffrents. L'hydroxylase terminale de P. oleovorans fonctionne comme une mono-oxygnase mais n'est pas un P450. La synthse de cette protine ou AlkB est induite exprimentalement par les alcanes ou par un inducteur gratuit (dicyclopropylctone). AlkB peut reprsenter jusqu 1,5 - 2% des protines totales, ce taux tant fortement accru si le gne est transplant et induit dans un colibacille. La protine saccumule alors dans des proportions extravagantes, slevant 10 - 15% des protines totales de la bactrie, qui en est affaiblie et subit un retard de croissance. Ceci nous donne l'occasion de citer un dtail important. Lhydroxylase AlkB est une protine membranaire intrinsque. Pour loger une aussi grande quantit de AlkB, la bactrie accrot la surface des membranes susceptibles de lhberger, et dveloppe en quantit des replis internes de cette membrane dont la composition est lgrement modifie [21]. Lenzyme n'est pas hminique. Elle active loxygne par un noyau bi-mtallique contenant du fer, un dispositif dj vu dans la dgradation des composs aromatiques [22]. On connat au moins 66 protines membranaires dont le site catalytique renferme deux ions Fe placs l'un au voisinage de l'autre. Ce sont des hydroxylases et dsaturases.
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Elles font partie dune mme grande famille regroupant aussi quelques protines solubles 5. L'oxygnase AlkB est associe dautres facteurs cods par un ensemble de gnes groups en deux oprons [23]. Ces gnes sont ports par un lment extrachromosomique, le plasmide OCT. Les deux parties sont alkR et lopron alkBAC (o A et C correspondent chacun trois gnes, et R deux gnes). Pour mieux raliser la participation de chacun, voici une carte gnomique succincte et un tableau :
locus alkR pABC T B F G opron alkBAC plasmide OCT K alkC L
H alkA
jactionne le feu rouge
c'est moi le chef !
Alk kDa Fonction S 99 Rgulatrice, agit sur le promoteur pABC et lactive en prsence dinducteur [24] T 48 Rubrdoxine rductase : rcupre les lectrons du NADH B 41 Mono-oxygnase membranaire : active O2 et oxyde le substrat aliphatique F 15 Rubrdoxine : ne serait pas essentielle au fonctionnement de lhydroxylase G 19 Rubrdoxine : transporte les lectrons de AlkT vers AlkB H 49 Dshydrognase : oxyde les aldhydes aliphatiques en lacide correspondant J 58 Dshydrognase membranaire : oxyde en aldhyde les alcools chane moyenne K 59 Ligase, synthtise un acyl-coenzyme A en scindant lATP ( AMP + PPi) L 20 Installe dans la membrane, pourrait tre un transporteur
Les gnes alk

Nous retrouvons le principe de base des mono-oxygnases : une source dlectrons oxyde par une rductase (AlkT) qui transmet les lments rducteurs loxygnase (AlkB) par l'intermdiaire d'une rubrdoxine*, une petite protine faisant office de ferrdoxine, mais dpourvue de soufre acido-labile. La rductase alkT est soluble et a fait lobjet dtudes physico-chimiques dtailles [25]. Il y a deux rubrdoxines interchangeables, AlkF et AlkG. Le croquis est imit de Staijen et coll. (2000). Lhydroxylase AlkB est longue de 401 acides amins et traverse plusieurs fois la membrane laquelle elle est solidement ancre. Elle oxyde surtout des chanes courtes de 6 12 atomes de C, mais certaines souches prfrent des substrats plus longs (jusqu 20 atomes de C).
5 - Les protines noyau bi-mtallique aperues propos des aromatiques sont des protines solubles formant une autre famille. Ici les squences ont un motif caractristique comprenant huit fois lhistidine : HxxxHxxx...HxxxHHx...HxxxHH. La prsence du noyau bi-mtallique dans lalcane hydroxylase est dduite des tudes en spectromtrie MSSBAUER, et on peut penser que toutes les protines ayant le motif 8 His ont aussi un tel centre bi-mtallique. Il y aurait donc deux grandes familles doxygnases renfermant 2 Fe, regroupant des enzymes solubles comme celle du tolune, et des enzymes membranaires o lenvironnement du mtal est diffrent.
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R-CH3 + O2 + 2 H+ alkane hydroxylase (AlkB) Fe
O Fe
R-CH2 OH + H2O cytoplasme
(Fe) NAD+ + H+ rubrdoxine (AlkG) Fe
FAD
NADH
rubrdoxine rductase (AlkT)
L'alcane hydroxylase membranaire du plasmide OCT

Les diffrences sont dues en partie au mtabolisme des acides gras en aval, o la longueur de chane a communment des effets diffrentiels marqus sur l'activit des enzymes. AlkH et AlkJ contribuent l'apparition d'un acide gras rcupr sous forme d'acyl-CoA. La liaison thioester avec le coenzyme A est la condition sine qua non pour que lacide gras soit mtabolis, en loccurrence dans une -oxydation. La fonction de AlkL nest pas connue. Elle a peut-tre un rle purement stabilisateur pour maintenir lassociation des diffrents partenaires sur la membrane. Tous les gnes cits sont sur le plasmide OCT. Chose curieuse, le chromosome bactrien possde aussi des gnes qui participent au mtabolisme des alcanes, alcA (alcool dshydrognase), et alcD (aldhyde dshydrognase). Lexpression de lopron alkBAC ( alkBFGHJKL) exige un gne alkS fonctionnel, mme lorsque lensemble est transport et exprim dans une autre espce. Le gne alkS a un effet trans. Son produit est une protine activatrice au niveau du promoteur de lopron alk. Elle autorise la phase critique du dmarrage de la transcription par lARN-polymrase [26], sur le principe habituel des activateurs bactriens mais avec une condition supplmentaire. Lexpression de lopron alk est soumise une rpression catabolique : lorsque le milieu de croissance contient une source carbone plus favorable comme le glucose ou le glycrol, P. oleovorans ne perd pas son temps fabriquer les enzymes Alk et consomme la dite source en priorit. Le mcanisme surajout l'activation par AlkS nest pas connu avec certitude, mais le fonctionnement de la rpression catabolique est bien document chez Escherichia coli, o il dpend de la protine CRP*. Ce double contrle nest pas une cl universelle. On sen est rendu compte en clonant les gnes alk dans un plasmide qui colonise aussi bien le colibacille que le Pseudomonas. Le colibacille induit les gnes alk et les exprime vigoureusement mme lorsque le milieu contient du glucose [27]. Ceci n'est pas surprenant a priori. Le colibacille renferme le plasmide en exemplaires multiples et possde comme toutes les espces ses propres circuits rgulateurs. Dans P. oleovorans, lattaque des alcanes est contrle de faon assez complique, parce que les gnes incrimins sont rpartis la fois sur le plasmide et le chromosome, et obissent des signaux distincts. Quelle est lorigine des gnes alk ? Elle reste mystrieuse, mais on peut penser quils ont t transmis partir dune espce diffrente. Un indice est le pourcentage de 47%, en bases G + C de lADN alk, nettement infrieur celui du Pseudomonas. Les gnes auraient t recombins accidentellement au plasmide dont la
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propagation aurait fourni un avantage slectif. Il est possible que de tels transferts gntiques horizontaux aient lieu dans la microflore la suite des mares noires. L'emploi de sondes nucliques reprsentant alkB (pour les aliphatiques) et xylE (pour les aromatiques) a montr que les populations bactriennes avaient acquis ces gnes en diffrentes proportions qui taient influences par la composition en hydrocarbures de la pollution initiale. La destruction des alcanes dans des sdiments pose un problme dlicat quand il s'agit d'une pollution par du krosne, de l'essence ou du gazole. Les contaminants ont dans tous les cas de trs nombreux constituants chane droite ou ramifie, mlangs des aromatiques. On ne peut plus se contenter des cultures pures s'attaquant un substrat dfini. Cette question a t tudie notamment par l'Institut Franais du Ptrole [28]. La mthodologie de base utilisait des mlanges synthtiques mis en prsence d'chantillons de boues prlevs dans l'environnement, et l'on mesurait la quantit de CO2 produite par oxydation. Les tests taient conduits sur milieu minral supplment par un mlange d'hydrocarbures en fioles fermes hermtiquement. Les fioles taient agites 30 pendant une priode d'un mois, au cours de laquelle la disparition des hydrocarbures individuels tait suivie par chromatographie gazeuse. Les bactries de l'environnement sont apparues comme ayant une capacit surprenante dgrader la gamme tendue des hydrocarbures prsents dans les produits ptroliers courants. Leur efficacit variait cependant avec la nature du produit. La dgradation des alcanes ramifis, comme les 2,2,3- et 2,3,4-trimthylpentanes, restait incomplte et le cyclohexane s'est montr relativement rcalcitrant. La contamination des rgions froides par des carburants pour Diesel et des huiles lourdes pose un problme difficile, car les basses tempratures des rgions arctiques tendent solidifier ces lments et retardent l'acclimatation de la microflore. La croissance biologique y est trs lente. Des auteurs ont isol en zone arctique une souche psychrotrophe de Rhodococcus (Q15), qui est susceptible de dgrader les hydrocarbures pour Diesel, comprenant des n-alcanes (C10-C21), des lments ramifis et du cyclohexane substitu [29]. Une dgradation tendue pour les premiers tait quasi totale 5C au bout de 28 jours en prsence d'extrait de levure. D'autres constituants taient galement dtruits, mais plus lentement. C'est un exemple supplmentaire des potentialits trs riches des bactries du genre Rhodococcus. Elles commencent l'attaque des chanes d'hydrocarbures par une oxydation terminale ou subterminale. Un alcool primaire est form dans le premier cas, un alcool secondaire puis une ctone dans le second. On sintresse actuellement trs vivement aux alcane hydroxylases multiples trouves dans certaines espces de bactries Gram-positives et chez Rhodococcus [30], et on sest rendu compte finalement que ces enzymes sont communes dans la nature. Il resterait videmment pouvoir les exploiter. Un Mycobacterium (IFP 2173) utilise l'iso-octane (2,2,4-trimthylpentane) comme seule source de carbone et d'nergie, [31].Cette souche dgrade tous les n-alcanes de 5 16 atomes de carbone, ainsi que les 2-mthyl-alcanes ayant 5 8 atomes de carbone dans leur chane principale. Cette souche utilise galement un certain nombre de di- et trimthyl-alcanes, ainsi que le tolune, les m- et p-xylnes. Chose
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curieuse, les bactries ignorent certains substrats comme le cyclohexane et l'thylbenzne quand ils sont prsents isolment, mais les transforment quand ils sont en mlange avec d'autres hydrocarbures. La cyclohexanone est alors un produit du cyclohexane et rsulte d'un comtabolisme, comme il se dgage des rsultats de SOLANO-SERENA et coll. Bien que toxiques par rapport aux homologues suprieurs, des hydrocarbures varis courte chane sont attaqus. Le procd par lequel les alcanes mthyls sont mtaboliss reste hypothtique. En principe, une ramification ne peut que gner les voies les plus rpandues comme celle de la -oxydation. Un mcanisme considr comme probable serait la carboxylation des groupes mthyle conduisant un actyle, qui serait ensuite limin avec ablation de la ramification latrale.
CO2 2-mthylpentane COOH CH3COOH
Carboxylation d'un mthyle

Plusieurs espces capables de se dvelopper sur le propylne et d'autres alcnes aliphatiques courte chane ont donn lieu des observations surprenantes. L'un de ces germes est un Gram-ngatif, Xanthobacter Py2. Un autre est un Gram-positif, Rhodococcus rhodocrous. Le mtabolisme commence par une mono-oxygnation qui donne un poxyde en logeant un atome d'oxygne sur la double liaison. La transformation ultrieure fait intervenir le coenzyme M (CoM), alors que ce cofacteur est un attribut normal des mthanognes. Un schma en reprsente le mcanisme. Une mono-oxygnation (1 ) produit deux nantiomres R et S, avant intervention d'une poxy-alcane-CoM transfrase (2), d'une dshydrognation (3), et d'une carboxylation par une oxydorductase/carboxylase (4) qui rgnre le coenzyme M [32]. L'actoactate alimente le mtabolisme intermdiaire.
HS CoM SO3 O COO actoactate 4 S OH S SO3 SO3
OH O 1 propne O 2 3 O S
2 e + H+ CO2 SO3
Dgradation du propne
La synthse du coenzyme M et celle des enzymes du mtabolisme des alcnes et des poxydes sont rgules de faon parallle, suggrant l'existence d'un contrle commun. Or on a pu dmontrer que les gnes taient ports par un mgaplasmide linaire de 320 kb chez Xanthobacter et de 185 kb chez Rhodococcus. Ces lments sont requis pour la croissance sur propylne, et renferment des squences fortement homologues de certaines structures gntiques des mthanognes [33].
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On ne retrouve pas cette homologie chez d'autres espces bactriennes. L'emploi du CoM chez les eubactries la place d'un cofacteur plus conventionnel reste mystrieux. L'importation d'information gntique en provenance d'archaebactries est probable. Elle n'est peut-tre pas exceptionnelle. Il a t observ rcemment chez des eubactries la prsence du coenzyme M et d'autres cofacteurs appartenant typiquement aux mthanognes : le MPTH4 et la dazaflavine (F420) [34]. Des homologies intressantes ont t trouves chez Bacillus subtilis avec des gnes archaebactriens impliqus dans la synthse du coenzyme M. Le L -sulfolactate en serait un intermdiaire. Ce produit est trouv en grande quantit, soit 5% et plus du poids sec, dans les cellules en cours de sporulation et dans les spores [35]. On ne sait pas pourquoi les spores accumulent ce produit qui est absent des cellules vgtatives, et d'o vient ce lien avec les mthanognes. Les spcialistes s'attendent trouver de plus en plus souvent des cas de ce genre. La frontire biochimique entre eubactries et archaebactries serait donc beaucoup moins tanche que primitivement escompt. Nous voyons en conclusion que la biodgradation des hydrocarbures aliphatiques, qui paraissait base au dpart sur des principes assez simples, rvle des connexions tranges qui remontent sans doute aux ges les plus lointains.
12.4 - ALICYCLIQUES ET TERPNES

Les hydrocarbures comportant une chane sature ferme sont appels alicycliques. Le cyclohexane est l'un des plus simples et pose des problmes environnementaux car il est utilis en grande quantit comme solvant pour les drivs de la cellulose, les laques, rsines et cires. Il est prcurseur de l'acide adipique utilis dans l'industrie du Nylon. L'effet pervers d'une contamination par le cyclohexane vient en partie de sa toxicit sur la microflore. Les molcules du solvant s'intercalent dans les membranes et les dsorganisent. Si la toxicit de ces molcules est lie leur hydrophobicit, elle dpend aussi de leur structure molculaire. Par exemple le n -hexane est mieux tolr que le cyclohexane par E. coli, le modle bactrien par excellence. Des auteurs y ont mis en vidence une porine (protine de la membrane externe) formant un canal destin faciliter l'expulsion des molcules hydrophobes vers l'extrieur [36]. La porine TolC participerait un pompage s'appuyant sur un autre facteur, AcrAB, un des agents de la rsistance multiple aux antibiotiques et substances toxiques 6. Le systme AcrAB/TolC est un dispositif de dfense allant d'une membrane l'autre et permet l'vacuation du cyclohexane considr comme antibiotique. La rsistance au cyclohexane est emblmatique d'une situation frquente dans la nature, lorsqu'un micro-organisme confront la transformation d'un agent extrieur doit commencer par rsister son action toxique. Il y a deux faons de se dfendre, soit rejeter le substrat l'extrieur de faon ce que sa concentration 6 - Les bactries se dfendent de l'intrusion de substanes trangres nocives, en particulier des antibiotiques, par des pompes peu spcifiques permettant leur expulsion (voir Rsistance multiple*).
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dans la cellule reste faible, soit le dgrader rapidement au fur et mesure, ce qui correspond une dtoxification. Le systme de dfense est soumis rgulation. Sa mise en route par l'expression des gnes concerns est une rponse un tat de stress. Il existe chez le colibacille plusieurs gnes de stress pour le dclencher (stress*) [37]. L'un d'eux est marA, qui commande un vaste rgulon de nombreux gnes. Ces ractions de stress sont peu spcifiques, et font qu'une agression par un solvant comme le cyclohexane va dclencher du mme coup une rsistance accrue aux antibiotiques hydrophobes. Le cyclohexane est-il vraiment rcalcitrant ? Les bactries arobies capables d'hydroxyler le cyclohexane et autres substrats alicycliques sont rpandues dans l'environnement. En rgle gnrale, les transformations se font par comtabolisme dans des populations mixtes. L'isolement des souches comptentes a souvent chou faute d'utiliser la source carbone auxiliaire approprie. La mono-oxygnation transforme le cyclohexane en cyclohexanol, dont les transformations ultrieures sont assez bien connues. Le cyclohexanol est transform en ctone, servant son tour de substrat la cyclohexanone-1,2-mono-oxygnase.
NAD+ OH H+ O2 H2O + H+ NADH NADPH NADP+ O O O O cyclohexanol cyclohexanone 1,2-mono-oxygnase COOH CH2OH COOH CHO COOH COOH acide adipique H2O H+ NAD+ NADH H+ NADP+ NADPH
Dgradation du cyclohexanol
On voit qu'il y a insertion d'un atome d'oxygne dans le cycle, opration qui rappelle la raction de BAEYER-VILLIGER*. Cette enzyme a un fonctionnement peu courant. On attendrait une hydroxylation, alors qu'il y a lactonisation en -caprolactone. L'enzyme est flavinique, ressemble la 4-hydroxybenzoate hydroxylase et son mcanisme a fait l'objet d'une tude dtaille [38]. On rattache au cyclohexane et hydrocarbures analogues des composs cycliques ou non, saturs ou dtenteurs d'une ou plusieurs doubles liaisons. La varit de ces produits dans l'environnement est considrable, qu'ils soient fabriqus par l'industrie ou qu'ils manent de source biologique. Les terpnes forment une vaste extension de cette famille. Certains terpnes ont un cycle. Ils peuvent tre des hydrocarbures stricto sensu, tandis que d'autres ont des fonctions oxygnes. La principale source de terpnes dans la nature vient du monde vgtal, en particulier des arbres. On a estim que prs de 480 millions de tonnes de terpnes taient mises par an dans l'atmosphre [39]. La part prise par laction photochimique avec l'aide des oxydes d'azote et celle de l'oxygne est importante. Hydrocarbures alicycliques et terpnes sont runis ici parce qu'ils posent des problmes de biodgradation tout fait comparables.
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Voici quelques exemples de monoterpnes simples 7. On peut voir que ce groupe renferme aussi des aromatiques comme le p-cymne.
OH (-)--citronellol graniol
OH nrol OH
O H R(+)-limonne (-)-menthol OH -terpinne -terpinne p-cymne eucalyptol
Le (+)-(4R)-limonne est l'un des terpnes les plus rpandus, fabriqu par plusieurs centaines d'espces de plantes, prsent dans les essences de citron, de bergamote, d'aiguille de pin Il a des proprits insecticides. On s'en sert pour la synthse de rsines adhsives, d'armes (menthol, carvone). Il existe dans la nature au moins 5 voies de biodgradation du limonne, qui dpendent chacune d'une limonne mono-oxygnase 8. Un petit tableau indique dans quelles espces bactriennes ou fongiques elles ont t trouves.
7 CH2OH HO I II
limonne 1,2 O
III
IV
OH
OH
7 - mono-ox. 6 - mono-ox. 1,2 - mono-ox. 3 - mono-ox. 8 - mono-ox.
Pseudomonas putida, Ps. gladioli, Penicillium digitatum, Arxula adeninivorans Pseudomonas sp., Aspergillus cellulosae Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas sp. Hormonema sp., Aspergillus cellulosae Pseudomonas gladioli, Penicillium digitatum
Mono-oxygnation du limonne
7 - Tous ces composs viennent de la diversification prodigieuse d'un mtabolisme qui part de l'actyL-CoA, passe par l'actoactyL-CoA, le mvalonyL-CoA, puis assemble des units en C5 pour donner des poly-isoprnodes. C'est la base de la synthse du cholestrol, des strodes, des carotnodes, de la chane latrale des ubiquinones, du caoutchouc naturel, d'hydrocarbures fabriqus par les plantes et les animaux, et d'une grande partie des terpnes et drivs. 8 - Les produits forms sont l'alcool prillylique(I), le trans-carvol(II), le (4R)-limonne-1,2-poxyde(III), l'isopritnol(IV) et l'alpha-terpinol.
550
Les drivs oxygns sont dgrads par plusieurs voies et les intermdiaires peuvent tre repris par d'autres organismes formant une chane ramifie de transformations. Le mtabolisme complet n'est pas connu, mais l'oxygnation en 7 du limonne donne une ide des ractions initiales.
(7-mono-oxygnase) CH2OH CHO COOH O C SCoA O C SCoA OH O C SCoA O O C SCoA SCoA O
acide prillylique deux dshydrognations
HSCoA -oxydation
HSCoA
Dgradation du limonne
Une succession ractionnelle analogue la -oxydation s'observe frquemment dans l'ouverture des cycles et aboutit des acyl-CoA. D'autre part un vaste ensemble de conversions transforment les terpnes dans la nature, que ce soit par l'action des plantes ou des micro-organismes. La mono-oxygnation du limonne en 6, donnant le trans-carvol, est suivie d'une dshydrognation l'origine de la carvone, un principe essentiel de la menthe verte. Une chimie extraordinaire et varie se droule sous nos yeux, et engendre parfois des substances mdicinales ou des parfums !
12.5 - LE CYTOCHROME P450 DU CAMPHRE

Le camphre est un terpne du camphrier (Laurus camphora). Le pinne, le camphne et le bornol en sont des drivs. Le camphre est devenu clbre dans les tudes de biodgradation cause de la dcouverte d'une souche de Pseudomonas putida capable de le dgrader, la premire tape tant catalyse par un cytochrome P450. Les cytochromes P450 forment une vaste famille denzymes hminiques qui ont toutes en commun de catalyser des ractions doxydation utilisant loxygne de lair. Les plus communes sont les hydroxylations ou mono-oxygnations du mtabolisme cellulaire normal (acides gras, strodes) au cours de la dtoxification de substances trangres. On les rencontre partout, des bactries aux plantes et aux animaux. Ceux de notre foie sont ncessaires notre survie, car ils transforment les substances toxiques venant de lalimentation et les mdicaments, facilitant leur limination sous forme de produits moins insolubles. Le tableau ci-aprs en rsume les proprits les plus caractristiques.
Proprit Solubilit Cofacteur Site actif Source de Mcanisme Spectre Spin Catalyse Spcificit
551
Hydrosolubles chez les procaryotes (65 kDa environ), membranaires ailleurs Hme B ; cinquime coordinence du fer occupe par un thiolate (cystine) Du ct de la sixime coordinence, occupe au repos par des molcules deau NAD(P)H, par lintermdiaire dune rductase et dune ferrdoxine (ou dun cyt.) Cycle dclench par le substrat , rduction du fer ; l'O2 se lie en 6e coordinence ltat rduit bande dabsorption caractristique 450 nm en prsence de CO tat bas spin au repos, haut spin en prsence du substrat avec signal spectral Oxygnations et diverses ractions secondaires : dsaturations, dsalkylations Gnralement largie une gamme plus ou moins tendue de substrats
Larchtype des cytochromes P450 bactriens est tir de Pseudomonas putida porteur du plasmide CAM. Il attaque le (1R)-camphre (ou D-camphre) et permet de mieux comprendre le cycle catalytique de ces enzymes [40]. Le cytochrome P450 du camphre (ou P450CAM) est soluble, sa structure dtaille est connue. Quant au camphre, il est reprsentatif de nombreux terpnes naturels et entre dans maintes prparations pharmaceutiques ou autres applications, par exemple comme agent plastifiant. Ce sera ici loccasion dobserver lattaque par hydroxylation dun carbone mthylnique (CH2). Un cytochrome P450 nutilise pas directement NADH ou NADPH comme source dlectrons, il ne le fait que par une mini-chane de transporteurs, ici une rductase et une ferrdoxine noyaux [2Fe-2S] appele putidardoxine. Seuls certains P450 du mtabolisme secondaire des vgtaux peuvent se passer de tels intermdiaires. La catalyse par P450 obit un plan de marche rigoureux. La protine est conue pour privilgier la liaison du substrat par rapport la vitesse du cycle catalytique, peut-tre ici pour permettre une fixation efficace du camphre, mme lorsque celui-ci est prsent dans lenvironnement un taux trs faible. Cette opration est rgle cooprativement par les ions potassium [41].
5-exo-hydroxycamphre O NADPH, H
+ +
FAD rductase
[2Fe-2S]
Fe(III) P450 Fe(II) O2 O
H 2O OH
putidardoxine [2Fe-2S]
2+
NADP
FADH2
camphre
Oxygnation du camphre
Le substrat commence par sinstaller dans la poche du site actif qui s'ouvre au niveau de la sixime coordinence comme symbolis par le schma qui suit.
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Tyr-96
OH O HOH HOH 6e O2 6e
camphre
5e S
5e S
a - Etat bas-spin
b - Etat haut-spin
Oxydation du camphre
Le fer est la boule noire dans la porphyrine vue par la tranche. En a, le fer tablit 4 coordinences au sein de la porphyrine, une cinquime avec un atome de soufre et la sixime avec une molcule deau. La poche o s'installera le substrat est tapisse de motifs hydrophobes. En b, le substrat expulse les molcules deau et s'oriente convenablement dans le site l'aide d'un lien hydrogne entre son atome doxygne et un rsidu de tyrosine de la cavit. La sixime coordinence reste libre et c'est l'oxygne diatomique qui viendra l'occuper. Larrive du substrat est ltape initiale essentielle en dgageant la place o se fixera O2. Tant que la sixime position reste libre, la gomtrie de coordination du fer est asymtrique et le mtal est l'tat haut spin. L'arrive de l'oxygne restaure cette symtrie et le fer passe alors l'tat bas spin. Cette alternance entre les deux tats se traduit par une modification spectrale.La perturbation induite par le substrat dclenche un petit remaniement structural de la protine avec lger dplacement du fer perpendiculairement au plan de lhme. Le passage de bas spin haut spin se traduit alors par un signal en RPE, un dplacement du spectre optique et l'apparition dune bande 380 nm.
absorbance
390
420
nm
haut-spin/bas-spin
Spectre diffrentiel P450 + camphre / P450
553
Puisque le substrat ne se lie donc pas directement au fer mais son voisinage immdiat, la stratgie utilise consiste rduire le mtal par une source extrieure pour qu'il puisse lier O2. Une fois en place, loxygne va tre transform en une entit trs oxydante qui sen prendra au substrat plac son contact. En somme lhme a pour action dexacerber la ractivit de loxygne, non pas celle du substrat. Le cycle catalytique est rsum par un diagramme [42].
OH OH dpart
OH
OH
OH
O Fe
3+
O2 Fe3+
Fe2+ e Camphre
H2O
2 H+
Cycle du P450 du camphre

Il se produit un changement notoire du potentiel redox du fer, qui passe de 300 mV 173 mV. La venue du camphre facilite donc la rduction ultrieure du mtal. Le passage du fer de ltat Fe3+ ltat Fe2+ permet larrive de loxygne la sixime coordinence comme dj indiqu. Le spectre figur ci-contre est la diffrence d'absorbance de la prparation contenant le cytochrome P450 et le substrat, et celle de la mme prparation sans substrat. L'installation du camphre dans le site se traduit donc par un signal facile dtecter, sans qu'il y ait apport d'lectrons ni raction d'oxygnation. La protine est donc facile doser en l'absence de rductase et de putidardoxine, simplement en mesurant l'amplitude de ce phnomne. Un signal inverse et un renforcement de l'tat bas spin s'observent en prsence de certains inhibiteurs (mtyrapone) quand ils dplacent l'eau et se lient directement au fer. On retrouve les faits suivants : l'arrive du substrat rompt la sixime coordinence (dpart dune molcule deau ou dun ion hydroxyle) ; le fer est rduit en Fe2+ par un seul lectron ;
554
la venue de loxygne sur le fer oxyde nouveau celui-ci et passe l'tat d'ion superoxyde (OO) ; La liaison entre les deux atomes doxygne est rompue (coupure dite htrolytique) et le fer est transform en oxne (Fe=O), une entit extrmement oxydante ; le cycle est complt par lhydroxylation proprement dite. Le substrat nest donc transform qu la fin du cycle. Le cycle complet consomme deux lectrons, c'est--dire un NADH par molcule substrat hydroxyl. Le dosage enzymatique de l'hydroxylation du camphre par un systme complet (avec rductase et putidardoxine) est donc trs simple, car il consiste mesurer la disparition de l'absorbance du NADH 340 nm. Le couplage entre oxydation de NADH et hydroxylation est alors de 100%. Ce rapport peut-il tre altr ? En principe, oui. On remarque que le substrat ne ragit qu la fin du cycle. En cas d'interruption, par exemple lorsque lhydroxylation ne peut tre ralise, il y a un dcouplage partiel et un excs doxydation de NADH par rapport au substrat transform. la limite, il peut ny avoir aucune hydroxylation et le systme se met fonctionner comme une vulgaire NADH oxydase. Voici par exemple comment le cycle peut sinterrompre. Le dessin montre le cycle tronqu du P450, en utilisant le mme symbolisme que prcdemment.
a
OH
b
OH OH dpart
H Cl C C
OH H Cl C C e
dpart
e H2O2 C=C O2 Cl
H Cl C C
2 H+
O2
O H Cl C C
O2
O
2+
2 H+
3+
+ H2O2
Cycles partiels du P450
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En a, un analogue du substrat ne peut pas se faire hydroxyler, le mcanisme drape en ne produisant que du peroxyde dhydrogne la manire d'une oxydase classique. Le cycle commence normalement, rcupre O2 et les deux lectrons successifs, mais avorte au stade peroxy en mettant H2O2. L'enzyme fonctionne alors comme une NADH oxydase, avec consommation d'oxygne et production d'eau oxygne. Mais le systme peut fonctionner aussi dans l'autre sens (avec une efficacit rduite) : l'enzyme son stade de dpart peut fixer H2O2 et donner directement l'intermdiaire peroxy, qui volue par la suite du cycle normal en oxydant le substrat. Le P450 agit alors comme une peroxydase. Ce type de dcouplage se produit assez souvent avec de nombreuses mono-oxygnases, surtout avec des analogues. L'activit peroxydasique du P450 du camphre reste cependant des plus modestes, mais donne lieu des situations intressantes. Ainsi l'enzyme hydroxyle un peu le naphtalne avec H2O2 par un dtournement d'activit assez curieux. Cette proprit a t le point de dpart d'une recherche cratrice d'un grand nombre de mutants par une variante de la technique PCR [43]. L'hydroxylation du naphtalne donne facilement des produits fluorescents faciles dtecter, et permet de slectionner des mutants dont le P450 a t modifi. On espre obtenir ainsi des enzymes uvrant facilement comme peroxydases sur des hydrocarbures et divers polluants. Le cycle b du schma est plus facilement observ faible taux d'O2. Le cytochrome P450 est porteur de superoxyde et fonctionne comme rducteur sur certains substrats. Le cycle normal avorte ce stade, mais le substrat est ventuellement transform. On peut assister une dshalognation dont nous verrons plus loin un exemple. Le P450 du camphre est donc une excellente molcule-laboratoire pour tudier les relations entre protine et substrat, car on peut cristalliser lenzyme en prsence de diffrents ligands et observer la position de celui-ci dans le site actif [44]. Les formules ci-dessous dsignent plusieurs ligands utiliss. Les petites flches indiquent les positions hydroxyles.
O 5 camphre O 3 S O 5 norcamphre thiocamphre adamantane adamantanone
6 5
6 5 camphane
Les critres utiliss sont ltat de spin, la position hydroxyle sur le substrat, le potentiel redox du fer, le nombre de coordinences de celui-ci (5 ou 6) et le facteur de temprature*. Chose curieuse, lattaque du camphre par le P450CAM nest pas rigoureusement stroslective. Lenzyme hydroxyle aussi le (1S)-camphre [45], qui se place avec deux orientations diffrentes, une seule tant favorable lhydroxylation en 5. Il en a rsult une mine de renseignements sur cette enzyme. Un ligand est positionn par une liaison hydrogne avec la tyrosine du site (Tyr-96), ainsi que par des forces de VAN DER WAALS. Quand un ligand ne remplit pas tout lespace ou ntablit pas de pont H, sa mobilit accrue a pour effet de faciliter lhydroxylation en des points surnumraires (norcamphre, camphane). Pour vrifier
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cela ont t utilises des mutations du P450 o Tyr-96 tait remplace par la phnylalanine, ce qui modifiait peu la gomtrie du site mais supprimait le pont H, confirmant limportance de celui-ci. La spcificit tait largie, le dplacement vers ltat haut spin tait moins marqu (la sixime coordinence avec leau ntant pas abolie). En outre le facteur de temprature (un paramtre cristallographique) tait plus lev que pour le camphre, traduisant un positionnement moins prcis dans le site actif. Le thiocamphre sinstallait avec plusieurs orientations et lhydroxylation avait lieu en 3, 5 et 6. Ladamantane et ladamantanone taient hydroxyls une seule position, un carbone tertiaire (dont la ractivit est plus grande [46]). Enfin quelques ligands offerts lenzyme comme des substrats imparfaits par rapport au camphre (thiocamphre, norcamphre et camphane) provoquaient un certain dcouplage entre la consommation de NADH et le taux dhydroxylation par le systme complet : il fallait environ deux fois plus de NADH que ncessaire, montrant que le cycle catalytique avortait une fois sur deux en moyenne comme il a t expliqu antrieurement. De faon gnrale si lattachement danalogues de substrat par le P450 revt un caractre de plus en plus acrobatique, l'importance de ce dcouplage saccrot dautant. Le taux dhydroxylation devient alors faible et lenzyme se met fonctionner de faon prdominante comme une oxydase ordinaire [47]. Le systme doxydation du camphre comprend la rductase, la putidardoxine et le P450 et fonctionne comme une seule unit. Les gnes forment un opron camDCAB dont lexpression est sous la dpendance dun rpresseur cod par camR. Le rpresseur bloque la transcription de lopron par lARN-polymrase, mais cesse de le faire en prsence dun inducteur qui est le camphre ou un analogue. Le rpresseur CamR rgule sa propre expression. Lopron renferme les gnes de la rductase (CamA, 422 acides amins), de la putidardoxine (CamB, 106 acides amins), du P450 (CamC) et de la dshydrognase qui opre en aval sur le produit dhydroxylation du camphre (CamD). Ces protines fonctionnent probablement en troite association. On en a la certitude pour lassociation putidardoxine-P450. Quand le camphre entre dans le cytochrome P450, ltat haut spin qui en rsulte saccompagne dun petit changement de conformation peru par la putidardoxine, qui en subit une modification structurale [48]. L'arrive du camphre dclenche lunisson des changements mutuels qui ont pour effet de modifier les deux potentiels redox et dabaisser la barrire nergtique lie loxydorduction entre les deux protines en damliorant la rapidit du transfert. Nous avons dj voqu ce principe propos des cytochromes respiratoires. D'autres cytochromes P450 solubles comparables celui du camphre ont t isols. Le P450TERP isol chez un Pseudomonas, est spcifique de l'alpha-terpinol et fonctionne sur le mme principe. Il est trs spcifique et possde un site actif un peu diffrent [49]. Une ferrdoxine appele terprdoxine est trs voisine de la putidardoxine et la remplace dans ce systme. Nous avons dj voqu les manipulations gntiques destines modifier la slectivit de ces enzymes. On a pu les dtourner vers des substrats dits exotiques : chlorothanes et 1,2-dichloropropane [50], des aromatiques polycycliques (naphtalne, pyrne !) [51]. Le naphtalne est oxyd en 1- et 2-naphtol, le pyrne est oxyd en 1,6- et 1,8-pyrnequinone. La mutation Y96F du P450CAM (tyrosine-96 remplace par phnylalanine) est la plus favorable sur le naphtalne, qui est oxyd aussi vite que le camphre lui-mme.
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Une application intressante a t publie par le groupe de WACKETT [52]. Un Pseudomonas modifi (P. putida G786) portait deux plasmides, l'un ayant les gnes du camphre, l'autre les gnes de la tolune di-oxygnase. La souche tait donc arme de deux systmes ayant chacun une large spcificit et capables de comtaboliser ensemble un chlorofluorocarbone (CFC). Le P450 catalysait une dshalognation rductrice, la di-oxygnase faisait une nouvelle dshalognation par oxydation.
Ps. putida G786 plasmide CAM plasmide HG-2 Cl Cl Cl C C F Cl F (P450) Cl C camC camA camB cytochrome P450CAM todC1 todC2 todB todA tolune dioxygnase Cl C F (Tolune diox.)
OOC COO
L'tude a port sur divers composs en C2 comportant du chlore, du brome et du fluor. Dans le cas du 1,1,1,2-ttrachloro-2,2-difluorothane, reprsent sur le dessin, la dshalognation tait complte : les bactries cultives sur ce produit en prsence de camphre (pour induire le P450) transformaient entirement le substrat en oxalate. L'efficacit dpendait beaucoup de la position des atomes d'halogne. Ici l'un des carbones devait porter 3 Cl, et non pas 2 Cl et un F. Un substrat ayant plus de deux atomes de fluor n'tait pas transform contrairement au 1,1,2,2-ttrabromothane (2 Br sur chaque carbone). D'autres combinaisons sont inactives. La souche n'avait donc pas une comptence universelle contre n'importe quel produit halogn, mais les rsultats se sont montrs trs prometteurs. Les cytochromes P450 agissent de prfrence sur des positions carbones aliphatiques. Ils sont rpandus chez les actinomyctes o ils contribuent la synthse des antibiotiques et la mobilisation de sources nutritives. Les P450 solubles observs dans le genre Streptomyces ont gnralement une spcificit bien plus large que celle du P450 du camphre [53] et contribuent liminer les mthoxyles (OCH3) sur les produits de dgradation de la lignine.
NADH, H+ O2 OCH3 OH guacol NAD+ H2O OH OCH2 OH H2O OH H H OH C O catchol
Oxygnation du gaacol
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L'intervention d'un P450 dans ce type de raction a t observe chez un Moraxella et un actinomycte [54]. Elle est reprsente par la dmthylation de substrats aromatiques comme le vratrole et le gaacol. L'hydroxylation du carbone mthylique engendre un hydroxymthyle facilement dtach en formaldhyde, pour laisser une fonction phnolique sur le cycle intact. De telles dmthylations ont des consquences importantes dans l'environnement, car elles engendrent des produits beaucoup plus solubles que les substrats de dpart. Dans le domaine pratique, les cytochromes P450 ont des applications potentielles nombreuses et ont l'avantage d'tre solubles, contrairement ceux de la levure et des eucaryotes en gnral. Ils ont l'inconvnient de fonctionner avec des sources d'lectrons auxiliaires qui ncessitent une rductase et une ferrdoxine. D'o l'intrt des enzymes o tous les facteurs sont intgrs dans une protine unique. Cette situation est connue dans le cas du cytochrome P450 de Bacillus megaterium induit par les barbiturates [55]. La protine soluble de 119 kDa regroupe toutes les fonctions, travaille avec NADPH, contient FMN et FAD et pratique des hydroxylations et poxydations sur des substrats varis. Ces cytochromes P450 peuvent donc s'en prendre des drivs aromatiques, sans toutefois ouvrir le cycle. Revenons au P450 du camphre labor par Pseudomonas putida. Sa large spcificit lui permet d'hydroxyler faiblement les di- et trichlorobenznes. Cette proprit montre que la poche du site catalytique est assez large pour que le substrat vienne dplacer les molcules d'eau et se positionner favorablement. L'analyse permet de mesurer deux paramtres importants. Le premier est la constante de dissociation Kd du complexe form entre le P450 et tel ou tel ligand, en se basant pour cela sur le dplacement spectral par le changement de l'tat de spin du fer. La constante mesure est une concentration du mme ordre de grandeur que le coefficient Km*. Le second paramtre est mesur par un coefficient k exprim en moles par seconde et correspond la vitesse de la raction enzymatique dans les meilleures conditions possibles. Le rapport k/Kd est d'autant plus lev que la transformation est plus rapide. Un passage au crible des diffrents substrats possibles permet de construire la carte des molcules acceptes. Divers polychlorobenznes sont hydroxyls par le P450 du camphre, mais l'efficacit reste trs faible par rapport au substrat normal, soit 0,2% seulement pour le 1,3-dichlorobenzne. La faiblesse du rsultat est imputable deux facteurs : une mauvaise adaptation du substrat dans le site catalytique et un certain dcouplage avec l'oxydation du NADH. Il n'y a que 8% de substrat hydroxyl par rapport au NADH consomm, alors que le rendement est de 100% avec le camphre. Le rsultat est encore bien plus mauvais avec le 1,3,5-trichlorobenzne avec un couplage tombant 1% seulement. Le systme oxyde alors beaucoup de NADH en pure perte. Est-il possible d'amliorer les performances du P450 en modifiant son site actif par gnie gntique ? Un travail dans ce sens a t ralis Oxford par JONES et coll [56]. Il a consist diminuer l'espace disponible dans le site actif du P450 en remplaant la tyrosine ou la phnylalanine par le tryptophane, ou la valine par la leucine. Plusieurs mutations taient introduites simultanment, et la protine tait exprime dans un colibacille. Un changement spectaculaire des proprits du cytochrome a t observ dans certains mutants. Par exemple le rapport k/Kd associ
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au 1,3,5-trichlorobenzne est pass de 3 . 102 1,5 . 106 M1 . s1 l'aide d'une triple mutation, soit une augmentation de 5 000 fois, tandis que l'efficacit du couplage remontait de 1 97%. Ces rsultats ont t interprts par l'effet de tassement du substrat prs du fer dans un espace plus resserr, facilitant l'expulsion des molcules d'eau, et une meilleure orientation dans le site. Voici par exemple la transformation du 1,2-dichlorobenzne (1,2-DCB) en 2,3- et 3,4-dichlorophnol.
Cl Cl NADH, H+ O2 OH Cl Cl 1,2-DCB NAD+ H2O 2,3-DCP Cl Cl 3,4-DCP OH
Oxygnation du 1,2-dichlorobenzne
Il est vident que les produits de la raction correspondent aux deux possibilits d'hydroxylation, parce que le substrat occupe diffrentes positions dans le site catalytique. Il est possible de prvoir les produits d'hydroxylation des diffrents polychlorobenznes autres que le 1,2-DCB. Ces substrats n'offrent chacun qu'une solution, sauf le 1,3-dichlorobenzne. La figure montre les 4 produits librs par le P450 d'un triple mutant Y96F-F87W-V247L dsign selon la notation habituelle (par exemple tyrosine-96 remplace par la phnylalanine).
100% CI NADH, H+ O2 Cl 1,3-DCB 60% OH Cl Cl 30% OH Cl Cl Cl 2,6-DCP 2,4-DCP 2,5-DCP 2,3-DCP 8% OH Cl 2% OH Cl Cl
NAD+ H 2O
Hydroxylation du 1,3-dichlorobenzne
Le plus abondant des produits obtenus est le 2,6-dichlorophnol (2,6-DCP). Un examen attentif montre cependant une petite entorse : les 2,5-DCP et 2,3-DCP ne sont pas exactement les produits attendus. Le substrat s'est bien install plusieurs positions dans le site, mais une raction secondaire s'est produite et correspond un dplacement de substituants sur le cycle aromatique sur le mode du NIH-shift*. Quoi qu'il en soit, il est visible que le fonctionnement de cette enzyme possde une souplesse d'action remarquable. De tels travaux montrent qu'il est parfaitement possible de modifier les proprits d'une enzyme de faon lui faire accepter plus efficacement des xnobiotiques. Dans le cas cit, le rsultat est doublement intressant, car il permet l'hydroxylation de polluants indigestes et assez insolubles comme les polychlorobenznes.
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En effet l'apparition de la fonction phnolique rend le produit plus facilement mtabolisable par la suite. Un cas particulier est l'hydroxylation du 1,2,4,5-ttrachlorobenzne en pentachlorophnol ou PCP, un compos polluant que nous retrouverons au chapitre suivant. L'hydroxylation de l'hexachlorobenzne parat possible a priori. Pourtant sa transformation en PCP aurait t observe. Ce paradoxe s'expliquerait par une dshalognation rductrice exerce par le P450 dont le cycle normal serait interrompu comme il a t expliqu. Les proprits voques dans cette section sont observes essentiellement chez les procaryotes et, dans une certaine mesure, chez les levures. Les cytochromes P450 des mitochondries rappellent ceux des bactries. Les membranes intracytoplasmiques des animaux et des plantes ont des P450 dont les proprits diffrent quelque peu des prcdentes, notamment les nombreux P450 qui participent au mtabolisme secondaire des plantes. Chez ces derniers, l'oxygne comme substrat peut cder la place au peroxyde et au superoxyde, et la protine utilise parfois directement NAD(P)H comme source d'lectrons. Cette section nous a montr le caractre remarquable des cytochromes P450, qui abolissent la frontire entre aromatiques et composs saturs. Leur plasticit remarquable autorise leur intervention dans plusieurs ractions sur une palette plus ou moins tendue de substrats.
12.6 - DGRADATION ANAROBIE DES ALIPHATIQUES

La premire culture pure de bactries anarobies capables de dtruire les alcanes a t dcrite en 1991 : un sulfato-rducteur se dveloppait sur hexadcane et autres hydrocarbures longue chane, et les minralisait jusqu'au stade de CO2 aux dpens du sulfate comme accepteur d'lectrons. Des sulfato-rducteurs sont galement capables d'utiliser des alcanes chane plus courte [57]. On a cru pendant longtemps que la dgradation des alcanes passait par un stade alcne. Pourquoi ? La cration d'une double liaison devrait faciliter l'addition d'une molcule d'eau et greffer ainsi un atome d'oxygne sur la chane comme le ferait une oxygnase partir d'O2. L'attaque des hydrocarbures peut se contenter d'une arobiose trs faible, voire de l'absence complte d'oxygne. Au fond des rservoirs de carburant s'accumulent des boues et des gommes plus denses contenant de petites quantits d'eau. Une faible arobiose l'interphase favorise la formation d'un film. Il renferme des bactries et surtout des champignons (Cladosporium et Aspergillus). Les conditions compatibles avec une dgradation totalement anarobie sont maintenant connues pour les alcanes moins de 6 atomes de C en chane droite. Les organismes comptents sont des bactries rductrices de nitrate ou de sulfate [58] ainsi que des mthanognes [59]. La souche AK-O1 isole des sdiments d'un estuaire par SO et YOUNG peut se dvelopper en minralisant les alcanes par le sulfate. La voie principale de ce mtabolisme passerait par un stade alcne et produirait un acide gras. Ces auteurs ont cultiv les bactries en prsence de
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n-alcanes 14, 15, 16 et 17 atomes de carbone marqus au carbone-13 ou deutris. Les chanes carbones de dpart se retrouvaient en partie dans les acides gras totaux des bactries, soit avec le mme nombre d'atomes de carbones en chane droite, soit avec 2 ou 4 atomes de carbone supplmentaires. Les n-alcanes nombre pair d'atomes de carbone (ttradcane, hexadcane) taient transforms en acides gras saturs correspondants (C14 : 0, C16 : 0). Le meilleur substrat tait le ttradcane. Les n-alcanes nombre impair d'atomes de carbone (pentadcane, heptadcane) donnaient en majorit des acides gras nombre impair de C, dont certains taient mthyls latralement. titre d'exemple ont t figurs deux acides gras en C15 et C17 mthyls latralement et forms partir de pentadcane. De faon gnrale, les mthyles latraux des nouveaux acides gras provenaient de l'extrmit de la chane dans l'alcane de dpart.
D3C D D C (C) CD3 D 12 D D D3C H C (C) CD3 D 12 HOOC 2-Me-C (15:0) D D3C H C (C) CD3 D 12 (C2D2H2) 4-Me-C (17:0)
HOOC
Pentadcane perdeutri (15:0)
L'axe carbon de ces hydrocarbures est donc partiellement rutilis et remani pour faire de nouveaux acides gras. Le mcanisme prcis de l'allongement de la chane reste dterminer. Les acides gras observs sont inhabituels, ne sont pas forms quand les bactries utilisent des alcnes, des alcanols ou des acides gras. Dans le schma suivant, qui conserve une part d'hypothse, aucune augmentation des chanes carbones n'est faite par des ractions de carboxylation qui grefferait directement la fonction acide sur l'hydrocarbure.
H H3C H C (C) CH3 H n HOOC -oxydation longation H H3C H C (C) CH3 H n (CH2)2 longation -oxydation HOOC H H3C H C (C) CH3 H n (CH2)4 oxydation H HOOC (C) CH3 H n catabolisme CO2
HOOC
Certains auteurs pensent avoir trouv le mode d'longation des chanes [60]. L'isolement de germes sulfato-rducteurs partir de terrains contamins par du gazole leur a permis d'identifier l'acide dodcylsuccinique comme intermdiaire de la dgradation du dodcane. Lidentification des drivs alkylsucciniques a t utilise par certains auteurs pour dtecter la dgradation anarobie des produits ptroliers dans les nappes phratiques [61]. Les marquages isotopiques montrent que la chane d'hydrocarbure est transmise en bloc dans une raction de synthse qui met en jeu probablement le fumarate. Aucun passage par un stade alcne n'est observ. Nous avons dj rencontr ce type de raction d'addition dans le passage anarobie du tolune au benzoate, sous l'action de la benzylsuccinate synthase et d'un cycle faisant intervenir le fumarate. L'oxydation portait sur le mthyle du tolune. Il est tentant de supposer que
562
l'oxydation du dodcane se fait ici sur un principe tout fait comparable. En somme cette recette pourrait tre caractristique du carbone aliphatique en anarobiose.
CH3 HC CH CH2 COOH COOH
acide CH3 dodcylsuccinique
L'addition de la partie succinique est subterminale et gnre deux carbones asymtriques, soit en tout quatre produits diastroisomres. Comment le driv alkylsuccinique est-il mtabolis ? Sans doute par une voie qui conduit l'oxydation d'un acide gras. Cette conclusion est corrobore par un travail rcent [62]. La dgradation anarobie du n-hexane par un dnitrifiant conduit au (1-mthylpentyl)succinate li au coenzyme A (1) et reprsent sur la partie a du dessin. Ce produit serait ainsi rarrang en (2-mthylhexyl)-malonyl-CoA (2). La raction peut paratre bizarre, mais ressemble la conversion du succinyl-CoA (3) en mthylmalonyl-CoA (4) dans les fermentations propioniques, une raction classique rappele en b.
COSCoA CH CH2 COO 1
COSCoA CH COO
COSCoA CH2 CH2 COO
COSCoA H3CCH COO
succinyl-CoA 2 3 4
Le produit figur en (2) est apparemment dcarboxyl en 4-mthyl-octanoyl-CoA, tout comme le malonyl-CoA est dcarboxyl en propionyl-CoA. Il correspond un acide gras ramifi 9 atomes de carbone dont le mtabolisme est connu, formant de l'actyl-CoA et du propionyl-CoA. On retrouve l'observation souvent faite que la nature sait utiliser des stratgies habituelles pour les appliquer aux biodgradations de produits trangers.
OH dH O dH O H2O O dH OH cyclohexanone O O O H2O CO2 H2O COO 5-oxocaproate
Dgradation anarobie du cyclohexanol
563
L'attaque anarobie de divers terpnes est pratique par les organismes dnitrifiants. Il y a toujours ouverture du cycle et souvent une minralisation peut tre totale. La transformation du cyclohexanol par un Pseudomonas est l'exemple le plus simple et offre la squence suivante [63] : Plusieurs dshydrognases (dH), une hydratase et une hydrolase se succdent jusqu'au 5-oxocaproate, qui est minralis. Cette voie diffre du processus arobie. Les bactries responsables sont des anarobies facultatifs et peuvent jouer sur les deux tableaux. Cependant le cyclohexanol est galement rduit et aromatis 40% en phnol, qui s'accumule dans le milieu. C'est donc une voie en impasse. Les oxydations faites dans la nature avec nitrate comme accepteur sont trs varies et il est possible que les connaissances acquises sur la dgradation des aliphatiques dans ces conditions soient encore rudimentaires par rapport la ralit.
12.7 - DCONTAMINATION DE SOLVANTS CHLORS

Certaines oxygnases ont une slectivit trs faible et attaquent une gamme tendue de substrats. Les oxygnases du tolune, du naphtalne, du mthane et de l'ammoniac sont dans ce cas. D'autres enzymes peu exigeantes sont les cytochromes P450. La tolune di-oxygnase de Pseudomonas putida F1 fait partie dun complexe de trois protines, dont la di-oxygnase proprement dite ou ISPTOL. Elle ne catalyse pas que la dioxygnation de substrats aromatiques mais fonctionne aussi comme mono-oxygnase, dsaturase, O- ou N-dsalkylase, sulfoxydase. Elle peut oxyder et dshalogner simultanment des substrats varis, du trichlorothylne (TCE) divers aliphatiques insaturs (alcnes) halogns ou non, contenant 2 8 atomes de carbone [64].La raction est toujours obtenue en prsence d'O2, dune source dlectrons (NADH), et les produits forms sont identifis par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse. Le tolune reste le meilleur substrat. Si on accorde la valeur 100% la vitesse de dioxygnation du tolune en conditions optimales, la raction initiale avec le TCE est de 15%, contre 23% avec le 3,4-dichloro-1-butne (DCB), 19% avec le 2,3-dichloro-1-propne (DCP), et moins de 15% pour la plupart des autres substrats. La figure ci-aprs donne quelques exemples de transformations. Les caractres gnraux observs sont les suivants : Lenzyme marche mieux, dans la plupart des cas, si la double liaison est en configuration cis. Selon les cas, le substrat est mono- ou dioxygn sans dpart de lhalogne. La dioxygnation concerne principalement les substrats dpourvus dhalogne au niveau de la double liaison (sur un carbone dit sp2), alors que dans le cas contraire une mono-oxygnation porte plutt sur un carbone voisin, formant un alcool ou un nol (qui se tautomrise en ctone). Pour le 2,3-dichloro-1-propne (DCP de la figure), un rarrangement produit un mlange disomres cis et trans.
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Lexprience montre que loxydation tend ralentir et mme sinterrompre bien avant que le substrat soit transform en totalit. Ce phnomne sexplique par la formation dintermdiaires ractifs qui inactivent lenzyme, notamment par alkylation. Cest important, car ce phnomne intervient souvent au cours de la biodgradation de nombreux xnobiotiques et diminue lefficacit des procds biologiques. Le trichlorothylne, qui est la cible de plusieurs mono- ou di-oxygnases, pourrait sembler facile liminer mais engendre ce type d'inhibition. Dautres enzymes comme les cytochromes P450 et la mthane mono-oxygnase catalysent des ractions similaires. Loxydation du 2,3-dichloro-1-propne (DCP) donne deux isomres comme indiqu et correspond au rarrangement appel allylique par les chimistes. Il est dclench en principe par la formation dun carbocation ou dun radical, qui est obtenu ici par voie enzymatique.
Cl Cl HO Cl CH2Cl Cl HO H3C H3C CH3 CH3 HO H3C HO OH Cl OH Cl OH CH3 OH CH3 Cl DCP Cl Cl Cl CH3 Cl Cl Cl CH2OH Cl CH2OH Br Cl Cl CH2Cl CH3 Br Cl O Cl CH2OH
H3C
Action sur alcnes halogns

Le ttrachlorothylne (Cl2=CCl2, PCE pour perchloroyhylne) et le trichlorothylne (Cl2C=CHCl, TCE) sont d'excellents solvants pour le dgraissage des machines, l'entretien de llectronique et le nettoyage sec. Il en a t fait usage en dnormes quantits dverses inconsidrment dans lenvironnement. Ils ne sont malheureusement que lentement biodgradables et leur demi-vie peut dpasser 300 jours. Les sols pollus les conservent parfois longtemps, et ils viennent miner les rivires et les eaux de boisson. Leur limination est devenue une priorit aux tats-Unis et ailleurs. Malheureusement leur transformation biologique peut engendrer au passage du chlorure de vinyle rput cancrigne. Ce nest pas le seul inconvnient, puisque les produits de transformation ont les effets secondaires signals antrieurement. De faon gnrale, le PCE est rcalcitrant en prsence dair et sa biodgradation ne survient, semble-t-il, quen anarobiose. Par contre le TCE est attaquable aussi bien labri de lair quen prsence d'O2. Il est trait dans le premier cas par une dshalognase rductrice et dans le second par une oxygnase. Le chlore est toujours limin sous forme dions chlorure. Le tableau ci-aprs donne quelques exemples :
12 ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS Organisme

Burkholderia cepacia G4 Pseudomonas putida F1 Methylosinus OB3b Nitrosomonas europaea Dehalobacter restrictus Dehalospirillum multivorans Sporomusa ovata
Cl Cl TCE Cl Cl chlorure de vinyle Cl Cl O Cl
565 Enzyme Produit(s) form(s)
O2
+ Tolune 2-mono-oxygnase [65] poxyde, glyoxylate, formiate, CO + Tolune di-oxygnase [66] Glyoxylate, formiate + Mthane mono-oxygnase [67] Chloral, trichloroactate, + Ammoniac mono-oxygnase [68] Glyoxylate ? (non dtermin) Dshalognase rductrice [69] Chlorure de vinyle Dshalognase rductrice [70] 1,2-Dichlorothylne Dshalognase rductrice [71] Chlorure de vinyle
Cl Cl Cl OH OH Cl Cl Cl O O O O O glyoxylate O
TCE poxyde
hydrate de chloral
trichloroactate
formiate
La destruction de composs chlors comme le TCE et produits de la mme famille est une proprit fortuite des mono- et di-oxygnases slectivit lastique. La tolune di-oxygnase oxyde une foule de substrats. Il en est de mme pour les oxygnases du mthane et de lammoniac. Nous avons dj rencontr ces enzymes. Elles exacerbent la ractivit de loxygne, crent dans leur site actif une entit hyper-oxydante qui agit tous azimuts sur tout ce qui vient son contact. Cette stratgie est aussi celle des P450. Les composs halogns volent en clats sous leur action avec libration de chlorure, formation de radicaux et apparition de plusieurs produits. Une catgorie intressante est celle des propane mono-oxygnases prsentes dans diverses espces appartenant au genre Mycobacterium. Ces germes peuvent se dvelopper sur des alcanes linaires contenant 2 5 atomes de carbone. Ils attaquent le TCE dans leur sillage en liminant compltement le chlore, ce que ne fait pas la tolune di-oxygnase [72]. Ces bactries nattaquent pas le mthane. Inversement celles qui oxydent le mthane sont inoprantes sur ces alcanes. Lammoniac mono-oxygnase, dont on sait qu'elle catalyse la premire tape de la nitrification des sols, mrite une mention. En oxydant NH3 en hydroxylamine, elle peut sen prendre aussi de nombreuses cibles. Le TCE est lun delles. Il s'agit d'oxydations gratuites (les substrats ne pouvant servir par eux-mmes la croissance cellulaire). Un travail de VANNELI et coll. [73] a mis en vidence lattaque de divers substrats halogns monocarbons (dichloromthane, dibromomthane, chloroforme), ou contenant deux atomes de carbone (bromothane, 1,1,1-trichlorothane, chlorure de vinyle, cis- et trans-dichlorothylne). Des effets assez compliqus sont observs en fonction de la taille du substrat, du nombre datomes dhalogne et de leur position, et il nest malheureusement pas facile den tirer des rgles gnrales claires [74]. Et en anarobiose ? En gnral la dgradation biologique dun organochlor est dautant plus difficile que la molcule contient davantage datomes de chlore. Pourtant ce nest pas toujours le cas. Quelle ne fut pas la surprise disoler des bactries capables de se dvelopper sur des substrats divers en utilisant le
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ttrachlorothylne (PCE) comme accepteur dlectrons ! Dehalospirillum multivorans est un anarobie strict capable de se dvelopper en oxydant lhydrogne avec le PCE. Loxydation de H2 ne peut pas donner lieu une synthse dATP par couplage au niveau dun intermdiaire, comme dans une fermentation. Force est dadmettre que la bactrie tire son nergie dun potentiel membranaire. Une respiration sur ttrachlorothylne ! Il sy trouve une dshalognase rductrice, qui a t purifie Stuttgart dans le groupe de DIEKERT [75]. Lenzyme transforme le PCE en TCE, puis en cis-1,2-dichlorothylne, le sous-produit de ce mcanisme nergtique respiratoire. La bactrie est donc capable de tirer toute son nergie de loxydation de lhydrogne par le PCE.
Cl Cl PCE Cl Cl Cl 2e + H+ Cl TCE Cl Cl Cl 2e + H+ Cl Cl
Comme il arrive souvent dans ce genre de question, le fonctionnement de lenzyme in vitro ncessite lusage dun donneur dlectrons artificiel tel que le mthyl-viologne. Le vritable donneur biologique est probablement une ferrdoxine. Chose curieuse, lenzyme se montre trs clectique et ne touche pratiquement que le PCE et le TCE, tout en tant trs efficace. Les deux substrats sont peu solubles dans leau (TCE : 1,1 g/L), mais le Km de lenzyme est bas, soit seulement 10 M pour le PCE et 4 M pour le TCE. Chaque molcule denzyme dshalogne plus dune centaine de molcules de substrat par seconde dans les conditions optimales. On peut stonner quun tel systme existe dans la nature pour dtruire des xnobiotiques absents de la plante, il y a plus de 50 ans. Une possibilit : lenzyme tait "prvue" pour des cibles naturelles, mes lesquelles ? On lignore. La PCE dshalognase fonctionne laide dun corrinode assist par deux centres [4Fe-4S] (ou peut-tre un [4Fe-4S] et un [3Fe-4S]). Un corrinode ? Nous avons rencontr ce type de constituant apparent la vitamine B12 chez les actognes et mthanognes. Le cobalt des corrinodes peut osciller entre trois degrs doxydation, soit Co(I), Co(II) et Co(III), avec un environnement diffrent du mtal dans chaque cas. Dans un corrinode ltat Co(III), le cobalt est hexacoordonn et une liaison peut-tre contracte directement entre le mtal et un atome de carbone. Le fonctionnement consiste commander ltablissement ou la rupture de cette liaison CoC en fonction de ltat doxydation. Cette question mrite un dtour. Le schma est celui de NEUMANN et coll. [75-76]. Les lectrons ncessaires la rduction sont apports par une hydrognase (Hase) de la face externe de la membrane. Ils sont canaliss par les deux centres fer-soufre de lenzyme, dsigns sur la figure suivante par Fe/S1 et Fe/S2. Le passage est sans doute facilit par lancrage de l'enzyme sur la face interne de la membrane. Les deux protons dgags sur la face externe par loxydation dune molcule de H2 contribuent tablir le potentiel membranaire. Le shma symbolise le comportement du corrinode qui rappelle celui que nous avons entrevu page 210.
H2 2 H+ Hase 2 e e Fe/S1 e Co
II
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extrieur membrane cytoplasme
e Fe/S2 C=C e Co
II
C=C
Co
Co
III
dshalognase substrat C C Cl
Cl
Fonctionnement de la PCE dshalognase

Il y a trois conversions du cobalt de Co(II) Co(I), de Co(II) Co(III) li un lment carbon, enfin de celui-ci Co(II). L'tablissement d'une liaison CoC accompagne l'oxydation de Co(I) en Co(III), avec perte d'un ion chlorure. La rduction de Co(III) en Co(II) chasse le produit de la raction. Les potentiels doxydorduction des couples Co(II)/Co(I) et Co(III)/Co(II) sont trs diffrents. Le premier est estim 350 mV et au-dessous, le second plus de 150 mV. Il en rsulte que la rduction de Co(II) par H2 gauche sur le schma est peu favorable thermodynamiquement, alors que celle de Co(III) est nergtique, et sert orienter le mcanisme vers la dshalognation. Ce modle conserve une part dhypothse tout en tant conforme ce qui est observ dans dautres systmes lorsque des noyaux fer-soufre et des corrinodes sont mis en jeu. Sur la figure ont t symboliss les tats base-off (pas de 5e coordinence) et base-on (5e coordinence en place) comme expliqu antrieurement dans l'tude des actognes ainsi quen glossaire. Quand un systme non-conformiste est trouv, on compte sur lanalyse des squences pour trouver des parents volutives avec dautres germes et dtecter de nouvelles souches dans lenvironnement. Dans le cas qui nous occupe, les ressemblances restent problmatiques [77]. Cette dshalognase remarquable est-elle un cas unique dans lenvironnement ? Apparemment non. Une autre bactrie capable de dchlorer le PTE et le TCE a t tudie en Suisse [78]. Il sagit dun Gram-positif strictement anarobie, Dehalobacter restrictus, voisin des Clostridium. Sa membrane est entoure dune couche S*. Son fonctionnement est fond sur une respiration construite en grande partie comme il vient d'tre expliqu. Il fait intervenir un corrinode. Les lectrons seraient canaliss vers lenzyme par une mnaquinone, qui remplace couramment l'ubiquinone en anarobiose. Un troisime
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germe assez particulier a t isol aux Etats-Unis [79], une eubactrie possdant aussi une couche S mais difficile classer. Cette nouvelle espce, contrairement aux prcdentes, peut dchlorer compltement le PCE en thylne et produire au passage du chlorure de vinyle. En conclusion de cette section, la biodgradation des solvants chlors est possible dans des conditions assez varies. L'attaque arobie procde essentiellement de l'action des oxygnases peu spcifiques, et la dgradation anarobie utilise le cas chant un mtabolisme respiratoire particulier o le solvant sert d'accepteur, et o des corrinodes sont des facteurs essentiels.
12.8 - LA DSHALOGNATION ET SES DIVERS MODES

Lindustrie a cr de trs nombreux xnobiotiques halogns dont llimination peut poser problme. Quels sont les principes gnraux qui prsident lenlvement de lhalogne ? La question apparat bien documente dans le cas des aromatiques. Les chapitres prcdents ont montr quun atome dhalogne pouvait tre t sous forme danion halognure au cours des tout premiers stades du mtabolisme ou un stade ultrieur. La biochimie de la dshalognation offre des situations varies, mais souvent lucides de manire incomplte. Cette section s'efforce de rcapituler les principaux procds en donnant des exemples o nous retrouverons quelques aromatiques. La dshalogntion hydrolytique des alcanes sera rserve une section ultrieure. Cette section revient sur les diffrents procds, dont certains ont dj t abords propos des aromatiques. Limitons la question quelques exemples. L'halogne est toujours limin sous forme d'ion halognure. Son dpart est provoqu par une oxydorduction, une hydrolyse, une limination, une hydratation ou une substitution. Le tableau est une rcapitulation des diffrents procds touchant les aromatiques et les aliphatiques.
Type de raction
Rductrice
Exemple
Oxydorduction 2 lectrons. L'atome d'halogne est libr en halognure et un atome d'hydrogne le remplace. Surtout arobie.
OOC
Cl
H+ + 2 e H+ + 2 e
OOC
+ Cl Cl Cl C C H Cl + Cl
Cl Cl
Cl Cl
Par oxygnation
Rencontre chez les aromatiques et uniquement arobie.

COO Cl O2 NADH, H+ OH OH + CO2 + NAD+ + H2O
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Type de raction
Hydrolytique
Exemple
Une halo-acide dshalognase chasse l'halogne d'un halo-alcane.
RCH2Cl + H2O RCH2OH + HCl
Dshydrohalognation Par dsaturation comme dans le cas du lindane (-hexacyclohexane).

Cl Cl Cl Cl Cl Cl
HCl Cl Cl Cl Cl Cl
Hydratation
Le 3-chloroacrylate est dchlor en malonate semialdhyde.

H2O
OOC-CH=CHCl
HCl
OOC-CH -CHO 2
Substitution intramolculaire
Le 3-chloroacrylate est dchlor en malonate semialdhyde.

CH2OHCHOHCH2Cl2 O CH2OHCHCH2 + HCl
Dshalognation par glutathion (GSH)
Reprsente par la conversion bactrienne du dichloromthane en formaldhyde et HCl.

CH2Cl2 + GSH [GS-CH2Cl] + H2O GS-CH2OH [GS-CH2Cl] + HCl GS-CH2OH + HCl HCHO + GSH
La dshalognation rductrice, qui remplace lhalogne par H, semble trs simple dans son principe, mais son mcanisme exact est mal connu. On pourrait le concevoir ainsi, comme un dpart du chlorure avec formation d'un carbocation, l'apport d'un proton, et une rduction deux lectrons :
Cl C H Cl C H
+
2 e + H+
H C H
Cette rduction est anarobie et porte aussi bien sur des haloaromatiques que sur des aliphatiques halogns. Le potentiel redox attach aux aromatiques (Ar-Cl/Ar-H) pH 7 est du mme ordre de grandeur que celui du couple NO3/NO2. Pour les aliphatiques, le potentiel correspondant (Al-Cl/Al-H) est entre 0,3 et 0,52 V, cest-dire peu prs dans la mme gamme. Un anarobie facultatif, comme le colibacille, est capable de transformer le ttrachloromthane en trichloromthane (le chloroforme) lorsquil se dveloppe en anarobiose avec le fumarate comme accepteur [80]. Il y a de trs nombreux exemples de telles dshalognations anarobies o la production de l'nergie ncessaire provient de mthanognse, de la rduction du sulfate ou de la dnitrification [81].
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Un cas remarquable est celui de Desulfomonile tiedjei, un anarobie qui peut coupler la rduction du sulfite la dshalognation dune srie de substrats chlors, broms ou iods. La source dlectrons est H2 ou le formiate. Laccepteur est le substrat halogn ou le sulfite. Il y a une comptition pour lhydrogne entre les deux voies qui sont lune et lautre des mcanismes respiratoires gnrateurs dnergie. Une respiration ? En effet, ces oxydorductions sont couples un potentiel membranaire, qui actionne son tour une synthse dATP [82]. Un schma tente de lexpliquer, montrant la dshalognation des m-halobenzoates, du ttrachlorothylne et du penta-chlorophnol. Lattaque rductrice de ce dernier nest pas le seul mode de dchloration, qui peut seffectuer aussi sur le mode hydrolytique.
extrieur membrane cytoplasme COO CI dshalognase COO X CI CI cyt. 2 e 2 H+ hydrognase H2 ADP + Pi n H+ ATPase n H+ ATP X X = Cl, Br, I Cl
OH Cl CI CI CI 2 Cl
Cl Cl Cl OH
Cl
Cl
Cl
CI
Cl
Desulfomonile tiedjei
Le brome et liode sont retirs de n'importe quelle position sur les halobenzoates et halobenzamides, alors que le chlore ne lest quen position mta. Ces bactries ont donc la particularit deffectuer leur respiration sur des accepteurs indits. D. tiedjei est lun des rares germes connus jusqu prsent qui peuvent tenir ce mtabolisme sans participation trangre. On retrouve ce type de respiration dans dautres cas o les bactries sont gnralement en association avec dautres germes dont les mthanognes. Ces associations avec bnfices mutuels sont essentielles dans la nature. Tous les aspects de ces dshalognations nont pas t rpertoris, mais on peut penser que ces ractions sont communes. Des Pseudomonas, Arthrobacter et autres germes du sol sont parmi les protagonistes. Lanarobiose privilgie apparemment la dshalognation rductrice de substrats halogns trs varis.
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12.9 - DSHALOGNATION HYDROLYTIQUE DES HALOALCANES

L'introduction d'un atome d'oxygne partir de l'eau peut conduire l'enlvement d'un halogne sans aucune intervention d'O2. Il existe un certain nombre de systmes bien rpertoris pour effectuer ce genre de raction. Les dshalognases hydrolytiques concernes sont appeles halidohydrolases. Une espce mthylotrophe facultative et fixatrice dazote, Xanthobacter autotrophicum, possde ce type d'enzyme, dont le substrat prfr est le 1,2-dibromothane, un additif de lessence sans plomb, un pesticide agricole et un intermdiaire dans des synthses industrielles. Les espces comptentes tirent paralllement leur nergie d'oxydations faites en prsence d'O2. Un tableau rassemble quelques exemples.
Bactries
kDa Substrats dshalogns*
nombre de C
1-4, 1-12 3, 2-3 1 2-5, 3-5 2-9, 2-6 3 2 2-9, 2-9 3-4 3-16, 2-10 2-4, 3 1-7, 2-10 2-10, 3-6 4-6 4, 9-10 4, 8 6
Xanthobacter autotrophicus GJ10 35 1-bromo- et 1-chloroalcanes DhlA 1-iodopropane, ,-dihaloalcanes Xanthobacter autotrophicus GJ70 28 Halomthanes 1-chloroalcanes, 2-bromoalcanes ,-dichloroalcanes, alcools halogns 1,2-dibromopropane Corynebacterium m15-3 36 Bromothane, 1,2-dibromothane 1-chloroalcanes, ,-dihaloalcanes -chloro--alcanols 34 1-chloroalcanes, ,-dihaloalcanes -chloro--alcanols, trihalopropanes 36 1-iodoalcanes, 1-bromoalcanes 1-chloroalcanes, ,-dihaloalcanes -chloro--alcanols
Rhodococcus erythropolis Y2, Rhodococcus m15-3, DhaA Rhodococcus HA1
Pseudomonas paucimobilis UT26 33 1-chlorobutane, 1-chloroalcane 2-chlorobutane, 2-chlorooctane LinB 3-chlorohexane
* Ont t omis pour simplifier des substrats secondaires, des alcools, poxydes et thers halogns.
Lenzyme DhlA a t squence aprs clonage et possde une chane de 310 acides amins code par un plasmide. On en connat la structure dtaille [83]. Le site catalytique est enfoui dans la molcule et possde un environnement particuirement hydrophobe reprsent sur un dessin. On y rencontre la leucine, la phnylalanine, le tryptophane et la valine, le substrat tant le 1,2-dichlorothane. Il a t montr par mutagense dirige que le site renferme trois rsidus essentiels, Asp-124, Asp-260 et His-289 (shma de la page suivante), les principaux acteurs d'une catalyse acide-base, dont nous retrouverons le principe plus loin. On constate ainsi une vague homologie avec dautres hydrolases comme les protases srine, qui ont galement une triade de trois acides amins essentiels (srine, histidine, aspartate).
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Phe-164 Phe-172
Leu-262 Leu-263 Cl Asp-260
Trp-175 Cl
Val-226 Pro-223 Phe-222
Phe-128 His-289 Asp-124
Trp-125
Environnement du 1,2-dichlorothane dans la dshalognase de Xanthobacter

La liaison carbone-chlore se positionne entre deux rsidus de tryptophane (Trp-125 et Trp-175). Laspartate-124 exerce une attaque nuclophile sur le substrat, carte le chlore sous forme de chlorure et forme une liaison covalente transitoire. Une hydrolyse de cette liaison est catalyse par lhistidine-289 agissant comme base. Le principe est symbolis ainsi, E tant lenzyme (la charge est celle Asp-124) et RX le substrat. Dans un premier temps : E + RX E.RX E-R, X (une substitution : la liaison ER remplace la liaison RX). l'tape suivante intervient une molcule deau pour rompre la liaison : ER, X + OH + H+ EH, ROH, X, puis finalement : E + ROH + H+ + X. Ltude cintique suggre que lalcool quitte lenzyme avant lion halognure. Le dpart de ce dernier est ltape limitante du processus, qu'on explique par un petit changement de conformation de la protine avant de s'en dbarrasser. Paradoxalement ce nest donc pas lattaque de la liaison carbone-halogne qui pose le plus gros problme pour la dgradation de ces xnobiotiques, mais lvacuation du chlorure ou du bromure, et d'ailleurs un excs de ces ions dans le milieu inhibe la raction. Les tudes de SCHANSTRA et coll. suggrent que la spcificit limite de lenzyme (voir le tableau prcdent) est rgle par linsertion de la chane carbone dans le site actif et le positionnement correct de la liaison CX entre les deux tryptophanes et lexpulsion de lhalognure. Des modifications de l'enzyme par mutagnse pourraient la rendre moins slective en lui faisant dtruire une gamme plus tendue dhaloalcanes. Lorsque le substrat contient deux atomes dhalogne comme dans le 1,2-dichlorothane, un seul est enlev dans un premier temps et il se forme un chloroalcool sur lequel lenzyme est sans action. L'enlvement du deuxime halogne rend ncessaire l'intervention d'une autre dshalognase. L'alcool dshydrognase a la particularit d'admettre le PQQ* comme cofacteur. Nous lavons rencontr dans l'oxydation du mthanol. Les donnes rassembles avec dautres systmes biologiques permettent de prsumer son intervention. La dshalognase DhlB de X. autotrophicum limine le deuxime atome de chlore. Cest une 2-haloacide dshalognase que nous retrouverons pages 577 et 578.
12 ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS Le mtabolisme du 1,2-dichlorothane serait le suivant [84] :

CH2Cl-CH2Cl haloalcane dshalognase (DhaA) CH2Cl-CH2OH H2O HCl PQQ alcool dshydrognase CH2Cl-CHO PQQH2 NAD+ aldhyde dshydrognase CH2Cl-COOH NADH H+ H2O
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2-haloacide dshalognase (DhaB) CH2O-COOH HCl mtabolisme intermdiaire
Des halidohydrolases analogues DhlA sont assez rpandues dans les espces du sol et donnent parfois lieu des situations intressantes. Par exemple un Mycobacterium mtabolise compltement le 1,2-dibromothane [85], ce qui est rarement observ parce que les produits intermdiaires forms sont toxiques faible taux. Le gne de la dshalognase DhaA a t clon et squenc. Il a donn lieu une observation tonnante. Il est presque identique au gne dune dshalognase trouve chez une autre espce, Rhodococcus rhodocrous, mais il est un peu plus long et comporte une partie correspondant une haloalcool dshalognase de Corynebacterium. On a donc limpression que la pression slective exerce sur une association bactrienne par le dibromothane a fait apparatre la recombinaison et la propagation de squences nucliques entre espces diffrentes. La minralisation du 1,2-dibromothane passe par un poxyde dont on ne connat pas la voie de transformation.
Br Br Br OH O CH2CH2 HBr minralisation
CH2CH2 H2O HBr
CH2CH2
Passage par un poxyde

Malgr toutes ces possibilits encourageantes, de nombreux pesticides halogns offrent chaque fois des risques lenvironnement. dfaut dune interdiction demploi, les effets sont combattus par la slection de souches appropries. Le 1,2,3-tribromopropane et le 1,2-dibromo-3-chloropropane sont des nmatocides usage agricole et figurent parmi les produits risque. ventuellement cancrignes et relativement rcalcitrants, ils inhibent la croissance des micro-organismes du sol et sont entrans facilement dans les nappes aquifres. Les chercheurs du groupe nerlandais de Janssen ont pu modifier gntiquement Agrobacterium radiobacter, rendant cette bactrie capable de se dvelopper efficacement sur les propanes trihalogns [86]. Pour y parvenir ils ont utilis le gne de la dshalognase DhaA dun Rhodococcus mt15-3. Cette enzyme est trs voisine de celle de Xanthobacter dcrite ici, mais se montre plus performante. Le gne a t recombin diffrents promoteurs sur un plasmide et introduit avec celui-ci dans A. radiobacter.
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La nouvelle souche fabrique la dshalognase taux lev et se multiplie sur 1,2-dibromo-3-chloropropane comme seule source de carbone, ce qui est remarquable. La vitesse de conversion du substrat initial lui permettait en mme temps de mieux rsister aux effets toxiques. Les trois atomes dhalogne seraient limins ainsi lun aprs lautre :
Trihalopropane X = Cl ou Br X X X H2O X H2O OH OH H 2O HX HX O OH H2O X X OH H2O HX OH OH OH CH2CHCH2 X O
CH2CHCH2
CH2CHCH2
CH2CHCH2
CH2CHCH2
CH2CHCH2
Trihalopropane
Les chercheurs ont galement examin la dpollution du 1,3-dichloropropne (ou 1,3-dichloropropylne [87]). Ce produit est galement un nmatocide. Il aurait t utilis en Hollande sur les champs de pommes de terre, des taux pouvant atteindre 170 kg par hectare, qui reprsentent plusieurs milliers de tonnes rpandus dans les champs sur une anne ! La moiti svapore dans latmosphre des PaysBas et y cre une pollution non ngligeable. Il a t possible de slectionner un Pseudomonas cichorii 170, capable de crotre sur diffrents composs halogns comme seule source de carbone, soit le 1,3-dichloropropne, des 1-haloalcanes et diffrents drivs oxygns. La dshalognation hydrolytique initiale procde du schma habituel :
H C=C Cl H 1,3-dichloropropne H2O HCl Cl CH2CI H C=C H CH2OH
1,3-dichloropropne
Les rsultats obtenus jusquici suggrent que la premire tape de biodgradation est souvent lvnement crucial et le goulot d'tranglement la suite duquel le reste du mtabolisme peut se drouler plus rapidement. Ces exemples montrent que la construction gntique de nouvelles souches permet une avance utile dans la bioremdiation des milieux contamins par des substances thoriquement rcalcitrantes. Tout compte fait, la dpollution des milieux contamins par les nombreux ingrdients chlors, broms ou iods invents par lhomme semble notre porte. Un problme pratique demeure cependant. Les microbes dont on sollicite les comptences doivent se dvelopper le plus rapidement possible. On utilise alors leur pouvoir de dgrader les alcanes. Lastuce consiste injecter dans un sol contamin par des organochlors un mlange contenant de l'air et du gaz propane dans des proportions assez faibles pour carter le risque dexplosion. Les bactries se dveloppent en oxydant le propane comme source de carbone et dnergie. Elles en profitent pour attaquer le reste. Cest ce quon appelle un comtabolisme utile !
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12.10 - LE CAS DES 2-HALOACIDES

Llimination de lhalogne partir dun 2-haloacide est de type hydrolytique et obit au principe gnral : RCHXCOOH + OH RCHOHCOOH + X. Substrats et produits ont une chiralit sur le carbone 2 que la transformation conserve ou inverse selon le mcanisme mis en jeu. Les dshalognases ou halidohydrolases peuvent tre classes en 4 catgories principales [88]. Caractristique
1 Sur L-2-haloacide, inverse la chiralit 2 Sur D- et L-2-haloacides, inversion de chiralit 3 Sur D- et L-2-haloacides, rtention de chiralit 4 Sur D-2-chloropropionate, inverse la chiralit
SH* Source (exemple)

Pseudomonas sp. YL (HI, HII) [89] Pseudomonas putida PP3 (DehII) [90] + Pseudomonas putida PP3 (DehI) [91] Rhizobium sp. [92], P. putida AJ1
* Sensibilit aux ractifs des thiols (+) quand la raction est bloque () dans le cas contraire
Le tableau montre une pluralit de modes daction. Les deux lignes intermdiaires (2 et 3) citent une attaque peu slective sur les nantiomres D et L, mais une espce inverse la chiralit des molcules transformes, alors que lautre la conserve. Cette multiplicit peut savrer intressante pour les biotechnologies utilisant ces dshalognases en vue de raliser des ractions strospcifiques, non seulement pour la dgradation de substances toxiques, mais pour la confection dintermdiaires de synthse dans lindustrie des herbicides et pesticides et appels synthons. Les enzymes de la premire catgorie sont de loin les plus tudies, en particulier la dshalognase des L-2-haloacides de Pseudomonas YL. La raction engendre un D-2-hydroxyacide. Cette enzyme est abondante, relativement thermostable. Elle a la structure d'un homodimre (2 26 kDa), ragit dans un solvant organique sur les substrats courte chane (2 5 carbones), mais attaque les substrats chane longue (16 carbones et plus) en solution aqueuse. Au moins une dizaine de dshalognases similaires ont t isoles ou mises en vidence chez diverses souches de Pseudomonas, Rhizobium et Xanthobacter autotrophicus [93] et forment une famille de protines homologues. Pseudomonas CBS3 possde deux dshalognases isofonctionnelles (des isoenzymes), DehCI et DehCII, homologues 45% [94]. On ne sait pas si cette double prsence dans les mmes bactries rsulte d'une acquisition fortuite aprs un transfert gntique et si elle rpond un avantage physiologique. Xanthobacter autotrophicus GJ10 a t tudi en dtail, car ce germe produit constitutivement deux halohydrolases : lune est DhlA, dj rencontre, active sur le 1,2-dichlorothane et quelques haloalcanes, lautre ou DhlB qui est active sur les haloalcanoates. Ces deux systmes appartiennent des familles distinctes sans homologie entre elles, et n'utilisant pas exactement le mme principe de fonctionnement. Cette observation laisse supposer que ces diffrentes familles d'enzymes ont fait leur apparition dans lvolution par des voies compltement indpendantes.
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Revenons la dshalognase de Pseudomonas YL (catgorie 1 du tableau) et aux enzymes apparentes. Une raction catalyse est la transformation du L2chloropropionate en D-lactate 9 :
CH3CHClCOO + H2O CH3CHOHCOO + HCl
La protine est bien connue par sa structure et sa squence. Un site carboxylique (aspartate) exerce une substitution nuclophile (SN2), tablit une liaison covalente transitoire qui s'hydrolyse ensuite avec inversion de configuration.
H3C
18O
H C Cl ENZ C O O
H C
O ENZ C O
CH3 + Cl
OOC H
COO
H ENZ
H O C O
CH3 ENZ
18
H + HO C
COO
CH3
+ H
COO D-lactate
Conversion du L-2-chloropropionate en D-lactate

Le chlore est limin en chlorure et se fait remplacer par un atome doxygne. Le problme est de savoir quelle est lorigine de cet oxygne dans le lactate. De leau ? La figure suggre quil nen est rien, et que cet oxygne vient de lenzyme. Ceci a t dmontr l'aide d'eau marque loxygne-18 et de la spectromtrie de masse [95]. Dans un premier temps, lenzyme et son substrat sont mlangs dans la mme proportion. Le cycle catalytique ne peut alors tourner quune seule fois, tout le substrat ayant t consomm instantanment. Si leau intervenait dans une simple hydrolyse de la liaison ester form sur lenzyme, le lactate devrait emporter loxygne-18 pendant que lenzyme garderait son oxygne-16. Ce n'est pas le cas. La spectromtrie de masse montre que le lactate est pratiquement dpourvu d'oxygne-18, et que lisotope se retrouve sur lenzyme. Cest ce que nous voyons sur le schma : lattaque de leau sest porte sur le carbone du C=O, et l'atome d'oxygne rcupr dans le lactate provient de l'enzyme. Si maintenant on rajoute un peu plus de substrat de faon laisser le cycle catalytique tourner plusieurs fois, le D-lactate form se charge en oxygne marqu. En effet, l'enzyme alimente en isotope partir de l'eau le transmet au produit de la raction au cours des cycles suivants. La contre-preuve est la suivante. On laisse fonctionner lenzyme dans leau marque de telle faon quelle rcolte le maximum disotope. Le substrat et le produit sont ensuite limins par ultrafiltration et lavage de lenzyme avec un tampon contenant de leau ordinaire. 9 - Une mesure simple est l'estimation du D-lactate form par une D-lactate dshydrognase et l'enregistrement de l'absorbance 340 nm du NADH. Une autre mthode est polarimtrique par une lectrode de mesure des ions chlorure. citer aussi la dtermination spectrophotomtrique du chlorure par le thiocyanate mercurique et le sulfate d'ammonium/fer(III) dans lacide sulfurique.
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Au bout d'un seul cycle ractionnel comme prcdemment, le lactate emporte loxygne-18, alors quau bout de plusieurs cycles, le lactate form est dpourvu de cet isotope. Les recherches ont permis didentifier lacide amin responsable de lopration dans la squence. Il est proche de l'extrmit N-terminale de chaque chane (Asp-10), conserv dans toutes les squences homologues. Son remplacement par mutation supprime lactivit de lenzyme. Plus rcemment, une exprimentation adroite par L IU et coll. [96] a confirm le caractre essentiel de Asp-10. Lhydroxylamine (NH2OH) inactive lenzyme de faon paracatalytique (en bloquant un intermdiaire ractionnel du cycle). Elle tablit une liaison covalente avec la protine quand celle-ci fonctionne avec le chloroactate ou le L-2-chloropropionate comme substrat. Il a fallu identifier quelle position se fait le blocage. La protine a donc t dcoupe en peptides et la masse prcise de chacun deux a t vrifie pour dtecter une augmentation ventuelle. Le peptide alourdi est prcisment celui qui contient Asp-10, et la diffrence de masse correspond la fixation de lhydroxylamine (sur le carbonyle en hydroxamate) et la prsence du substrat.
HON N peptide alourdi de 87 kDa sur laspartate-10 HON O O blocage paracatalytique C
Le dessin suivant reprsente la structure du monomre dans la 2-haloacide dshalognase de Pseudomonas YL. Limage a t construite daprs les donnes dposes par HISANO et coll. [97]. Le polypeptide est arrang en deux domaines probablement articuls dans une zone qui occupe le fond de la crevasse forme par le site actif (ouverte vers le bas de la figure). Cette disposition en deux domaines articuls autour dun site catalytique nest pas rare dans la structure des enzymes, la faon des lames tranchantes d'une paire de ciseaux. Le rsidu essentiel, Asp-10, est tapi dans cette zone. Le domaine figur gauche contient 4 hlices alpha, celui de droite a un feuillet bta bord dhlices. La chane principale est en trait paissi, les chanes latrales des acides amins en traits plus fins. lentre du site se tiennent les deux "gardiens", les tryptophanes 49 et 179. Certaines positions entourant le sillon du site actif sont conserves dans les protines homologues de la mme famille, et leur importance a t vrifie en les remplaant un un par mutation. Un dtail curieux est visible droite du dessin : les acides amins N et C terminaux sont rapprochs. Cette particularit nest pas rare dans les structures protiques et sa signification n'a pas d'explication certaine. Plusieurs modlisations ont t publies, notamment celle de LI et coll. avec 2-chlorobutyrate en place dans le site [98].
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N C
W49 W179 ASP10
2-haloacide dshydrognase
La famille forme par ces enzymes diffre des trois autres catgories de dshalognases du tableau.. Il n'est pas rare quune mme souche synthtise plusieurs enzymes distinctes. Cest prcisment le cas de Pseudomonas YL examin par LIU et coll [99]. Sur 2-chloropropionate comme seule source de carbone, la dshalognase induite est n'active que sur les drivs L (catgorie 1 du tableau). Elle est relativement thermostable et a deux sous-units gales de 26 kDa dont nous avons aperu la structure. En croissance sur 2-chloroacrylate, les bactries fabriquent une dshalognase active sur drivs L et D (catgorie 2 du tableau). Les deux enzymes fonctionnent de faon optimale pH alcalin (pH 9-10) et provoquent une inversion de configuration. La seconde est monomrique (36 kDa). Voici page suivante un diagramme permettant de comparer lactivit des deux protines sur plusieurs chloroacides. Elles sont dsignes respectivement par L-DEX et DL-DEX. La longueur de chaque barre compare pour chaque enzyme lactivit sur un substrat donn la valeur obtenue sur le L-2-chloropropionate ramene 100%. La L-DEX a la possibilit de fonctionner dans le n-heptane qui offre un milieu commode pour tester lenzyme sur des halodrivs longue chane, peu solubles dans leau.
substrat L-2-chloropropionate fluoroactate bromoactate Iodoactate chloroactate 2-chloroacrylate D-2-chloropropionate DL-3-chloropropionate 2,2-dichloropropionate DL-2chloro-n-butyrate DL-2-chloro-n-valrate DL-2-chloro-n-caproate
0 50 100%
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L-DEX DL-DEX
0 50 100%
Les substrats sont dissous dans lheptane et lenzyme est ajoute ltat lyophilis 10. La vitesse de conversion du L-2-chloropropionate dans lheptane est seulement 3% de celle qui est observe dans leau. Mais on peut voir que lenzyme dshalogne des substrats chlors et broms ayant 8 16 atomes de carbone. On remarquera labsence dactivit des deux enzymes sur le fluoroactate. Le problme du fluor mrite un petit dtour. La plupart des plantes communes ont de faibles quantits de fluor, de lordre de quelques g par g de poids sec. Une partie de ce fluor existe est celui du fluoroactate, dont la teneur est de 10 200 ng (trs variable en fonction des parties de la plante, du lieu et de lespce). Il y en a ainsi des traces dans le th, un taux beaucoup trop insignifiant pour constituer un danger quelconque, car le fluoroactate est un poison violent pour les animaux. Sa conversion en fluorocitrate bloque le cycle de KREBS au niveau de laconitase, les organes les plus sensibles tant le cur et le cerveau. Le fluoroactate a t utilis comme raticide (dsign comme poison 1080), et pour lutter contre la prolifration de certains prdateurs (il aurait t utilis contre les coyotes dans lOuest amricain). Certaines plantes contiennent des quantits exceptionnellement leves de fluoroactate, et sont toxiques pour les herbivores qui les consomment. La plus connue est Dichapetalum cymosum, une plante dAfrique du Sud o la teneur dpasse 230 g par g de poids sec. La plus haute concentration est chez Gastrolobium bilobium : 1 mg/g ! L'existence du fluoroactate comme produit du rgne vgtal explique sans doute la prsence dans les micro-organismes des outils pour le dgrader. La dshalognation du fluoroactate a t dcrite en dtail chez un Moraxella, souche B. On y trouve deux haloacide dshalognases dsignes par H-1 et H-2. Laction prdominante de la premire est sur le fluoroactate, alors que la seconde 10 - Une enzyme lyophilise conserve toujours des molcules d'eau de constitution faisant partie de la structure protique et des molcules trs fermement lies. Certaines enzymes peuvent fonctionner dans un milieu organique renfermant une faible teneur en eau, de prfrence dans un solvant peu miscible l'eau comme l'heptane. Dans le cas contraire (alcool, actone), le solvant organique a un fort effet dnaturant car il tend "dshabiller" la protine des molcules d'eau ncessaires son intgrit. L'exprience tire de LIU et coll. (1994) est intressante tout en restant peu prcise car il nest pas fait tat de la teneur en eau rsiduelle.
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est sans effet sur celui-ci. Les deux protines sont codes sur un mme plasmide, le pUO1, mais sont distinctes et ne prsentent aucune homologie entre elles. Cependant H-1 ressemble des hydrolases de Pseudomonas putida, qui renferme un plasmide pUO2 trs similaire au prcdent, et lalcane dshalognase de Xanthobacter [100]. On a limpression qu'une fois de plus linformation gntique a t transmise horizontalement entre espces par le jeu de plasmides et de transposons. Le fonctionnement de la fluoroactate dshalognase H-1 de Moraxella est considr comme fond sur le mme principe que dans lenzyme de Xanthobacter, utilisant la catalyse acide-base par un site nuclophile (Asp) et un rsidu basique (His) [101]. Le modle est reprsent par le schma :
+ enz. C O N H H O C COO F H F H+ C O NH
NH N N H
+ enz. H C O
NH
enz. O
H C COO
HO
18 O
C COO
H H
18
O H H
Dfluoration du fluoroactate
Le nuclophile a t identifi par lusage de leau marque avec loxygne-18 et par la spectromtrie de masse, comme expliqu prcdemment. Le nuclophile qui est un aspartate est le premier se marquer. Le caractre essentiel de laspartate et de lhistidine dans ce mcanisme a t vrifi par mutagense. Maintenant que nous avons une ide sur le mode de dgradation du fluoroactate, voici pour finir une application pratique possible. Nous nous souvenons du caractre toxique du fluoroactate prsent dans certaines plantes. Linconvnient existe pour le btail et peut diminuer la productivit du cheptel ! Il sagit donc dintroduire dans une bactrie du rumen linformation gntique ncessaire pour dgrader le poison. Ceci a t ralis par clonage du gne de H-1 (Moraxella) accompagn du promoteur ad hoc dans un plasmide de Butyrivibrio fibrisolvens, une espce qui contribue comme son nom lindique liqufier les fibres vgtales par fermentation. Une expression de lenzyme taux lev a t russie [102], et le plasmide avait llgance de ne pas sliminer spontanment des cellules htes. Lobjectif sest donc avr parfaitement ralisable. Des applications se dveloppent tirant profit des dshalognases. Elles s'adressent au traitement des eaux et la fabrication de molcules chirales utilises comme intermdiaires de synthse [103].
CONCLUSION
Il a t vident tout au long des rubriques examines ici que les potentialits d'limination par les bactries de substances artificielles sont immenses, car elles s'appuyent sur des outils qui taient prsents dans la nature bien avant que
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l'homme existe et portaient sur l'limination de substances naturelles. Le problme particulier des pandages ptroliers et des mares noires cristallise juste titre l'inquitude publique. Bien que les outils naturels aient pu venir notre secours, il est certain qu'ils ne suffiront pas pour nous protger des pollutions ptrolires, vu les normes quantits pompes et transportes sur la plante. C'est certainement un des aspects de la pollution o l'action politique et juridique doit tre renforce nergiquement de toute urgence.
RFRENCES
[1] D E N N I S M & K O L A T T U K U D Y PE (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 5306-5310. [2] R E E D JR, V A N D E R W E L D , C H O I S , P O M O N I S JG , R E I T Z RC & B L O M Q U I S T G J (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 10000-10004. [3] P R I N C E RC (1993) Critical Reviews Microbiol. 19 : 217-242 ; S W A N N E L L RPJ et al. (1996) Microbiol. Reviews 60 : 342-365. [4] I Q B A L S , K H A L I D ZM & M A L I K KA (1995) Lett. Appl. Microbiol 21 : 176-179. [5] S I K K E M A J, D E B O N T JAM & P O O L M A N B (1995) Microbiol. Reviews 59 : 201-222. [6] L A U B I E R L & A L Z I E U C (2002) La Recherche 355 : 74-77. [7] B R I T T O N LN (1984) In "Microbial Degradation of Organic Compounds", G I B S O N D T ed., Marcel Dekker. [8] S O R K H O H NA, AL- H A S A N RH , K H A N A F E R M & R A D W A N S S (1995) J. Appl. Bacteriol. 78 : 194-199. [9] R E I L I N G H E, T H A N E I - W Y S S U, G U E R R A - S A N T O S LH , H I R T R, K A P P E L I O & F I E C H T E R A (1986) Appl. Environ. Microbiol. 51 : 985-989. [10] K O C H AK, K A P P E L I O , F I E C H T E R A & R E I S E R J (1991) J. Bacteriol. 173 : 4212-4219. [11] J E N N Y K, K A P P E L I O & F I E C H T E R A (1991) Appl. Microbiol. Biotechnol. 36 : 5-13. [12] K A P P E L I O & F I N N E R T Y W R (1979) J. Bacteriol. 140 : 707-712. [13] G I L E W I C Z M, Z A C E K M, B E R T R A N D JC & A Z O U L A Y E (1979) Can. J. Microbiol. 25 : 201-206. [14] K A P P E L I O (1986) Microbiol. Reviews 50 : 244-258. [15] S C H E L L E R U, Z I M M E R T, B E C H E R D , S C H A U E R F & S C H U N C K W H (1998) J. Biol. Chem. 273 : 32528-32534. [16] K A P P E L I O , W A L T H E R P, M U E L L E R M & F I E C H T E R A (1984) Arch. Microbiol. 138 : 279-282. [17] K A M A S A W A N, O H T S U K A I, K A M A D A Y , U E D A M, T A N A K A A & O S U M I M (1996) Cell. Struct. Funct. 21 : 117-122 ; O H K U M A M, P A R K S M, Z I M M E R T, M E N Z E L R, V O G E L F, S C H U N C K W H , O H T A A & T A K A G I M (1995) Biochim. Biophys. Acta 1236 : 163-169. [18] S A N G L A R D D , K A P P E L I O & F I E C H T E R A (1984) J. Bacteriol. 157 : 297-302 ; I M A J O T, K A W A C H I H , A T O M I H , S A N U K I S , Y A M A M O T O S , U E D A M & T A N A K A A (1997) Arch. Microbiol. 168 : 389-395 ; U E D A M, K A W A C H I H , A T O M I H & T A N A K A A (1998) Biochim. Biophys. Acta 1397 : 213-222. [19] O H K U M A M, Z I M M E R T, I I D A T, S C H U N C K W H , O H T A A & T A K A G I M (1998) J. Biol. Chem. 273 : 3948-3953.
582
[20] S C H A E F F E R TL, C A N T W E L L S G , B R O W N JL, W A T T D S & F A L L RR (1979) Appl. Environ. Microbiol. 38 : 742-746. [21] N I E B O E R M, K I N G M A J & W I T H O L T B (1993) Mol. Microbiol. 8 : 1039-1051. [22] S H A N K L I N J, A C H I M C , S C H M I D T H , F O X BG & M U N C K E (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 2981-2986. [23] V A N B E I L E N JB, W U B B O L T S MG & W I T H O L T B (1994) Biodegradation 5 : 161-174 ; V A N B E I L E N JB, E G G I N K G , E N E Q U I S T H , B O S R & W I T H O L T B (1992) Mol. Microbiol. 6 : 3121-3136. [24] C H E N Q , J A N S S E N D B & W I T H O L T B (1996) J. Bacteriol. 178 : 5508-5512. [25] L E E H J, B A S R A N J & S C R U T T O N NS (1998) Biochemistry 37 : 15513-15522. [26] E G G I N K G , L A G E V E E N RG , A L T E N B U R G B & W I T H O L T B (1987) J. Biol. Chem. 262 : 17712-17718. [27] S T A I J E N IE, M A R C I O N E L L I R & W I T H O L T B (1999) J. Bacteriol. 181 : 1610-1616 ; S T A I J E N IE, V A N B E I L E N JB & W I T H O L T B (2000) Eur. J. Biochem. 267 : 1957-1965. [28] S O L A N O - S E R E N A F, M A R C H A L R, L E B E A U L T JM & V A N D E C A S T E E L E JP (2000) Biodegradation 11 : 29-35 ; S O L A N O - S E R E N A F, M A R C H A L R, H U E T T, L E B E A U L T JM, V A N D E C A S T E E L E JP (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 : 121-125 . [29] W H Y T E L G , H A W A R I J, Z H O U E, B O U R B O N N I R E L, I N N I S S W E & G R E E R C W (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2578-2584. [30] W H Y T E L G , S M I T S TH , L A B B E D , W I T H O L T B, G R E E R C W & V A N B E I L E N JB (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68 : 5933-5942. [31] S O L A N O - S E R E N A F, M A R C H A L R, C A R A S G O L A S , V A S N I E R C , L E B E A U L T JM & V A N D E C A S T E E L E JP (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 2392-2399. [32] C L A R K D D , A L L E N JR & E N S I G N S A (2000) Biochemistry 39 : 1294-1304. [33] K R U M JG & E N S I G N S A (2001) J. Bacteriol. 183 : 2172-2177. [34] P U R W A N T I N I E & D A N I E L S L (1998) J. Bacteriol. 180 : 2212-2219 ; V O R H O L T JA, C H I S T O S E R D O V A L, S T O L Y A R S M, T H A U E R RK & L I D S T R O M ME (1999) J. Bacteriol. 181 : 5750-5757. [35] B O N S E N PPM , S P U D I C H JA, N E L S O N D L & K O R N B E R G D L (1969) J. Bacteriol. 98 : 62-68. [36] F R A L I C K JA (1996) J. Bacteriol. 178 : 5803-5805 ; A O N O R, T S U K A G O S H I N & Y A M A M O T O M (1998) J. Bacteriol. 180 : 938-944. [37] W H I T E D G , G O L D M A N JD , D E M P L E B & L E V Y S B (1997) J. Bacteriol. 179 : 6122-6126. [38] S H E N G D , B A L L O U D P & M A S S E Y V (2001) Biochemistry 40 : 11156-11167. [39] Z I M M E R M A N N PR, C H A T F I E L D RB, F I S H M A N J, C R U T Z E N PJ & H A N S T PL (1978) Geophys. Res. Lett. 5 : 679-682. [40] P O U L O S TL & R A A G R (1992) FASEB J. 6 : 674-679. [41] W E S T L A K E AC , H A R F O R D - C R O S S C F, D O N O V A N J & W O N G LL (1999) Eur. J. Biochem. 265 : 929-935. [42] A T K I N S W M & S L I G A R S G (1988) Biochemistry 27 : 1610-1616. [43] J O O H , L I N Z & A R N O L D FH (1999) Nature 399 : 670-673. [44] R A A G R & P O U L O S TL (1991) Biochemistry 30 : 2674-2684. [45] S C H L I C H T I N G I, J U N G C & S C H U L Z E H (1997) FEBS Lett . 415 : 253-257.
12 ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS [46] W H I T E RE, M C C A R T H Y M- B , E G E B E R G KD & S L I G A R S G (1984) Arch. Biochem. Biophys. 228 : 493-502. [47] Z H A N G Z, S I B B E S E N O , J O H N S O N RA & O R T I Z D E M O N T E L L A N O PR (1998) Bioorg. Med. Chem. 6 : 1501-1508.
583
[48] S H I M A D A H , N A G A N O S , A R I G A Y , U N N O M, E G A W A T, H I S H I K I T, I S H I M U R A Y , M A S U Y A F, O B A T A T & H O R I H (1999) J. Biol. Chem. 274 : 9363-9369. [49] P E T E R S O N JA, L U JY , G E I S S E L S O D E R J, G R A H A M - L O R E N C E S , C A R M O N A C , W I T N E Y F & L O R E N C E MC (1992) J. Biol. Chem. 267 : 14193-14203 ; A N D E R S S O N LA, J O H N S O N AK & P E T E R S O N JA (1997) Arch. Biochem. Biophys. 345 : 79-87. [50] L E F E V E R MR & W A C K E T T LP (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201 : 373-378. [51] E N G L A N D PA, H A R F O R D - C R O S S C F, S T E V E N S O N JA, R O U C H D A & W O N G LL (1998) FEBS Lett. 424 : 271-274. [52] H U R H G , S A D O W S K Y MJ & W A C K E T T LP (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 4148-4154. [53] O ' K E E F E D P & H A R D E R PA (1991) Molecular Microbiol. 5 : 2099-2105. [54] D A R D A S A, G A L D , B A R R E L L E M, S A U R E T - I G N A Z I G , S T E R J I A D E S R & P E L M O N T J (1985) Arch. Biochem. Biophys. 236 : 585-592 ; S U T H E R L A N D JB (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52 : 98-100 ; S A U R E T - I G N A Z I G , D A R D A S A & P E L M O N T J (1988) Biochimie 70 : 1385-1395.
[55] N A R H I LO & F U L C O AJ (1986) J. Biol. Chem. 261 : 7160-7169.
[56] J O N E S JP, O ' H A R R E EJ & W O N G LL (2001) Eur. J. Biochem. 268 : 1460-1467. [57] A E C K E R S B E R G F, B A K F & W I D D E L F (1991) Appl. Environ. Microbiol. 156, 5-14 ; A E C K E R S B E R G F, R A I N E Y FA & W I D D E L F (1998) Arch. Microbiol. 170 : 361-369. [58] E H R E N R E I C H P, B E H R E N D S A, H A R D E R J & W I D D E L F (2000) Arch. Microbiol. 173 : 58-664 ; S O C M & Y O U N G LY (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 5532-5540. [59] Z E N G L E R K, R I C H N O W H H , R O S S E L L - M O R A R,M I C H A E L I S W & W I D D E L F (1999) Nature 401 : 266-269 ; A N D E R S O N RT & L O V L E Y D R (2000) Nature 404 : 722-723. [60] K R O P P KG , D A V I D O V A IA & S U F L I T A JM (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 5393-5398. [61] G R I E G LM & S U F L I T A JB (2002) Env. Sci. Technol. 36 : 3755-3762. [62] W I L K E S H , R A B U S R, F I S C H E R T, A R M S T R O F F A, B E H R E N D S A & W I D D E L F (2002) Arch. Microbiol. 177 : 235-243. [63] D A N G E L W , T S C H E C H A & F U C H S G (1988) Arch. Microbiol. 150 : 358-362 ; D A N G E L W , T S C H E C H A & F U C H S G (1988) Arch. Microbiol. 152 : 271-279. [64] L A N G E C C & W A C K E T T LP (1997) J. Bacteriol. 179 : 3858-3865. [65] Z Y L S T R A G J, W A C K E T T LP & G I B S O N D T. (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 ; 3162-3166 ; S H I E L D S MS , M O N T G O M E R Y S O , C U S K E Y S M, C H A P M A N PJ & P R I T C H A R D PH (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 1935-1941. [66] W A C K E T T LP, H O U S E H O L D E R S R, S T R U I J S J & R O G E R S JE(1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2723-2725. [67] J A H N G D & W O O D TK (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 2473-2482 ; F I T C H MW , S P E I T E L G E & G E O R G I O U G (1996) Applied. Environ. Microbiol. 62 : 1124-1128.
584
[68] A R C I E R O D , V A N N E L L I T, L O G A N M & H O O P E R AB (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 159 : 640-643. [69 ] H O L L I G E R C , H A H N D , H A R M S E N H , L U D W I G W , S C H U M A C H E R W , T I N D A L L B, V A Z Q U E Z F, W E I S S N & Z E H N D E R AJ (1998) Arch. Microbiol. 169 : 313-321. [ 70] N E U M A N N A, S C H O L Z - M U R A M A T S U H & D I E K E R T G (1994) Arch. Microbiol. 162 : 295-301. [71] T E R Z E N B A C H D P & B L A U T M (1994) FEMS Microbiol. Lett. 123 : 213-218. [72] W A C K E T T LP, B R U S S E A U G A, H O U S E H O L D E R S R & H A N S O N RS (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2960-2964. [73] V A N N E L L I T, L O G A N M, A R C I E R O D M & H O O P E R AB (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 : 1169-1171. [74] R A S C H E ME, H I C K S RE, H Y M A N MR, A R P D J (1990) J. Bacteriol. 172 : 5368-5373. [75] N E U M A N N A, W O H L F A R T G , D I E K E R T G (1996) J. Biol. Chem. 271 : 16515-16519. [76] M I L L E R E, W O H L F A R T G & D I E K E R T G (1998) Arch. Microbiol. 169 : 497-502. [77] N E U M A N N A, W O H L F A R T G & D I E K E R T G (1998) J. Bacteriol. 180 : 4140-4145. [78] S C H U M A C H E R W & H O L L I G E R C (1996) J. Bacteriol. 178 : 2328-2333 ; S C H U M A C H E R W , H O L L I G E R C , Z E H N D E R AJ & H A G E N W R (1997) FEBS Lett. 409 : 421-425. [79] M A Y M O - G A T E L L X, C H I E N Y - T , G O S S E T T JM & Z I N D E R S H (1997) Science 276 : 1568-1571. [80] C R I D D L E C S , D E W I T T JT & M C C A R T Y PL (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 : 3247-3254. [81] F A T H E P U R E BZ & B O Y D S A (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 2976-2980 ; E G L I C , S C H O L T Z R, C O O K AM & L E I S I N G E R T (1987) FEMS Microbiol. Lett. 43 : 257-261 ; L E W I S TA & C R A W F O R D RL (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 1635-1641. [82] M O H N W W & T I E J E JM (1991) Arch. Microbiol. 157 : 1-6. [83] V E R S C H U E R E N KH G , F R A N K E N S M, R O S E B O O M H J, K A L K KH & D I J K S T R A BW (1993) J. Mol. Biol. 232 : 856-872 ; S C H A N S T R A JP, K I N G M A J & J A N S S E N D B (1996) J. Biol. Chem. 271 : 14747-14753. [84] J A N S S E N D B, S C H E P E R A, D I J K H U I Z E N L & W I H O L T B (1985) Appl. Environ. Microbiol. 49 : 673-677. [85] P O E L A R E N D S G J, V A N H Y L C K A M A JET , M A R C H E S I JR, F R E I T A S D O S S A N T O S LM & J A N S S E N D B (1999) J. Bacteriol. 181 : 2052-2058. [86] B O S M A T, K R U I Z I N G A E D E B R U I N EJ, P O E L A R E N D S G J & J A N S S E N D B (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4575-4581. [87] P O E L A R E N D S G J, W I L K E N S M, L A R K I N MJ, D I R K V A N E L S A S J & J A N S S E N D B (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2931-2936. [88] H A R D M A N D J (1991) Crit. Rev. Biotechnol. 11 : 1-40. [89] L I U JQ , K U R I H A R A T, H A S A N AK, N A R D I - D E I V, K O S H I K A W A H , E S A K I N & S O D A K (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 2389-2393. [90] W E I G H T M A N AJ, W E I G H T M A N AL & S L A T E R JH (1982) J. Gen. Microbiol. 128 ; 1755-1762 ; S M I T H JM, H A R R I S O N K & C O L B Y J (1990) J. Gen. Microbiol. 136 : 881-886. [91] T H O M A S AW , T O P P I N G AW , S L A T E R JH & W E I G H T M A N AJ (1992) J. Bacteriol. 174 : 1941-1947. [92] L E I G H JA, S K I N N E R AJ & C O O P E R RA (1988) FEMS Microbiol. Lett. 49 : 353-356. [93] V A N D E R P L O E G J, V A N H A L L G & J A N S S E N D B (1991) J. Bacteriol.173 : 7925-7933 ; N A R D I - D E I V, K U R I H A R A T, O K A N I U R A T, L I U JQ & S O D A K (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 3375-3380.
12 ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS [94] S C H N E I D E R B, M L L E R R, F R A N K R & L I N G E N S F (1991) J. Bacteriol.173 : 1530-1535. [95] L I U JQ , K U R I H A R A T, M I Y A G I M, E S A K I N & S O D A K (1995) J. Biol. Chem. 270 : 18309-18312. [96] L I U JQ , K U R I H A R A T, M I Y A G I M, T S U N A S A W A S , N I S H I H A R A M, E S A K I N & S O D A K (1997) J. Biol. Chem. 272 : 3363-3368. [97] H I S A N O T, H A T A Y , F U J I I T, L I U JQ , K U R I H A R A T, E S A K I N & S O D A K (1996) J. Biol. Chem. 271 : 20322-20330. [98] L I Y F, H A T A Y , F U J I I T, H I S A N O T, N I S H I H A R A M, K U R I H A R A T & E S A K I N (1998) J. Biol. Chem. 273 : 15035-15044. [99] L I U JQ , K U R I H A R A T, H A S A N AK, N A R D I - D E I V, K O S H I K A W A H , E S A K I N & S O D A K (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 2389-2393. [100] K A W A S A K I H , T S U D A K, M A T S U S H I T A I & T O N O M U R A K (1992) J. Gen. Microbiol. 138 : 1317-1323. [101] K R O O S H O F G H , K W A N T EM, D A M B O R S K Y J, K O C A J & J A N S S E N D B (1997) Biochemistry 36 : 9571-9580 ; L I U JQ , K U R I H A R A T, I C H I Y A M A S , M I Y A G I M, T S U N A S A W A S , K A W A S A K I H , S O D A K, E S A K I N (1998) J. Biol. Chem. 273 : 30897-30902. [102] G R E G G K, C O O P E R C L, S C H A F E R D J, S H A R P E H , B E A R D C E & A L L E N G , X U J (1994) Biotechnology (N Y) 12 : 1361-1365. [103] S W A N S O N PE (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10 : 365-369.
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CHAPITRE 13 HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS

Ce chapitre nous confirmera la puissance de la microflore pour liminer des hydrocarbures ptroliers ou des composs chlors ns de l'industrie. Nous commencerons par essayer de comprendre comment les microorganismes arobies liminent les composs hydrocarbons non aromatiques provenant du ptrole ou rpandus par l'univers des plantes comme les terpnes. Les cytochromes P450 apparaissent comme des pices essentielles pour cette action. D'autres outils effectuent aussi des biodgradations l'abri de l'air. Ce chapitre s'intressera l'limination de certains drivs halogns aliphatiques, qui sont bien souvent des contaminants indsirables dans l'environnement. L'activit bactrienne capable de les faire disparatre apparat alors comme d'autant plus prcieuse. 13.1 - Quelques aspects gnraux 13.2 - Dgradation d'un herbicide 13.3 - Des herbicides chlors 13.4 - Les acides phosphoniques - Le Roundup 13.5 - Organophosphates - Parathion et autres 13.6 - Organochlors - Lindane et DDT 13.7 - Le pentachlorophnol 13.8 - Carbamates et pyrthrodes 13.9 - Herbicides du groupe des triazines 13.10 - Anilides et analogues 13.11 - Sulfates - Sulfonates 13.12 - Les peroxydases, une arme absolue ? 589 592 598 601 606 610 616 620 623 627 629 633
13 HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS

13.1 - QUELQUES ASPECTS GNRAUX
Le terme de pesticide dsigne ordinairement toutes les substances ou prparations destines dtruire les espces animales et vgtales nuisibles aux cultures. Dans la pratique, on distingue des insecticides, acaricides, nmaticides, fongicides, herbicides On estime que la bagatelle de 2,5 millions de tonnes de pesticides sont appliqus chaque anne sur toute la plante. Les spcialistes craignent que les produits utiliss natteignent vritablement leur cible qu 0,3% au maximum. Cela veut dire que plus de 99% partent dans l'environnement, ce qui donne l'ampleur du problme [1]. Certains ingrdients sont toxiques des taux divers, d'autres sont trs rmanents. La lgislation de chaque pays tend contrler l'utilisation des nombreuses prparations mises sur le march, voire en interdire certaines. Une liste exhaustive des pesticides dont on connat de faon dtaille la biodgradation serait ici compltement hors de porte. La mise au point de substances artificielles actives dans la destruction des mauvaises herbes ou des insectes parasites de l'agriculture a t stimule la fois par la recherche du profit et des considrations humanitaires, dont l'ambition tait de lutter contre la faim et la maladie dans le monde. Depuis de nombreuses annes, on s'inquite juste titre des effets pervers exercs sur la flore et la faune par l'pandage en grande quantit des herbicides et insecticides, notamment pour l'agriculture haut rendement. La mise au point de plantes cultives gntiquement modifies, les fameux OGM, n'a fait qu'exacerber les polmiques et a catalys une plus grande prise de conscience. Comme la prsence de pesticides dans le sol, les eaux de boissons et les produits alimentaires fait courir des risques grandissants la sant des personnes et des animaux, une directive de la CEE en 1985 a fix 0,1 g par litre la limite tolrable pour tout pesticide donn dans l'eau, et 5 g par litre la teneur totale des pesticides en mlange. Ce sont des limites forfaitaires, qui ne peuvent prendre en compte la diversit des cas individuels. Les contrles s'tant multiplis, il a fallu mettre au point des techniques suffisamment sensibles pour dtecter ces substances taux faible. Chromatographie en phase gazeuse et HPLC sont des mthodes prcises et sensibles, mais onreuses et difficiles adapter sur le terrain. Les mthodes immuno-enzymatiques permettent la construction de "kits" pour des mesures efficaces. Un pesticide rechercher est coupl une macromolcule comme l'albumine. L'antigne ainsi conjugu sert diriger la production d'anticorps
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capables de reconnatre les constituants faible masse molculaire prsents l'tat de conjugus. Ces anticorps servent alors d'agents de dtection dans des immuno-dosages de type ELISA*. Des coffrets pour mesures rapides ont t mis sur le march afin de faire des valuations sur le terrain. Mais les grandes quantits de pesticides utiliss pour la culture provoquent une contamination alarmante des rivires et nappes phratiques, et appellent une surveillance accrue. Elles incitent au resserrement des dispositions lgales. Les lments du sol exercent une profonde influence sur les transformations chimiques qui s'y droulent. Le milieu est extrmement htrogne, variable d'un lieu un autre, et renferme des minraux l'tat divis, argiles, de l'humus et des matires organiques en dcomposition. Les argiles et micas, dont quelques caractres gnraux sont donns en glossaire, sont des lments importants pour retenir les substances dissoutes. Les argiles ont en mme temps des ples hydrophobes et un caractre ionique leur donnant les proprits d'un changeur d'ions. Lorsque le contaminant est entran par un courant de liquide, le phnomne a pour effet de retarder sa migration par rapport la phase mobile, d'une manire comparable ce qui se passe dans une chromatographie, mais en plus compliqu puisque la phase fixe est faite de particules trs htrognes [2].
adsorption
absorption particule du sol
Adsorption d'un solut en surface d'une particule et absorption l'intrieur sont deux phnomnes qui n'ont pas de frontire trs tranche entre eux. Dans les deux cas, l'association dpend du caractre soluble du contaminant, de sa masse molculaire, de sa charge ionique ou de son hydrophobicit. On utilise volontiers le terme gnral de sorption pour dsigner l'association du contaminant avec une particule solide L'action des composants minraux comme les argiles est seconde par l'humus. Une fraction de celui-ci est soumise un renouvellement extrmement lent et sa composition est trs htrogne. Cependant il est loin d'tre inerte chimiquement et ses vertus sont mises profit dans des oxydations biologiques imparfaitement connues, mais qui paraissent trs importantes. La sorption d'un pesticide dans le sol retient souvent l'attention. Elle correspond un tat d'quilibre, dtermin par une constante Kd qui est le rapport de la concentration du polluant li la phase fixe sa concentration dans le milieu liquide. Cette constante a une valeur moyenne qui dpend de plusieurs facteurs, dont la taille des particules, leur nature et le pH du milieu qui intervient dans la solubilit du produit. La valit d'une notion d'quilibre en contaminant sorb et libre en solution temprature donne est approximative, car lorsque la concentration l'tat libre C augmente, il s'tablit un
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phnomne de saturation des sites disponibles sur les particules, avec courbe inflchie vers un plateau comme l'indique la figure en a. La partie b de la figure montre une relation logarithmique quasi linaire entre les deux fractions fixe et soluble du polluant.
L (mg/kg) log L
concentration C en solution (mg/L)
log C
Masse lie L en fonction de la concentration C

Un contaminant peut tre d'autant mieux retenu par les particules du sol qu'il est plus hydrophobe. Cette proprit s'exprime par le coefficient Koc*. Par exemple l'Atrazine (un herbicide) a une solubilit de 33 mg . L1, contre 40 mg . L1 pour un insecticide d'action gnrale, le Diazinon. Ces deux produits ont respectivement 163 et 194 comme Koc. Par comparaison le DDT, insecticide bien connu et maintenant banni, est trs peu soluble (moins de 0,004 mg . L1), et son Koc est de 24 000. Il est donc fortement adsorb, et de plus trs rmanent car sa biodgradation est trs lente [3]. Les mesures de rtention dans le sol donnent une ide sur le comportement du contaminant, mais il faut tenir compte de la rapidit avec laquelle l'quilibre est atteint, et on doit tenir compte de la vitesse d'coulement de l'eau. Lorsqu'elle est grande, l'quilibre n'a pas le temps de s'tablir et le produit est plus rapidement entran. Beaucoup de contaminants sont volatils, et leur entranement en profondeur diminue leur vacuation dans l'atmosphre, en particulier si le produit possde une grande densit. Comme indiqu prcdemment, un entranement lent par les eaux circulantes permet au contaminant de rsider plus longtemps dans le sol et de se voir expos l'action des micro-organismes avant de parvenir la nappe phratique. Une action qui dpend de manire considrable du taux d'oxygne prsent, de la prsence d'autres lments organiques, et qui rend complexe la modlisation de la biodgradation. Beaucoup de contaminations dnonces par la presse et les spcialistes de l'environnement rsultent de l'usage en quantits inconsidres de pesticides, d'herbicides ou d'engrais favorisant la culture intensive. Cette dernire n'est pas la seule responsable, les produits mis dans le commerce l'usage des jardins tant souvent surconsomms dans un esprit de facilit. Les doses prescrites sont souvent assez peu lisibles sur les emballages. Les mesures faites avec les godets en plastique accompagnant ces emballages sont parfois d'une imprcision telle qu'un spcialiste habitu la vie de laboratoire aurait du mal oprer proprement. Il y a toujours la base le besoin d'une information meilleure et plus transparente. L'extension de l'habitat individuel et la vogue des jardins crent un march important de produits en tout genre, allant de la
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lutte contre les pucerons l'enlvement des mauvaises herbes. Il y a donc un risque qui n'chappe pas aux organismes de dfense de l'environnement. Des efforts intressants sont consacrs de nouvelles mthodes, comme l'agriculture "bio", ou l'agriculture "raisonne". Il y a un quilibre difficile raliser entre les impratifs conomiques, cologiques, sanitaires et politiques. Le dbat est alors facilement pollu, c'est le cas de le dire, par des prises de position dogmatiques ou animes par des objectifs gostes. Son analyse est loin des objectifs fixs ici, centrs uniquement sur les aspects biologiques, chimiques et gntiques de la dpollution.
13.2 - DGRADATION D'UN HERBICIDE

Les herbicides de la famille des phnoxyacides sont trs communment utiliss : ils perturbent le dveloppement des plantes en imitant par leur l'action l'acide 3-indolactique, l'une des principales phytohormones contrlant la croissance. Voici quelques exemples, dont le 2,4-D et le 2,4,5-T qui sont respectivement les acides 2,4-dichlorophnoxyactique et 2,4,5-trichlorophnoxyactique. Le Mcoprop et le MCPB (acide 2-mthyl-4-chlorophnoxybutyrique) sont trs actifs sur les dicotyldones. On les emploie au dsherbage slectif des crales, raison de 500-1500 g par hectare, ou pour liminer les mauvaises herbes du gazon 1. D'autres produits ont une action similaire Ils drivent de l'acide benzoque (Dicamba) ou de l'acide picolinique (Piclorame). Ce dernier agit dose faible (50-200 g par hectare), mais a l'inconvnient d'tre assez rmanent.
O CH2COOH Cl 2,4-D Cl Cl O CH2COOH Cl 2,4,5-T H3C O CHCOOH CH3 Mcoprop O CHC2CHC2CHC2COOH CH3 MCPB
Cl
Cl
Cl
Les phnoxyactates ont t dcouverts en 1942 par ZIMMERMAN. Ils sont absorbs par les feuilles des plantes dicotyldones, vhiculs dans tout le vgtal jusqu'aux racines, et provoquent la distorsion des tiges et le dprissement de toute la plante. De tels produits sont dits systmiques. Ils sont en principe sans effets sur les graines ou les vgtaux dormants. Des effets diffrentiels trs nets se manifestent en fonction de la facilit de pntration, de la vitesse de circulation dans les vaisseaux et des transformations au sein de la plante. Pour faciliter leur absorption, on a parfois recours aux sels alcalins et amines correspondants qui rgnrent l'acide dans la plante. Le MCPB a un effet retard : inactif par lui-mme,
1 - Lentretien du gazon est trs dvelopp dans les pays anglo-saxons climat humide ou aprs irrigation, pour lesquels cest une tradition culturelle, et il est dimportance conomique pour les terrains de golf ou certains parcs de loisir. Des gramines adaptes comme le ray-grass ont t slectionnes en vue de ce march.
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la plante le transforme en son homologue actique aprs -oxydation de la chane butyrique. Les plantes sont souvent capables d'exercer une dtoxification de ces produits, qui peut se faire par hydroxylation du noyau et formation d'un glycoconjugu avec du glucose. Les phnoxyactates dont le 2,4-D fait partie sont limins par plusieurs voies. En conditions arobies, les bactries commencent par dtacher la chane latrale, hydroxylent le cycle jusqu former un catchol, et traitent celui-ci par la voie du 3-oxoadipate. Les champignons se contentent dhydroxyler le cycle (Aspergillus niger), ou le dtruisent entirement par une peroxydase (Phanerochaete chrysosporium). Lattaque anarobie est moins bien connue et son principe est diffrent. Le chlore est enlev par dshalognation rductrice. Une dgradation arobie bien analyse est offerte par Ralstonia eutropha JMP134 muni du plasmide pJP4, dont la longueur est de 85 kb. Ces bactries peuvent se dvelopper sur le 2,4-D, le 3-chlorobenzoate, et divers chloro-aromatiques grce 6 gnes essentiels qui sont sur le plasmide. L'herbicide est la cible des gnes tfd. Voici les deux premires tapes, qui vont nous ramener trs rapidement la voie ortho. La premire est catalyse par une dioxygnase dtentrice de Fe(II) et appartenant une catgorie spciale, car les deux atomes d'oxygne sont reus par des molcules carbones distinctes [4]. Dans une mono-oxygnase classique, la source d'lectrons serait NADH ou NADPH au lieu de l'oxoglutarate, et il y a formation d'une molcule d'eau. L'enzyme est cod par le gne tfdA.
O CH2COOH Cl O2 (TfdA) Cl 2,4-D COOH CO CH2 CH2 COOH 2-oxoglutarate CO2, H COOH CH2 CH2 COOH succinate
+
OH Cl + Cl 2,4-dichlorophnol glyoxylate CHO COO
Le dichlorophnol form est transform son tour par le produit du gne tfdB, qui est une mono-oxygnase fonctionnant comme hydroxylase productrice de 3,5-dichlorocatchol. Il est mtabolis et dchlor jusqu'au 3-oxoadipate par la voie ortho modifie comme vu antrieurement. R. eutropha peut ainsi se dvelopper sur 2,4-D comme seule source de carbone et d'nergie, par conversion jusqu'au stade succinate, actyl-coenzyme A et glyoxylate. Ces bactries peuvent aussi se dvelopper sur 3-chlorobenzoate. Celui-ci est transform par une dioxygnase et une dshydrognase en 3- et 4-chlorocatchols, ces enzymes tant codes par le chromosome. La transformation des chlorocatchols par la voie ortho modifie est code par le pJP4 et a t reprsente dans un chapitre antrieur. On a pu voir qu'une mme dioxygnase code par tfdC admet comme substrats les deux chlorocatchols et le 3,5-dichlorocatchol. Un mme opron tfdCDEF (dioxygnase, cycloisomrase, dinelactone hydrolase, malylactate rductase) dirige l'expression de
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toute la voie jusqu'au 3-oxoadipate. Le gne rgulateur est tfdR. Le mtabolisme de l'oxoadipate est ensuite pris en charge par des gnes chromosomiques. Les bactries ayant reu le plasmide pJP4 sont ainsi devenues capables de se nourrir d'un substrat difficile et entirement artificiel, le 2,4-D. Une surprise attendait cependant les chercheurs. La portion du plasmide responsable de la biodgradation est plus longue que prvue (22 kb) et contient non pas un seul opron tfd mais deux [5]. L'ensemble contient aussi le gne d'un transporteur (tfdK) et pas moins de trois gnes rgulateurs : tfdR, tfdS et tfdT dont la disposition est symbolise par un schma (les longueurs relatives sont arbitraires).
unit II A S R DII CII EII FII BII K IS T C D unit I E F B
2,4-D-oxygnase transporteur muc.cyclo-isomrase dichlorocat.di-oxygnase muc.cyclo-isomrase dichlorocat. di-oxygnase dinelactone hydrolase dinelactone hydrolase malylactate rductase malylactate rductase dichlorophnol oxygnase dichlorophnol oxygnase
Les deux units tfdCDEF ou tfdDCEF

Les deux premiers gnes rgulateurs sont les seuls fonctionnels, car tfdT est inactiv par la prsence d'un lment d'insertion IS [6]. Comme tfdR et tfdS sont identiques, il est possible que la duplication qui leur a donn naissance soit un phnomne rcent. Un deuxime lment d'insertion t dcouvert 9 kb du premier entre tfdS et tfA [7]. La rgion tfdR-tfdS donne lieu une structure curieuse. Les deux squences identiques sont transcrites en sens inverse sur l'ADN et sont loges dans une boucle de prs de 16 kb symbolise par le dessin ci-dessous. La ralit de cette boucle a t constate par microscopie lectronique sur un fragment du plasmide. Les lettres p dsignent des rgions promotrices. Nous savons qu'elles sont directement en amont des rgions transcrites.
200 pdb
tfdS tfdA
tfdR tfdDll ADN
Les gnes rgulateurs tfdR, tfdS et tfdT sont placs tte-bche par rapport aux gnes rguls et partageant avec eux la mme rgion promotrice (petites flches)
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selon la disposition caractristique. Les protines rgulatrices appartiennent au type LysR rencontr en examinant la voie du catchol (CatR). Elles reconnaissent un mme motif consensus et ont entre elles une similitude structurale. Voici titre d'illustration une comparaison de squences entre trois activateurs LysR dans la rgion o ils se lient l'ADN. La disposition relative des rsidus identiques (ombrs) traduit une similitude structurale et le mme mode d'attachement l'ADN.
TfdR E G N V G A A A R R L H I S Q P P V T R Q I H A L E Q H L G V L L F E R S A R G V O L T P A G A A F L E D A R R LysR A G S L T E A A H L L H T S Q P T V S R E L A R F E K V I G L K L F E R V R G R L H P T V Q G L R L F E E V Q R ClcR E G N I G A A A R R L H I S Q P P I T R Q I Q A L E Q D L G V V L F E R T H R G V P L T A A G T T F L E D A R R
L'unit tfd formant cette boucle aurait t insre en bloc la faveur d'une transposition venant doubler les gnes pr-existants du plasmide. Il ne s'agirait pas d'une simple duplication sur le plasmide, mais d'un apport extrieur. En effet l'ordre des gnes n'est pas tout fait le mme (inversion entre C et D), et le gne tfdK est un nouveau venu. C'est important parce que la protine TfdK facilite l'entre du 2,4-D travers la membrane. Le gne tfdA fait un peu bande part de l'autre ct et dtermine la 2,4-D mono-oxygnase qui catalyse la premire raction. En l'absence d'inducteur, ces protines rgulatrices agissent comme rpresseurs et tendent bloquer la transcription dans les deux directions. Par exemple TfdS entrave la fois l'expression de son propre gne et celle de tfdA (le gne de la dioxygnase initiale). Quel est l'inducteur ? Le signal transformant TfdS en activateur de tfdA est le 2,4-dichloromuconate, qui est produit partir du 3,5-dichlorocatchol pendant la dgradation du 2,4-D [8]. Le 2- ou le 3-chloromuconate agiraient dans le mme sens. Puisque TfdR et TfdS sont identiques, elles sont sans doute interchangeables. Elles semblent agir pourtant plus efficacement en cis, c'est--dire sur la transcription des gnes directement adjacents, soit TfdS sur l'expression de tfdA, et TfdR de l'autre ct de la boucle. Que se passe-t-il si on supprime la boucle apporte par insertion sur pJP4 ? Les bactries restent alors capables de dgrader dans une certaine mesure le 3-chlorobenzoate. Le contrle de cette action devrait revenir prfrentiellement TfdT, mais nous savons que son gne a t inactiv par l'insertion. Les deux protines TfdR et TfdS viendraient compenser cette perte en agissant en trans, c'est--dire au-dehors de leur site prfr. L'addition de 2,4-D une culture continue de R. eutropha sur fructose provoque une cascade d'vnements que LEVEAU et coll. ont tent d'analyser [9]. Ces auteurs ont mis en vidence l'augmentation des ARN messagers spcifiques dtects par hybridation au cours d'une phase d'adaptation qui dure une deux heures. Les cellules en absence de 2,4-D ont une faible activit de base (TfdA, TfdB, TfdC) sans laquelle elles ne pourraient pas fabriquer l'inducteur en temps voulu. Aprs addition du 2,4-D, la monte du 2,4-dichloromuconate dclenche alors les diffrentes transcriptions qui apparaissent au cours du temps en fonction de l'ordre dans lequel les diffrents gnes sont disposs : tfdA, tfdDII et tfdC placs au voisinage d'un promoteur sont transcrits les premiers, tandis que tfdB et tfdK le sont plus tardivement.
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Ces problmes donnent lieu un commentaire d'intrt gnral. La priode d'adaptation qui suit l'apport d'un inducteur obit une cintique difficile analyser sur le plan exprimental. La transcription des gnes successifs donne une ide sur la marche des oprations au cours de l'induction, mais ne renseigne pas sur l'intensit de chaque tape du mtabolisme, car il n'y a pas ncessairement proportionnalit entre le taux d'ARN messager pour une enzyme donne et l'activit globale de celle-ci. Supposons qu'une tape s'avre peu efficace sur le plan de la catalyse par rapport d'autres. Elle peut crer un goulot d'tranglement dans le processus total et limiter la vitesse de l'ensemble. C'est peut-tre l'un des avantages de la prsence des enzymes en double, comme ici avec les deux sries tfd. Les enzymes ne sont pas identiques d'une srie l'autre, ne sont pas rgules exactement de la mme faon, et ne fonctionnent pas au mme taux. Nanmoins chaque enzyme oprationnelle peut compenser un instant donn la dficience de son homologue. On pourrait videmment doser chaque enzyme dans la culture bactrienne aprs induction. Ce travail n'est pas commode dans la pratique, car les dosages avec les cellules entires souffrent d'interfrences et de complications causes par des phnomnes de permabilit. L'abondance des artefacts viendrait ruiner la prcision des analyses. Enfin des effets trs compliqus sont causs par la toxicit de certains intermdiaires mtaboliques comme le dichlorocatchol, qui est un agent dcouplant au niveau de la membrane et lse l'conomie nergtique des cellules ds qu'il s'accumule. Si sa formation est plus rapide que sa consommation en aval, il y aura fatalement des effets toxiques qui seront ventuellement amplifis et amneront des rsultats peu reproductibles. Le mtabolisme de l'herbicide 2,4-D est un cas de figure exemplaire, o on peut voir comment des bactries du sol se sont quipes pour dgrader un compos purement artificiel en remaniant leur matriel gntique et leurs rgulations. La pression slective a favoris des cellules les mieux pourvues au hasard, croit-on, des mutations et recombinaisons gntiques. Le plasmide pJP4 n'est peut-tre pas l'outil idal pour dgrader le 2,4-D dans la nature, mais les bactries qui ont les bonnes chaussures leurs pieds vont un peu plus vite que les autres, la seule chose qui compte finalement dans la comptition vitale. Les bactries capables d'attaquer le 2,4-D et les divers phnyl-alcanoates paraissent rpandues dans la nature, notamment chez les protobactries de la sous-classe bta [10]. La recherche systmatique peut s'effectuer par la dtection des squences nucliques tfdA, tfdB, tfdC, mais on risque alors de passer ct des formes bactriennes qui emploient des oxygnases d'un autre type [11]. Pourtant certaines espces bactriennes dj pourvues des enzymes cites ici restent incapables de se dvelopper sur le 2,4-D et herbicides de la mme famille. Pourquoi ? Le mcanisme courant fait appel une dioxygnase utilisant le 2,4-D et le 2-oxoglutarate. Ce dernier est un intermdiaire du cycle de KREBS et figure comme prcurseur dans plusieurs synthses (pour mmoire : glutamate, glutamine, proline, arginine). L'oxygnase le dcarboxyle en succinate, une autre source de carbone intressante pour le mtabolisme. Les bactries ne peuvent s'en tirer ici qu'en rgnrant d'une faon ou d'une autre leur oxoglutarate, sans lequel l'attaque du 2,4-D s'arrterait. Le schma aide comprendre comment peut s'effectuer ce re-
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tour. Un mcanisme essentiel est le cycle du glyoxylate*, et les consquences thoriques de ce systme ont t values rcemment par MLLER ET BABEL [12].
COO 2,4-D C=O CH2 HC=O COO glyoxylate CH2 COO 2-oxoglutarate
TfdA
CO2 TfdB
OH HO Cl
cycle glyoxylique cycle de KREBS
CO2
Cl
voie ortho
2 Cl actyl-CoA malate oxaloactate actyl-CoA 2 CO2
OOCCH CH COO 2 2 OOCCH2CH2COO
gluconogense
CO2
3-phosphoglycrate
succinate
Le 2,4-D est dgrad par la dioxygnase TfdA et par TfdB en 3,5-dichlorocatchol, qui est transform son tour en succinate et actyl-CoA par la voie ortho. Pour que les cellules puissent se dvelopper sur l'herbicide comme seule source de carbone et d'nergie, il faut qu'une partie du carbone soit assimile, en conduisant par exemple au 3-phosphoglycrate, et produire suffisamment d'nergie ATP pour faire fonctionner les synthses et la maintenance cellulaires. Des 13 atomes de carbone du 2,4-D et du 2-oxoglutarate, 8 sont rcuprs en succinate, 4 dans le glyoxylate et l'actyle, 1 comme CO2. La rgnration de l'oxoglutarate (5 atomes de C) s'effectue partir du succinate et du cycle du glyoxylate. Finalement l'excdent utilis pour les synthses cellulaires, reprsent par le phosphoglycrate, ne reprsente que 3 atomes de carbone sur les 8 du substrat initial, la diffrence tant sous forme de 5 molcules de CO2. Il y a donc beaucoup de pertes carbones en cours de route, mais les oxydations produisent de l'nergie. Pourquoi un systme aussi compliqu fond sur l'utilisation du 2-oxoglutarate ? Une transformation du 2,4-D par mono-oxygnase utilisant le NADH donneur d'lectrons la place de l'oxoglutarate ne serait-elle pas plus simple et plus avantageuse ? Les calculs suggrent que l'efficacit estime serait peu prs la mme. Il y aurait moins de pertes carbones mais aussi moins d'nergie produite. Cette discussion sommaire est rvlatrice des problmes mtaboliques lis de nombreuses biodgradations. Nous voyons qu'il ne suffit pas d'avoir les bonnes enzymes et les bonnes rgulations, mais comme dans l'industrie un bilan nergtique et financier quilibr. Bien entendu ce n'est pas toujours le cas. Des bactries munies de TfdA et TfdB mais incapables de rgnrer correctement leur
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2-oxoglutarate finissent par accumuler le dichlorocatchol, s'intoxiquent ventuellement et ne peuvent crotre sur 2,4-D. Seule solution, ventuellement : le comtabolisme. En consommant paralllement une autre source carbone, les bactries peuvent compenser leur dficit et dgrader le 2,4-D de manire plus ou moins incomplte. Comme quoi il est toujours prfrable de diversifier ses activits. On conoit aisment que les micro-organismes viennent notre secours pour dpolluer les sols contamins par les chlorophnoxyactates, mais une observation intressante a t publie par des auteurs italiens [13] : le 2,4-D marqu au carbone-13 est scind non enzymatiquement en dichlorophnol et actate par lhumus. Cette action se fait pH neutre, elle est inhibe pH acide ou par une peroxydase. Elle sinterprte comme une raction radicalaire favorise par la nature des substances humiques. Lintervention des substances humiques dans un processus de dgradation est donc nouveau une perspective creuser. Lavenir dira si cette observation est exceptionnelle, ou au contraire applicable dautres polluants.
13.3 - DES HERBICIDES CHLORS

De nombreux herbicides chlors autres que les phytohormones de la srie du 2,4-D ont t mis sur le march. La priorit a t donne en gnral aux tudes de toxicit, de rmanence et de mobilit dans les milieux naturels, mais les donnes manquent bien souvent sur le mtabolisme par les plantes ou les micro-organismes. Les herbicides de la famille des chloroactamides (Alachlor, Metolachlor, Propachlor) sont des inhibiteurs de germination. Un de leurs modes d'action est de bloquer la synthse des acides gras longue chane [14].
O Cl N O Cl O N O Cl O N
Alachlor
Metolachlor
Propachlor
Chloroactamides
Le mtabolisme de ces herbicides a mis en lumire l'intervention du glutathion (GSH) dans les biodgradations. Plusieurs auteurs avaient remarqu l'abondance de la glutathion S-transfrase dans de nombreuses espces bactriennes se multipliant au voisinage immdiat des racines vgtales, c'est--dire dans la rhizosphre. Cette enzyme se rencontre aussi chez les champignons et les protozoaires [15]. Le glutathion forme des conjugus avec une foule de composs lectrophiles. Cette raction constitue un des principaux modes de dtoxification chez les mammifres, et les plantes s'en servent pour neutraliser d'assez nombreux herbicides dans leurs tissus. Ce mode de liaison a t observ dans le mtabolisme des chloroactamides par les germes du sol, et montr pour la premire fois sur le Propachlor [16]. L'enzyme cl est la -glutamyl transfrase qui
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soude le GSH au substrat avec dpart du chlore. La recherche systmatique de l'enzyme avec le 1-chloro-2,4-dinitrobenzne (CDNB) a montr qu'elle tait prsente dans le colibacille, Proteus mirabilis et plus d'une vingtaine d'espces [17]. Le procd mis en uvre est assez particulier. Le tripeptide est rogn successivement aux deux bouts pour ne laisser que la cystine soude au substrat. La liaison du substrat dj dchlor avec le thiol sera rompue par oxydation. Ce procd a t dmontr pour l'Alachlor et le Propachlor.
glutathion Cl NO2 NO2 SH Cl S NO2 NO2 NO2 S NO2 NO2 S NO2 Cys
Conjugu du CDNB avec le glutathion

Voici comment le Propachlor aprs la perte de son atome de chlore serait minralis par un Acinetobacter (voie 1) et un Pseudomonas (voie 2) capables de se dvelopper sur Propachlor comme seule source de carbone. Le catchol est un intermdiaire dans les deux cas.
HN Propachlor Cl O N H3C H3C OH O NH OH catchol O H3C NH2 CO2 H2O
NH2
D'autres herbicides chlors appartiennent la famille des pyridiniques, le Triclopyr et ses drivs le butoxythyl ester (TBEE) et le sel de trithylamine (TEA) appels aussi respectivement Garlon 3A et Garlon 4. Ces produits aprs pandage se transforment trs rapidement en Triclopyr, qui pntre dans les feuilles et les racines et agit comme une phytohormone sur les plantes large feuilles. Ces produits ont t trs utiliss pour dbrousailler et dsherber en milieu forestier, car ils ont tendance rester en surface. Le Trichlopyr est rput peu toxique. Pourtant son usage a t trs vivement critiqu cause de sa nocivit pour les abeilles. La rmanence moyenne dans les eaux est de quelques jours. Il est mtabolis par les plantes, notamment aprs conjugaison avec l'acide aspartique. Les micro-organismes arobies du sol le transforment en acides organiques, en dioxyde de carbone et eau. La figure indique deux des principaux mtabolites intermdiaires trouvs, le trichloropyridinol (TCP) et la trichloromthoxypyridine (TMP). L'acide oxamique est un produit de dcomposition non biologique du Trichopyr par photolyse dans l'eau.
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Cl Cl N Cl O COOH Cl Cl N TCP Cl OH Cl Cl
Cl N TMP OCH3
O H2N C COOH Acide oxamique
Tichlopyr
Les herbicides prcdents n'avaient pas de chiralit, c'est--dire d'isomres R ou S. Un seul fait exception ici, le Metolachlor. La varit active ici est la forme S, tandis que le produit fabriqu par Ciba-Geigy est un racmique o les deux nantiomres sont en gale proportion. La discrimination entre molcules asymtriques est courante en biologie et donne lieu des phnomnes de tout ou rien. Certains mdicaments sont livrs sous forme de l'nantiomre actif, de faon augmenter son efficacit et limiter les effets secondaires. Nanmoins les synthses asymtriques et la sparation des inverses optiques dans un racmique ont un prix de revient qui est prohibitif pour les agents chimiques industriels produits en grande quantit, comme les pesticides et herbicides. Le problme devient aigu au niveau de leur biodgradation, puisque rien n'indique a priori que les deux nantiomres seront limins la mme vitesse. De nombreuses tudes d'environnement se voient donc entaches d'erreur, quand l'une des formes est dgrade beaucoup plus rapidement que l'autre. Des essais ont t pratiqus par LEWIS et coll. [18] sous trois latitudes diffrentes, en Norvge, aux Etats-Unis et au Brsil. Les produits choisis sont deux herbicides, le Dichlorprop et le Mthyl-dichlorprop, ainsi qu'un insecticide, le Crufomate encore appel Ruelne de la famille des phosphoramides. Les deux herbicides agissent comme phytohormones, la manire du 2,4-D et du Trichlopyr. Seuls sont actifs comme herbicides les nantiomres (+). Le Crufomate est un insecticide utilis dans les levages de bovins, les deux nantiomres sont actifs mais le (+) est quatre fois plus toxique que l'autre.
CH3 Cl O CH COOH Cl (R)-(+)-dichlorprop Cl (H3C)3C O O P H3C (S)-crufomate NH HN OCH3 H3C HC O HOOC Cl (S)-(-)-dichlorprop O P O CH3 (R)-crufomate Cl C(CH3) Cl
H3CO
De multiples chantillons ont t examins chaque fois. Les deux isomres du Mthyl-dichlorprop sont rapidement dmthyls au mme taux en Dichlorprop, les estrases bactriennes tant souvent peu slectives. Il n'en est pas de mme pour la dgradation du Dichlorprop, beaucoup plus lente et amorce aprs un retard de plusieurs semaines. En comparant le sol forestier amazonien et diverses parcelles dforestes, des diffrences sensibles ont t constates. Par exemple le premier type de sol avait tendance liminer plus rapidement l'nantiomre (+) actif
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comme herbicide, contrairement aux sols des secteurs dfrichs. De mme la dforestation semblait privilgier l'limination du Crufomate (), qui est le moins toxique. Des diffrences ont t constates galement entre prlvements de sol provenant des trois latitudes et les recherches ont montr une trs grande variabilit entre populations microbiennes et slectivit. La dgradation diffrentielle des nantiomres d'un mme produit est donc une difficult dont il faudra tenir compte de plus en plus dans les tudes environnementales.
13.4 - LES ACIDES PHOSPHONIQUES - LE ROUNDUP

Ces produits sont caractriss par une liaison directe carbone-phosphore, contrairement aux esters phosphoriques o un atome d'oxygne est intercal. Les phosphonates d'origine biologique sont relativement rares dans la nature. On les trouve pourtant en abondance chez certains invertbrs comme une anmone de mer, chez des insectes, et surtout dans les enveloppes de micro-organismes : streptomyctes, Trypanosoma, Tetrahymena et bien d'autres. Cette catgorie de composs regroupe quelques antibiotiques dont la fosfomycine (ou Phosphonomycine). Dans les phosphonolipides, le 2-aminothylphosphonate (AEPn ), ou ciliatine, que nous retrouverons plus loin, remplace la trs classique thanolaminephosphate. En somme les phosphonates sont des produits naturels, stables et rsistants l'hydrolyse, auxquels se sont adaptes de nombreuses espces de bactries ou de champignons. L'industrie chimique s'est empare des phosphonates et en a rpandu dans l'environnement depuis plus de trois dcennies, en particulier des herbicides dont le chef de file est le glyphosate (N-phosphonomthylglycine). Celui-ci entre dans la composition d'un dsherbant trs utilis en agriculture et rpandu sous le nom de Roundup (Monsanto) 2. Le glyphosate y est mlang un ammonium quaternaire prvu pour faciliter la pntration dans les feuilles. La cible de son action est une raction particulire dans la synthse de la phnylalanine et de la tyrosine, catalyse par la synthase de l'EPSP (voir figure de la page suivante). L'enzyme est code par le noyau et fonctionne dans le chloroplaste. Le glyphosate imite le shikimate-3-phosphate qui est l'un des substrats de l'enzyme, inhibe la synthse des acides amins aromatiques dans les plantes en cours de croissance. Le glyphosate agit comme dsherbant total sur les vgtaux en cours de croissance.
2 - Lusage trs souvent abusif de ce dsherbant efficace cristallise les protestations des organisations cologistes, pour les raisons cites plus loin. Il en rsulte une prise de conscience progressive du public pour une utilisation plus raisonne, par exemple au cours des activits de jardinage.
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PEP COO P OH HN P glyphosate O CH2 COO
OH
COO
CH2 C O COO O
O
O OH shikimate-3-P
COO
OH 5-noylpyruvyl-shikimate-3-P (EPSP)
P O
La raction inhibe par le glyphosate

L'absorption du glyphosate par les particules du sol retarde son drainage vers les aquifres, le rendant rmanent dans le sol avec un temps de prsence variable allant de quelques semaines plus d'une anne. D'aprs l'OMS, l'utilisation normale du glyphosate ne ferait pas faire courir de risque la sant, mais ce point de vue est trs controvers. L'emploi du glyphosate grande chelle 3 et la pollution constate des rivires prsente une relle menace. On accuse ces herbicides d'augmenter le taux d'apparition d'une forme de leucmie. Le glyphosate est mal limin par l'organisme humain. Des pollutions scandaleuses et rgulires des cours d'eau ont t constates ici et l, en particulier en Bretagne. Dans l'Elorn, une rivire qui alimente en eau potable le tiers du Finistre, le "dbordement" du glyphosate y a dpass en 1999 plus de 170 fois la norme considre comme acceptable [19] ! Une lutte se poursuit sur les plans conomique et politique, entre les multinationales comme la firme Monsanto d'une part et diverses organisations de dfense qui rclament le bannissement de ces herbicides sur la base du principe de prcaution. Les rsultats sont embrouills par la prsence, en mlange avec l'herbicide, d'adjuvants qui ne sont pas sans effets secondaires sur l'environnement et la sant. La rupture de la liaison C-P est l'opration essentielle pour la dgradation du glyphosate, mais elle rsiste l'acide chlorhydrique et la soude ! Le mode d'action de l'enzyme comptente, ou C-P lyase, est mal connu. Le glyphosate serait dgrad selon deux voies. La premire ou voie de la sarcosine (1), est pratique par Enterobacter aerogenes et la plupart des espces bactriennes capables de faire une coupure de la liaison CP [20], selon le principe : La C-P lyase libre du phosphate. La sarcosine entre facilement dans le mtabolisme intermdiaire aprs avoir perdu un lment monocarbon qui sera pris en charge par le ttrahydrofolate (FH4) [21]. Une tude systmatique a montr que la plupart des souches isoles partir de sites contamins par le glyphosate scindaient celui-ci par la voie de la sarcosine [22].
3 - Prs de 24 000 tonnes avaient t utilises aux Etats-Unis au cours de l'anne 2000 d'aprs un rapport de l'EPA. Le Roundup est l'herbicide le plus vendu au monde, a reprsent prs de 2,6 milliards de dollars en chiffre d'affaire pour le groupe MONSANTO au cours de l'anne 2000.

H N
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O P O O
H2O
OOC
OOC
C P O H2 O glyphosate C H2
H N
C-P lyase 2
C CH3 + HO H2 sarcosine
C P O + unit 2 C H2 O aminomthyl-phosphonate H2O phosphonatase O H2N CH3 + HO mthylamine P O O
H2N
glycine lments monocarbons
Dgradation du glyphosate
Par contre la seconde voie (2), notamment chez certains Pseudomonas, passe par le 2-aminomthyl-phosphonate (AMPA). Celui-ci est scind par une C-P lyase comme indiqu sur le schma, la mthylamine forme tant oxyde en NH4+, CO2 et H2O. Il semble cependant que la plupart des souches capables d'utiliser le glyphosate ne le transforment pas en AMPA. On a dcrit aussi une rupture du glyphosate entre N et C du ct phosphate avec production de glycine et de formyl-phosphonate [23]. La C-P lyase coupe la liaison CP par un mcanisme d'oxydorduction radicalaire encore imparfaitement connu (raction a du schma) [24]. Elle peut librer du mthane partir de mthylphosphonate, qui est le plus simple des composs organophosphoniques. La raction b concerne plus particulirement l'AMPA qui est scind par une C-P lyase. La voie b opre en deux tapes, une transamination et une raction qui ressemble celle de la C-P lyase tout en tant distincte par son mcanisme d'hydrolyse. Cette enzyme est dsigne comme phosphonatase.
a b
CH3PO3H2 mthylphosphonate
CP-lyase
CH4 + HPO32 mthane phosphite CHOCH2PO3H2
H2NCH2CH2PO3H2 2-aminothylphosphonate
phosphonatase
CHOCH3 actaldhyde
H3PO4 Pi
phosphono-actaldhyde
Enterobacter aerogenes et quelques espces ont la fois les deux voies [25], alors que d'autres n'utilisent que celle de la phosphonatase. La synthse de la C-P lyase chez Escherichia coli est dtermine au sein de l'opron phnA-Q, qui offre une situation extraordinaire car il ne contient pas moins de 17 gnes sur un segment de 15611 pdb entirement squenc [26]. Cet ensemble impressionnant dtermine un mcanisme de transport, la C-P lyase, des protines rgulatrices et des lments accessoires, comme les facteurs responsables de l'oxydation du phosphite en phosphate. Le diagramme donne une ide de cette unit gntique.
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N O P Q 1 kb
squences Rep
consensus :
GCCGGATGCGACGCTAGCGTCTTATCCGGCCTAC
Les 17 gnes phn chez E. coli B

On peut y relever plusieurs particularits intressantes. L'ensemble est peut-tre transcrit d'une pice partir de trois sites promoteurs identifis (petites flches coudes), mais l'existence de promoteurs secondaires n'est pas exclue. Plusieurs gnes, tels que phnH, phnJ, sont lgrement chevauchants sur les gnes voisins. Enfin les zones intergniques, non traduites, sont trs restreintes, sauf en quelques endroits o se rencontrent des squences rptes inverses dites Rep*. La principale est entre phnA et phnB. L'ensemble du vaste segment phn renferme des ORF supplmentaires de fonction non identifie, dont la squence est porte par le brin d'ADN complmentaire, et qui sont orientes en sens inverse. La signification individuelle de tous ces gnes a t examine par comparaison avec des gnes connus, par complmentation de mutants et surexpression afin d'isoler la protine correspondante. L'utilisation des phosphonates ne requiert pas la totalit des gnes de cet ensemble, mais se limite au bloc phnCP (14 gnes au lieu de 17), les gnes phnA, phnB et phnQ n'tant pas concerns [27]. Le colibacille n'est pas le seul organisme possder une telle lyase, dont l'quivalent s'observe dans d'autres espces (Rhizobium meliloti, Sinorhizobium, Agrobacterium , Klebsiella et Arthrobacter). Le Rhizobium peut mme se dvelopper sur benzylphosphonate et sur glyphosate comme seule source de phosphore, contrairement au colibacille. La C-P lyase de Rhizobium est peu spcifique et agit sur n'importe quel phosphonate. Les gnes sont homologues de ceux de E. coli. Un appareil gntique aussi important pour attaquer les phosphonates a de quoi surprendre. Les bactries ont besoin du bloc phnCP pour avoir une C-P lyase fonctionnelle. Le mthyl-phosphonate est le substrat utilis pour rvler la prsence de la lyase membranaire, qui est code par l'ensemble phnGHIJKLM. On suppose que l'enzyme est membranaire et tourne vers le priplasme de la cellule. Elle est relativement complexe, et renferme des sous-units diffrentes. La partie phnCDE correspond un systme transporteur et phnO aurait une fonction rgulatrice qu'on ne connat pas exactement. La fonction des protines codes par phnN et phnP serait de faciliter l'insertion des autres lments dans la membrane et de les stabiliser. Tout cet arsenal ne serait pas dirig seulement contre les phosphonates. Par exemple, le transporteur prsum cod par phnCDE concerne aussi les esterphosphates, l'ion phosphate et les ester-phosphites. L'utilisation d'un phosphite comme source de P ncessite l'oxydation du phosphore de + 3 + 5, c'est--dire sa transformation en phosphate. Il y a probablement un cycle d'oxydorduction o alternent les niveaux phosphate et phosphite. C'est pourquoi la C-P lyase, qui
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scinde une structure chimique passablement inerte, serait une enzyme relativement complexe car elle comporte un mcanisme fond sur cette oxydorduction. Les phosphonates donneurs de phosphore ou d'azote sont rarement utiliss comme seule source de carbone, soit parce qu'ils ne pntrent pas dans la cellule, soit parce que les bactries n'arrivent pas quilibrer leur mtabolisme en leur prsence. Le phosphate est libr partir des phosphonates l'extrieur du cytoplasme et utilis l'intrieur aprs transport. Les bactries dtentrices d'une C-P lyase et d'un transport des phosphonates ne peuvent utiliser le phosphore qu'aprs oxydation du phosphite (HPO32, anion de l'acide phosphoreux) en phosphate (HPO42). Ceci a t mis en vidence par clonage des gnes phn du colibacille chez Klebsiella aerogene, qui peut alors utiliser divers phosphonates et le phosphite minral comme source de phosphore [28]. Cette proprit est intressante pour l'industrie o l'hypophosphite (H2PO2) est utilis en grande quantit comme rducteur des ions mtalliques dans la fabrication des disques compacts. Il en rsulte une pollution par phosphite, dont l'oxydation biologique en phosphate est donc fort utile. Klebsiella excelle si bien dans la rcupration du phosphore qu'elle accumule en son sein du polyphosphate. L'ensemble des gnes phn est soumis induction et rpression. Le dispositif est plac sous le contrle de PhoR* [29], une protine de contrle global la base d'un vaste rgulon, dont la mission est d'approvisionner la cellule en phosphate. Deux conclusions semblent merger. Tout d'abord la consommation des phosphonates, dont le glyphosate est un cas particulier, parat beaucoup plus rpandue dans la nature que suppos initialement. Ensuite les phosphonates sont utilisables comme source de phosphore, et mme d'azote comme dans le cas du glyphosate. Leur dgradation est sous le contrle de plusieurs gnes et implique des mcanismes de transport. La complexit de tout cet appareil vient d'un problme crucial, la rcupration du phosphore, car cet lment est trs souvent limitant pour la croissance des organismes dans les conditions naturelles. Le systme que nous avons dcrit permet aux bactries de faire feu de tout bois pour assimiler le prcieux lment. Parmi les phosphonates naturels figure la fosfomycine (ou phosphonomycine), un antibiotique dcouvert chez Streptomyces fradiae et agissant sur une tape initiale de la synthse des peptidoglycanes. Son effet ressemble celui de la pnicilline, mais s'exerce autrement. Les Penicillium sont capables de convertir un phosphonate, le cis-propnylphosphonate (cPA), en fosfomycine par poxydation strospcifique catalyse l'aide d'une cPA oxydase [30] :
H C H3C C
O
H O P O poxydation
H C H3C O C
H O P
O O fosfomycine
Les champignons peuvent synthtiser des composs phosphoniques et les transformer. On les suppose capables de les dgrader. En effet, la croissance de Penicillium notatum est possible en utilisant divers phosphonates comme seule source de phosphore [31]. Les substrats utiliss sont le 2-aminothylphosphonate (ciliatine) et
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une srie de composs alpha-amins comprenant ce produit et les homologues suprieurs chane carbone plus longue. Le mcanisme d'attaque serait comparable celui qu'utilisent les bactries comme dfense contre cet antibiotique. Un Rhizobium huakuii est capable d'utiliser la fosfomycine dose leve (10 mM) comme source de carbone, de phosphore et d'nergie [32], une proprit qui semble rpandue dans le genre Rhizobium. On ne s'attendait pas videmment rencontrer l'emploi d'un systme aussi complexe consacr la dgradation des phosphonates, alors que ces derniers ne sont pas au premier plan des circuits mtaboliques habituels et ont attir l'attention aprs emploi d'un compos artificiel. Une trs longue volution a probablement prpar les micro-organismes rencontrer des phosphonates : la fabrication industrielle de nouveaux phosphonates ne les aurait pas "surpris" l encore. En rsum, on a pu voir que les phosphonates ne sont finalement que des sources de phosphore parmi d'autres. Les espces bactriennes ont dvelopp un outillage perfectionn pour les utiliser et n'ont fait que l'employer la biodgradation des phosphonates artificiels dont le glyphosate fait partie.
13.5 - ORGANOPHOSPHATES - PARATHION ET AUTRES

Parmi les insecticides les plus utiliss sur la plante sont des organophosphates synthtiques, dont l'action essentielle est d'inhiber les actylcholine estrases dans les organismes cibles. Ce sont des neurotoxiques. Les organophosphates commercialiss comme insecticides paralysent le systme nerveux des insectes tout en mnageant celui des vertbrs. Leur toxicit sur l'Homme n'est cependant pas nulle, et l'pandage massif de ces produits dans l'agriculture provoque des accidents. Leur caractre hydrophobe les fait s'adsorber facilement sur les sdiments (log Koc de 2 prs de 4), et la contamination de l'environnement peut devenir proccupante. C'est pourquoi des efforts importants ont t consacrs l'tude du transport et de l'limination de ces produits. La figure montre des exemples courants.
Cl Cl O O P O O Diazinon N Cl O N N O P O S O O P NH O Fenamiphos S Chlorpyrifos O2N O O P O S Parathion
Quelques organophosphates
Ces diffrents ingrdients ont plusieurs noms commerciaux. Par exemple le Diazinon s'appelle aussi Spectracil, Neocidol, Alfa-Tox, Knox-out et AG 500. Un mme insecticide existe sous des conditionnements varis et s'utilise en poudre,
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pulvrisation, granuls, microcapsules Les usages diffrent sans que les effets soient rigoureusement spcifiques. Le Diazinon est courant pour le jardin et l'agriculture, le Chlorpyrifos pour le contrle des cafards, des puces et des termites, le Fenamifos pour lutter contre les nmatodes, enfin le Parathion pour protger les cultures. Les insecticides organophosphors ont en commun d'avoir une liaison phosphoryle ou thiophosphoryle (P=S). Leur solubilit excde rarement 40 mg . L1. Les plus hydrophobes comme le Chlorpyros sont en mme temps les plus volatils. Ce caractre joint un pouvoir d'adsorption marqu sur les particules du sol limite la contamination des eaux circulantes. Tous ont tendance s'chapper partiellement dans l'atmosphre, o ils sont soumis des oxydations photochimiques. La plupart de ces insecticides peuvent devenir trs dangereux lorsqu'ils sont utiliss sans prcaution, en particulier le Fenamiphos trs toxique par contact, ingestion et inhalation. Ces insecticides agissent sur l'actylcholine estrase comme inhibiteurs comptitifs, et ne sont donc pas transforms par l'enzyme. Une action efficace est celle d'un inhibiteur "suicide" : l'enzyme scinde alors l'insecticide en servant d'estrase, mais son site actif reste bloqu par une liaison covalente. Comme ces insecticides sont inactivs par hydrolyse, il doit exister des agents biologiques naturels qui dcontaminent facilement ces produits. Les organophosphate hydrolases microbiennes (OPH) ont t dtectes depuis plus de quinze ans. Une bactrie du sol, Pseudomonas diminuta, possde cette estrase qui a t purifie [33]. L'effet est extrmement variable en fonction de l'insecticide choisi pour cible, le plus rapidement hydrolys tant le Paraoxon. Celui-ci se forme au cours de l'attaque du Parathion par une aryldialkyl phosphatase, avec remplacement du soufre par l'oxygne. Le Paraoxon a lui-mme les proprits d'un insecticide. Son hydrolyse fait apparatre du 4-nitrophnol.
O2N O O P O paraoxon H2O O2N O O P O parathion S H2 O O HO P O S H2S O2N OH 4-nitrophnol O O HO P O O
Attaque du Parathion
Nous connaissons le mtabolisme du 4-nitrophnol, lequel est facilement dtect par sa couleur jaune due l'ion nitrophnolate. Une mono-oxygnase l'oxyde en nitrocatchol, ou encore en p-benzoquinone. Celle-ci est entirement biodgradable et conduit la voie du 3-oxoadipate (voie ortho). L'enzyme cl est l'organophosphate hydrolase (OP), qui transforme directement le Parathion ou le Paraoxon en
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nitrophnol. Un Pseudomonas transform par un plasmide o avait t insr le gne de l'hydrolase est devenu capable de dgrader le 4-nitrophnol et de se dvelopper sur Parathion [34]. La minralisation complte du Parathion et des autres organophosphates est ralise par les associations bactriennes du sol, mais ce processus est assez lent. Des recherches ont eu lieu pour amliorer la vitesse de l'hydrolyse du Parathion, du Paraoxon et des composs analogues. Par chance on connat la structure dtaille de l'hydrolase OP [35]. La spcificit de son action dpend de l'insertion plus ou moins favorable des divers organophosphates dans le site actif. En modifiant celui-ci par mutagense dirige, on peut esprer obtenir utilement une hydrolase active sur d'autres molcules. Une application de cette recherche est la biodgradation du mthyl-Parathion. L'usage de cet insecticide est trs rpandu dans le monde entier pour la dfense des cultures de riz, du soja, du coton, du mas, ainsi que des arbres fruitiers. Il diffre du Parathion en ayant deux groupes mthoxyles sur le phosphore au lieu d'thoxyles. La molcule est donc plus petite, mais s'hydrolyse plus lentement que son homologue thoxyl. La mutagense dirige permet d'amliorer l'hydrolyse du mthyl-Parathion, mais cette recherche peut s'avrer trs laborieuse. La mthode utilise pour obtenir rapidement un grand nombre de mutations est celle du DNA shuffling* ou mthode de STEMMER. Le but est ici d'obtenir rapidement de nombreux changements d'acides amins dans le site actif, afin de modifier les performances de l'enzyme. Diverses mutations sont dfavorables et ignores. Par contre d'autres modifications amliorent les proprits. En introduisant des rsidus d'acides amins plus encombrants dans le site, on obtient une enzyme mutante dont la prfrence va au mthyl-Parathion. Cette mthodologie est assez puissante pour construire des gnes nouveaux intressants. Par incorporation dans un plasmide transmis aux bactries, celles-ci deviennent du mme coup beaucoup plus performantes pour dtruire un produit donn. En somme on reconstitue l'volution qui s'effectue spontanment dans la nature, par mutations et slection, mais on peut esprer obtenir le rsultat un rythme acclr ! Les organophosphates sont-ils utilisables comme source de phosphore par les micro-organismes ? La rponse est affirmative. La dtoxification hydrolytique de plusieurs organophosphates a t constate dans une bactrie des plus banales dans les laboratoires, E. coli K12. La dfluoration du di-isopropylfluorophosphate (DFP), dont la formule est donne un peu plus loin, engendre l'ester di-isopropylphosphate, puis l'ester monophosphate et enfin le phosphate. Il y a en somme une dshalognation et deux hydrolyses successives avant que les bactries puissent utiliser le phosphate. Le nettoyage des milieux contamins par les organophosphors est devenu urgent depuis qu'a t reconnue la grande toxicit de bon nombre de ces produits, par exemple le Malathion utilis dans des pays en voie de dveloppement pour lutter contre le vecteur du paludisme. Le Parathion a t aussi le responsable d'un nombre incalculable d'accidents. Le Phosvel est un autre organophosphor dangereux, fabriqu aux Etats-Unis o son usage est maintenant interdit, mais distribu autrefois par milliers de tonnes dans les pays du tiersmonde au titre de l'aide au dveloppement ! Beaucoup de ces insecticides sont maintenant soumis un usage trs rglement et sont mme bannis dans de nombreux pays. La menace s'est dplace vers les organophosphates utiliss comme
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armes de guerre (gaz de combat). La marge est finalement assez troite entre les proprits insecticides et l'action neurologique sur l'homme par blocage de l'actylcholine estrase. Citons le Tabun, le Sarin et le di-isopropylfluorophosphate (DFP) qui sont de puissants neurotoxiques.
CH3 H5C2 O P O C N F P O O CH CH3 CH3 CH3 Sarin F CH3 P C CH3 O O CH CH3 CH3 Soman CH3 F P O O CH DFP CH CH3 CH3 CH3
O N CH3 CH3
Tabun
La crainte suscite par ces produits a augment avec la menace de leur utilisation au cours de conflits arms, de rpressions sauvages comme au Kurdistan ou dans des attentats terroristes. En Mars 1995, les adeptes d'une secte criminelle ont dpos du Sarin plusieurs endroits du mtro de Tokyo, tuant 11 voyageurs. Plus de cinq mille personnes furent plus ou moins gravement atteintes, avec des troubles oculaires, respiratoires ainsi que de violentes nauses. Ces produits sont volatils et extrmement toxiques. Le DFP donne tout de mme lieu a des applications pacifiques pour la recherche. C'est un excellent inhibiteur suicide des protases srine, vaste famille d'enzymes dont font partie la trypsine, la chymotrypsine, des facteurs du complment sanguin et des protases participant l'hmostase. L'inhibition s'exerce par la formation d'une liaison covalente irrversible avec la srine essentielle du site catalytique 4. Le DFP est galement utilis dans certains traitements en ophtalmologie et contre la myasthenia gravis 5. Une surprise nous vient d'Escherichia coli, qui est capable de dtoxifier le DFP l'aide d'une hydrolase, en librant du di-isopylphosphate et du fluorure ! Les bactries peuvent aussi hydrolyser le Paraoxon et le Soman, une tentative pour elles de rcuprer le prcieux phosphate. La capacit d'obtenir du phosphore par cette voie dans les diffrentes souches microbiennes dpend non seulement de la prsence de la bonne hydrolase, mais des mcanismes de transports. La protine PhnE de E. coli loge dans la membrane est l'hydrolase, mais un deuxime gne, glpT, commande un transport du DFP [36]. Nous avons donc retrouv dans cette section un certain nombre d'aspects abords propos des phosphonates. L'limination de ces produits est fonde sur leur hydrolyse. Ils agissent principalement sur l'actylcholine estrase des insectes, mais comme la marge est troite entre cette action spcifique et les effets toxiques sur l'homme, beaucoup de ces produits apparaissent donc comme des polluants dangereux dont la nature justifie dimportants contrats de recherche.
4 - Un antidote doit pouvoir faire sauter la liaison entre srine et phosphate. La Pralidoxime agit dans ce sens en formant un complexe oxime-phosphonate avec le groupe phosphoryl, le rendant labile et permettant la rgnration de l'enzyme sous sa forme initiale. 5 - Dgnrescence des muscles squelettiques, d'origine auto-immunitaire, par blocage des neurorcepteurs de l'actylcholine.
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13.6 - ORGANOCHLORS - LINDANE ET DDT

Cette section voquera le cas de certains insecticides comme le Lindane, le DDT et le Chlordane, qui sont aussi au cur de problmes environnementaux, et pour certains (le DDT) de vives polmiques. Ces produits et ceux qui leurs sont apparents symbolisent bien les contradictions modernes lies au progrs technologique. Leur usage a t interdit en France. D'un ct ils apparaissent ncessaires dans la lutte mene contre les insectes ravageurs de l'agriculture et vecteurs de maladies. Inversement leur biodgradation est lente, leur rmanence fait courir des risques sur la sant des populations et des animaux domestiques. Les pyrthrodes sont aussi des insecticides organochlors, mais ils offrent un cadre part et seront examins dans une section suivante. L'histoire du Lindane a commenc en 1826 quand FARADAY, un chimiste anglais, s'aperut qu'on pouvait faire une addition massive du chlore sur le benzne l'aide d'un excs de Cl2 la lumire. Le produit obtenu tait l'hexachlorocyclohexane (HCH) et comportait plusieurs isomres en fonction de la configuration des 6 atomes de carbone asymtriques. C'est en 1935 aux Etats-Unis, qu'on dcouvrit le pouvoir insecticide du HCH. En fait seul l'isomre gamma reprsent ici s'avra tre un puissant insecticide. Cl
Cl Cl Cl Cl Cl
g-hexachlorocyclohexane
Il a t isol par la chimiste belge VAN DER LINDEN, d'o son nom. Cet insecticide agit sur les insectes comme neurotoxique, avec un effet thermique ngatif (devenant plus actif par abaissement de temprature). Aprs la deuxime guerre mondiale, les Etats-Unis entreprirent la grande production du Lindane renfermant plusieurs isomres, et il en fut fait une norme utilisation jusqu' ce que fut constate l'accumulation de certains isomres particulirement rmanents ( et ). Aprs fabrication du Lindane moindre cot au niveau technique, il y avait 5 isomres, alpha, bta, gamma, delta et epsilon. Le gamma n'est pas optiquement actif. Il en rsultait une contamination forte des plantes et des animaux. Les inconvnients sur la sant ont fait bannir ce produit de la plupart des pays dvelopps. En outre, les prparations impures d'insecticide avait une odeur de moisi qui pouvait se communiquer aux plantes consommes. Une contamination de l'environnement persiste encore ici et l, et le Lindane est encore en usage dans certaines parties du monde cause de son faible cot. La dgradation biologique du Lindane a fait l'objet de travaux japonais dtaills. Un Pseudomonas, appel maintenant Sphingomonas paucimobilis, est capable de crotre sur le Lindane comme seule source de carbone et d'nergie, le chlore tant limin sous forme de chlorure [37]. Les intermdiaires sont dtects et mesurs essentiellement par chromatographie en phase gazeuse. Une premire voie transforme le Lindane en 2,5-DCHQ (2,5-dichlorohydroquinone) :

Cl Cl Cl Cl lindane Cl Cl LinB Cl HO OH Cl H2O HCl NAD+ LinC NADH, H+ Cl HO 2,5-DCHQ OH Cl OH Cl Cl Cl LinA HCl Cl Cl Cl Cl Cl LinA LinB HCl Cl Cl H2O HCl Cl Cl HCl Cl OH Cl HCl Cl Cl Cl
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Voie du Lindane chez S. paucimobilis

Les crochets dsignent des intermdiaires non isols dans le milieu, et les flches en pointill des dchlorations spontanes en produits secondaires, le 1,2,4-trichlorobenzne et le 2,5-dichlorophnol. Les trois premires tapes jusqu' la 2,5-DCHQ sont sous la dpendance des gnes constitutifs linA, linB et linC. LinA est une dchlorase de 17 kDa d'un type nouveau, car sa squence n'a aucune homologie avec d'autres protines connues, mais la part prise dans ce mtabolisme a t vrifie l'aide d'une mutation [38]. Deux atomes de chlore sont enlevs, conduisant au 1,4-TCDN (1,3,4,6-ttrachloro-1,4-cyclohexadine). LinB est une 1,4-TCDN chlorohydrolase qui ressemble d'autres dshalognases hydrolytiques. Enfin LinC est une dshydrognase provoquant l'aromatisation du cycle. La dgradation ultrieure de la 2,5-dichlorohydroquinone (2,5-DCHQ) fait penser la dgradation des phnols halogns, mais les deux hydroxyles sont en position para. Il ne se forme pas un catchol, mais une structure qu'on voit dans le gentisate. Le substrat est pris ici en charge par deux enzymes inductibles, LinD et LinE. La premire est une dchlorase catalysant une oxydorduction avec le glutathion (GSH), tandis que LinE est une dioxygnase. La protine LinE a t exprime chez le colibacille [39] et se montre capable d'oxyder l'hydroquinone presque aussi bien que la chlorohydroquinone en utilisant une quantit quivalente d'O2 mais reste sans action sur le catchol. La surprise vient surtout de sa squence, qui montre une parent quasi certaine avec les dioxygnases mta, tandis qu'aucune ressemblance n'a t vue avec la gentisate 1,2-dioxygnase. Les tudes restent incompltes, mais ont permis de dtecter la formation de malylactate et de 3-oxoadipate. Les dernires tapes du tableau mtabolique restent donc hypothtiques. La dchloration du Lindane peut s'effectuer dans des conditions diffrentes de celles qui prcdent, en particulier en anarobiose. Il est devenu vident depuis plusieurs annes qu'elle est ralise par des espces dnitrifiantes [40].
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2 GSH GSSG HCI Cl HO OH Cl LinD HO O2 OH Cl LinE
2 GSH GSSG HCI OH LinD HO LinE O2
COOH HO H2O HCl HO COOH COOH ? O C=O Cl HO
COOH CHO
COOH COOH
LinD et l'oxygnase LinE

Chez la cyanobactrie Anabaena PCC7120, la dchloration du Lindane dpend assez curieusement d'un opron nir qui commande l'utilisation du nitrate et du nitrite [41]. Chez cet organisme comme dans d'autres cyanobactries, l'utilisation du nitrate est arobie et dpend de plusieurs gnes rpartis en nirA, ntrABCD et narB. Ils codent pour la nitrite rductase, des protines de transport du nitrate et la nitrate rductase. La dchloration ne fonctionne que lorsque l'opron nir est fonctionnel, ce qui est le cas la lumire et en absence d'ammonium. L'obscurit et l'ammonium inhibent les fonctions nir.
Cl Cl Cl Cl Cl Cl HCl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 2 HCl Cl Cl + Cl Cl Cl
Transformation du Lindane par Anabaena

La dchloration du Lindane par des cyanobactries comme les Anabaena, Nostoc, Phormidium et autres, est assez commune. Tout lien avec le mtabolisme du nitrate reste sujet caution et cette action rsulte peut-tre d'une proprit fortuite de la nitrate rductase. Les cyanobactries ont des potentialits intressantes, et l'introduction artificielle de gnes bactriens les rend capables d'attaquer d'autres polluants comme le 4-chlorobenzoate [42]. Parmi les insecticides organochlors largement rpandus jusqu' une date rcente, le DDT 6 a occup une place emblmatique. Il n'est que trs lentement limin dans l'environnement, avec une demi-vie de l'ordre de plusieurs annes, alors qu'il en a t fait massivement usage. La seule agriculture amricaine en a utilis plus 6 - 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4'-chlorophnyl)thane.
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de mille millions de tonnes entre 1940 et 1972 ! L'inconvnient le plus grave est son accumulation dans l'organisme animal o il n'est limin que difficilement. Il s'accumule progressivement au niveau des lipides, et la contamination crot au fil des chanes alimentaires pour culminer notamment dans les poissons consomms par l'homme. Son principal inconvnient est donc de polluer toute la chane alimentaire. Il a t fait un emploi trs laxiste du DDT en agriculture. Avant l'embargo plac sur son usage dans de nombreux pays ds 1972, le DDT a t utilis non seulement dans l'agriculture mais en vue dliminer les vecteurs de pathognes dans les pays tropicaux. Au premier chef tait la lutte contre la malaria. Le DDT a t utilis aussi ds la dernire guerre mondiale pour lutter contre le typhus, la fivre jaune, les maladies trypanosomes. L'embargo s'est traduit par une terrible augmentation des cas de paludisme. La monte des cas mortels causs par la malaria dans le monde a t estime prs de 2 millions par an, sur un total de plus de 200 millions de personnes paludennes. De trs vives polmiques ont t engages quelque temps pour ou contre le DDT, qui est encore utilis dans certains pays en voie de dveloppement. La solution devrait tre trouve dans lemploi de produits moins nocifs ou par dautres mthodes. Les argumentations ne sont pas toujours d'ordre scientifique, mais reposent parfois sur des critres politiques ou des conflits d'intrt. Ils dpassent le cadre biochimique fix ici. Une certaine minralisation du DDT a t mise en vidence chez les champignons [43]. Des bactries capables d'attaquer le DDT en comtabolisme ont t isoles rptition, mais les transformations taient souvent incompltes. La diminution du DTT s'accompagne ventuellement de la monte d'un nouveau produit, le DDE 7, un compos plus toxique que le DDT et dont les effets se manifestent longtemps aprs arrt de tout usage de l'insecticide. La transformation du DTT en DDE s'effectue par une DTT dchlorase (EC 4.5.1.1) :
Cl Cl C Cl HCl
Cl
Cl O2
Cl
Cl
Cl DDT
Cl
Cl DDE
Cl
Cl
HO OH
Cl
On a cru pendant longtemps que le DDE tait le stade ultime rcalcitrant fait partir du DDT. Dans les pays tropicaux, le DDE est partiellement limin par volatilisation dans l'atmosphre. Le DDE prsente une certaine analogie avec un polychloro-biphnyle (PCB). On peut donc s'attendre ce que les espces capables de dgrader les PCB puissent attaquer aussi le DDE. C'est effectivement ce qui a t constat avec une souche de Pseudomonas acidovorans, et un Terrabacter [44]. Le DDE est doublement hydroxyl par une dioxygnase comme indiqu droite sur le schma, le procd d'attaque habituel sur un cycle benznique en prsence d'O2. Les auteurs HAY et FOCHT on tudi en dtail les produits de transformation du DDE
7 - 1,1-dichloro-2,2-bis(4'-chlorophnyl)thylne.
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lorsque les bactries taient cultives sur biphnyle [45]. En partant du mtabolisme du biphnyle dj connu, et en identifiant par spectromtrie de masse les diffrents intermdiaires, il a t possible de construire un schma probable des transformations conduisant des composs aromatiques faciles minraliser. Le principe est donc trs simple. Aprs double hydroxylation du DDE donnant le cis-dihydrodiol, une dshydrognase aromatise nouveau le cycle pour donner un catchol. Une dioxygnase ouvre alors ce dernier en mta :
Cl C Cl Cl C Cl O Cl Cl O COO Cl 4-chlorobenzoate Cl OH COO Cl Cl OH COO C Cl COO
dH
Cl HO OH
dioxygnation mta
Cl O2 Cl
Ce schma conserve une part d'hypothse. Il suggre une formation possible de 4-chlorobenzoate aprs un stade chloroactophnone. Chez un Ralstonia, le DDT peut subir directement une double hydroxylation sans passer par le stade DDE, mais conduit aux mmes produits finaux [46]. Des souches comptentes ont t isoles partir de bactries capables de crotre en prsence de biphnyle. AISLABIE et coll. [47] ont recherch des bactries capables de mtaboliser le DDE en milieu solide recouvert d'une couche glose contenant ce produit. Comme le DDE est peu soluble, il formait un voile superficiel opaque. Le biphnyle tait utilis comme substrat et inducteur. Il tait plac dans le couvercle des botes de Petri et atteignait le milieu de croissance par diffusion dans l'air. Les colonies bactriennes capables d'attaquer le DDE taient faciles reprer car elles s'entouraient d'une zone claire dans le tapis opaque. Terrabacter DDE-1 a t isol ainsi. Cette souche Gram-positive produit partir du DDE une cascade d'intermdiaires, dont le 4-chlorobenzoate. On a ainsi l'impression que le DDT est biodgradable, mais les conditions de son limination une vitesse raisonnable sont rarement ralises dans la nature. Aucune souche ne s'est montre rellement capable de minraliser entirement le DDT comme seule source de carbone dans les conditions de laboratoire, et les transformations s'observent gnralement par comtabolisme ou association de plusieurs espces. On a envisag des alternances d'arobiose et d'anarobiose. En effet des transformations du DDT l'abri de l'air ont t observes l'aide de Proteus vulgaris et Klebsiella pneumoniae placs en conditions dnitrifiantes. Il y a dchloration, rduction et dcarboxylation sur pont carbon entre les deux cycles aromatiques. La figure suivante a pour but d'en donner une ide sommaire. Les ractions de ce schma n'ont pas toutes t caractrises et les renseignements restent fragmentaires. La saga du DDT n'est donc pas termine.

Cl Cl C H Cl H2O HCl H OH C H H Cl CO2 oxyd. COO H H H Cl HCl Cl H C H Cl HCl Cl C H [2 H] Cl C Cl H
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COO
Cl 4-chlorophnylactate
Le DDT en anarobiose
D'autres insecticides organochlors ont t responsables de pollutions considres comme dangereuses, car ils se retrouvaient dans les animaux d'levage et pouvaient se concentrer dans les lipides. Une dchloration rductrice est la premire modification de ces produits dans l'environnement. Parmi ces insecticides sont les cyclodines comme l'Aldrine, utilise autrefois en grande quantit pour la protection des cultures de mas, du coton, ou dans la lutte contre les termites. Son poxydation au niveau du foie et par l'action des moisissures du sol la transforme en Dieldrine. Ces composs atteignent les plantes, contaminent les aliments et prsentent des risques cancrignes. D'autres insecticides de la mme famille sont le Chlordane et l'Heptachlor.
Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl O Aldrine Dieldrine Cl Cl Cl H Cl Cl O aprs dchloration rductrice Cl Cl syn Cl Cl Cl Cl O H Cl anti
La premire dchloration rductrice peut exercer une slectivit illustre par les nantiomres syn et anti aprs enlvement de l'atome de chlore [48]. La dpollution efficace de ces divers pesticides, parfois rpandus en abondance inconsidre, reste le plus souvent problmatique. Ils ont gnralement en commun une grande rmanence et une forte toxicit qui rendent ces produits dangereux pour le btail. Pourquoi a-t-on diversifi la fabrication de ces produits ? l'origine il s'agissait de diversifier les moyens de lutte pour contourner l'apparition d'une rsistance chez les insectes. Le Chlordane a t longtemps utilis pour vaincre les termites. Mais ces armes efficaces se retournent contre nous. La tendance est donc de rserver l'emploi de ces pesticides aux professionnels avertis, ou de les interdire totalement. Mais dans les pays o ils sont interdits, on continue parfois exporter les stocks dans les pays pauvres, ce qui procde tout de mme d'un trs regrettable cynisme.
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La dchloration anarobie des poly-chlorobiphnyles (PCB) a fait l'objet de nombreuses recherches, parce que ces ingrdients sont gnralement trs rcalcitrants en milieu arobie ds que la molcule comporte plus de 2 ou 3 atomes de chlore, comme dans l'Aroclor 1242. L'Aroclor 1260 a plus de 4 atomes de chlore et sa biodgradation n'est connue qu'en anarobiose. La dchloration rductrice enlve progressivement les atomes d'halogne par de l'hydrogne comme source d'lectrons et conduit aux biphnyles mono- et bichlors.
(Cl)n (Cl)n PCB
La transformation de ces produits se poursuit en arobiose. Les dgradations commencent dans les boues des rivires ou dans les sdiments l'abri de l'air, avec des slectivits en gnral compliques, avant que des organismes arobies prennent le relais et russissent une minralisation complte. En rsum, les conditions anarobies semblent les plus efficaces pour liminer les molcules lourdement chlores, et peuvent prparer le terrain une dgradation plus complte. Nous retrouverons les dchlorations rductrices dans le cas d'un polluant clbre, le pentachlorophnol.
13.7 - LE PENTACHLOROPHNOL
Le pentachlorophnol ou PCP est un biocide organochlor largement utilis dans le pass pour la prservation du bois, essentiellement comme fongicide. On l'a employ aussi dans la fabrication du papier, dans la protection des tissus, et comme bactricide. Par sa toxicit et sa rmanence dans le sol et les eaux, il est devenu un polluant majeur avant que son emploi soit maintenant restreint ou mme interdit un peu partout. Les recherches ont montr que des souches bactriennes pouvaient se dvelopper sur PCP comme seule source de carbone et d'nergie. Rcapitulons les diffrentes solutions apportes la dchloration du noyau aromatique : La dshalognation rductrice remplace Cl par H. Elle correspond une attaque lectrophile du noyau, avec rduction du chlore deux lectrons et dpart du chlorure. L'oxygnation remplace le chlore par un hydroxyle dont l'atome d'oxygne provient d'O2. La dshalognation par une halohydrolase remplace le chlore par un hydroxyle, mais l'atome d'oxygne vient de H2O par une substitution nuclophile (arrive de OH, dpart de Cl). Moins "logique" qu'une attaque lectrophile, elle suit un mcanisme plus compliqu faisant intervenir le glutathion. Le chlore est enlev par dsaturation (forme une double liaison) comme dans le cas du Lindane.
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La coupure du cycle aromatique intervient avant que l'halogne soit soustrait en totalit. La biodgradation du PCP est possible avec ou sans oxygne. Le chemin mtabolique a t analys en dtail chez Flavobacterium ATCC 39723, dans un Burkholderia cepacia (ancien Pseudomonas cepacia) et chez des actinomyctes (Rhodococcus chlorophenolicus et Mycobacterium fortuitum) [49]. Le schma indique les trois premires dchlorations arobies du PCP par Flavobacterium et Burkholderia. La PCP-4-mono-oxygnase catalyse la premire raction (1), et conduit la 2,3,5,6-ttra hydroquinone (TeCH). Les deux autres ractions (2 et 3) sont rductrices et engendrent la 2,6-dichlorohydroquinone (DiCH).
OH Cl Cl Cl Cl Cl H2O OH Cl Cl OH 2 e + H+ TeCH Cl Cl Cl OH Cl Cl Cl OH 2 e + H+ TrCH Cl OH Cl
3
Cl OH
O2 Cl + 2 NADPH + H 2 NADP+ PCP
DiCH
Premires dchlorations sur le PCP

La mono-oxygnase initiale de Flavobacterium a t tudie en dtail, son gne pcpB a t clon dans E. coli et squenc [50]. L'enzyme a un double intrt, d'abord d'appartenir la famille des mono-oxygnases du noyau aromatique utilisant le NADPH comme donneur d'lectrons, ensuite d'tre peu spcifique et d'attaquer divers phnols halogns. On observera que la raction consomme 2 NADPH par mole de substrat, la deuxime molcule de rducteur tant ncessaire pour la rduction du chlore en chlorure. Voici quelques phnols attaqus par cette monooxygnase [51]. La substitution par un hydroxyle a lieu en para par rapport la fonction phnol, avec dpart des entits indiques. Le chiffre en gras indique le nombre de moles de NADPH consomm par mole de substrat.
OH Cl Cl H 1 Cl Cl I 2 CN 2 NO2 2 NH2 1 l OH l l OH l Br OH Br Cl OH Cl
sans
CN
NO2
NH2OH
Quelques substrats de la PCP-4-mono-oxygnase

L'enzyme attaque galement le Bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile), un herbicide que Flavobacterium est capable de minraliser entirement [52].
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L encore, l'oxygnase attaque la position para par rapport l'hydroxyle. Il n'y a donc pas dbromation au cours de cette premire raction, mais libration de cyanure. Le Bromoxynil est dgrad par d'autres espces selon un protocole distinct. Pseudomonas putida et Rhodococcus rhodocrous font du 3,5-dibromo-4-hydroxybenzamide par hydratation de la fonction nitrile en amide.
OH Br Br Br OH Br
CN Bromoxynil
OH HCN 2 NADPH+ + H2O
O2 2 NADPH + 2 H+
Attaque du Bromoxynil
Revenons Flavobacterium sur PCP. Les trois premires ractions ont limin chacune un ion chlorure, produisant la 2,6-dichlorohydroquinone (DCHQ). Il n'y a plus que 2 Cl enlever. L'ouverture du cycle par une dioxygnase a lieu ce niveau [53]. Le produit form s'hydrate spontanment en jectant un quatrime ion chlorure. Le dernier atome de chlore en lice saute son tour par une rduction. Une ultime rduction conduit au 3-oxoadipate (3-OA), que nous connaissons bien pour l'avoir rencontr dans la voie ortho du catchol.
OH Cl Cl H+ Cl COO Cl , H+ Cl Cl , H+ COO COO COO COO COO COO O H+ rduction rduction 3-OA
Cl O
OH DCHQ O2 dioxygnation
OH H2O
Vers le 3-oxoadipate
Ceci montre comment un substrat lourdement halogn comme le PCP peut perdre successivement ses 5 atomes de chlore et se voir transformer en un produit aisment mtabolisable comme le 3-OA, source d'actyl-CoA et de succinyl-CoA. L'acquisition d'une voie mtabolique capable de dtruire un xnobiotique comme le PCP a quelque chose de miraculeux. Elle aurait pu avoir plusieurs origines par le jeu de transferts gntiques horizontaux successifs et de recombinaisons (patchwork hypothesis). Des oxygnases prenant pour cible des phnols chlors naturels auraient t recrutes. La deuxime enzyme de la voie du PCP rduisant le TeCH pourrait provenir d'une isomrase appartenant la dgradation de la tyrosine, une filiation vrifiable par les comparaisons de squences [54]. Le Bromoxynil, l'herbicide voqu antrieurement, donne lieu un mtabolisme similaire o le brome remplace le chlore. La biodgradation anarobie du PCP conduit sa minralisation complte dans des cultures bactriennes mixtes non dfinies, o il n'est pas facile d'analyser le rle des diffrents organismes responsables. Le chlore est limin du
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noyau par dshalognations rductrices successives. Dans les boues non exposes pralablement un chlorophnol, la dshalognation du PCP commence gnralement en ortho. Les boues acclimates diffrents chlorophnols exercent une certaine rgioslectivit, c'est--dire un enlvement du chlore des positions prfrentielles du cycle. titre d'exemple, l'attaque du PCP par des boues acclimates l'un des trois phnols monochlors (dsigns par 2-CP, 3-CP,4-CP) dmarre de la faon suivante [55] :
OH Cl Cl Cl Cl Cl Cl OH Cl sur 3-CP Cl Cl Cl PCP OH Cl Cl sur 4-CP Cl OH Cl Cl Cl OH Cl sur 2-CP Cl Cl Cl OH OH
+
Cl Cl
+
Cl Cl Cl
Dchloration du PCP aprs acclimatation sur diffrents chlorophnols (CP)

L'acclimatation des boues sur plusieurs chlorophnols fait apparatre un mlange de produits ayant perdu de un quatre atomes de chlore diffrentes positions, mais conduit des phnols rcalcitrants, les 3,5-, 3,4- 2,4-dichlorophnols, et le 4-chlorophnol. Cependant la minralisation complte du PCP marqu au carbone-14 en mthane et dioxyde de carbone marqus a t observe dans des granules mthanognes [56]. L'opration est lente, ncessite l'apport de sources carbones supplmentaires comme le glucose. Aussi le nettoyage de zones fortement contamines par le PCP, notamment aux Etats-Unis, a-t-il donn lieu des oprations longues et coteuses. Par la suite on s'est aperu que d'excellents rsultats s'obtenaient tout simplement par le compostage (qui implique une certaine aration) et par l'pandage de fumier animal [57] ! De faon gnrale, la dshalognation rductrice s'exerce sur des composs lourdement chlors, ce que nous avions eu l'occasion de remarquer dans le cas de l'hexachlorobenzne et des poly-chlorobiphnyles. Cette question a t le point de dpart d'avances intressantes sur le plan fondamental. Tout d'abord, elle nous a permis d'apprhender la varit des voies et la complexit des adaptations dans les populations microbiennes mixtes. Elle a permis ensuite d'identifier les germes concerns et d'isoler les enzymes responsables. Il est alors devenu vident que diverses espces bactriennes tiraient de l'nergie pour leur croissance en anarobiose partir de la dshalognation des composs polychlors. Nous retrouvons ici le processus appel dshalorespiration. Le PCP et substrats similaires servent donc d'accepteurs d'lectrons dans un mcanisme respiratoire utilisant comme donneurs l'hydrogne, le formiate ou diffrents substrats organiques. Il en rsulte un stockage d'nergie sous forme d'un potentiel de membrane, source potentielle d'ATP [58]. Le cas le plus tudi est celui
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de Desulfomonile tiedjei DCB-1, une souche dj cite parce quelle est capable d'utiliser le 3-chlorobenzoate comme accepteur d'lectrons. Ce sulfato-rducteur peut dshalogner une gamme assez tendue de substrats chlors, parmi lesquels divers polychlorophnols, les benzoates et benzamides monohalogns ! La dshalognation du PCP effectue par D . tiedjei s'exerce surtout sur les deux positions mta, cette proprit tant inductible par le 3-chlorobenzoate. Des analogues de celui-ci sont galement inducteurs, tous substitus en mta. Beaucoup d'inducteurs ne sont pas substrats et rciproquement. La COOH, CH2OH, CONH2 dshalognation peut aussi survenir en ortho et en (OH, NH2 exclus) para.
Cl, Br, I, F, CH3, CF3 (CHO, NH2, CN, OH exclus)
Inducteurs de dshalognaion (D. tiedjei)
La recherche systmatique de souches comptentes dans les boues d'puration a rvl que diverses espces bactriennes pouvaient fonctionner sur un principe analogue. Ces espces ne sont pas toutes sulfato-rductrices, mais comptent des bactries dnitrifiantes. Certaines sont Gram-positives, dont un Clostridium DCB [59] capable de dgrader une large gamme de chlorophnols. Cette souche pourrait combiner la fois une fermentation et une respiration, la premire fournissant l'hydrogne dont la seconde a besoin comme donneur d'lectrons. Contrairement D. tiedjei, DCB est peu active la position mta, enlve au mieux 29 mol de chlorure par heure et par g de protine, contre 54 mol pour la premire. Inversement elle attaque 30 fois plus vite le 2,4,6-trichlorophnol. La souche DCB aurait aussi plusieurs dshalognases induites par des produits diffrents ! Ces quelques lments nous aident comprendre l'tendue du problme, la diversit des solutions rencontres et la richesse des renseignements acquis. L'tude d'un problme pratique pos par l'puration de produits polluants peut conduire comme ici une perce des connaissances fondamentales en bionergtique.
13.8 - CARBAMATES ET PYRTHRODES

Cette section concerne des produits communs. Le terme de carbamate englobe dans la pratique une famille d'insecticides et de fongicides trs utiliss comme les N-mthylcarbamates porteurs d'une fonction hydrolysable carbamique ou ester. Ces composs sont biodgradables et inactivs par hydrolyse, mais prsentent des risques pour l'environnement et la sant par suite de leur emploi intensif et rpt. Ils sont employs comme insecticides systmiques large spectre, les plus connus tant le Carbaryl ou Sevin, et l'Aldicarbe. La fabrication du Carbaryl est l'origine de la terrible catastrophe de Bhopal en Inde, en dcembre 1984, faisant un nombre norme de victimes. L'usine de l'Union Carbide effectuait la synthse de l'isocyanate de mthyle partir du phosgne, et le condensait l'-naphtol. Une ngligence fut l'origine d'une entre d'eau dans une cuve contenant plusieurs dizaines de tonnes d'isocyanate de mthyle, provoquant une explosion librant
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plusieurs gaz, dont l'acide cyanhydrique, lequel fit le plus grand nombre de victimes 8. Ce fut probablement la plus terrible catastrophe industrielle des temps modernes. Assez curieusement, on continue dsigner les installations risque en milieu urbain comme usines "Seveso", faisant rfrence un accident qui n'a fait que trs peu de victimes mais qui a t lorigine dune prise de conscience. En raison de sa solubilit dans l'eau, le Carbaryl est vraisemblablement trs mobile dans les sols. De manire gnrale, la persistance des insecticides du type carbamate est assez faible (moins de 4 mois) du fait de leur mobilit et de leur fragilit aux agents biologiques. Nanmoins le Carbaryl a l'inconvnient d'tre dangereux pour les abeilles. Oxygnations et hydrolyse sont les tapes initiales de l'attaque du Carbaryl par les Aspergillus (1). L'attaque hydrolytique du Carbaryl par les bactries du sol (2) a t dcrite plusieurs reprises depuis 1972, les bactries tudies tant des Arthrobacter, Pseudomonas et Blastobacter [60]. Les champignons Glicladium sont des ectomycorhizes et attaquent le Carbaryl par hydroxylation (3).
H O C N CH3 O H O C N CH2OH O O O C NH2 OH
1 3 O H O C N CH3 2 O H O C N CH3 1
1 OH
OH
OH COO 2 2
OH COO 2 OH CO2 H2O
+
OH OH O -naphtol
carbamates R O C N CH3
salicylate
gentisate
Dgradation du Carbaryl
L'estrase d'un Rhizobium hydrolyse le Carbaryl en -naphtol et mthylamine. L'enzyme a t isole et squence. Son gne cehA, fait partie d'une structure chromosomique qui serait un transposon. Une souche d'Arthrobacter (RC100) peut se dvelopper sur Carbaryl comme seule source de carbone et d'nergie, et minraliser entirement le produit de dpart [61]. Elle contient trois plasmides. L'un d'eux (pRC1) hberge le gne d'une hydrolase qui transforme le Carbaryl en -naphtol. Un second (pRC2) code pour la voie qui conduit au gentisate en passant par le salicylate. La dernire phase est code par des gnes du chromosome. Les bactries dbarrasses des plasmides sous l'action de la mitomycine continuent se dvelopper sur gentisate mais cessent de dgrader le Carbaryl. Leur retour de pRC1 et pRC2 par conjugaison restaure entiremement cette proprit. 8 - La fabrication du Sevin en Inde tait cense venir en aide contre les ravageurs responsables de la famine. Lire le livre de Dominique LAPIERRE et Javier MORO : Il tait minuit cinq Bhopal (ditions ROBERT LAFFONT).
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Ces exemples montrent que le pouvoir de dgrader le pesticide a t acquis au cours de la phase d'acclimatation par introduction d'un transposon et de plasmides. Un autre insecticide systmique de la famille des carbamates est le Carbofuran. Il a t trs utilis comme nmaticide, mais on a commenc s'inquiter au cours des dernires annes sur la contamination des eaux par un usage excessif et sa toxicit sur le personnel. Largement utilis dans les rizires, il a l'inconvnient d'tre toxique pour la microflore utile [62] dont les cyanobactries assimilatrices d'azote. Il est modrment soluble dans l'eau (0,7 g . L1) et sa minralisation complte par Pseudomonas ou Micrococcus a t observe aprs un temps assez long [63]. Les agents actifs sont ventuellement les mmes que ceux qui attaquent le Carbaryl. L'tape la plus facile est comme on pouvait le prvoir l'hydrolyse, le chanon latral tant trs rapidement mtabolis alors que le phnol form et le driv hydroxyl du Carbofuran sont relativement persistants et adhrent aux particules du sol.
O H HO C N CH3 O H O C N CH3 O CH3 CH3
rapide
CO2 O H O C N CH3
OH O CH3 CH3
CH3 CH3
carbofuran
OH 3-hydroxycarbofuran
Attaque du Carbofuran
Un cas intressant est celui d'un mthylotrophe capable de se dvelopper trs rapidement sur Carbofuran et d'autres carbamates (Bendiocarb, Propoxur) comme seule source de carbone et d'azote [64]. La partie mtabolise aprs hydrolyse est la chane latrale, avec persistance de la partie aromatique. L encore, l'acquisition de cette proprit semble due la dissmination d'un plasmide apportant les gnes essentiels. D'autres insecticides sont aussi limins par hydrolyse. Le pyrthre est un insecticide naturel tir de Chrysanthemum cinerariaefolium, peu toxique mais relativement fragile la lumire et d'action assez brve. Il a t amlior par inclusion dans des cyclodextrines*. Divers pyrthrodes de synthse sont rpandus sur le march, notamment la Cypermthrine et la Permthrine. Ils sont plus stables et d'action plus durable. Leur biodgradation complte est ralise par des Bacillus, Pseudomonas et Achromobacter. La figure suivante montre que l'hydrolyse libre deux parties qui sont entirement minralises. D'autres voies mineures n'ont pas t indiques. Ces produits entirement synthtiques sont aurols de leur parent avec des composs naturels et facilement biodgradables. Leur mode d'action est de bloquer le transport des ions sodium dans les cellules nerveuses des insectes et des acariens.
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O O Cl Cl pyrthrine
CN O O Cl Cl
CH2OH
O permthrine
O COOH
COOH CH2OH COOH COOH CI CO2 H2O OH
Cl
Cl CO2 H2O
Cl
Cl
Attaque de la Permthrine
13.9 - HERBICIDES DU GROUPE DES TRIAZINES

Les triazines sont des cycles insaturs caractre aromatique comprenant 3 atomes de carbone et 3 atomes d'azote. Dans les triazines symtriques ou s-triazines, carbone et azote alternent autour du cycle qui est assembl par trimrisation de nitriles en milieu acide.
R1 R1CN R2CN R3CN N R3 N N R2 N H N N atrazine Cl N N H N H N N simazine Cl N N H
s-Triazines
Cette famille de produits contient la Simazine et l'herbicide le plus utilis d'entre eux, l'Atrazine. Leur action large spectre est d'inhiber la chane d'oxydorductions de la photosynthse au niveau du PS II en s'installant au site QB [65]. L'Atrazine entrerait surtout par voie racinaire avant de remonter dans la plante en gagnant les feuilles. Cependant ces produits prsentent de forts effets diffrentiels. Certaines espces vgtales sont intrinsquement plus rsistantes que d'autres et on associe gnralement plusieurs herbicides pour un mme traitement, par exemple la terbuthylazine, efficace sur liseron, chiendent et rumex, associe la Simazine pour dsherber les vignes. L'Atrazine tait indique pour la culture du mas. La raison en est que le mas contient un glucoside spcial capable de neutraliser l'Atrazine en replaant l'atome de chlore par un hydroxyle. Ce glucoside est prsent dans les axes du mas et permet une dtoxification spontane. Une fois dans les feuilles, l'Atrazine est hydroxyle en 2, avec dpart de chlorure, l'aide d'une
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enzyme fonctionnant avec du glutathion. Ces actions s'avrent efficaces puisque les neuf diximes de l'Atrazine prsente dans la plante sont neutraliss au bout de quelques heures. Par contre ces dfenses n'existent pas chez d'autres plantes comme l'avoine. On voit donc pourquoi l'Atrazine a t utilise massivement dans les rgions productrices de mas, notamment aux Etats-Unis. En France, au moins 90% des surfaces cultives en mas au cours de l'anne 2000, soit plus de 2 millions d'hectares, avaient reu de l'Atrazine. La consommation annuelle, en baisse, tait de 750 g d'herbicide par hectare. Son usage avait t interdit en 1997 pour des usages autres qu'agricoles. Malheureusement l'Atrazine n'est pas un produit dnu de risque. Souvent rpandue un peu trop gnreusement par les cultivateurs, elle est facilement entrane dans le sol malgr sa faible solubilit (33 mg . L1), et vient souvent contaminer les nappes phratiques. On lui prfre parfois la simazine, moins soluble (6 mg . L1) et plus facilement retenue dans les couches superficielles du sol. Ces herbicides ne sont limins qu'assez lentement. La toxicit de lAtrazine reste modre (LD50 de 670 mg . kg1 chez le rat), mais suffisamment proccupante pour la sant en cas de contamination de l'eau et des animaux, bien qu'elle soit dclare non cancrigne. L'interdiction d'emploi de l'Atrazine et de la Simazine a t dcide en France en Septembre 2002. L'Atrazine et les composs homologues utiliss comme herbicides sont lentement biodgradables. La plupart des tudes ont port sur l'Atrazine et ont mis en vidence l'intervention des bactries et de certains champignons (Penicillium, Fusarium roseum, Aspergillus niger). Il y a deux stratgies principales. La premire dbute par l'action d'une chlorohydrolase, qui remplace le chlore par un hydroxyle (Pseudomonas souche ADP, Ralstonia, Clavibacter, Agrobacterium ). La seconde part d'une mono-oxygnation (Rhodococcus, Pseudomonas, Streptomyces). La premire voie est lance par une chlorohydrolase. Le mtabolisme se poursuit par l'enlvement successif des deux chanes latrales. La deuxime voie inverse les tapes : l'attaque commence par une mono-oxygnation sur chane latrale avant remplacement du chlore. La figure montre la premire voie :
Cl N N H N atrazine N A N H N H N N H Cl N OH N B N H N H2O OH C N HO OH N thylamine N O N
isopropylamine NH3 + CO2 NH2 E O NH2 NH2 N H O CO2
O NH3 + CO2 F H2N
OH N acide H2O cyanurique
A - Atrazine chlorohydrolase B - Hydroxy-Atrazine thylaminohydrolase C - N-isopropylammelide isopropylaminohydrolase
D - Acide cyanurique amidohydrolase E - Biuret amidohydrolase F - Urase
Dgradation de l'atrazine par Pseudomonas sp.
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La premire raction de cette succession connue depuis 1993 est catalyse par l'Atrazine chlorohydrolase (AtzA), qui enlve l'halogne et suffit inactiver le pouvoir herbicide. Son rle est donc essentiel. La protine a t purifie et montre une spcificit qui s'tend plusieurs substrats voisins de l'Atrazine dont un analogue fluor [66]. Il a t dmontr que la raction tait purement hydrolytique [67]. Les deux ractions suivantes, catalyses par AtzB et AtzC, conduisent l'acide cyanurique, que maintes bactries du sol savent dgrader par les ractions D, E et F. La dernire raction est celle de l'urase, une enzyme trs anciennement connue dont une particularit est de contenir du nickel. Les trois protines AtzA, AtzB et AtzC sont codes par un plasmide. On a eu la surprise de constater qu'elles prsentent des ressemblances de squences entre elles, et avec d'autres hydrolases porteuses d'ions mtalliques : dihydro-orotase, adnine dsaminase, cytosine dsaminase. Une squence ancestrale commune serait l'origine d'une vaste famille de protines o figurent des enzymes du mtabolisme des bases nucliques. L'alignement des squences de AtzC (l'aminohydrolase catalysant l'tape C sur notre tableau) et CodA, la cytosine dsaminase du colibacille, montre dans certaines zones une correspondance troublante. Les motifs histidine (H) et la paire HxH (petites flches sur la figure) sont considrs comme site d'attachement d'un mtal.
AtzC 56
64
206
217
244
303
FV DA H T H M D LA KE YD VD ID Y H RVT T SH D NIR D F W V P F G FV RP H I H L D LA QK YD RL ID V H RVT A SH D DVF D P W V P L G 57 CodA 65 203 214 241 313
Toutes les protines de cette famille fixent facilement un mtal, et plusieurs d'entre elles ont un noyau bi-mtallique. La cytosine dsaminase, par exemple, peut lier du zinc, du cobalt, du manganse, et son maximum d'activation sobtient avec du fer. Dans le cas de AtzC, le fer ou le cobalt sont des activateurs, mais le vritable mtal prsent dans le site actif serait le zinc [68]. Cet exemple montre pourquoi les comparaisons de squences suggrent que AtzA, AtzB et AtzC sont des mtallo-enzymes, avant mme que les mtaux aient t caractriss dans les protines purifies. Le plus curieux est l'apparente banalit des gnes homologues de atzA , atzB et atzC dans la nature, si on en crot une recherche systmatique faite par sondes nucliques et amplification PCR. En fait les protines Atz font partie de la superfamille des amidohydrolases reprsente chez tous les tres vivants, catalysant l'hydrolyse des amides et de la liaison CN des amines. Ces enzymes se rencontrent dans le mtabolisme de l'histidine, des bases des acides nucliques et de l'ure. On constate une fois de plus que la nature parat avoir adapt et diversifi des formulations de base permettant la digestion de nouvelles substances, et c'est finalement heureux pour nous. Cette possibilit est confirme par la facilit avec laquelle on peut slectionner des mutants munis d'une chlorohydrolase amliore, susceptibles dapplications intressantes en station d'puration [69]. L'Atrazine n'est certainement pas la seule cible de AtzA. Ainsi Clavibacter michiganese possde une AtzA travaillant comme chlorohydrolase sur plusieurs analogues de l'Atrazine, le chlore tant remplac par un groupe cyano (cyano-Atrazine),
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azido (azido-Atrazine), OCH3 (Atratone), SCH3 (Ametryne), ou encore par des chanes latrales diffrentes (propazine, terbutylazine). Toutes les bactries ne sont pas armes pour mtaboliser entirement l'Atrazine. Cet objectif est atteint ventuellement par des associations d'espces amenant chacune un ou deux gnes participant aux transformations. Les associations microbiennes ont comme d'habitude un rle essentiel dans la nature pour dtruire des substrats hors norme, et chaque espce participante apporte son savoir faire chimique. La deuxime voie de dgradation de l'Atrazine, qui commence par l'action d'une mono-oxygnase, diffre de la prcdente dans son principe. L'attaque commence par l'ablation des chanes carbones latrales, suivie de la dsamination du noyau et de l'limination ultrieure du chlore. Le rsultat est encore l'acide cyanurique qui est facilement limin par les bactries du sol. Les chanes latrales sont-elles alors attaques par une hydrolase ? Pas exactement puisque leur enlvement se fait par mono-oxygnase. Une hydrolase couperait la chane latrale au ras du cycle triazine, laissant un hydroxyle et faisant partir l'azote sous forme d'amine. Ici l'azote reste en place, la partie qui s'limine est un aldhyde ou une ctone, comme l'indique le schma :
Cl N N H N atrazine O2 NADH H+ N H2O NAD+ N H N H N NH2 Cl O2 NADH H+ N H2O NAD+ H2N N H N NH2 N N H O H C CH3 Cl H3C C H3C O
Atrazine mono-oxygnase
Ces oxygnations se rencontrent chez des Pseudomonas, Streptomyces et divers actinomyctes [70]. Une mono-oxygnase active sur Atrazine a t identifie chez un Rhodococcus comme un cytochrome P450 peu spcifique cod par un plasmide, qui dtermine aussi la dgradation des thiocarbamates [71]. Cette enzyme fonctionne avec la participation d'une rductase et d'une ferrdoxine [2Fe-2S]. Les Rhodococcus sont des germes intressants par la diversit de leurs actions dpolluantes sur les hydrocarbures, les haloaromatiques, les pesticides et les herbicides En outre ces bactries sont relativement peu sensibles la rpression catabolique*, ce qui leur permet de continuer fabriquer des enzymes de dgradation tout en se dveloppant sur une source carbone du type glucose. Une facilit trs importante sur le plan pratique comme on le sait. La dgradation de l'Atrazine par mono-oxygnation peut se poursuivre par dchloration et dsamination. La figure montre l'intermdiaire dsalkyl ou disopropyl-dsthyl-Atrazine (DIEA) :

Cl N NH3 Cl N H2N N N H DIEA NH2 H2O Cl H+ H2N Cl N N H N H2O NH2 HO H2O HO N H N NH2 H2O Cl H+ Cl N N
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OH N H acide cyanurique
NH3
L'Atrazine est-elle limine en anarobiose ? Une observation rcente permet de rpondre par l'affirmative, l'aide d'un organisme non identifi fix sur colonne [72]. Les conditions taient celles de la dnitrification, dmontre par la production de N2 marqu l'azote-15 partir de 15NO3. L'Atrazine marque au carbone-14 tait l'origine de CO2 radioactif. La dcontamination simultane du nitrate et de l'herbicide dans une eau d'origine agricole est donc possible.
13.10 - ANILIDES ET ANALOGUES

Les anilides sont des drivs N-acyls de l'aniline (aminobenzne), sans autre substituant sur le noyau aromatique. D'autres produits leur sont apparents et ont un noyau porteur d'atomes de chlore ou d'autres lments. Ces herbicides agissent sur la photosynthse ou remplacent des auxines, avec divers effets slectifs. Leurs cibles les plus nombreuses sont des plantes larges feuilles ainsi que les gramines. Les problmes environnementaux viennent de leur rmanence dans le sol et des transformations en composs toxiques qui rappellent les dioxines. Voici des exemples, dont le Propanil et le Propanochlor. Les noms chimiques exacts sont en note 9 :
O H5C2 C NH H3C HC H7C3 O C NH H3C H3C O N C NH H3C HC O O C NH
Cl Cl Propanil CH3 Pentanochlor
Cl CH3 Chlorotoluron
Cl Naproanilide
Herbicides drivs d'anilides

9 - De g. dr. : 3'4'-dichloropropananilide, 3'-chloro-2,4'-dimthylpentananilide, 3-(3-chloro-4-mthylphnyl)1,1dimthylure, 2-(2-naphtyloxy)-N-phnylpropanamide.
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Tous sauf le Chlorotoluron sont photosensibles et transforms en composs inactifs. Nous n'voquerons que leurs transformations biologiques. Ces produits sont utiliss pour le dsherbage dans les cultures de riz (Propanil, Naproanilide), des cultures marachres (Pentanochlor), et du bl d'hiver (Chlorotoluron), en particulier contre la gramine Alopecurus myosuroides ou encore la folle-avoine (Avena fatua). Chose intressante, ces herbicides sont mtaboliss par les plantes aprs avoir t absorbs par les feuilles ou les racines, et l'intensit des modifications serait en grande partie responsable de la slectivit de ces produits. La multiplicit de ces prparations chimiques s'explique par les tentatives de contrer les mauvaises herbes sans nuire aux cultures. Que le mtabolisme de ces herbicides soit pratiqu par des plantes ou des bactries du sol, il commence par une hydrolyse de la liaison amidique l'aide d'une amidase.
CH3 O CH COO NPA
Le Naproanilide est un cas particulier : ce compos est inactif par lui-mme comme herbicide, mais son hydrolyse libre l'acide 2-(2-naphtoxy)propionique (NPA) qui est le vritable herbicide. Son action est celle d'une auxine et ne porte pas sur la photosynthse. La dtection des produits intermdiaires se fait gnralement l'aide de substrat marqu. On a peu de renseignements sur les ractions individuelles. Voici par exemple quelques transformations observes dans les plantules de riz. Une partie de la radioactivit se retrouve dans un glucoside et dans la lignine, par liaison avec la 3,4-dichloroaniline.
O OH O NH C C2H5 Cl Cl Cl propanil Cl acide propionique Cl Cl liaison avec la lignine NH C CCH3 H acide lactique NH2
conjugaison au glucose
Attaque du Propanil chez le riz

La transformation de l'herbicide par les vgtaux offre un cadre assez favorable son emploi, ce qui explique son usage trs rpandu pour la culture du riz. En outre, le produit s'hydrolyse assez vite en milieu aqueux pour librer la 3,4-dichoroaniline. Celle-ci est assez mobile, facilement entrane par l'eau, mais elle a la proprit de se fixer sur les particules d'humus du sol, o elle peut persister assez longtemps.

NH2
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H N
entranement
Cl Cl oxydation
humus N Cl CI CO2 H2O Cl N
Cl Cl
Cl Cl 3,4-dichloroaniline
biodgradation
Le produit d'hydrolyse du Propanil a le grave inconvnient de s'oxyder en ttrachloro-azobenzne, un compos trs toxique rappelant les dioxines, avec un pouvoir cancrigne et un risque de troubles anmiques chez les personnes exposes. Sa biodgradation complte a t observe l'aide des micro-organismes du sol, bactries (Pseudomonas) ou champignons (Fusarium). L'aniline et les chloroanilines 10 sont des polluants industriels qui ont la proprit de se lier aux groupes quinoniques de l'humus. Une dioxygnation de l'aniline la transforme en catchol aprs dsamination et dpart d'ammoniac. L'limination des chloroanilines est plus lente mais possible. Il y a deux mcanismes de base. Le premier est une rduction anarobie en conditions dnitrifiantes qui remplacent la fonction amine par un atome d'hydrogne. Ainsi un Rhodococcus a t vu transformer la 3,4-dichloroaniline en 1,2-dichlorobenzne [73]. La seconde se fait en prsence d'oxygne par une dioxygnation. Un certain nombre de drivs halogns et mthyls de l'aniline sont convertis en un catchol qu'un Moraxella mtabolise par la voie ortho [74]. La 2-chloroaniline est ainsi minralise par Pseudomonas acidovorans [75]. L'intervention d'une dgradation de l'aniline et de ses divers drivs par la voie mta est galement possible chez un Pseudomonas. Elle se traduit par l'induction d'une catchol 2,3-dioxygnase [76]. Les nombreuses tudes ralises suggrent que la majorit de ces produits sont exposs l'action microbienne.
13.11 - SULFATES - SULFONATES

Les sulfates sont des esters de l'acide sulfurique, caractriss par l'enchanement COS et la structure ROSO3H . Dans les sulfones, le soufre est directement li au carbone comme dans RSO3H. Ces deux catgories renferment de nombreux produits naturels qui reprsentent la part prdominante du soufre dans les sols. Dans le rgne animal existent des ester-sulfates varis parmi les glycosaminoglycanes et d'importants constituants des tissus conjonctifs. Des sulfones remarquables sont le coenzyme M (HSCH2CH2SO3H) de la mthanognse, et chez les mammifres la taurine (H2NCH2CH2SO3H) ne de la L-cystine par oxydation et dcarboxylation. Le mthane-sulfonate est engendr partir du dimthyl-sulfure des algues marines. Les plantes ne sont pas en reste, car les sulfonolipides sont des constituants importants des membranes o s'effectue la photosynthse : ils sont
10 - Parmi les principaux usages de l'aniline et de ses drivs chlors est la production des isocyanates et des urthanes. On les utilise aussi dans l'industrie du caoutchouc, dans la fabrication des colorants.
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probablement les sulfonates les plus importants de la biosphre. On pense que beaucoup de sulfonates du sol sont engendrs par addition de sulfure sur des liaisons carbone-carbone insatures. L'humus, d'une grande diversit de structure et de composition, est le sige d'une chimie complexe o les sulfonations et dsulfonations alternent sous l'empire des micro-organismes. L'industrie ajoute l'environnement des sulfates et sulfones sous la forme de dtergents, colorants, additifs et intermdiaires varis. Exemples de dtergent : le sodium dodcylsulfate (SDS) et les alkylbenzne sulfonates linaires (LAS). Le tolune-sulfonate est trs rpandu comme agent solubilisant.
H3 C (CH2)k C12H55SO3 , Na SDS
+
HSO3 LAS (CH2)J H3C
HSO3
CH3
Tolune-sulfonate
Les populations microbiennes sont gnralement bien armes pour hydrolyser ces composs, considrs le plus souvent comme n'offrant pas de risque majeur condition que le reste de la molcule soit lui-mme facilement dgradable. C'est pourquoi les LAS, largement utiliss dans les produits mnagers depuis une quarantaine d'annes, ont remplac des produits contenant une chane aliphatique ramifie, plus rcalcitrante. La dtection des LAS dans les cours d'eau, lorsque la chane droite possde 10 12 atomes de carbone, est un indicateur commode des pandages domestiques. L'assimilation du sulfate par les bactries est soumise une rgulation qui a pour effet d'induire diverses protines appeles SSI (sulfate starvation-induced) destines faire face une carence en soufre. Chez le colibacille et Pseudomonas aeruginosa, les gnes concerns font partie d'un rgulon plac sous la dpendance de CysB, et rglant la synthse de la L-cystine [77]. On relve parmi ces protines divers composants de transport, des sulfatases et des sulfonatases. Les sulfatases (EC 3.1.6.x) sont trs rpandues dans la nature. Les mieux connues sont les arylsulfatases actives par exemple sur les LAS et isoles partir du colibacille, de Pseudomonas, de Klebsiella, des mycobactries 11, de cyanobactries et autres germes [78]. Voici les particularits les plus intressantes. Ces enzymes sont souvent prsentes sous des formes multiples (isoenzymes), tantt priplasmiques (Klebsiella ), tantt intracellulaires. Elles ont toutes une squence consensus (C ou S)xPxRx4TG. Une modification secondaire ncessaire l'activit oxyde la cystine ou la srine dans ce consensus et fait apparatre la formylglycine (Fgly) comme l'explique la figure suivante.
11 - Base d'un test d'identification pour le genre Mycobacterium.

SH H S H O OH
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Cys 2 H+ + 2 e H2O H2S
FGly 2 H+ + 2 e
Ser
Modification secondaire de Cys ou Ser

Les cellules humaines contiennent des sulfatases au niveau de leurs lysosomes. Une maladie hrditaire rare, ou MSD (multiple sulfatase deficiency), s'accompagne de la disparition de ces sulfatases et de troubles varis (surdit, malformations osseuses, hypertrophie de la rate et du foie, et anomalies de la peau). On a pour cela une explication : le dfaut ne rside pas au niveau des gnes de sulfatase, mais au niveau du mcanisme qui effectue la modification secondaire en Fgly. Le mcanisme des arylsulfatases implique la formation d'un intermdiaire covalent, expliqu par le schma [79] :
H O + H2O FGly H2O O HO H O S O O O O
HO
OH
S O
SO42
HO
Mcanisme d'une sulfatase

Les gnes contrlant la synthse des sulfatases et enzymes d'activation sont rprims par le sulfate et induits par la prsence de mthionine ou de sulfates organiques. Ils font figure de mcanisme de secours en cas de carence de sulfate assimilable. Les alkylsulfatases, comme celle qui hydrolyse le SDS chez Bacillus cereus [80], oprent de faon diffrente. La liaison rompue n'est pas OS, mais la liaison carbone-oxygne sans passage par un stade covalent. La modification gnratrice de Fgly est absente. La dgradation des alkylsulfonates diffre de celle des arylsulfonates par le mcanisme. Vu l'abondance dans l'environnement de sulfonates naturels ou artificiels, il n'est pas tonnant que les souches bactriennes capables de les dgrader soient banales. Les premires tudes se sont consacres la dsulfonation de la taurine, pratique par E. coli et diverses entrobactries, mais ce cas de figure n'est pas entirement reprsentatif. L'examen gntique montre que le colibacille a deux oprons distincts impliqus dans les dsulfonations. Le premier, tauABCD, concerne la taurine. Le second, ssuEADCB, dirige la dsulfonation des substrats aliphatiques. Ces deux systmes diffrent par leurs composants et les modes opratoires.
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Sur taurine tauA Sur alkylsulfonates ssuE Symboles protine priplasmique de liaison protine liant l'ATP ssuA ssuD tauB tauC
tauD ssuC ssuB
permase oxygnase (mono- ou di-) rductase FMN
Oprons de dsulfonation chez Escherichia coli

Le premier mode est catalys par TauD, une dioxygnase active par Fe2+, dont la particularit est d'oxyder le 2-oxoglutarate (2-OG) en mme temps que la taurine [81]. Celle-ci est transforme en intermdiaire instable qui se dcompose en amino-actaldhyde et sulfite. La taurine peut aussi servir de source de carbone par une voie lgrement diffrente. Son mtabolisme est rsum par une figure :
HOOC O H2N SO3H taurine 2-OG O2 TauD H2N OH H OC actate sulfite SO3H COOH HOOC COOH + CO2 succinate O H
oxydation ou transamination
H2N
SO3H
Dgradation de la taurine
Le deuxime mcanisme est celui des alkane-sulfonates longue chane. Il fait appel une mono-oxygnase (SsuD) associe une NAD(P)H rductase (SsuE) [82]. L'oxygnase est flavinique mais appartient un type particulier, car la flavine n'y est pas loge demeure comme dans la 4-hydroxybenzoate hydroxylase. La rductase transforme FMN en FMNH2 reconnu comme substrat par l'oxygnase sur un principe rpandu chez les Pseudomonas. Il s'observe aussi dans la dsulfonation du benzne-sulfonate. La mme famille d'oxygnases renferme des enzymes actives sur des complexants tels que l'EDTA et le nitrilotriactate. Toutes les espces concernes ont un transporteur de type ABC pour faire entrer le substrat dans la cellule.
OH NAD(P)H rductase NAD(P)+ FMNH2 FMN O2 R CH2 SO3H R CH SO3H R CHO + SO32
Mono-oxygnase FMN
Cette question a son prolongement dans la dsulfuration des hydrocarbures ptroliers, parce qu'elle met en jeu des enzymes similaires SsuD. Le soufre est abondant dans le ptrole brut et peut reprsenter jusqu' 5% du total en masse.
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La majeure partie, soit au moins 60%, est loge dans le dibenzothiophne et ses drivs. Au cours de la combution des hydrocarbures, le soufre est converti en oxydes corrosifs qui retournent au sol par les pluies acides. De gros efforts ont t dploys pour obtenir une dsulfuration par voie biologique. Elle est possible grce l'action bactrienne, des Pseudomonas et d'espces Gram-positives. Les premiers tendent attaquer les noyaux benzniques par dioxygnation puis ouverture du cycle en mta selon le principe que nous connaissons. Les seconds exercent des mono-oxygnations qui conduisent liminer le soufre avant attaque des cycles aromatiques. Le schma reprsente ici le dbut de l'attaque par Rhodococcus erythropolis, qui est reprsentatif des germes capables de se multiplier par comtabolisme avec le dibenzothiophne .
S DszA O2 FMNH2 O S O DszC OH SO2H DszB
DBT
O2 FMNH2
OH
Dsulfuration du dibenzonthiophne (DBT)

Les trois tapes [83] sont codes par l'opron plasmidique dszABC, DszA et DszC tant des mono-oxygnases FMNH2, DszB une dsulfinase. L'opron est soumis rpression par la cystine, le sulfate et la mthionine, ce qui montre que le substrat est trait par les bactries comme une source de soufre. Le 2-hydroxybiphnyle form est potentiellement biodgradable par bactries. Les composs organosoufrs sont aussi dgrads en anarobiose, mais le mcanisme est mal connu et diffre de ceux que nous avons rencontrs avec les Pseudomonas et consorts. Clostridium pasteurianum dsulfurise le tolune-sulfonate, et C. beijerincki s'en sert comme seule source de soufre [84]. Les sulfonates peuvent aussi servir de donneurs d'lectrons au cours de la dnitrification pratique par un Alcaligenes et Paracoccus denitrificans [85]. Les formes nouvellement isoles comme capables de dsulfurer ces substrats appartiennent souvent des espces non dcrites et l'exploration de cette question ncessitera encore beaucoup de travail [86]. Nous voyons en conclusion que la dgradation des sulfates et sulfonates s'intgre facilement aux cycles naturels dont celui du soufre. Leur recyclage s'effectue par voies arobies et anarobies, les premires tant de loin les mieux connues.
13.12 - LES PEROXYDASES, UNE ARME ABSOLUE ?

La biodgradation d'une foule de substances est souvent rendue difficile cause des contraintes exerces sur les enzymes concernes lorsqu'elles sont spcifiques dune gamme trs limite de substrats, voire dun seul. Cependant les exceptions ne manquent pas. Citons les cytochromes P450, diverses mono- et dioxygnases,
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ou encore des hydrolases. Les peroxydases occupent une place part. Ces enzymes ubiquistes utilisent le peroxyde dhydrogne (ou eau oxygne, H2O2) comme agent doxydation, et leur action s'exerce sur une grande varit de cibles. La plupart sont des protines hminiques dorigine vgtale, mais existent aussi dans les bactries, certains champignons et dans les tissus animaux. Les phnols et amines aromatiques figurent parmi leurs nombreux substrats, ainsi que le NADH, le cytochrome c rduit, lion chlorure (myloperoxydase leucocytaire). Des peroxydases vanadium totalement distinctes des prcdentes sont connues depuis plus de vingt ans [87] et sont spcialises dans loxydation des ions halognure. On les rencontre chez des algues, champignons et lichens. Lintrt des peroxydases vient de leurs normes potentialits, aussi bien dans des cycles naturels fondamentaux que dans le recyclage des contaminants de lenvironnement. Les peroxydases hminiques se rpartissent en trois groupes : la classe I est celle des enzymes dorigine procaryotique 12, la classe II est celle des peroxydases fongiques attaquant la lignine, et la classe III correspond aux peroxydases scrtes par les plantes suprieures. Le principe de base est le suivant : lenzyme commence par soxyder avec H2O2 en perdant deux lectrons quil rcupre un un en oxydant chaque fois une molcule de substrat. Le rsultat est alors lapparition de radicaux, qui ragissent deux deux ou avec dautres radicaux. Ceci est expliqu par le schma ractionnel dune peroxydase (POD), o AH2 dsigne le substrat avant oxydation : POD + H2O2 Complexe I + AH2 Complexe II + AH + H . . AH + AH HAAH Complexe II + H2O2 .
+
Complexe I Complexe II + AH + H+ . POD + AH + H2O Complexe III (inactif) + H2O .
(1) (2) (3) (4) (5)
Seules les ractions (1) (4) font partie du cycle catalytique normal. La raction (4) est une dimrisation du radical. Le compos I rsulte donc dune oxydation de lenzyme deux lectrons, et devient lui-mme un oxydant trs puissant. De faon gnrale une peroxydase fait des oxydations lectron par lectron partir du compos I, et engendre des produits polymriss dont le spectre dabsorption est dplac vers le spectre visible. Les ractions colores sont nombreuses en fonction des divers substrats et facilitent le dosage de ces enzymes. Ltape (2) voit un lectron prlev sur le substrat, qui est transform en radical, au profit de lenzyme qui devient le complexe II 13. Enfin une deuxime molcule de substrat est oxyde (3) avec retour la POD de dpart. Le principe est rsum par quelques schmas.
12 - Bactries, chloroplastes, cytochrome c peroxydase, ascorbate peroxydase du cytosol, glutathion peroxydase. 13 - Les complexes I, II et III sont dsigns ainsi comme dans la littrature. Les chiffres romains n'ont rien voir avec les tats d'oxydation du mtal, Fe(II), Fe(III), Fe(IV).
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Phe
His HO O III Arg
His
Le fer dans la peroxydase

Au dpart, la molcule de H2O2 ionise en HO2 se lie au fer en sixime position du ct oppos l'histidine. La liaison OO est ensuite scinde par des rsidus darginine et dhistidine, ce qui libre une molcule deau.La premire tape (1) est loxydation de lenzyme en compos I, o le fer ferrique Fe(III) est oxyd en Fe(IV) avec formation dun radical dlocalis entre la porphyrine et des acides amins de la protine. Un lectron est rcupr sur le substrat au cours du passage au compos II. Une deuxime molcule de substrat permet le retour l'tat initial.
O Fe(III) H H O O H H O O Fe(IV)
POD AH H H O AH2 H+
Fe(IV)
AH2 AH H+
compos I
compos II
Cycle d'une proxydase hminique

La raction (5) est une voie secondaire abortive, conduisant linactivation de lenzyme. Comme elle part du compos II, cette inactivation par leau oxygne seffectue seulement en prsence dun substrat, mais elle est plus ou moins rversible en fonction de la nature de celui-ci.
O Fe(IV) H H O O O O Fe(III) O O Fe(II)
compos II
H H O
compos III
Le Compos III
Ce phnomne est important dans la pratique. Le compos III quivaut une molcule d'enzyme qui aurait fix du superoxyde dont la charge est dlocalise. La structure est celle dune peroxydase dont le mtal aurait t rduit en Fe(II), et qui
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aurait fix de loxygne diatomique. Ces mcanismes sont connus depuis longtemps dans le cas de la catalase. Celle-ci forme aussi un compos I qui oxyde une deuxime molcule de peroxyde et rgnre lenzyme de dpart par l'oxydorduction 2 lectrons, pouvant s'crire : H2O2 + H2O2 O2 + 2 H2O. Une tape intermdiaire est possible et fait voluer le compos II en compos III inactif. En somme une catalase est une peroxydase particulire dont le substrat oxyder est leau oxygne. On sait que les catalases servent denzymes de dfense contre les peroxydes engendrs par les oxydases flaviniques. Les peroxydases sont aussi des enzymes de dfense, et chez lhomme la glutathion peroxydase est un agent important de llimination des peroxydes. Les peroxydases et les catalases ont souvent des mcanismes protecteurs qui tendent minimiser leur inactivation en compos III. On connat la structure dtaille d'un certain nombre de peroxydases, dont les plus connues sont la peroxydase du raifort (horseradish peroxidase) [88], la glutathion peroxydase animale, les lignine peroxydases fongiques LiP et MnP, et une enzyme propre la levure qui est la cytochrome c peroxydase [89]. Les catalases les mieux connues sont celles du foie bovin et de Proteus mirabilis [90]. L'tude physique montre clairement que le radical du compos I n'est pas concentr sur la porphyrine mais passe sur un acide amin voisin, tryptophane ou tyrosine, partir duquel seffectue une chane d'changes de radicaux qui gagne la surface par d'autres acides amins. Par son Fe(IV) et sa nature radicalaire, le compos I est donc un oxydant puissant particulirement efficace pour de nombreux substrats faible masse molculaire susceptibles dentrer dans le site actif. Le compos II peut prendre la relve. Sa ractivit est parfois presque quivalente celle du compos I, gnralement un peu infrieure, jamais plus leve. L'eau oxygne ncessaire l'activit des peroxydases provient des oxydases flaviniques, et chez les plantes de l'oxydation de NADPH avec O2, stimule par des phnols et les ions manganse. Le rle des peroxydases dans le rgne vgtal est considrable. L'archtype de ces enzymes est certainement la peroxydase du raifort sur laquelle existe une abondante littrature. Chaque espce fabrique plusieurs isoformes (ou isoenzymes) intra- et extracellulaires. Laction des peroxydases est prdominante dans la lignification, la subrisation, le renforcement des parois cellulaires, les mcanismes de dfense et le contrle des actions hormonales (auxines, gibbrellines). La fonction physiologique des peroxydases chez les champignons nest pas toujours bien cerne, mais elles doivent jouer un rle dans la conqute du milieu environnant et linvasion des dchets organiques. Les haloperoxydases mritent une mention spciale : elles synthtisent une liaison carbone-halogne dans des cibles organiques. La chloroperoxydase de Caldariomyces fumago est hminique tandis que d'autres fonctionnent avec du vanadium. Les haloperoxydases vanadium sont bien reprsentes dans les algues marines, mais se rencontrent aussi chez les lichens et champignons. Ces enzymes lient l'ion vanadate (VO43) comme cofacteur. Celui-ci ne change pas d'tat d'oxydorduction pendant le cycle catalytique, mais agit comme acide de LEWIS. Contrairement aux peroxydases hminiques, ces enzymes sont stables en prsence d'un taux lev de H2O2. Leur mcanisme gnral implique une oxydation deux lectrons de l'halognure en acide hypohalogneux HOX fix ou non l'enzyme, ragissant avec une grande varit de substrats nuclophiles AH.
13 HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS H2O2 + X + H+ + enzyme enzyme-HOX HOX + AH AX + H2O enzyme-HOX + H2O
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enzyme + HOX
Des ractions secondaires sont observes. En absence de substrat halognable, la bromoperoxydase en prsence de bromure catalyse la dismutation de l'eau oxygne en oxygne et eau. Un courant de recherche important a t entrepris sur les proprits et la structure des haloperoxydases. L'application des haloperoxydases vanadium dans les ractions d'halognation industrielle est en ligne de mire, d'autant plus que ces enzymes prsentent une stabilit bien meilleure que les peroxydases hminiques. Cependant les applications sont freines par le cot d'isolement de ces enzymes. Parmi les plus tudies sont les bromoperoxydases de l'algue marine Ascophyllum nodosum et de Xanthoria parietina, un lichen terrestre de couleur rouge-orang. Citons aussi la chloroperoxydase du champignon Curvularia inaequalis, dont la structure dtaille a t rsolue [91]. La fonction biologique des peroxydases vanadium est probablement multiple. Les variations de leur production indique un lien avec les phnomnes de stress. Ces enzymes produisent de l'acide hypochloreux ou hypobromeux agissant vraisemblablement comme bactricide. Un autre effet, chez les champignons, est l'attaque des parois vgtales par oxydation, donnant accs la cellulose et hmicelluloses. Enfin la production de composs halogns ayant la valeur d'antibiotiques est un facteur de dfense tout fait probable. Les peroxydases ont t inventes dans la nature la fois pour recycler la matire organique de manire expditive et pour introduire des ions halognure dans une varit d'accepteurs. Nous sommes loin des enzymes banales qui ne transforment qu'une gamme limite de substrats, parfois un seul. Les peroxydases rendent possible llimination de certains xnobiotiques par une action qui est peut-tre accidentelle. Les peroxydases ont dans l'environnement une fonction d'une importance norme, qui dpasse le cadre de cet ouvrage et qui concerne le cycle du bois. Les plantes continentales utilisent des peroxydases pour synthtiser la lignine, rsine de constitution complexe et variable qui entre dans le bois pour une proportion pouvant dpasser 30%. La matire ligneuse reprsente une masse colossale d'un matriau assez rcalcitrant dans la biosphre, contrairement la cellulose et aux hmi-celluloses qui sont assez rapidement consommes. La lignine est lentement dgrade en produits aromatiques simples par des peroxydases produites par des champignons, l'acteur le plus clbre tant le Phanerochaete chrysosporium de la pourriture blanche du bois (white-rot). Ces peroxydases sont principalement LiP et MnP. La seconde fonctionne l'aide de manganse. Les peroxydases sont assistes par des laccases*. Notre environnement se pollue donc tout seul par une masse colossale de dchets sous forme de bois mort, mais il dispose des outils pour y remdier. Cette situation nous sauve de nos propres pollutions par maints produits de notre industrie, parce que les bactries habitues faire disparatre les petites molcules issues de la fragmentation de la lignine se sont adaptes consommer des substrats diffrents qui leur ressemblent sur le plan chimique.
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Les catalases sont prsentes dans la majorit des espces bactriennes arobies. Ces enzymes peuvent fonctionner dans certaines conditions comme peroxydases. Cette proprit est bien connue par exemple dans le colibacille qui est muni de deux catalases appeles HPI et HPII. La premire est une catalase/peroxydase induite par leau oxygne, la seconde est une catalase complexe renfermant des hmes D. Les catalases et peroxydases ont une grande parent fonctionnelle et sont utilises par les bactries pour se dfendre contre les agressions par oxydation provenant des animaux ou des plantes. Les peroxydases sont particulirement communes dans les espces pathognes et participent la guerre chimique entretenue avec lhte par entits oxydantes interposes [92]. La prsence de peroxydases dans des souches communes de lenvironnement commence intresser la recherche, car on les souponne de pouvoir intervenir dans diverses biodgradations.
CONCLUSION
Ce voyage parmi des exemples de xnobiotiques nous a fait explorer des mcanismes naturels par lesquels ils sont limins pour notre plus grand bien. Pour tous ces ingrdients conus pour servir de pesticides existent des mcanismes biologiques d'limination, au moins pour ceux dont la mise sur le march a t autorise aprs que le fabricant eut fait la preuve que leur produit tait biodgradable, prcisment. La fabrication des pesticides les plus varis, vendus sous une foule de dsignations commerciales complexes, est une vritable course aux armements pour tenir compte de la varit des situations et compenser la monte des formes de rsistance, proccupante dans le cas de la lutte contre les insectes. Une course au risque d'empoisonner notre environnement et nous-mmes. Aussi l'tude de ces questions ne fait-elle que se dvelopper.
RFRENCES
[1] P I M E N T E L D (1995) J. Agricultural Environental Ethics 8 : 17-29. [2] B E N N E T T G D & Z H E N G C (1995) Applied Contaminant Transport : Theory and Practice, Van Norstrand Reinhold, N.Y. [3] H E R N E R AE, H O R N S B Y AG & W A U C H O P E RD (1996) Pesticides Properties in the Environment, Springer Publishers, N.Y. [4] F U K U M O R I F & H A U S I N G E R RP (1993) J. Biol. Chem. 268 : 24311-24317. [5] M A T R U B U T H A M U & H A R K E R AR (1994) J. Bacteriol. 176 : 2348-2353. [6] L E V E A U JH & V A N D E R M E E R JR (1997) Gene 202 : 103-114. [7] Y O U I- S & G H O S A L D (1995) Molec. Microbiol. 16 : 321-331. [8] F I L E R K & H A R K E R AR (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 : 317-320.
13 HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS [9] L E V E A U JH J , K N I G F, F C H S L I N H , W E R L E N C & V A N D E R M E E R JR (1999) Molec. Microbiol. 33 : 396-406. [10] F U L T H O R P E RR, C . M C G O W A N , O . V. M A L T S E V A , W . E. H O L B E N & J . M. T I E D J E . (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 3274-3281. [11] X U N L & W A G N O N KB (1995) Applied Environ. Microbiol. 61 : 3499-3502. [12] M L L E R RH & B A B E L W (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 339-344. [13] P I C C O L O A, C O N T E P, C O Z Z O L I N O A & P A C I M (2001) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26 : 70-76. [14] M A T T H E S B, S C H M A L F U S S J & B G E R P (1998) Z. Naturforsch 53c : 1004-1011. [15] L A U EP, N I S W A N D E R L, W A R S O N D & F A L L RR (1980) Chemosphere 9 : 565-569. [16] L A M O U R E U X G L & R U S N E S S D G (1989) Pestic. Biochem. Physiol. 34 : 187-204. [17] Z A B L O T O W I C Z RM, H O A G L A N D RE, L O C K E MA & H I C K E Y W J (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 1054-1060. [18] L E W I S D L, G A R R I S O N AW , W O M M A C K KE, W H I T T E M O R E A, S T E U D L E R P & M E L I L L O J (1999) Nature 401, 898-901.
639
[19] L E G O F F L ( Juillet 2001) Mission Biotechnologies de l'association France Nature Environnement, cit par Le Monde Diplomatique. [20] P A R K E R G F , H I G G I N S TP, H A W K E S T & R O B S O N RL (1999) J. Bacteriol. 181 : 389-395. [21] K I S H O R E G M & J A C O G G S (1987) J. Biol. Chem. 262 : 12164-12168 ; W A C K E T T LP, S H A M E S S L, V E N D I T T I C P & W A L S H C T (1987) J. Bacteriol. 169 : 710-717. [22] D I C K RE & Q U I N N JP (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43 : 545-550. [23] P I P K E R, A M R H E I N N (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 1293-1296. [24] F R O S T JW , L O O S , C O R D E I R O ML & L I D (1987) J. Amer. Chem. Soc. 109 : 2166-2171 ; W A N N E R BL (1994) Biodegradation 5 : 175-184. [25] L E E KS , M E T C A L F W W & W A N N E R BL (1992) J. Bacteriol. 174 : 2501-2510. [26] C H E C M, Y E Q Z, Z H U Z, W A N N E R BL & W A L S H C T (1990) J. Biol. Chem. 265 : 4461-4471. [27] M E T C A L F W W & W A N N E R BL (1993) Gene 129 : 27-32. [28] I M A Z U K, T A N A K A S , K U R O D A A, A N B E Y , K A T O J & O H T A K E H (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 3754-3758. [29] W A C K E T T LP, W A N N E R BL, V E N D I T T I C P & W A L S H C T (1987) J. Bacteriol. 169 : 1753-1756. [30] W A T A N A B E M, S U M I D A N, M U R A K A M I S , A N Z A I H , T H O M P S O N C J, T A T E N O Y & M U R A K A M I T (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1036-1044. [31] B U J A C Z B, W I E C Z O R E K P, K R Z Y S K O - L U P I C K A T, G O L A B Z, L E J C Z A K B & K A V F A R S K I P (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 2905-2910. 32] M C G R A T H JW , H A M M E R S C H M I D T F & Q U I N N JP (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 356-358. [33] D U M A S D P, C A L D W E L L S R, W I L D JR & R A U S H E L FM (1989) J. Biol. Chem. 264 : 19659-19665. [34] W A L K E R AW & K E A S L I N G JD (2002) Biotechnol. Bioeng. 78 : 715-721. [35] B E N N I N G LL, K U O JM, R A U S H E L FM & H O L D E N H M (1995) Biochemistry 34 : 7973-7978. [36] E L A S H V I L I I , D E F R A N K JJ & C U L O T T A VC (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2601-2608. [37] N A G A T A Y , O H T O M O T O R, M I Y A U C H I K, F U K U D A M, Y A N O K & T A K A G I M (1994) J. Bacteriol. 176 : 3117-3125 ;
640
M I Y A U C H I K,S U H S - K , N A G A T A Y & T A K A G I M (1998) J. Bacteriol. 180 : 1354-1359 ; N A G A T A Y , F U T A M U R A A, M I Y A U C H I K & T A K A G I M (1999) J. Bacteriol. 181 : 5409-5413 ; M I Y A U C H I K, A D A C H I Y , N A G A T A Y & T A K A G I M (1999) J. Bacteriol. 181 : 6712-6719. [38] N A G A T A Y , I M A I R, S A K A I A, F U K U D A M, Y A N O K & T A K A G I M. (1993) Biosci. Biotechnol. Biochem. 57 : 703-709. 39] M I Y A U C H I K, A D A C H I Y , N A G A T A Y & T A K A G I M (1999) J. Bacteriol. 181 : 6712-6719. 40] H G G B L O M MM, R I V E R A MD & Y O U N G LY (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 1162-1167. [41] K U R I T Z T, B O C A N E R A LV & R I V E R A NS (1997) J. Bacteriol. 179 : 3368-3370. [42] K U R I T Z T & W O L K C P (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61 : 234-238. [43] B U M P U S JA, P O W E R S RH & S U N TA (1993) Mycol. Res. 97 : 95-98. [44] M A S S R, L A L A N N E D , M E I S S E R F & S Y L V E S T R E M (1989) Biomed. Environ. Mass. Spectrom. 18 : 741-752 ; A I S L A B I E J, D A V I S O N AD , B O U L H L, F R A N Z M A N N PD , J A R D I N E D R & K A R U S O P (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 5607-5611. [45] H A Y AG & F O C H T D D (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 : 2141-2146. [46] N A D E A U LJ, M E N N FM, B R E E N A & S A Y L E R G S (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60 : 51-55. [47] A I S L A B I E J, D A V I S O N AD , B O U L H L, F R A N Z M A N N PD , J A R D I N E D R & K A R U S O P (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 5607-5611. [48] M A U L E A, P L Y T E S & Q U I R K AV (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27 : 229-236. [49] M C A L L I S T E R KA, L E E R & T R E V O R S JT (1996) Biodegradation 7 : 1-40. [50] W A N G H , T I I R O L A MA, P U H A K K A JA & K U L O M A A MS (2001) Biochem. Biophys. Res. Comm. 289 : 161-166. [51] X U N L, T O P P E & O R S E R C S (1992) J. Bacteriol. 174 : 2898-2902. [52] T O P P E, X U N LY & O R S E R C S (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 502-506. [53] X U N L, B O H U S L A V E K J & C A I M (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 266 : 322-325. [54] C O P L E Y S D (2000) Trends Biochem. Sci. 25 : 261-265. [55] N I C H O L S O N D K, W O O D S S L, I S T O K JD & P E E K D (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 2280-2286. [56] W U W M, B H A T N A G A R L & Z E I K U S JG (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 389-397; B O U C H A R D B, B E A U D E T R, V I L L E M U R R, M C S W E E N G , L E P I N E F & B I A I L L O N JG (1996) Int. J. Syst. Bacteriol. 46 : 1010-1015. [57] J A S P E R C J, E W B A N K G , M C C A R T H Y AJ, P E N N I N C K X MJ (2002) J. Appl. Microbiol. 92 : 127-133. [58] M O H N W W & T I E D J E JM (1992) Microbiol. Rev. 56 : 482-507; L O U I E TM & M O H N W W (1999) J. Bacteriol. 181 : 40-46. [59] M A D S E N T & L I C H T D (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 2874-2878. [60] S U D RK, S U D AK & G U P T A KG (1972) Arch. Mikrobiol. 87 : 353-358 ; D E R B Y S H I R E MK, K A R N S JS , K E A R N E Y PC & N E L S O N JO (1987) J. Agr. Food Chem. 35 : 871-876 ; C H A P A L A M A D U G U S & C H A U D H R Y G R (1991) Appl. Env. Microbiol. 57 : 744-750 ; H A S H I M O T O M, F U K U I M, H A Y A N O K & H A Y A T S U M (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68 : 1220-1227. [61] H A Y A T S U M, H I R A N O M & N A G A T A T (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1015-1019 [62] H A M M O U D A O (1999) Ecotoxicol. Environ. Saf. 44 : 215-219.
13 HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS [63] D O D D A M A N I H P & N I N N E K A R H Z (2001) Curr. Microbiol. 43 : 69-73. [64] T O P P E, H A N S O N RS , R I N G E L B E R G D B, W H I T E D C & W H E A T C R O F T R (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3339-3349. [65] M U L L E T JE & A R N T Z E N C J (1981) Biochim. Biophys. Acta 635 : 236-248 ; D A Y A N FE, V I N C E N T AC , R O M A G N I JG , A L L E N S N, D U K E S O , D U K E MV, B O W L I N G JJ & Z J A W I O N Y JK (2000) J. Agric. Food Chem. 48 : 3689-3693. [66] S E F F E R N I C K JL, J O N H S O N G , S A D O W S K Y MJ & W A C K E T T LP (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66 : 4247-4252. [67] D E S O U Z A ML, S A D O W S K Y MJ & W A C K E T T LP (1998) J. Bacteriol. 178 : 4894-4900. [68] S H A P I R N, O S B O R N J, J O H N S O N G , S A D O W S K Y MJ & W A C K E T T LP (2002) J. Bacteriol. 184 : 5376-5384. [69] W A C K E T T LP (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci . 864 : 142-152.
641
[70] G I A R D I N A MC , L Y K I N S BW , G I A R D I A MT & F I L A C C H I O N I G (1982) Agric. Biol. Chem. 46 : 1439-1445 ; B C H K I R & K H A N S (1986) J. Agric. Food Chem. 34 : 746-749 ; B C H K I R & K H A N S (1994) J. Agric. Food Chem. 42 : 1237-1241 . [71] N A G Y I, S C H O O F S G , C O M P E R N O L L E F, P R O O S T P, V A N D E R L E Y D E N J & D E M O T R (1995) J. Bacteriol. 177 : 676-687 ; N A G Y I, C O M P E R N O L L E F, G H Y S K, V A N D E R L E Y D E N J & D E M O T R (1995) 61 : 2056-2060. [72] C R A W F O R D JJ, S I M S G K, M U L V A N E Y RL & R A D O S E V I C H M (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 : 618-623. [73] T R A V K I N V, B A S H K U N O V BP, G O L O V L E V EL, B O E R S M A MG , B O E R E N S , V E R V O O R T J, V A N B E R K E L W J, R I E T J E N S IM & G L O V L E V A LA (2002) FEMS Microbiol. Lett. 209 : 307-312. [74] Z E Y E R J, W A S S E R F A L L E N A & T I M M I S KN (1985) Appl. Environ. Microbiol. 50 : 447-453. [75] H I N T E R E G G E R C , L O I D L M & S T R E I C H S B I E R F (1994) J. Basic. Microbiol. 34 : 77-85. [76] M U R A K A M I S , N A K A N I S H I Y , K O D A M A N, T A K E N A D A S , S H I N K E R & A O K I K (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 : 747-752. [77] H U M M E R J O H A N N J, K U T T E L E, Q U A D R O N I M, R A G A L L E R J, L E I S I N G E R T & K E R T E S Z MA (1998) Microbiology 144 : 1375-1386. [78] D O D G S O N K, W H I T E G F & F I T Z G E R A L D JW (1982) Sulfatases of Microbial Origin, CRC Press, Boca Raton. [79] V O N F I G U R A K, S C H M I D T B, S E L M E R T & D I E R K S T (1998) Bio Essays 20 : 505-510. [80] S I N G H KL, K U M A R A & K U M A R A (1998) World J. Microbiol. Biotechnol. 14 : 777-779. [81] E I C H H O R N E, V A N D E R P L O E G JR, K E R T E S Z MA & L E I S I N G E R T (1997) J. Biol. Chem. 272 : 23031-23036. [82] K E R T E S Z MA (1999) Microbiol. Rev. 24 : 135-175. [83] G R A Y KA, P O G R E B I N S K Y O S , M R A C H K O G T, X I L, M O N T I C E L L O D J & S Q U I R E S C H (1996) Nature Biotechnol. 14 : 1705-1709. [84] C H I E N C C , L E A D B E T T E R ER & G O D C H A U X W (1995) FEMS Microbiol. Lett. 129 : 189-193 ; D E N G E R K, K E R T E S Z MA, V O C K EH , S C H O N R, M A G L I A & C O O K AM (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62 : 1526-1530. [85] D E N G E R K, L A U E H & C O O K AM (1997) Microbiology 143 : 1919-1924 ; M I K O S C H C , D E N G E R K, S C H A F E R EM & C O O K AM (1999) Microbiology 145 : 1153-1160.
642
[86] C O O K AM, L A U E H & J U N K E R F (1998) FEMS Microbiol. Rev. 22 : 399-419. [87] B A D E N D G & C O R B E T T MD (1980) Biochem. J. 187 : 205-211 ; A H E R N TJ, A L L A N G G & M E D C A L F D G (1980) Biochim. Biophys. Acta. 616 : 329-339 ; A L M E I D A M, F I L I P E S , H U M A N E S M, M A I A MF, M E L O R, S E V E R I N O N, D A S I L V A JA, F R A U S T O D A S I L V A JJ & W E V E R R (2001) Phytochemistry 57 : 633-642. [88] H E N R I K S E N A, S M I T H AT & G A J H E D E M (1999) J. Biol. Chem. 274 : 35005-35011. [89] P O U L O S TL & K R A U T J (1980) J. Biol. Chem. 255 : 8199-8202. [90] K I R K M A N H N & G A E T A N I G F (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 4343-4347 ; G O U E T P, J O U V E H M & D I D E B E R G O (1995) J. Mol. Biol. 249 : 933-954. [91] M E S S E R S C H M I D T A & W E V E R R (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 392-396. [92] M I L L E R RA & B R I T I G A N BE (1997) Clin. Microbiol. Rev. 10 : 1-18.
LA CIRCULATION DES MTAUX

L'arsenal chimique moderne pour lutter contre les ravageurs de toute nature est devenu immense. L'poque est rvolue, du moins on ose l'esprer, o l'on pouvait rpandre n'importe quoi sans trop se soucier de l'environnement. Les micro-organismes viennent une fois de plus notre secours pour corriger les excs. Mais la varit des structures chimiques dgrader est trs grande. Ce chapitre ne tente pas d'examiner toutes les possibilits, ce qui serait impossible, mais se focalise sur quelques exemples typiques des herbicides et des insecticides courants. Quelques-uns ont dj t interdits l'emploi dans un certain nombre de pays, mais contaminent encore les sols et les chanes alimentaires. Le but est ici d'examiner diverses formulations chimiques biodgradables, et d'attirer l'attention le cas chant sur celles qui sont rcalcitrantes toute action biologique. 14.1 - Grer le taux de mtal 14.2 - Le fer - un mtal essentiel 14.3 - Quelques mtaux indispensables 14.4 - Mtaux et pollution 14.5 - Le pompage du cadmium et du zinc 14.6 - Le contrle du plomb 14.7 - La rsistance au cuivre 14.8 - Transport par potentiel membranaire 14.9 - Mercure et mercuriels 14.10 - Rsistances l'arsenic et l'antimoine 645 647 653 657 661 666 668 674 678 685
CHAPITRE 14
14 LA CIRCULATION DES MTAUX

La circulation des mtaux, et les transformations cycliques de certains d'entre eux, participent aux quilibres de la biosphre et interviennent tous les niveaux du dveloppement des organismes. Il ne peut y avoir de regard sur les biotransformations de l'environnement sans tenir compte de leur prsence et de leurs effets. Les mtaux ne sont pas seulement ncessaires tout mtabolisme cellulaire, mais leur accumulation empcherait toute survie microbienne si les cellules navaient pas des dispositifs pour sen dfendre. Les bactries sont armes pour contrler trs efficacement le t a u x des diffrents mtaux quelles contiennent. Les mtaux retenant particulirement notre attention seront le fer, le cadmium, le zinc, le plomb, le cuivre et le mercure, ainsi que l'arsenic et l'antimoine.
14.1 - GRER LE TAUX DE MTAL

Pour les cellules vivantes, de nombreux mtaux sont infiniment plus prcieux que le platine, l'or et l'argent, mais tous n'ont pas la mme valeur pour leur fonctionnement. Les plus importants comme cofacteurs des enzymes sont sous forme de cations divalents. On dsigne empiriquement comme "mtaux lourds" ceux qui appartiennent la quatrime ligne de la classification priodique et au-del, en partant du titane et du vanadium 1. Les monovalents tels que Na+ et K+ en sont exclus, ainsi que les cations divalents "lgers" tels que Mg2+ et Ca2+. Les cations des mtaux lourds sont les seuls que nous voquerons dans ce chapitre. Il sera facile de reprer leur position dans la classification priodique, si bien qu'il n'a pas t jug utile de la reproduire in extenso puisqu'elle figure dans tous les livres de chimie. Ont t souligns les mtaux d'intrt biologique et environnemental, soit comme cofacteurs, soit comme poisons. Larsenic ne fait pas partie des mtaux proprement parler, mais prsente avec eux des analogies, tout comme l'tain, le plomb et le bismuth. Certains lments mtalliques ont une importance biologique par leurs oxydorductions. Les plus importants sont le manganse, le fer, le cobalt, le nickel et le cuivre. Le vanadium, le molybdne et le tungstne (W) interviennent comme nous le savons dans le cycle de l'azote dans le cycle de l'azote.
1 - Lexpression mtaux lourds ne correspond aucune dfinition rigoureuse. En principe ce sont les mtaux dont la densit l'tat pur est dau moins 4 ou 5.
646
B Na Mg K Ca Sr V Cr Mo W Mn Fe Co Ni Cu Ag Zn Cd Hg Sn Pb Al C Si N P As Sb Bi O S Se F Cl Br I
Comment les ions mtalliques sont-ils reconnus par les molcules biologiques ? Parmi les critres sont la charge, la taille ionique, la sphre d'hydratation et ltablissement de coordinences avec les structures organiques. Des atomes d'oxygne, d'azote et de soufre se placent frquemment autour des cations mtalliques les plus lgers, mais le soufre est le donneur prfr pour les cations les plus volumineux comme ceux du mercure et du plomb. Ce critre n'est pas automatique. Le plomb se lie volontiers l'oxygne. La stabilit dun complexe est augmente si la molcule organique partenaire se replie de faon respecter exactement la gomtrie de coordination du mtal. La spcificit de liaison entre une protine et un cation mtallique nest pas toujours tranche. Un mtal peut alors en remplacer un autre et affecter lactivit biologique de la protine. Il en rsulte des effets toxiques plus ou moins importants. Les mtaux s'entourent de quatre, cinq ou six coordinences qui peuvent tre compltes par des molcules d'eau pour former un complexe dont la gomtrie est guide par lorientation des orbitales mtalliques et la nature des atomes donneurs.
Zn2+ Co2+ Cd2+ Ni2+ Pb2+ Cu2+ Hg2+
Mn2+ log MIC (mM)

10
Ag+
0,1
Ralst. m. E. coli
0,01 20 30 40 50
log Kmtal-S
Le tableau tabli d'aprs DIETRICH NIES Halle en Allemagne, montre la corrlation entre la concentration inhibitrice minima (MIC) et la solubilit du sulfure correspondant, mesure par la constante d'affinit K du mtal pour le soufre. Les ions les
647
plus toxiques sont reprs vers le bas et droite. La comparaison entre Ralstonia et le colibacille montre que le premier est globalement plus rsistant, sauf pour l'argent. Le fer est un cas particulier et a t laiss part. On pense que la toxicit des mtaux s'explique en partie par leur capacit de se combiner avec les thiols du glutathion ou des protines. La corrlation indique ici suggre que c'est bien un des facteurs possibles. La tolrance dun organisme un excs de mtal s'appuie sur labsence fortuite de tout dgt important au niveau des protines cellulaires. Une rsistance est au contraire un phnomne actif mettant en jeu des transporteurs actionns par une source d'nergie. La rsistance des bactries comme Ralstonia metallidurans un stress mtallique peut tre considrable. Ces germes peuvent survivre des taux levs de pollution mtallique au voisinage dinstallations industrielles ou minires. Les cations les plus abondants dans la cellule sont ceux du magnsium. Il en faut environ 100 fois plus que de zinc. Le magnsium reprsente lui seul environ 1% du poids sec de la bactrie. C'est norme, et le magnsium na des effets toxiques qu des niveaux trs levs. Pour trouver et accumuler les ions Mg2+, les bactries disposent d'un transporteur dsign par CorA. Une mutation au niveau de cette protine provoque une carence en magnsium qui est imparfaitement compense par d'autres transporteurs qui amnent aussi du magnsium. Dans les conditions normales, CorA fait entrer en mme temps des ions Co2+ et Ni2+ qui peuvent se trouver en excs dans le milieu cellulaire. La disparition de CorA rend secondairement les cellules tolrantes au cobalt et au nickel extrieurs puisque ces derniers ne pntrent plus aussi facilement. Cet exemple montre quil faut sattendre des interfrences biologiques complexes entre les diffrents mtaux de lenvironnement. Les mtaux qui nous intressent ici sont pour lessentiel le plomb, le mercure, le cadmium, le cuivre, le zinc et les mtaux dits de transition : fer, cobalt nickel. Ils interviennent dans le monde vivant essentiellement sous forme de cations, malgr quelques exceptions par association avec l'oxygne comme dans les anions molybdate et vanadate. Divers mtaux sont indispensables aux organismes vivants comme cofacteurs de catalyse enzymatique ou doxydorduction, ou encore pour stabiliser les macromolcules et membranes. Des mcanismes de pompage assurent lentre et la sortie des ions mtalliques de telle sorte que leur concentration lintrieur des cellules soit optimise.
14.2 - LE FER - UN MTAL ESSENTIEL

Le fer est prsent dans lenvironnement sous forme doxydes, de carbonates, de sulfures et dhydroxydes, dans des solides cristalliss ou amorphes. Il est en grande partie squestr par des lments minraux ou organiques du sol (argiles, humus). Citons pour mmoire lhmatite (Fe2O3), la sidrite (FeCO3 ), la pyrite (FeS2). Le tableau suivant rcapitule quelques interventions du fer en biochimie :
648 Fonction
Transport dlectrons [Fe(II) Fe(III)] Oxydorductions Fixateur de O2 [Fe(II)] Mtabolisme de H2 Elimination dO2 Peroxydases [Fe(III)] Oxygnation [Fe(III), Fe(II)] Respiration Rduction du nitrite Rgulation des gnes
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Protines hminiques

Cytochromes a, b, c Flavocytochromes Hmoglobines, myoglobine
Protines non hminiques

Protines fer-soufre, ferrdoxines, rubrdoxine Divers complexes flaviniques Hmrythrine Hydrognases Superoxyde dismutases Fe Mono-oxygnases, dioxygnases Ribonuclotide rductase NO rductase Fur, FNR
Catalases, peroxydases Mono-oxygnases type P450, dioxygnases Cytochromes respiratoires terminaux Nitrite rductase Fe Capteur dO2 type FixL
Malgr son abondance dans la biosphre, le fer est ingalement rparti et peu mobilisable quand il est sous forme d'oxydes et d'hydroxydes trs insolubles. On peut se reprsenter assez facilement la formation d'un hydroxyde de ce genre. Le mtal s'entoure de 6 molcules d'eau formant un complexe hydrat comme l'indique le dessin. Le dpart d'un proton correspond un pKa de l'ordre de 3, donc rapide pH neutre et encore plus rapide si le pH s'lve. La base conjugue forme se lie un autre complexe formant un dimre, qui perd son tour un autre proton, et ainsi de suite, formant des prcipits d'hydroxydes mtalliques contenant des milliers d'atomes de fer.
H H O O III O O O H H H H H H H H+ H H O H H H O H O III O O O H H H H H2O III H O III H
H H O H
dimrisation polymrisation
Un tel "polymre" n'est rcuprable par les tres vivants qu'en mettant des complexants dont l'affinit pour le Fe(III) est assez leve pour entraner la dissociation des hydroxydes et composs similaires. Les micro-organismes carencs en fer dveloppent une raction de stress et produisent cet effet des petites molcules organiques appeles sidrophores. Il existe une extraordinaire varit de ces substances, toutes habilites fixer le Fe(III) avec une trs grande efficacit. Les sidrophores sont capts par des rcepteurs appropris la surface des cellules. Les procaryotes n'en ont pas l'exclusivit, car les champignons et les plantes en produisent galement. Les formules reprsentent trois sidrophores appartenant des catgories communes. L'arobactine est produite par Aerobacter aerogenes, et a t trouve chez un colibacille porteur d'un plasmide (pColV). Les deux autres sidrophores pigent le fer par des motifs du type catcholate, disposs sur un cycle trilactone dans l'entrobactine, appele aussi entrochline. Les Pseudomonas
649
font des sidrophores particuliers comme la pyochline. Ces diffrents produits ont une affinit norme pour le fer et servent de modles la synthse de nouveaux complexants artificiels [1].
O COO NH O COO NH O N
OH CH3 O HN N O CH3 OH OH HN O Entrobactine O O O O NH O O O OH OH O OH
H3C H N
COO N S H
S OH Pyochline
COO Arobactine
Sidrophores
Comment expliquer une telle multiplicit de moyens naturels ? Des rcepteurs particuliers ces produits existent la surface des cellules qui les produisent et cherchent peut-tre en garder lexclusivit. De nombreuses espces de l'environnement parmi les Pseudomonas, Listeria, Klebsiella , Mycobacterium et beaucoup d'autres sont des pathognes opportunistes. Par exemple Pseudomonas aeruginosa carenc en fer met deux sidrophores, une pyoverdine et une pyochline, reconnues sparment par les rcepteurs FpvA et PptA. Les pyoverdines sont des produits caractristiques des Pseudomonas fluorescents. Leur structure est de nature peptidique contenant des acides amins particuliers qu'on ne trouve pas dans les protines. Le dessin montre la structure d'une pyoverdine et montre comment le produit se referme autour du fer [2] par des groupes de type hydroxamate et catcholate.
N N N O Fe O O O O
N O HOOC HN + H
NH2 O
HO N H
COOH H N N HN
O NH O O NH OH
NH O O OH OH
O HN O N H
HOOC
O HO N
Pyoverdine
Tout agent infectieux doit rcuprer du fer en conditions difficiles car le mtal est dj accapar par les molcules organiques varies de l'hte et s'y trouve
650
fermement li. Un arsenal de sidrophores, rcepteurs et transporteurs divers permet de s'attaquer au problme dans toutes les conditions de pH, et denvironnement molculaire [3]. En outre les sidrophores mis par une population bactrienne sont facilement pirats par d'autres espces, et font lobjet dune vritable comptition. Malgr son abondance dans la biosphre, le fer est parfois difficile rcuprer, soit parce qu'il est sous forme d'oxydes hautement insolubles, soit parce qu'il est dj troitement squestr sous forme de complexes organiques. La complexit de ces outils a cependant linconvnient physiologique dexiger des voies de synthse onreuses pour de trs petites quantits de produit. Aussi la production des sidrophores est-elle rgule. Les gnes disposs en oprons sont rprims ds que la teneur du fer dans le milieu dpasse 10 M, ou ds que Fe(II) est excdentaire dans la cellule. Les ressources en fer sont souvent limitantes en milieu ocanique. Les recherches essaient dvaluer ce facteur dans l'hypothse du rchauffement climatique. En effet on admet que les ocans contiennent de vastes rservoirs de phytoplancton susceptible d'ponger une partie du CO2 de l'atmosphre. Parmi les formes vivantes figurent en nombre immense les cyanobactries et les diatomes. Une prolifration de diatomes a t observe dans les mers australes aprs un pandage exprimental de ressources en fer [4]. Dautres analyses effectues dans les mers chaudes ont montr que le fer tait retenu soit par des sidrophores, soit par des matires organiques de dcomposition comprenant des porphyrines et leurs produits d'altration. Il y a comptition au sein du microplancton pour ces ressources. La rcupration du fer parat utiliser deux stratgies distinctes. Les cyanobactries privilgient l'absorption du fer partir des sidrophores libres et varis que les micro-organismes plagiques librent. Les Synechococcus, par exemple, peuvent dtourner les sidrophores produits par d'autres espces, mais sont relativement impuissants utiliser le fer attach aux porphyrines. Diverses cyanobactries sont relativement bien armes pour utiliser le fer minral. La situation est diffrente pour les diatomes qui sont des eucaryotes. Elles rduisent le fer l'tat ferreux par une ferrirductase et peuvent l'assimiler de prfrence partir des porphyrines. On a dcouvert que des ractions photochimiques participent la circulation du fer ocanique. Les aquachlines sont des sidrophores mis par Halomonas aquamarina, une espce isole sur la cte ouest de l'Afrique quatoriale profondeur moyenne. Une oxydorduction en lumire ultraviolette dcompose les complexes Fe(III)-aquachlines en librant du Fe(II) plus mobile, facilitant la circulation du mtal en milieu ocanique [5]. La disponibilit du fer est donc un facteur critique pour le dveloppement des espces biologiques en gnral. Les vgtaux en ont besoin pour btir leur photosynthse. Toute carence chez les plantes s'accompagne d'ailleurs du jaunissement des feuilles et du phnomne de chlorose, bien connu des jardiniers et horticulteurs. Les protines du type ferritine sont les rservoirs de fer les plus courants. Il est transport dans le rgne animal par la transferrine et la lactoferrine. Comment le fer entre-t-il dans les bactries ? Les sidrophores chargs de leur mtal sont capts par des rcepteurs et pntrent laide de porines. Le fer est alors libr par plusieurs procds. L'un d'eux est une hydrolyse enzymatique du sidrophore, ce qui a pour effet de gommer sa haute affinit. Une autre solution est la
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rduction en Fe(II) par une fer rductase flavinique [6]. Le colibacille possde une panoplie complexe doutils et la production des transporteurs du fer est rgle par le rpresseur Fur (ferric uptake regulator) [7], qui ne contrle pas moins de cinq systmes d'entre du fer, soit un ensemble de gnes et d'oprons formant un rgulon. Fur est un polypeptide de 148 acides amins dont la squence N-terminale riche en histidine est apparemment la portion qui lie un cation divalent. Une autre partie lie les ions Zn2+. Cette protine examine en RMN se lie lADN sous forme d'un dimre, sur une squence spcifiquement reconnue appele "bote Fur". place en amont des gnes que Fur vient rguler ngativement [8] : en cas d'abondance du fer, elle inhibe la transcription des gnes placs en aval. Ce type de contrle a t mis en vidence chez de nombreuses espces libres ou pathognes [9]. Dans Bacillus subtilis, la protine Fur ne rprime pas moins de 39 gnes contenus dans 20 oprons [10] ! Pourquoi le fer cellulaire est-il aussi soigneusement squestr par les tres vivants malgr son abondance naturelle ? On pense quil sagit dune parade la toxicit potentielle de ce mtal, qui catalyse en solution la clbre raction de FENTON, une calamit des environnements arobies : H O + O + H+ H O + OH. + O
2 2 2 2 2
Le peroxyde et le superoxyde sont produits par les oxydases. Le premier est rduit par le second et gnre le radical hydroxyle OH., extrmement ractif sur de nombreuses cibles organiques dont l'ADN. En prsence de fer la raction se dcompose en deux temps : Fe3+ + O2 Fe2+ + O2 2+ + Fe3+ + H O + OH. Fe + H O + H
2 2 2
En oscillant entre les deux niveaux d'oxydation, les ions du fer catalysent la raction de Fenton et la rendent beaucoup plus intense. L'immobilisation du fer dans des molcules organiques au sein de porphyrines ou d'enzymes varies relve d'une stratgie anti-Fenton. La disparition du fer libre est alors vcue par les germes infectieux comme un tat de stress. Certains facteurs de virulence rpondent cette forme de crise. Ils induisent des toxines, des enzymes hmolytiques et dautres lments guerriers susceptibles de faire des dgts chez l'hte afin den arracher le fer ! Revenons l'entre du fer dans les cellules. Li son sidrophore, il est pris en charge par un rcepteur membranaire avant d'tre propuls vers l'intrieur par un pompage appropri. Le problme est rendu plus compliqu dans les bactries Gram-ngatives cause de l'existence des deux membranes. La plus externe se laisse traverser plus ou moins passivement par des molcules et ions varis, par le jeu des porines*. Le diamtre d'ouverture de celles-ci ne permet pas le passage des sidrophores, qui sont reconnus par un rcepteur log dans la membrane externe. Or le passage vers le priplasme ncessite un couplage nergtique, et c'est la membrane interne qui dtient le potentiel lectrochimique ( p). Il faut donc un dispositif spcial pour transmettre l'nergie d'une membrane l'autre. C'est le facteur TonB qui s'en charge. Cette protine forme un pont entre les deux membranes et entre en contact avec le rcepteur. Un dessin imag voque des changements de conformations actionns par le potentiel de membrane, permettant au complexe
652
sidrophore d'tre dcharg dans le priplasme. Le modle simplifi, imit de MOECK ET COULTON [11], est le suivant. Le rcepteur (FepA chez E. coli) fixe le complexe avec une forte affinit, subit un petit changement de nature allostrique qui attire TonB, plant dans la membrane interne. TonB est sous une conformation porteuse d'nergie. Le contact avec le rcepteur lui permet de se vider de cette nergie sur le rcepteur qui change de conformation en perdant sa haute affinit pour le complexe. Celui-ci trouve alors une porte ouverte sur le priplasme, tandis que les deux protines reprennent leur tat initial. L'action de TonB oblige le rcepteur lcher sa proie, qui serait autrement retenue avec une telle affinit que le mtal resterait la surface de la cellule.
rcepteur sidrophore-Fe
membrane externe priplasme TonB
+++
membrane interne
cytoplasme
Action de TonB
La transduction de l'nergie par TonB se fait en association avec deux autres protines membranaires, ExbB et ExbD. La machinerie importatrice TonB + ExbB + ExbD se retrouve sous une forme similaire chez diverses espces Gram-ngatives et ses effets s'exercent dans plusieurs directions. La premire est l'importation du fer vhicul par des sidrophores, galement apport par des molcules organiques telles que les porphyrines. Cette proprit est d'importance, car elle permet aux espces pathognes d'arracher le fer leur organisme hte, en utilisant notamment l'hme provenant de la destruction de l'hmoglobine et des cytochromes. Elle a t mise en vidence notamment dans Neisseria meningitidis [12]. La seconde action de TonB est de faciliter l'importation de molcules telles que la vitamine B12, trop volumineuse passer directement travers une porine, mais reconnue par un rcepteur. Son entre pose un peu le mme problme que celle du fer, car la vitamine est rcolte dose trs faible et doit tre pige avec haute affinit. Une troisime intervention de TonB est dans l'entre de bactriophages et de protines spciales comme les colicines*. Enfin TonB possde une fonction qui n'est pas celle d'un importateur, mais d'un outil de signalisation : l'occupation de rcepteurs la surface de la cellule par leur ligand est dtecte et signale l'intrieur du cytoplasme aux protines rgulatrices de l'expression des gnes. Comment le fer entre-t-il ? Il est pris en charge par un mcanisme tirant son nergie de l'hydrolyse de l'ATP et fond sur un transporteur ABC*. L'entre de l'entrobactine de E. coli en offre un exemple. Elle est assure par le systme FepBCDG. La premire opration est la prise en charge du complexe libr par FepA dans le priplasme afin de le conduire la membrane. Ce rle revient FepB, une protine
653
priplasmique qui est ncessaire l'importation du fer par entrobactine [13]. L'tape suivante est la plus importante : le passage travers la membrane assur par les protines FepD et FepG. Le complexe est tir vers le cytoplasme grce une dpense d'nergie. La protine responsable du couplage est FepC, une ATPase attache la face interne de la membrane. Le systme FepDGC forme ce qu'on appelle une permase, un transporteur spcifique unidirectionnel actionn par une source d'nergie. Le fer dont la cellule a besoin doit se trouver l'tat de Fe(II). Comment celui-ci est-il libr ? Le passage de Fe(III) Fe(II) implique une rduction. Celle-ci dtache le mtal du sidrophore, parce que celui-ci a na une affinit leve que pour le fer oxyd, non pas pour Fe(II). Un autre mcanisme observ dans certains transports du fer consiste hydrolyser le sidrophore, ce qui fait disparatre son pouvoir. Une fois libr dans le cytoplasme, le fer est immdiatement disponible pour le mtabolisme cellulaire, mais sa prsence est dtecte par des protines rgulatrices. La protine Fur , voque dans la section prcdente, tient ce rle dans les entrobactries et contrle de nombreux gnes concerns par l'approvisionnement en fer. Tout excdent en mtal se traduit immdiatement par une rpression des gnes codant pour les sidrophores et les protines de transport. La protine Fur ne fait pas que cela. Les mutants sur le gne fur cessent de crotre sur diverses sources carbones, ce qui suggre lexistence dinteractions complexes. De grands efforts de recherche sont dploys tous azimuts pour mieux les comprendre, car ces questions intressent autant l'agriculture et la dfense de l'environnement que la sant.
14.3 - QUELQUES MTAUX INDISPENSABLES

Limportance des mtaux dans lenvironnement et leurs rpercussions sur les biodgradations ne se limitent pas au cas du fer. Et le cuivre ? Il est gnralement toxique faible taux, mais intervient de manire essentielle dans des systmes enzymatiques importants. Voici quelques exemples : Protines cuivre (cuproprotines)
Cytochrome c oxydases, quinol oxydases Superoxyde dismutases Zn/Cu Ammoniac mono-oxygnase Mthane mono-oxygnase Nitrite rductase Cu Laccase Oxydases Tyrosinase Hmocyanine Azurine, amicyanine Plastocyanine
Fonction
Avec porphyrines, catalyse la rduction d'O2 en H2O sur un site bi-mtallique Fe/Cu Catalyse la dismutation du superoxyde en O2 et H2O2 Participe la nitrification des sols Mono-oxygnase membranaire des mthanotrophes Rduction du nitrite dans la dnitrification Oxydation des phnols chez les vgtaux Oxydation des amines et du galactose Oxydation de la L-tyrosine en DOPA* Transport d'O2 (mollusques). Transporteurs dlectrons chez les bactries Transporteur dlectrons dans la photosynthse
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D'autres mtaux ont des fonctions vitales particulires et certains cations peuvent changer de niveau d'oxydation. Ceux qui sont lis aux protines sont parfois remplaables par d'autres cations de mme type, comme le zinc par le cobalt, le nickel ou le cadmium, mais la substitution s'accompagne d'une diminution d'activit biologique et mme d'une inhibition complte, expliquant les effets toxiques constats. Un tableau simplifi rappelle quelques proprits courantes. Mtal
Nickel Cobalt
Proprits essentielles
CO-dshydrognase anarobie (actyl-CoA synthase), diverses hydrognases, cofacteur F430 de la mthanognse, urase. Mtal prsent dans la vitamine B12 et caractristique des corrinodes. Oscille entre les tats Co(I), Co(II), Co(III), avec changements de la gomtrie de coordination. Une liaison directe carbone-cobalt se forme sur Co(I), avec passage Co(III), rompue inversement par rduction. Mthyltransfrases : synthse de CH3CoM dans la mthanogense, actyl-CoA synthase, mthionine synthase. Ractions radicalaires : rduction des ribonuclotides chez divers anarobies, rarrangements (succinate en malonyl-CoA dans la fermentation propionique).
Molybdne Dans un noyau fer-soufre spcial de la nitrognase, ou li un cofacteur nuclotidique du type MGD dans les nitrate rductases, la DMSO rductase, la TMAO rductase et les molybdoprotines (xanthine oxydase, formiate dshydrognase, CO dshydrognase). Son degr d'oxydation varie entre Mo(IV) et Mo(VI). Il est quelquefois remplac ou remplaable par du vanadium ou du tungstne. Zinc Possde une double fonction, comme stabilisateur de la structure des protines, comme lment catalytique dans les enzymes o il est retenu avec une trs haute affinit, sans changer d'tat d'oxydation (Zn2+). Anhydrase carbonique, des hydrolases (parmi les RNases et peptidases, phosphatase alcaline), certaines dshydrognases (alcool dshydrognase Zn), aldolases de classe II.
Manganse Noyau 4 Mn dans PS2 de la photosynthse oxygnique o H2O est le donneur d'lectrons. Mn2+ dans les phosphotransfrases, ARN-polymrase procaryotique, glutamine synthtase, arginase, concanavaline A (une lectine), peroxydase MnP. Peut entrer dans un cycle d'oxydorduction entre Mn2+, Mn3+ (trs oxydant), et Mn(IV) (dans MnO2). Ce dernier intervient comme accepteur dans une respiration anarobie. La prsence de Mn est facilement dtectable par RPE. Magnsium Ne change pas de niveau d'oxydation (Mg2+), indispensable aux transformations des nuclotides adnine (ATP, ADP). Hexokinase, diverses phosphotransfrases et hydrolases. Cofacteur de la Rubisco aprs y avoir t introduit par une raction d'activation. Stabilisateur des ribosomes et de la paroi bactrienne. Calcium Stabilisateur et activateur de nombreuses protines sous forme de Ca2+ sans changer de niveau d'oxydation, coordonn typiquement par des groupes carboxyliques (glutamate, aspartate). Le calcium intracellulaire libre (de 0,1 1 M est un rgulateur mtabolique fondamental dont le taux est rgul de manire complexe, avec la participation de la pompe calcium, qui est une ATPase catalysant son rejet hors de la cellule. Le calcium se lie avec une haute affinit avec la tubuline, intervient dans l'adhrence entre cellules, est indispensable la contraction des fibres musculaires, la division cellulaire Un des matriaux de base pour la construction des squelettes et coquilles. Na+, participe la rgulation de la pression osmotique intracellulaire, la polarisation de la membrane (ATPase Na/K des eucaryotes), au fonctionnement de transporteurs.
Sodium
Potassium K+, comme le sodium, activateur spcifique de certains transporteurs et enzymes (pyruvate phosphokinase, tryptophanase).
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La plupart des mtaux cits sont souvent toxiques faible dose lorsquils gnrent des ractions secondaires ou inactivent des enzymes cls du mtabolisme. Le cuivre est dans ce cas. Dautres mtaux tels que le chrome, l'tain, le plomb, le cadmium, l'uranium et le mercure sont lorigine de pollutions industrielles ou minires nfastes, et nont pas de fonction biologique particulire. Lantimoine, le bismuth et larsenic sont mettre en renfort. La pollution par les mtaux est parmi les plus difficiles traiter, car au contraire des molcules organiques dont la structure est scinde ou modifie, ils ne sont pas transmutables en d'autres lments, seulement oxyds ou rduits, immobiliss par squestration ou pousss un peu plus loin. Le mercure est un cas particulier car il est volatil ltat mtallique et peut schapper dans latmosphre o il figure ltat de traces. La plupart des organismes sont amens se dfendre contre un excs d'ions mtalliques. Une mthode usuelle consiste les neutraliser par squestration avec des molcules organiques. Les mtallothionines font partie dun tel systme de dfense. Ces petites protines sont prsentes chez les eucaryotes, ainsi que dans divers procaryotes. Elles sont remarquables par leur teneur leve en cystine et sont induites comme protines de stress servant lier des cations mtalliques divalents (zinc, cadmium) [14]. Ces protines nont en moyenne que 61 acides amins chez les animaux. Elles sont dpourvues d'acides amins aromatiques et la cystine y figure une vingtaine de fois. Des mtallothionines ont t dcrites chez les plantes et champignons les plus divers, ainsi que dans certains procaryotes. Labondance de cystine et des squences consensus permet de les reprer facilement. Ainsi chez les ascomyctes, le consensus est C-x-K-C-x-C-x(2)-C-K-C dans 55-56 acides amins renfermant aussi le motif CCC. Chez les procaryotes dont les cyanobactries, le consensus est K-C-A-C-x(2)-C-L-C dans une squence de 53-56 acides amins. La prsence des mtallothionines dans les cyanobactries n'est pas vitale, comme le montre la slection de mutants qui en sont dpourvus et restent pourtant parfaitement viables, mais deviennent trs sensibles l'empoisonnement par les sels de zinc ou de cadmium. Quelle est la fonction relle des mtallothionines ? Elle est double. Elles offrent d'abord une protection contre le zinc et divers mtaux en excs. La deuxime fonction est le stockage des mtaux essentiels afin de constituer un rservoir o la cellule peut puiser la demande. Or l'expression des gnes dpend couramment de protines rgulatrices contenant du zinc stock dans la mtallothionine sur des thiols voisins. Loxydation de ces thiols pour former un pont disulfure (SS) se fait avec un potentiel relativement bas ( 360 mV) et libre le cation. La synthse des mtallothionines est gnralement augmente en prsence de concentrations mtalliques leves, et leur taux est ajust de manire prcise au cours du dveloppement. Ainsi les mammifres possdent deux mtallothionines voisines, appeles I et II, qui maintiennent un stock de cuivre et de zinc ncessaire aux tissus croissance rapide (en particulier pendant la vie ftale), tout en servant de rempart en cas d'intoxication par des mtaux comme le cadmium ou le mercure.
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SH SH S S
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES La recette fonde sur l'oxydorduction des thiols s'applique aux thiordoxines. Ces petites protines d'environ 12 kDa fonctionnent dans la rduction du ribose des nuclotides 2 et sont des transporteurs d'lectrons la manire des ferrdoxines, mais sans avoir de noyau fer-soufre. Elles fonctionnent par oxydation rversible en pont disulfure de la structure C-x-x-C porteuse de thiols voisins. On sait que les liaisons de ce type affectent gnralement des protines destines tre exportes hors de la cellule, et contribuent les stabiliser.
HS
SH
DsbA
DsbA
S Q
S S
priplasme membrane
DsbB
cytoplasme
Oxydorduction par dithiols
Cette question a fait l'objet d'tudes dtailles chez dans le colibacille. La confection des ponts disulfures est sous la dpendance de la paire de protines DsbB/DsbA [15], munies lune et lautre des sites dithiols soumis oxydorduction. La protine DsbB est membranaire et se trouve l'tat oxyd en quasi-permanence. Elle oxyde son tour DsbA, dont le site dithiol C-x-x-C forme alors un pont disulfure. DsbA oxyde son tour une cible priplasmique (cercle gris). DsbB est roxyd par la chane respiratoire. Ce n'est pas tout. Il existe une deuxime paire, DsbD/DsbC (et DsbG), non reprsente ici, qui effectue l'opration inverse, cest--dire de rduire nouveau les ponts disulfures des les protines priplasmiques. Pourquoi ? C'est probablement un systme de rparation. Quand une protine se replie, un pont disulfure erron peut se former entre deux thiols non prvus. Un va-et-vient entre oxydation et rduction peut s'oprer jusqu' l'acquisition de la solution correcte, un effet apparent celui des chaperons molculaires. Les changes dlectrons ncessaires se font avec la membrane cytoplasmique. Les deux cascades antagonistes font et dfont des ponts disulfures dans les protines. Les mtallothionines pourraient donc capter et se dbarrasser alternativement de leur charge mtallique par des oxydorductions similaires commandes en fonction des conditions. Laluminium est rarement cit en biologie malgr son abondance dans lcorce terrestre o il est massivement immobilis dans des silicates. Les proprits chimiques des ions aluminium ont des analogies avec celles de cations divalents comme Mg2+et Ca2+, ou trivalents comme Fe3+ et Cr3+. Laluminium entre en comptition avec le magnsium et le calcium pour les atomes doxygne. Par contre les ions Al3+ ont des effets toxiques sur les cellules. Il y a depuis quelque temps un regain dintrt pour laluminium quon souponne dtre en partie responsable de troubles neurologiques comme la maladie dAlzheimer. Heureusement presque tout
2 - La raction est celle des nucloside-diphosphate rductases, avec la thiordoxine rduite comme donneur. La thiordoxine oxyde est rduite nouveau par NADPH laide dune thiordoxine rductase .
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laluminium de lenvironnement est sous forme insoluble et son influence biologique en est limite. Cependant les ions AlF4 forms en prsence de fluorure ont une action toxique au niveau des rgulations cellulaires, et inhibent le fonctionnement des GTPases, car ils imitent les ions phosphate. Le tandem form par Al3+ et le GDP dans le site enzymatique se comporte comme un analogue du GTP. L'aluminium ne fait alors quaggraver les effets dsastreux exercs sur la flore par les pollutions au fluor 3. taux gal, l'impact des diffrents mtaux sur l'environnement dpend de facteurs multiples rangs sous le terme de spciation [16]. Elle dpend : de la nature du mtal ; de son degr d'oxydation ; de son tat physique (solide, liquide, collodal, cristallin, adsorption sur une surface) ; de sa structure molculaire dtaille. Par exemple le chrome sous forme d'oxyde de Cr(VI) se prsente comme un anion ttradrique soluble facilement entran par les eaux, alors que le Cr(III) est entour par 6 atomes d'oxygne dans un complexe octadrique, insoluble et immobile, ce qui le rend beaucoup moins dangereux pour les organismes. De faon gnrale, l'adsorption des polluants mtalliques sur des surfaces organiques, les argiles et autres silicates interfre avec leur mobilit et leur accessibilit biologique.
14.4 - MTAUX ET POLLUTION

Grce l'analyse des glaces du Groenland et de l'Antarctique, nous disposons d'archives remarquables de la pollution mtallique engendre par l'activit humaine. La contamination s'effectue au niveau de la troposphre par les poussires portes par les vents, selon des courants ariens bien connus des mtorologues. Le vent du sud amne de trs fines poussires qui se remarquent aisment sur les voitures ou les toitures vitres, jusqu' teinter la neige des Alpes en ocre ou en rose. Ces poussires viennent gnralement de plusieurs rgions du Sahara, o elles sont entranes par des vents violents. Un trajet classique est celui de poussires souleves en Mauritanie par les alizs, portes haute altitude au-dessus de l'Atlantique et rejetes vers le Nord-Est en direction de l'Europe par les contre-alizs (jet-streams). Encore s'agit-il de poussires "propres", essentiellement silicates. Les rejets de poussires mtallifres dans la basse atmosphre manent surtout de l'industrie et des transports, et colportent du plomb, du zinc, du cadmium, du cuivre Daprs les premires mesures faites en 1969, la contamination de la glace du Groenland par le plomb aurait augment 200 fois depuis le dbut du sicle. Cette contamination a t attribue aux additifs tels que le plomb ttrathyle qui a t utilis comme antidtonant dans l'essence. De nombreux pays dcidrent d'en
3 - Exemple dans le pass : la pollution cause par les industries chimiques de la valle de la Maurienne.
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limiter l'utilisation ds 1970, avant de les interdire compltement. Des carottages ont t pratiqus dans le Groenland central au nord du 72e parallle, par des technologies "ultra-propres" susceptibles d'liminer toute contamination artefactuelle de la glace au cours de son extraction, car les doses de mtal analyses sont de lordre du picogramme par gramme d'eau. Pour le cadmium, cela quivaut trouver un gramme de ce mtal dans 20 millions de tonnes de glace [17] ! Les chantillons manipuls avec de grandes prcautions ont t transports congels en Australie pour tre examins par des spectroscopies ultrasensibles (K. ROSMAN, Universit de Perth). Naturellement, plus on creuse profond, plus on remonte dans le temps, et plus les mesures sont dlicates. Des expriences du mme type ont t faites dans plusieurs parties du monde. L'examen de la neige tombe en 1998-99 dans les Alpes franaises a mis en vidence une pollution par le plomb venant de l'activit humaine, l'analyse isotopique suggrant un apport en provenance de l'Europe de lEst [18]. La mtallurgie du plomb serait vieille de 6000 ans. Le plomb tait extrait de la galne, qui est un sulfure renfermant un peu d'argent. Le grillage du minerai produisait des oxydes, qui tait fondu plusieurs fois l'air libre ce qui avait pour effet denlever l'oxyde d'argent. La rduction en mtal fondu se faisait par du charbon de bois. Une activit trs polluante ! On estime qu' l'apoge de l'Empire romain, la production globale a pu atteindre 80 000 tonnes par an, dont 4-5% se retrouvaient dans l'atmosphre 4 ! Lanalyse de la glace a rvl l'importance de cette pollution, qui s'est leve 5 fois le niveau naturel avant de dcrotre au cours de la dcadence de l'Empire, puis de s'lever nouveau aprs le Moyen ge. La pollution globale par le plomb entre 1850 et 1915 aurait t multiplie par cinq. On a tent de lexpliquer par la circulation maritime, car les baleiniers et navires marchands brlaient du charbon contenant du plomb. Une stabilisation et mme une diminution ont t constates partir de 1915 lors de l'ouverture du canal de Panama qui vitait aux navires de contourner le Cap Horn. Une forte remonte sest produite aprs 1940 avec lnorme accroissement de la circulation automobile, laissant loin derrire elle la pollution engendre par nos anctres ! L'analyse des isotopes du plomb a permis de se faire une ide de l'origine gographique du mtal [19]. Une part trs importante tait prise par lAmrique du Nord. Aprs 1972 a t observe une chute marque de l'apport de plomb accompagnant les mesures svres prises pour bannir le plomb de l'essence. On sait que le passage l'essence sans plomb est devenu obligatoire en France le 1er Janvier 2000. Comme quoi il n'est pas vain pour les gouvernements de prendre des mesures de protection efficaces. Une histoire comparable existe pour d'autres mtaux comme le cuivre. Ce mtal fut d'abord exploit l'tat natif, puis partir de minerais (oxydes et carbonates)
4 - Dans les annes cinquante, le plomb des cits antiques tait encore recherch pour la confection des enveloppes de dtecteurs GEIGER bas bruit de fond. Un tel pillage des richesses archologiques tant maintenant proscrit, on prpare le plomb ultrapur par raffinage du plomb "moderne". Le plomb a quatre isotopes naturels stables, dont trois sont engendrs par la dcomposition radioactive de l'uranium et du thorium.
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partir de l'ge du bronze. L'analyse de la glace a permis de dtecter deux surcrots de pollution au cours de lhistoire, supposs lis l're romaine et l'industrie chinoise de la fin du premier millnaire 5. Le fort tonnage de cuivre extrait des mines au cours des temps modernes na pas entran une augmentation aussi grande que ce que lon pouvait craindre, grce aux progrs technologiques raliss dans la cuisson et le raffinage des minerais. Une autre pollution de lre industrielle est celle du cadmium. C'est un sous-produit du traitement des minerais de cuivre, de plomb et surtout du zinc. Il est utilis en galvanoplastie, dans la confection de batteries Ni-Cd et autres, dans la fabrication de pigments, de ractifs chimiques et dans la production des matires plastiques. Des mtaux toxiques comme le cadmium et le vanadium peuvent saccumuler dans les sols et passer dans les plantes cultives. Les engrais chimiques phosphats en contiennent comme impurets. Le cadmium est considr comme cancrigne. Les pays riches ne sont pas seuls rpandre des mtaux dans la nature. Des problmes apparaissent un peu partout dans le monde cause de pratiques minires artisanales dans l'extraction de l'or ou d'autres mtaux. La contamination de l'environnement par l'tain s'tend cause de l'utilisation massive des botes de conserve et emballages mtalliques des boissons. L'emploi de l'tain ces usages est un march de plus de 50 000 tonnes par an et reprsente un fort enjeu conomique. Plutt que de bannir l'tain, on envisage une meilleure rcupration du mtal lors du tri des dchets. Les micro-organismes du sol et des eaux sont donc conduits rsister la menace que constitue lentre dun excs de mtal dans leur cytoplasme. C'est autour des sites miniers et industriels qu'on peut rcolter assez facilement des micro-organismes rsistants. Les bactries ont dvelopp plusieurs stratgies pour lutter contre un empoisonnement mtallique : le pompage du mtal vers l'extrieur de la cellule ; une oxydorduction susceptible de rendre les cations moins solubles en facilitant leur prcipitation autour de la cellule ; linsertion dans des complexes comme ceux de la mtallothionine dj cite. Dautres stratgies sont galement possibles. Les proprits de rsistance accompagnent gnralement lacquisition de gnes supplmentaires codant pour de nouvelles protines. Les micro-organismes utilisent souvent en mme temps plusieurs systmes de dfense qui sont pratiquement toujours rguls par induction et rpression. En outre les cellules amliorent leur capacit de rsistance en exacerbant les mcanismes de rparation en rapport avec un tat de stress. Do viennent les gnes de rsistance ? Ils sont gnralement apports par des plasmides. Aucun deux ne confre dun seul coup une rsistance tous les mtaux. Par contre un mme plasmide peut commander des rsistances multiples et donner lieu des situations remarquables. Un Ralstonia metallidurans-34 est 5 - S. HONG & coll. (1996) Science 272 : 246-249. Les besoins en cuivre taient irrguliers mais importants dans l'antiquit, en particulier pour la frappe des monnaies. Forte inflation, conqutes et changement de rgime politique ont d augmenter la consommation. Cest sans doute grce cela quon trouve dans les sites archologiques autant de pices perdues, oublies, ou encore jetes quand elles n'avaient plus aucune valeur.
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issu de terrains contamins par divers mtaux des teneurs slevant 50 000 ppm. Les systmes de dfense bass sur plasmide concernent notamment largent, le chrome, le cuivre, le mercure, le nickel, le titane et le zinc. Existent aussi des mcanismes de dfense contre larsnite, larsniate et le chromate. Les gnes concerns sont ordinairement regroups en oprons. Chaque systme de dfense est plus ou moins spcialis contre une cible dtermine [20]. Or la spcificit dun transporteur est rarement stricte. En expulsant un mtal indsirable, la cellule peut vacuer par mgarde un autre lment dont elle a besoin et dont elle risque de se trouver carence. Il y a donc des parades, et on peut s'expliquer ainsi que les mcanismes de transport sont gnralement contrls par des rglages perfectionns. Le tableau suivant montre quelques exemples de plasmides examins dans la littrature [21] : Plasmide Hte
R773 p1258 R100 pDU1358 pMOL28 pMOL30 pUM505 pRJ1004 E. coli Staphylococcus aureus Espces varies Serratia Ralstonia metallidurans 34 Ralstonia metallidurans 34 Pseudomonas aeruginosa E. coli
Rsistance
As(III), As(V), Sb3+ Cd2+, Zn2+ Hg2+ Hg2+, mthyl-Hg Co2+, Ni2+, CrO42 Cd2+, Co2+, Zn2+ CrO42 Cu2+
Gnes
arsABC cadA merR,OP,TPAD merR,OP,TPABD cnr, chrABC czcCBAD chr cdr, pcoARBC
Mcanisme*
A A R R+L E, E+I E I E + rep
La lettre A dans la colonne de droite (*) dsigne lexpulsion des lments indsirables sans oxydorduction. Comme elle a lieu contre-courant thermodynamique, une dpense dnergie est ncessaire. La source dnergie est lATP ou le potentiel membranaire. Dans le premier cas, la pompe est une ATPase spciale. Dans lautre il sagit dun systme antiporteur : les protons pousss vers lintrieur par le potentiel croisent le mtal qui se dirige vers la sortie. Lintervention dune oxydorduction est signale par R. La rsistance au mercure implique typiquement une rductase et une lyase organomercurique (L). Une rsistance par efflux (E) et une barrire lentre du mtal (I) interviennent aussi. Enfin les mcanismes de rsistance peuvent mettre en jeu des enzymes de rparation des dgts causs lADN (rep). Les plasmides porteurs de gnes de rsistance peuvent accueillir en mme temps d'autres oprons impliqus dans des biodgradations de xnobiotiques et offrent ainsi des perspectives pratiques intressantes. Dautre part des espces acidophiles que nous connaissons, comme des Thiobacillus, rsistent de trs fortes concentrations mtalliques et sont utilises dans la lixiviation de minerais faible teneur de fer et de cuivre. L'espoir des chercheurs et techniciens chargs de dcontaminer les sols est de favoriser la croissance de tels germes en ajoutant des nutriments et des facteurs de croissance, afin d'obtenir un lixiviat partir duquel on peut prcipiter les mtaux lourds, les rcuprer ou les liminer.
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14.5 - LE POMPAGE DU CADMIUM ET DU ZINC

Ces deux lments mtalliques nous offrent des exemples de protection par pompage travers la membrane. Le cadmium ne fait pas partie des lments indispensables la vie, contrairement lautre, et son abondance dans la lithosphre est relativement faible (0,15 g par tonne). Mais l'accumulation de ces mtaux pose rapidement des problmes environnementaux. Les contaminations proviennent de dchets industriels ou mnagers (batteries, galvanoplastie, alliages, pigments). La fabrication des piles et accumulateurs reprsente elle seule prs de 40% du cadmium consomm. En gnral les ions ne pntrent pas librement dans une cellule sans le concours dun transporteur. Les ions Cd2+ nchappent pas cette rgle, mais profitent fortuitement du systme prvu pour le manganse, et parviennent ainsi au cytoplasme. Un premier exemple de dfense fond sur le pompage du cadmium vers lextrieur a t examin en dtail chez Staphylococcus aureus. Diverses espces Gram-positives ont un dispositif trs similaire [22]. Le refoulement de lion Cd2+ lextrieur de la cellule ncessite de lATP comme source dnergie. Il est catalys par une ATPase membranaire selon ce principe : en prsence des ions cadmium lenzyme sautophosphoryle en un site dfini par lATP ; la dphosphorylation est couple avec le transport unidirectionnel de lion Cd2+. Ce principe est caractristique des ATPases fonctionnant avec un stade phosphoryl intermdiaire et elles sont appeles ATPases de type P. Leur inhibiteur caractristique est lion vanadate. LATPase du cadmium fait partie dune famille regroupant des transporteurs de cations tels que ceux du calcium, du magnsium ou des mtaux lourds [23]. La rsistance de Staphylococcus au cadmium est code sur un plasmide (pI258) porteur de l'opron cadAC dont le gne de lATPase (CadA) est la pice matresse. Lopron est induit par les cations divalents agissant sur la protine rgulatrice CadC. Ainsi chez Bacillus subtilis sont inducteurs les ions Cd2+, Zn2+, Pb2+ et Bi3+, le premier tant le plus efficace. La pompe CadA est enchasse dans la membrane mais dpasse largement dans le cytoplasme o se font la fixation du cadmium, lhydrolyse de lATP avec phosphorylation dun aspartate (D) sur la protine, lhydrolyse de cette liaison et la translocation du mtal travers la membrane. Un diagramme symbolise la squence des 727 acides amins de lenzyme chez le staphylocoque (sans respect de lchelle). Cette squence laisse prvoir quau moins 6 hlices traversent la membrane, bordes par des charges positives et ngatives contribuant dterminer lorientation. Le modle structural est typique des ATPases dites de type P qui sont exportatrices de cations, mais la partie N-terminale de la squence renferme un motif supplmentaire deux thiols (Cys-23, Cys-26) qui existe aussi dans des protines fixant le cuivre et le mercure. Sa fonction est de lier le mtal [24]. Un motif de squence caractristique des ATPases de ce type est CPC (Cys-Pro-Cys) dans la quatrime hlice transmembranaire 6. On le
6 - La prsence de proline dans une hlice alpha implique une torsion qui correspond certainement ici une exigence structurale.
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considre comme essentiel au transport des cations. Dautres dtails sont conservs dans cette famille de protines, comme le segment de 8 acides amins contenant thronine, glycine, glutamate et srine (TGES), une position aspartate-415 (D) et la lysine-489 (K) [25]. La phosphorylation transitoire se fait sur cet aspartate comme dans tous les transporteurs de type P des bactries, vgtaux et animaux.
domaine phosphatase site cadmium N SH SH domaine kinase
cytoplasme
+ + +
T G E S
+ +
+ + +
C P C
K C
extrieur
Organisation de CadA
Chose curieuse, des gnes codant pour des ATPases trs ressemblantes CadA par leur squence et leur mcanisme ont t identifis chez lhomme, et concernent le transport du cuivre. Le syndrome de Menkes est une carence aige en cuivre cause par une ATPase du GOLGI. Le cuivre dclenche la migration de lenzyme vers la membrane plasmique o se fait le pompage des ions. linverse la maladie de WILSON est une surcharge en cuivre due lincapacit du foie exporter le cuivre vers le sang ou la bile, d l encore au dfaut dune ATPase. La ressemblance de ces pompes ions Cu2+ avec CadA est une bizarrerie volutive qui na pas encore reu dexplication [26]. Elles sont dsignes dans la littrature respectivement par MNK et WND. Il y a une diffrence cependant : du ct N-terminal se trouvent 6 motifs susceptibles de lier le cuivre au lieu dun seul, ce qui fait que la chane est plus longue que celle de CadA. Les transporteurs de cations de type P forment une famille regroupant plus dune cinquantaine dATPases dont un inhibiteur caractristique est lion vanadate. Le modle CadA reprsente une sous-famille particulire o se rencontrent les transporteurs du cuivre voqus prcdemment, ainsi quun transporteur du zinc (ZntA) chez le colibacille [27], les transporteurs du cuivre CopA et CopB chez Enterococcus hirae 7, et CtaA dun Synechococcus (une cyanobactrie). Nous reviendrons sur le cuivre dans la section suivante. Des protines CadA et CopA sont prsentes chez
7 - Appel antrieurement Streptococcus faecalis. Prsent dans lintestin, pathogne quand il passe dans le sang : infections rnales, endocardites
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Helicobacter pylori [28]. La liste est certainement bien plus longue, car la dtermination complte des gnomes suggre que ces enzymes sont trs rpandues. Le colibacille est un organisme trs tolrant des doses relativement fortes dions Zn2+, Cd2+ et Pb2+. Une mutation sur le gne ZntA rend les cellules trs sensibles ces mtaux. Lhomologie de ce transporteur avec CadA est trs forte, et son fonctionnement a t tudi exprimentalement [29] par la technique des vsicules membranaires inverses. La liaison du mtal se fait sur la squence caractristique GxxCxxCz, la position z tant gnralement occupe par l'alanine (A). Le site aspartate phosphorylable (D) est dans un motif FD KTGTLT bien conserv. Le consensus transmembranaire montr titre dillustration contient la proline entoure de cystine et de rsidus hydrophobes.
G G G A L L L I T A A S L V V V L L L L L V V V I V V V 371 373 GCPCA GCPCA GCPCA ACPCA L L L L V V V G I I I L S S S A T T T T P P P P A I I T ZntA (E. coli) CadA (pI258, S. aureus) CadA (Bacillus subtilis) CtaA (Synechococcus)
Homologies
La construction dun arbre gnalogique indique une volution de ces transporteurs vers deux voies spcialises.
Cd, Zn ZntA (E. coli) CadA (S. aureus) CadA (B. subtilis) CopB (E. hirae) HRA1 (E. coli) HRAE (E. coli) MNK (Homme) WND (Homme) CopA (E. hirae) CtaA (Synechococcus)
Cu Zn ?
Cu Cu
Relations volutives bases sur les squences

La premire renferme les transporteurs du zinc et du cadmium (CadA, ZntA). La seconde est celle des transporteurs du cuivre (CatA, CopB, protines MNK et WND de lhomme). Le gnome du colibacille renferme au moins deux gnes supplmentaires correspondant ce groupe. Ils sont prsums impliqus dans le transport du cuivre, et dsigns par HRA1 et HRA2. Toutes ces protines ont un motif GCPC ou GCPH cystine ou histidine [30]. La gnalogie dduite des squences par RENSING et coll. suggre que ces ATPases ont une origine volutive trs ancienne, bien antrieure lre industrielle. La prsence chez lhomme de transporteurs du cuivre homologues de ceux des bactries est l pour suggrer une anciennet qui peut se comprendre, parce que la biosphre a t soumise de tout temps au lessivage des roches et des missions volcaniques. La plupart des facteurs de rsistance ninterviennent quen cas de contamination mtallique leve. Leur localisation sur des plasmides transmissibles autorise une dissmination rapide et la survie de la population bactrienne en conditions adverses.
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Le zinc est le mtal le plus abondant dans les organismes aprs le magnsium. Les bactries ont besoin de le rcuprer dans le milieu et parviennent le faire des teneurs aussi basses que 10 nM. Inversement tout excs devient toxique. Les bactries adaptes peuvent vivre en prsence de Zn2+ 10 mM, soit un taux plus lev dun million de fois que le prcdent. Il faut donc des mcanismes rgulateurs. En comptabilisant les protines connues pour fonctionner avec du zinc, on peut estimer quune bactrie "standard" a besoin d'environ 2 millions d'ions Zn2+, affects pour plus du quart l'ARN-polymrase qui en dtient deux par molcule denzyme. Le taux interne du zinc intracellulaire est finement rgul et maintenu un niveau de lordre de 1 mM. On peut provoquer artificiellement une disette en zinc par un complexant du type EDTA. Inversement un taux de ZnCl2 suprieur 1 mM dclenche un stress par excs de mtal. La pompe ZntA permet au colibacille de refouler le mtal l'extrieur, tandis que deux transporteurs le font entrer : ZnuABC (de la famille des transporteurs de type ABC) et le transporteur ZupT rcemment dcouvert. Il appartient une famille dj observe chez les eucaryotes [31]. Un quatrime facteur ZitB est un transporteur de type CDF. ZntA expulserait le zinc quand il est taux lev, tandis que ZitB agirait pour des taux plus faibles. Deux mutations supprimant la fois ZntA et ZitB rendent les bactries particulirement sensibles un excs de zinc, de cadmium et de plomb [32]. La rsistance au zinc n'est donc pas rgle par un seul transporteur, mais par une remarquable palette d'outils qui interfrent les uns avec les autres. La complexit de ces panoplies de transporteurs adapts des situations particuZn2+ Zn2+ lires est bien l'expression de la ZupT ZnuABC ncessit critique de rgler fineATP ment l'entre et la sortie d'un Zur ADP mtal la fois indispensable et dangereux. ADP + ZntR +
ATP ZntA Zn2+ ZitB Zn2+
Les transporteurs du zinc chez Escherichia coli
Les graphiques a et b sont tirs des expriences de GRASS, FAN et coll. (2000) pour mettre en vidence le transporteur ZitB.
poids sec (mg/mL)
1
Zn incorpor (nmole/mg protine) 1 2 3 4

4
3
8
0,4
0,5
1,5
concentration en ZnCl2 (mM)
20
40
60
temps en minutes
665
Des mutants sur tel ou tel transporteur sont slectionns par insertion dans les gnes correspondants d'une cassette porteuse d'un marqueur de rsistance un antibiotique (ttracycline). En a, la croissance de diffrentes souches au bout de 15 heures 37 a t mesure en fonction du taux de zinc dans le milieu. Les 4 sries de points exprimentaux sont les suivantes : 1 - Croissance du colibacille W3110 en prsence de diffrentes teneurs en chlorure de zinc aprs 15 heures 37C. La toxicit du zinc devient donc importante audessus de 1 mM. 2 - Le gne de la pompe ZntA a t inactiv. Les bactries sont plus fragiles un excs de zinc. 3 - Les bactries ont perdu la fois ZntA et ZitB. La sensibilit au zinc est encore plus forte. 4 - Les bactries utilises pour la courbe 3 ont reu un plasmide porteur du gne de ZitB. Ce dernier suffit restaurer une rsistance pratiquement normale lorsque ZitB est exprim son niveau maximum en prsence d'une ttracycline. Cette prcaution est indispensable, sinon le gne plasmidique serait mal exprim et les bactries risqueraient d'tre dpourvues de ZitB dans leur membrane. L'expulsion du zinc par ZitB compense nettement l'absence de la pompe ZntA. En b, les bactries ont t mises en prsence de 5 M de sulfate de zinc marqu par le zinc-65. La pntration du mtal est suivie au cours du temps. La suspension cellulaire est rapidement filtre sur membrane dont la radioactivit est mesure aprs lavage. La courbe 3 correspond aux cellules les plus sensibles qui sont dpourvues de ZntA et ZitB. Les bactries accumulent progressivement du mtal. En 4, il s'agit du mme mutant ayant reu le plasmide porteur du gne de ZitB. Quand ZitB est pleinement induit, l'accumulation du zinc est visiblement plus lente et s'explique par l'expulsion du zinc sous l'effet de ZitB. Il existe une premire protine rgulatrice Zur (zinc uptake regulator) homologue de Fur pour le fer (section 2). Elle lie le zinc selon une gomtrie ttradrique avec une incroyable affinit, des doses de l'ordre de 1012M, et rprime le transporteur ZnuABC. Elle a pour effet de freiner l'entre du zinc quand le taux de mtal dans la cellule est suffisant pour les besoins. Une deuxime protine rgulatrice, ZntR, est homologue d'une protine qui acclre la sortie du mercure (MerR). En activant la transcription du gne de ZntA, elle encourage le rejet du zinc quand son taux est excessif. Le rglage de la concentration interne en mtal, ou homostase, obit donc un rglage fin o les mmes outils contrlent l'entre du zinc ncessaire la survie et dclenchent sa sortie en cas de concentration trop leve. Ils permettent la cellule de se dfendre contre les conditions adverses de concentration, dans un sens comme dans l'autre. Cette section nous a donc permis de rencontrer des pompes membranaires fonctionnant comme des ATPases de type P. Ces enzymes dont le prototype est CadA permettent de refouler le mtal lextrieur en dpensant de lnergie ATP, son intervention tant dclenche en prsence de cadmium par CadC. Nous avons galement constat que le taux interne dun mtal essentiel la vie cellulaire comme le zinc, tait rgul par un ensemble de protines et de rgulateurs. Le
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refoulement du zinc vers lextrieur est catalys par ZntA et ZitB, lentre du mtal est assure par ZnuABC et ZupT. Le fonctionnement de ce systme est supervis par deux protines rgulatrices au moins, Zur et ZntR.
14.6 - LE CONTRLE DU PLOMB

Retour au plomb. Plusieurs espces bactriennes rendues rsistantes au plomb ont t isoles partir de terrains contamins, observation devenue banale alors que les mcanismes biochimiques n'ont t tudis que dans quelques cas. Le site minier de Carnouls, dans le Gard, abandonn depuis 30 ans, a de vastes carrires o le minerai de sulfure de plomb tait exploit. Il s'y trouve un stock important de rejets de traitement contenant encore 10% de sulfure de fer, du plomb et de l'arsenic. Les eaux d'un ruisseau avoisinant sont particulirement acides (pH 2,5-3,5) et riches en mtaux (Fe, Zn, Pb). Il en a rsult une pollution en aval par du fer et de l'arsenic. L'action des bactries fixes en tapis stratifis (Thiobacillus, Leptothrix), oxyde l'arsenic en arsniate (Section 10), mais il y a aussi du plomb qui coprcipite avec l'arsniate, ce qui contribue l'immobiliser et diminuer sa diffusion distance [33]. Le rejet du plomb par les ATPases de type P, CadA de S. aureus et ZntA de E. coli, montre que les ions Pb2+ sont substrats de mcanismes de rsistance prvus en mme temps pour d'autres cations. Par exemple le rgulateur CadC, qui rgule l'opron cadCA, rpond au plomb, au cadmium et au zinc [34]. Une souche remarquable est Ralstonia metallidurans 34 8, isole en Belgique il y a plus dune dizaine dannes par MERGEAY, et renfermant deux mgaplasmides, pMOL28 et pMOL30. Ces derniers confrent une rsistance leve une srie de mtaux [35]. Un systme autonome de rsistance au plomb a t caractris sur le pMOL30 [36], constitu par un opron inductible, pbrABCD codant pour les quatre composants : PbrA PbrB PbrC PbrD ATPase de type P homologue de CadA et ZntA Lipoprotine de la membrane externe Protine membranaire qui aurait rle dans l'exportation de PbrB Protine cytoplasmique capable de squestrer les ions Pb2+.
Les homologies de squence ont permis didentifier les diffrentes pices. Par exemple PbrA a des ressemblances nettes avec CadA et ZntA et sert visiblement repousser le plomb vers lextrieur. Le petit alignement de squences montre le site de fixation du mtal sur les trois protines, CPTE pour PbrA, CxxC pour les deux autres.
PbrA de R. metallidurans ZntA de E. coli CadA de S. aureus I E NMD C P T E E A L I R D K L A K L P G V V SG F DC A A C A RK V E N A V RQ L A G V V QG F T C A NC A GK F E KN V KK I P G V
8 - Anciennement Alcaligenes eutropha H34, puis Ralstonia eutropha H34.
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Ressemblance ne veut pas dire identit. Mais la prsence distance fixe de GV (les deux flches) est lindice dune homologie structurale. Il est trs probable que PbrA fonctionne comme une ATPase insre dans la membrane. La fonction de PbrB est par contre moins claire. Ce serait une lipoprotine exporte vers lextrieur avec l'aide de PbrC. Les trois protines PbrA, PbrB et PbrC sont induites ensemble, et le dfaut d'une seule d'entre elles rend les bactries plus sensibles aux ions Pb2+. Sur un plan gnral, les protines destines tre exportes hors du cytosol sont munies dune portion de squence N-terminale dite signal*. Cette squence est dtache la plupart du temps par une peptidase quand la protine se trouve libre de lautre ct de la membrane. La protine PbrC code par le plasmide pMOL30 serait une telle peptidase spcifiquement affecte lexportation de PbrB. La quatrime protine, PbrD, offre aussi une situation intressante. Elle n'est pas absolument ncessaire la rsistance au plomb, mais les mutants qui en sont dpourvus accumulent moins de mtal que le type sauvage. La protine possde un motif trs curieux, C(x)7CC(x)7C(x)7H(x)14C, o l'abondance de la cystine, de la proline et de la srine, voque la fixation d'un mtal et rappelle les mtallothionines. Son rle serait de stocker le plomb et de le neutraliser. Un intervenant intressant est le facteur PbrT, non cod par le mme opron que l'ATPase et log dans la membrane cytoplasmique. Cette protine est considre comme un transporteur de Pb2+ vers l'intrieur de la cellule. Quand PbrT est prsent alors qu'un dfaut affecte l'opron pbrABCD, les cellules deviennent extrmement sensibles au plomb, sans doute parce que celui-ci s'accumule en excs sans pouvoir tre export. On peut se demander l'intrt physiologique pour la cellule de possder un tel transporteur qui en somme fait entrer l'ennemi. Deux explications sont possibles. La premire est de supposer que PbrT n'est pas rellement spcifique du plomb et fait entrer un mtal utile qui n'a pas t identifi. Cette ide est contredite par le fait que le transporteur est induit en mme temps que l'opron pbrABCD, grce une protine rgulatrice qui est PbrR. La deuxime explication laisse penser que le transporteur est l pour loigner prcipitamment le plomb du priplasme et de la membrane interne (o il y a la prcieuse machinerie des oxydations), et de l'expdier sur PbrD avant dtre export de nouveau. Le schma d'interprtation de BORREMANS et coll. (2001) rsume lintervention prsume de ces diffrents facteurs :
Pb2+ extrieur
priplasme PbrT cytoplasme ATP PbrA ADP PbrB PbrD PbrC
Le modle du systme pbr
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Le systme pbr est rgul par la protine PbrR. Celle-ci commande l'opron pbrABCD et son propre gne, suivi de pbrT. La protine PbrR a des similitudes avec MerR qui commande la rsistance au mercure (section 9).
PbrR + Pb2+ pbrT pbrR pbrA pbrB pbrC pbrD
PbrR seul
Opron pbr
On notera la disposition caractristique des deux transcriptions divergentes partir du mme segment dADN, dun ct en prsence de plomb, de lautre en son absence.
14.7 - LA RSISTANCE AU CUIVRE

Bien qu'indispensable aux tres vivants, le cuivre devient vite redoutable par sa toxicit quand sa teneur slve dans les cellules. Le cuivre est assez gnreusement rpandu dans la nature par l'industrie ou l'agriculture, par exemple par l'emploi de la fameuse bouillie bordelaise comme fongicide. Les mcanismes de rsistance mis en uvre sont souvent complexes et diffrent d'un organisme l'autre. Nous en citerons quelques-uns en commenant par Enterococcus hira et en terminant par Escherichia coli. Enterococcus hirae est un pathogne dans certaines infections hospitalires. Il a des ATPases de type P spcialises dans le transport du cuivre, qui sont CopA (3.A.3.5.1) et CopB (3.A.3.5.2), codes par des gnes chromosomiques, et longues respectivement de 727 et 745 acides amins. Elles offrent une situation intressante. Les mutants copA deviennent relativement rsistants au cuivre et ont besoin dun taux suprieur de ce mtal dans leur milieu pour crotre. La protine CopA serait donc implique dans le transport du cuivre(I) de lextrieur vers lintrieur [37], contrairement la CopA de E. coli (3.A.3.5.1) qui travaillerait dans l'autre sens. La protine comporte deux sites dithiols, C-x-x-C et CPC, et le transport se ferait essentiellement sur le second. Le deuxime facteur CopB travaillerait de l'intrieur vers l'extrieur. Il a t possible dobserver ces transports avec des vsicules isoles comme dans lexprience faite avec CadA : laccumulation de cuivre-64 sobtenait en prsence dATP et de conditions rductrices. Les deux transporteurs sont des ATPases de type P et ont ici des effets antagonistes. Elles fonctionnent aussi avec Ag+, ont besoin d'un rducteur dans des membranes isoles, et le vritable substrat du transport dans les deux cas semble bien tre du cuivre rduit (Cu+). Une oxydorduction fonctionnerait donc la priphrie cellulaire en parallle avec le transport.

Cu+ ATP cytoplasme ATP
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CopA (importe)
extrieur
CopB (exporte)
Cu+
Les deux pompes de structure comparable mais non identique ont la mme orientation car elles captent lATP du ct interne. Si elles fonctionnent dans des directions opposes, cela pose une nigme intressante. Un transporteur subit des changements de conformation au cours dun cycle catalytique comme nimporte quelle enzyme. Un transport seffectuant sans couplage avec une dpense dnergie peut seffectuer potentiellement dans les deux sens, avec un va-et-vient rversible entre deux tats X et Y. Cest ce quon appelle une diffusion facilite, avec passage prdominant du compartiment le plus concentr vers le moins concentr. Au contraire si un couplage a lieu comme ici avec une hydrolyse dATP, le passage de lentit transporte (le cuivre) ne suit pas exactement le mme cheminement de X vers Y et de Y vers X. Il stablit un circuit analogue un cycle dhystrsis entre les deux parcours qui ne sont pas strictement inverses lun par rapport lautre. Dans CopA, une moiti du cycle est favorable au passage du cuivre de lextrieur vers lintrieur de la cellule, dans CopB cest lautre partie du cycle qui interviendrait en poussant le cuivre dans lautre sens. La protine CopB serait une pompe expulsant le trop-plein de cuivre sous forme de Cu+. Elle est active aussi sur l'argent (Ag+) [38]. On peut essayer de comprendre provisoirement cette situation assez paradoxale, en attendant que le mcanisme exact du transit soit mieux connu. Les deux gnes copA et copB appartiennent au mme opron, ainsi que deux autres gnes copY et copZ, qui codent pour des protines rgulatrices capables de lier le cuivre ou largent. Le dispositif est apparemment rgl pour que la cellule dispose en permanence du cuivre (noublions pas son caractre indispensable), mais qui veille ce qu'il n'y en ait pas trop. Voici le schma de cet opron avec son systme de rgulation [39]. Lopron copYZAB est transcrit dune seule pice en aval du promoteur (O) tant que la protine CopY, un rpresseur, ne vient pas sinstaller sur la rgion O/P (oprateur/promoteur). Cest le cas lorsque le milieu est pauvre en cuivre. La protine CopY est alors libre dans le cytoplasme. Les ions prlevs lextrieur et rduits en Cu+ sont imports par la pompe CopA qui est synthtise puisque lopron est transcrit. La pompe CopB sert de soupape et empche le taux intracellulaire du cuivre de monter. Or il reste modr parce que le mtal est utilis au fur et mesure pour la croissance.
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O/P sens de transcription copY copZ 145 Cu
+
copA 727
copB 745
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rpresseur
CopY
CopZ Cu+
Cu+ Cu+ forte concentration
Cu+ rpresseur inactiv
Quand le taux de mtal augmente, des ions Cu+ (ou peut-tre Cu2+) sont capts par CopY qui devient un rpresseur actif, s'attache lADN en O/P et freine la transcription de lopron. La cellule na plus besoin momentanment des pompes CopA et CopB, les besoins tant assurs pourvu que la concentration intracellulaire en cuivre reste dans des limites tolrables.Un mutant priv dun gne copY fonctionnel exprime intensment lopron et notamment copB, permettant aux cellules de se dvelopper en prsence dune concentration trs forte en sulfate de cuivre (10 mM). Par contre ce mme mutant crot beaucoup plus lentement que la souche sauvage en milieu pauvre en cuivre, sans doute parce que lexcs de CopB refoule au fur et mesure le cuivre qui vient de l'extrieur. Le mutant rcupre un comportement quasi normal si on y introduit un plasmide porteur dun gne copY intact qui ralise ce qu'on appelle une complmentation. Si le taux de mtal lev devient excessif, la protine CopZ intervient. En liant Cu+, elle sattache CopY et lempche de fonctionner comme rpresseur. Le site O/P tant alors libre, lopron est exprim et lindispensable pompe CopB, celle qui expulse le cuivre, est fabrique. Les bactries peuvent alors se multiplier en prsence de sulfate de cuivre 8 mM, ce qui est norme. Les ions du cuivre agissent donc comme inducteurs dans ces conditions. Les ions Cd2+ et Ag+ ont le mme effet. Les protines CopY et CopZ changent l'une et l'autre de proprits en liant les ions Cu+, la suite d'une modification structurale de nature allostrique, mise en vidence en RMN dans le cas de CopZ [40]. La solution observe chez E. hirae nest pas extrapolable toutes les espces bactriennes. La nature recle au contraire une grande varit de solutions. Synechococcus PCC7942 est une cyanobactrie dtenant une ATPase membranaire pour lentre du cuivre (CtaA, dont le gne figure dans larbre gnalogie de la section 5), et PacS localise dans la membrane du thylakode pour la sortie. Les deux gnes ctaA et pacS ne sont pas lis et sont rguls sparment [41]. Une situation encore diffrente se rencontre chez une autre cyanobactrie, Synechocystis PCC8303. Ces ATPases sont certainement rpandues aussi chez les eucaryotes. La levure de bire pompe les ions cuivre extrieurs avec une ATPase ressemblant la CopA rencontre prcdemment [42]. L'examen de Pseudomonas syringae rvle un dispositif particulier. Cette espce renferme un groupe de pathognes des plantes cultives, produisant des taches et des auroles sur les feuilles. L'emploi courant dagents antifongiques contenant du
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cuivre comme la bouillie bordelaise a facilit lapparition despces rsistantes au cuivre. Une des premires tudes dtailles a concern un Ps. syringae isol de cultures de tomates et porteur du plasmide pPT23D [43]. La rsistance au cuivre des espces bactriennes leur est souvent confre par un plasmide porteur de gnes qui se retrouvent sous une forme trs similaire dans les Pseudomonas, Xanthomonas et autres. Les gnes de structure sont dans lopron copABCD accompagn des deux gnes rgulateurs copR et copS. La nomenclature est ici fort malencontreuse, car ces gnes nont rien voir avec ceux de la rsistance au cuivre dcrits chez E. hirae. Les protines Cop cites maintenant sont donc totalement diffrentes des prcdentes. Les quatre protines CopA , B, C et D fabriques grce au plasmide viennent en renfort des facteurs dj cods par la bactrie sur son chromosome, spcialiss dans le transport du cuivre et son stockage ventuel l'intrieur du cytoplasme. Les gnes plasmidiques sont groups en opron copABCD. La protine CopD est membranaire, CopA et CopC sont priplasmiques, CopB serait associe la membrane externe. Quant au tandem CopR + CopS, il intervient dans une rgulation classique deux composants : CopS sautophosphoryle en prsence du mtal, et phosphoryle son tour CopR qui est lactivateur de la transcription [44]. Nous savons que les systmes deux composants sont construits sur une base commune reconnaissable par les homologies de squence. Ils fonctionnent en gros de la mme manire en utilisant un capteur et un rgulateur. Le premier dtecte le problme, le second passe la commande en activant la transcription des gnes concerns. Le schma rsume le transport du cuivre de faon hypothtique. Sont mis en jeu des facteurs membranaires de transport et de stockage cods par le chromosome ( gauche), et l'appareil de rsistance Cop cod par le plasmide.
Cu(II) CopD CopC Cu(I) Cu(II) stock Cu CopA priplasme cytoplasme
CopD Cu(II) Cu(I) enzymes
Transport du cuivre et rsistance

Le robinet d'entre du cuivre n'est jamais compltement ferm, car la cellule en a besoin comme oligo-lment. Si la concentration intracellulaire du mtal devient excessive, il y a deux parades : le piger par des protines spcialises, si possible au niveau du priplasme, ou l'expulser totalement. La premire mthode existe, au moins en partie, chez P. syringae, dont les colonies deviennent d'un beau bleu en prsence d'un sel de cuivre, car elles retiennent les ions Cu2+ dans leur priplasme. On pense gnralement que les deux procds coexistent, le cuivre accumul dans le priplasme tant celui que les cellules n'ont pas encore eu le
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temps de librer dans le milieu. Nanmoins le pigeage priplasmique est peut-tre physiologiquement avantageux comme une mise lcart du mtal pour en limiter les effets toxiques. CopA semble efficace pour cela, car la protine peut retenir 11 ions cuivre grce la rptition du motif squentiel MxxMxHxxM et de sites histidine surnumraires, tandis que CopC n'en auraient qu'un seul. Les protines CopA et CopC seraient donc des protines priplasmiques de stockage de Cu(II), mais on connat mal leurs relations avec les deux autres partenaires membranaires. Il existe en outre une oxydorduction des ions cuivre entre Cu(I) et Cu(II), mais on ignore presque tout de son mcanisme. Neutraliser les ions cuivre par des protines ? Le procd peut paratre onreux pour la cellule. Il n'est peut-tre pas suffisant. P. syringae se sert ventuellement de polysaccharides externes, comme les alginates, pour complexer ces ions. La synthse d'alginate dans certaines souches, qui deviennent mucodes, est induite assez spcifiquement par les ions cuivre. Ce n'est jamais qu'un cas particulier de ces bactries qui utilisent les alginates comme agents protecteurs, malheureusement pour nous quand il sagit de formes pathognes dont le pouvoir infectieux n'en est que renforc. Escherichia coli hberge des gnes plasmidiques (pRJ1004) comparables ceux de P. syringae, La terminologie officielle tant pcoABCD et pcoRS [45]. La dcouverte de colibacilles rsistants au cuivre tire son origine de l'levage industriel du porc : les bactries ont t isoles partir des djections de jeunes animaux auxquels on administrait des rations augmentes en cuivre pour promouvoir leur croissance ! Le fait dominant est ici l'existence de deux appareils diffrents pour vacuer le cuivre du cytoplasme, les systmes cue (Cu efflux) et cus (Cu-sensing). Chacun possde son propre rgulateur. Le colibacille est un anarobie facultatif, l'un des systmes est mieux adapt l'arobiose, l'autre l'anarobiose. Activateurs Protine Nature
CueR CusR, CusS CopA CueO CusC CusB CusA CusF Dans la membrane interne, ATPase exportatrice de Cu+. Oxydase contenant 4 Cu, oxyde Cu+, Fe2+, des sidrophores. Protine de la membrane externe. Systme actionn par p. Ancre dans la membrane interne avec long domaine priplasmique. Antiporteur de la famille RND, fait sortir Cu+ et entrer un proton. Lie le cuivre dansle cytoplasme.
Les comptences des deux systmes se recouvrent en grande partie [46]. La pompe CopA, induite par CueR quand la concentration interne en cuivre prend une valeur critique, aurait le rle principal dans la tolrance au mtal en vie arobie. La protine a t caractrise comme ATPase de type P [47]. Inversement les protines CusABC forment un complexe induit par CusR. Sa fonction prdominerait en anarobiose. Le tandem CusS/CusR est un systme deux composants o CuS a pour fonction de dtecter les ions Cu+ dans le priplasme, et o CusR est l'activateur. Leur dtection dans le cytoplasme appartient CueR. Le mtal est donc reconnu dans les deux compartiments. Le systme cus est galement activ par les ions argent (Ag+) qu'on peut considrer comme des analogues des ions Cu+.
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Le systme cusCFBA pour les biochimistes est un reprsentant de la vaste famille des transporteurs RND*, dont l'une des branches est consacre au transport vers l'extrieur de cations mtalliques. Ce systme est tout fait distinct des ATPases de type P car il tire son nergie du potentiel membranaire. Le quatrime constituant, CusF, est une petite protine capable de lier le cuivre dans le priplasme. Sa fonction n'est pas encore bien cerne. Un schma voque les deux systmes cue et cus. On y voit un facteur CueO. Quel est le rle de cette protine ? Cette protine est une oxydase transformant les ions Cu+ en Cu2+ au niveau du priplasme. La rduction du cuivre intervient au niveau cellulaire sous l'action du mtabolisme et de plusieurs rductases et augmente en anarobiose. Le potentiel Cu2+/Cu+ en solution aqueuse ions est trs physiologique, soit E' = + 150 mV , peu loign de celui du glutathion (+ 220 mV). Or les ions Cu+ sont plus toxiques que la forme oxyde, car ils induisent des ractions radicalaires. Inversement Cu+ est plus favorable au passage travers la membrane interne pour des raisons nergtiques. Quand la pompe CopA fonctionne, les ions Cu+ sont jects dans le priplasme o ils sont oxyds par CueO et accumuls. On peut penser que lorsque ce systme est satur, la prsence des ions Cu+ en excs est alors dtecte par CusS, qui contribue activer l'autre systme.
membrane externe priplasme membrane interne CueO CopA ATP CueR CusR CusS
CusC CusB p CusA
copA cueO
cusC
cusB cusF cusA
L'exportation du cuivre chez E. coli

La structure de l'oxydase priplasmique CueO est connue en dtail par la cristallographie [48]. Elle renferme 4 ions cuivre dont un spar des trois autres et de type I (voir cuivre*). Elle se rapproche d'autres cuproprotines comme la laccase, l'ascorbate oxydase et la cruloplasmine. L'enzyme n'oxyde pas que le cuivre, mais aussi les ions Fe2+, le 2,6-dimthoxyphnol et le sidrophore entrobactine. La fonction prcise de cette oxydase reste nanmoins incertaine. En rsum, il est visible que lentre du cuivre et la lutte contre les excs du mtal ont fait natre au cours de lvolution une varit de dispositifs. Enterococcus hirae contrle lentre et la sortie par les ATPases CopA et CopB, rgules par CopY et CopZ. La deuxime solution voque est celle de Pseudomonas syringae, avec apport plasmidique de facteurs CopA, B, C et D rpartis entre la membrane externe, le priplasme et la membrane interne. Les rgulations se font par un systme
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deux composants, CopR et CopS. Finalement le colibacille possde au moins deux systmes diffrents, celui de lATPase CopA rgul par CueR et favoris en arobiose, lensemble CusAFBC dominant en anarobiose, rgul par les deux composants CusS et CusR. Une protine CueO intervient dans une oxydorduction sur le cuivre.
14.8 - TRANSPORT PAR POTENTIEL MEMBRANAIRE

Nous retrouvons ici le cadmium, mais il revient accompagn du cobalt, du zinc, du chrome et du mercure. Le principe de dfense est encore lexpulsion du mtal hors du cytoplasme, mais lATP est remplac par le potentiel de membrane comme source dnergie. La sortie des ions mtalliques est couple avec lentre des protons, selon le principe des transporteurs RND voqus dans le cas du cuivre. Leur analyse a t faite par gntique molculaire. Le petit tableau nous aidera retrouver la signification des sigles gntiques utiliss dans la littrature : Sigle
cus czc czr cnr ncc sil
Rsistances
cuivre, argent cadmium, zinc, cobalt cadmium, zinc cobalt, nickel nickel, cobalt, cadmium argent
Organismes
Escherichia coli Ralstonia metallidurans Pseudomonas aeruginosa Ralstonia metallidurans Alcaligenes xylosoxidans Salmonella
Une premire espce bactrienne modle est le Ralstonia metallidurans (dj cit et dsign autrefois comme Alcaligenes eutropha), un chimiolithotrophe facultatif du sol ne se dveloppant gure plus de 30C. Les bactries peuvent utiliser loxydation de lhydrogne comme source dnergie, et vivre en autotrophie sur CO2, mais se cultivent commodment sur gluconate. La souche la plus intressante est R. metallidurans CH34 de MERGEAY et coll. [49]. Les multiples facteurs de rsistance prsents dans cette souche sont situs sur les deux mgaplasmides, pMOL28 (180 kb) et pMOL30 (238 kb), dont l'ensemble confre une rsistance trs leve 9 mtaux. Lopron czcCBA sur pMOL30 code pour une rsistance au cobalt, au zinc et au cadmium o participent trois protines formant un complexe plac cheval sur les deux membranes. On en connat la composition, mais son organisation relle reste problmatique [50]. Larrangement symtrique suggr par le croquis est une interprtation hypothtique. Le fonctionnement serait celui dun antiporteur. Quand un ion mtallique sort, des protons rentrent. On suppose que les charges sont quilibres (deux protons pour un cation bivalent). Le potentiel membranaire bti sous forme dune force protonmotrice p par couplage avec les oxydations cellulaires, favorise le retour des protons vers lintrieur et entrane lexpulsion dun ion mtallique.

Cd2+ Zn2+ Co2+
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extrieur membrane externe priplasme CzcB CzcC
CzcC
CzcB
peptidoglycanes
+++++
membrane interne CzcA CzcA
+++++
2 H+
Le complexe antiporteur Czc

La pice essentielle serait CzcA dans la membrane interne. Les deux autres protines, CzcC et CzcB faciliteraient le passage travers le priplasme et la membrane externe. Le retour des protons au cytoplasme pendant la sortie des cations mtalliques entranerait donc une augmentation locale de pH et la prcipitation des sels mtalliques (hydroxydes, carbonates, sulfures). Il se formerait dabord un dpt amorphe, puis des cristaux visibles en microscopie lectronique. Cette prcipitation des sels mtalliques lextrieur est une stratgie de rsistance frquente, et rend moins ais le retour des ions toxiques vers l'intrieur cause de leur insolubilit. La synthse du complexe CzcCBA dpend d'une rgulation deux composants (encore une) compose de CzcR et CzcS. Un autre complexe bti sur le mme principe et homologue du prcdent est cod par pMOL28 dans la souche CH34. Il sagit du systme Cnr qui confre la rsistance au cobalt et au nickel. Sa mise en uvre montre un dispositif intressant. Comme la plupart des rsistances aux facteurs trangers, ce systme est inductible, cest--dire quil est fabriqu lorsque les mtaux expulser sont prsents en excs. Il est donc fond sur des protines rgulatrices. Il y en a trois : CnrH, CnrX et CnrY. Les gnes sont disposs en deux oprons, les promoteurs tant indiqus par les flches [51] :
cnrY cnrX cnrH cnrC cnrB cnrA
Les oprons cnr

Le pompage vers lextrieur se fait par CnrA, CnrB et CnrC. Lopron correspondant est command par un autre opron dont lexpression est dclenche surtout par les ions Ni2+ une forte concentration (0,2 mM), et dans une moindre mesure par les ions Co2+, Zn2+, et chromate. Une dltion de cet opron rgulateur cnrYXH, empche en grande partie la synthse du complexe de pompage. La prsence du gne rgulateur cnrH tout seul favorise au contraire une synthse maximale du
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complexe. Explication : le gne cnrH code pour un facteur sigma* autorisant le dmarrage de la transcription par lARN-polymrase partir des deux promoteurs. Comment le rglage fonctionne-t-il ? Les protines CnrX et Y formeraient un ensemble priplasmique. qui viendrait sassocier ce facteur sigma (CnrH) et bloquerait son action lorsque le taux de mtal dans le priplasme est trs faible. Cest la partie CnrX qui reconnat cette situation. Cet lment fixe lion mtallique et transmerait linformation CnrY, qui agirait son tour sur CnrH en bloquant son action. Il y aurait donc une cascade d'information du nickel CnrX, puis vers CnrY. Celui-ci bloquerait alors le facteur sigma CnrH. La transcription en aval tant entrave, la synthse de la pompe exportatrice serait ainsi mise en veilleuse. Que se passe-t-il quand le nickel est en excs ? Le complexe CnrXY devient satur par Ni2+ et se dtache de CnrH. Le facteur sigma tant libr, la transcription peut commencer au niveau des deux promoteurs. Il en rsulte une induction simultane de toutes les protines, CnrX, CnrY, CnrH et la pompe CnrCBA. La rarfaction du nickel devrait entraner un retour la case dpart avec blocage de la transcription. En fait il y a toujours une petite synthse rsiduelle des protines priplasmiques car sans cela les cellules deviendraient peu peu incapables de dtecter la prsence du nickel. Pourquoi un dispositif aussi compliqu dans R. metallidurans ? Nous savons que cette espce est chimio-lithotrophe et peut se dvelopper sur H 2 et CO2. Or le nickel lui est absolument ncessaire pour le fonctionnement de ses hydrognases ! Le transport dun minimum de nickel est requis, mais le systme de reflux CnrABC se charge de chasser un trop-plein ventuel. Les bactries sont donc armes pour faire face aux situations extrmes. Le facteur sigma appel ici CnrH sera pour nous le prtexte dvoquer une question intressante d'importance gnrale. Il suffit de se rappeler la nature exacte d'un facteur sigma ou facteur damorage* de la transcription. Pour transcrire tous les gnes de son patrimoine, la cellule dispose de plusieurs facteurs sigma, chacun tant capable de reconnatre un type dtermin de promoteur. Il existe des promoteurs courants concernant la transcription d'un grand nombre de gnes et reconnus par sigma-70. D'autres promoteurs intressent une partie spcialise de l'conomie cellulaire : mtabolisme azot, choc thermique Un facteur sigma particulier, cod par rpoE, a t dcouvert initialement chez E. coli et a reu le nom de sigma-E ou sigma-23. Il correspond une nouvelle famille ou facteurs ECF (extracytoplasmic function factor), capables de dclencher une transcription sous l'effet d'un signal extrieur [52]. La protine CnrH en fait partie. La rsistance aux mtaux n'est pas la seule utiliser ce mode de dclenchement par un signal extrieur. Parmi ces derniers, il y a la prsence dans le priplasme de protines abmes par un choc thermique (sigma-E de E. coli), l'action de facteurs d'environnement sur Pseudomonas aeruginosa pour la synthse d'alginate, l'irradiation lumineuse de Myxococcus xanthus pour la synthse de carotnodes, et la rsistance la pression chez un Photobacterium 9. La ressemblance du facteur CnrH du Ralstonia CH34 avec le sigma-E du colibacille suggre donc que nous sommes en
9 - Une espce Gram-ngative dite barophile, isole plus de 5000 m de profondeur et croissant au-dessous de 18C, avec un optimum vers 10 MPa de pression. L'adaptation ces conditions repose sur une rgulation
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prsence d'un mcanisme anti-stress d'un modle banal chez les bactries. Voici la trame simplifie dune rponse anti-stress chez Escherichia coli :
signal extrieur
extrieur, priplasme
anti- anti-
cytoplasme
ARN-polymrase
transcription
ADN
Facteur sigma de type "ECF"

Le facteur sigma-E (ou -23) est brid au niveau de la membrane cytoplasmique par deux protines priplasmiques, RseA et RseB, formant un complexe qui dborde l'extrieur (comme plus haut les protines CnrX et Y). La dtection par ces deux protines des divers dgts survenus dans les protines du priplasme ou dans la membrane externe active le sigma-E. Ce facteur lance la transcription d'une dizaine de gnes. De nouvelles protines apparaissent. L'une d'elles est une protase DegP qui va digrer les protines endommages, pratique des rparations plus subtiles. Sur la liste des protines induites figure RpoH. La protine RpoH est elle-mme un facteur sigma (ou -32), qui lance l'expression d'une srie de gnes du choc thermique. Plusieurs protines nouvelles apparaissent dans le cytoplasme. La machine s'emballe, mais pas pour longtemps car des rtrocontrles viennent brider nouveau le fonctionnement de RpoH et de sigma-E, empchant une vritable amplification des effets caractre explosif.
remise en ordre extra-cytoplasmique activation par action extrieure, choc thermique, apparition de protines dnatures remise en ordre l'intrieur de la cellule
-E
RpoH

rtro-contrles
Sigma-E chez le colibacille

gntique qui ressemble au systme rpoE du colibacille. Beaucoup de Photobacterium vivent comme des pathognes sur les poissons. Ils sont voisins des Vibrio et leur nom vient de leurs proprits luminescentes.
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Nous constatons que lexcs dun lment mtallique est parfois assimilable un tat de stress, contre lequel la cellule peut lutter avec des outils comparables ceux qui sont observs au cours de diverses agressions comme le choc thermique.
14.9 - MERCURE ET MERCURIELS

Le mercure est prsent ltat de traces dans les roches et dans un sol non pollu, des taux de lordre de 0,01 0,02 ppm. Son minerai est le cinabre (HgS) de couleur rose. Le caractre particulier du mercure mtallique est dtre la fois liquide temprature ordinaire et relativement volatil, ce qui fait que latmosphre en contient une quantit faible qui augmente de prs de 1% par an pour cause de pollution. Le mercure est le seul mtal prsent sous forme de vapeur dans l'atmosphre. Il est transport distance et oxyd en Hg2+ par action photochimique en prsence dozone [53]. Le mercure se lie facilement au soufre ainsi quau carbone. Dans le premier cas des combinaisons insolubles telles que (RS)2Hg se forment avec les thiols. Dans le second, les produits forms sont le mthylmercure CH3Hg, ou le dimthylmercure (CH3)2Hg. La mthylation du mercure est ralise chez des bactries et ces produits tendent saccumuler dans les invertbrs et les poissons, do ils sont transmis lhomme. Ces mthylations sont catalyses par des enzymes corrinode 10. Il existe un cycle du mercure dans la nature. Les volcans et les ocans sont l'origine du mtal, qui est retenu et immobilis dans les sols pendant de longues dures sous forme d'ions mercuriques Hg2+. L'activit bactrienne les rduit en Hg0 volatil. C'est sous la forme mercurique qu'il est entran nouveau vers le sol, o il peut rsider pendant des priodes fort longues. Aussi l'rosion des sols, particulirement dans les pays chauds, est-elle l'un des facteurs qui contribuent mobiliser le mercure vers les cours d'eau. Le mercure est gnralement toxique sous ses trois formes diffrentes : mercure lmentaire (Hg0), ion mercurique (Hg2+), et composs organomercuriques, dont le principal est le mthylmercure , la forme la plus nocive. La toxicit sexplique par la formation d'une liaison covalente avec les thiols de nombreuses enzymes. La contamination par le mercure remonte gnralement les chanes alimentaires sous sa forme mthyle qui ne slimine que trs lentement. Les principales sources de contamination viennent de rejets varis (mdicaments, herbicides, fongicides, piles, lampes fluorescentes, contacteurs, thermomtres), sans oublier la pollution atmosphrique globale de l'hmisphre nord. En Amrique du Sud (Guyane, Brsil), l'orpaillage entrane une forte contamination des sols et des rivires par le mercure. Chaque kilogramme d'or extrait consomme au moins 1,2 kg de mercure lmentaire, dont une partie est rejete dans l'atmosphre. Des taux significatifs peuvent se trouver dans la chair des poissons du grand large et s'lever 1 g/g (en poids sec). La contamination des poissons de rivire par le mthylmercure peut atteindre des taux trs levs, de 500 plus de 5000 g/g ! L'exposition au mer10 - Le mthyl-mercure se prpare facilement (mais dangereusement) par raction du chlorure mercurique sur la mthyl-cobalamine (analogue de la vitamine B12).
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cure reste modre en France, mais notre ingestion moyenne par semaine peut s'lever une centaine de microgrammes, soit environ un tiers de la dose juge maxima par l'OMS. Elle viendrait essentiellement de la consommation de gros poisson. La dtection de la contamination chez l'homme se fait surtout au niveau des cheveux. Une prise de conscience mondiale des dangers de la pollution par le mercure a eu lieu la suite du drame de Minamata, au Japon. Entre 1932 et 1968, la compagnie Chisso spcialise dans lindustrie des fertilisants, des parfums et des matires plastiques 11, dversa sans prcaution dans la baie des rsidus contenant du mercure pour un total estim 27 tonnes. La population habitue manger du poisson a t gravement contamine, plus de 800 personnes ont t atteintes par des troubles neurologiques graves, 46 en moururent et beaucoup souffrirent dun handicap irrversible. La firme responsable, rpute performante, est devenue pour longtemps le symbole des traitements dsinvoltes infligs lenvironnement et aux populations quand la recherche du profit maximum prime sur tout le reste. Un autre mfait mettre sur le compte de linconscience ou de lignorance est la pollution de lAmazonie brsilienne par les chercheurs dor. On estime que la distillation de lamalgame par les "garimpeiros" avec des moyens rudimentaires laisserait chapper 30-40% du mercure dans latmosphre. Le mercure utilis en grande quantit pour lextraction a gravement contamin le sol, les eaux et la faune. De gros efforts techniques et lgislatifs ont t consacrs un peu partout pour contrler lpandage du mercure et de ses composs. Chose curieuse, cest dans latmosphre sous forme de vapeur trs dilue que le mercure pose le moins de problme. La dcontamination biologique des eaux et du sol consiste donc transformer le mercure en Hg0, afin qu'il schappe dans lair ambiant. Le mercure libre est beaucoup trop dilu pour avoir une action toxique. Quant aux ions mercuriques, ils restent pigs par les acides fulviques du sol ou sur les thiols des sdiments. La dpollution des composs mercuriels par les bactries repose sur deux oprations essentielles. La premire est la rupture par une lyase intracellulaire, de la liaison CHg dans les composs organiques comme le mthyl-Hg ou le phnyl-Hg, et le mercure est libr ltat dions Hg2+. La deuxime est l'action d'une rductase mercurique qui transforme les ions Hg2+ en mercure lmentaire (Hg0).
MerB lyase CH4 Hg2+ MerA rductase bactries, tissus animaux Hg0 bactries mercure atmosphrique cycle du mthane
dimthyl-Hg mthyl-Hg+
Cycle simplifi du mercure
11 - Chisso veut dire Azote, en japonais. Lun des produits de base tait lactaldhyde, dont la fabrication peut se faire par ptrochimie partir de lactylne (hydratation en milieu sulfurique contenant HgSO4 comme catalyseur).
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En 1974 ont t rcolts dans une collection hospitalire prs de 800 plasmides de rsistance aux antibiotiques. Leur examen aprs introduction dans le colibacille a rvl quun quart de ces plasmides comportaient des gnes de rsistance au mercure [54]. La disposition des gnes sur transposon est peu prs toujours la mme et les recherches ont mis laccent sur quelques cas, tels que Tn21 (dans R100 de Shigella flexneri), Tn501 (dans PVS1 de Pseudomonas), et le plasmide pDu1358 de Serratia marcescens [55]. La structure de la rgion mer dans ce dernier est indique par un diagramme :
transcription merR O/P merT merP merA merB merD
Protine merR merT merP merC merA merB merD
Fonction p. rgulatrice agissant comme rpresseur sur la rgion oprateur/promoteur (O/P) protine membranaire de transport des ions Hg2+ capte les ions Hg2+, les cde MerT deuxime route de transport de Hg2+ rductase mercurique, contient FAD, utilise NADPH comme source dlectrons lyase organomercurique, confre la rsistance au mthylmercure protine rgulatrice accessoire
Opron mer de pDU1358

Ce schma est soumis des variations d'un plasmide l'autre. Le gne merB nest pas toujours prsent chez les bactries Gram-ngatives. Il confre une rsistance large spectre, qui sexerce non seulement sur les ions mercuriques mais sur le phnyl- ou le mthylmercure. La rsistance des bactries dpourvues de merB est dite "spectre troit". Lordre des gnes est parfois diffrent, comme chez Thiobacillus, qui renferme deux gnes rgulateurs merR1 et merR2, et deux gnes merA dont lun nest pas fonctionnel [56]. Les progrs de la biologie molculaire ont permis de rviser danciennes donnes. Par exemple Pseudomonas K62, qui est la premire souche tudie dans les annes 1970 pour sa rsistance au mercure, a non pas un seul gne merB impliqu dans la rsistance aux organomercuriques, mais un second spcifique pour la rsistance au phnylmercure [57]. Voici un schma de fonctionnement pour la lyase MerB sur un organomercuriel, un thiolate de mthylmercure [58]. Le site catalytique renferme deux positions thiol et une rgion hydrophobe. Le mercuriel est scind en trois parties. Les chimistes prvoient un tat de transition (cas des ractions d'limination SE2) symbolis entre crochets. L'enzyme a besoin d'un thiol externe not R-SH pour se dbarrasser du mercure. MerP et MerT sont des protines de transport de Hg2+, la premire tant priplasmique et la seconde membranaire. Un troisime facteur MerC est parfois prsent (Thiobacillus). On a compar ces transporteurs une paire de gants de base-ball, le mtal tant nich dans chaque cas sur deux thiols logs dans une cavit.
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S RSHgCH4
Hg A
CH3 H S S Hg A H
S S H
RSH rgion hydrophobe A H RSHgSR RSH (en excs) S S Hg A CH4
CH3
MerB
Il saute dun gant lautre, de dithiol en dithiol, mais sans passage ltat libre. Les ions mercuriques affectionnent les sulfures et thiols, et cest sur des groupes thiols quils se retrouveront dans MerA, la rductase. Les mutants dpourvus dun transport efficace des ions mercure continuent simbiber des organomercuriques sans avoir besoin de ces protines, car leur caractre lipophile facilite le passage travers la membrane. On connat assez bien le fonctionnement de la rductase mercurique ou MerA, lenzyme de Bacillus ayant t cristallise et analyse aux rayons X [59]. Les homologies de squence montrent que l'enzyme fait partie d'une famille d'oxydorductases organises en deux sous-units symtriques portant chacune un site catalytique. La glutathion rductase et la lipoamide rductase* font partie du mme groupe. Ces rductases oxydent NADH ou NADPH, ont toujours du FAD li de faon covalente et renferment un site dithiol essentiel. La glutathion rductase fournit le modle de fonctionnement pour un site. Le glutathion oxyd sera symbolis ici par GSSR, le glutathion rduit par GSH.
NADPH 2 H+ S GSSG FAD SH SH SH NADP+ 2 GSH FAD SH SH
NADP+ FADH2 S
NADP+ FAD
FAD
EH2
SH
Le schma suivant nous aidera comprendre le fonctionnement de la rductase mercurique o deux sous-units fonctionnant sur ce mode participent la liaison du mercure [60]. La protine rduite en EH2 sur les deux thiols du site actif est rduite nouveau en EH4 par NADP. Le cycle catalytique reprsent sur un seul site s'effectue donc entre le stade EH2 muni de ses deux thiols et le stade EH4 possdant la fois une flavine rduite et deux thiols.
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NADPH Hg2+ 4 H+
4 H+ NADP+ Hg0
FAD
S HS SH HS SH HS SH S
FADH2
NADP+
S S 0 Hg S S SH HS SH S
FAD
auxil.
auxil.
S HS SH HS SH HS SH S
auxil.
EH2
FAD
EH4
FAD
EH2
FAD
Rductase mercurique
La protine dispose en outre d'une paire de cystines supplmentaires pour lier le mtal. Le stade EH4 retourne EH2 en cdant deux lectrons l'ion mercurique. Chaque sous-unit sert ainsi d'auxiliaire pour celle d'en face en apportant la coordination du mercure deux thiols supplmentaires qui n'existent pas dans les autres rductases de la mme famille. Le mercure est donc li ici par 4 atomes de soufre. Comment les ions Hg2+ s o n t-ils introduits dans la cellule ? L'un des facteurs responsables est la protine MerP localise dans le priplasme et porteuse de deux thiols libres [61]. Le passage travers la membrane cytoplasmique est assur par une petite protine de 116 acides amins, MerT. Le contrle gntique de la rsistance au mercure est devenue une question classique [62], le systme le plus connu tant l'opron merTPCAD port par les transposons Tn21, TN501. Cet opron renferme les gnes d'un systme de transport (merTPC), celui de la rductase mercurique (merA) et un gne rgulateur (merD) qui bloque l'expression de l'opron quand les ions mercuriques Hg2+ ont t rduits en Hg0. L'opron mer du plasmide pDU1358 contient en outre un gne merB pour la lyase qui scinde le mthylmercure, situ entre merA et merD (voir un schma prcdent). Le schma suivant reprsente l'opron mer du transposon Tn21 de Shigella flexneri [63].
merR p
MerD
p merT MerR Hg2+
merP
merC
merA
merD
MerR
Opron mer
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Deux transcriptions partent en sens contraire d'un promoteur (p). La protine rgulatrice MerR est un dimre qui se lie l'ADN dans la rgion des promoteurs, mais son effet n'est pas le mme selon que ce facteur a li ou non du mercure. En prsence des ions Hg2+, MerR active la transcription de l'opron merTPCAD. Il la rprime en leur absence (signes + et ). De plus, la protine MerR gne la transcription de son propre gne. Enfin la protine MerD se lie galement au promoteur de l'opron sur le mme site que MerR, et contribuerait au rglage fin de l'ensemble. La liaison les ions mercuriques avec MerR est trs forte, la constante de dissociation tant de l'ordre de 0,01 M. MerR lie aussi avec moins d'affinit d'autres mtaux comme Cd(II), Zn(II), Au(I) et Au(III). Le facteur MerR a servi de modle pour mieux comprendre le principe des associations entre protines rgulatrices et ADN. Dans le cas prsent, MerR est la fois activateur et rpresseur, et semble infliger dans les deux cas une distorsion locale l'ADN. Le caractre essentiel de ce systme est de pouvoir basculer avec une grande sensibilit de l'activation de l'opron un blocage pur et simple [63, 64]. MerR est une protine allostrique pouvant sauter d'une conformation une autre selon qu'il y a liaison ou non avec un ion mtallique. Il n'y a peut-tre pas de diffrence fondamentale entre l'activation et la rpression ce niveau, parce que MerR s'installe dans les deux cas au niveau du site promoteur et favorise l'accs de l'ARN-polymrase l'tat du complexe dit ouvert qui est ncessaire au dmarrage de la transcription*. Dans le cas de la rpression, MerR n'empcherait pas le complexe ouvert de se former, mais empcherait l'ARN-polymrase de dmarrer. La liaison avec le mercure entrane un changement structural favoris par le mode de liaison de l'ion Hg2+ sur trois thiols de cystine, dont deux se trouvent sur un monomre, le troisime sur l'autre. Il en rsulte un arrangement dissymtrique qui fait que la protine ne lie qu'un seul ion mtallique bien que le dimre dispose thoriquement de deux sites [65]. Des remplacements d'acide amin par mutation permettent MerR de fixer prfrentiellement le cadmium plutt que le mercure, mais il n'y a pas encore d'explication complte sur le comportement de ce rgulateur faute den connatre la structure dtaille. Ce sujet mrite un bref dtour vers les vgtaux. On a remarqu depuis longtemps la capacit quont certaines plantes vivant prs des exploitations minires de rsister de trs fortes concentrations mtalliques et daccumuler selon les cas de larsenic, du cadmium, du cuivre, du cobalt, du slnium, ainsi que du mercure. Lide est venue dutiliser les plantes pour nettoyer le terrain par phytoremdiation. Limprgnation mtallique dun organisme vivant requiert en gnral une chlation par des protines spciales, comme les phytochlatines vgtales et les mtallothionines des animaux. Malheureusement les plantes rsistantes ne sont pas aussi courantes qu'on le souhaiterait. Peut-on rendre rsistantes des espces qui ne le sont pas ? Lopration a t ralise au cours des dernires annes sur Arabidopsis thaliana malgr quelques complications techniques. Elle a consist introduire dans un ADN vecteur un gne merA provenant de Tn21, et linjecter dans les plantules par lintermdiaire dAgrobacterium*. Les plantules transgniques devenaient beaucoup plus rsistantes aux ions mercuriques que les plantules tmoins, pouvant supporter des teneurs allant de 20 100 M [66]. Le dessin inspir de RUGH et coll., reprsente le principe exprimental. Aprs addition
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dun sel mercurique (25 M), les vapeurs de mercure produites sont entranes et analyses. Les plantes transformes, o toute bactrie est absente, dgagent nettement plus de mercure que les plantes de dpart, au-dessus dun bruit de fond n en grande partie de ractions non spcifiques 12.
nanogrammes Hg0/mg de tissu vgtal
air filtr
60
avec merA
40
analyseur de vapeur de mercure Hg0
20
tmoin
plantules dans milieu contenant HgCl2
0 0
minutes aprs addition de Hg2+
10
Rduction des ions mercuriques par des plantules d'Arabidopsis transgnique

Chose amusante, les auteurs ont observ que certains Arabidopsis transforms et rendus rsistants ne pouvaient plus se passer des ions mercuriques pour se dvelopper ! Les plantes taient galement rsistantes aux sels dor (Au3+). Nul doute que ces expriences devraient valoir effectivement de lor pour les laboratoires la recherche dun contrat ! Forts de ces rsultats, les chercheurs ont effectu la mme opration de transfert gntique avec merB, qui dtermine la synthse de la lyase dans Arabidopsis thaliana laide dun promoteur en place [67]. La plante transforme rsiste facilement des concentrations de mthylmercure allant jusqu 2 M qui seraient ltales pour les plantes non-transformes. Linsertion simultane de merA et merB a t ralise plus rcemment. Compare la plante normale, lArabidopsis transforme peut se dvelopper sur des concentrations de mthylmercure 50 fois plus leves ! La phytoremdiation attire lattention des spcialistes chargs de dcontaminer les sols, parce que de nombreuses plantes sont capables dapporter des solutions, soit par les micro-organismes quelles attirent au contact de leurs racines, soit par leur facult dextraire des substances comme ici les mtaux. Le mercure a lavantage de se voir expuls dans latmosphre. Les autres mtaux sont au plus pigs sous une forme moins toxiques ou dplacs dun endroit un autre. Les plantes charges dlments mtalliques sont prleves, brles, et les cendres sont stockes ou traites pour en extraire le mtal.
12 - Par la photosynthse les vgtaux produisent des corps rducteurs. En outre il y a des oxydorductions spontanes avec la matire organique.
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14.10 - RSISTANCES L'ARSENIC ET L'ANTIMOINE

L'arsenic et l'antimoine ne font pas partie des mtaux proprement dits, mais en ont certaines proprits. Ils donnent lieu comme eux des phnomnes de rsistance. Le minerai le plus rpandu est un sulfure de fer et d'arsenic FeAsS ou mispickel, ou arsnopyrite, dont l'une des sources en France est la mine d'or de Salsigne dans l'Aude. L'arsenic y a t exploit surtout une certaine poque avant 1910 quand il tait employ principalement comme fongicide. Cette mine a t exploite pendant des sicles et contient aussi du cuivre, du bismuth et de l'argent. En 1982, on avait dj extrait 71 tonnes d'or, 200 d'argent, 1300 de bismuth, 20 000 de cuivre et 325 000 d'arsenic ! Son exploitation tait surtout celle de l'or avant sa fermeture en 2004. Le mtal prcieux est dispers dans l'arsnopyrite, dont il fallait traiter une tonne pour rcuprer 5-7 g d'or. L'accumulation de l'arsenic pour lequel il n'y avait plus de march suffisant a ncessit un stockage volumineux et un risque norme de pollution dans la rgion, devenant l'objet d'une vive proccupation au cours de ces dernires annes, vu les grandes quantits de scories laisses l'abandon. La contamination touche les cours d'eau (des taux de 50 mg et plus d'As ont t relevs localement), et les terres cultivables sont contamines par les poussires. L'arsenic a des analogies avec le phosphore par ses proprits, et presque toutes les molcules contenant de l'arsenic sont toxiques. Au niveau le plus oxyd ou As(V), l'ion arsniate (AsO43) correspond l'acide ortho-arsnique et se comporte comme un analogue de l'ion phosphate. Le niveau intermdiaire, ou As(III), est celui de la plus grande toxicit ; il correspond aux arsnites et l'anhydride arsnieux As 2O3, ou dans la nature un minerai appel orpiment (As2S3). L'anhydride arsnieux est la poudre blanche ressemblant de la farine, presque sans saveur ni odeur, le poison clbre qui a inspir la fameuse comdie Arsenic et vieilles dentelles mise au cinma par Frank CAPRA, et les humoristes l'ont fait appeler poudre de succession. L'orpiment a une couleur jaune vif utilise dans des peintures. Un arsnite (AsO2) se lie aux fonctions thiols des protines, notamment les sites dithiols de la thiordoxine et de la glutardoxine. L'antidote est le 2,3-dimercaptopropanol. La forme la plus rduite de As correspond aux arsniures et l'hydrogne arsni AsH3. L'activit bactrienne du sol transforme facilement l'arsenic en mono- et dimthyl-arsenic, qui sont des formes trs toxiques. L'antimoine est plac au-dessous de l'arsenic dans la classification priodique et donne des combinaisons chimiques comparables. Il est relativement courant dans les roches sous forme Sb(V) dans la stibine (Sb2S3). Un certain nombre d'espces Gram-positives et -ngatives tudies pour leur rsistance l'arsenic et l'antimoine paraissent employer le mme mcanisme de base qui leur est confr par des gnes plasmidiques groups en oprons ars et prsentant de fortes homologies d'une espce l'autre. Dans ce cas de figure, l'arsniate est rduit en arsnite. Le dispositif complet se rencontre chez Escherichia coli R773 et R46. Le plasmide est prsent en plusieurs exemplaires dans les bactries rsistantes, et chaque opron est soumis rpression par la protine ArsR [68]. L'induction par un taux faible d'arsniate lve l'inhibition et
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permet l'expression des gnes successifs sous le contrle de ArsD, qui agirait comme une sorte de valve. La longueur en acides amins (aa) et la fonction des diffrentes protines drives sont indiques par un tableau.
O/P
arsR
arsD
arsA
arsB
arsC
Prot. Long. ArsA ArsB ArsC ArsD ArsR 583 429 141 120 117 aa aa aa aa aa
Fonction ATPase membranaire, s'associe ArsB Transport de l'arsnite vers l'extrieur, actionn par le potentiel membranaire Arsniate rductase Protine rgulatrice accessoire Rpresseur
Opron ars du plasmide R773

Les deux protines les plus importantes sont ArsC et ArsB. La premire a une action malencontreuse, car elle rduit l'arsniate en une forme bien plus toxique, l'arsnite. Le facteur ArsC utilise indirectement NADPH comme donneur d'lectrons. Le mcanisme observ chez Staphylococcus met en jeu une thiordoxine et une thiordoxine rductase (signale par TR). Dans d'autres cas, une glutardoxine remplace la thiordoxine, et le principe reste le mme par l'alternance entre formes dithiol et disulfure [69].
NADPH H+ S thiordoxine S oxyde ArsC SH SH S S arsniate As (V)
TR
NAD+ SH thiordoxine SH rduite ArsC arsniate As (III)
Rduction de l'arsniate
Le passage de l'arsniate une forme bien plus toxique peut paratre une opration fort dltre pour la cellule. En fait il n'en est rien parce que l'arsnite est rapidement vacu par une pompe qui est ArsB. La source d'nergie est la force protonmotrice p. C'est l qu'intervient un systme trs intressant. La protine ArsA est une ATPase qui est capable de s'associer ArsB. Lorsque le complexe membranaire ArsA/ArsB est form, l'ensemble fonctionne comme une pompe actionne par l'hydrolyse d'ATP. C'est un cas particulier o les bactries peuvent jouer sur les deux sources d'nergie habituelles, le potentiel membranaire d'un ct, le potentiel ATP de l'autre [70]. D'autre part, la protine ArsA est intressante sur le plan biochimique. C'est un dimre o chacune des deux parties a deux domaines homologues articuls sur une zone flexible. Chaque domaine a un site d'hydrolyse d'ATP. Il y en a donc quatre pour la molcule entire. L'arsnite est pig par des fonctions thiol, peut-tre au sein d'un mme monomre comme indiqu par le croquis [71].

sites ATPase
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S domaine N-terminal S As S domaine C-terminal
Diagramme structural du dimre de ArsA

Revenons la structure de l'opron ars. On dispose maintenant d'un certain nombre de squences plasmidiques obtenues partir de Staphylococcus aureus, S. xylosus, Escherichia coli et Bacillus subtilis. L'ordre est le mme et les squences sont ressemblantes, mais les gnes arsA et arsD peuvent manquer l'appel, notamment chez les staphylocoques. Seules sont toujours prsentes les protines ArsB, ArsC et ArsR dans les souches rsistantes, et c'est pourquoi elles ont t signales plus haut en caractres gras dans le tableau. Autre fait singulier : la rsistance l'arsenic et l'antimoine n'est pas toujours porte par un plasmide. Les souches de colibacille dpourvues de plasmide montrent une rsistance non ngligeable, et on a dcouvert que le chromosome renferme des gnes arsR, arsB et arsC regroups dans un opron homologue de celui qui a t dcrit dans le plasmide, hormis l'absence des gnes A et D [72]. Le cas particulier de Bacillus subtilis laisse apercevoir une situation trange [73]. Cette espce banale de l'environnement est connue pour ses endospores extrmement rsistantes. La sporulation est dclenche par une carence nutritive. Ds les premiers stades, une division donne naissance deux cellules trs diffrentes, la cellule mre et la prspore qui reste englobe dans la premire. La maturation de la spore est analogue une diffrenciation cellulaire qui met en jeu au moins 80 gnes. La cellule mre de son ct est le sige de nombreuses modifications. L'une d'elles intresse la rsistance l'arsenic. L'expression de protines nouvelles dans la cellule mre ncessite un facteur d'amorage particulier, un sigma, cod par sigK. Ce gne n'existe pas au dpart, ou plutt il est constitu de deux parties spares par une longueur de 48 kb dsigns par spoIIIC et spoIVCB (schma). C'est l'excision complte du segment de 48 kb qui va permettre de joindre les deux morceaux et de faire un sigK fonctionnel. La longueur excise renferme le gne spoIVCA, qui code pour une recombinase spcifique du site ncessaire cette excision !
IICA skin IVCB IICA 48 kb IIID IIIC sigK pro-K K
Gnes spo
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La partie excise par l'intervention conjointe de la recombinase IVCA et d'une protine code ailleurs par spoIIID est appele "skin" 13 par les spcialistes. C'est dans cette partie que se trouvent les gnes ars de la rsistance l'arsenic. Derrire un promoteur se trouve un opron arsR, un gne de fonction non identifie, puis arsB et arsC. Les trois gnes R, B et C sont homologues de ceux qu'on trouve chez Staphylococcus. La partie "skin" est excise sous forme d'une boucle et code pour une recombinase. Cette question intrigue. Elle suggre l'excision d'un prophage correspondant un ancien virus hberg par la bactrie, car l'excision de cette boucle ressemble celle du bactriophage Lambda. En conditions adverses, l'induction d'un prophage lui permet de s'extirper et de commencer sa multiplication. L'excision ne dbouche ici sur rien, mais reconstitue un facteur sigma dont l'utilit est sans doute la raison pour laquelle ce curieux dispositif n'a pas t limin. Le produit de sigK n'est en fait que le prcurseur de ce facteur sigma, qui est transform en produit dfinitif par une maturation comportant un point de coupure de la chane par une peptidase. L'tude de ces rsistances pose le problme de l'apparition des gnes cits et de leur dissmination la fois chez les Gram-positifs et -ngatifs. Il est probable que les gnes R, B et C sont trs anciens, leur prsence tant lie la prsence ubiquiste des minraux et combinaisons chimiques de As et Sb. Les gnes arsA et arsD auraient pu natre d'un recrutement ultrieur. Les gnes ars rpandus dans les populations bactriennes auraient t intgrs secondairement dans des plasmides, dont la multiplicit dans les cellules qui les hbergent peut apporter celles-ci un fort avantage slectif. Le problme va au-del des cas particuliers abords dans ce chapitre, car il concerne l'volution et l'adaptation des populations de micro-organismes face des agents toxiques ou xnobiotiques. Cette question a t aborde par plusieurs auteurs [74]. En gros, il s'agit d'obtenir artificiellement des recombinaisons et mutations partir des trois gnes ars (R, B et C ) apports par le plasmide pI258 de S. aureus et multipli dans le colibacille. Un peu comme on bat les cartes avant de jouer, le rsultat tant filtr par une forte slection, aboutissant l'obtention de cellules capables de se multiplier en prsence d'une dose trs leve d'arsniate (jusqu' 0,5 M !). Il a t possible d'obtenir des oprons recombins extrmement performants qui avaient tendance s'intgrer au chromosome, donc d'occuper une position stable. Les exemples prcdents ont fait tat d'une rduction de l'arsniate en arsnite (le couple As(V)/As(III) a un E' de l'ordre de 60 mV). Le processus inverse, qui est l'oxydation de l'arsnite, transforme celui-ci en une entit moins toxique l'aide d'une arsnite oxydase. L'arsniate form est ensuite mthyl. Cette proprit semble assez courante chez des Pseudomonas, Alcaligenes, Thiobacillus et autres. L'arsnite oxydase la mieux caractrise est celle d'Alcaligenes faecalis [75]. L'enzyme de 100 kDa renferme des noyaux fer-soufre et du molybdne dans un cofacteur du mme type que ceux qu'on trouve dans les molybdo-enzymes. La structure dtaille de la protine montre qu'elle appartient un modle original, 13 - Jeu de mots pour "sigK intervening".
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avec deux sous-units trs ingales. La premire renferme un ion molybdne li deux bioptrines et un centre fer-soufre particulier du type [3Fe-4S]. Elle ressemble la DMSO rductase et la nitrate rductase dissimilatrice. Le molybdne passe alternativement du stade Mo(IV) Mo(VI). La seconde sous-unit est une protine de type RIESKE qui ressemble celle du cytochrome bc1. Les plantes peuvent aussi accumuler de l'arsenic et servir de base une phytoremdiation [76]. Un bon concentrateur est Pieris ensiformis et son glutathion rduit l'As(V) en As(III). Ce dernier est alors facilement pig, soit par trois molcules de glutathion pour donner un trithiolate d'arsenic, soit par une phytochlatine. Un travail rcent a montr que cette phytoremdiation tait amliorable par transformation gntique des plantes. Deux gnes impliqus dans la tolrance d'E. coli l'arsenic ont t insrs dans le gnome d'Arabidopsis. L'un d'eux est celui qui code pour ArsC, la rductase transformant l'arsniate en arsnite. Le second code pour une gamma-glutamylcystine synthtase, qui participe la gense du glutathion [77]. L'arsnite est alors pig par les thiols et la plante prsente une forte rsistance l'arsenic, qu'elle accumule dans ses feuilles. Des essais sont en cours avec d'autres plantes. Une quipe espagnole a montr rcemment que le radis mis en prsence de taux levs d'As (1 5 mg/L) pouvait le concentrer fortement des niveaux le rendant impropre la consommation sans que la plante en subisse des effets toxiques [78]. Cette constatation ne peut donc qu'inciter la prudence dans les cultures industrielles intensives lorsque sont rpandus des pesticides arseniqus.
CONCLUSION
Les exemples abords dans ce chapitre permettent de se faire une ide sur l'intervention des mtaux dans les cycles naturels, leur circulation, les oxydorductions dont ils sont le sige. La contamination grandissante de l'environnement par les rejets mtalliques n'est pas seulement directement dommageable pour nous, mais aussi pour la microflore laquelle on confie la charge des biodgradations. Nous avons vu que les bactries ont dvelopp des systmes sophistiqus pour importer les mtaux dont elles ont besoin tout en limitant les entres excessives. Une part de leur nergie, par ATP ou potentiel de membrane, est consacre au refoulement des excs toxiques. Les systmes aperus sont des exemples supplmentaires de mcanismes d'asservissement par lesquels les cellules maintiennent la composition de leur milieu interne.
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Pyrite de fer
RFRENCES
[1] M E Y E R M, T E L F O R D JR, C O H E N S M, W H I T E D J, X U J & R A Y M O N D KM (1997) J. Am. Chem. Soc. 119 : 10093-10103. [2] W O N G - L U N - S A N G S , B E R N A R D I N I V, H E N N A R D C , K Y S L I K P, D E L L A & A B D A L L A H MA (1996) Tetrahedron Lett. 37 : 3229-3232. [3] W A T E R S VL (1991) Microbiol. Rev. 55 : 437-450. [4] B O Y D PW & coll. (2000) Nature 407 : 695-702. [5] B A R B E A U K, R U E EL, B R U L A N D KW & B U T L E R A (2001) Nature 413 : 409-4403. [6] F O N T E C A V E M, C O V E S J & P I E R R E JL (1994) Biometals 7 : 3-8. [7] H A N T K E K (2001) Cur. Opin. Microbiol. 4 : 172-177. [8] B A I C H O O N & H E L M A N N JD (2002) J. Bacteriol. 184 : 5826-5832. [9] P A N I N A EM, M I R O N O V AA & G E L F A N D MS (2001) Nucleic. Aids Res. 29 : 5195-5206. [10] B A I C H O O N, W A N G T, Y E R & H E L M A N N JD (2002) Mol. Microbiol. 45 : 1613-1629. [11] M O E C K G S & C O U L T O N JW (1998) Molecular Microbiol. 28 : 675-681. 12] S T O J I L J K O V I C I & S R I N I V A S A N N (1997) J. Bacteriol. 179 : 805-812. [13] S P R E N C E L C , C A O Z, Q I Z, S C O T T D C , M O N T A G U E MA, I V A N O F F N, X U J, R A Y M O N D KM, N E W T O N S M & K L E B B A PE (2000) J. Bacteriol. 182 : 5359-5364. [14] K A G I JH & S C H A F F E R A (1988) Biochemistry 27 : 8509-8515. [45] K O B A Y A S H I T & I T O K (1999) Embo J. 18 : 1192-1198 ; C O L L E T JF & B A R D W E L L JC A (2002) Molec. Microbiol. 44 : 1-8. [16] B R O W N G E, F O S T E R AL & O S T E R G R E N JD (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 3388-3395. [17] B O U T R O N C (1996) Pour La Science, 228 : 34-41. [18] V E Y S S E Y R E AM, B O L L H O F E R AF, R O S M A N KJ, F E R R A R I C P & B O U T R O N C F (2001) Environ. Sci. Technol. 35 : 4463-4469.
14 LA CIRCULATION DES MTAUX [19] R O S M A N KJR , W . C H I S H O L M W , B O U T R O N C F, C A N D E L O N E JP & U. G R L A C H U (1993) Nature 362 : 333-335. [20] S I L V E R S & P H U N G LT (1996) Annu. Rev. Microbiol. 50 : 753-789. [21] M E R G E A Y M (1991) Trends Biotech. 9 : 17-24. [22] N U C I F O R A G , C H U L, M I S R A TK & S I L V E R S (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86 : 3544-3548 ; I V E Y D M, G U F F A N T I AA, S H E N Z, K U D Y A N N & K R U L W I C H TA (1992) J. Bacteriol. 174 : 4878-4884. [23] A G R A N O F F D D & K R I S H N A S (1998) Molec. Microbiol. 28 : 403-412. [24] S I L V E R S & W L D E R H A U G M (1992) Microbiol. Rev. 56 : 195-228 [25] T S A I KJ & L I N E T AL (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305 : 267-270. [26] S I L V E R S (1996) Gene 179 : 9-19. [27] O K K E R I J & H A L T I A T (1999) Biochemistry 38 : 14109-14116.
691
[28] M E L C H E R S K, S C H U M A C H E R A, B U H M A N N A, W E I T Z E N E I G G E R T, B E L I N D , G R A U S & E H R M A N N M (1999) Res. Microbiol. 150 : 507-520. [29] R E N S I N G C , M I T R A B & R O S E N BP (1997) Proc. Natl. Acad. Sci 94 : 14326-14331 ; B E A R D S J, H A S H I M R, M E M B R I L L O - H E R N A N D E Z J, H U G H E S MN & P O O L E RK (1997) Molec. Microbiol. 25 : 883-891/ [30] S O L I O Z M & V U L P E C (1996) Trends Biochem.Sci. 21 : 237-241 . [31] G R A S S G , W O N G MD , R O S E N BP, S M I T H RL & R E N S I N G C (2002) J. Bacteriol. 184 : 864-866. [32] G R A S S G , F A N B, R O S E N BP, F R A N K E S , N I E S D H & R E N S I N G C (2000) J. Bacteriol. 183 : 4664-4667. [33] L E B L A N C M., A C H A R D B & P E R S O N N E J.- C H (1995) In " Mineral Deposits : from their origin to their environmental impacs", P A S A V A , K R I B E K & Z A K eds, publ. Balkema, Rotterdam : 127-130. [34] R E N S I N G C , S U N Y , M I T R A B & R O S E N BP (1998) J. Biol. Chem. 273 : 32614-32617. [35] M E R G E A Y M, M O N C H Y S , V A L L A E Y S T, A U Q U I E R V, B E N O T M A N E A, B E R T I N P, T A G H A V I S , D U N N J, V A N D E R L E L I E D & W A T T I E Z R (2003) FEMS Microbiol Rev. 27 : 385-410. [36] B O R R E M A N S B, H O B M A N JL, P R O V O O S T A, B R O W N NL & V A N D E R L E L I E D (2001) J. Bacteriol. 183 : 5651-5658. [37] R E N S I N G C , F A N B, S H A R M A R, M I T R A B & R O S E N BP (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 : 652-656 ; F A N B & R O S E N BP (2002) J. Biol. chem. 277 : 46987-46992. [38] O D E R M A T T A & S O L I O Z M (1995) J. Biol. Chem. 270 : 9217-9221 [39] O D E R M A T T A & S O L I O Z M (1995) J. Biol. Chem. 270 : 4349-4354. [40] W I M M E R R, H E R R M A N N T, S O L I O Z M & W U T H R I C H K (1999) J. Biol. Chem. 274 : 22597-22603. [41] P H U N G LT, A J L A N I G & H A S E L K O R N R (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 9651-9654 ; K A N A M A R U K, K A S H I W A G I S & M I Z U N O T (1994) Molec. Microbiol. 13 : 369-377. [42] P H U N G LT, A J L A N I G & H A S E L K O R N R (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 9651-9654. [43] C O O K S E Y D A (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53 : 454-456. [44] C O O K S E Y D A (1994) FEMS Microbiol. Rev. 14 : 381-386. [45] B R O W N NL, B A R R E T T S R, C A M A K A R I S J, L E E BT & R O U C H D A (1995) Mol. Microbiol. 17 : 1153-1166. [46] O U T T E N FW , H U F F M A N D L, H A L E JA & O ' H A L L O R A N TV (2001) J. Biol. Chem. 276 : 30670-30677. [47] F A N B & R O S E N B (2002) J. Biol. Chem. 277 : 46987-46992.
692
[48] R O B E R T S S A, W E I C H S E L A, G R A S S G , T H A K A L I K, H A Z Z A R D JT, T O L L I N G , R E N S I N G C & M O N T F O R T W R (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99 : 2766-2771. [49] M E R G E A Y M, N I E S D H , S C H L E G E L H G , G E R I T S J, C H A R L E S P & V A N G I J S E G E M F (1985) J. Bacteriol. 162 : 328-334. [50] D O N G Q & M E R G E A Y M (1994) Mol. Microbiol. 14 : 185-187 ; D I E L S L, D O N G Q , V A N D E R L E L I E D , B A E Y E N S W & M E R G E A Y M (1995) J. Indust. Microbiol. 14 : 142-153 ; R E N S I N G C , P R I B Y L T & N I E S DH (1997) J. Bacteriol. 179 : 6871-6879. [51] G R A S S G , G R O B E C , N I E S D H (2000) J. Bacteriol. 182 : 1390-1398 ; T I B A R Z A W A C , W U E R T Z S , M E R G E A Y M, W Y N S L & V A N D E R L E L I E D (2000) J. Bacteriol. 182 : 1399-1409. [52] M I S S I A K A S D & R A I N A S (1998) Molec. Microbiol. 28 : 1059-1066. [53] B A R K A Y T, T U R N E R R, S A O U T E R E & H O R N J (1992) Biodegradation 3 : 147-159. [54] S C H O T T E L J, M A N D A L A, C L A R K D , S I L V E R S & H E D G E R RW (1974) Nature 251 : 335-337. [55] P A R K S - J ,W I R E M A N J & S U M M E R S AO (1992) J. Bacteriol. 174 : 2160-2171 [56] I N O U E C , S U G A W A R A K & K U S A N O T (1991) Mol. Microbiol. 5 : 2707-2718. [57] K I Y O N O M, O M U R A T, F U J I M O R I H & P A N - H O U H (1995) Arch. Microbiol. 163 : 242-247. [58] B E G L E Y TP & W A L S H C T (1986) Biochemistry 325 : 7192-7200 ; W A L S H C T, D I S T E F A N O MD , M O O R E MJ, S H E W C H U K LM & V E R D I N E G L (1988) FASEB J. 2 : 124-130. [59] M I L L E R S M, M A S S E Y V, B A L L O U D P, W I L L I A M S C H J R , D I S T E F A N O MD & coll. (1990) Biochemistry 29 : 2831-2841 ; M I L L E R S M, M A S S E Y V, W I L L I A M S C H J R , B A L L O U D P & W A L S H C T (1991) Biochemistry 30 : 2600-2612. [60] D I S T F A N O MD & coll. (1989) Biochemistry 28 : 1168-1183 ; M O O R E MJ & W A L S H C T (1989) Biochemistry 28 : 1183-1194 ; M I L L E R S M & coll. (1989) Biochemistry 28 : 1194-1205. [61] Q I A N H , S A H L M A N L, E R I K S S O N PO , H A M B R A E U S C , E D L U N D U & S E T H S O N I (1998) Biochemistry 37 : 9316-9322. [62] S U M M E R S AO (1986) Microbiol. Rev. 40 : 607-634. [63] C A G U I A T JJ, W A T S O N AL & S U M M E R S AO (1999) J. Bacteriol. 181 : 3462-3471. [64] L U N D PA & B R O W N NL (1989) J. Mol. Biol. 205 : 343-353 ; F R A N T Z B & O ' H A L L O R A N TV (1990) Biochemistry 29 : 4747-4751. [65] W R I G H T JG & coll. (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112, 2434-2436. [66] R U G H C L, W I L D E H D , S T A C K NM, T H O M P S O N D M, S U M M E R S AO & M E A G H E R RB (1996 ) Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 3182-3187. [67] B I Z I L Y S P, R U G H C L, S U M M E R S AO & M E A G H E R RB (1999) 96 : 6808-6813. [68] W U J & R O S E N BP (1991) Mol. Microbiol. 5 : 1331-1336 ; W U J & R O S E N BP (1993) Mol. Microbiol. 8 : 615-623. [69] G I G & S I L V E R S (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 7974-7978 ; J I G , G A R B E R EA, A R M E S L G , C H E N C M, F U C H S JA & S I L V E R S (1994) Biochemistry 33 : 7294-7299. [70] D I E L S L & R O S E N BP (1995) J. Bacteriol. 177 : 385-389.
14 LA CIRCULATION DES MTAUX [71] R O S E N BP, B H A T T A C H A R J E E H & S H I W (1995) J. Bioenerget. Biomemb. 27 : 85-91. [72] C A R L I N A, S H I W , D E Y S & R O S E N BP (1995) J. Bacteriol. 177 : 981-986 ; D I O R O C , C A L J, M A R M O R J, S H I N D E R R & D U B O W MS (1995) J. Bacteriol. 177 : 2050-2056. [73] S A T O T & K O B A Y A S H I Y (1998) J. Bacteriol. 180 : 1655-1661. [74] C R A M E R I A, D A W E S G , R O D R I G U E Z E J R , S I L V E R S & S T E M M E R W P (1997) Nat. Biotechnol. 15 : 436-438. [75] A N D E R S O N G L , W I L L I A M S J & H I L L E R (1992) J. Biol. Chem. 267 : 23674-23682 ; E L L I S PJ, C O N R A D S T, H I L L E R & K U H N P (2001) Structure 9 : 125-132. [76] I N G R I D J. P I C K E R I N G IJ, P R I N C E RC , G E O R G E MJ, S M I T H RD , G E O R G E G N & S A L T D E (2000) Plant Physiol. 122 : 1171-1178.
693
[77] D H A N K H E R O P, L I Y , R O S E N BP, S H I J, S A L T D , S E N E C O F F JF, S A S H T I NA & M E A G H E R RB (2002) Nature Biotechnol. 20 : 1140-1145. [78] C A R B O N E L L - B A R R A C H I N A AA, B U R L O F, L O P E Z E & M A R T I N E Z - S A N C H E Z F. (1999) J. Environ. Sci. 34 : 661-679.
GLOSSAIRE
Accepteur d'lectrons - Agent oxydant, organique (fumarate, pyruvate...) ou inorganique (O2, sulfate, nitrate...), capable de roxyder le dernier terme d'une chane de transporteurs d'lectrons (chane respiratoire) ou une oxydorductase (par exemple une oxydase). Actoclastique - Se dit de la synthse du mthane partir de lacide actique. Actogne - Bactrie anarobie du sol utilisant CO2 comme accepteur dlectrons et formant de l'acide actique comme sous-produit. Les actognes renferment une CO dshydrognase (voir ce terme). Les premires tudes dtailles ont port sur Clostridium thermoaceticum. Actyl-coenzyme A - CH3COScoA. Thioester form entre lacide actique et le coenzyme A, haut potentiel de transfert du groupe actyle. La scission de la liaison thioester par hydrolyse ou transfert libre une nergie largement suffisante pour un couplage avec la synthse d'une molcule d'ATP. L'actyl-coenzyme A ou actyl-CoA possde une double ractivit, comme donneur dactyle dans les ractions dactylation, comme nuclophile par le carbone du mthyle. La liaison avec le coenzyme A confre au mthyle une certaine acidit qui nexiste pas dans lactate libre (le pKa est abaiss de quelques 20 fois). Dans ce type de raction, lactyl-CoA participe a des ractions de synthse caractristiques, comme la formation de lacide citrique par la citrate synthase, par celle du malonyl-CoA par carboxylation, dans la synthse dacides gras et de certains acides amins. L'actyl-CoA est un carrefour mtabolique essentiel plac la base de la synthse des lipides. Actyl-coenzyme A synthase - Voir CO dshydrognase. Acidophile - Organisme dont l'optimum de croissance est dans la rgion de pH 1-4. ACP (Acyl carrier protein) - Fixe les chanes acyles par un lien thioester la place du coenzyme A au cours de la synthse et de la dsaturation des acides gras. Actinomyctes - Bactries filamenteuses Gram-positives, taux lev de G + C, formant un groupe d'une trs grande diversit d'habitants normaux du sol, vivant un optimum de pH compris entre 6 et 8. Exemples : Actinomyces, Arthrobacter, Bifidobacterium, Micrococcus, Nocardia, Streptomyces, Rhodococcus. Forment souvent des structures diffrencies, notamment des fructifications ariennes. La fragmentation des hyphes peut former des conidies, faisant office de spores dissmines par le vent. On considre les actinomyctes comme des agents efficaces du recyclage de la matire organique dans les sols. Parmi ces bactries, les streptomyctes sont particulirement utiles par leur capacit fabriquer de nombreux antibiotiques, notamment la plupart de ceux qui sont utiliss des fins thrapeutiques. Le groupe des Nocardia et Rhodococcus effectuent des biodgradations varies. Des espces sont thermophiles, comme Thermoactinomyces, croissant 50C et formant des endospores rsistantes. Voir aussi Gram-positives. Activateur de transcription - Protine se liant une zone spcifique de l'ADN et facilitant l'amorage de la transcription d'un ou plusieurs gnes situs au voisinage. Contracte une association physique avec l'ARN-polymrase, ou inflige seulement une courbure dans l'ADN et fait intervenir d'autres facteurs. Dans le cas d'une association physique, peut se lier l'ADN assez loin du site d'amorage, mais venir au contact de l'enzyme par une courbure de l'ADN inflige par des protines telles que IHF. Voir Amorage de transcription. L'activation
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de transcription chez les eucaryotes obit des mcanismes plus nombreux et complexes, notamment par des enhancers. Acyle - Radical RCO, R tant CH3 (radical actyle) ou une chane hydrocarbone. Arobactine - Sidrophore de la famille des hydroxamates. Voir Sidrophore. Arotactisme - Mcanisme analogue au chimiotactisme et command par l'oxygne dissous. Aerotolrant - Organisme n'utilisant pas O2 mais capable de se dvelopper en sa prsence. Exemple : les bactries lactiques. Agar - Polysaccharides complexes extraits d'algues marines, contenant environ 70% d'agarose et 30% d'agaropectines. Utilis comme milieu glifiant en microbiologie au-dessous de 40-50C. Agarose - Polysaccharide tir d'algues marines, constitu de chanes linaires o alternent le D-galactose et le 3,6-anhydro-L-galactose. AHDS - 2,6-anthrahydroquinone disulfonate. Substrat utilis comme analogue des acides humiques dans les tudes de biodgradations, utilis dans un test colorimtrique. AHL - Acyl-homosrine lactone. Alcalophile - Organisme dont l'optimum de croissance se situe au-dessus de pH 8,5 jusqu' 10,5. Alcane (Alkane en anglais) - Hydrocarbure satur (dpourvu de liaisons doubles ou triples). Alcne - Hydrocarbure non aromatique comportant au moins une double liaison C=C. Alcool dshydrognases (ADH) - Les plus courantes oxydent les alcools primaires en aldhyde. On distingue plusieurs sries. Une premire catgorie est celle des ADH dpendantes de NAD+ ou NADP+(EC 1.1.1.1). Celles-ci appartiennent trois types. Les ADH de type I oxydent les alcools longue chane et fonctionnent avec du zinc. La plus tudie est l'ADH de cheval. Les enzymes de type II n'ont pas de mtal, concernent des alcools chane courte et ont une assez large spcificit (rpandues dans le mtabolisme). Les enzymes de type III sont communes chez les bactries, ont gnralement du fer. Une deuxime catgorie ne fait pas intervenir NAD+ ou NADP+, mais du PQQ, un hme ou le F420. La mthanol dshydrognase priplasmique des bactries mthylotrophes est PQQ. Une dernire catgorie est celle des levures mthylotrophes (EC 1.1.3.13) et fonctionnent avec l'oxygne de l'air la manire des oxydases et possde le plus souvent du FAD. Aldhyde oxydase - Enzyme oxydant un aldhyde en acide carboxylique, l'accepteur d'lectrons direct tant O2. Aldolase - Enzyme catalysant une aldolisation, c'est--dire l'addition sur un aldhyde d'un groupement carbon caractre nuclophile, comme la raction du type : CH3CHO + CH3R CH3CH(OH)CH2R, ou encore catalysant la raction inverse dite parfois rtro-aldolisation. Dans ce dernier cas, il y a scission de la molcule dont l'un des morceaux est un aldhyde. Alginates - Polysaccharides poly-anioniques abondants chez les algues brunes (Phaeophyces), galement rencontrs dans la parois despces bactriennes (Pseudomonas aeruginosa). Ce sont des copolymres de -D-mannuronate et d-L-guluronate (qui diffre du prcdent par inversion du carbone n 5), attachs par les liens 1 4 dans une chane non ramifie. Labondance des deux catgories de monomres et leur agencement dans la squence du polysaccharide dtermine les proprits. Les alginates bactriens sont caractriss par labondance de groupes actyles, et chez P. aeruginosa sont responsables daffections bronchiques, notamment dans la mucoviscidose. Chez ces bactries la synthse dpend d'une douzaine de gnes groups en oprons, le premier tant algD qui est celui d'une dshydrognase transformant le GDP-mannose en GDP-mannuronate. Il semble que ce soit l'environnement bronchique dans le cas de fibrose cystique qui dclenche la synthse, qui est inductible et couramment provoque par des agents extrieurs. Les alginates forment des gels en prsence dions calcium, ce qui les prdestine divers emplois pratiques : paississants et stabilisants dans lindustrie alimentaire, ptes utilises pour les empreintes dentaires, confection de compresses et divers enrobages, immobilisation de
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cellules Les alginates utiliss commercialement sont souvent tirs dalgues brunes de la cte Ouest des Etats-Unis (Macrocystis), ou dalgues rcoltes sur les ctes europennes (Laminaria, Ascophyllum). Allostrie - Modification conformationnelle rversible acquise par une protine multimrique (plusieurs sous-units) en fonction de l'attachement spcifique du substrat ou de molcules trangres, appeles effecteurs. L'action d'un effecteur peut s'exercer sur les sites catalytiques eux-mmes, ou sur des sites spcifiques distincts. La structure molculaire peut basculer dans son ensemble entre deux tats en fonction des effecteurs prsents, ou passer par divers intermdiaires. Les modifications affectent en gnral les proprits biologiques de la protine : activit catalytique, constantes cintiques, affinit pour d'autres molcules. L'allostrie intervient notamment dans le rglage des voies mtaboliques au niveau de l'activit des enzymes (voir Rtro-inhibition), dans le rglage de la transcription par rpresseur ou par activateur (induction et rpression), et dans le fonctionnement de rcepteurs qui sont souvent eux-mmes dots de proprits enzymatiques. L'allostrie peut tre considre comme une manifestation particulire de la flexibilit structurale des protines dont dpend l'essentiel de leurs proprits. Aminotransfrase - Enzyme catalysant rversiblement le transfert d'azote entre un acide amin et un oxoacide sur le mode : RCH(NH2)COOH + R'COCOOH RCOCOOH + R'CH(NH2)COOH Le coenzyme caractristique des aminotransfrase est le pyridoxal-5'-phosphate ou PLP. La raction est rversible. Lacide amin donneur du groupe amin est souvent le glutamate, qui est lui-mme un point dentre de lazote ammoniacal dans le mtabolisme. Ammoniac mono-oxygenase - Premire enzyme de la nitrification (Nitrosomonas europaea) oxydant lammoniac en hydroxylamine (NH2OH). Membranaire, stimule par Cu, offre quelque ressemblance avec la mthane mono-oxygnase, et possde une activit sur le mthane. Inhibe par lactylne agissant comme marqueur covalent. Cette enzyme est difficile purifier. Ammonification - Libration de NH3 ou d'ammonium partir de molcules azotes. De faon plus restrictive, dsigne parfois la conversion d'azote organique en ammonium, ou encore la rduction du nitrite (produit partir du nitrate) en ammonium. Non productrice dnergie, elle permet probablement aux bactries de dtoxifier le nitrite et de contrler une chute excessive du potentiel redox en conditions anarobies, considre alors comme dissimilation (l'ammonium tant en excs sur les besoins cellulaires). Certains auteurs se contentent de dsigner comme ammonification le passage global du nitrate l'ammonium. Amorage de transcription - La synthse de l'ARN messager effectue par l'ARN-polymrase s'effectue aprs reconnaissance de la squence d'un promoteur par un facteur sigma (ou facteur d'amorage). Le complexe ARN-polymrase-sigma install sur l'ADN correspond ce qu'on appelle le complexe "ferm". Il amorce la transcription courte distance du promoteur en crant une petite dnaturation locale de l'ADN, et le complexe devient alors "ouvert", indispensable pour que la transcription puisse continuer. Le passage au complexe ouvert exige parfois l'interaction avec une protine supplmentaire, un activateur de trancription. Voir Transcription. AMPA - 2-aminomthyl-phosphonate. AMP cyclique - Adnosine-3',5'-monophosphate cyclique, agit chez les bactries comme le signal interne d'une demande en nergie, reconnu par CRP, inhibe la rpression catabolique. Anarobie - Caractrise un environnement dpourvu d'O2, ou dsigne un organisme capable de se dvelopper dans un tel milieu. Les anarobies stricts voient leur croissance ou mme leur viabilit supprime par la prsence d'oxygne molculaire. Anaplrotique (Voie) - Voie mtabolique qui prlve une partie des composs carbons ns au cours d'une fermentation pour approvisionner des voies de synthse. Anhydrase carbonique - Enzyme trs rpandue catalysant linterconversion entre CO2 et hydrognocarbonate : CO2 + H2O HCO3 + H+. Lenzyme des cyanobactries, algues, lichens et plantes peut aussi hydrolyser le sulfure de carbonyle (produit dans les sols partir
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du thiocyanate) : OCS + H2O CO2 + HS + H+. Tous les micro-organismes fixant directement le dioxyde de carbone, par exemple avec la Rubisco, sont amplement pourvus danhydrase carbonique pouvant consommer OCS comme analogue de CO2. Lanhydrase carbonique favorise la fixation de CO2 dans un milieu alcalin qui dplace lquilibre en faveur de HCO3. Anisole - Mthoxybenzne. Antibiotique - Substance mise par bactrie ou champignon bloquant la multiplication ou la survie dune gamme plus ou moins tendue de microorganismes, infectieux ou non. Par extension, un antibiotique est un analogue synthtique d'un produit naturel reproduisant son action. Ils ne correspondent qu quelques pour cent des antibiotiques rpertoris. Le tableau donne quelques exemples.
Famille chimique
Aminoglycosides Ansamycines Bta-lactamines Blomycine Chloramphnicol Glycopeptides Macrolides Quinolone Sulfamides, trimthoprine Ttracyclines
Exemples
Gentamycine, kanamycine Rifampicine Pnicilline, ampicilline Blomycine Chloramphnicol Vancomycine Erythromycine Acide nalidixique c-Trimoxazole Tetracycline, minocycline
Cible physiologique gnrale

Synthse des protines ARN-polymrase Formation de la paroi bactrienne Anti-tumoral, coupure de lADN Synthse des protines Formation de la paroi bactrienne Synthse des protines Rplication de lADN Mtabolisme de lacide folique Synthse des protines
Antiporteur - Transporteur membranaire catalysant lentre dun substrat dans la cellule et la sortie conjointe, mole pour mole, dun autre composant. Lchange est le plus souvent trs spcifique, potentiellement rversible, mais fonctionne gnralement dans un sens dtermin. Les lments transports sont des composs organiques ou minraux, ioniques ou neutres. Anti-sens (ARN) - ARN complmentaire du produit normal de la transcription, notamment de l'ARN messager. L'appariement de ce dernier avec un ARN anti-sens bloque son fonctionnement. Les ARN anti-sens interviennent dans certaines rgulations. APS - Adnosine phosphosulfate. Sa formule correspond celle de lADP o le phosphate distal est remplac par un sulfate. Form partir de sulfate et dATP par une ATP sulfurylase. L'APS est un donneur de sulfate dans les sulfatations. ArcA, ArcB - Systme rgulateur deux composants contrlant la transcription de gnes mtaboliques au cours de lalternance arobiose-anarobiose. ArcB est une histidine kinase transmembranaire. En absence de O2, ArcA est phosphoryle partie de ArcB, active les gnes du mtabolisme anarobie, rprime ceux des chanes arobies (voir Rgulations deux composants). Archaebactries - Ensemble au sein des procaryotes, distincts des eubactries par leur arbre volutif et un certain nombre de critres biochimiques. Certaines espces sont considres comme proches des procaryotes primitifs des premiers ges de la vie. Lexamen des squences dADN et des structures protiques rvle des caractres qui se retrouvent chez les eucaryotes.
GLOSSAIRE Critre
Ribosomes ARN-polymrase Paroi Membrane Coenzymes Photosynthse ATP synthase Potentiel membranaire
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Structure. Contient des protines acides chez les halophiles Structure plus eucaryotique que procaryotique Pas de peptidoglycanes, couche S, priplasme quasi absent Des phospholipides deux ttes polaires, di-thers, ttra-thers Particuliers chez les mthanognes, nexistent pas ailleurs Absente, sauf phototrophie spciale chez les halophiles Un seul type, rappelle les ATPases vacuolaires des eucaryotes Couplage avec oxydations, transferts de mthyle, lumire
Il y a donc un certain nombre de caractres qui rappellent les eucaryotes, d'autres qui sont typiquement ceux des bactries ou eubactries. Les voici regroups dans un petit tableau :
Caractres rappelant les eucaryotes

Mcanisme de rplication de l'ADN, histones, structures type nuclosome ARN-polymrase, TATA-box, facteur de transcription Facteurs damorage et dlongation Protines des ribosomes, sensibilit la toxine diphtrique Sous-units de l'ATPase/ATP synthase
Caractres rappelant les eubactries

Chromosome circulaire unique, oprons, pas d'introns sauf exception Absence de noyau Porines, transporteurs transmembranaires Production d'nergie Nombreux traits mtaboliques
Les archaebactries ou archaea montrent une grande diversit dadaptations, sont les seules coloniser des milieux trs acides ou force ionique trs leve, ou encore se dvelopper plus de 95C On distingue deux grands groupes, les euryarchaeotes et les crenarchaeotes. Dans les premiers sont les halophiles extrmes, mthanognes, thermoacidophiles. Les seconds renferment surtout des thermophiles extrmes dpendantes du soufre et diffrentes formes marines (voir Crenarchaeotes). Leur habitat ne se limite pas ces environnements extrmes et elles sont trs rpandues tous les niveaux marins, y compris dans les eaux froides des grandes profondeurs. Les archaebactries reprsenteraient 20% de toutes les cellules microbiennes marines, et prs de 40% des cellules planctoniques entre 150 m et les abysses, et beaucoup seraient autotrophes. LARN de la petite sous-unit des ribosomes est devenu un outil commode pour analyser la diversit des archaebactries sans avoir les cultiver, mais lventail rel de leurs proprits physiologiques reste incompltement connu, et de nombreuses formes nont pas encore t tudies en laboratoire, ni mme a fortiori cultives. Argiles - Mlange de phyllosilicates hydrats formant des cristaux extrmement petits, o sont superposs des feuillets composs de couches ttradriques (ct) et octadriques (co). Les feuillets sont de type ct-co-ct ou ct-co. Ils sont anioniques. Entre eux se placent des cations : Ca2+, K+, Na+, et des molcules deau (voir aussi Micas). Lpaisseur des feuillets va de 0,7 nm 1,4 nm, et lidentification des minraux trs varis se fait par diffraction des rayons X. La kaolinite Al4[SiO4O10] (OH)8 est de type ct-co. Elle est caractristique de laltration des roches riches en feldspaths (granites, pegmatites). Le minral le plus courant des roches argileuses est lillite (ct-co-ct, dpaisseur 1 nm) dont la structure est proche de celle des micas. La glauconite (trouve dans les associations minrales dsignes par glauconie) est de lillite fortement charge en fer. Les smectites et la montmorillonite ont des teneurs variables en Al, Fe, Mg, Na. Les vermiculites naissent de la biotite aprs perte du potassium. Avec les smectites, elles augmentent fortement en volume par chauffage. Les nombreux minraux argileux sont des minraux daltration (cas le plus frquent, argiles dtritiques
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dites argiles primaires) ou ont t crs par recristallisation au sein des sdiments ou des roches magmatiques (argiles secondaires). Tous ces minraux subissent des volutions complexes par adjonction dions, migration dlments. Ltude des argiles est pratiquement une science en soi. Dans le langage courant le terme dargiles dsigne non seulement les minraux argileux, mais les roches argileuses dont ils reprsentent au moins la moiti. Les roches argileuses sont abondantes dans les formations marines ou continentales, alternent souvent avec des niveaux calcaires ou grseux dans les sdiments. Par leur caractre impermable, les couches argileuses jouent un rle trs important dans la circulation et laccumulation des eaux souterraines, les accumulations de matires dissoutes ou de polluants. Certains terrains argileux ont des inclusions caractristiques, comme les argiles silex du Miocne dans le Bassin parisien, considrs comme des sols fossiles, ou des cailloux dorigine morainique ou fluvioglaciaire. Enfin dans les pays calcaires sont courantes les argiles de dcalcification qui viennent combler les dpressions dans les zones karstiques. ARN 16S - Voir ARNr. ARN anti-sens - Voir Transcription et Anti-sens. ARN-polymrase - Enzyme catalysant la synthse de l'ARN cellulaire en reproduisant la squence contenue dans une portion d'ADN (voir Transcription). L'ARN-polymrase bactrienne a une structure 2 ' , pour 450 kDa environ. Une sous-unit s a une fonction temporaire et sert de facteur d'amorage ou facteur sigma. La sous-unit catalytique serait . Les eucaryotes ont plusieurs polymrases, I, II et III, la II faisant surtout de l'ARN messager. ARNr - ARN des ribosomes, servant de charpente l'assemblage des protines dans les particules, et jouant galement un rle capital dans la traduction : attachement au messager, mcanisme de traduction des gnes. Le grand conservatisme structural des ribosomes chez les tres vivants se traduit par un plan d'organisation dtermin. L'ARN 16S des procaryotes, appartenant la plus petite des sous-units (particule 30S), a servi d'outil de comparaison pour retracer des gnalogies volutives et revoir parfois la taxonomie bactrienne. Opration tendue aux eucaryotes avec un ARN un peu plus long (ARN 18S). ARNt - ARN de transfert. Aromatique - Dsigne une vaste famille de composs carbons dont le benzne est un des plus simples. La structure du benzne a t dtermine pour la premire fois en 1865 par KKUL VON STRAPONITZ (1829-1896). Les lectrons (pi) appartenant aux doubles liaisons sont entirement dlocaliss dans tout le cycle. Un compos aromatique comporte au moins un cycle insatur avec 2 n + 4 lectrons pi, n tant un nombre entier positif. La proprit s'applique des htrocycles (comportant des atomes d'azote ou de soufre). Dans le benzne : n = 1 ; dans le naphtalne avec 10 lectrons pi, n = 3. Il existe d'autres critres pour caractriser l'aromaticit, fonde sur la symtrie ou l'nergie de rsonance responsable de la stabilit des noyaux aromatiques. Laromaticit confre une conformation rigide et saccompagne de proprits caractristiques au point de vue substitution, addition, oxydorduction. Par exemple un noyau aromatique ragit volontiers avec des composs lectrophiles. Un substituant attracteur dlectrons diminue la densit lectronique du cycle, comme dans le nitrobenzne. Il rend le noyau encore plus rsistant loxydation, tend dsactiver les attaques lectrophiles et oriente les substitutions en mta. Un groupe donneur, soit parce quil exerce un champ rpulsif (mthyle, alkyle), soit parce quil peut partager un doublet lectronique avec le noyau (hydroxyle, amine, mthoxyle, halogne) a leffet inverse et oriente les substitutions en ortho ou para. Par exemple le tolune est plus facile oxyder que le benzne et le mthyle tend orienter les attaques lectrophiles en ortho et para. Arsniate rductase - Rduit larsniate (AsO43) en arsnite (AsO33). Lenzyme a t dcrite comme respiratoire en anarobiose chez Chrysiogenes arsenatis : en croissance sur actate (KRAFFT T & MACY JM (1998) Eur. J. Biochem. 255 : 647-653). Lenzyme est un htrodimre renfermant Mo, au moins un noyau fer-soufre et Zn. Ne rduit pas le nitrate, le slniate ou
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le fumarate. On connat aussi des arsniate rductases distinctes non respiratoires chez Escherichia coli et Staphylococcus aureus. Arthrobacter - Gram-positifs arobies non-sporulants importants dans la flore microbienne adapte au sol, rsistants la dessication et au manque de nourriture, physiologie trs souple leur permettant de s'adapter la dgradation des herbicides et pesticides. Ils se divisent sous une membrane commune enveloppant un chapelet de cellules. Sous l'effet de la croissance, cette membrane se dchire partiellement, mais persiste en faisant une charnire entre les cellules maintenues ensemble en formant un angle de l'une l'autre (mode de division dit par cassure). En phase stationnaire, les cellules s'arrondissent sous forme coccode. Ascorbate - Vitamine C, agent rducteur ncessaire au fonctionnement de diverses oxygnases. Sa synthse partir du glucose a disparu chez les Primates, do son rle de vitamine. Il est indispensable chez les animaux la formation dhydroxyproline et dhydroxylysine dans les procollagnes, et sa carence empche la maturation normale du collagne (do le scorbut). Lascorbate est abondant chez les plantes o il fonctionne notamment comme antioxydant dans la photosynthse, en soxydant lectron par lectron en monodhydroascorbate (radicalaire) et dihydroascorbate. Il intervient aussi dans le mtabolisme des hormones vgtales de croissance appeles gibbrellines. Les enzymes utilisant de lascorbate comme cofacteur ont souvent aussi du fer. On peut doser facilement la vitamine C par dcoloration du dichlorophnol-indophnol. Assimilation - Mcanisme destin produire des molcules ou des ions directement incorporables dans la matire vivante, tels que le phosphoglycrate ( partir de CO2 dans le cycle de CALVIN), NH3 (par rduction de nitrate ou de nitrite), ion sulfure (par rduction de sulfate), . Assimilation du nitrate (chez les plantes) - Cest globalement lincorporation de lazote du nitrate dans les molcules organiques, aprs une cascade de rductions qui fournit lammonium intermdiaire. Quelques repres : Lassimilation du nitrate prdomine dans les feuilles ou dans les racines selon les espces. Le pigeage du nitrate par les racines est trs efficace, utilise un transport actif. La vacuole est un lieu de stockage du nitrate en excs. La nitrate rductase est cytoplasmique, utilise NAD(P)H comme source dlectrons, contient FAD, un cytochrome b557, et un cofacteur Mo. La rduction du nitrite a lieu dans les plastes. Lenzyme (61 kDa dans lpinard) utilise la ferrdoxine rduite comme donneur, contient une chane interne constitue dun noyau [4Fe-4S], de FAD et dun sirohme. Lazote ammoniacal est incorpor sous forme de glutamine puis de glutamate. Un systme de navette couple la sortie du glutamate avec lentre de malate et doxoglutarate. Une transamination du glyoxylate (venant de la photorespiration) par le glutamate a lieu au niveau des peroxysomes. Le mtabolisme de la glycine forme se poursuit dans la mitochondrie. Atmosphre (Composition de lair sec en gaz principaux) -
Constituant
N2 O2 Ar CO2 Ne
Moles%
78,08 20,95 0,93 0,0356 0,0018
Demi-vie
Constituant
He CH4 Kr H2 N2O
Moles%
0,00052 0,00017 0,00011 0,000053 0,000031
Demi-vie
10 ans
50-200 ans
150 ans
La vie moyenne est indique pour des constituants effet de serre. Autres constituants : Xe, O3, CO, SO2, NO2, NH3. Le dioxyde de carbone augmente actuellement de 0,5% par an, celui du mthane de 0,9% par an (MACKENZIE FT & MACKENZIE JA (1995) Our changing planet,
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Prentice-Hall : 288-307). Latmosphre contient en outre de grandes quantits deau, variables (temprature, rgion, altitude), et des traces de constituants fabriqus par lhomme comme les CFC. ATPase - Enzyme catalysant lhydrolyse exergonique de lATP en ADP et phosphate, ou la raction inverse par couplage avec une source dnergie (notamment p dans le cas de l'ATPase FoF1). Lenzyme est alors une ATP synthase. Les ATPases sont de plusieurs sortes :
Catgorie
ATPases ATPases ATPases ATPases H (F0F1) A0A1 P V
Localisation
Bactries, mitochondries et plastes Archaebactries Eucaryotes Vacuoles, endosome
Exemple, fonction
Pompes protoniques, synthases Comme F0F1 Pompes ioniques (Na, K, Ca) Pompes protoniques
Les ATPases de type P forment une liaison covalente temporaire entre phosphate et enzyme. Une des plus connues est la pompe d'change Na/K des eucaryotes. Les ATPases de type V sont des pompes protons (2H+ par ATP hydrolys) qui acidifient certains compartiments cellulaires comme les vacuoles. ATP synthase - Voir ATPase. Autokinase - Protine catalysant sa propre phosphorylation l'aide d'ATP. Fait partie souvent d'un systme rgulateur deux composants. Voir Rgulations deux composants. Autotrophe - Organisme utilisant le CO2 comme seule source de carbone (quelques facteurs de croissance excepts). Certains auteurs tendent la dfinition des germes qui se dveloppent sur CO ou sur formiate, parce que ces composs sont alors oxyds en CO2 qui reste la vritable porte d'entre du carbone dans le mtabolisme. Par contre les mthanotrophes et mthylotrophes utilisant des mono-carbons rduits ne sont pas des autotrophes, car le CO2 n'est pas la porte d'entre du carbone ou ne l'est que partiellement.
Axnique (Culture) - Culture pure.

Azoques - Composs organiques caractriss par la liaison N=N . Azorductase - Enzyme rduisant le groupe nitro des colorants diazoques en amine. Ce sont des nitrorductases, en particulier celles de classe II (voir Nitrorductases). Azospirillum - Bactries Gram-ngatives flagelles de forme incurve, fixatrices de N2, remarquables par leur capacit de se dvelopper au contact troit des racines de diverses plantes, notamment de gramines tropicales (A. lipofenum) et du riz (A. irakense) dans une relation caractre symbiotique o les bactries stimulent la croissance de la plante par sa fixation de l'azote et l'apport d'hormones de croissance. La plupart des Azospirillum colonisent la surface des racines, l'attachement tant facilit par une glycoprotine des flagelles. A. diazotrophicus est un endophyte avec d'autres espces ( A z o a r c u s , Herbaspirillum). L'assimilation de l'azote est sous la dpendance de NifA, un activateur transcriptionnel, inactif en excs d'azote et en prsence de O2, tudie en dtail chez A. brasiliense. Cette espce a trois voies de synthse de l'acide indole-3-actique (une auxine), dont deux partir du tryptophane et une atypique (STEENHOUDT O & VANDERLEYDEN J (2000) FEMS Microbiol. Rev. 24 : 487-506). Voir Rhizobactries. Azotobacter - Espces Gram-ngatives vivant librement dans le sol et fixatrices d'azote. Azurine - Protine bactrienne bleue monomrique de 14-16 kDa contenant un ion Cu2+ li par une gomtrie bipyramidale (deux pyramides triangulaires accoles par leur bases), avec Cys, 2 His dans un mme plan, Met et un cinquime ligand aux sommets. La structure est connue en dtail chez Pseudomonas fluorescens o elle a 128 acides amins, Ps. aeruginosa et Alcaligenes xylosoxidans. Absorbance 625-630 nm ( d'environ 7000 M 1 . cm 1). Transporteur dlectron priplasmique, coupl ventuellement avec un cytochrome c. Le potentiel redox est dans la gamme des + 300 mV. L'azurine intervient notamment dans la rduction du nitrite en oxyde nitrique.
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Bactrioferritine - Voir Ferritine. Bactriorhodopsines - Protines membranaires rcepteurs la lumire, prsentes chez les halobactries. Leur structure est similaire celle de la rhodopsine de notre rtine et renferme du rtinal dont lisomrisation commande par la lumire dclenche le signal initial. Halobacterium salinarum a 4 bactriorhodopsines de 26 kDa, lune delle agit comme pompe protons et permet dtablir un potentiel membranaire utilisable pour la synthse dATP. La seconde est une pompe chlorure, les deux autres semblent tre des rcepteurs pour phototactisme. Bactrodes - Bacilles Gram-ngatifs courants dans l'environnement, anarobies, chimiohtrotrophes, produisent des acides organiques comme produits de fermentation. Ne rduisent pas les composs soufrs. Exemples : Bacteroides, Cytophaga, Flavobacterium. Certains comme B. succinogenes et B. ruminicola ont un rle majeur dans la flore du rumen, d'autres sont pathognes. Dans la littrature, on a parfois dsign comme bactrodes les formes bactriennes altres morphologiquement, rencontres dans le genre Rhizobium et genres voisins, au cours de la symbiose dans les nodules de lgumineuses. Barreaux bta - Font partie des structures dites secondaires dans les protines. Quand la chane principale fait des va-et-vients dans la structure, elle peut tablir latralement sur ellemme des ponts hydrogne entre NH et O=C. Plusieurs barreaux forment ainsi des structures aplaties, dites feuillets bta, rarement planes mais le plus souvent fortement vrills (comme un panneau de bois qui aurait travaill), formant parfois des structures cylindriques. Les barreaux bta sont frquents dans le coeur des protines en dfinissant dans la molcule une zone rigide. Autres structures secondaires communes : les hlices alpha. Bas-spin - Etat atteint par un atome mtallique, comme le fer, lorsque sa gomtrie de coordination est complte et rgulire dans une situation dite de champ-ligand fort. Basta - Glufosinate, herbicide analogue du glutamate, agit en inhibant la synthse de glutamine. Rapidement biodgradable dans le sol. Batch - (= lot). Une culture en batch est une culture discontinue en milieu liquide en fermenteur. Le liquide est ensemenc, incub sans apport ultrieur de milieu frais, puis collect avec les cellules. Dans une culture en batch aliment, on renouvelle des lments nutritifs en cours de croissance, et en batch rpt, on remplace priodiquement une partie de la culture par du milieu frais. Benzyl-viologne - Voir Violognes. Bta-lactames - Famille de composs naturels contenant dans leur formule un cycle lactame prcontraint 4 atomes (un lactame est un amide interne la molcule comme une lactone est un ester interne). Exemples : pnicilline, ampicilline. Les bta-lactamases sont des amidases qui hydrolysent le cycle par un mcanisme similaire celui des protases srine. Bta-oxydation - Mcanisme classique doxydation des acides gras saturs en liaison thioester avec le coenzyme A, selon un principe potentiellement rversible, comportant : une dshydrognation ; une hydratation de la liaison double ; une nouvelle dshydrognation ; une rupture par thiolyse (ralise par une molcule de coenzyme-A), conduisant un acylCoA plus court de deux carbones et lactyl-CoA.
CSCoA O 1 CSCoA O 2 OH 3 HSCoA CSCoA + O CSCoA O 4 O CSCoA O CSCoA O
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Cette squence dvnements est probablement trs ancienne dans lhistoire de la vie, et se retrouve sous forme camoufle (modifie par lvolution ?) dans dautres mtabolismes cellulaires. La squence dshydrognation, hydratation, dshydrognation, raction avec le coenzyme A, se voit aussi dans le cycle de KREBS. Biocapteur - Dispositif fonctionnant la manire d'une lectrode, permettant le couplage entre un processus biologique (tel qu'une raction enzymatique) et l'apparition d'un signal lectrique li spcifiquement la prsence d'un compos qu'il s'agit de dtecter ou de doser. Biofilm - Revtement variable en paisseur (de 1 quelques dizaines de nm) form la surface des matriaux les plus divers par la multiplication de micro-organismes au sein d'une gangue de polysaccharides extracellulaires associs des sels minraux. Un biofim est une structure changeante au cours du temps. Plusieurs populations microbiennes peuvent s'y succder en fonction des caractres physiques environnants. Des changes de cellules et de composants macromolculaires ont lieu avec le milieu ambiant. L'valuation du nombre des bactries peut se faire par mesure de la respiration cellulaire utilisant un sel de tetrazolium fluorescent, ou encore par microscopie quantitative aprs marquage de l'ADN avec un fluorochrome, le DAPI (4'-6-diaminidino-2-phnylindole) (RODRIGUEZ GG et coll. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58 : 1801-1808). Biogaz - Gaz produit par la dgradation anarobie de la matire organique. Il comprend du mthane (50 65%), du gaz carbonique (35 40%) et d'autres gaz l'tat de traces (malodorants quand ils sont la base de soufre et mercaptan). Il est gnrateur d'nergie, peut tre utilis de faon autonome ou coupl une installation de gaz naturel. Biolixiviation - Extraction d'lments mtalliques par solubilisation, ralise surtout par des bactries arobies et acidophiles du genre Thiobacillus. Ces bactries transforment le soufre des composs minraux en acide sulfurique. T. ferrooxydans oxyde le fer ferreux en fer ferrique. Ce dernier en milieu acide peut oxyder l'uranium IV insoluble en uranium VI soluble. Dans le cas de minerai aurifre, la biolixivation permet d'extraire l'or en dgradant les gangues de pyrite. Bioluminescence - Emission de lumire par un tre vivant. L'nergie est gnralement fournie par une raction d'oxydation effectue sur une lucifrine. Dans la biofluorescence, l'mission lumineuse se fait par absorption d'une radiation incidente dans une gamme de longueurs d'onde dtermines plus courtes que celles de la lumire produite. La bioluminescence prlve une part non ngligeable de l'nergie de la cellule mettrice et a souvent une fonction de reconnaissance ou de dissuasion (vibrions luminescents des poissons). Une enzyme bactrienne de rparation de l'ADN, la photolyase, a besoin de lumire pour fonctionner, et la bioluminescence peut y contribuer dans des cas particuliers. Biomasse - Masse totale des cellules vivantes dans un milieu donn. Biormdiation - Emploi des micro-organismes pour la dtoxification ou llimination de produits chimiques dont llimination de lenvironnement est souhaite. Biosorption - Rcupration de mtaux dissous en utilisant les proprits des parois cellulaires de champignons filamenteux ou autres organismes, qui pigent les cations mtalliques tels que ceux de Cd, Ni, Pb, Zn, Ag, Cr, Ur. Biotine - Vitamine H. Cofacteur des enzymes de tranfert des carboxyles, carboxylases et dcarboxylases. La biotine proprement dite (encadre) forme une liaison covalente avec une chane latrale de lysine dans la protine.
O HN S O NH H N chane de lysine protine CO 2 H N
O
O HN S NCOO H+
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Le long bras flexible permet un mouvement de la tte de la biotine du donneur vers l'acepteur (mouvement exagr sur le dessin sous forme d'un retournement). La synthse de la carboxybiotine partie de CO2 ncessite de l'ATP, avec formation intermdiaire d'un carboxyphosphate. La biotine est lie trs fortement par des protines (avidine du blanc d'uf, streptavidine de Streptococcus). Des biotechnologies importantes reposent sur cette proprit. BOD5 - Biochemical oxygen demand. C'est la quantit d'oxygne dissous (mg/L) consomm au bout de 5 jours 20C au cours de l'oxydation biologique des substances contenues dans un effluent. Bote (ou box) - Terme utilis en gntique molculaire, dsigne une tranche d'ADN spcifiquement reconnue par une protine. Boues actives - Culture bactrienne libre brasse et oxygne forme en bassin d'puration, qui se rassemble en flocons ou "flocs" sous forme dune sorte de boue. Les espces bactriennes des boues sont pour 50% des Gram-ngatifs (Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), des Gram-positifs comme Kurthia, Micrococcus. La plupart sont des htrotrophes, mais il y a aussi quelques autotrophes (Nitrosomonas, Nitrobacter), des champignons (Geotrichum), des organismes filamenteux gnants pour les dcantations quand ils prolifrent excessivement : Sphaerotilus, Thiothrix BTEX (ou BTXE) - Sigle utilis par les techniciens de l'environnement pour dsigner un mlange de benzne, tolune, thylbenzne et xylne, dtect dans les nappes aquifres et sdiments aprs contamination par des produits ptroliers abondants dans les carburants.
BTX - Voir BTEX.

Cadre de lecture (ou phase de lecture) - Mode de traduction qui fait qu'un message est lu en codons de trois lettres selon un dcoupage dtermin, soit AGG UCA UUG CCU AGA et non pas en A GGU CAU UGC CUA GA dont la signification est totalement trangre la premire. Le choix initial ou mise en phase de la squence traduire part le plus souvent du codon d'amorage AUG (mthionine, formyl-mthionine), soit ATG sur l'ADN. Cadre de lecture ouvert - Souvent repr par le sigle ORF. Il sagit dun gne prsum plac en aval dun promoteur, parfois au sein dun opron (donc le promoteur peut tre situ assez loin en amont), avec : un codon d'amorage (ATG) ; une soixantaine de codons au moins dont le dernier est un codon non-sens ou Stop (TGA, TAG, TAA) ; une squence d'attachement des ribosomes place en amont du codon d'amorage ; elle est appele squence de SHINE-DALGARNO chez les procaryotes, avec le consensus AAGGAGGT. Le produit dexpression correspondant peut ne pas avoir t formellement identifi, mais sa nature peut se deviner parfois par suite dune ressemblance de squence avec des protines connues. CALVIN (Cycle de) - Appel aussi cycle de CALVIN-BENSON. Cycle mtabolique permettant l'assimilation du CO2 par les plantes vertes (au niveau des chloroplastes), les algues, les cyanobactries et diverses espces bactriennes photosynthtiques ou non. Le cycle fonctionne sur un principe rappelant la voie des pentose-phosphates. Le premier produit caractristique identifi par marquage est le 3-phosphoglycrate. L'identification dans un organisme de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (Rubisco), de la ribulose 5-phosphate kinase (RPK) et de la sdoheptulose-1,7-bisphosphate phosphatase (SBPase) indique qu'il s'agit d'un autotrophe fonctionnant avec le cycle de CALVIN. Le cot nergtique de l'assimilation de chaque molcule de CO2 par tour du cycle est de 3 ATP et de 2 NAD(P)H. Le cycle engendre des prcurseurs essentiels pour les synthses : l'rythrose-4-phosphate (E4P) vers le cycle aromatique, le ribose-5-phosphate (R5P) vers les acides nucliques. Le sdoheptulose-7-phosphate (S7P) est aussi un intermdiaire caractristique de la voie des pentose-phosphates.
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3 CO2 3 RuBP Rubisco FBP
3 ATP Xu5P R5P 3 Ru5P
6 6 ATP NAD(P)H 6 PGA 2 G3P 6 G3P
Pi F6P Xu5P Pi S7P SBP E4P
G3P
G3P
G3P G3P
E4P - Erythrose 4-phosphate F6P - Fructose 6-phosphate FBP - Fructose 1,6-bisphosphate G3P - Glycraldhyde 3-phosphate PGA - 3-Phosphoglycrate R5P - Ribose 5-phosphate
Ru5P - Ribulose 5-phosphate RuBP - Ribulose 1,5-bisphosphate S7P - Sdoheptulose 7-phosphate SBB - Sdoheptulose 1,7-bisphosphate Xu5P - Ribulose 5-phosphate
(Le cercle noir indique la transctolase et le cercle blanc la transaldolase) CAP - Catabolite activator protein. Voir CRP. Carbamyl-phosphate - OC(NH2)OPO32 . Intermdiaire important du mtabolisme central, engendr partir de HCO3, NH3 et ATP, intervenant notamment dans la synthse du cycle des pyrimidines destines aux acides nucliques. Carbonyle - Fonction C=O des aldhydes et ctones. Carboxydotrophe - Micro-organisme arobie capable de se dvelopper sur monoxyde de carbone. Il y a deux cas trs diffrents. Chez les carboxydotrophes arobies, loxydation de CO en CO2 fournit la fois de lnergie et du carbone assimilable sil sagit dun autotrophe. Chez un anarobie actogne, le CO est substrat de la CO dshydrognase ou actyl-CoA synthase. Carotnodes - Pigments insolubles dans leau, de nature isoprnode (assemblage dunits en C5 synthtises partir de lacide mvalonique, qui est aussi lorigine du cholestrol). Leur spectre dabsorption prsente souvent une forme caractristique trois pics entre 400 et 520 nm, leur donnant une couleur rouge, orang ou jaune. Larchtype est le carotne , dont la structure contient deux cycles en C5 relis par une chane hydrocarbone insature. Sa scission et son oxydation sont lorigine du rtinal. Les carotnes fonctionnent comme pigments accessoires de la photosynthse, ventuellement capables de capter lnergie lumineuse et de la transmettre la chlorophylle antennaire, mais agissant surtout comme anti-oxydants et protecteurs contre loxygne singulet. La fucoxanthine est le carotnode brun confrant la couleur aux algues brunes et diatomes. Les bactries non photosynthtiques et les champignons se chargent en carotnodes comme protection anti-solaire. Catalase - Enzyme catalysant la destruction du peroxyde d'hydrogne (eau oxygne) : 2 H2O2 O2 + 2 H2O. Les catalases sont gnralement des enzymes hminiques ubiquistes dans les organismes arobies, et interviennent notamment l o des oxydases produisent H2O2 (peroxysomes). Certaines catalases ne sont pas hminiques et contiennent du vanadium ou du manganse. CDP - Cation diffusion facilitator. Transporteur membranaire agissant par diffusion facilite, c'est--dire rendant la membrane permable des cations dtermins appartenant des
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mtaux lourds, participant l'expulsion de l'excs de mtal dans la cellule (PAULSEN IT & SAIER MJ (1997) J. Membr. Biol 156 : 99-103). Voir Diffusion facilite. Centre ractionnel - Dsigne le complexe molculaire de la photosynthse o se fait la sparation de charges partir de l'nergie lumineuse. CFC - Chlorofluorocarbones. Exemples : frons utiss autrefois dans les groupes frigorifiques. Chaperonine - Chaperon molculaire reprsent typiquement par les HSP-60 ou le systme GroELS dEscherichia coli, une protine du choc thermique intervenant dans la phase terminale de lenroulement dun polypeptide substrat ou comme agent de rparation des protines dnatures. Chaperon molculaire - Terme dsignant une protine capable de sassocier une chane polypeptidique naissante ou partiellement droule (dnature), lempchant de sassocier dautres polypeptides. Les chaperons molculaires favorisent lenroulement correct des polypeptides, exercent leur action sur une vaste gamme de produits ou sur des substrats particuliers. Beaucoup sont des protines du choc thermique, ont souvent un fonctionnement coupl une hydrolyse dATP. Leur action peut s'exercer sur l'enroulement d'un grand nombre de polypeptides substrats, ou avoir au contraire une action plus limite certains composants qu'ils stabilisent. la limite, un chaperon molculaire spcifique d'un seul composant peut rester associ lui et stabiliser par exemple son insertion dans la membrane. Charge nergtique - C'est le rapport ([ATP] + 1/2 [ADP])/([ATP] + [ADP] + [AMP]). Le facteur 1/2 est affect [ADP], parce qu'une enzyme trs rpandue, l'adnylate kinase, catalyse la raction rversible ATP + AMP 2 ADP (en prsence de Mg). Chmostat - Culture continue faite volume constant, o le milieu frais est apport en continu, ainsi que le prlvement du milieu de culture. Le chmostat est gnralement utilis en prsence d'un facteur limitant, comme l'apport d'un lment nutritif. Il s'tablit un tat stationnaire, quilibre dynamique o la concentration cellulaire et la composition du milieu restent constants au cours du temps, aussi longtemps que cette situation fragile n'est pas rompue par l'apparition de mutants ou par un lger changement des conditions. Voir aussi Turbidostat. Chimio-lithotrophe - Organisme tirant son nergie de l'oxydation d'un compos minral : H2, NH3, S2 , S2O42 , Fe2 + L'accepteur d'lectrons est O2, ou encore le nitrate. Exemples rpandus : les bactries du genre Thiobacillus, qui oxydent les sulfures jusqu'au stade sulfate. Les chimio-lithotrophes facultatifs peuvent aussi tirer leur nergie de loxydation dun substrat organique. Les chimio-litho-autotrophes utilisent CO2 comme seule source carbone. Chimiotactisme - Mcanisme permettant d'orienter le dveloppement d'un organisme ou ses dplacements sous l'influence de signaux chimiques, agissant par la prsence ou l'absence d'un produit ou les variations de sa concentration. Chiralit - Proprit qui fait qu'un objet n'est pas superposable son image dans un miroir, comme la main gauche et la main droite. Chloroperoxydase - Glycoprotine extracellulaire dorigine fongique tudie chez Caldariomyces fumago, possdant une gamme tendue dactivits catalytiques qui la rapproche des peroxydases, catalases et cytochromes P450. Elle peut halogner par chlorure, bromure ou iodure des molcules organiques diverses. La cystine est le cinquime ligand du fer comme dans un P450. Chlorosomes - Structures membranaires particulires aux bactries vertes sulfureuses, disposes en tubules accols la face interne de la membrane cytoplasmique et contenant les pigments sensibles la lumire (bactriochlorophylles a, c, d et e). Choc thermique - Brusque changement de temprature susceptible de modifier la structure de certains constituants cellulaires ou de perturber les rgulations. Chez E. coli, l'exposition temporaire une temprature suprieure 42C. Cinnamique (Acide) - Acide phnyl-3-propnoque.
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CO dshydrognase - Catalyse loxydation de CO en CO2. Il y en a deux sortes trs diffrentes : Chez les actognes et mthanognes, la CO dshydrognase catalyse rversiblement la scission de lactyl-CoA et peut sappeler actyl-CoA synthase. Lenzyme contient des noyaux fer-soufre, du nickel, et se montre trs sensible O2. Chez les bactries carboxydotrophes arobies et les pourpres non sulfureuses, oxydent uniquement CO en CO2. C'est une enzyme flavinique compltement trangre la prcdente. Cobalamines - Voir Corrinodes. Cobalt - Mtal de transition, pouvant osciller entre trois niveaux redox Co(I), Co(II) et Co(III). Sa fonction physiologique essentielle est sa participation dans la vitamine B12 et les corrinodes. Les sels de Co(II) changent de couleur avec la temprature et lactivit de leau, passant de la gomtrie de coordination octadrique (rose) une gomtrie ttradrique (bleu). Cobamides - Voir Corrinodes. COD - Chemical oxygen demand. CODH - Monoxyde de carbone dshydrognase. Voir CO dshydrognase. Codon - Succession sur le brin signifiant de l'ADN de trois bases successives reprsentant un acide amin ou un signal de fin dans le tableau du code gntique. Ces codons se retrouvent sur l'ARN messager aprs transcription, l'uracile tant la place de la thymine. Le tableau du code gntique, pratiquement universel et reproduit dans tous les manuels, montre que certains acides amins sont dtermins par plusieurs codons. Le tableau est dit dgnr (du mot anglais degenerate ). Dans leur traduction les espces vivantes ont gnralement une prfrence pour certains codons. La frquence particulire de certains codons pour d'autres de mme signification est caractristique ("codon bias") et se retrouve entre espces apparentes. C'est donc un outil utilis dans les comparaisons de squences. Coenzyme A (CoA) - Ce cofacteur se lie par la fonction thiol porte son extrmit avec les fonctions carboxyliques, avec perte dune molcule deau, en formant un thioester. Lacide ainsi li au coenzyme A est sous forme acyle dite active, lui permettant dtre transfr tel quel un autre accepteur ou de subir une modification, par exemple une rduction. Le coenzyme A et sa fonction thiol est souvent dsign en abrg par HS-CoA. Il est assembl par petits morceaux :
O O HS CH2 CH2 NH cystamine CO2 cystine C O CH2 C CH2 NH OH CH CH3 C CH3 adnosine 3',5'-phosphate CH2 O P O O O P O
adnosine 3',5'-phosphate
acide pantothnique pantthine 4'-phosphate
Lacide pantothnique a pour prcurseurs la -alanine et la valine. Cest une vitamine du groupe B (les cellules humaines ne peuvent pas lassembler), trs rpandu dans le monde vivant, mais exig ici et l (facteur de croissance) par certaines espces bactriennes (Proteus morganii). La liaison thioester entre le coenzyme A et un acide carboxylique est une raction endergonique qui ncessite lhydrolyse de lATP en AMP et pyrophosphate (voir Ligase).
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Coenzyme B - 7-mercaptothanoylthronine-phosphate, dsign aussi par HS-HTP. Cofacteur de la mthanognse dans la rduction du mthylcoenzyme M. Coliformes - Bactries Gram-ngatives non sporulantes capables de fermenter le lactose en formant du gaz au bout de 48 h 35C. Les plus courantes sont Escherichia coli, Enterobacter et espces voisines. Souvent utilises comme indice d'une contamination fcale de l'eau. Colicines - Protines antibiotiques (bactriocines) codes par plasmide et produites par les coliformes contre d'autres bactries. Les colicines se fixent la surface des bactries sensibles l'aide de rcepteurs. Elles peuvent provoquer la lyse ou attaquer des sites intracellulaires comme les ribosomes. Coliphage - Bactriophage utilisant Escherichia coli pour hte. Comtabolisme - Dgradation dun compos inhabituel par un organisme, qui ne peut pas s'en servir comme seul support de croissance mais doit utiliser une autre substance comme source de carbone et dnergie. Le comtabolisme concerne souvent un substrat qui prsente des similitudes avec le substrat de croissance, reconnu par les mmes enzymes quand la spcificit de ces catalyseurs est suffisamment lastique. Un comtabolisme peut sinterrompre un stade intermdiaire et accumuler un produit qui n'est pas transform plus avant. Commensalisme - Association de deux organismes o l'un d'eux tire un bnfice de la situation tandis que l'autre n'en est pas affect. Comptence - Voir Transformation. Complexant des mtaux - Compos organique formant un complexe de coordination avec un ion mtallique, qui est squestr. Les mtaux de transition (Fe, Co, Ni) se combinent volontiers avec un atome dazote ou doxygne, moins souvent avec le soufre. Zn et Hg se combinent souvent avec le soufre, les alcalins et alcalino-terreux (Mg, Ca, Mn) souvent avec des oxy-anions (aspartate, glutamate dans les protines). Consensus - Portion de squence montrant des caractres constants au cours des comparaisons de squence. Dans le cas des protines, traduit un conservatisme structural entre protines homologues, accompagne gnralement une fonction dtermine. Dans un acide nuclique, un consensus est typiquement un motif reconnu par une protine rgulatrice, les ribosomes Consortium - Terme utilis surtout dans les textes anglo-saxons. Cohabitation de plusieurs organismes prsentant entre eux une association fonctionnelle. Par exemple une espce A fournit un facteur de croissance l'espce B, celle-ci limine un inhibiteur dfavorable la multiplication de A. Sapplique le plus souvent des espces bactriennes ou fongiques. Convergence volutive - Rsultat d'une volution o la slection naturelle a impos un type de structure ou une morphologie adapte la fonction. Par exemple, requins et dauphins. Cooprativit - Phnomne concernant la liaison d'un ligand sur une protine ou un acide nuclique, quand elle facilite (cooprativit positive) ou entrave (cooprativit ngative) la fixation d'une deuxime molcule identique. La cooprativit peut jouer sur un nombre plus ou moins important de molcules de ligand et se traduit par une constante d'affinit variable en fonction du nombre de molcules en place. Coproporphyrine III - Intermdiaire de synthse de la protoporphyrine IX, qui avec du fer donne l'hme. La transformation remplace deux chanes propionyle en groupes vinyle. Corrinodes - Cofacteurs renfermant un noyau rappelant la structure des porphyrines et contenant du cobalt. On les appelle aussi cobamides ou cobalamines. Les reprsentants les plus connus de cette famille ubiquiste, dont il existe une assez grande varit chez les archaebactries, est la vitamine B12, dont la formule apparat dans les manuels de biochimie, et la 5'-dsoxyadnosyl-cobalamine. Le mtal est Co(I), Co(II) ou Co(III), plac au centre d'un noyau chimique rappelant celui des porphyrines. L'tat Co(III) permet ltablissement dune liaison organomtallique entre le cobalt et un atome de carbone. Le cobalt est alors hexacoordonn (base-on), parce que du ct oppos au plan du noyau
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s'tablit une sixime liaison avec un noyau azot benzimidazole ou analogue. Par rduction Co(I), cette liaison est rompue, le cobalt est alors ttracoordonn (base-off), comme symbolis par un schma trivial o le plan de la pseudo-porphyrine est indiqu par un carr.
"base-off" CoI "base-on" CoII CH3 CoIII
L'tablissement de la liaison CoC, notamment par l'apport d'un mthyle, se fait donc par une oxydorduction interne et un changement de conformation du cofacteur, qui stabilisent cette liaison. L'opration inverse la rend labile. Les proprits de Co dans les corrinodes permettent ces cofacteurs dintervenir dans des ractions radicalaires, des transpositions, des transferts de mthyle (comme dans la formation du mthylmercure), de participer des mtabolismes varis dans une grande partie du monde vivant, et de nombreux microorganismes font une synthse de corrinode. Cette versatilit des corrinodes au niveau du centre mtallique leur permet de fonctionner la manire d'un ractif de GRIGNARD (anionique), d'un agent radicalaire ou d'un ractif de MEERWEIN (cationique). COT - Carbone organique total, mesur dans les eaux uses par calcination d'un microchantillon et mesure du CO2. Crnarchaeotes - Groupe d'archaebactries considres comme proches des formes de vie les plus primitives, contenant des thermophiles extrmes vivant en milieu trs acide et diverses formes planctoniques. Pyrolobus fumaris peut vivre jusqu' 113C. Le gnome de Aeropyrum pernix a t compltement squenc. Appartiennent ce groupe : Sulfolobus, Pyrodictium, Acidianus, Thermosphaera et d'autres. Crsols - ortho-, mta- et para-hydroxytolune (ou mthyl-phnols). Les deux derniers sont abondants dans le goudron de houille, librs par pyrolyse du bois. Ils sont prsents dans le crosote. Les chauffages domestiques, moteurs combustion, ainsi que l'abrasion de l'asphalte des routes en librent de grandes quantits dans l'environnement. Peu solubles, ils peuvent se dposer au fond des eaux et leur libration progressive engendre des effets trs toxiques pour la faune aquatique raison de 10-20 mg/L en moyenne. Les doses ltales sont de l'ordre de 40 mg/L pour les algues vertes, et seulement de 7 mg/L pour les cyanobactries. Ils peuvent s'accumuler dans les sdiments par adsorption sur l'argile, mais les plantes sont capables de les absorber et de les liminer progressivement. Crosote - Goudron huileux, bruntre et odorant provenant du bois ou du goudron de houille aprs distillation. C'est un mlange complexe et mal dfini, insoluble dans l'eau mais possdant des constituants volatils confrant une odeur forte. partir du bois, on trouve surtout du phnol, des crsols, du gaacol. partir de la houille sont prsents de trs nombreux produits dont des hydrocarbures aromatiques polycycliques plus ou moins fortement oxygns. Utilis comme agent protecteur du bois contre les champignons (traverses, poteaux tlgraphiques). Utilis accessoirement pour la protection des collections d'insectes et confrant alors avec le formol une odeur caractristique dans les laboratoires de Zoologie! CRP - Cyclic AMP receptor protein. Appele aussi CAP. En liant lAMP cyclique, la protine chez E. coli se lie lADN et active la transcription des gnes de lopron Lactose, ainsi que celle de divers oprons commandant gnralement des fonctions cataboliques. Linduction de la -galactosidase (LacZ) se produit donc deux conditions : leve du blocage exerc par le rpresseur spcifique par fixation de linducteur (qui agit comme effecteur allostrique, voir Allostrie), et liaison de CRP sur lADN en un site adjacent, lui permettant d'intergir avec lARN-polymrase. La rpression catabolique, exerce par exemple sur un milieu glucos, est due un taux dAMP cyclique insuffisant pour lattachement de CRP sur lADN. Par contre une lvation de lAMP cyclique, un signal pour la mobilisation des ressources nergtiques, dclenche laction favorable de CRP comme activateur de linduction des gnes lac.
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Cuivre - Oligo-lment essentiel introduit dans diverses enzymes doxydorduction ayant pour substrat O2, du superoxyde, des oxydes dazote, de l'ascorbate, des phnols et autres : des oxydases (les plus nombreuses) oprant spcifiquement sur des substrats varis (galactose, amines, catchol, ascorbate, cytochrome c dans la chane respiratoire...) ; des mono-oxygnases (phnols, peptidyl-glycine, tyrosine, dopamine,..) ; des dioxygnases (indole, querctine...) ; des rductases (nitrite, oxyde nitreux) ; les superoxyde dismutases cuivre et zinc. Le cuivre fonctionne entre les tats Cu(I) et Cu(II). Il figure galement dans des transporteurs dlectrons (azurine, plastocyanine) ou doxygne (hmocyanines animales). Il est vhicul dans notre plasma par la cruloplasmine, qui est une ferro-oxydase transformant Fe(II) en Fe(III). Le cuivre est indispensable la marche de la photosynthse et la synthse de la chlorophylle. Le cuivre dans les protines se rencontre dans plusieurs environnements molculaires, identifis par le spectre et la RPE. Les types I et II nont rien voir avec le degr doxydation. Dans le type I (bleu), le cuivre est coordonn 5 sites dont 4 acides amins, soit 2 H, S, M (azurine, plastocyanine), ou 2 H, S, E (phytocyanine), ou encore 2 H, S, H2O dans la cruloplasmine. Les oxydases "bleues" comme l'ascorbate oxydase contiennent un Cu de type I. Dans le type II, le cuivre est galement pentacoordonn avec des atomes d'azote, de soufre ou d'oxygne, en gnral par plusieurs histidines. Le cuivre adoptant cette structure se trouve dans certains superoxyde dismutases, l'amine oxydase et diverses oxydases, des oxygnases dont la mthane oxygnase, la nitrite rductase. Dans le type III, il y a deux ions Cu ponts par de l'oxygne et formant un noyau bimtallique silencieux en RPE. Dans la N2O rductase, les deux ions Cu sont ponts par du soufre. Un environnement particulier autour du cuivre s'observe dans la cytochrome c oxydase et les quinol oxydases. Cuprdoxine - Protine transporteur dlectrons fonctionnant laide dions cuivre. Cyanate - N=C=O (correspond N=C=OH). C'est un nuclophile agissant sur deux poles, O ou N, pouvant donner thoriquement les deux ractions sur un ractif RX : N=C=OR (cyanate ou alkylcyanate) ou RN=C=O (driv isocyanate). La raction est gnralement rgiospcifique et ne forme que l'isocyanate. Dans le cas du thiocyanate ou S remplace O (N=C=S), les deux solutions coexistent, et il y a formation de driv thiocyanate N=C=SR, bien que le driv thioisocyanate RN=C=S soit gnralement le produit majoritaire. La mesure du cyanate consiste estimer l'ammonium form aprs traitement pH acide et bullition, ou encore par une raction colore avec l'acide anthranilique (DORR & KNOWLES (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60 : 289). Le thiocyanate est mesur par colorimtrie comme cyanate ferrique. Cyanobactries - Procaryotes photosynthtiques, appels autrefois algues bleu-vert. Renferment de la chlorophylle a, l'exclusion de la chlorophylle b, qui est remplace par des pigments spciaux similaires la bilirubine et appels phycobilines. Pigments fixs par des liaisons covalentes des complexes protiques appels phycobilisomes contribuant capter la lumire pour le PS2. Photosynthse pratique sur le mode de celui des chloroplastes, fait la photolyse de l'eau et libre O2. Monocellulaires ou pluricellulaires, souvent filamenteuses. On y observe des diffrenciations cellulaires et plusieurs formes de propagation. Certaines espces assimilent l'azote atmosphrique. Rserves carbones particulires (voir Cyanophycines). Les cyanobactries se rencontrent dans tous les biotopes, souvent aptes coloniser des milieux difficiles, et ont exist aux temps les plus anciens dont nous avons conserv des traces de vie (voir Stromatolites). Peuvent donner lieu des prolifrations importantes dans les eaux, rsistent assez bien des conditions alcalines, et scrtent des substances toxiques pour les autres espces, voire pour lhomme (voir Microcystine). Tendance frquente s'associer avec d'autres organismes, par exemple Azolla dans les fougres aquatiques. Symbiotiques dans de nombreuses espces de lichens (en particulier des Nostoc). On admet gnralement que les chloroplastes drivent d'anciens organismes endosymbiotiques apparents aux cyanobactries actuelles. Quelques exemples sont donns dans un tableau.
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Unicellulaires ou coloniales Unicellulaires ou coloniales Filamenteuses Filamenteuses htrocystes Filamenteuses ramifies
BIODGRADATIONS ET MTABOLISMES Reproduction

fission binaire bourgeonnement trichomes (chanes de cellules) fragmentation de trichomes fragmentation de trichomes
Exemples
Gloebacter, Microcystis, Synechocystis, Chroococcus Dermocarpa, Chamaesiphon, Xenococcus Oscillatoria, Spirulina, Phormidium, Schizothrix Nostoc, Anabaena, Calothrix, Cylindrospernum, Scytonema Stigonema, Chlorogleopsis
Cyanophycines - Rserve carbone et azote des cyanobactries, faite de polymres d'acide aspartique dont chaque unit est lie l'arginine. Cycle de CALVIN - Voir CALVIN. Cyclodextrines - Molcules cycliques (macrocycles) naturelles constitues de six dix units de D-glucose, obtenues par transformation microbiologique ou enzymatique de lamidon. Lenchanement constituant les cyclodextrines dlimite une cavit rigide pour les plus simples, apolaire et chirale, dont la dimension varie en fonction du nombre dunits. La caractristique la plus importante des cyclodextrines est leur capacit inclure dans leur cavit une varit de substances solides, liquides ou gazeuses conduisant la formation de supermolcules. Cyclosrine (D-) - Antibiotique tir l'origine d'un Streptomyces, utilis dans le traitement de la tuberculose, agirait comme analogue de la D-alanine et inhibe la synthse d'une paroi normale de peptidoglycanes. CysB - Protine rgulatrice commandant le rgulon d'assimilation des composs soufrs par les bactries ( la manire de PhoR pour le phosphate). Cytochrome - Protine hminique, c'est--dire renfermant un ou plusieurs hmes, fonctionnant comme transporteurs d'lectrons. Les chanes respiratoires comportent habituellement un ou plusieurs cytochromes. Une activit enzymatique se rencontre dans des cytochromes particuliers (P450, nitrite rductase). Bien qu'il existe des cytochromes solubles, beaucoup sont insrs dans une membrane et fonctionnent ventuellement en couplant une translocation unidirectionnelle de protons avec le passage des lectrons. La nomenclature est fonde sur la bande dite alpha du spectre dabsorption du cytochrome rduit. Les cytochromes b ont une bande alpha comprise entre 555 et 565 nm, et contiennent un hme B. Dans les cytochromes c (bande au-dessous de 555 nm), il y a un ou plusieurs hmes B lis la protine par liaisons covalentes. Les cytochromes a ont une bande vers 590 nm et contiennent au moins un hme A. Les cytochromes o ont un hme O (hme A modifi). Les cytochromes sont souvent dsigns par leur bande alpha (par exemple cytochrome b558), plus rarement par la valeur de leur potentiel redox. Voir Hme. Cytochrome b5 - Cytochrome de faible masse molculaire plant dans les membranes internes des cellules eucaryotiques, et participant au fonctionnement de mono-oxygnases. Bien connu dans les cellules du foie animal o il est ancr aux membranes du rticulum endoplasmique. Cytochrome c - Cytochrome contenant un ou plusieurs hmes C (voir Hme, Cytochrome), la porphyrine tant attache au polypeptide par des liens thio-thers. Les cytochromes c sont typiquement extracytoplasmiques, c'est--dire dans le priplasme des Gram-ngatifs ou associs la membrane du ct priplasmique. Dans les mitochondries, ils sont localiss lextrieur de la membrane interne. On reconnat plusieurs classes de cytochromes c sur la base de proprits structurales, se traduisant par des gammes de potentiels diffrents. Dans la classe I, o sont les cytochromes mitochondriaux solubles, les ligands sont His et Met, celui-ci tant prs du C-terminal. Le cytochrome c mitochondial de source animale,
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vendu commercialement, est un accepteur dun lectron (la rduction saccompagne dun changement de spectre), utilis comme ractif commode dans les tests, en particulier avec les rductases flaviniques comportant un centre fer-soufre. Dans la classe II, il y a un ou plusieurs hmes, le fer tant souvent pentacoordonn ; un exemple est le cytochrome c' de Chromatium vinosum. Ils lient CO, NO, CN. Dans la classe III, ce sont gnralement des cytochromes bas potentiel, plusieurs hmes, comme le cytochrome c3, les coordinants du fer tant deux His. La classe IV regroupe des cytochromes ayant des hmes et d'autres groupements, comme une flavine dans les flavocytochromes. On y rassemble diverses protines comme l'hydroxylamine rductase, le c554 de Nitrosomonas Cytochrome P450 - Voir P450. Dam (D-adenine methylation) - Mthylation de l'ADN bactrien par une mthylase code par le gne dam, exerce sur les deux brins d'ADN sur la squence (identiques dans les deux sens) qui est GATC. Permet aux mcanismes de rparation de l'ADN de distinguer le brin parental du brin nouveau au cours de la rplication, celui-ci n'tant mthyl son tour qu'aprs un dlai. Le brin nouveau est donc slectionn pour la rparation des erreurs d'appariement (mismatch). Les bactries dam sont viables mais prsentent un taux accru de mutations. Les sites dam sont nombreux et disperss dans le gnome bactrien. DAPI - 4,6-diamidino-2-phnylindole. Colorant dintercalation des acides nucliques bicatnaires, fluorescent, pouvant servir reprer les hybrides. Par exemple en faisant une hybridation avec une sonde approprie sur lARN ribosomique dans des cellules pralablement fixes, on peut faire une numration des cellules totales ou des cellules dune espce dtermine (en fonction de la sonde). On peut voir une application des aquifres contamins dans HESS A et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 : 2136-2141. DBMIB - 2,5-dibromo-3-mthyl-6-isopropyl-p-benzoquinone. Poison de la photo-synthse oxygnique, intervenant au niveau de l'oxydation du plastoquinol. DBO - Demande biologique en oxygne. Sa dtermination consiste mesurer la quantit totale de O2 consomme au cours de l'oxydation des matires organiques dans un chantillon donn. La DBO5 est mesure au bout de 5 jours. Des appareils automatiss tels que le Micro-Oxymax (Columbus) permettent de mesurer la DBO5 ainsi que la production de CO2. Ces mesures sont souvent utilises pour vrifier le caractre biodgradable d'un compos. Elles permettent aussi d'avoir une ide de la contamination organique globale d'un effluant, moyennant certaines corrections, notamment lorsqu'il y a des nitrates. Une eau potable doit avoir une DBO5 pratiquement nulle. Les eaux uses urbaines ont une DBO5 pouvant varier de 150 350 mL/L. Des valeurs bien plus leves sont enregistres la sortie des laiteries, abattoirs, et surtout des distilleries (vinasses), parfois plus de 30 000 mg/L. Voir aussi COT , DCO. DCCD - Dicyclohexylcarbodiimide, peu soluble, dcouplant concentration faible (1 M). DCIP - Dichlorophnol-indophnol. Colorant accepteur de deux lectrons, dcolor en DCIPH2. Test dabsorbance 600 nm ( = 22 000 M1 cm1). Commode pour le dosage de nombreuses oxydorductions, en particulier celle des rductases flaviniques. La raction trs rapide permet le dosage des oxydases, mme en prsence de O2. Le DCIP rduit ne se roxyde que lentement lair, mais le fait trs rapidement en prsence dions Mn2 + ou de superoxyde dismutase (cause dartefacts). Le DCIP est souvent utilis en mlange avec le PMS. DCMU - 3-(3,4-dichlorophnyl)-1,1-dimthylure. Bloque la photosynthse au niveau du PS2, en empchant le transfert d'lectron aprs QA. DCO - Demande chimique en oxygne des eaux uses, obtenue l'aide d'un agent oxydant puissant comme K2Cr2O7. Evalue en kg dans les eaux industrielles. Dazaflavines - Analogues des flavines ou une position azote (N10) intervenant dans l'oxydorduction est remplace par le carbone. Le nouveau coenzyme ne peut alors plus faire d'changes lectron par lectron, mais par 2 lectrons la fois comme le NAD+ . Utilis exprimentalement pour lucider le mcanisme ractionnel. Le F420 est une dzaflavine naturelle.
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Dcarboxylation - Perte d'une fonction carboxylate (COO ) sous forme de CO2. Dcouplant - Agent inhibant la synthse d'ATP partir du potentiel membranaire ou l'opration inverse. Il y a deux sortes de dcouplants, ceux qui rendent la membrane permable aux protons ou aux ions, ceux qui entravent le fonctionnement de l'ATPase/ATPsynthase. Dnitrification - Rduction de l'ion nitrate en milieu anarobie dans l'environnement. La dnitrification sensu stricto est un mcanisme nergtique o le nitrate est rduit en nitrite, puis en N2O et N2. Une autre voie est la dissimilation rductrice du nitrate en ammoniac appele aussi ammonification dissimilatrice. Dans les deux cas l'ion nitrite est une tape intermdiaire de la rduction du nitrate. Une rductase convertit l'oxyde nitreux en azote. Elle est inhibe par l'actylne, et la dtection de N2O qui en est facilite, est un bon indice de dnitrification. La dissimilation du nitrate entrane dans tous les cas une consommation de nitrate bien suprieure celle qui est requise pour approvisionner la cellule en azote, c'est--dire l'assimilation. La rduction du nitrate s'accompagne d'un fractionnement isotopique suffisant pour qu'on puisse faire la part de la dnitrification et de l'ammonification : au fur et mesure qu'il est consomm, le nitrate restant s'enrichit lgrement en azote-15, alors que le rapport 15N/14N s'abaisse dans les produits forms. Dsacylation - Enlvement d'un acyle, soit par hydrolyse librant l'acide carboxylique correspondant, soit par un transfert portant le fragment acyle sur un accepteur. Dsaturase - Cre une double liaison dans la chane carbone dun acide gras. Opre la faon dune mono-oxygnase : hydroxylation, puis limination dune molcule deau. Dans lenzyme du ricin le site catalytique comporte un noyau Fe-O-Fe, les substrats sont lolyl-ACP (voir ACP), le NADPH et O2. La longueur de chane optimale est celle de lACP-18 : 0. Dans le foie de lhomme les lectrons sont transports du NADH loxygnase par une rductase et le cytochrome b5. Dshalognase - Enlve un atome d'halogne sous forme d'ion halognure. Les dshalognases hydrolytiques remplacent l'halogne par un hydroxyle provenant d'une molcule d'eau. Dshydrognases - Enzyme catalysant une dshydrognation, en utilisant un coenzyme (pouvant se comporter comme deuxime substrat quand il nest pas li de faon covalente la protine), du type NAD+, NADP+, flavine (FAD, FMN), PQQ et autres. On a coutume de nommer lenzyme en lui donnant le nom du substrat principal dans le sens de l'oxydation, mme lorsque la raction observe sobserve en sens inverse. Dshydrognation - Raction doxydation comportant le prlvement simultan dun ou de deux atomes dhydrogne sur le substrat. Dans le cas du NAD comme accepteur, le modle est : AH2 (substrat) + NAD+ A + NADH + H+. Lhydrogne est alors enlev sous forme dun ion hydrure et dun proton, et loxydation est deux lectrons. Un coenzyme nicotinique tel que le NAD+ est gnralement li de faon non covalente et reste facilement changeable sauf quand l'affinit est trs forte dans les enzymes appeles maintenant nicotinoprotines. Dans le cas de FAD, le modle est : AH2 + FAD A + FADH2. Loxydation laide des flavines peut se faire deux lectrons, ou lectron par lectron, avec formation intermdiaire de radicaux (voir Flavines). Les dshydrognations sont potentiellement rversibles, en fonction des concentrations des entits en prsence et des potentiels doxydorduction. Le modle de certaines dshydrognations est plus complexe, peut comporter une dcarboxylation ou dautres oprations, et mettre en jeu des cofacteurs supplmentaires lis lenzyme : hmes, noyaux fer-soufre Dsulfordoxine - Protine transporteur d'lectrons de trs petite taille (2 36 acides amins) chez Desulfovibrio gigas, de type rubrdoxine. Le fer est substituable par d'autres mtaux. Excellent modle pour tudier les rapports polypeptide-mtal dans les mtalloprotines (ARCHER M et coll. (1999) Protein Sci. 8 : 1536-1545). Dsulfoviridine - Sulfite rductase dissimilatrice de Desulfovibrio vulgaris (WOLFE BM & COWAN JA (1994) Eur. J. Biochem. 223 : 79-89). DHAP - Dihydroxyactone-phosphate. Diagnse - Ensemble des processus qui transforment progressivement un sdiment en roche sdimentaire. Commence par laction des tres vivants, se poursuit avec le temps par
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compaction et perte deau, ractions chimiques, migration de certains lments, remplacement de certaines formes minrales par dautre (calcite en aragonite, opale en calcdoine). Diauxie - Prsence de deux phases de croissance observes parfois dans des cultures o il y a deux substrats carbons. L'un des deux est utilis prioritairement jusqu' puisement avant que l'utilisation du second prenne le relais. Ce phnomne est frquent dans les biodgradations. Il a pour effet de freiner l'utilisation d'un polluant ou d'un xnobiotique par une population bactrienne aussi longtemps qu'un substrat de croissance plus favorable (glucose, acide amin) n'a pas t presque totalement consomm. Voir Rpression catabolique. Diazoque - Form par diazotation avec une amine aromatique et un nitrite en milieu acide. Les diazoques ragissent avec des phnols et amines pour donner des produits colors. Cette chimie a une norme importance dans l'industrie des colorants. Diazotrophe - Organisme capable de se dvelopper avec N2 comme seule source d'azote. DIC - Dissolved inorganic carbon ou carbone minral dissous, soit CO2, HCO3, CO32. Ces entits sont en quilibre dans l'eau. L'hydrognocarbonate (bicarbonate) domine en eau neutre ou alcaline (valeur des pK en eau douce) :
H+ CO2 + H2O H2CO3 pKa1 = 6,4 HCO3 H+ pKa2 = 10 CO32
Le carbone assimil par la rubisco est sous forme de CO2. Par contre il est utilis par la plupart des carboxylases du mtabolisme sous forme de HCO3 (bicarbonate), notamment la phosphonolpyruvate carboxylase qui fonctionne dans les plantes C4. D'o l'importance de ces conversions. L'eau de mer a un pH de 7,8-8,2. La DIC est de l'ordre de 2 mM, se rpartissant en bicarbonate 1,8 mM, carbonate 0,35 mM, gaz carbonique 0,01-0,02 mM. Diffusion facilite - Migration travers une membrane obissant au mme principe qu'une diffusion passive, mais acclre par un transporteur ou un canal ionique spcifique de substrats dtermins. Diffusion passive - Migration de molcules ou d'ions travers une membrane en allant de la concentration la plus leve la concentration la moins leve. Dinoflagells - Dinophytes ou algues unicellulaires flagelles et planctoniques, se nourrissant de diatomes, renfermant de la chlorophylle c. Les dinoflagells comportent divers caractres inhabituels au niveau de leur matriel gntique (nombreux chromosomes et grande quantit dADN non associ des histones, o lhydroxymthyluracile remplace la thymine). Il existe divers genres fluorescents (Noctiluca, Gymnodinium, Peridinium, Pyrodinium, Gonyaulax). La population des dinoflagells peut atteindre dans certaines conditions des densits leves. Gonyaulax polyedra est souvent responsable de la luminescence des ocans, les cellules mettant la suite dune stimulation mcanique des flashes de lumire brefs et intenses bien visibles dans lobscurit (par exemple sous le choc des rames). Les Noctiluca sont bien connus pour leur formation de "mares rouges". La prolifration des dinoflagells, parfois phmre, est responsable dintoxications pouvant atteindre lhomme, et rendre le poisson ou les coquillages inconsommables. Dioxines - Terme gnrique regroupant une gamme de composs chlors drivs de la dibenzo-p-dioxine, contenant deux cycles benzniques relis par deux ponts oxygne. Composs toxiques en fonction du nombre d'atomes de chlore et de leur position. Le plus dangereux est le TCDD ou 3,4,7,8-ttrachlorodibenzo-p-dioxine. Dioxygnase - Enzyme d'oxydation utilisant O2, introduisant les deux atomes d'oxygne sur la molcule substrat des positions spares (la liaison entre les deux atomes de loxygne diatomique est rompue). Les dioxygnases ouvrant le cycle aromatique en ortho ou mta fonctionnent avec du fer non hminique, respectivement Fe(III) et Fe(II), sans source dlectrons auxiliaire. Les dioxygnases catalysant la double hydroxylation du cycle aromatique, formant un cis-dihydrodiol, ont une NADH-ferredoxine rductase de nature flavinique,
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un transporteur d'lectrons (ferrdoxine) et une hydroxylase ou ISP, gnralement sous forme 3 3, contenant du fer non hminique et un noyau Fe/S dans chaque sous-unit . Certaines dioxygnases oprent en introduisant un seul atome d'oxygne dans le substrat, le second servant oxyder et dcarboxyler le 2-oxoglutarate en succinate et CO2. Ces dioxygnases utilisant le 2-oxoglutarate sont assez rpandues, ne font pas que des hydroxylations mais participent d'autres ractions telles que des dsaturations. Dissimilation - Srie de transformations rductrices naboutissant pas llaboration dune entit directement assimilable par le mtabolisme cellulaire. La dissimilation soppose donc lassimilation. Nanmoins dans certaines conventions, une dissimilation ne produit pas de potentiel membranaire, ce dernier cas de figure tant rserv la respiration. Dithionite - Agent rducteur trs utilis exprimentalement sur enzymes et transporteurs d'oxydorduction, correspond l'ion S2O42. Le vrai rducteur est son produit de dissociation : S2O42 2 SO2 ; SO2 + H2O HSO3 + H+ + e . La rduction est donc la plus rapide sur des cibles rduites lectron par lectron (flavines, cytochromes, fer-soufre), plus lente sur des accepteurs deux lectrons (hydrure) comme NAD+. DMSO - Dimthylsulfoxyde. Produit dans la nature par oxydation du dimthylsulfure, et prsent dans les effluents des papeteries. DMSO rductase - Rduit le DMSO et le dimthylsulfure. Peut intervenir comme accepteur respiratoire. Chez Escherichia coli lenzyme DmsABC est attache la membrane par DmsC, et la partie catalytique DmsAB est tourne du ct cytoplasmique. La sous-unit DsmB renferme 4 noyaux [4Fe-4S]. DsmA possde un cofacteur molybdne de type MGD. Lenzyme accepte plusieurs sulfoxydes et pyridine-N-oxydes. Chez dautres espces lenzyme peut-tre priplasmique. Cest le cas de Rhodobacter capsulatus, o la structure de la rductase a t dtermine haute rsolution par analyse cristallographique. Dnase I (protection ) - Technique consistant localiser les portions d'ADN lies spcifiquement par une protine. Celle-ci recouvre la double hlice suffisamment pour empcher son hydrolyse. Les portions restes libres sont scindes. Aprs traitement, la portion protge est isole par lectrophorse et squence. DNA shuffling - Mthode permettant de recombiner rapidement des fragments d'ADN homologues portant chacun une ou plusieurs mutations ponctuelles, et d'obtenir nouveau un segment de longueur identique celle des fragments de dpart, mais emportant une srie de mutations distribues au fil des recombinaisons au hasard comme l'indique le schma :
fragmentation alatoire (DNase I) recombinaison
X X X X X X X X X
X X
X X X X X
X X X X X X X X X
X X
X X X X
X X X X X X X X X
X X
X X X X X
X X
X X
X X
nouveau cycle
X X X X X X X X un des recombinants
Les segments de dpart, variants d'une mme squence initiale, sont fragments alatoirement par DNase, et par amplification sans amorce extrieure mais servant d'amorces mutuelles conduisant leur allongement par la polymrase. l'arrive s'obtient une squence nouvelle, de mme longueur qu'au dpart (en principe 1 kb), renfermant un lot de mutations. Lorsque ce lot correspond une squence favorable, il est nouveau amplifi par PCR classique. On obtient trs rapidement ainsi une volution artificielle de la squence de dpart qui est passe au crible de la slection (STEMMER WPC (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 10747-10751). DOPA : 3,4-dihydroxy-L-phnylalanine.
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Doubles hybrides (mthode des) - Technique de biologie molculaire permettant de dtecter l'association spcifique de deux protines, ou de rechercher systmatiquement les facteurs protiques qui s'associent une protine dtermine. Elle est fonde sur l'expression d'un gne rapporteur (lacZ ) dans une souche recombinante de levure. Quand il y a transcription de ce gne, la levure fait de la -galactosidase et ses colonies sont facilement repres sur bote par une raction colore catalyse par l'enzyme. L'activateur de transcription GAL4, de structure A-B comporte un domaine A qui reconnat l'ADN sur un site UAS (voir cette rubrique) en amont du promoteur, et un domaine B ncessaire l'activation. L'ide est de remplacer GAL4 par ses deux parties A et B spares, l'une tant runie une protine trangre (x), l'autre une autre protine (y). Ces manipulations se font par recombinaison gntique sur deux plasmides spars, conus pour faciliter l'insertion d'un gne tranger et faciliter la slection des recombinants. Ils sont introduits dans la levure, dont on ne slectionne que les cellules qui ont reu la fois les deux plasmides. Ces cellules font alors les deux protines chimres A-x et B-y, mais ne synthtisent de la -galactosidase (test positif) que si les parties x et y s'associent, en reconstituant un activateur fonctionnel (A-x, y-B).
1. activateur GAL4 GAL4 (1-881) B A A : domaine li lADN B : domaine activateur 2. activateur chimre Y B X 1-147 A A UAS promoteur 768-881 Y X B ADN transcription du gne GAL1 - lacZ UAS promoteur ADN transcription du gne GAL1 - lacZ
Mthode des doubles hybrides

La mthode permet aussi un criblage systmatique partir d'une banque dADN complmentaire (ou cDNA) de tous les clones comportant un facteur y. Une fois souds B en y-B, ils sont susceptibles de s'associer un activateur incomplet A-x pour reconstituer un activateur fonctionnel (A-x,y-B) contenant A et B et capable d'activer l'expression de lacZ. Une autre application est la recherche des domaines favorisant au sein d'une protine son association avec une autre, ou encore sa propre oligomrisation (association entre molcules identiques). Eau de mer - Composition moyenne en lments minraux (environ 35 g/L de sel, contre 38 g/L en Mditerrane, 270 g/L dans la Mer Morte, seulement 17,5 g/L dans la Mer Noire et 13 g/L dans la Caspienne). Cl Na+ SO42 Mg2+ Ca2+ K+ HCO3 Br g/L 19,3 10,7 2,69 1,29 0,41 0,39 0,15 0,07 ECF - Extra-cytoplasmic function sigma factor. Facteur damorage de transcription, ou facteur sigma, spcialis dans lexpression de gnes commands par des signaux extrieurs au cytoplasme : agents mtalliques, protines endommages dans le priplasme, irradiation lumineuse, lsions de la paroi Les promoteurs reconnus appartiennent un type standard bien conserv. Chez E. coli, le facteur sigma-24 ou sigma-E est le produit du gne rpoE. Il est induit par un choc thermique et concerne la rparation ou llimination des protines du priplasme. (Voir Facteur damorage, Rgulon). EDTA - Ethylnediamine-ttraactate. Agent complexant des cations divalents.
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Effet de serre - Rchauffement climatique gnral caus par un certain nombre de gaz de l'atmosphre qui retiennent la chaleur induite par le rayonnement solaire ainsi que l'nergie du rayonnement thermique de la surface du sol et des mers. La terre reoit en moyenne 350W/m2, soit sur une surface perpendiculaire au rayonnement solaire environ 1360 W/m2. Les gaz effet de serre retiennent l'infrarouge mis par la surface et le transforme en chaleur en fonction de l'nergie absorbe et de la vibration des liaisons molculaires. La vapeur d'eau est responsable de plus de la moiti de l'effet de serre, mais les effets de l'eau sont compliqus par la formation des nuages, qui rflchissent de l'nergie vers l'espace et vers le sol (albedo). La nbulosit est soumise de nombreux facteurs, est encourage par les arosols et poussires formant des germes de condensation (traines des avions). Les autres gaz sont le CO2, prsent 370 ppmv dans l'atmosphre et le principal responsable de l'effet de serre, le CH4 (1,8 ppmv), le N2O (0,3 ppmv) et l'ozone (0,03 ppmv mais variable). Ajoutent leurs effets les chloro-fluorocarbures (CFC). Le rle des activits humaines dans l'augmentation des gaz effet de serre comme le CO2 est dmontre par l'tude de leur composition en isotopes. Elastomre - Rsulte comme une matire plastique de la polymrisation de monomres naturels ou artificiels, mais s'en distingue par une proprit physique essentielle qui est de se dformer la moindre sollicitation mcanique. Entrent dans cette catgorie les caoutchoucs, naturels partir de l'Hevea brasilensis, ou artificiels partir de la ptrochimie. Electron-volt (eV) - Unit d'nergie. Lorsquun ensemble de N lectrons (N, nombre dAvogadro : 6,022 1023) passe dun systme S1 un systme S2 tel que le saut de potentiel E2 E1 est de 1 volt , il libre une nergie de 1 lectron-volt (eV), soit 96,49 kJ. ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assays. L'antigne fix sur un support (verre ou membrane) est reconnu par une IgG anticorps. Le complexe fix est reconnu son tour par un deuxime anticorps anti-IgG fourni par une espce diffrente, et soud une enzyme permettant la dtection du nouveau complexe antigne-anticorps-anticorps anti-IgG-enzyme. On utilise souvent la peroxydase (raction colore). Nombreuses variantes. Par exemple l'anticorps peut tre immobilis sur le support et c'est l'antigne qui est soud une enzyme. L'antigne ainsi conjugu est mis en comptition avec l'antigne libre du milieu doser. La quantit d'antigne conjugu l'enzyme, retenu par le support et dos par la raction enzymatique, varie inversement avec l'antigne comptiteur libre. EMP (Voie d'EMBDEN-MEYERHOF) - Voir Glycolyse. Enantiomres - Appels aussi inverses optiques. S'applique aux molcules renfermant un carbone asymtrique, ou toute autre structure confrant une chiralit. Voir chiralit. Endospore - Spore forme l'intrieur d'une cellule dite vgtative, et libre aprs destruction de celle-ci. La spore et la cellule vgtative rsultent d'une division asymtrique dclenche par des facteurs du milieu et mettant en jeu pas moins de 80 gnes chez les Bacillus, connus pour faire des spores particulirement rsistantes la chaleur, possdant de l'acide dipicolinique, une paroi paissie et une teneur en eau trs basse. Voir Formes de rsistance. Entrobactries - Groupe de bactries Gram-ngatives dans lequel se trouve le colibacille, en principe spcialises pour la vie dans le tube digestif animal mais trs rpandues dans la nature. Genres importants : Escherichia, Salmonella, S h i g e l l a , Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia. Dgradent les sucres par la voie d'EMBDEN-MEYERHOF (EMP), font du formiate partir du pyruvate, font en majorit des fermentations acides mixtes et produisent du gaz. Les tests biochimiques classiques sont fonds sur l'utilisation du lactose, la formation d'indole, l'hydrolyse de l'ure, la production de H2S et la formation de butanediol. ENTNER-DOUDOROFF (voie d') - Mtabolisme du glucose selon une voie spciale caractristique de diverses bactries Gram-ngatives, notamment des Pseudomonas, Alcaligenes, Ralstonia. Dcrite dans les livres de Microbiologie. Le glucose-6-phosphate est oxyd en 6-phosphogluconate, dshydrat en un produit caractristique, le KDPG ou 2-cto-3-dsoxy-6-phosphogluconate. Celui-ci est scind par aldolisation en pyruvate et glycraldhyde-3-phosphate (G3P).
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EnvZ - Premier terme d'une rgulation deux composants actionne par la pression osmotique. Sa structure est connue et reprsente l'archtype des protines jouant le rle de capteur dans ces rgulations, avec un domaine priplasmique, un domaine cytoplasmique contenant une histidine phosphorylable et responsable de la dimrisation de la protine, un domaine kinase liant l'ATP. Une des cibles de EnvZ est OmpR. Voir OmpR, Rgulations deux composants. H H Epoxyde - Compos rsultant de l'addition d'un atome d'oxygne sur une double C C liaison, formant un cycle triangulaire ractif donnant facilement des ractions O d'addition. Euryarchaeotes - Voir Archaebactries. Estrase - Enzyme catalysant l'hydrolyse d'un ester. La raction est rversible, mais favorise l'hydrolyse dans les conditions habituelles. Etat stationnaire - Equilibre dynamique atteint au cours d'une succession de ractions dans un mme flux mtabolique, quand toutes les concentrations intermdiaires sont constantes (chaque intermdiaire est utilis aussi vite qu'il est produit). Etat de transition - Forme intermdiaire thorique, non isolable, par lequel une molcule passe au cours d'une transformation ractionnelle lmentaire, correspond au sommet d'une colline nergtique accompagnant les dformations de liaisons, ionisations ou distorsions ; sa structure exacte est pressentie par des considrations thoriques ou par comparaison avec des molcules stables. Eubactries - Division majeure des procaryotes, avec les archaebactries. On y distingue au moins 11 groupes sur la base de l'ARN 16S. Voir notamment Bactrodes, Gram-positives, Cyanobactries, Planctomyces, Protobactries, Sulfato-rducteurs, Sulfureuses vertes. Euglnes - Algues flagelles monocellulaires, trs ubiquitaires et caractrises par leur grand pouvoir d'adaptation. Rsistantes aux variations de pH (2-10), de salinit, de temprature (15-40C), de conditions d'clairement. L'espce la plus tudie au laboratoire est Euglena gracilis. Les euglnes peuvent se dvelopper en autotrophie par photosynthse et forment alors des rserves carbones autour du chloroplaste sous forme de paramylon (-1-3-glucane), en organotrophie l'obscurit, avec rgression du chloroplaste, croissance sur substrats carbons (synthse de paramylon autour des mitochondries), enfin en photoorganotrophie qui est une combinaison des deux modes prcdents. Le lactate est transform par la mitochondrie en CO2. Celui-ci est rcupr par le cycle de CALVIN taux plus lev qu' partir du CO2 externe, et il en rsulte une acclration de la croissance. Certaines euglnes possdent des hydrognosomes et une hydrognase (voir ces termes). Les euglnes sont dexcellents modles de laboratoire pour des tudes varies portant sur la dgradation des xnobiotiques, la pharmacologie, les mcanismes d'adaptation et le mtabolisme des cellules hpatiques, dans lequel on retrouve curieusement certaines analogies avec celui de l'Euglne. Eutrophisation - Enrichissement des eaux par des composs carbons, azots ou phosphors, qui dclenchent une prolifration intempestive dalgues, de plantes et de cyanobactries, avec des effets pervers sur la faune aquatique. Exciton - Energie d'excitation, associe au dplacement d'un lectron vers un niveau d'nergie plus lev, transmise de molcule molcule sans transfert de masse (diffusion) ou d'lectricit (conduction d'un courant). Les physiciens considrent un exciton comme une quasi-particule se dplaant par sauts successifs en dcrivant le transfert d'nergie dans un semi-conducteur. Un exciton est particulirement instable, et ne se maintient que si le transfert est ultra-rapide, faute de quoi l'nergie serait perdue sous forme de chaleur. Exotoxine - Protine toxique rejete dans le milieu, gnralement thermostable engendre dans le mtabolisme normal ou la suite d'un tat de stress, souvent lie la prsence d'un plasmide. Extrmophiles - Organismes vivant dans des environnements o les conditions scartent fortement de celles qui rgnent habituellement l o se dveloppent la plupart des espces vivantes :
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froid permanent (< 5C, organismes psychrophiles) ; temprature leve, souvent forte concentration d'lments mtalliques (hyperthermophiles) ; temprature leve et milieu acide des sources volcaniques sulfureuses, lacs volcaniques (acidophiles) ; haute concentration en sel des lagunes d'vaporation, archaebactries et algues (halophiles) ; eaux sales et trs alcalines pH > 10 ; hautes pressions dans les grands fonds marins (barophiles). F420 (coenzyme) - Dazaflavine particulire des mthanognes, fonctionnant deux fois comme coenzyme doxydorduction du mthnyl-MPTH4 au mthyl-MPTH4, ainsi que lors de la dernire phase productrice du mthane. F430 (facteur) - Cofacteur structure porphyrinique modifie, contenant du nickel, intervenant dans la dernire tape de la mthanognse. Facteur de croissance - Compos organique ncessaire en faible quantit la croissance, parce quil est pour la cellule un composant essentiel quelle ne peut pas synthtiser par elle-mme. Cest souvent un coenzyme ou son prcurseur. Pour les organismes suprieurs, on utilise plus couramment le terme de vitamine. Facteur damorage - Appel aussi facteur sigma. Sassocie un promoteur sur lADN et lARN-polymrase, formant un complexe ternaire permettant lamorage de la transcription. ne pas confondre avec les activateurs de transcription, dont l'action est plus spcifique de certaines rgions de l'ADN et oprent de faon diffrente. Un facteur sigma se lie lARNpolymrase, permet l'association forme de reconnatre une portion dADN appele promoteur. L'ARN-polymrase peut alors former avec l'ADN un complexe "ferm". Le dmarrage de la transcription en aval se fait par un complexe "ouvert" impliquant la sparation locale des deux brins d'ADN, l'un d'eux servant de modle. Pour transcrire tous les gnes de son patrimoine, la cellule dispose de plusieurs facteurs sigma, chacun tant capable de reconnatre un type dtermin de promoteur et de commander la transcription d'une collection de gnes faisant partie d'un rgulon (Voir Rgulon). Cette situation a t bien rpertorie chez E. coli, avec au moins 7 sigmas diffrents. Le plus abondant est le sigma-70 (sD ou RpoD) qui assure les "fonctions de mnage", soit un millier de gnes. La squence du promoteur contient deux "botes" 35 et 10 spares par 17 pdb : TTGACAx17-TATAAT. Dautres facteurs commandent des rgulons spcialiss, et reconnaissent des promoteurs distincts. Le conservatisme de squence du sigma-70 et sa prsence universelle chez les eubactries en font maintenant un indicateur trs utilis pour la filiation volutive des espces, au mme titre que l'ARN16S. Le sigma-54 ou RpoN dirige une quinzaine de gnes du mtabolisme azot sur CTGGxA-x6-TTGCA (botes 24 et 12), le sigma-38 (S ou RpoS) concerne une centaine de gnes rglant l'entre en phase stationnaire, le sigma-32 (H ou RpoH) est celui du choc thermique (une quarantaine de gnes). Chaque facteur sigma correspond donc un rgulon et reconnat les promoteurs appartenant un consensus spcifique. Tous appartiennent un mme modle structural, o un domaine reconnat le promoteur sur l'ADN et un autre la liaison avec la sous-unit b de l'ARN-polymrase. Ce systme de reconnaissance spcifique n'est pas toujours suffisant, et peut ne lancer la transcription quavec lintervention supplmentaire dun activateur de transcription. Dans dautres cas au contraire, des protines jouant un rle rgulateur sassocient au sigma pour lempcher dagir (voir ECF). Les facteurs 70 et 38 (RpoD et RpoS) prsentent des similitudes structurales, reconnaissent en commun certains promoteurs et entrent en comptition dans certaines conditions. L'abondance et l'activit de ces facteurs est soumise des contrles in vivo : ARN 6S, surenroulement de l'ADN, protases spcifiques. FAD - Flavine-adnine-dinuclotide. Fenton (Raction de) - Engendre des radicaux hydroxyle partir de superoxyde et de peroxyde : O2 + H2O2 OH. + OH + O2. Catalyse par les ions ferreux. Les radicaux forms ragissent avec une grande quantit de substances, raison pour laquelle le fer est
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indirectement toxique lorsqu'il est l'tat libre. Chez les tres vivants le fer est presque toujours squestr. Fer - Le mtal de transition le plus abondant de la biosphre. Oscille entre les tats Fe(II) et Fe(III), intervient dans de nombreuses oxydorductions, dans le transport ou le stockage de O2 Protines hminiques : cytochromes, catalases, peroxydases, hmoglobines ; non hminiques : protines fer-soufre, oxydases, oxygnases. Les principaux ligands du fer dans les protines sont habituellement la cystine, laspartate, le glutamate, lhistidine et la tyrosine. Les minerais de fer sont la magntite (Fe3O4), l'hmatite (Fe2O3, la forme la plus abondante), la goethite (Fe2O3, H2O), la limonite (goethite avec oxydes hydrats), la sidrite (FeCO3), la pyrite (FeS2). Le fer de Lorraine exploit jusquen 1977 est une sidrite impure appele minette. Fermentation - Oxydation cellulaire d'un substrat organique o une formation d'ATP a lieu en phase soluble par couplage direct au niveau d'une ou plusieurs ractions, sans passer par la formation intermdiaire d'un potentiel lectrochimique membranaire. L'accepteur d'lectrons est le plus souvent un produit de dgradation du substrat, et chaque fermentation se caractrise par le rejet abondant d'un ou plusieurs produits incompltement transforms. Certaines fermentations ont lieu en prsence d'air (lactobacilles). Ferrdoxine - Petite protine renfermant un ou plusieurs noyaux fer-soufre, sans activit enzymatique, fonctionne comme transporteur d'lectrons entre d'autres protines qui ont elles-mmes des noyaux fer-soufre. Procaryotiques ou d'origine procaryotique (bactries, mitochondries, plastes), interviennent souvent en conditions trs rductrices, leur potentiel tant le plus souvent infrieur 250 mV. Souvent remplaables par des flavodoxines. Ferritine - Protine de stockage du fer, comportant 24 sous-units et renfermant 10003000 ions ferriques sous forme d'hydroxyde et de phosphate. Le fer entre ou sort de la protine sous forme de fer rduit. La ferritine a en mme temps les proprits d'une ferroxydase. Les ferritines bactriennes (bactrioferritines) peuvent renfermer galement une porphyrine (hme B). Ferrozine - 3-(2-pyridyl)-5,6-bis-(4-phnylsulfonique acide)-1,2,4-triazine pour dosage de Fe2+. Fer-soufre (noyaux ou centres) - Cofacteurs contenant part gale du fer et du soufre, facilement dtachable par traitement acide et dsign comme acido-labile. Contenus dans une gamme trs tendue de protines dites Fe/S, qui sont en majorit des transporteurs d'lectrons et des protines d'oxydorduction. Les plus simples sont les ferrdoxines. Dans les enzymes un ou plusieurs noyaux sont gnralement associs d'autres cofacteurs, flavines, porphyrines, cofacteurs molybdne, ventuellement des noyaux fer-soufre complexes comme dans les hydrognases et nitrognases. Les plus courants sont [4Fe-4S] et [2Fe-2S]. Attachs la protine par des liaisons entre le fer et des rsidus de cystine, parfois d'histidine (voir RIESKE). Des noyaux fer-soufre plus complexes existent dans les hydrognases, nitrognases, et CO dshydrognases. L'oxydorduction fait changer ordinairement l'tat du noyau de [ ]2+ [ ]+. Les atomes de fer ont une coordination peu prs ttradrique et sont l'tat haut-spin ; par suite du couplage le noyau est pratiquement silencieux la RPE, mais aprs addition d'un lectron, une distorsion cre des tats de spin de S = 1/2 et S = 3/2.
[2 Fe2 S]
[4 Fe4 S]
[3 Fe4 S]
La spectroscopie MSSBAUER est utlise aprs remplacement du fer par l'isotope fer-57, qui a un spin nuclaire. Le potentiel E' des [4Fe-4S] est habituellement entre 350 et 500 mV, fortement modul par la structure conformationnelle de la protine. Une quilibre entre [4Fe-4S]2+ et [4Fe-4S]3+ correspond un potentiel beaucoup plus lev de l'ordre de
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+ 350 mV, mais n'intervient que plus rarement. Le potentiel des [2Fe-2S] lis 4 rsidus de cystine est infrieur 250 mV, surtout dans les ferrdoxines de plantes lies la photosynthse. Dans les protines d'oxydorduction de type RIESKE, le noyau est li deux rsidus de cystine et deux d'histidine, le potentiel est plus lev, se rapproche de 150 mV. Les noyaux fer-soufre ont galement des fonctions ne relevant pas d'une oxydorduction : [4Fe-4S] comme site catalytique de l'aconitase, comme capteur de O2 dans FNR et SoxR, stabilisateur structural de l'endonuclase III de la rparation de l'ADN. Les noyaux fersoufre peuvent se former spontanment en prsence d'un taux suffisant de sulfure et de fer rduit et se sont trs probablement forms aux ges les plus anciens quand prvalaient les conditions trs rductrices. Fertilisants - Ils sont de deux sortes, minraux ou organiques. Les premiers contiennent une source dazote minral, du phosphate et K2O. On tend les dsigner par leur analyse lmentaire (NPK). Par exemple du 10.4.8 contient 8 g de llment potassium pour 100 g du total. Le nitrate dammonium est reprsent par 33.0.0 (pas de P ni K). On ajoute ceci dautres lments, comme de petites quantits de sulfate de fer, de magnsium Les fertilisants organiques sont apports par pandage du traditionnel fumier animal, de dchets de poisson, de compost ou de prparations permettant une libration progressive dazote sous laction des bactries (ure, formaldhyde/ure). FH4 - Voir Ttrahydrofolate. Fimbriae - Filaments souples distincts des flagelles la surface de nombreuses espces bactriennes, surtout des Gram-ngatives, contenant des protines appeles adhsines. Firmicute - Bactrie Gram-positive paisse couche de peptidoglycanes retenant le colorant de Gram. Bacillus, Clostridium, Streptomyces. FixL/FixJ - Systme rgulateur deux composants de Rhizobium et espces apparentes, dclenchant une cascade d'expression des gnes de l'assimilation de N2 en l'absence de O2. FixL est une protine hminique Fe(II) s'autophosphoryle sur histidine tat "on", cette activit tant bloque par interaction de O2 avec le fer. Flavines - Cofacteurs doxydorduction trs rpandus, les principaux tant FAD et FMN. La troisime principale flavine dans la nature est la riboflavine ou vitamine B2. Le potentiel E de FAD et FMN est de + 190 mV, fortement modifi par insertion dans la protine, souvent avec liaison covalente, de 490 mV + 19 mV. Lattachement covalent entre la protine et FAD contribue abaisser le potentiel. Les flavines peuvent fonctionner lectron par lectron ou par 2 lectrons la fois. Aprs rduction 2 lectrons de FAD, la forme rduite est FADH2 ou seulement la forme semiquinonique FADH, lautre lectron tant accept par un site voisin. Les enzymes flaviniques ont souvent plusieurs cofacteurs, avec fer-soufre, mtal Voir Dazaflavines, Dshydrognases, Flavocytochrome, Flavodoxines, Flavo-enzymes, Rductases. Flavocytochrome - Protine hminique doxydorduction (transporteur dlectrons ou enzyme) contenant une flavine qui est gnralement FAD. Lhme est le plus souvent li de faon covalente avec un cytochrome c. Flavodoxines - Petites protines contenant une flavine (FMN) fonctionnant comme transporteurs dlectrons interchangeables avec les ferrdoxines, qu'elles remplacent en cas de carence en Fe ou S. La forme radicalaire semiquinonique FMN0 est fortement lie par la protine, ce qui dplace son potentiel redox. E de FMN/FMNH0 = + 50 mV au lieu de 219 (FMN libre), FMNH0/FMNH2 = 495 mV au lieu de 219. Flavo-enzymes - Fonctionnent l'aide d'une flavine comme cofacteur, les plus importantes tant des oxygnases et des dshydrognases, lesquelles sont appeles oxydases quand elles utilisent O2 comme accepteur. Flavonodes - Pigments vgtaux solubles trs varis de nature phnolique. Ils comportent un noyau de base en C15 ou flavone, constitu de deux cycles benzniques A et B et d'un cycle pyrone soud A. Le noyau est gnralement hydroxyl, surtout en 3, 5, 7 et 3'. Les termes hydroxyls en 3 sont appels flavonols. Certains sont communs, comme le kaempferol (50% des angiospermes), la querctine, la cyanidine et la lutoline. Flavonodes et
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isoflavonodes diffrent par la position de la liaison entre A et B, et forment une gamme trs vaste de produits naturels o le noyau est li gnralement des glucides, le plus souvent en 3 et 7. Les animaux ne font pas de flavonodes, mais les flavones des ailes de certains papillons sont dorigine alimentaire. Tous ces produits drivent mtaboliquement de la phnylalanine comme tous les termes de la vaste famille des phnylpropanodes regroupant les coumarines, lignines, esters benzoques.
8 7 6 A 5 0 C O 2 3 2 3 B 6 5 O 4 A
O C
Noyaux flavone et isoflavone
Floc - Boues formes dans les stations d'puration par l'action de micro-organismes floculants ayant la proprit de s'agrger et d'entraner diverses matires organiques ou minrales (ammoniaques, phosphates) qui se dposent et se concentrent dans les bassins de dcantation avant rejet de l'eau traite. La formation du floc est inhrente au bon fonctionnement d'une station d'puration, et sa dcantation est une opration essentielle, parfois entrave par divers facteurs parasites comme la prolifration de micro-organismes filamenteux. FMN - Flavine-adnine-mononuclotide. FNR - Fumarate-nitrate-reduction. Protine rgulatrice contrlant lexpression des gnes lis la rduction du nitrate et du fumarate, reconnat la prsence ou labsence de O2 grce un noyau fer-soufre [4Fe-4S] dont l'tat d'oxydation dpend du potentiel redox du milieu. En absence de O2, FNR se lie sous forme de dimre aux promoteurs d'une bonne cinquantaine de gnes impliqus dans le mtabolisme anarobie et active leur transcription, en rprime d'autres. De faon gnrale, FNR est donc l'agent d'une rgulation globale ayant pour effet d'activer le mtabolisme anarobie au dtriment du mtabolisme arobie, est reprsentatif avec CRP d'une super-famille de rgulateurs de transcription trs rpandus chez de nombreuses espces et consacres des fonctions similaires. Exemples : FixK de Rhizobium et Bradyrhizobium, ANR de Pseudomonas aeruginosa, CysR (Synechococcus), NNR (Paracoccus denitrificans) Formes de rsistance - Diverses espces bactriennes ont la facult de former des cellules spcialises montrant une rsistance accrue des facteurs d'environnement dfavorables, notamment une temprature leve, l'absence d'lments nutritifs ou la dessiccation. Un vocabulaire particulier dsigne les diffrentes formes de bactries rsistantes qui sont rsumes par un tableau :
Endospores
Thermorsistance Cortex Ac. dipicolinique Nombre/cellule Exemples Forte Prsent Prsent 1 Bacillus Clostridium Desulfomaculm Sporosarcina Thermoactinomyces
Exospores
Modre non non 1-4 Methylosinus Rhodomicrobium
Cystes
non non non 1 Azotobacter Myxococcus Sporocytophaga
Conidies
non non non N (chane) Actinomyces Micromonospora Nocardia Streptomyces
Les cyanobactries font des acintes. Les champignons forment des chlamydospores, qui sont des spores trs rsistantes formes par la condensation du cytoplasme et de la paroi. Des structures plus complexes sont les pycnides ou organes de rsistance constitues par des agrgations mycliennes avec spores. Il n'y a pas de dmarcation nette entre spores de
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propagation et spores de rsistance, ces deux caractres se retrouvant dans celles des levures et de certains protozoaires. Formiate - HCOO . Mtabolite important du mtabolisme intermdiaire anarobie, notamment dans la dcarboxylation du pyruvate (produit conjointement lactyl-coenzyme A ou lactyl-phosphate). Le formiate est scind en CO2 + H2 par la formiate-hydrogne lyase, ou sert de donneur dlectrons par la raction de la formiate dshydrognase dans la rduction du nitrate et du nitrite. Le formiate est galement engendr par rduction de CO2 (actognes, mthanognes), donne lieu une cascade de rductions aprs formylation du FH4 ou du MPTH4, et intervient dans le cycle de WOOD. Formiate dshydrognase (FDH) - Catalyse : CO2 + 2e + 2H+ HCOOH. On trouve une FDH chez de nombreux organismes : plantes, levures, bactries arobies et anarobies, mthanognes. Il en existe plusieurs sortes selon quelles rduisent le CO2 en formiate, ou oxydent le formiate en CO2 (notamment chez les arobies). Slnium souvent prsent, apport par un acide amin modifi, la slnocystine. Le cofacteur est une bioptrine portant du molybdne ou parfois du tungstne. Les FDH appartiennent plusieurs catgories. La formiate-NADP+ oxydorductase (EC 1.2.1.43) rduit le CO2 par NADPH chez les actognes (Clostridium thermoaceticum), trs sensible O2, catalyse rversiblement une oxydorduction entre mthylviologne et NADPH. Les autres FDH sont des formiate-NAD+ oxydorductases (EC 1.2.1.2) ou des oxydorductases ragissant avec des cytochromes ou dautres accepteurs, comme le F420 (EC 1.2.2.1, EC 1.2.2.3). Les mthylotrophes oxydent HCOOH avec une assez grande varits de FDH solubles utilisant NAD+, les unes ayant une structure dhomodimre, dpourvues de cofacteur interne et rsistantes O2 (levures mthylotrophes), les autres ayant une structure plus complexe avec bioptrine, Mo ou W, centres fer-soufre et flavine. Ces dernires FDH sont trs sensibles O2. Les formiate dshydrognases oxydant le formiate en CO2 sont reprsentes chez E. coli par la FDH-N, dont le fonctionnement fournit des lectrons la nitrate rductase (NAR-A), et la FDH-H qui entre dans le complexe appel formiate-hydrogne lyase (voir Formiate-hydrogne lyase). FDH-H et NAR-A sont des protines membranaires complexes codes chacune par un opron (fdnGHI, narGHJI), et sont en mme temps des translocateurs de protons (conservation dnergie). Ce systme nest synthtis quen absence de O2. Il a pour rplique un second systme fonctionnant aussi en arobiose (FDH-Z et NAR-Z). La FDH-H est distincte, extrmement sensible O2, partiellement protge par le formiate. Elle contient une seule chane de 79 kDa dont la structure dtaille est connue. Elle renferme un noyau fer-soufre de type [4Fe4S] et le molybdne [Mo(IV) ou Mo(VI)] qui est li directement deux cofacteurs MGD et au slnium dun rsidu de slnocystine. Formiate-hydrogne lyase - Catalyse en anarobiose la raction de dcomposition du formiate, soit HCOOH CO2 + H2. Etudie en dtail chez Escherichia coli, forme un complexe de deux enzymes : une formiate dshydrognase ou FDH, la FDH-H, et une hydrognase, lhydrognase-3. Le formiate apparat par dcarboxylation du pyruvate en cours de fermentation, et sa dcomposition gnratrice de gaz intervient en milieu acide. En somme le formiate des fermentations anarobies engendre du CO2 de deux faons selon la FDH implique, soit comme source dhydrogne molculaire par la formiate-hydrogne lyase dont la FDH-H fait partie, soit comme donneur dlectrons par la FDH-N pour la rduction du nitrate. Formylmthanofurane - Cofacteur fonctionnant comme accepteur de formyle (CHO) dans la mthanognse partir de CO2 et H2. Fractionnement isotopique - Les isotopes d'un mme lment sont censs avoir les mmes proprits chimiques, mais la diffrence de masse engendre de petits carts dans la ractivit des molcules qui les hbergent. Ainsi la photosynthse actionne par la Rubisco et le cycle de CALVIN assimile un peu plus vite le [12C]CO2 que le [13C]CO2. Les matires organiques synthtises sont alors lgrement appauvries en carbone-13. L'cart est plus faible dans les plantes dites C4. Si le rapport R est le rapport 13C/12C dans un chantillon, et Ro ce rapport dans un standard, l'cart y est mesur par = 1000 (R R0)/R0. Un des carts les plus importants est li la synthse biologique du mthane, et le dsquilibre est lgrement accru par les mthanotrophes, qui oxydent un peu plus vite le [12C]-CH4 que le
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[13C]-CH4, avec comme rsultat un CO2 appauvri en carbone-13. L'cart est modifi de faon complexe par changes entre les diffrents rservoirs de carbone, l'atmosphre, les carbonates, les matires organiques Des fractionnements isotopiques sont galement enregistrs pour l'hydrogne, le soufre, l'azote et le fer. De faon gnrale, ils portent la signature d'une activit biologique. Frankia - Bactries appartenant au groupe des actinomyctales, formant des filaments pluricellulaires ou hyphes mycliens, ainsi que des vsicules et des spores. Saprophytes du sol, font une symbiose avec plus de 200 espces de plantes dicotyldones, parmi lesquelles figurent des arbres et arbustes tels que les filaos et les aulnes, sinstallent au niveau des racines qui subissent une transformation nodulaire en actinorhizes, et assimilent lazote, qui est transmis la plante principalement sous forme d'ammonium. Exemples de plantes colonises : Alnus, Casuarina, Allocasuarina , Eleagnus, Hippophae, Myrica, Ceanothus, Dryas. Dans les cellules nodulaires quelles infectent, les Frankia font des diffrenciations en hyphes, en sporanges producteurs de spores, et des vsicules o se trouve localise la nitrognase. Celle-ci produit de l'hydrogne, qui est oxyd par une hydrognase. Il y a scrtion par les filaments de diverses protines, notamment des enzymes d'hydrolyse de la cellulose. Les nodules de certaines plantes (Casuarina, Myrica) ont une quantit notable d'hmoglobine. Les Frankia contiennent un taux de superoxyde dismutase particulirement lev, rapprocher de la proprit des plantes de librer du superoxyde et du peroxyde en raction un tat de stress ou sous l'effet d'une infection. Fulviques (acides) - Composs organiques solubles de couleur jauntre ou brune, rcuprs dans le surnageant aprs prcipitation des acides humiques par un acide. G + C (Taux de) - La composition en guanine et cytosine d'une squence d'ADN rvle la proportion des paires G-C dans la double hlice par rapport aux paires A-T. Cette proportion affecte la stabilit locale de l'ADN et intervient dans plusieurs mcanismes biochimiques de reconnaissance ADN-protine. Elle tend tre constante tout au long du gnome, en relation avec l'usage prfrentiel des diffrents codons, lui-mme en rapport avec la composition en ARN de transfert de la cellule. Un taux de G + C localement diffrent est un indice d'origine externe. Fur (Protine) - Protine rgulatrice mise en vidence dans E. coli, agissant en prsence de Fe2+ comme rpresseur des gnes codant pour les transporteurs du fer. Gaacol - o-Mthoxyphnol. Gallique (Acide) - Acide 3,4,5-trihydroxybenzoque. Gne - Unit lmentaire du matriel gntique, spcifiant la synthse d'un polypeptide dtermin ou d'un ARN spcifique (ARN de transfert, ARN des ribosomes, ARN viral, ARN messager). Gne rapporteur - Pour voir si un gne s'exprime, on ralise artificiellement une fusion de celui-ci avec un gne rapporteur dont l'expression se fera dans la foule et sera dtecte par un test simple. On utilise souvent lacZ, le gne de la bta-galactosidase de E. coli comme gnes rapporteur. On peut dtecter aussi le fonctionnement d'un promoteur en soudant en aval le gne rapporteur, observer galement la production de protines rgulatrices, difficiles tester par une mthode simple, et gnralement produites en faible quantit. Gnome - L'ensemble des gnes d'un organisme. Gnomique - Analyse des gnomes par cartographie, squenage, comparaisons volutives et identification des gnes lis au phnotype. Gentisique (Acide) - Acide 2,5-dihydroxybenzoque. GFP - Green fluorescent protein. Produit fluorescent de la mduse Aequoria victoria. Protine fluorescente trs stable, de 238 acides amins, dont la structure dtaille en forme de cylindre est connue. Elle fluorescence vers 508 nm, et fonctionne in vivo par la lumire mise par l'aequorine. La GFP est couramment utilise comme marqueur d'autres protines pour les rendre fluorescentes. Son gne est utilis aussi comme rapporteur : recombin avec un autre gne dont on veut observer l'expression in vivo, il donne des renseignements sur les mcanismes rgulateurs au niveau gntique. Cette technologie connat de multiples
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applications. Recombin un gne de rsistance aux herbicides dans les plantes transgniques, il peut servir surveiller la dissmination ventuelle dans l'environnement des gnes artificiellement introduits. Une application caractre spectaculaire a consist rendre fluorescent un lapin albinos (Eduardo Kac) nomm Alba, prsent comme une fantaisie caractre artistique. Glissement - Mode de dplacement sans flagelles sur une surface. Trs rpandu chez les procaryotes, notamment les Gram-ngatifs, les cyanobactries, les espces colonisant les rhizosphres et les bactries prdatrices (Myxococcus). Glucanes - Polymres du glucose, linaires ou ramifis ; cellulose, amidon, dextrane Glutamate dshydrognase - Catalyse la raction : Oxoglutarate + NH3 + NAD(P)H, H+ glutamate + NAD(P)+ + H2O Le 2-oxoglutarate est un compos intermdiaire du cycle de KREBS , et la raction, dont le sens thermodynamique favorable est vers la droite, participe lentre de lammonium dans le mtabolisme chez les vgtaux, les champignons et les bactries (chez les animaux, la principale source dazote est constitue par les protines et les acides amins de lalimentation). Glutamate synthase - Absente dans le rgne animal, catalyse la raction : 2 Glutamate + NADP+ Glutamine + 2-oxoglutarate + NAD(P)H, H+ Lenzyme est appele galement Glutamine-2-oxoglutarate aminotransfrase (GOGAT). Glutamine synthtase - Catalyse la raction : Glutamate + NH3 + ATP Glutamine + ADP + phosphate Le glutamate est lui-mme un lieu d'entre de l'azote ammoniacal dans le mtabolisme, partir du 2-oxoglutarate. La formation de la glutamine est un second point dentre privilgi dans le mtabolisme de lammonium, favoris quand celui-ci est peu abondant. La raction est essentiellement irrversible et engendre un produit (la glutamine) qui sera son tour un donneur dazote pour de nombreuses synthses cellulaires (carbamyl-phosphate, arginine, cytosine, bases puriques, glycine, histidine, osamines, tryptophane...). Chez les bactries lenzyme est rgule allostriquement de faon complexe par intgration de multiples signaux, ainsi que par induction et rpression. Glutardoxine - Protine d'oxydorduction similaire la thiordoxine et fonctionnant sur le mme principe. Glutathion - L- -glutamyl-L-cystinyl-glycine (GSH), ubiquiste, le thiol faible masse molculaire le plus abondant. Il ragit dans deux directions principales. 1. Il participe des oxydorductions, car 2 molcules se lient par oxydation de leur thiol, pour former GSSG (formation dun pont disulfure). Cette oxydation peut se raliser notamment par la glutathion peroxydase laide de H2O2 ; le GSSG est rduit nouveau par une rductase NADPH. 2. Dans une deuxime srie de ractions, le glutathion forme des conjugus : il fonctionne comme cofacteur de diverses enzymes, par exemple les glutathion S-transfrases : le glutathion rduit, GSH, exerce une attaque nuclophile sur diffrents accepteurs, un type de raction extrmement important chez les organismes suprieurs pour llimination dagents toxiques comme les produits mutagnes. Le modle est : RX + GSH HX + RSG, o R peut tre un radical aliphatique, aromatique ou htrocyclique, X tant le sulfate, le nitrite, lhalognure, un poxyde ou autre. Les glutathion S-transfrases ont t tudies surtout chez les mammifres, et ont aussi la proprit de faire des isomrisations, comme celle de la malylactone en fumarylactone. Les conjugus forms entre le glutathion par son thiol et un compos tranger (Glu-Cys-Gly)R peut tre scind par une -glutamyltranspeptidase, qui enlve le glutamate et cre le conjugu (Cys-Gly)R. Une hydrolyse par carboxypeptidase forme le conjugu (Cys)R, qui est mtabolis. Ce processus s'observe dans certaines biodgradations.
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H H HOOC CH CH2 CH2 C N CH C N CH2 COOH NH2 O Glu CH2 O SH Cys Gly
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Glutathion (GSH)
Glycocalyx - Polysaccharides fibreux extracellulaires contribuant l'adhsion des bactries la surface d'un support, parfois trs abondants et formant une sorte de capsule autour des cellules. Glycolyse - Terme gnralement utilis pour dsigner l'oxydation du glucose en pyruvate par la voie de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Pour mmoire : glucose glucose-6-phosphate fructose-6-phosphate fructose-1,6-diphosphate triose-phosphate (DHAP + 3-phospho-glycraldhyde) 3-phosphoglycrate 2-phospho-glycrate phosphonol-pyruvate (PEP) pyruvate. Glyoxylate (cycle du) - Mtabolisme prsent chez les plantes, les champignons et les bactries, inexistant chez les animaux. Les tapes essentielles ; scission de l'isocitrate (isocitrate lyase) en glyoxylate OHC-COO et succinate (court-circuit du cycle de KREBS entre isocitrate et succinate). Le glyoxylate et l'actyl-CoA forment le malate (par la malate synthase), le malate conduit l'oxaloactate, qui redonne le citrate par une deuxime molcule d'actyl-CoA. Retour au cycle de KREBS, l'isocitrate. Le cycle du glyoxylate permet une rcupration efficace de l'actyle, intervient aussi dans la photorespiration. Glyoxysomes - Voir Peroxysomes. Golgi - Rseau de vsicules membranaires des cellules d'eucaryotes, formant un compartiment extracytoplasmique en communication fonctionnelle avec le rticulum endoplasmique mais non associ directement aux ribosomes. Le systme de GOLGI intervient dans la maturation et le glycosylation des protines qui transitent par lui, soit pour tre exportes l'extrieur de la cellule par exocytose, soit pour gagner d'autres compartiments cellulaires comme les lysosomes. Gram (coloration de) - Coloration par le violet cristal permettant de distinguer deux grands groupes d'eubactries en fonction de la structure de leur paroi. Les Gram-positifs fixent le colorant et le conservent aprs un court lavage par l'thanol ou l'actone, alors que les Gram-ngatifs sont dcolors par ce lavage. Gram-positives - Bactries pourvues d'une paisse couche de peptidoglycane entourant une membrane simple (pas de membrane externe et de priplasme), trs rpandues dans l'environnement. La composition en G + C est un critre taxonomique. Les formes G + C lv sont les actinomyctes (voir rubrique correspondante). Les formes G + C faible se distinguent par leur morphologie (coques comme Staphylococcus, ou btonnets comme Bacillus), leur caractre arobie (strict ou facultatif) comme Bacillus, ou anarobie strict (Clostridium), et leur facult de former ou non des endospores. Autres genres importants : Enterococcus, Lactobacillus, Spiroplasma, Streptococcus, Listeria. On rattache les mycoplasmes ce groupe. GSH - Glutathion. Gyrase - Protine ncessaire la rplication de l'ADN, en compense les supertours que celle-ci gnre. Introduit des supertours ngatifs dans l'ADN et fait partie des topoisomrases II. Habitat - Tranche d'espace, parfois microscopique (micro-habitat) o se rencontrent des conditions peu prs uniformes favorables la multiplication d'une ou de plusieurs espces. Il y a parfois confusion avec niche cologique. Celle-ci se rapporte moins au milieu de croissance qu'aux proprits de ses habitants. Par exemple une espce peut occuper une niche cologique caractrise par l'assimilation de l'azote, mais peut se dvelopper dans plusieurs habitats distincts o prolifrent en mme temps d'autres formes vivantes. Halidohydrolase - Remplace un halogne par un hydroxyle dans un substrat organique.
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Halognes - Fluor, chlore, brome, iode. Le rayon de VAN DER WAALS et le caractre polarisable de la liaison carbone-halogne compare CH crot dans le sens I > Br > Cl > F > H. Lnergie de dissociation et la polarit de la liaison carbone-halogne varient en sens inverse. La liaison C-F est la plus forte des liaisons simples quun carbone peut contracter, latome de fluor est peine plus gros quun atome dH. Linteraction de rsonance entre les paires dlectrons de lhalogne avec le noyau aromatique augmente la densit lectronique en ortho et p a r a, et oriente en consquence les substitutions lectrophiles. Ainsi F est souvent un activateur dune telle substitution, mais sa liaison avec le cycle aromatique est particulirement stable et ses proprits se dmarquent de celles des autres halognes. Le fluor est un marqueur commode en RMN du fluor-19. Haloperoxydases - Peroxydases catalysant l'oxydation d'un ion halognure avec H2O2, conduisant la synthse de composs halogns naturels, comme certains antibiotiques (chloramphnical, auromycine). Trouves chez les bactries, les champignons, les algues, les invertbrs, les mammifres. Les chloroperoxydases oxydent le chlorure, le bromure et l'iodure, les bromoperoxydases oxydent les deux derniers. La chloroperoxydase de Caldariomyces fumago est une protine hminique. Diverses haloperoxydases sont des enzymes vanadium, la plus tudie tant celle de l'algue Ascophyllum nodosum. Halons - Drivs perhalogns du mthane, tels que CBrF3, CBr2ClF. Halophile - Organisme capable de se dvelopper une concentration leve en sel, soit parce quil est tolrant au sel, soit parce que le sol forte concentration lui est ncessaire. On peut distinguer les halophiles modrs, croissant dans le NaCl 3-15%, les halophiles intermdiaires (dans NaCl 9-24%), et les halophiles extrmes (NaCl de 18 35%). La concentration en sel de l'eau de mer est environ de 3,5%, celle de la Mer Morte peu prs dix fois plus leve. Les halophiles extrmes sont des archaebactries comme Halobium salinarum, sauf rares exceptions comme lalgue Dunaniella salina. HAMMET (constante de) - Constante note , qui caractrise les substituants du cycle aromatique en fonction de leur nature, et faisant partie de la fonction de HAMMET. Cette fonction sefforce de formuler une prdiction quantitative sur le changement de ractivit apport par le substituant en mta ou para du cycle en fonction du type de raction (les effets en ortho sont plus compliqus). On peut se rfrer par exemple l'quilibre d'ionisation dissociation de l'acide benzoque C6H5COOH. La constante d'un substituant sur le cycle est dfinie par la fonction log(K/Ko) = , o est gal 1 pour l'acide benzoque (dpend du compos aromatique), Ko la constante d'quilibre pour l'acide benzoque non substitu, K cette constante aprs substitution. La constante de HAMMETT dpend donc du substituant (effet inductif, rsonance), et sa dtermination provient de mesures exprimentales de constantes dquilibre ou de vitesses ractionnelles (voir MARCH J, Advanced Organic Chemistry : Reactions, Mechanisms, and Structure, McGraw-Hill). Une valeur positive de dnote un substituant attracteur d'lectrons (facilite l'ionisation de l'acide benzoque), une valeur ngative indique un groupe donneur. Exemples de substituants attracteurs : Cl, Br, I, COOH, CN, NO2, CN, NH3+. Exemples de substituants donneurs : NH2, OH, OCH3, CH3. La valeur de s n'est pas la mme en mta et en para, surtout pour les valeurs positives (et OH en particulier). Des complications naissent dans le cas de plusieurs substituants, ou lorsqu'un substituant prsente une rsonance lectronique avec le noyau. De nouvelles constantes de HAMMETT modifies sont notes + et . La modification est classique en particulier pour les halognes avec leurs effets contradictoires. Tout en tant attracteurs (affaiblissent la charge lectronique du noyau), ils sont l'objet d'une rsonance (msomrie) qui tend faire apparatre une charge ngative sur le cycle. HAP - Hydrocarbures aromatiques polycycliques. Le naphtalne est le premier terme. Prsents dans les huiles et carburants, contaminants des produits de combustion par les moteurs. Haut potentiel (de transfert) - Une raction de type AX + B A + BX, o un groupe X est transport d'un donneur un accepteur, s'effectue favorablement de gauche droite si la variation d'enthalpie libre G est ngative. Le potentiel de transfert est cette variation d'nergie quand B est un accepteur de rfrence, gnralement H2O (nergie libre par
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hydrolyse pure et simple dans l'eau). Le potentiel de transfert est d'autant plus lev que la valeur absolue de G est plus grande (quivaut une forte tendance de AX se dbarrasser de X). Dans les conditions standards, on dfinit un potentiel de transfert standard. Quand une chane de transporteurs se repassent le groupe X, servant alternativement d'accepteur et de donneur, le groupe X "s'coule" dans le sens des potentiels dcroissants. HCFC - Hydrochloro-fluorocarbones utiliss en remplacement des CFC. Hlicase - Enzyme catalysant la sparation des deux brins dADN en utilisant lATP comme source dnergie. Hme - Dsigne lorigine la ferroporphyrine situe au nombre de 4 dans lhmoglobine. Cest la protoporphyrine IX contenant Fe2+, soit lhme B des cytochromes b. Loxydation du fer en Fe3+ conduit lhmine. Pour simplifier dans lusage courant, on dsigne par hme une porphyrine contenant du fer sans prciser ltat doxydation qui varie dans les cytochromes, et on prcise sa catgorie par une lettre majuscule. Les diffrentes sortes dhmes (hme A, hme B, hme D1) se distinguent par les chanes latrales de la porphyrine et dans certains cas le noyau de celui-ci (voir aussi Sirohme). Un hme C est attach par des liens covalents sur un motif caractristique de la protine. Les cytochromes sont dsigns par des lettres minuscules. Exemple : un cytochrome b renferme de lhme B, un cytochrome cd1 renferme un hme C et un hme D1 ; un cytochrome aa3 contient deux hmes A qui se distinguent par leurs proprits. Le spectre caractristique et les proprits doxydorduction des hmes dans les protines hminiques sont modules par lenvironnement molculaire. Le fer dans un noyau hme est hexacoordonn selon une gomtrie octadrique (ventuellement dforme), ou pentacoordonn. Dans ce cas la sixime position peut-tre complte par une molcule deau, de O2, CO, NO, notamment dans les protines ayant une action enzymatique ou fonctionnant comme transporteur terminal dune chane doxydorductions. Les modifications au niveau de lhme peuvent tre suivies par RPE et spectre dabsorption. Voir Porphyrines. Hmicelluloses - Polysaccharides htrognes des parois vgtales, constitus notamment de xylanes, arabinoxylanes, mannanes, galactomannanes, glucomannanes, arabinogalactanes II, -1,3-glucanes et -1,3--1,4-glucanes. Ces polymres sont interconnects entre eux, ainsi qu'avec des microfibrilles de cellulose et de pectines. Le terme d'hmicellulose dsigne parfois empiriquement les constituants qui sont facilement solubiliss par la soude dilue aprs enlvement de la lignine. Voir Parois vgtales. Hminique (Protine) - Protine caractrise par la prsence d'au moins une porphyrine dans laquelle est loge du Fe(II) ou du Fe(III). Hmolysine - Toxine protique provoquant la lyse des hmaties, favorise la dissmination de lagent pathogne en lui apportant une source de fer. Htrocystes - Cellules intercales dans les chanes de cellules cyanobactriennes, diffrencies par un bouleversement important de lexpression des gnes en faveur de lassimilation de N2 : enveloppe spciale, induction de la nitrognase, mise en veilleuse ou suppression du PS2 (vite la production d'O2), modifications du mtabolisme intermdiaire Homoactogne - Actogne dont l'activit anarobie ne produit que de l'acide actique. HPr (protine) - Protine cytoplasmique de faible masse, oscillant entre ltat phosphoryl et non phosphoryl. La forme phosphoryle sur rsidu dhistidine (HPr-P) a un haut potentiel de transfert de phosphate et sert de donneur dans plusieurs systmes, dont la phosphotransfrase, le contrle de la synthse de lAMP cyclique, et les permases. C'est donc un intermdiaire dans une cascade rgulatrice, analogue aux systmes deux composants mais en plus compliqu, agissant sur une cible protique phosphorylable. HQNO - 2-Heptyl-4-hydroxyquinoline N-oxyde, inhibiteur respiratoire comme analogue des ubiquinones, bloque la rduction de celles-ci. Hsp - Heat Chock protein ou protine du choc thermique chez les bactries. Exemples : Hsp-60, Hsp-70, Hsp-90. Le chiffre qui les caractrise est leur masse molculaire approximative en kDa.
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HU - Petite protine basique, lie non spcifiquement l'ADN (petit sillon), jouant un rle dans l'emballage interne de l'ADN bactrien et formant des zones compactes ou "nuclodes" (FRIEDMAN DI (1988) Cell 55 : 545-554). Humiques (acides) - Matriel organique mal dfini, riche en cycles aromatiques et de couleur bruntre, extrait partir du sol par diffrents ractifs (et notamment par la soude dilue), et prcipitable en milieu acide (pH 1-2). Voir AHDS, Humus. Humus - Ensemble des matires organiques du sol transformes par voie biologique l'exclusion des cellules vivantes, des composs animaux ou vgtaux non dgrads ou incompltement dgrads (appartenant aux zones superficielles appeles litires). Chimiquement, lhumus renferme des units alkyles et aromatiques pontes par des atomes doxygne et des groupes azots, portant des groupes fonctionnels, dont les principaux sont des carboxyles, hydroxyles, carbonyles, units phnoliques et quinoniques. Lhumus est donc la fois hydrophile et hydrophobe, joue un rle important dans le transport des mtaux et des hydrocarbures dans lenvironnement. Lhumus contracte des associations troites par cations interposs avec les constituants minraux du sol comme les argiles. Aprs extraction par la soude dilue ou le pyrophosphate 0,1 M, on distingue trois fractions de base en fonction de leur solubilit : les humines insolubles (rsidu aprs extraction), les acides humiques insolubles pH < 2 (prcipitables l'acide), et les acides fulviques solubles tous les pH. L'humus dans son ensemble correspond une partie rsiduelle plus ou moins rcalcitrante aprs l'attaque microbienne des matires vgtales, polyphnolique et quinonique, progressivement oxyde et polymrise de faon anarchique. La filiation volutive est : acides fulviques acides humiques humine. Elle saccompagne dune polymrisation accrue et dun ensemble de transformations qui dpend de la nature du couvert vgtal et du climat. L'humus du sol se caractrise par une dure de vie trs longue, qui est de plusieurs annes, voire de plusieurs sicles. Dans les sols biologiquement les plus actifs, l'humine se lie aux argiles, intervient dans les proprits absorbantes du sol, le gonflement, l'change d'ions et la texture gnrale en agrgats. Les sols moins actifs au contraire, o l'volution est moins pousse, ont moins d'agrgats, davantage de produits peu polymriss et acides qui complexent facilement les mtaux, et sont corrosifs sur les roches dont l'altration est acclre. Les spcialistes des sols distinguent plusieurs catgories et niveaux d'humus en fonction du climat, de la couverture vgtale, de la roche environnante et du taux d'aration. La tourbe est un humus particulier plus ou moins acide, engendr en milieu non ar. Voir Tourbe. Hybridation (entre acides nucliques) - Association par ponts hydrogne entre les bases de deux chanes nucliques monocatnaires, comportant une complmentarit de squence. L'hybridation peut se faire entre ADN et ADN, ADN et ARN, ARN et ARN. Dans les conditions opratoires, l'hybridation avec un ADN s'obtient aprs dnaturation de celui-ci en brins spars, et peut se raliser entre squences imparfaitement complmentaires. L'hybridation entre ADN et sondes (court polydsoxyribonuclotides de synthse) essentielle dans la recherche des gnes et la mthode d'amplification dite PCR. Hydratase - Enzyme catalysant laddition dune molcule deau sur la liaison insature. Hydrate de mthane - Matire gristre et poreuse, forme sous pression partir de mthane et deau, et formant des accumulations considrables dans les sdiments ocaniques profonds. Instable sous pression atmosphrique, laisse chapper du mthane raison de 160 cm3 de gaz environ par cm3. Source potentielle d'nergie quand les problmes pratiques lis son exploitation auront t rsolus. Hydrognase - Catalyse la raction : H2 + 2e 2H+. L'accepteur ou le donneur d'lectrons est gnralement une ferrdoxine. Toutes les hydrognases stricto sensu contiennent des centres fer-soufre, sauf exceptions rencontres parmi les mthanognes. Elles fonctionnent en consommant de lhydrogne (uptake hydrogenases), ou en le produisant. Proprits caractristiques : coupure htrolytique de lhydrogne molculaire en un proton et un + hydrure, catalyser un change H2/H , rduire avec H2 des colorants bas potentiel (violognes), tre sensible O2. Dans le premier cas, l'change est mesurable en prsence de gaz deuterium (D2) par la formation de HD. Le rapport H2/HD dpend des hydrognases
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en fonction de leur effet isotopique (choix de H par rapport D). Dans le second cas, on peut mesurer la production de H2 ( l'abri de l'oxygne) avec le mthylviologne rduit, ou sa consommation par le mme colorant oxyd. Les hydrognases consommant H2 dans le priplasme ou sur la face externe de la membrane cytoplasmique, contribuent former le potentiel membranaire en librant des protons et participent ainsi la conservation de lnergie cellulaire. Les hydrognases dites [Fe] sont trs sensibles O2, ont deux atomes de fer leur site actif lis par des ligands inhabituels tels que CO et CN, des centres [4Fe4S] et produisent H2 dans les fermentations. Les hydrognases consommatrices de H2 ou uptake hydrogenases, [Ni-Fe], renferment une chane intramolculaire de noyaux [4Fe-4S] et un centre bi-mtallique contenant du nickel et du fer, reli aussi parfois CO et CN. Certaines d'entre elles, [Ni-Fe-Se], renferment aussi du slnium dans la slnocystine. Rpandues dans les eubactries (sulfato-rductrices, phototrophes) et les archaebactries. Depuis quelques annes, les connaissances sur les hydrognases ont rapidement progress. Une revue trs complte consulter est celle de VIGNAIS PM & COLBEAU A (2004) Curr. Issues Mol. Biol. vol.6, qui tait en cours de parution au moment o ce livre tait chez lditeur. Hydrognosomes - Organites intracellulaires denviron 1 m, productrices de H2 laide dune hydrognase. Leur morphologie rappelle les mitochondries. On les trouve dans des protozoaires (des trichomonades, certains cilis) et des champignons adapts la vie anarobie. Dans le cili Nyctotherus ovalis vivant dans le milieu quasi anarobie du tube digestif de blattes, on observe associs des mthanognes endosymbiotiques de nombreux hydrognosomes qui ont conserv des caractres mitochondriaux et un gnome rsiduel (AKHMANOVA et coll. (1998) Nature 396 : 527-528). Une hydrognase est code par lADN nuclaire. Dans d'autres cas, les hydrognosomes sont entirement dpourvus d'ADN. Les divisions se font de faon autonome, sous le contrle de gnes qui sont tous dans le noyau. Origine problmatique. Hydrognosulfite rductase - Voir Sulfite rductase. Lion HSO3 prdomine sur SO32 en milieu aqueux pH neutre. Hydrognotrophe - Organisme utilisant loxydation de H2 comme source dnergie. Hydrolase - Enzyme catalysant une hydrolyse, commande par le caractre nuclophile de l'ion hydroxyle OH, et conduisant la rupture d'une liaison. Hydroxylamine oxydorductase - (EC 1.7.3.4) ou hydroxylamine oxydase, fait partie de la nitrification. Catalyse loxydation 4 lectrons de lhydroxylamine en nitrite. NH2OH + O2 NO2 + H2O + H+. Chez Nitrosomonas europaea, protine trimrique contenant 7 hmes c et un hme P460 (hme c li la protine par un lien covalent supplmentaire, ne pas confondre avec lhme dun cytochrome P450). Le P460 rduit peut lier O2, CO ou H2O2. La structure de lenzyme a t dtermine par rayons X. Une enzyme similaire existe chez un mthylotrophe (Methylococcus capsulatus). Hydroxylation - Apport d'un hydroxyle sur un accepteur organique. C'est le plus souvent le rsultat d'une oxygnation, l'atome d'oxygne provenant de O2. Elle survient galement par addition d'une molcule d'eau du solvant sur une double liaison. La raction est alors dsigne comme une hydratation, catalyse par une hydratase. Diagnostic exprimental par oxygne-18. Hyperthermophile - Thermophile extrme : micro-organisme dont la temprature optimale de croissance est au-dessus de 80C. Les bactries hyperthermophiles sont gnralement des archaebactries appartenant 3 groupes, les mthanognes (Methanopyrus, Methanococcus, Methanothermus), des sulfato-rducteurs comme Archaeglobus, des soufredpendants ou sulfothermophiles (Pyrodictium, Thermococcus, Pyrococcus). La plupart ont besoin de la rduction du soufre lmentaire en H2S pour crotre. Tous contiennent une gyrase inverse, qui induit des super-tours positifs dans lADN et accrot sa rsistance la dnaturation. Autres modifications : composition de la membrane, certaines proprits au niveau de la transcription des gnes, thermostabilit accrue des enzymes consolides par des zones hydrophobes, importance de protines stabilisatrices (chaperons molculaires). L'optimum de Pyrococcus furiosus est de 100C avec un temps de doublement d'une demi-
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heure, est htrotrophe, crot jusqu' 103C et rsiste 110C. Les hyperthermophiles sont souvent des barophiles, et une augmentation de pression peut augmenter leur optimum de croissance de plusieurs degrs. On trouve aussi des hyperthermophiles en biotope terrestre chaud et acide prs des solfatares (pH 1-3), ou alcalin prs des geysers et sources alcalines. On a caractris dans plusieurs espces des tungsto-enzymes (voir Tungstne). Hyphes - Filaments tubulaires et souvent ramifis formant le corps vgtatif de nombreux champignons. Les bactries du groupe des Actinomyctes laborent des filaments daspect similaire. Hyphomicrobium - Voir Prosthque. IHF - Integration Host Factor. Protine trouve l'origine comme ncessaire l'intgration du propage Lambda dans le gnome du colibacille. Sa fonction serait double, en participant avec HU l'enroulement compact de l'ADN dans la bactrie (nuclode), en contribuant spcifiquement au contrle de la transcription de divers gnes. L'IHF se lie l'ADN sur une squence consensus spcifique en y imposant une forte courbure de l'ordre de 140. C'est un htrodimre faisant partie de la mme famille que HU (voir HU) et fait partie d'une famille souvent dsigne comme histone-like proteins. Chez les Gram-ngatifs, IHF participe la rgulation de gnes varis, en particulier ceux du mtabolisme azots commands par le facteur d'amorage sigma-54, de la synthse d'alginate chez Pseudomonas aeruginosa, de la synthse des flagelles chez Caulobacter, de la voie haute de dgradation du tolune dans la plasmide TOL de Ps. putida. Voir CALB R et coll. (1996) J. Bacteriol. 178 : 63196326. lots de pathogncit - Voir Pais. Incompatibilit (plasmides) - Il y a incompatibilit entre deux plasmides quand ils ne peuvent coexister de faon stable dans le mme hte, parce que leur rplication obit au mme systme de contrle. Les plasmides peuvent donc tre classs en fonction du systme Inc. Inducteur - Compos dont la prsence dans la cellule dclenche le phnomne d'induction. Inducteur gratuit - Inducteur non transform par les protines synthtises aprs induction. Induction - Mcanisme rgulateur se traduisant par l'acclration de la transcription en ARN messager d'un ou plusieurs gnes sous l'effet d'un inducteur, qui est reconnu par un rpresseur li spcifiquement l'ADN en un site oprateur (voir Rpresseur, Rpression). Inhibiteur comptitif - Compos non transform par une enzyme mais capable de prendre la place du substrat dans son site catalytique. Pour tre reconnu par le site, l'inhibiteur prsente donc une certaine ressemblance chimique ou structurale avec le substrat normal. Comme le substrat et l'inhibiteur s'excluent mutuellement sur la protine, il en rsulte une comptition qui ralentit la raction. Ce ralentissement est faible ou quasi nul si le substrat est en grand excs sur l'inhibiteur, mais l'efficacit de celui-ci dpend de la constante de dissociation Ki du complexe enzyme-inhibiteur. Une constante Ki faible correspond une forte affinit de la protine pour l'inhibiteur et une plus grande sensibilit celui-ci. Dans le cas particulier des analogues de l'tat de transition, la structure de l'inhibiteur imite un tat de transition plutt que le substrat intact. Un analogue de l'tat de transition est gnralement reconnu avec une affinit trs forte et exerce une inhibition trs efficace. Inhibiteur suicide - Expression dsignant couramment un inhibiteur de type comptitif (reconnu par site spcifique) contractant une liaison covalente caractre dfinitif avec la protine et conduisant son inactivation permanente. Inipol EAP22 - Micro-mulsion lipophile contenant de lure dissoute dans une saumure et encapsule dans de lacide olique et du lauryl-phosphate. Produit dvelopp par ElfAquitaine et expriment aprs le naufrage de lAmoco Cadiz. Insertion - Mutation gntique lie l'introduction d'un ou plusieurs nuclotides dans la squence d'ADN. Insertion (squences d') - Les squences d'insertion (IS) sont des lments transposables prsents chez les eucaryotes et les procaryotes, segments d'ADN capables de s'insrer ou de s'exciser en des points spcifiques du gnome. Chez les bactries Gram-ngatives, les IS
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ont une longueur de 0,7 1,5 kb. E. coli en contient d'assez nombreux appartenant une dizaine de types diffrents. Cette situation est apparemment trs commune. Les IS sont responsables d'une certaine variabilit des souches, modifient leurs proprits en apportant parfois des promoteurs supplmentaires ou de nouveaux sites de rgulation qui ont pour effet de changer le taux d'expression des gnes en fonction des conditions physiologiques, ou mme de les inactiver. Interactions - Liaison non covalente tendant empiler deux cycles aromatiques l'un sur l'autre, par transfert de charge. Revient pour les deux cycles changer un lectron dans un sens ou dans l'autre (voir Aromatique). Deux cycles aromatiques trs voisins tendent donc se disposer paralllement l'un l'autre comme deux assiettes. Ce facteur structural est important en environnement apolaire, dans les membranes ou dans l'organisation des protines, entre certains acides amins (phnylalanine, tyrosine, tryptophane) et divers cofacteurs ayant des cycles aromatiques. Intgrase - Protine contribuant l'intgration d'un ADN dans un autre la faveur d'une recombinaison, laquelle est en gnral spcifique du site. Exemples : intgrase du virus Lambda catalysant l'intgration de l'ADN dans le gnome bactrien sous forme de prophage, intgrase lie au fonctionnement d'un intgron. Intgron - Structure gntique de base comportant le gne d'une intgrase, une squence de 59 bp autorisant des recombinaisons et un promoteur. On suppose que cette structure a t l'origine d'une famille de transposons de diffrentes tailles (Tn21), par intgrations successives de segments supplmentaires (ou cassettes) porteurs de facteurs de rsistance. Intron - squence intercalaire non codante dans un gne discontinu, transcrite en ARN mais limine par pissage au cours de l'laboration de l'ARN messager dfinitif (vgtaux, levures, animaux, certaines archaebactries). IR - Inverted repeats ou rptitions inverses. Petites squences se trouvant aux extrmits d'un lment d'insertion (IS). On distingue les IR gauche et droite : IRL et IRR. IRMS - Isotope Ratio Mass Spectrometer. Spectromtrie de masse destine valuer les rapports isotopiques d'lments lgers (H, C, N, O, S) dans des molcules gazeuses : H2, CO2, CH4, N2, SO2). La mthode comporte l'injection du mlange gazeux, la conversion en ions des molcules injectes par un bombardement ionique, leur acclration et focalisation par un champ lectrique, une sparation en fonction de leur masse dans un champ magntique, un dtecteur pour dterminer l'intensit des diffrents faisceaux ioniques aprs sparation. IS - Squence d'insertion. Voir Insertion (squences d'), Transposon. Iso-enzymes - Lorsque deux enzymes labores par un mme organismes catalysent la mme raction mais sont sparables exprimentalement par lectrophorse ou chromatographie, on dit que ce sont des iso-enzymes. Il existe une varit de situations. Voici les trois principales : Les enzymes sont codes par des gnes distincts, mais conservent une parent structurale gnralement importante qui traduit une origine volutive commune. Les enzymes sont codes par le mme gne, mais certaines molcules dARN messager ont perdu un segment (intron) qui est conserv dans dautres : les polypeptides forms aprs traduction nont pas tous la mme longueur (pissage diffrentiel de lARN). Les enzymes sont codes par le mme gne, mais certains polypeptides sont soumis des modifications secondaires (actylation, oxydation, phosphorylation, rupture hydrolytique en certain(s) point(s) de la chane), ce qui a pour effet de crer des molcules qui prsentent de petites diffrences de structure et de proprits. Isoflavonodes - Voir flavonodes. Isoforme - Souvent cit dans la littrature comme synonyme diso-enzyme. Isoprnode - Compos structure d'hydrocarbure insatur correspondant la rptition d'units en C5 ramifies, assembles partir d'units de 5 atomes de carbones apportes sous forme d'esters diphosphate. Le premier terme de la srie est le dimthylallyldiphosphate condens plusieurs fois avec l'isopentnyl-diphosphate (IPP) pour donner des
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chanes renfermant un multiple de 5C et divers constituants importants, comme indiqu par la figure.
OPP IPP OPP OPP IPP OPP IPP
C5 C 10 C 15
Dimthylallyl-diP Granyl-diP Farnesyl-diP
C 20
Granylgranyl-diP
C C C C
25 30 35-50 > 5O
Granylfarnsyl-diP Hexaprnyl-diP Polyprnyl-diP Gommes
Cytokinines Monoterpnes Strodes, cholestrol, sesquiterpnes, protines farnsyles, hmes A,O, Vitamine K2. Avec allongement et liaisons cis : caoutchoucs Carotnodes, rtinodes, diterpnes, protines granylgranyles, chlorophylles et bactriochlorophylles, idem caoutchoucs avec des liaisons cis, lipides des archaebactries Lipides des archaebactries Ubiquinone 6, naphtoquinone 6 Ubiquinones 7-10, naphtoquinones 7,10 Gommes vgtales, Gutta percha (C > 500-3000)
Isotopes - Diffrentes formes d'un mme lment chimique comportant le mme nombre de protons et d'lectrons, mais un nombre de neutrons diffrents. Isotopique (Effet) - Modification de la vitesse d'une catalyse enzymatique obtenue dans certains cas en remplaant un atome du substrat par un isotope. Exemple : remplacement d'un atome d'hydrogne par un atome de deutrium. Isotopique (Dviation) - Voir Fractionnement isotopique. ISP - Iron Sulfur Protein. Katal - Unit dactivit enzymatique, transforme une mole de substrat par seconde. Dans la pratique, on utilise plutt les micro- et nanokatals. Kb - Kilobase. 1 kb = 1000 paires de bases (1000 pdb), units de longueur sur lADN. Le pas de la double hlice est proche de 10 pdb. Krogne - Ensemble de produits insolubles et polymriss transforms au cours des priodes gologiques, provenant de la matire organique enfouie dans les sdiments marins ou lacustres. La transformation en profondeur sous pression et lvation de temprature a provoqu crot-on une fragmentation en rsines, asphaltnes et divers hydrocarbures retrouvs dans le ptrole brut. Kinase - Catalyse une phosphorylation avec l'ATP comme donneur, librant de l'ADP. Km (Coefficient) - Dans le cas d'une enzyme obissant la loi de MICHAELIS, c'est la concentration d'un substrat limitant donn pour laquelle la vitesse de la raction catalytique est la moiti de la vitesse maxima thorique (les autres facteurs n'tant pas limitants). Le taux d'enzyme est lui-mme un facteur limitant. Le Km pour un substrat est gnralement indiqu en molarit. Il est proche de la constante de dissociation du complexe form rversiblement entre l'enzyme et son ligand. Il est d'autant plus faible que l'affinit de la protine pour celui-ci est plus forte. Le Km se dtermine par extrapolation graphique en dosant la vitesse de la raction avec diffrentes concentrations de substrat, tous les autres facteurs tant constants. La gamme de valeurs observes selon les systmes enzymatiques va le plus souvent de 1 M 2-3 mM. Voir MICHAELIS. Koc (et log Koc) - Le Koc d'un contaminant est le coefficient de partage entre la phase organique fixe sur les particules du sol et la phase libre. Le Koc est caractristique de chaque contaminant, et est reli son hydrophobicit. On mesure celle-ci en agitant le contaminant dans un mlange constitu parts gales d'octanol et d'eau. Aprs sparation
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des deux phases, le coefficient de partage ou Kow est la proportion entre la partie dissoute dans l'octanol par rapport l'eau. Une relation fait dpendre le Koc de ce partage Kow. Par exemple pour divers composs aromatiques, log Koc = log Kow 0,21. Les contaminants Koc lev ont davantage tendance s'adsorber aux particules du sol. Kow - Coefficient de partage octanol/eau : voir Koc. KRAFT (procd) - Technique industrielle utilise dans la fabrication des ptes papetires dites chimiques, consistant liminer une grande partie de la lignine du bois. Pour extraire une tonne de lignine, il faut environ 800 kg de soude et 300 kg de sulfure de sodium. A dfaut d'une opration de blanchiment, qui limine la lignine rsiduelle, le papier jaunit progressivement la lumire (c'est le cas du papier journal). Le blanchiment conduit par divers ractifs (ClO2, O3, CO2...) tend librer des substances polluantes pour l'environnement. Laccases - p -Diphnol oxydases extracellulaires (EC 1.10.3.2) des champignons et des plantes, beaucoup plus rarement des procaryotes (Azospirillum). Les laccases rduisent O2 en H2O par un mcanisme 4 lectrons. Elles sont impliques chez les plantes dans la morphognse, dans le dveloppement et dans le mtabolisme de la lignine, elles font aussi partie des facteurs de virulence dans certains champignons pathognes. Ce sont des glycoprotines contenant 2 4 Cu par molcule, dosables 525 nm par oxydation de la syringaldazine pH modrment acide. Elles produisent des quinones et semiquinones, et sont des inhibiteurs de la chane respiratoire. Les laccases se distinguent des tyrosinases qui sont des monophnol mono-oxygnases (EC 1.18.14.1) et des o-diphnol oxydases (EC 1.10.3.1). Les laccases 4 Cu ont la fois un Cu de type I, un Cu de type II, et un groupe bi-mtallique de type III (voir Cuivre). Lactone - Ester interne n de la raction d'une fonction acide et d'une fonction alcool portes par la mme molcule. Exemple : gluconolactone forme aprs oxydation en acide de la fonction aldhydique du glucose. Lagunage - Procd d'auto-puration des eaux uses, fond sur les processus naturels de biodgradation et de recyclage des polluants en biomasses bactriennes, vgtales et animales. Le lagunage est pratiqu dans des bassins peu profonds l'air libre, traverss par les eaux pollues. Il peut s'appliquer aussi bien aux effluents urbains qu'aux eaux trs pollues par le lisier de porc. Il tend vers des applications valorisables, comme l'levage en masse de daphnies, l'levage de poisson ou la production de vgtaux qui seront ultrieurement enfouis dans les sols comme fertilisants. L'puration par lagunage est souvent facilite par le dveloppement trs rapide de vgtaux verts flottants pouvant former un tapis continu : Lemna minor et Lemna gibba (lentilles d'eau), Eichornia crassipes (jacinthe d'eau), Pistia stratiotes (laitue d'eau). Les lentilles d'eau constituent un excellent engrais vert, facile rcolter, la production pouvant dpasser 70 tonnes de vgtaux frais par hectare. La dcomposition anarobie des jacinthes d'eau en milieu tropical est une source de mthane utilisable des fins domestiques. Le lagunage permet aussi une production de larves chironomes (vers de pche) et de zooplancton (daphnies). Latrites - Dsignent plusieurs types de sol tropical de couleur rouge par labondance du fer, formant la surface du sol une crote de consistance analogue celle du bton. La formation des latrites est caractristique des pays chauds et humides, et sexplique par une vaporation superficielle intense facilitant la remonte et laccumulation des silicates dalumine et des oxydes mtalliques des couches plus profondes. Lapparition des latrites peut rendre irrversible la dgradation de la vgtation due au dboisement, rend les sols impropres lagriculture, facilite les dvastations par ruissellement aprs de fortes pluies. Lectine - Protine vgtale de surface capable de lier spcifiquement et avec une haute affinit un motif glucidique ou un chanon glucidique (polysaccharide), libre ou plac la surface d'une cellule. Une lectine peut participer un mcanisme de reconnaissance de cellule cellule. Terme tendu frquemment des protines animales montrant des proprits comparables. Leghmoglobine - Hmoglobine particulire (Leg pour lgumineuse) synthtise par les plantes (lhme tant fourni par les bactries) au niveau des nodules racinaires o sont loges les bactries symbiotiques assimilatrices de N2. La protine pige O2 taux lev
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avec une forte affinit et le restitue taux faible, comme le fait l'hmoglobine animale. Des hmoglobines forte affinit pour O2 se rencontrent dans diffrents tissus des di- et monocotyldones indpendamment de toute symbiose, leur fonction physiologique ntant pas bien cerne. LEWIS (Acides et bases de) - Un acide de Lewis est une substance dont lun des lments a une couche lectronique vide ou incomplte, agit comme accepteur dlectron(s). Un acide de BRNSTED, ou donneur de proton, est aussi un acide de Lewis dans le sens o acceptant un lectron, il libre H+ et forme avec la charge supplmentaire un anion. Un mtal se comporte gnralement comme acide de Lewis. Inversement une base de Lewis est un donneur d'lectron(s) ou de doublet lectronique, accepte volontiers un proton (base de BRNSTED) et a une ractivit nuclophile. Une addition entre acide et base de Lewis peut former une liaison de coordinence. LH (Complexes) - Light-harvesting. Complexes contenant un agencement de polypeptides spcifiques et de pigments associs, dits antennaires, participant la collecte de l'nergie lumineuse chez les phototrophes. Chez les bactries phototrophes, les complexes LH-1 entourent directement le centre ractionnel. Le dispositif est parfois entour par des complexes LH-2. Lichen - Organisme constitu par l'association symbiotique entre une algue type Trebouxia ou une cyanobactrie (exemple : Nostoc) avec un champignon (souvent un ascomycte). Ligand - Terme anglo-saxon trs utilis pour dsigner un atome ou un groupe d'atomes venant s'attacher rversiblement, en un site spcifique, sur une protine. Le ligand d'une enzyme diffre d'un substrat en ce qu'il n'est pas transform par elle, et peut tre un inhibiteur comptitif. Ligases - Terme dsignant les enzymes de classe 6, qui ont en commun deffectuer une synthse endergonique couple la consommation dune molcule dATP, hydrolyse en AMP et pyrophosphate. Ces enzymes sont aussi appeles synthtases, par opposition aux synthases, qui crent galement une liaison entre deux molcules mais sans couplage nergtique. Lignine - Polymres tridimensionnels amorphes forms par l'association non rptitive et en proportions variables de trois units monomres : les alcools coumarylique, conifrylique et sinapylique. La complexit de la lignine vient de la grande diversit de ses liaisons, de son htrognit, et des liaisons contractes avec d'autres polymres tels que les glucides de la paroi vgtale. La synthse de la lignine rsulte d'une branche mtabolique particulire issue de la phnylalanine, qui est en mme temps le prcurseur de nombreux produits vgtaux impliqus dans la protection, la pigmentation et les communications chimiques. Les diffrentes mthodes disolement des lignines comportent des tapes de broyage des copeaux de bois et des extractions laborieuses par le dioxane ou le ttrahydrofurane consistant liminer la partie glucidique, mais provoquent certaines altrations comportant la fois des fragmentations et des repolymrisations. Une mthode dite de "bois explos" consiste chauffer les copeaux en prsence de vapeur d'eau haute pression plus de 200C, et provoquer une dtente adiabatique brutale qui a pour effet de dstructurer compltement les fibres et d'empcher les molcules de lignine de se condenser entre elles. La lignine obtenue est commode pour de nombreuses tudes mais il est pratiquement impossible dobtenir une lignine purifie "native". Malgr son insolubilit, la lignine (en particulier si elle est partiellement dgrade) peut tre efficacement dissoute dans des solvants tels que le dioxanne ou des thers couronne. Lindane - -hexachlorocyclohexane. Insecticide large spectre. LiP - Peroxydases mise par des champignons (voir Pourriture blanche), oxydent des substrats faible masse molculaire comme le vriatraldhyde, qui son tour oxyde dautres substrats et notamment la lignine. Liposomes - Vsicules membranaires artificielles (bicouches ou multicouches), prpares partir de phospholipides, dans lesquelles sont insrs des constituants choisis par lexprimentateur. Les liposomes dfinissent un compartiment interne, dont la composition est galement rglable.
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Litho-autotrophe - Micro-organisme autotrophe tirant son nergie de loxydation dune source non organique comme NH3, H2, les sulfures, Fe(II) Lixiviat - Effluent venant de la percolation des eaux de pluies travers des dchets (dcharges), entranant des produits polluants et des composs ns de l'action biologique. Lucifrase - Enzyme catalysant l'oxydation d'une lucifrine, avec mission de lumire. Chez Vibrio et Photobacterium, c'est une oxydorductase flavinique et la lucifrine est un aldhyde (RCHO). L'oxydation utilise O2 : FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O avec mission de lumire (490 nm). Celle-ci est mise par un intermdiaire oxygn de la flavine (FMNHOOH) qui est rduite nouveau par NADH. Chez les animaux le principe est diffrent. Les lucifrines appartiennent des types chimiques varis, la lucifrase peut tre une oxydase, une peroxydase ou une oxygnase. La lumire est mise alors par la lucifrine oxyde, la lucifrase peut exiger O2, ATP et Mg2+ (Photina), ou n'exiger aucun cofacteur particulier. Lucifrine - Voir Lucifrase. Lyase - Enzyme catalysant sans oxydorduction la formation ou la rupture d'une liaison entre deux atomes autres que l'hydrogne (classe 4 de la classification des enzymes). Lysognie - Proprit de certains bactriophages de se transmettre l'tat dormant dans la descendance des bactries infectes sans les lyser. Cas les plus tudis, le phage Lambda et le phage Mu (transposon). Seul entre dans l'hte l'ADN du virus. L'ADN Lambda, au dpart linaire, se circularise, puis est intgr au gnome bactrien en un point prcis (att) sous forme de prophage. Celui-ci est transmis la descendance pendant la phase lysogne comme un segment banal du gnome. Le prophage contient trois catgories de gnes : les gnes des fonctions prcoces (rplication de l'ADN, excision et remaniements du prophage), les fonctions tardives (protines de l'enveloppe) et les gnes rgulateurs. Ceux-ci, notamment le gne d'un rpresseur, empchent l'expression des deux catgories prcdentes pendant la phase lysogne, mais provoquent leur induction au cours de l'entre en phase lytique conduisant l'assemblage de particules infectieuses dstines tre libres aprs destruction de la cellule. LysR - Activateur des gnes de la synthse de la lysine en prsence de diaminopimlate, caractris chez E. coli. Voir aussi Activateur de transcription. LysR est le chef de file d'une importante famille de rgulateurs positifs de transcription chez les procaryotes, partageant une similitude volutive et plusieurs caractres : Ce sont des protines de 276 334 acides amins qui, en absence d'inducteur, se lient l'ADN l'tat de dimres ou de ttramres, en amont des gnes rguls sur une squence T-n11-A symtrie imparfaite (parfois G-n11-A). Leur gne est exprim contre-courant partir d'un promoteur qui chevauche en grande partie celui des gnes rguls. La plupart rgulent leur propre synthse qui est limite automatiquement un taux faible. En prsence de l'inducteur, il y a changement des relations avec l'ADN, interaction avec l'ARN-polymrase et amorage de la transcription en aval. Magnsium - Mtal ncessaire la vie et abondant, sous forme d'oxyde ou de cations bivalents. Prsent dans les chlorophylles, ncessaire de nombreuses enzymes, notamment celles qui utilisent de l'ATP. Il y en a 1,29 g/L dans l'eau de mer, soit 8 fois moins que de sodium. Mandlate - 2-hydroxy-3-phnylpropioniate. Manganse - Intervient dans les molcules biologiques sous forme Mn(II), Mn(III) et Mn(IV). La dernire forme correspond au degr d'oxydation du dioxyde de manganse (MnO2), abondant dans la nature et insoluble, mais rduit en anarobiose par des espces bactriennes. Inversement le Mn(II) est oxyd par de nombreuses bactries de l'environnement. Le manganse peut avoir un rle structural. Mn(II) est un cofacteur de diverses enzymes o il agit comme un acide de LEWIS. Un cas particulier est celui des enzymes cofacteur bimtallique comportant deux ions Mn(II) ponts par un atome d'oxygne : arginase, catalases Mn, nolase, certaines exonuclases et des ARN catalytiques. Sur ce problme, voir DISMUKES CG (1992) Chem. Rev. 96 : 2909-2926. La fonction la plus spectaculaire du manganse dans la biosphre est sans doute son association au PS2 de la photosynthse
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chez les vgtaux, algues et cyanobactries, o il intervient dans la photolyse de leau, et par consquent dans la production de O2. Mangrove - Ecosystme particulier des pays tropicaux au niveau des rivages marins dans la zone intertidale, l o la temprature moyenne de l'eau est d'au moins 23C. La vgtation caractristique des mangroves comporte des paltuviers, dont il existe une assez grande varit selon les rgions du monde. Le terme de paltuvier dsigne des arbres qui sont capables de vivre dans l'eau de mer peu profonde, l o elle se retire priodiquement par le jeu des mares, ont des racines ariennes assurant les changes gazeux de la respiration arobie, leurs tissus sont capables de repousser le sel et de l'excrter. Les mangroves des rivages continentaux sont soumises des apports de sdiments et de fortes variations de salinit, car elles sont inondes la fois par l'eau de mer et l'eau douce des fleuves. Les mangroves formes sur des hauts fonds subissent des variations de salinit dues l'intense vaporation et l'apport des pluies tropicales. Les racines en chasse des paltuviers hbergent une faune particulire, une trs grande varit d'algues et de micro-organismes. Les mangroves sont souvent associes des rcifs coralliens lorsqu'il n'y a pas d'apport excessif de sdiments ou de remonte d'eau froide. Il s'agit gnralement de milieux biologiques fragiles, dont l'quilibre est facilement menac par l'activit humaine et les changements climatiques. Mannanes - Polymres de mannose, prsents dans les plantes et les levures. Les mannanes de levure contiennent une charpente principale d'units de mannose lies en -1,6 et des branches attaches en -1,2 ou -1,3. Maturation - Phase terminale de la synthse d'une macromolcule biologique, lui permettant d'acqurir son tat dfinitif. Pour une protine, elle peut concerner la mise en forme dfinitive ou l'assemblage des diffrentes sous-units. Elle peut s'accompagner aussi de modifications de la structure covalente (acide nuclique, protine) survenant aprs synthse l'tat de prcurseur, consister en coupure hydrolytique de la chane, phosphorylations, soudure d'un cofacteur Voir aussi Chaperon molculaire. Mgaplasmide - Plasmide de grande dimension, de longueur suprieure 100 kb. Mnaquinones - Ou naphtoquinones. Quinones respiratoires, apparentes la vitamine K3 ou mnadione, de potentiel plus bas que celui des ubiquinones, et qui prdominent en mtabolisme anarobie ou dans la photosynthse des cyanobactries ou des plantes vertes. Elles se distinguent entre elles comme les ubiquinones par la longueur de leur chane latrale hydrophobe de type isoprnode. La phylloquinone, abondante dans les plantes, ou vitamine K1, a une chane latrale phytyle (en C15). La farnoquinone ou vitamine K2 a une chane farnsyle (en C20). La mnadione proprement dite n'a pas de chane latrale isoprnode. Msophiles - Organismes nombreux du sol dont l'optimum de croissance est entre 15 et 45C, avec un optimum couramment situ de 20 40C. Ne se dveloppent plus au-dessous de 8C. Messager (ARN) - Voir Transcription. Mtallothionines - Famille de protines ayant en commun une faible masse molculaire, une grande richesse en fonctions thiols (30% en cystine, pas d'acides amins aromatiques ni d'histidine), des squences consensus Cys-x-Cys, et la capacit de fixer des mtaux. Mthanofurane (MF) - Cofacteur des mthanognes, accepteur de formyle. Mthanogne - Archaebactrie dont le mtabolisme nergtique produit du mthane. Mthanophnazine - Cofacteur membranaire doxydorduction dans le passage du mthylcoenzyme M au mthane. Mthanotrophe - Organisme capable de se dvelopper sur CH4 comme seule source de carbone et d'nergie. Est en mme temps un mthylotophe. Mthionine (L-) - La mthionine est un acide amin essentiel de la nutrition animale. Hormis sa fonction dans la construction des protines, c'est en mme temps un agent important du mtabolisme mono-carbon, en particulier dans les mthylations. La mthionine synthase ajoute un mthyle sur la fonction thiol de la L-homocystine l'aide du mthyl-ttrahydrofolate
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comme donneur. La structure de l'enzyme a t dtermine (CHISTOSERDOVA et coll. (1998) Science 281 : 99-102). L'enzyme fonctionne avec un corrinode, avec le Co(I) comme accepteur intermdiaire. La synthase s'inactive facilement par oxydation de Co(I) en Co(II). Elle est ractive par une mthionine synthase rductase. La mthionine est potentiellement le donneur de mthyle dans la plupart des ractions de mthylations, le vritable donneur tant la S-adnosyl-mthionine (voir cette rubrique). Mthylotrophe - Bactrie ou levure capable de se dvelopper en utilisant du mthanol ou dautres composs mono-carbons comme seule source de carbone et dnergie. Mthylviologne - Colorant bas potentiel redox (E' = 446 mV) utilis exprimentalement comme accepteur dlectrons. Sa forme rduite nest stable quen absence doxygne dissous. On peut maintenir un potentiel trs bas par du citrate de titanium(III) comme donneur d'lectrons artificiel (E' = 446 mV). MF - Voir Mthanofurane. MGD - Molybdoptrine-guanine-dinuclotide, cofacteur structure dinuclotide trouv dans les enzymes molybdne (voir Molybdne), ou tungstne (Voir Tungstne), li Mo. Micas - Phyllosilicates composs de feuillets lmentaires de 0,1 nm dpaisseur, comportant deux couches de ttradres SiO44, avec substitution partielle de Si par Al, encadrant une couche doctadres. Les feuillets sont unis entre eux par des cations (K, Na, Mg, Fe). La composition des micas va dun pole magnsien un pole ferreux . La biotite commune des granites contient Fe et Mg : K(Mg,Fe)3[Si3AlO10](OH,F)2. La biotite est souvent altre en chlorite. La muscovite ou mica blanc a la composition : Kal2[Si3AlO10](OH,F)2. MICHAELIS (loi de) : Ou loi de MICHAELIS-MENTEN. Si S est la concentration d'un substrat limitant et Vm la vitesse maxima atteinte dans les conditions de mesure, la vitesse observe est v (dans la mme unit que Vm) dpend de S (Voir Vm et Km). L'expression, valable dans les cas les plus courants, cesse de l'tre pour les protines dites allostriques. Son application est plus dlicate en phase htrogne (support solide), ou quand la diffusion du substrat vers l'enzyme introduit un facteur limitant (traverse d'une membrane). Micro-arophile - Organisme ayant besoin de O2 pour sa croissance, mais ne pouvant supporter sa prsence qu' faible taux, par exemple 1-5% du taux normal (air ambiant ou O2 dissous saturation dans l'eau). Microcystines - Heptapeptides contenant des acides amins non standards, librs par dgnrescence cellulaire de cyanobactries, inhibant l'actylcholine estrase. Microsomes - Particules membranaires obtenues aprs dsintgration des cellules eucaryotiques, provenant des membranes cytoplasmiques : rticulum, GOLGI... MK - Abrviation pour mnaquinone. Minralisation - Destruction complte d'une source organique en CO2, H2O, NH3, sulfure, chlorure Mitomycine C - Antibiotique de la famille des aziridines, dcouvert dans Streptomyces caespitosus. Tranform dans les cellules cibles par rduction et rarrangement, produisant un driv ractif bipolaire qui se lie de faon covalente l'ADN en formant un pont entre les deux brins de la double hlice. Inhibe la rplication de l'ADN, bloque particulirement la rplication des plasmides. Sert notamment l'limination des plasmides dans une souche bactrienne. Mixotrophe - Organisme capable de se dvelopper en assimilant simultanment du CO2 et des composs organiques pour leurs synthses carbones. MnP - Peroxydases mises par des champignons (voir Pourriture blanche), oxydent les ions Mn2+ en ions Mn3+, qui leur tour oxydent dautres substrats et notamment la lignine. Modulon - Ensemble des oprons commands par une mme protine rgulatrice. la diffrence des rgulons (voir Rgulon), ces oprons correspondent des fonctions physiologiques diffrentes, par exemple le contrle du mtabolisme azot. Quand la distinction s'avre dlicate, les auteurs prfrent souvent parler prudemment de rgulation globale.
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Molybdne - Log sous forme de molybdate ( ltat oxyd) dans un cofacteur doxydorduction des molybdo-enzymes. La partie essentielle ou molybdoptrine a la structure dun nuclotide modifi comportant un motif dithiolate, mais chez les eubactries un autre nuclotide, contenant de la guanine ou une autre base, est soud la molybdoptrine formant le MGD. Fait exception la prsence dun tel cofacteur la nitrognase, o le molybdne est log dans un noyau fer-soufre spcial. Des molybdo-enzymes ont une fonction essentielle chez les plantes et les micro-organismes, telles que la nitrate rductase, la xanthine oxydase, la sulfite oxydase et laldhyde oxydase. La plupart des molybdo-enzymes renferment aussi un ou plusieurs noyaux fer-soufre et une flavine, ou encore un groupe hminique. On distingue en gros trois grandes familles de molybdo-enzymes. La premire est celle de la xanthine oxydase renfermant la structure O=Mo=S et renferme des hydroxylases. Les enzymes de ce groupe sont facilement inactives par l'ion cyanure, qui remplace le soufre par un deuxime groupe oxo et libre du thiocyanate. La seconde est reprsente par la sulfite oxydase, avec la structure O=Mo=O. Une troisime est celle de la DMSO rductase. Le cofacteur MGD y est prsent en deux exemplaires autour du molybdne, formant le bis(MGD)Mo. La formiate dshydrognase et la nitrate rductase priplasmique appartiennent ce groupe. Le remplacement du molybdne par du tungstne prserve ou supprime l'activit selon les cas, en provoquant une chute importante, de l'ordre de 300 mV, du potentiel redox. Molybdoptrine - Voir Molybdne. Mono-oxygnase - Enzyme utilisant O2, catalysant la raction gnrale (o A-H est un substrat) : A-H + O2 + 2e + 2H+ A-OH + H2O. La source de deux lectrons, NADH, NADPH ou vitamine C, est reconnue soit directement par lenzyme (mono-oxygnases flaviniques) ou par lintermdiaire dune chane doxydorduction (par exemple pour un P450). Les mono-oxygnases sont des hydroxylases, des poxydases ou catalysent une varit dautres ractions. Leur cofacteur est du fer (hminique ou non hminique), du cuivre, une ptrine ou une flavine. Parmi les diffrentes mthodes de dosage utilise, lune delles consiste mesurer 340 nm la disparition de la bande d'absorption du NADH (340 = 6300 cm1 M1). Mssbauer (spectroscopie) - Bas sur un phnomne dmission et dabsorption de photons gamma par des noyaux atomiques sans perte dnergie due au recul de ces noyaux, sans perte de rsolution due leur agitation thermique. Concerne surtout le fer, ltain et liode. MPTH4 - Voir Ttrahydromthanoptrine. Mutagnse dirige - Changement par recombinaison artificielle d'une ou plusieurs bases une position prcise d'un gne. Ce procd sert en particulier obtenir le remplacement d'un acide amin prcis dans la squence d'une protine, de manire observer les effets sur les proprits de celle-ci. Par exemple remplacer un segment Val-His-Tyr par Val-Ala-Tyr dans un site actif. Mutation - Modification du matriel gntique avec transmission dfinitive dans la descendance. Il y a plusieurs catgories. mutation ponctuelle dans une base, dont l'effet est de provoquer le remplacement d'un acide amin par un autre dans une protine ; insertion, par IS, transposon ou prophage ; inversion, dltion, duplication d'un segment de l'ADN, les cas les plus compliqus o interviennent des recombinaisons entre segments d'ADN ; changement du cadre de lecture ; apport d'un ADN tranger par transformation, conjugaison, transduction. Des phnomnes plus complexes s'ajoutent ou les remplacent chez les eucaryotes avec les remaniements et changes parmi les chromosomes. Mutualisme - Association obligatoire de deux organismes diffrents qui en tirent lun et lautre des conditions ncessaires leur dveloppement. Les dmarcations ne sont pas toujours bien tablies entre symbiose, symbiose mutualiste et mutualisme intgral. Dans le syntrophisme ou synergie, chaque partenaire peut se dvelopper seul dans certaines conditions de milieu. Mycelium - Ensemble des hyphes formant la partie vgtative des champignons.
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Mycobacterium - Forme les mycobactries, Gram-positifs arobies, en forme de bacilles ou de cellules filamenteuses. Leurs parois sont riches en lipides et ont des acides mycoliques, cires spciales renfermant de 60 90 atomes de carbone (acides gras complexes ramifis et hydroxyls). Caractrises par leur coloration alcoolo-acido-rsistante (la fuchsine acide nest pas enleve par un traitement alcool + acide). Certaines espces sont saprophytes dans le sol, capables dutiliser des hydrocarbures aliphatiques courte chane ou des aromatiques, autotrophes facultatifs. Dautres espces sont pathognes : M. tuberculosis (source principale de la tuberculose humaine), M. bovis (tuberculose bovine), M. leprae (lpre). Mycorhizes - Champignons du sol troitement associs aux racines des plantes. Il y en a deux sortes, les ectomycorhizes formant un manchon externe autour des racines, et les endomycorhizes qui y pntrent. Les premiers sont souvent associs aux ligneux forestiers, les seconds colonisent au moins 80% des plantes cultives. Les amanites, bolets et girolles sont les fructifications dectomycorhizes. Les lactaires sont auprs du pin sylvestre, les truffes auprs des noisetiers et chnes. Les champignons endomycorhiziens sont plus dlicats tudier. Leurs ramifications internes dans les racines forment ce quon appelle les arbuscules. Ils colonisent maints arbres tropicaux et dautres, comme les rables, les gingkos et les squoias. Il stablit une sorte de symbiose entre le vgtal et le champignon, avec change de matriaux organiques ou minraux. Le champignon aide mobiliser dans le sol les phosphates, lammoniac, les dbris vgtaux, et mme le potassium des feldspaths. Il nassimile pas N2, fonction rserve aux procaryotes. Les mycorhizes peuvent intervenir dans la rpartition des plantes et leur comptition. Par exemple les conifres, qui nont pas les mmes champignons que les plantes des alentours, peuvent rafler les lments nutritifs leur profit et faire le vide leur contact immdiat. Myxobactries - Bactries du sol Gram-ngatives, caractrises par leur mobilit qui se fait par glissement, et par un cycle biologique complexe o les cellules s'associent en nappe, se propagent par glissement d'ensemble, forment des fructifications au-dessus de la surface du sol, librant des myxospores trs rsistantes la dessiccation. Scrtion d'enzymes digestives qui attaquent et lysent dautres bactries et les levures, synthse d'antibiotiques. Utilisent des peptides et des acides amins comme source de carbone, dazote et dnergie. Exemple trs tudi - Myxococcus xanthus. NADH-dshydrognase - Assure le passage des lectrons de NADH vers les quinones respiratoires au cours de la respiration, forment des complexes membranaires translocateurs de protons (type I) ou non translocateurs. Le type I renferme 14 sous-units (E. coli), FMN et centres fer-soufre, se prsente comme homologue du complexe mitochondrial des eucaryotes. Le type II est beaucoup plus simple, avec un seul type de sousunit et FAD, sans fer-soufre, utilis plus couramment chez les bactries en arobiose ou dans la dnitrification. Nanoplancton - Organismes planctoniques de trs petite taille, infrieure 2 m. Naphtoquinones - Voir Mnaquinones. Nappe phratique - Si on creuse un trou assez loin dans le sol, on voit ventuellement le fond se remplir deau, qui se stabilise un certain niveau : on vient datteindre la nappe phratique. NarL - Voir NarX/NarL. NarQ/NarP - Fonctionne comme NarX/NarL. NarX/NarL - Systme rgulateur deux composants (capteur/activateur de transcription) rpondant la prsence du nitrate ou du nitrite, commandant lexpression de divers gnes impliqus dans la dnitrification ou dans des voies de fermentation. Nmatodes - Vers microscopiques non segments abondants dans les sols et se nourrissant de plantes, animaux, champignons ou bactries. NERNST (loi de) - Relie le potentiel standard d'oxydorduction de l'quilibre Ox + n e Red en fonction des concentrations (ou activits) [Ox] et [Red] des formes oxydes et rduites : E = E + (RT/nF) ln ([Red]/[Ox] ; R = 8,314 J . mol1 . degr1, F = 95484, n est le nombre
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d'lectrons transfrs, T est la temprature absolue et les potentiels sont en volts. 25C et pour 2 lectrons transfrs, le potentiel pH 7 est : E' = E' + 0,0296 log ([Red]/[Ox]). Nickel - Mtal prsent dans la CO dshydrognase (actyl-CoA synthase) dans un noyau Ni-Fe/S spcial, diverses hydrognases (complexes Ni-Fe), le F430 des mthanognes (un corrinode o Ni est au centre), enfin dans lurase. NIH-shift (Dplacement NIH) - Mcanisme mis en vidence par marquage au deutrium, se traduit par le dplacement d'un atome d'hydrogne sur un oxyde aromatique. Le modle est dans le passage de la phnylalanine la tyrosine. L'poxyde en 3,4 form par mono-oxygnation s'ouvre pour donner la fonction phnol en 4, tandis que l'hydrogne qui tait en 4 passe en 3. Un mcanisme similaire a lieu dans la formation de l'homogentisate. Nitracline - Niveau ocanique (100-150 m de profondeur) sparant la zone superficielle o la concentration en nitrate est nanomolaire en ordre de grandeur, et la zone profonde o elle est prs de mille fois plus leve. Nitrapyrine - (2-chloro-6-trichloromthylpyridine). Inhibiteur covalent de lammoniac mono-oxygnase (nitrification), inhibe aussi la mthanognse, loxydation du mthane, la rduction du sulfate et la dnitrification. Attaque en mme temps de faon complexe par lammoniac mono-oxygnase en acide 6-chloropicolinique avec dshalognation partielle (VANNELI T & HOOPER AB (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 : 3597-3601). Nitrate rductase - Chez les vgtaux et micro-organismes, renferme du fer, du soufre et du molybdne, catalyse la rduction du nitrate en nitrite : NO3 + 2 e + 2 H+ NO2 + H2O Nitrification - Oxydation naturelle de l'ammoniac (ammonium) en nitrate. Elle se fait en deux tapes principales, jusqu'au stade nitrite (la nitrification proprement dite) par des espces telles que Nitrosomonas europae, Nitrosococcus oceanus ou Nitrospira briensis, puis par oxydation du nitrite en nitrate ralise par les Nitrobacter et Nitrococcus. Ce sont des organismes chimio-autotrophes, qui tirent leur nergie des oxydations faites partir de NH3. Il existe aussi une nitrification htrotrophe, par des espces qui ont besoin dune source carbone organique pour se dvelopper. Cest le cas de Paracoccus denitrificans, de certains Pseudomonas et autres espces. Le passage de NH3 au nitrite est catalys par lammoniac mono-oxygnase et par lhydroxylamine oxydase. La nitrification nest pas exclusivement arobie, et sobserve en O2 limitant ou nul chez les espces pouvant faire fonctionner simultanment une dnitrification. Un inhibiteur de la nitrification est lallyl thioure. Nitrognase - (EC 1.18.6.1) Enzyme fer-soufre exclusivement procaryotique, renfermant habituellement du molybdne (parfois du vanadium), catalysant la raction : N2 + 8 H+ + 8 e + 16 ATP 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi L'apport des lectrons s'effectue typiquement par une ferrdoxine rduite. La nitrognase est trs sensible O2, et sa synthse est rprime lorsque le milieu contient de l'ammonium ou une source d'azote organique. Communment dose par rduction de lactylne. Nitrorductase - Enzyme rduisant le groupe azot des nitro-aromatiques. Dans la classe I, l'enzyme est une oxydorductase (EC 1.6.99.2) amenant le groupe azot au stade de l'amine en utilisant NADH ou NADPH comme source d'lectrons, et en fabriquant des intermdiaires nitroso (NO.) et hydroxylamino (NHOH). Ces enzymes sont gnralement des flavoprotines et peuvent fonctionner en prsence d'O2. Le cofacteur est FMN chez les bactries, FAD chez les mammifres. Dans la classe II, les enzymes bactriennes sont des NADPH-cytochrome P450 oxidoreductases (EC 1.6.2.4) qui engendrent partir du groupe nitro des radicaux anioniques. Ceux-ci s'oxydent par O2 pour engendrer du superoxyde et redonner le substrat de dpart selon un processus en circuit ferm. Ces nitrorductases sont sensibles au dioxygne et transforment le groupe nitro en amine dans les conditions anarobies. Noyau fer-soufre - Voir fer-soufre. NtrA - Voir sigma-54.
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NtrC - Dsigne aussi comme GlnG, NRI (la nomenclature ne s'est stabilise que rcemment). Activateur de transcription sous forme phosphoryle, soit Ntr-P, impliqu dans le mtabolisme azot. La phosphorylation de NtrC se traduit par un changement de conformation analys par RMN (KERN D et coll. (1999) Nature 402 : 894-898). Elle est catalyse par NtrB ainsi que sa dphosphorylation. Le couple NtrB/NtrC forme donc un systme deux composants d'un type particulier, o le transmetteur du signal, NtrB, est une protine kinase quand elle est active, une protine phosphatase dans le cas contraire. Nuclases de restriction - Endonuclases coupant les deux brins d'un ADN bicatnaire au niveau d'une courte squence dfinie, de 4 7 pdb, trs souvent symtrique. Les deux brins sont hydrolyss en des points dcals ou au mme niveau selon les cas. Ce sont des enzymes de dfense contre les ADN trangers, et la bactrie protge son propre ADN par des enzymes de mthylation qui reconnaissent les mmes squences. Les nuclases de restriction utilises en gnie gntique appartiennent au type II, sans activit de mthylation associe. L'ADN est dcoup en fragments de longueur dtermine pour chaque nuclase, et la sparation des fragments par lectrophorse permet d'tablir ce qu'on appelle des cartes de restriction. Les fragments obtenus par EcoRI, qui reconnat une squence de 6 pdb, ont de l'ordre de 4 kb. Les nuclases reconnaissant 5 pdb font des fragments de 1 kb environ. Plusieurs dcoupages utilisant plusieurs nuclases sont pratiqus pour l'tude de zones dtermines de l'ADN. Les fragments sont spars par lectrophorse sur agarose, rcuprs sur filtre de nitrocellulose (Southern blotting). Les nuclases de restriction sont les premiers outils indispensables l'analyse de gntique molculaire. OLAND - Oxygen-limited autotrophic nitrification-denitrification. Conditions pauvres en oxygne o sobservent en mme temps loxydation de lammoniac et la rduction des oxydes dazotes par des organismes au moins en partie autotrophes. Oligo-lments - Elments ncessaires au dveloppement cellulaire mais dont l'apport est suffisant dose faible ou trs faible. Bore, calcium, cobalt, cuivre, fer, magnsium, manganse, molybdne, nickel, slnium, tungstne, vanadium, zinc. Les oligo-lments entrent d'ordinaire dans la constitution de cofacteurs indispensables au fonctionnement de nombreuses enzymes, soit en tant que tels (par coordination par des groupes appartenant la protine), soit au sein de molcules organiques (coenzymes). Oligomycine - Antibiotique inhibiteur de l'ATP synthase F1F0 au niveau de F0. Oligotrophe - Espce pouvant se dvelopper avec des taux trs faibles d'lments nutritifs. OmpR - Protine rgulatrice de 27 kDa du colibacille, faisant partie d'une rgulation deux composants actionne par la pression osmotique. Celle-ci rgle le taux d'autophosphorylation de EnvZ, une protine de la membrane interne de 45 kDa, dpassant dans le priplasme. EnvZ-P phosphoryle son tour OmpR en OmpR-P, mais agit aussi comme dphosphorylase (phosphatase) sur cette dernire. Ces deux activits antagonistes sont probablement fondes sur deux tats conformationnels de la protine. OmpR est donc phosphoryle et dphosphoryle en permanence, mais le rapport OmpR-P/OmpR crot quand la pression osmotique s'lve. OmpR-P est son tour un rgulateur de transcription. En se fixant sur l'ADN en amont du gne de OmpF en un site de haute affinit, il active l'expression de ce gne. Cette action est renverse quand OmpR-P est abondant, car il y a alors fixation en plusieurs sites secondaires faible affinit provoquant la rpression de l'expression. Le taux de OmpF s'lve donc en pression osmotique faible, devient ngligeable en pression forte. Mcanisme trs tudi aux modalits complexes o d'autres fonctions cellulaires sont galement contrles (voir aussi Porines, Rgulations deux composants). Opron - Ensemble de gnes adjacents sur lADN, transcrits dans le mme sens partir dun promoteur commun (il peut y avoir des promoteurs secondaires dans lopron lui-mme). Permet lexpression concerte des gnes qui le composent, placs sous linfluence dun mme rgulateur, et correspond gnralement une fonction physiologique dtermine. Le groupement des gnes en oprons est un trait essentiellement procaryotique. ORF - Open reading frame. Voir Cadre de lecture ouvert.
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Origine (de rplication) - La rplication d'un rplicon (chromosome, plasmide) commence toujours une ou plusieurs zones prcises du cercle (environ 245 bp chez E. coli), appeles origines de rplication. Orthologues (Gnes) - Des gnes sont dits orthologues entre diffrentes espces quand ils sont homologues par leur structure et la fonction quils reprsentent. Oxocarboxylate rductase - (2R)-hydroxycarboxylate-viologne-oxydorductase. Rduit un 2-oxocarboxylate (RCOCOO ) en (2R)-hydroxycarboxylate avec donneurs probablement varis, dont des colorants rduits bas potentiel. Large spcificit, bioptrine comme cofacteur, trouv chez Proteus vulgaris (TRAUTWEIN et coll., (1994) Eur. J. Biochem. 222 : 1025-1032). Oxydase - Enzyme oxydant un substrat l'aide de O2, lequel est rduit en H2O2 et (ou) en superoxyde dans le cas des oxydases flaviniques, en deux molcules d'eau par les oxydases respiratoires et les laccases. Les atomes d'oxygne ne sont pas incorpors dans le substrat (diffrence importante avec les oxygnases). Lorsque le produit de l'oxydation d'un substrat organique par une oxydase a incorpor un atome doxygne, celui-ci provient du solvant, et rsulte de laddition dune molcule deau sur double liaison. Oxygnase - Enzyme doxydorduction utilisant O2 pour introduire dans le substrat un atome doxygne (mono-oxygnase), ou les deux atomes des endroits diffrents (dioxygnase). Un critre important pour dmontrer loxygnation dun substrat est lintroduction d'oxygne-18 dans le produit de la raction partir d'O2 marqu avec cet isotope. Oxygne singulet - Forme d'O2 engendre par excitation photochimique. Loxygne diatomique ordinaire est un tat triplet paramagntique stable et relativement peu ractif, car cest un bi-radical (.OO.) contenant deux lectrons non apparis et de spins parallles. Dans loxygne singulet, trs ractif et vie brve, les spins sont en sens contraire. OxyR - Protine rgulatrice de E. coli et Salmonella typhimurium activant sous forme oxyde la synthse d'une gamme d'enzymes de rsistance aux peroxydes, dont la catalase, la glutathion rductase, l'alkylhydroperoxyde rductase. OxyR commande un rgulon dit du stress oxydant. P450 (Cytochrome) - Enzyme hminique fonctionnant le plus souvent comme monooxygnase ou comme hydroxylase, poxydase, caractrise par une bande d'absorption vers 450 nm l'tat rduit et en prsence de monoxyde de carbone. Ncessite une source d'lectrons (NAD(P)H + rductase), souvent un transporteur intermdiaire (ferrdoxine, cytochrome b5). Les substrats sont majoritairement des hydrocarbures, des terpnes ou des strodes. Le fer de la porphyrine est li la protine par une coordination sur un groupe thiolate (cystine). Les P450 peuvent aussi catalyser diverses ractions telles que des dshalognations. Ceux des procaryotes sont des protines solubles, membranaires chez les eucaryotes (notamment dans le foie des mammifres, chez les champignons et les plantes). Ces enzymes ont souvent une spcificit tendue, caractrise par les variations de leurs spectres visibles et RPE en prsence d'un substrat ou d'un inhibiteur comme la mtyrapone ou le SKF 525A. Lanalyse gnomique rvle prs de 80 gnes de P450 chez lhomme, et prs du double chez les plantes comme Arabidopsis. Le sujet connat une trs grande extension grce la compilation de nombreuses squences permettant d'tablir un arbre volutif. Les P450 sont maintenant classs en familles et sous-familles. Ils sont dsigns par le sigle CYP suivi d'une lettre, indiquant la sous-famille, et d'un numro d'ordre. Le rgne vgtal renferme de trs nombreux P450 affects au mtabolisme secondaire : synthse d'auxines, de pigments, de facteurs de dfense. Certains sont atypiques, ne font pas d'hydroxylations, utilisent le peroxyde au lieu de l'oxygne et peuvent utiliser la source d'lectrons sans transporteurs intermdiaires. PABA - Acide p-aminobenzoque, facteur de croissance dont la structure est imite par les sulfamides. Prcurseur de la synthse de l'acide folique et du FH4. PAH - Voir HAP. Pais - Pathogenecity island, ou lot de pathogncit. Srie de gnes groups sur une longueur d'ADN parfois assez grande (plus de 30 kb, jusqu' 200 kb) chez les bactries
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Gram-positives et ngatives, prsente dans les souches pathognes et absente des souches non virulentes. Le contenu en G + C peut tre diffrent de celui du reste du gnome. Aux bornes d'un Pais s'observent frquemment des squences spciales telles que des IS et des gnes codant pour des ARNt. On trouve dans ces lots des vestiges de gnes corrrespondant des intgrases et des facteurs de flexibilit du gnome ressemblant ceux qu'on trouve dans les plasmides et les phages, suggrant que les Pais ont pu avoir pour origine d'anciens plasmides ou phages intgrs. Les Pais de souches uropathognes (E. coli, Yersinia spp., Helicobacter pylori) ont tendance subir des dltions, ou au contraire une amplification, et renferment des traces de squences laissant supposer des transferts et propagations frquents, en particulier par des bactriophages. Les lots de pathogncit sont souvent gntiquement instables (HACKER J, BLUM-OEHLER G, MUHLDORFER I & TSCHAPE H (1997) Mol. Microbiology 23 : 1089-1097). PAPS - Phosphoadnosine phosphosulfate. Intermdiaire dans la rduction assimilatrice du sulfate en sulfite, comme lAPS avec un phosphate supplmentaire en position 3 du ribose. Paralogues - Protines homologues adoptant le mme type de conformation mais ayant des fonctions diffrentes. L'volution des gnes paralogues est considre comme une source importante d'apparition de nouvelles protines et de diversification des voies mtaboliques. Paroi vgtale - Les cellules des plantes suprieures sont entoures d'une paroi constitue de polysaccharides o dominent initialement des hmicelluloses et substances pectiques, accompagnes d'une petite proportion de cellulose, et formant la paroi primaire. Cette paroi reste flexible, participe au rglage de la croissance cellulaire, contient des enzymes qui assurent ses remaniements et son allongement au cours de la croissance cellulaire. La paroi primaire renferme des glycoprotines spciales dont certaines d'entre elles ou HGRP (hydroxyproline-rich glycoprotein), se caractrisent par l'abondance de proline hydroxyle rappelant les collagnes des animaux. Ces HGRP sont mailles d'oligosaccharides renfermant de l'arabinose (A. HEREDIA et coll. (1995) Z. Lebensm. Unters. Forsch. 200 : 24-31). Au cours d'un processus appel parfois secondarisation, la paroi s'paissit du ct intrieur par le dpt de fibres de cellulose et atteint ses dimensions dfinitives. Cette nouvelle paroi dite secondaire, dominante cellulosique, se charge de divers constituants qui vont lui donner une grande variabilit d'un tissu vgtal un autre et d'une espce l'autre. Parmi ces constituants figurent des xylanes (dans les dicotyldones notamment) et en bonne place la lignine, dont la teneur atteint 30 pour cent et plus dans le bois. Voir Hmicelluloses, Lignine, Pectines. PAS (domaine) - Sigle provenant l'origine du nom de trois protines de la Drosophile. Structures caractristiques, repres dans de trs nombreuses squences, parfois rptitives, et longues d'une centaine de rsidus. Existent chez les animaux, vgtaux et bactries, sont toujours placs dans des protines cytosoliques ou du ct cytosolique des protines membranaires. Les domaines PAS accompagnent les protines formant des associations et intervenant dans la transmission de signaux dclenchs par la lumire, le potentiel redox intracellulaire, le niveau nergtique de la cellule, la prsence de l'oxygne, la fixation d'un ligand sur son rcepteur Exemples : Aer dans l'arotactisme de E. coli, NifL, PhoR, ArcB. Les domaines PAS chez les bactries sont invariablement trouvs dans les rgulations deux composants. Voir l'importante revue par TAYLOR BL & ZHULIN IB (1999) Microbiol. Molecular Biol. Rev. 63 : 479-506. PCE - Dsigne couramment le perchlorothylne ou ttrachlorothylne. PCP - Pentachlorophnol. PCR - Polymerase chain-reaction. Technique damplification molculaire portant sur un segment dADN disponible en quantit infime. Explique sous sa forme simple par un ADN bicatnaire fictif, symbolis par deux flches orientes en sens oppos (les biochimistes disent que les deux chanes dans la double hlice sont antiparallles). Les fragments d'ADN sont placs dans un mlange contenant les 4 dsoxyribonuclotide triphosphates (dTNP), MgCl2, KCl, tampon pH 9, ADN-polymrase Taq (Thermus aquaticus) et oligonuclotides synthtiques utiliss comme sondes et amorces.
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5 3 ADN deux brins
3 5
Un chauffage (30 s, 95C) droule la double hlice et dnature lADN en brins spars :
5 + 3 5 3
On provoque (30 s 55C) lhybridation de chacun des ADN monocatnaires avec une sonde synthtique longue de 10-15 dsoxyribonuclotides, la squence tant ajuste pour tre homologue dune portion de lADN dnatur. Les deux sondes sont en fort excs sur lADN hybrider. La disposition obtenue aprs hybridation est alors :
sonde n1 3 3 5 5 3 3 sonde n2
Chaque sonde sert damorce au travail dune ADN-polymrase thermostable ( lorigine on a utilis celle de Thermus aquaticus, une bactrie thermophile). Le milieu contient avec les sondes en excs suffisamment des quatre substrats ncessaires et un sel de magnsium. Lenzyme reconstitue (3 min, 72C) un ADN bicatnaire complet en prolongeant lextrmit 3 de chaque sonde hybride, les dsoxyribonuclotides tant assembls selon la squence complmentaire du brin modle :
sonde n1 3 5 3 3 5 3 sonde n2
On obtient ainsi deux molcules identiques la molcule dADN de dpart. Le cycle est rpt, grce une petite machine qui programme les tapes successives de chauffage et de refroidissement (iCycler de Bio-Rad). La polymrase en place nest pas inactive au cours de la dnaturation de lADN et suit toutes les oprations. Si on effectue 35 cycles sur ce principe (en allongeant les tapes chaque cycle), on obtient partir dune molcule dADN 235 molcules, soit une norme amplification du fragment de squence initial. On trouvera facilement les dtails supplmentaires, variantes, difficults ventuelles et applications dans les manuels de biologie molculaire. Un rafinement de la technique PCR consiste introduire des erreurs au cours de lamplification, conduisant une banque de gnes contenant individuellement une mutation ponctuelle. Par recombinaison et criblage des mutations, on sefforce dobtenir des enzymes "mutantes" dont les proprits sont amliores ou modifies. Lorsque l'ADN de dpart est un mlange de fragments obtenus partir d'une squence par digestion partielle avec la Dnase I (qui ne coupe pas des positions spcifiques), ces fragments peuvent tre amplifis sans addition d'amorces, car ils ont des portions de squence en commun, s'hybrident partiellement et servent mutuellement d'amorce. On obtient alors rapidement une squence complte et homogne, amplifie sans le secours des sondes artificielles. La mthode PCR connat des variantes plus complexes, offre la possibilit d'amplification avec erreurs de squence, permettant l'obtention de mutations artificielles. Voir aussi DNA shuffling. Pectines - Mlange complexe de polysaccharides collodaux qui peuvent tre extraits des parois vgtales par l'eau et les agents chlateurs comme l'oxalate. Les plus caractristiques sont les rhamnogalacturonanes I et II, les arabinanes, galactanes, arabinogalactanes I et D -galacturonanes. L'arabinose et le galactoses des substances pectiques peuvent tre estrifis par des acides phnoliques tels que l'acide frulique.
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Pnicillines - Ces antibiotiques clbres faisant partie des bta-lactames sont produits l'origine par un Penicillium. Ils agissent sur les bactries dont la paroi contient des peptidoglycanes en empchant la synthse d'une paroi normale. Les cellules en voie de croissance ont alors une paroi moins rigide qui les rend sensibles la pression osmotique. Les cellules qui ne croissent pas ne sont pas lses. Les espces rsistantes ont couramment une pnicillinase (bta-lactamase). Pentose-phosphates (Voie des) - Voie d'utilisation du glucose dont le point de branchement avec la glycolyse est le glucose-6-phosphate (qui est en mme temps le point de dpart de la voie d'ENTNER-DOUDOROFF). Les principaux points de sortie sont le 3-phosphoglycraldhyde (G3P) vers le pyruvate, l'rythrose-4P prcurseur des acides amins aromatiques, le ribose5P utilis dans la synthse des nuclotides. Enfin l'oxydation du glucose-6P est gnratrice de NADPH. Le tableau est le cycle chez la levure de bire. Le cercle blanc symbolise la transaldolase, les cercles noirs les transctolases 1 et 2.
glucose NADP+ glucose-6P NADP 6-phosphogluconate CO2 NADP+ NADPH ribulose-5P
fructose-6 P
2
rythrose-4P sdoheptulose-7P
xylulose5P
G3P
ribose-5P
PEP - Phosphonolpyruvate. Peptidoglycanes - Polymres complexes caractristiques de la paroi des eubactries, constitus par un maillage de polysaccharides alterns d'acide N-actylmuramique et de N-actylglucosamine, lis des oligopeptides comportant des acides amins appartenant la fois aux sries D et L. Les peptidoglycanes contractent des liaisons covalentes avec des protines de la membrane externe chez les bactries Gram-ngatives. Appels aussi murines. Priplasme - Dans les bactries Gram-ngatives, dsigne lespace log entre la membrane interne cytoplasmique et la membrane externe. La premire est le sige de transports dlectrons, de la permabilit slective et d'activits enzymatiques lies la conservation de lnergie ou des synthses. Dans le priplasme se trouvent les peptidoglycanes, des protines de transport, des enzymes dtermines dont la prsence est utilise comme marqueur (phosphatase alcaline ou PhoA, 5'-nuclotidase, -lactamase, protines de transport des systmes ABC, nitrite rductase, certaines dshalognases) La plupart de ces protines sont synthtises sous forme d'un prcurseur porteur d'une squence additionnelle du ct N-terminal, et celle-ci est limine au cours de la sortie dans le priplasme. Le compartiment priplasmique permet la cellule de disposer des macromolcules fonctionnant au dehors du cytoplasme, sans risquer de les voir svader dans le milieu ambiant, et de faire barrire par sa membrane externe la pntration dagents extrieurs, notamment des protines et des antibiotiques. Permase - Dans sa dfinition ancienne claire par l'tude du transport du lactose (A. KEPS, J. MONOD ), protine de la membrane interne fixant spcifiquement un substrat extrieur et catalysant son transport actif vers le cytoplasme par couplage avec le potentiel membranaire (ventuellement comme symporteur). Terme souvent tendu aux systmes catalysant un transport actif l'aide de plusieurs protines dont un rcepteur priplasmique,
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le couplage tant alors gnralement effectu par hydrolyse d'ATP (comme les transporteurs ABC). Certains auteurs dsignent alors indistinctement par permase (et peut-tre tort) tout systme bactrien de transport. Peroxydases - Catalysent loxydation de substrats varis avec une large spcificit, en utilisant le peroxyde dhydrogne comme oxydant. En majorit hminiques. La molcule de peroxyde commence par oxyder le fer et la porphyrine, qui oxydent leur tour le substrat lectron par lectron. D'autres peroxydases, dont certaines haloperoxydases, fonctionnent avec du vanadium. Les peroxydases engendrent communment des radicaux, les composs forms donnant lieu des ractions secondaires de polymrisation conduisant des produits colors. Peroxyde dhydrogne - H2O2. Produit naturel, substrat de la catalase et des peroxydases, fabriqu aussi par lindustrie raison de plus de 500 000 tonnes par an (en tant que 100%) pour ses multiples applications. Gnre facilement des radicaux hydroxyle par catalyse avec Fe(II). Parmi les composs les plus oxydants sont alors dans la hirarchie : fluor > radical OH. > ozone > peroxyde dhydrogne > permanganate > dioxyde de chlore > chlore Peroxysomes - Particules subcellulaires prsentes dans la plupart des cellules eucaryotiques, entoures dune membrane, souvent en contact troit avec le rticulum endoplasmique, renfermant la catalase, D-aminoacide oxydase, diverses oxydases, des enzymes du catabolisme des acides gras et autres protines (une cinquantaine dans les peroxysomes de la cellule animale). Les peroxysomes sont considrs comme des reliques de structures o seffectuaient des oxydations sur O2 et rendues obsoltes par lavnement des mitochondries. La multiplication des peroxysomes et la synthse de leurs protines sont commandes et rgules par des gnes du noyau. Des peroxysomes spcialiss existent dans le monde vgtal, participent la photorespiration ou effectuent le cycle du glyoxylate (glyoxysomes), notamment au cours de la germination dans le mtabolisme des triglycrides. Pesticide - Compos utilis pour lutter contre des vgtaux ou des animaux jugs nuisibles directement ou indirectement lactivit humaine. Ils sont dsigns selon les cas comme insecticides, acaricides, nmaticides, fongicides, rodenticides ou herbicides. Ptrole brut - On y distingue trois familles chimiques de base : Les paraffines. Les hydrocarbures les plus courants de la srie dominante sont des alcanes chane droite, CnH2n+2, Liquides temprature ordinaire mais bouillant entre 40 et 200C, quivalent aux composants principaux de lessence. Les naphtnes (CnH2n) correspondent une srie cyclique sature, abondants dans les fractions lourdes. Les aromatiques, le plus commun tant le benzne. Les aromatiques ne sont prsents quen pourcentage restreint dans la majorit des ptroles bruts. cela sajoutent des matires organiques qui sont des restes biologiques fossiles (krognes). Le ptrole contient en outre des lments minraux, du soufre (de 0,05 2% en poids), de loxygne et de lazote. On trouve galement des mtaux, en particulier du vanadium et du nickel. Dans la hirarchie des fractions spares par leur point dbullition : les thers de ptrole, essence, krosne, gazole, huiles de graissage, huiles lourdes rsiduelles, bitume, paraffine. La composition des ptroles bruts varie normment en fonction du lieu dextraction. Les ptroles les plus denses sont gnralement ceux qui ont le plus de soufre. Dans le commerce international, le ptrole est mesur en barils contenant chacun 42 gallons US. Une tonne de brut (systme mtrique) correspond environ 7,2 barils US. Phnatole - Ethoxybenzne. Phnoxyactates - Famille dherbicides comprenant notamment le 2,4-D et le 2,4,5-T Phromone - Substance scrte l'extrieur d'un organisme et reue par un autre individu de la mme espce, o elle dclenche une action spcifique, par exemple un comportement ou un dveloppement particulier (KARLSON P & LSCHER M (1959) Nature 183 : 55-56). PhoR - Protine rgulatrice caractrise chez E. coli, insre dans la membrane, contrlant le rgulon Pho et fonctionnant comme dtecteur de phosphate. Quand celui-ci est abondant, elle rprime l'expression des gnes de transport pst si ces derniers sont fonctionnels.
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En phosphate rare, elle agit comme kinase sur la protine PhoB, formant avec elle un systme rgulateur classique deux composants. PhoB phosphoryle agit son tour comme activateur de transcription pour un certain nombre de gnes impliqus dans le mtabolisme du phosphate. PhoR en phosphate abondant active PhoU qui dphosphoryle PhoB. Un autre systme command par CreC/CreB commande galement l'activation de PhoB. L'une des protines rgles par PhoR est la phosphatase alcaline (PhoA), prsente chez E. coli ; elle se trouve dans le priplasme. Le rgulon Pho de E. coli contrle 31 gnes rpartis dans au moins 5 oprons. Phosphate minral - Gnralement limitant pour la croissance de la microflore et des vgtaux dans les sols et milieux aquatiques. Le dversement de phosphates par lactivit humaine facilite leutrophisation des lacs et cours deau. Les phosphates sont peu mobiles dans les sols, car les formes insolubles peuvent reprsenter 95-99% du phosphore total. La mobilit est augmente en milieu alcalin. Une source tellurique de phosphate est la fluoroapatite (3 Ca3(PO4)2,CaF2). Le calcium tend se fixer la surface des oxydes de fer et daluminium, facilitant la libration du phosphate. Les micro-organismes contribuent solubiliser le phosphate par des acides (lactique, citrique, oxalique, glycolique) et leur activit est essentielle au niveau de la rhizosphre. En outre ils recyclent les phosphates organiques contenus dans les vgtaux morts. Les plantes avides de phosphate (en particulier des vgtaux cultivs, luzerne, laitue, pomme de terre...) bnficient de lactivit microbienne et fongique autour de leurs racines, rcuprent le phosphore contenu dans les cellules mortes et lassimilent sous forme dorthophosphate (H2PO4). Les acides humiques et fulviques du sol facilitent aussi la libration de lorthophosphate en pigeant le calcium, le fer et laluminium (GREENLAND DJ & HAYES MHB (1981) in "Chemistry of Soil Processes", John Wiley & Sons, Chichester : 1-21). Phospholipides - Lipides contenant au moins un groupe phosphate substitu et deux acides gras lis par liaison ester un polyol tel que le glycrol. Certains phospholipides peuvent renfermer des liaisons thers ou amidiques, et contenir un alcool de structure complexe. Les phospholipides sont des constituants lipidiques majeurs des membranes biologiques. Phosphotransfrase (Transport) - Systme de transport actif des sucres tirant son nergie du PEP et tudi notamment chez les entrobactries. Il comporte trois parties : une protine cytoplasmique ou enzyme I qui sautophosphoryle avec le PEP comme donneur ; la protine HPr, qui est phosphoryle par lenzyme I, laquelle s'autophosphoryle avec le PEP comme donneur ; une enzyme II spcifique dun sucre (il y en a une pour le glucose, une pour le mannitol, plus dune dizaine en tout) qui est le vritable transporteur. Lenzyme II est phosphoryle par l'intermdiaire d'une protine III dans le cas du glucose, directement dans le cas du transporteur du mannitol. L'enzyme II fait passer le substrat vers lintrieur de la cellule en le phosphorylant. Dans le cas du glucose, il apparat ainsi du glucose-6P qui est directement mtabolisable. Quand il n'y a pas de glucose transporter, la protine III est phosphoryle au maximum et elle active l'adnyl cyclase, l'enzyme gnratrice de l'AMP cyclique. Quand la protine III est faiblement phosphoryle parce que l'enzyme II fait rentrer activement du glucose et tire elle tout le courant de phosphate, la synthse d'AMP cyclique est ralentie et en mme temps il y activation de certaines permases, comme celle du lactose. Voir aussi HPr, Rpression catabolique. Photo-autotrophe, photo-htrotrophe - Voir Phototrophe. Photorespiration - Consommation d'O2 lie la Rubisco. Voir Rubisco. Photosynthse - Mcanisme physiologique permettant l'utilisation de l'nergie lumineuse pour la synthse de molcules organiques partir de CO2 (cas gnral) ou de molcules simples comme source de carbone. Phototrophe - Organisme utilisant la lumire comme source d'nergie pour sa croissance. Cette utilisation est selon les espces obligatoire, ou facultative s'il existe une autre source d'nergie en l'absence de lumire. Un photo-autotrophe utilise le CO2 comme seule source de carbone. Un photo-htrotrophe utilise simultanment ou exclusivement une autre source
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de carbone que le CO2. Certaines bactries, comme les pourpres non sulfureuses, peuvent passer alternativement du mode photo-autotrophe au mode photo-htrotrophe en fonction des conditions du milieu. Phratique - Voir Nappe phratique. Phycobilines - Pigments ttrapyrroliques des cyanobactries, attachs par liens covalents aux phycobiliprotines, faisant partie des pigments antennaires (collecteurs de l'nergie lumineuse) autour du PS2 des cyanobactries. Leur rpartition dans les phycobilisomes permet une adaptation spectrale la lumire. Protine Allophycocyanine B Allophycocyanine Phycocyanine C Phycocyanine R Phycorythrocyanine Phycorythrine C Phycorythrines B et R Phycobilines Phycocyanobiline Phycocyanobiline Phycocyanobiline Phycocyanobiline et Phycorythrobiline Phycocyanobiline et Cryptovioline Phycorythrobiline Phycourobiline et Phycocyanobiline Maximum d'absorption (nm) 670 650 620 617 568 565 546, 565 Maximum d'mission de fluorescence (nm) 680 660 648 642 625 576 576
Phycobilisomes - Complexes antennaires spciaux associs au PS2 des cyanobactries et des rhodophytes (algues rouges), renfermant des phycobilines lies des protines de plusieurs sortes, selon un plan d'organisation caractristique. Les phycobilisomes varient en extension et en composition en fonction de la lumire incidente et de sa couleur (adaptation chromatique). Le spectre d'absorption des phycobilisomes complte grosso modo celui de la chlorophylle a. Phylloquinone - Voir Mnaquinones. Phytate - Myo-inositol hexaphosphate (IP6) appel aussi acide phytique. Anti-oxydant et rserve de phosphore chez les plantes, notamment les crales. Peu digr par le btail. Les sels de magnsium et de calcium s'appellent phytine. Phytochlatines (PC) - Polypeptides vgtaux forms par condensation multiple partir du glutathion, de structure (-Glu-Cys)n-Gly, o n > 1. Ces constituants font partie des mtallothionines de classe III, prsentes dans les plantes, les algues et les levures, absentes chez les animaux. Faits par la PC-synthase, une dipeptidyl transfrase (EC 2.3.2.15). Celle-ci est active par un mtal. Les complexes PC-mtal gagnent les vacuoles servant de lieu de stockage. Phytochrome - Pigment vgtal quasi universel proche de la phycocyanine C des cyanobactries, permet le rglage de certaines fonctions physiologiques avec la lumire, existe sous 2 formes. L'une, la plus stable, absorbe surtout 660 nm (lumire rouge), et est induite par le rouge, l'autre 730 nm, moins stable, et prdomine dans le rouge lointain. Les phytochromes rglent la floraison et la germination, interviennent dans la photopriode. Par exemple la germination des graines de laitue est stimule en lumire rouge, inhibe par le rouge lointain. Phytoplancton - Plancton pratiquant la photosynthse, comprenant des cyanobactries, et des algues eucaryotiques unicellulaires. Phytoremdiation - Emploi des plantes pour dcontaminer les sols et eaux souterraines. Photosystme (PS) - Ensemble form par un centre ractionnel (CR) et un ensemble de complexes antennaires collectant l'nergie lumineuse. Le centre ractionnel fait la
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conversion de cette nergie en potentiel chimique. On dsigne parfois un photosystme comme le centre ractionnel lui-mme, par la lettre P suivi d'un nombre : P700, P870 Picoplancton - Ensemble des organismes planctoniques dont les dimensions vont de 0,2 2 m seulement. Piricidine A - Antibiotique analogue de l'ubiquinone (modifie sur chane latrale). Pili (ou pilus au singulier) - Filaments protiques plus ou moins rigides, mis la surface des bactries, intervenant dans leur adhsion un support (adhsines) ou dans la conjugaison entre cellules (pili de type F). Servent parfois de rcepteurs des virus. Les pili de type IV sont trouvs sur de nombreuses espces bactriennes, Pseudomonas, Vibrio, Neisseria, Myxococcus. Leur longueur est de l'ordre de 4 m, sur un diamtre de 6 nm. Constitus de sous-units majoritaires de piline, selon un arrangement hlicodal de 5 sous-units par tour. pKa - Si Ka est la constante de dissociation d'un acide AH, c'est--dire la constante de l'quilibre AH A + H+ (le proton tant accept par une molcule d'eau en solution aqueuse), pKa = logKa. L'quilibre tant dplac en fonction du pH, celui-ci rgle l'ionisation des groupes dissociables. Pour les groupes acides (donneurs de protons) tels que la fonction carboxylique, l'quilibre RCOOH RCOO + H+ correspond un pKa allant le plus souvent de 3 6, et ces fonctions sont gnralement ionises pH neutre. Pour une amine aliphatique primaire R-NH2, l'quilibre R-NH3+ R-NH2 + H+ a un pKa suprieur 8, et ces fonctions sont le plus souvent cationiques pH neutre. Planctomyces - Bactries bourgeonnantes, formant des colonies enrobes de glycocalyx la surface des algues, des cyanobactries et des plantes dans les eaux douces et marines. Caractrises par l'absence d'une paroi de peptidiglycane, mais une couche protique (couche S). Le cycle comporte une phase mobile flagelle et une phase fixe. Vivent par htrotrophie, arobies facultatives, habitats trs divers, des milieux trs pauvres aux eaux fortement pollues. Plasmide - Molcule d'ADN bicatnaire, le plus souvent circulaire, capable de se rpliquer dans la cellule indpendamment du gnome principal. Il existe aussi des plasmides linaires non referms sur eux-mmes. La taille des plasmides varie de quelques milliers de pdb plus de 100 000 (mgaplasmides). Peut tre transmis de cellule cellule par conjugaison et s'insrer ventuellement dans le chromosome bactrien. Le nombre d'exemplaires du plasmide par cellule est variable et rgul. Les plasmides ne transportent pas des gnes indispensables la croissance et la reproduction cellulaire, mais souvent des gnes porteurs de potentialits nouvelles, comme la rsistance des antibiotiques ou des mtaux, la dgradation de substrats "exotiques" ne faisant pas partie du menu habituel de l'espce, la virulence (chez les pathognes) Une revue exhaustive de la rplication et du contrle des plasmides circulaires bactriens a t publie par DEL SOLAR G et coll. (1998) Microbiol. Molec. Biology Rev. 62 : 434-464. Plastique (matire) - Une matire plastique a pour proprit physique de se dformer uniquement pour des contraintes mcaniques suprieures une valeur seuil. Ce sont toujours des polymres. Dans la pratique on rserve le terme de "plastique" aux matriaux synthtiss par l'homme partir de monomres naturels ou artificiels. Voir Elastomre. Plastocyanine - Petite protine contenant du cuivre, fonctionnant comme transporteur d'lectrons dans la photosynthse des chloroplastes et cyanobactries, faisant partie comme l'azurine de la famille des cuproprotines transporteurs d'lectrons. Voir Azurine. Plastoquinone - Quinone lipophile membranaire de structure similaire celle des ubiquinones, mais avec remplacement des groupes mthoxyles par des mthyles. Mme fonction, mais dans la photosynthse oxygnique des chloroplastes et cyanobactries. PMS - Phnazine mthosulfate. Colorant jaune rduit en PMSH2 par de nombreuses enzymes. PMSH2 se roxyde rapidement lair, ou rduit encore plus rapidement le DCIP, avec lequel il est souvent utilis dans les tests. Inversement, lorquune dshydrognase inactive sur O2 rduit le PMS, on peut transformer commodment lenzyme en oxydase puisquon obtient alors la chane doxydorductions substrat PMS O2. La solution de
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PMS doit tre prpare immdiatement avant lexprience. Elle est sensible la lumire, peu stable et devient inactive (avec une couleur verte intense). Polaire (mutation) - Mutation ayant pour effet de bloquer l'expression de l'information en aval, en provoquant un arrt de la transcription ou en introduisant sur son parcours un codon Stop. Polaire (substance) - Une entit chimique est dite polaire lorqu'elle porte une charge ionique et contient des liaisons polaires tablies entre atomes d'lectrongativit diffrente, comme C et O, O et H, et possdant un moment dipolaire. Les substances polaires tendent tre solubles dans l'eau car les molcules d'eau sont elles-mmes polaires (attractions dipoledipole), et la solubilit peut tre renforce par l'tablissement de ponts hydrogne entre le solut et le solvant. Une forte solubilit d'un compos polaire dans l'eau n'est pas un caractre automatique, quand les molcules de solut tendent s'associer entre elles de telle manire que l'nergie mise en jeu est plus forte que l'nergie de solvatation du solut par le solvant. Exemples de produits polaires peu solubles : la tyrosine ( pH neutre), la cellulose. Polymrisation radicalaire - Caractristique des polymrisations de type vinylique (styrne, acrylamide, chlorure de vinyle). Prsente les 3 phases habituelles : amorage, longation, terminaison. L'amorage est la transformation du monomre A en A. L'longation dmarre par addition du radical sur une molcule non radicalaire pour donner un dimre, qui devient lui-mme un radical AA. Celui-ci ragit nouveau avec un monomre pour donner AAA et ainsi de suite. La raction d'arrt fait ragir une chane en cours de croissance AAA avec un autre radical A, R, oxygne), qui le neutralise : AAA + A AAAA. Polysulfure rductase - EC 1.8.99.- Chez Wollinella succinogenes, utilise comme accepteur final le polysulfure form chimiquement partir du soufre lmentaire et du sulfure. Pompe protons - Systme membranaire, souvent une ATPase ou un cytochrome, qui transmet les protons dans une direction prfrentielle travers la membrane. Le rsultat est un couplage nergtique, transformant l'nergie ATP ou celle d'une oxydation en force protonmotrice. Certaines ATPases sont des pompes contribuant l'acidification des vacuoles et lysosomes. Porines - Protines mnageant un canal traversant la membrane externe des bactries Gramngatives, facilitant le passage, souvent faiblement slectif, d'entits hydrophiles : ions, molcules de petite taille ou mme polypeptides. Etudies en dtail chez les entrobactries. OmpF et OmpC sont des protines abondantes (2% des protines cellulaires), participant au contrle de la pression osmotique cellulaire. Leur synthse est rgule par le systme deux composants EnvZ/OmpR. Le rapport OmpF/OmpC est lev en pression osmotique faible, bas dans le cas contraire. Ces porines ont une structure cylindrique spciale traversant la membrane externe par 16 barreaux bta antiparallles, mnageant une ouverture centrale dont le diamtre est lgrement suprieur 1 nm. La squence du gne montre habituellement un segment supplmentaire codant pour un peptide signal (voir Signal). Porphyrine - Vaste famille de pigments et cofacteurs qui prsentent ltat libre et en lumire ultraviolette une vive fluorescence rouge. Drivs ttrapyrroliques cycliques, dont les formules peuvent tre ramenes celle de la porphine. Sont synthtises l'intrieur des cellules, la principale voie partant du succinate et de la glycine, se diversifiant dans plusieurs directions : porphyrines hminiques, sirohme, chlorophylle, corrinodes, F430. L'activit biologique des porphyrines fait gnralement appel l'association avec un ion mtallique. Les complexes forms avec Fe, Cu, Ni et Co ne fluorescent pas, contrairement ceux de Zn, Mg et Cd. Le tableau ci-contre rassemble quelques exemples importants. Potentiel redox (Potentiel d'oxydorduction) - donn en millivolts (mV) par la relation E' = E' + k log [Ox]/[Red] (pH 7), 25C, conditions normales, o k vaut peu prs 59 pour un seul lectron transfr, la moiti pour 2 lectrons transfrs. E' est le potentiel standard obtenu quand il y a autant de forme oxyde [Ox] que de forme rduite [Red]. Quand la transformation est mole pour mole, E' est en mme temps le potentiel de demi-rduction ou E'm.
GLOSSAIRE Ion
Fe
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Hmoglobines, myoglobines, cytochromes, peroxydases hminiques, catalases, P450, chloroperoxydase Le noyau de base commun est la protoporphyrine IX Cytochrome bo, quinol oxydase, cytochrome c554 (oxydation de l'ammoniac), cytochromes c de la photosynthse Cytochrome c oxydases des chanes respiratoires Cytochrome bo, quinol oxydase bactrienne Cytochrome cd, nitrite rductase Nitrite et sulfite rductases Hydroxylamine oxydorductase Photosystmes, pigments antennaires de la photosynthse Cobamides, cobalamines, vitamine B12, tablissement et transferts de liaisons entre lments mono-carbons, mthanisation Facteur de la mthanisation
Porphyrine
Hme B
Fe Fe Fe Fe Fe Fe Mg Co Ni
Hme C Hme A Hme O Hme D Sirohme P460 Chlorophylles Corrinodes F430
Pourriture blanche - Terme dsignant les champignons basidiomyctes filamenteux qui ont la proprit de dtruire la fois les polysaccharides et la lignine du bois (dcoloration) laide denzymes extracellulaires qui sont des oxydases gnratrices de peroxyde et des peroxydases (LiP et MnP). Espce la plus tudie : Phanerochaete chrysosporium. ppm - partie par million (en units de masse). ppmv - partie par million en volume. PQQ - Pyrroloquinoline quinone. Cofacteur de dshydrognases extracellulaires ou membranaires actives sur mthanol, divers alcools et sucres. Synthtis partir de glutamate et de tyrosine, appropri des mcanismes radicalaires. Produit rouge vif trs stable, changeable entre micro-organismes dans le sol o sa prsence interviendrait dans l'quilibre entre diverses espces bactriennes. Voir GOODWIN PM & ANTHONY C (1998) Adv. Microb. Physiol. 40 : 1-80. Promoteur - Portion d'ADN reconnue par un facteur sigma, autorisant l'attachement de l'ARNpolymrase et le dmarrage de la transcription en ARN (parfois avec l'aide de facteurs supplmentaires). Il n'y a pas de squence unique de promoteur, mais un consensus o certaines bases et leur espacement jouent un rle critique. Les promoteurs appartiennent plusieurs familles adaptes la reconnaissance par un facteur sigma dtermin. Les promoteurs les plus courants chez les bactries sont reconnus par le sigma-70. Ils sont caractriss par deux "botes" centres sur les positions 10 et 35, places en amont du dpart de la transcription, et non transcrites en ARN. La premire facilite l'ouverture de la double hlice d'ADN, prlude l'amorage. La seconde est plus oriente vers la reconnaissance du promoteur. La squence d'un promoteur est toujours reprsente sur le brin d'ADN dit "signifiant", sur lequel sera galement indiqu la squence des gnes placs en aval. Le promoteur dtermine donc dans quel sens l'ARN-polymrase va parcourir l'ADN servant de modle. Prophage - Gnome d'un bactriophage intgr au chromosome d'une bactrie hte dite lysogne. Voir Lysognie. Prosthque - Prolongement cellulaire plus ou moins effil, comportant du cytoplasme en quantit rduite, la membrane plasmique et la paroi. Les bactries prosthque sont gnralement fixes un support solide par leur base et ont une division asymtrique. Une nouvelle cellule se forme par bourgeonnement l'extrmit de la prosthque. Elle est flagelle, et aprs division nage vers un nouveau support sur lequel elle se diffrenciera nouveau. Ce mode de propagation est bien reprsent par les Caulobacter, qui adhrent des plantes, d'autres bactries ou des particules du sol. Elles se dveloppent en gnral
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dans des milieux trs pauvres, et l'allongement de leur prosthque en fin filament leur permet d'augmenter la surface de leur membrane et de mieux capter les lments dissous. Les Hyphomicrobium appartiennent aussi cette catgorie. Les cellules fixes peuvent bourgeonner rptition des cellules migratrices flagelles. Les Hyphomicrobium sont des mthylotrophes facultatifs. Ils peuvent se dvelopper sur des milieux extrmement pauvres en source carbone, et probablement en captant des traces de composs apports par l'atmosphre. Ces bactries se dveloppent facilement dans un bain marie de laboratoire. Protase - Catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques dans les protines. La plupart des protases ont une slectivit plus ou moins accentue, attaquant prfrentiellement les liaisons peptidiques localises dans un environnement molculaire dfini, soit par la squence des acides amins au niveau de la coupure, soit par l'organisation spatiale de la cible. La plupart des protases ont en mme temps une activit comme estrase. Il y a quatre grandes classes de protases en fonction du nuclophile de leur site ractionnel : protases srine (dont fait partie la trypsine) ; protases cystine (comme la papane) ; protases aspartate (comme la pepsine) ; mtalloprotases (du type thermolysine). Protases cystine - Voir Protase. Protases srine - Les archtypes sont la trypsine et la chymotrypsine. La srine du site actif acquiert un pouvoir nuclophile fort dans un environnement spcial, et se comporte comme un alcoolate. Elle attaque le carbonyle de la liaison rompre, qui est un lien peptidique ou amidique (CONH), ou ester (COOR). tablit un lien, covalent temporaire qui est scind par hydrolyse dans une deuxime phase. Il y a un nombre immense de ces enzymes dans la nature, o elles ont des fonctions trs diverses. Elles sont caractrises par la "triade" de trois rsidus essentiels, His, Asp et Ser disposs dans cet ordre dans la vaste sous-famille de protases homologues o se trouve la trypsine. Dans une autre sousfamille, l'ordre dans la squence est diffrent (Asp, His, Ser) et rsulte d'une volution indpendante et convergente. On y trouve par exemple des protases des bactries Grampositives, dont la subtilisine est l'exemple le plus connu. Protine A - Rcepteur trs stable port la surface de Staphylococcus aureus, liant efficacement les immunoglobulines, notamment les IgGs (sur leur partie Fc). Outil de recherche classique pour des marquages par fluorescence, tests ELISA, chromatographies d'affinit. Protine kinase - Enzyme catalysant la phosphorylation par l'ATP des sites spcifiques d'une ou plusieurs protines, qui sont actives ou inhibes selon les cas. Les cascades rgulatrices par protine kinases sont particulirement dveloppes chez les eucaryotes, phosphorylent en gnral sur srine dans les rgulations du mtabolisme, sur histidine dans le contrle de la division cellulaire et de la diffrenciation. Des protines phosphatases renversent l'action des kinases. Protobactries - Font partie des eubactries. Appeles aussi bactries pourpres, ensemble trs important rassemblant les bactries pourpres photosynthtiques et les formes apparentes non photosynthtiques, et contenant la majorit des bactries dites Gram-ngatives. On les distingue en sous-groupes , , et dans un arbre gnalogique (ci-contre) calcul sur la base de l'ARN 16 S (WOESE C (1987) Microbiol. Rev. 51 : 221-271). Protome - Ensemble des protines codes par le gnome d'une cellule. Protiste - Eucaryote vivant sous forme de cellules isoles ou groupes dans des colonies simples. Les protistes reprsentent un groupe htrogne drivant des premiers eucaryotes. On peut distinguer sommairement les protozoaires proches des animaux, les algues unicellulaires, proches des vgtaux, et les fongiformes proches des myctes. Protocatchuique (Acide) - Acide 3,4-dihydroxybenzoque. Protonmotrice (Force) - Note p, exprime en volts ou millivolts. Equivalent d'une force lectromotrice, les lectrons tant remplacs par des protons. La force protomotrice au niveau d'une biomembrane est le potentiel qui favorise le passage des protons d'un ct l'autre.
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Rhodocyclus purpureus Rhodocyclus gelatinosa
Chromatium vinosum Legionella pneumophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter calcoaceticus Escherichia coli Myxococcus xanthus Desulfovibrio desulfuricans Bdellovibrio stolpii Desulfotobacter postgatei Desulfuromonas acetoxidans
nitrosolobus multiformis Spirillum volutans Neisseria ghonoraeae Rhodobacter capsulatum Rhodopseudomonas acidophila Rhodopseudomonas palustris Agrobacterium tumefaciens Rhodospirillum rubrum
Arbre des bactries pourpres
Protonophore - Compos rendant une membrane biologique permable aux protons. Protoporphyrine IX - Porphyrine qui devient lhme B aprs adjonction du fer, prsente dans lhmoglobine, les cytochromes b et P450, la catalase et les peroxydases. Pseudo-azurine - Transporteur dlectrons (Alcaligenes faecalis) de structure voisine de celle de lazurine, mais de squence assez diffrente. Donneur de la nitrite rductase. Pseudomonas - Bactries Gram-ngatives (gamma-protobactries) en forme de btonnet, un ou plusieurs flagelles une extrmit. Essentiellement arobies, en principe ne font pas de fermentations mais la dnitrification est rpandue dans le genre. Certaines espces ont une sorte de fermentation par catabolisme de larginine, beaucoup font du poly-hydroxybutyrate. La taxonomie des Pseudomonas a t revue la faveur des analyses dARN 16S. Un groupe entier comprenant des Pseudomonas pathognes pour les animaux et les plantes a t rebaptis Burkholderia. Les Pseudomonas sont remarquables par limmense diversit de leur habitat et les trs nombreuses oxydations et biodgradations que ralisent certaines espces. Les Pseudomonas fluorescents comme P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. syringae, ne font pas de poly-hydroxybutyrate, mais laissent diffuser un pigment fluorescent. Psychrophile - Espce croissant de 0 20C, avec optimum au-dessous de 15C. Les psychrophiles extrmes se dveloppent au-dessous de 5C ou sur la neige (algues, lichens) et dans l'eau en surfusion, la vedette revenant aux organismes observs dans le lac Vostok 3600 m sous la surface de la calotte glaciaire de l'Antarctique, laissant supposer la possibilit d'une forme de vie existant sous l'ocan gel de la surface d'Europa, un satellite de Jupiter. Psychrotrophe - Espce croissant de 0 30-35C. Putidardoxine - Ferrdoxine noyau fer-soufre de type [2Fe-2S] li 4 rsidus de cystine, commune dans les oxygnases bactriennes. Elle intervient notamment dans l'oxygnation du camphre et reprsente une famille de ferrdoxines procaryotiques souvent plus ou moins interchangeables exprimentalement, dans laquelle on trouve aussi l'adrnodoxine des mitochondries des glandes surrnales. Leur squence renferme un consensus Cys-xxxxx-Cysxx-Cys-x(n)-Cys. Pyridoxal phosphate - Coenzyme driv de la vitamine B6, intervenant dans de nombreuses conversions mtaboliques des acides amins, ncessaire au fonctionnement des
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aminotransfrases, des racmases et dcarboxylases des acides amins, de la L-srinehydroxymthyl transfrase, de la L-tryptophane synthase, de la tryptophanase Pyruvate dcarboxylase - Dans la fermentation alcoolique de la levure, transforme lacide pyruvique (CH3-CO-COOH) en actaldhyde (CH3-CHO) et CO2. Le cofacteur caractristique est le TPP. Le plus souvent la pyruvate dcarboxylase est intgre dans un complexe multienzymatique o laldhyde est oxyd et transfr sur coenzyme A ou du phosphate pour donner de lactyl-CoA ou de lactyl-phosphate. Pyruvate formiate lyase - Catalyse : Pyruvate + CoA Formiate + Actyl-CoA. Lenzyme (EC 2.3.1.54) ou PFL est bien connue dans la fermentation acide mixte de E. coli, et le formiate est une source dlectrons pour la dnitrification. Son site actif a deux thiols adjacents. Mais sa particularit remarquable est davoir un fonctionnement radicalaire. Un rsidu de glycine est transform en radical par une protine dactivation ou PFL activase, contenant un noyau fer-soufre et une flavine rduite comme rducteur. Lactivase utilise la S-adnosyl-mthionine comme donneur de radical (WAGNER et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm 254 : 306-310). Le radical glycyle transforme en radical lun des deux thiols essentiels du site actif. Quinol - Quinone rduite deux lectrons, appele aussi hydroquinone. Quinol oxydase - Enzyme respiratoire utilisant O2 comme accepteur et recevant ses lectrons directement partir dune quinone rduite (quinol) sans passer par un cytochrome c. Quinones respiratoires - Transporteurs dlectrons exclusivement membranaires, drivs de la benzoquinone (ubiquinones) ou naphtoquinone (menaquinones). Oscillent entre ltat oxyd (quinone), ltat rduit (quinol ou hydroquinone) avec un stade intermdiaire radicalaire (semiquinone).Les menaquinones dont le potentiel redox est plus bas que celui des ubiquinones se rencontrent particulirement dans les chanes anarobies. La structure chimique contient greffe sur le noyau une longue chane isoprnode contenant un nombre variable dunits en C5 et confrant la molcule son caractre lipophile marqu. Racmase - Enzyme de la classe 5 (une isomrase EC 5.x.x.x) qui transforme une molcule optiquement active en son inverse par une raction rversible. Raman (spectre) - Technique de spectromtrie infrarouge examinant la lumire diffuse perpendiculairement la radiation incidente. La lumire diffuse est majoritairement la mme frquence que la radiation incidente (diffusion RALEIGH) et comporte des radiations beaucoup plus faibles comportant des carts de frquence par rapport la prcdente (raies RAMAN). Les carts de frquence donnent une indication sur les mouvements de vibration des molcules et aident en mme temps les caractriser. Rcepteur - Protine capable de capter rversiblement des ligands dtermins, sans les transformer. Dans la plupart des cas, la liaison fait natre un signal qui sera peru par dautres composants cellulaires. Dans des cas particuliers le ligand est remplac par la lumire (photorcepteurs). Beaucoup de rcepteurs sont membranaires, reconnaissent spcifiquement des ligands extrieurs et prviennent de leur prsence la machinerie cellulaire. Le signal engendr apparat sous forme dune modification conformationnelle du rcepteur (avec dimrisation ventuelle) qui est alors reconnue par dautres protines venant son contact, ou peut faire apparatre une activit enzymatique sur le rcepteur lui-mme. Dans ce dernier cas le rcepteur activ transmet le signal en modifiant dautres protines, souvent en agissant comme kinase. Inversement on connat des enzymes qui fonctionnent comme rcepteur dans des situations particulires. Au point de vue des mcanismes molculaires mis en jeu, il ny a pas de dmarcation rigoureuse entre rcepteurs et enzymes. Recombinaison - Mcanisme par lequel un nouvel ADN recombinant est form partir de portions provenant de deux ADN parents. Chez les eucaryotes le processus s'accompagne d'un change entre parties de chromosomes ou crossing over. Il en rsulte un changement dans l'agencement des gnes et habituellement une modification du phnotype. La recombinaison homologue met en jeu un change rciproque entre une paire de squences homologues, par un mcanisme de cassure et de runion command par des facteurs enzymatiques dont RecA. Une homologie au moins partielle entre les squences partenaires y joue un rle essentiel et dtermine le lieu o se fera l'change. La recombinaison non
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homologue peut tre spcifique de site et s'observe dans l'insertion d'un ADN viral ou autre un endroit prcis du chromosome bactrien. Ce type de recombinaison implique la coupure transitoire des ADN partenaires sur les deux brins, et leur jonction sans faire intervenir d'hydrolyse d'ATP ou de synthse d'ADN. Le premier cas trs classique de ce type est l'insertion du prophage Lambda dans le gnome du colibacille. D'autres recombinaisons non homologues ne se font pas en des sites dtermins. La transposition est un cas particulier de recombinaison, dite recombinaison rplicative (Tn3) Rductases - Enzymes catalysant la rduction dun substrat en utilisant un donneur dlectrons qui est souvent NADH ou NADPH. Le substrat est organique faible masse molculaire (fumarate, glutathion), macromolculaire (ferrdoxine, cytochrome P450), oxygnase fer non hminique, ou encore minral (Hg2+, nitrate). Les rductases contiennent typiquement une flavine, notamment FAD, ou une dazaflavine comme F420 chez les mthanognes. Rgulation globale - Voir Modulon, Rgulon. Rgulations deux composants - Systmes frquents chez les bactries (on en dnombre dj 62 chez le colibacille) o ils peuvent reprsenter 1% des protines totales. Dans le cas le plus simple, ils sont constitus de deux protines, un capteur et un rgulateur (activateur de transcription). Le capteur reconnat un signal physiologique spcifique et agit comme protine kinase sur lui-mme, en se phosphorylant sur un rsidu dhistidine (histidine kinase). C'est un dimre fonctionnant par trans-phosphorylation, o chaque sous-unit utilise l'ATP pour phosphoryler sur histidine la sous-unit partenaire. Dans les protines fonctionnant comme capteur, on note gnralement la prsence dans leur structure d'un domaine cytoplasmique caractristique appel PAS (voir PAS). Le capteur ainsi phosphoryl se dcharge de son phosphate sur la deuxime protine qui est une phosphotransfrase dont le domaine N-terminal, trs conserv, contient un rsidu d'aspartate phosphorylable. La phosphorylation de l'aspartate dtermine un changement structural qui renforce en gnral la liaison de la protine sur ADN en des sites spcifiques, lui permettant de jouer un rle comme activateur de la transcription. La chane de phosphorylations intermdiaires peut tre allonge par des protines phosphorylables supplmentaires. Ce type de rgulations est moins frquent chez les champignons et les levures, mais existe aussi chez les amibes (Dictyostelium) et les plantes (Arabidopsis), commencer par la rgulation hormonale fonde sur l'thylne. On a identifi chez Arabidopsis au moins 15 gnes rgulateurs de cette catgorie.
a - Systme deux composants

stimulus capteur domaine His H P ADP rponse kinase ATP rgulateur D P effecteur ADN
b - Systme hybride
stimulus capteur H P ADP rponse ATP kinase hybride D P protine relais H P D P ADN effecteur
Systme deux composants
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Chez les eucaryotes en gnral, la rgulation ne se fait pas directement par activation des gnes, mais sur des facteurs situs en amont de cascades rgulatrices plus complexes (MAP kinase). Dans les cas les plus simples chez les procaryotes, la transcription des gnes concerns est alors active (principe a sur le schma). Ces gnes sont groups ventuellement en plusieurs oprons, et forme ce quon appelle un modulon. La cascade des deux composants, capteur et activateur, peut alors mettre en route l'expression de toute une collection de gnes concerns par une grande fonction. Le systme est renvoy son point de dpart aprs dphosphorylation de l'activateur de transcription par une phosphatase. Un tel mode de rgulation, commun chez les bactries, est donc rversible ; il "allume" ou "teint" globalement une collection de gnes en fonction d'une action extrieure : oxygne, pression osmotique, prsence de certaines substances ou d'ions (Voir aussi OmpR, FixL/FixJ). Certains systmes deux composants sont un peu plus compliqus. Une mme protine dite kinase hybride servant de capteur contient aussi un domaine histidine phosphorylable, qui phosphoryle son tour sur histidine une protine servant de relai supplmentaire dans le mcanisme rgulateur (partie b du schma ; voir Hpr). Le modle b se rencontre plus frquemment chez les eucaryotes. Les domaines rgulateurs contenant un aspartate phosphorylable indiqu par D possde en mme temps un pouvoir de phosphatase, qui permet la dsactivation par enlvement du groupe phosphate, dans un laps de temps extrmement variable allant de quelques secondes plusieurs heures. Rgulon - Ensemble doprons bactriens ou de gnes isols, disperss dans le gnome, placs sous la dpendance dun mme systme de contrle - facteur d'amorage (sigma) et promoteurs correspondants, protines rgulatrices spcifiques. Un rgulon correspond typiquement une mme grande fonction physiologique dont le fonctionnement ncessite lintervention simultane de nombreux facteurs : choc thermique, entre en phase stationnaire, mtabolisme azot, carence nutritive, milieux oxydant, surpopulation Voir aussi PhoR. Il peut exister un chevauchement partiel entre rgulons. Par exemple un gne donn activ au sein d'un rgulon sous l'effet d'un signal de stress peut tre activ aussi par un autre rgulateur sous l'effet d'un stress diffrent. Rep (Squences) - Repetitive extragenic palindromic sequences. Plus courtes que les IS (35-40 kb seulement), squences rptitives abondantes dans certains gnomes, rparties irrgulirement, responsables de structures particulires dans l'ADN. Fonction imparfaitement connue, pourrait intervenir dans les recombinaisons et rarrangements adaptatifs du gnome, dans l'attachement de l'ADN la membrane et la fixation de la gyrase (voir Gyrase). Rplicon - Portion d'ADN qu'une cellule sait rpliquer et transmettre sa descendance au cours des divisions. Chez les bactries, le "chromosome" est un grand rplicon. Le gnome de la cellule contient un ou plusieurs rplicons qui sont constitus de molcules d'ADN gantes refermes en cercles covalents. Les plasmides sont des rplicons plus petits distincts des chromosomes. Chaque rplicon contient les signaux ncessaires pour que la rplication dmarre en un point origine, se propage sur le cercle entier et spare les deux copies. Rpresseur - Protine rgulatrice capable de se lier l'ADN en une zone appele oprateur, ayant pour effet de bloquer la transcription des gnes situs en aval, et donc leur expression. Ce blocage est lev ou renforc rversiblement selon les cas, par interaction avec des produits trangers servant de signaux rgulateurs. Par exemple l'expression des gnes de l'utilisation du lactose chez le colibacille est entrave par un rpresseur. En liant un -galactoside, le rpresseur subit un changement de conformation qui rend le blocage moins efficace. Les gnes d'utilisation du lactose sont alors exprims, donc induits, et les -galactosides qui dclenchent cette action sont dsigns comme des inducteurs. Le gne lacZ de l'enzyme essentielle, la -galactosidase de E. coli, est souvent utilis dans des tests de biologie molculaire et recombin avec d'autres gnes en vue d'tudier leur expression. Rpression - Mcanisme inverse de l'induction, a pour effet d'entraver l'expression de un ou plusieurs gnes, gnralement groups en oprons chez les bactries.
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Rpression catabolique - Mcanisme rgulateur qui consiste empcher une bactrie dexprimer des gnes codant pour des enzymes de dgradation, quand le milieu renferme une source carbone plus favorable ou plus directement assimilable par larsenal enzymatique banal de la cellule. La rpression catabolique s'oppose l'induction. Le glucose est souvent une telle source, qui est attaque en priorit. Aussi longtemps quelle nest pas puise, linduction des enzymes de dgradation de la seconde source est inhibe. Do le nom de rpression catabolique, primitivement appele "effet glucose", mais qui n'est pas actionn exclusivement par le glucose. Ce phnomne est responsable de la diauxie, ou croissance en deux temps, qu'on observe ventuellement (mais pas obligatoirement) dans une culture utilisant deux sources carbones. La rpression catabolique de l'opron du lactose s'explique par une chute d'AMP cyclique, dont la protine CAP (ou CRP) a besoin pour activer la transcription. La monte de l'AMP cyclique dans la cellule est un signal correspondant grosso modo un besoin de mobiliser les ressources nergtiques. Quand le glucose est abondant, la chute de l'AMP cyclique dclenche la rpression catabolique de faon ce que le glucose soit utilis en priorit, et ce phnomne est d l'intervention du transporteur de glucose dans le cas de la phosphotransfrase (voir cette rubrique). La rpression catabolique chez E. coli n'est pas dclenche par d'autres substrats de croissance comme le glycrol. De faon gnrale, ce type de contrle est trs frquent dans les biodgradations de substrats naturels ou artificiels, notamment dans l'attaque des xnobiotiques, qui est entrave par la prsence dans le milieu d'un substrat de croissance plus favorable. Rsidu - Terme utilis dans le jargon scientifique avec son sens anglo-saxon, pour dsigner ce qui reste dun acide amin lorsquil est log dans un polypeptide, aprs dpart dune molcule deau pour chaque liaison peptidique forme. Les abrviations standards sont : A Alanine G Glycine M Mthionine S Srine C Cystine H Histidine N Asparagine T Thronine D Aspartate I Isoleucine P Proline V Valine E Glutamate K Lysine Q Glutamine W Tryptophane F Phnylalanine L Leucine R Arginine Y Tyrosine Rsistance mutiple (multidrug resistance MDR) - Complexe priphrique permettant aux bactries d'expulser des substances toxiques, notamment des antibiotiques, coupl avec l'nergie du potentiel de membrane. Le colibacille a au moins une dizaine de MDR, lui permettant de se dfendre contre une gamme trs tendue d'antibiotiques, une situation dtcte chez de nombreuses espces. Chez les Gram-positifs, diverses pompes actionnes par le potentiel membranaire repoussent des cations hydrophobes, tels que le bromure d'thidium ou l'acriflavine. Parmi les MDR du colibacille, les plus tudis sont EmrAB et AcrAB, possdant une protine membranaire (A) et une protine de jonction avec la membrane externe (B). Rsolvase - Enzyme code par transposon, venant seconder l'action de la transposase quand le dplacement se fait avec rplication. Aprs celle-ci, les deux exemplaires de celui-ci restent attachs dans un "co-intgrat". La rsolvase permet de dmler cette association, permettant l'un des exemplaires de rester sur place et l'autre de s'installer ailleurs. Rsorcinol - 1,3-dihydroxybenzne. Respiration - Chane doxydations implantes au moins partiellement dans une membrane biologique, o lnergie des transferts dlectrons est couple ltablissement dun potentiel lectrochimique ou potentiel de membrane, ordinairement par translocation unidirectionnelle de protons ou dions sodium. Les diffrentes respirations sont caractrises par leur accepteur terminal, qui est soit loxygne, soit des composs minraux ou organiques (oxydes dazote, sulfate, DMSO, CO2, Fe(III), fumarate, chlorobenzoate...). Quand loxygne nest pas laccepteur, on considre le phnomne comme une respiration anarobie si il est vrifi quil y a bien couplage avec la construction dun potentiel de membrane, lATP tant form secondairement partir de celui-ci par lATP synthase. Respiration anarobie - Respiration utilisant un accepteur terminal autre que O2.
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Restriction (nuclase de) - Voir Nuclases de restriction. Rhizobactries - Terme gnral dsignant les bactries qui s'associent aux racines des plantes et stimulent la croissance vgtale. Ce sont le plus souvent des assimilateurs d'azote : Azotobacter, Azoarcus , Azospirillum, Herbaspirillum seropedicae, Acetobacter diazotrophicus. Rhizoplane - Surface d'une racine, entoure par la rhizosphre. Rhizosphre - Rgion du sol place au contact immdiat d'une racine, colonise par des bactries et des champignons la faveur des substances mises par la plante et de l'oxygne qu'elle met. La plante bnficie en retour d'lments labors par la microflore, notamment des composs azots et des phosphates solubiliss par leurs partenaires. Rhodanse - Transfrase rpandue dans la nature comme principal agent d'utilisation du thiosulfate (EC 2.8.1.1). Catalyse : S2O32 + A SO32 + AS, o A est un accepteur. Rhodococcus erythropolis - Bactrie appartenant au groupe des actinomyctes, montrant des potentialits intressantes dans les biodgradations et applicables au traitement des eaux uses. Ses parois renferment des glycolipides aux proprits floculantes, dont la partie lipidique a des acides gras ramifis longue chane (mycoliques et mycoliques). Rhodophytes - Algues rouges, caractrises par leur pigment appartenant au groupe des phycobilines, la phycorythrine. Celle-ci absorbe dans le bleu et constitue une adaptation la vie plus grande profondeur. Ribonuclotide rductase - Catalyse le passage du ribose au dsoxyribose dans les nucloside-diphosphates (NDP), ou dans les nucloside-triphosphates (NTP). La rduction du ribose sur le carbone 2, essentielle la formation des prcurseurs dans la synthse de lADN, seffectue par un mcanisme radicalaire. Dans les organismes arobies, la rductase de structure R1R2 (Type I) comporte au repos un radical port par une chane latrale de tyrosine de R2, stabilis par un centre bimtallique contenant du fer (FeOFe). Le site actif contenant deux thiols essentiels est dans R1. Ce dispositif nexiste quen arobiose, car la prsence de dioxygne est indispensable la prparation du radical, catalyse par le centre bi-mtallique. Dans les organismes anarobies, lactivation fait appel dautres solutions. Le substrat est un NTP. Dans le type II, le radical est port par un thiol, et lactivation utilise ladnosyl-cobalamine comme donneur de radical. Dans le type III le radical est sur glycine, et lactivation est faite laide de S-adnosyl-mthionine. Il faut une "activase", qui catalyse le passage de la proprit radicalaire du donneur vers la ribonuclotide rductase. Ce mcanisme existe dans l'activation de la benzylsuccinate synthase. Ribosomes - Particules cytoplasmique, prsentes aussi dans les mitochondries et plastes, o s'effectue la traduction de l'ARN messager en protines. Composes de deux parties ingales dsignes par leur coefficient de sdimentation, 30 S et 50 S chez les procaryotes mitochondries et plastes, 40 S et 60 S chez les eucaryotes. Voir ARNr. Rickettsie - Bactrie Gram-ngative non mobile de petite taille, obligatoirement intracellulaire. RIESKE (protine de) - Ferrdoxine particulire caractrise par un noyau [2Fe-2S] o les atomes de fer sont lis par deux rsidus dhistidine et deux de cystine, au lieu de 4 rsidus cystine. Motif de squence consensus associ : CPHx15-17CxxH. Plus prcisment : C-x-H-R[G/A]-xxxxxxxx-N-xxxxx-C-x-[F/Y]-H (naphtalne dioxygnase et dioxygnases de la classe dite IIB). Le potentiel redox de ces protines est plus lev que celui des autres ferrdoxines ( 150 mV prs de 200 mV). Une protine de RIESKE est prsente dans les chanes respiratoires arobies au niveau du complexe bc1 et dans la chane des transferts dlectrons associe certaines oxygnases et oxydases. On a identifi un noyau [2Fe-2S] li par 3 Cys et 1 Asp chez l'hyperthermophile Pyrococcus furiosus. RMN - Rsonance Magntique Nuclaire (ou NMR dans la littrature anglo-saxonne). Outil essentiel de la chimie moderne et qui a pris une grande importance en imagerie mdicale. La RMN est d'une trs grande utilit dans l'analyse structurale des protines. Technique fonde sur le couplage entre spins nuclaires de noyaux nombre atomique impair au sein d'une mme molcule : hydrogne (RMN du proton ou 1H), du carbone-13, du phosphore-31 et du fluor-19. Les dveloppements modernes permettent un accroissement du pouvoir de
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rsolution, notamment par l'emploi de champs intenses, le traitement informatique du signal et la transforme de FOURIER, ainsi que par de nombreuses astuces technologiques. L'emploi du deutrium facilite l'analyse des changes de protons, l'analyse cintique rapide, et l'tude des ractions asymtriques. Parmi d'autres applications on peut citer l'analyse structurale et cintique sur des molcules enrichies en carbone-13, les dosages in vivo des phosphates, de l'ATP et autres nuclotides dans la cellule par le phosphore-31, l'emploi de molcules fluores comme substrats ou inhibiteurs et le marquage artificiel de protines par le fluor. Par exemple la RMN du fluor-19 est une technique permettant de suivre la biodgradation de composs fluors par une population de micro-organismes. RND - Resistance-nodulation-cell division. Antiporteurs (sortie du substrat, entre de protons), ubiquistes chez les bactries, archaebactries, eucaryotes, formant une superfamille structurale avec des subdivisions. Leur structure comporte de grandes chanes polypeptidiques de 700 1300 acides amins, 12 segments transmembranaires et un gros domaine extracytoplasmique. Les deux moitis de la squence ont une ressemblance qui laisse supposer qu'il y a eu duplication et fusion partir d'une squence ancestrale. Les substrats sont des mtaux lourds (Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+), des antibiotiques et mdicaments (multi-drug), des lipopolysaccharides et facteurs de nodulation, des strols et des protines. Le transporteur proprement dit ou A est associ un facteur B faisant un pont entre les deux membranes chez les Gram-ngatifs, et une troisime protine externe ou C. Les transporteurs de type RND sont actionns par la p, et non pas par l'ATP. Pour les distinguer des transporteurs ABC actionns par l'hydrolyse de l'ATP, on les dsigne comme complexes CBA ! Le colibacille renferme au moins 6 antiporteurs de type RND actionnant l'exportation de diverses substances dont des polysaccharides, des antibiotiques et des produits toxiques. Ces systmes RND ont un rle important dans la rsistance multiple des bactries aux antibiotiques. RPE - Rsonance Paramagntique Electronique (ou EPR dans la littrature anglo-saxonne). Une technique essentielle pour l'observation des entits molculaires contenant des lectrons non apparis ou plus gnralement un "moment de spin". Approprie en particulier l'examen des formes radicalaires (par exemple dans les flavoprotines), des centres contenant des mtaux de transition : fer, nickel, cobalt, applique galement au cuivre. La RPE est trs utile pour dterminer l'tat d'oxydorduction du mtal et les variations de son environnement organique au cours d'une raction enzymatique dans les protines hminiques, les dioxygnases RpoN - Voir Sigma-54. RpoS - Facteur d'amorage, appel aussi sigma-S, KatF, sigma-38. Fonctionne la base d'un vaste rgulon, qui concerne le passage de la phase de croissance la phase stationnaire, certains changements morphologiques, l'osmoprotection, un renforcement de la protection de l'ADN, une rsistance accrue une carence nutritionnelle, la tendance l'adhsion et d'autres fonctions. C'est typiquement une rponse au passage des conditions moins favorables. Chaque opron command par RpoS est en mme temps soumis des rgulations par d'autres protines agissant de concert. Le facteur RpoS est lui-mme rgul, par exemple par OmpR. Son activit comme facteur d'amorage est augmente par un facteur spcial DsrA qui n'est pas une protine mais un ARN de 87 nuclotides. Cet ARN forme une structure hybride en s'appariant localement l'ARN messager du gne rpoS, provoquant un droulement local qui facilite la traduction de cet ARN par les ribosomes. La synthse de RpoS est donc soumise une rgulation au niveau traductionnel. Rubisco - Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RBP), caractristique de l'assimilation du CO2 par le cycle de CALVIN. La raction entre RBP et CO2 produit deux molcules de phosphoglycrate. Prsente dans les chloroplastes, les carboxysomes des cyanobactries, et le cytosol des bactries photo-autotrophes. Son abondance vient en contrepartie de la lenteur relative de son cycle catalytique. Cest aussi une oxygnase utilisant O2 sur le mme substrat, et cette raction (RBP + CO2 phosphoglycrate + phosphoglycolate) qui entre en comptition avec la fixation de CO2 est lorigine de la photorespiration. La Rubisco possde sauf exception une structure quaternaire L8S8. Les sous-units L ont chacune un site actif. Pour que celui-ci puisse fonctionner, une activation pralable consiste greffer CO2 sur un rsidu de lysine. La fonction carbamyle ainsi forme facilite linsertion dun ion
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magnsium, chlat par lui et dautres sites environnants. Cet ion mtallique participe ensuite laction catalytique. La carbamylation de la lysine est sous la dpendance de la Rubisco activase, fonctionnant en hydrolysant de lATP. Rubrdoxines - Petites protines de couleur rouge faisant office de ferrdoxines, mais dpourvues de soufre acido-labile : un ou deux ions Fe sont coordonns directement par 4 soufres de cystine. Potentiel moins bas que celui des ferrdoxines. La premire isole, chez Clostridium pasteurianum, a un E' de 57 mV. Communes chez les sulfato-rducteurs, comprenant une dsulfordoxine (voir aussi Rubrrythrine) et chez les phototrophes. Rubrrythrine - Transporteur d'lectrons fer non hminique dcrite chez Desulfovibrio vulgaris. Les deux sous-units identiques renferment chacune du fer dans un environnement de type rubrdoxine, et un noyau bimtallique rappelant celui de l'hmrythrine ou de la ribonuclotide rductase. Ce noyau contient du fer hexacoordonn et du zinc ttracoordonn, chaque mtal tant li un motif GluxxHis (SIEKER LC et coll. (2000) J. Biol. Inorg. 5 : 505513). Rumen - La panse ou compartiment principal de lestomac des ruminants, o seffectue lessentiel des transformations et fermentations de la matire vgtale. S-adnosyl-mthionine (AdoMet) - Cofacteur de nomCH3 breuses ractions de mthylation dans le mtaOOC adnine S+ bolisme cellulaire, portant notamment sur les acides CH (CH2)2 CH2 + H N nucliques, les glucides, les lipides. La perte du 3 O mthyle transforme l'AdoMet en S-adnosyl-homocystine, prcurseur son tour dans diverses synthses OH OH (polyamines, alcalodes). Saprophyte - Organisme dcomposant les matires organiques pour s'en nourrir. Slniate rductase - Rduit le slniate (SeO42) en slnite (SO32). Le potentiel redox correspondant (+ 0,44 V) est proche de celui du couple nitrate/nitrite. Etudie comme enzyme respiratoire en anarobiose sur slniate chez Thauera selenatis, o elle apparat comme priplasmique. Lenzyme trimrique localise dans le priplasme contient Mo, au moins un centre fer-soufre et un hme B. Ne rduit pas le nitrate, le nitrite ou le chlorate (SCHRODER I et coll. (1997) J. Biol. Chem. 272 : 23765). Une activit slniate rductase est galement reconnue chez dautres espces bactriennes, comme Escherichia coli et Rhodobacter sphaeroides. Slnium - Elment plac au-dessous du soufre dans la classification priodique, donnant des anions similaires (slniate, slnite, slnure). Les slnols (R-SeH), contrairement aux thiols, sont dprotons pH neutre, et leur potentiel redox est plus bas. Le slnium peut remplacer certains atomes de soufre dans les noyaux fer-soufre et dans la cystine, qui devient slnocystine (voir Slnocystine), laquelle est incorpore dans la squence de quelques enzymes. Exemples : formiate dshydrognase (en particulier en anarobiose), xanthine dshydrognase, glycine rductase (Clostridium) et la glutathion peroxydase (mammifres, oiseaux), hydroxylase de lacide nicotinique (Clostridium barkeri). Le slnium est un oligo-lment indispensable aux animaux, mais trs toxique forte dose. Slnocystine - Acide amin similaire la cystine, mais o le soufre est remplac par du slnium. Son incorporation au cours de la traduction est dtermine par le codon-stop UGA, qui est reconnu au sein d'une boucle forme par l'ARN messager l'aide d'un ARNt particulier, acyl par la srine en sryl-ARNt (la raction d'activation de l'acide amin avant mise en place dans la chane protique naissante). Cet ARNt charg est alors transform en slnocystyl-ARNt par remplacement de S avec Se. Le donneur de slnium est le slnophosphate. Il est sensible O2. C'est donc une opration rserve aux organismes vivant en anarobiose ou capables de protger le slnophosphate contre l'oxygne. Il est form partir de slnure et d'ATP par une slnophosphate synthtase, rpandue chez les procaryotes et eucaryotes. Dans le rgne animal, le slnium est un composant essentiel de la glutathion peroxydase. Semi-aldhyde - Compos chane ouverte porteur ses extrmits d'un carboxyle et d'une fonction aldhydique.
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Squences d'acides amins - Voir Rsidus. Srovars - Souches d'une mme espce montrant des proprits antigniques distinctes. Shuffling - Brassage et recombinaison de squences. Voir DNA shuffling. Sidrophores - Composs organiques hydrosolubles faible masse molculaire, mis par les micro-organismes et capables de piger le fer(III) avec une trs haute affinit. Ils renferment en gnral un motif catcholique, ou une fonction hydroxamate. La disponibilit du fer et la comptition entre espces pour sa rcupration est un facteur biologique important. De tels composs existent chez les plantes, notamment les Gramines, sous forme de phytochlatines. Sigma-54 - Facteur de transcription se liant lARN-polymrase et permettant la reconnaissance des promoteurs placs en amont de certains gnes impliqus dans divers mtabolismes spcialiss, dont le mtabolisme azot, soit pour la rduction du nitrate et des oxydes dazote, soit pour lassimilation de lammonium ou du glutamate dans les conditions de carence en azote, ou encore pour l'assimilation de l'azote. Appel aussi RpoN, NtrA, GlnF. C'est notamment au niveau de ce systme qu'intervient l'activateur de transcription NifA chez les assimilateurs de N2. Les promoteurs reconnus par sigma-54, dont dpendent beaucoup de gnes de l'azote, ont cette structure consensus :
promoteur 5 dbut de la transcription 3
x x x x x x xCTGGCACx x x x xTTGCAx x x x x x x x x X X X X
20 10 +1
Sigma-70 - Voir Facteur damorage. Signal (peptide) - Portion N-terminale d'une protine, longue en gnral d'une vingtaine d'acides amins, caractrisant les produits destins tre exports au dehors du cytoplasme, soit dans le reticulum endoplasmique (eucaryotes), soit dans le priplasme ou le milieu extrieur chez les procaryotes. Cette portion caractre hydrophobe s'insre dans la membrane et facilite le transit du reste de la chane. Elle est ensuite dtache par un signal peptidase. Les gnes des protines soumises un tel transit ont ainsi une squence initiale supplmentaire codant pour des acides amins qu'on ne retrouve pas dans le produit dfinitif. Voir aussi Translocon. Signal peptidase - Voir Signal. Sirohme - Ferri-isobactriochlorine. Ferriporphyrine analogue lhme B, caractristique de plusieurs systmes enzymatiques. La nitrite rductase des chloroplastes (EC 1.7.7.1), monomrique, utilise la ferrdoxine rduite comme donneur, celle des bactries et des champignons (EC 1.6.6.4), un homodimre, emploie NAD(P)H. Les sulfite rductases des cyanobactries et plantes (EC 1.8.7.1) utilisent une ferrdoxine rduite, celles des bactries emploient NADPH (EC 1.8.1.2) ou NADH (EC 1.8.1.-). Ces enzymes ont une partie flavoprotique, une autre contenant un centre fer-soufre attach un sirohme. Sonde (nuclique) - Polynuclotide (ADN ou ARN) de squence donne, naturelle ou artificielle, susceptible de s'hybrider avec tout acide nuclique porteur localement de la squence complmentaire. Le reprage de l'hybride se fait par marquage : les sondes utilises marques contiennent un isotope radioactif ou un groupe fluorescent. Parfois les sondes utilises sont porteuses d'un groupe chimique supplmentaire (biotine) ou d'une enzyme (peroxydase). L'hybride est alors dtect in situ, sur un gel d'lectrophorse ou mme dans la cellule entire. Une application extrmement importante est la mthode d'amplification PCR. Soret (bande) - Bande d'absorption des protines hminiques dans la rgion 405-430 nm, dplace de plus grandes longueurs d'onde par le monoxyde de carbone. C'est la plus intense des cytochromes, ou bande , mais la moins spcifique. SOS (Rponse) - La soudure anormale de deux bases de l'ADN par action photochimique, notamment de deux thymines, cre une anomalie qui induit la synthse d'enzymes de
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rparation, commandes par une vingtaine de gnes chez E. coli. La protine RecA provoque l'hydrolyse d'un rpresseur, LexA (qui est elle-mme le rpresseur du gne de RecA), action qui est le point de dpart de cette induction. Les protines UvrA, B et C excisent la partie malade sur le brin d'ADN, l'ADN polymrase I synthtise nouveau la partie manquante et une ligase fait la soudure. Parmi les protines induites figurent aussi UmuC et UmuD, qui font partie des enzymes de rparation, et des protines mutagnes comme MutS, MutL et MutM. Soufre acido-labile - Soufre prsent sous forme dions sulfure dans les noyaux fer-soufre, o ils sont lis Fe. Contrairement au soufre appartenant aux rsidus cystine, ces ions sulfure sont limins sous forme de H2S par un traitement acide. SOUTHERN (ou SOUTHERN blot) - Mthode rappelant le papier buvard. L'ADN dnatur aprs lectrophorse sur plaque d'agarose est transfr sur un filtre de nitrocellulose, sur lequel on peut obtenir une hybridation avec un ADN complmentaire ou une sonde nuclique. SOUTHERN est le nom d'un chercheur. Pour l'humour, la technique de ce transfert tant applicable aussi pour l'ARN ou les protines, on parle respectivement de Northern et de Western. Spin (Haut spin, Bas spin) - Concerne en biochimie surtout l'tat lectronique du fer et autres mtaux de transition, mais galement les radicaux libres forms par des facteurs organiques, par exemple les flavines. Les lectrons priphriques du fer tendent se rpartir dans les orbitales de niveau suprieur en restant non apparis (tat haut-spin). Quatre ou six liaisons de coordinence sont tablies avec des atomes donneurs de doublet. Le "champ ligand" exerc tend installer ces doublets dans les orbitales externes en refoulant les lectrons du fer vers les couches plus basses. C'est ce qui se passe dans l'tat bas-spin du fer, notamment quand le champ est tabli par 6 donneurs forts selon la gomtrie de l'octadre rgulier (spin = 1/2 dans Fe(III)).
3d10 Fe3+ haut-spin Fe3+ haut-spin en champ faible Fe3+ haut-spin en champ fort 6 liaisons de coordination 4s2 4p6 4d10
Dans l'tat haut spin du fer, l'environnement de coordination est incomplet (5 liaisons), asymtrique, ou tabli avec des donneurs faibles, de telle sorte que les lectrons priphriques du fer restent non apparis dans leurs orbitales 3d10 (spin = 5/2 dans Fe(III)), et les lectrons des atomes donneurs occupant des orbitales un niveau suprieur. L'tat de spin du fer est observ en RPE et renseigne sur la gomtrie et le nombre des liaisons autour du fer. SoxS - Protine de stress, code par l'opron soxRS qui contrle le rgulon du stress par oxydation (prsence de superoxyde, de peroxyde, pression partielle forte en O2) , soit une quarantaine de gnes. La raction est dclenche par SoxR, qui active la production de SoxS. Spores - Cellules spcialises assurant la survie en conditions adverses et la dissmination. Les Bacillus et Clostridium engendrent des endospores (une cellule une spore) particulirement rsistantes la chaleur, la dessiccation, aux radiations. Les endospores ont une teneur rduite en eau, ont une paroi paisse et contiennent du dipicolinate de calcium. Les conidies formes par certains actinomyctes sont des spores asexues paroi mince produites par la fragmentation des hyphes et non pas lintrieur de sporanges. On les appelle aussi conidiospores. Les ascospores des champignons ascomyctes et basidiospores des basidiomyctes sont des spores sexues (aprs mose) formes dans des sporanges (asques, basides). Staryl-ACP D9 dsaturase - Transforme lacide starique en acide olique par la cration dune double liaison. Voir Dsaturase.
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Streptomyctes - Bactries Gram-positives prsentes dans le sol et les eaux, formant des filaments ramifis et des hyphes ariennes formateurs de spores ou conidies. Elles produisent une gamme tendue dantibiotiques dont quelques pour cent ont des applications thrapeutiques. Certaines espces font de la gosmine, responsable de lodeur du sol humide et du compost. Stress - Situation cre par un agent physique ou chimique agressif : temprature leve, changement de salinit ou de pH, action d'une substance toxique ou phnomne de carence. La rponse un tat de stress est rgule sur le plan gntique par un rseau d'interactions sophistiqu. E. coli a 3 gnes de stress, marA, robA et soxS (voir SoxR). Ce sont des activateurs de transcription pour au moins une dizaine de gnes formant un vaste rgulon, dterminant notamment la synthse d'une superoxyde dismutase, d'une endonuclase de rparation de l'ADN, d'une aconitase, d'une fumarase, d'une NADPH-ferrdoxine oxydorductase, d'une glucose-6P-dshydrognase et de OmpF (expliqu la rubrique OmpR). cette liste s'ajoutent les protines du choc thermique (Hsp60, Hsp70), et ArcAB pour la rsistance aux solvants organiques (hexanol). Ces protines de stress augmentent en mme temps la rsistance aux antibiotiques hydrophobes et aux mtaux lourds. Chacune (MarA, SoxS) voit sa synthse commande par une protine rgulatrice (MarR, SoxR) servant de dtecteur du signal. Ainsi en l'absence de tout stimulus, MarR bloque la synthse de l'activateur MarA. Cette inhibition est leve par divers stimuli (antibiotiques, aspirine, paraquat, dinitrophnol, cyclohexanol). Une fois produite, MarA active le rgulon mar comportant de nombreux gnes sur le chromosome de E. coli. Stromatolites - Formations fossiles lamelles pouvant remonter au Prcambrien, dues la prcipitation du carbonate de calcium sur des manteaux cyanobactriens par couches successives. Les stromatolites sont abondants surtout avant la fin du Primaire, mais peuvent se former encore actuellement (tufs du littoral de Shark Bay, Australie occidentale). Structures secondaires - Replis forms dans la structure des protines par des liaisons hydrogne formes entre deux points de la chane principale. Celle-ci est forme par la rptition du motif NH(R)CHCO, R tant une chane latrale d'acide amin. Les plus importantes sont les hlices alpha, les barreaux bta et les tournants de la chane. Les structures secondaires sont les premires stablir quand la chane passe de ltat dnatur (droul) la forme native, et forment une importante charpente structurale. Lexpression est tendue aux acides nucliques, en particulier l'ARN, dont la chane se replie par des liaisons hydrognes tablies entre bases ou entre diffrents points de la molcule et formant une architecture spcifique. Le plan des structures secondaires dans lARN des ribosomes a conserv des caractres constants dans lvolution des tres vivants (voir ARN 16S). Structure tertiaire - Reprsente l'organisation gnrale de la chane polypeptidique dans l'espace, englobe les structures secondaires, est consolide par des liaisons non covalentes entre les chanes latrales d'acides amins (liaisons H, ponts ioniques) ou des liaisons covalentes, notamment les ponts disulfures venant de l'oxydation de deux thiols (cystine). Structure quaternaire - On dsigne ainsi l'association dans une mme protine de plusieurs chanes polypeptidiques, identiques ou non, relies par des liens covalents ou non covalents. Un nombre immense d'enzymes possdent une structure quaternaire, dont la fonction s'interprte par diffrents critres : Stabilisation de la structure gnrale. L'association se fait parfois par des bras et replis plus ou moins importants qui permet une sous-unit de mieux s'attacher une voisine (la catalase est dans ce cas) ; L'accolement des sous-units ou protomres permet de soustraire des sites hydrophobes du contact du solvant. L'accolement de deux chanes contribue souvent former un site catalytique, dont les motifs essentiels appartiennent l'une et l'autre ; La structure molculaire totale fonctionne comme un ensemble intgr, o les mouvements conformationnels d'une partie se rpercutent sur la structure du reste. Ce principe est trs important dans les protines allostriques, mais pas seulement car dans les structures quaternaires dtentrices de plusieurs sites catalytiques, le fonctionnement de l'un peut inflchir le fonctionnement des autres ;
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Une structure quaternaire facilite le transfert d'lectrons dans une protine d'oxydorduction possdant plusieurs sites (flavines, fer-soufres, mtaux) ; Une structure quaternaire conditionne parfois l'association de la protine avec d'autres macromolcules. Cet effet est trs important pour les protines rgulatrices associes des acides nucliques ou agissant comme nuclases de restriction. Sulfato-rducteurs - Bactries utilisant le sulfate comme accepteur respiratoire anarobie, utilisent des composs organiques ou H2 comme sources dlectrons. Sulfite rductase - Enzyme catalysant la rduction 6 lectrons de l'hydrosulfite en sulfure. Superoxyde - Radical et anion, provient de la rduction mono-lectronique de loxygne diatomique (O2 + e O2), notamment au cours des ractions catalyses par les oxydases. Superoxyde dismutase (SOD) - Catalyse la raction : 2 O2 + 2 H+ O2 + H2O2. Il y en a trois sortes : avec Fe (bactries, cyanobactries, chloroplastes) ; manganse (bactries, cyanobactries, archaebactries, mitochobndries ; cuivre et zinc (cytoplasme des eucaryotes, certains chloroplastes). Le dosage utilise la proprit du superoxyde de rduire le cytochrome c ou des colorants accepteurs, ou d'oxyder l'adrnaline en adrnochrome. Le superoxyde est facilement engendr in vitro en faisant fonctionner la xanthine oxydase. Super-tours - Structure hlicodale forme par torsion de la double hlice d'ADN dans un sens ou dans l'autre (super-tours positifs et ngatifs). Les super-tours ont pour effet un entortillement de la double hlice et sont engendr par la rplication de l'ADN. Les topoisomrases sont charges de les contrler. L'une des plus importantes est la gyrase. Swarming - Essaimage. Au sein d'une population, facult de certaines cellules bactriennes de se dplacer rapidement dans une matrice de polysaccharides, leur permettant de coloniser une grande suface en ensembles denses au sein desquels existent une certaine diffrenciation. Le swarming, caractristique de certaines espces comme les Proteus, aboutit de vritables ensembles pluricellulaires avec division du travail, et obit un mcanisme complexe. Symbiose - Cohabitation troite et stable de deux espces tirant un bnfice mutuel de leur association, mais pouvant se dvelopper sparment. Les interactions peuvent aller dun simple commensalisme un mutualisme, mais les diffrents facteurs ne sont pas toujours bien cerns exprimentalement, et lemploi de cette terminologie n'a cess d'voluer. La symbiose peut apparatre parfois comme une relation obligatoire, et on la qualifie alors de symbiose mutualiste. Le parasitisme se dtache comme un concept distinct lorsque les bnfices de l'association sont sens unique. Synergie - Association de deux organismes pouvant se dvelopper sparment, mais trouvant un bnfice dans leur prsence simultane. Synporteur - Transporteur faisant traverser la membrane par un substrat en mme temps et dans la mme direction qu'un autre lment, le plus souvent un ion, un proton Synthase - Enzyme effectuant une synthse sans lintervention dune source dnergie du type ATP, et se distinguant ainsi des ligases ou synthtases. Les synthases (classe 4 des enzymes) se distinguent par la nature de la liaison concerne : CC, CN, CS Synthtase - Voir Ligase. Syntrophisme - Dveloppement simultan de deux organismes ou davantage, tirant parti d'un change de substances ncessaires leur croissance. Par exemple deux germes ont besoin de deux facteurs de croissance A et B. Supposons que le premier est capable de synthtiser A tandis que le deuxime peut fabriquer B. Sur un milieu dpourvu la fois de A et de B, les deux organismes ne peuvent se dvelopper que sils sont prsents ensemble. Cest un cas de synergie. Voir aussi Mutualisme. Systme deux composants - Voir Rgulation deux composants. TAP-tag - Marqueur par Tandem Affinity Purification. Mthode permettant de purifier des complexes muti-protiques applicable une recherche systmatique dans un extrait cellulaire,
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mise au point l'origine pour la levure de bire. La purification est dtermine par une protine "hameon" dont le gne a t modifi par recombinaison gntique, de faon lui faire porter du ct N- ou C-terminal une squence supplmentaire ou tag (tiquette) reconnue par chromatographie d'affinit. Cette squence obtenue artificiellement forme une cassette gntique amplifie par PCR, comporte un espaceur (esp.), un module correspondant une protine de liaison de la calmoduline (CBP), un site facile hydrolyser par la protase TEV (voir TEV), et la protine A (voir Protine A). La cassette est borde par de courtes squences destines orienter la recombiaison homologue. Les cellules de levure sont transformes par plasmide contenant cette cassette, et les recombinants sont slectionns, cultivs, leurs protines extraites. Un produit modifi par la tag est alors reconnu en chromatographie d'affinit sur des billes de gel contenant des IgG ( cause de la protine A) ou de la calmoduline. L'emploi de la protase TEV hydrolyse l'amarre et permet d'luer facilement le produit purifier. Cette mthodologie en expansion comporte dj diverses variantes brevetes.
esp. site TEV CBP tag protine A
Protine de fusion avec TAP-tag
NH2
protine
TCDD - Ttrachloro-p-dioxines (voir Dioxines). TCE - Trichloro-thylne, ClCH=CCl2. TEF - Toxicity equivalency factor. Dans une famille de composs toxiques (dioxines), le TEF de chacun est sa toxicit compare celle d'un produit de rfrence (2,3,7,8-TCCD, TEQ = 1). Par exemple avec un TEF de 0,1, il faut 10 fois plus de ce compos pour avoir le mme effet qu'avec le poison de rfrence. TEQ - Toxic equivalence quotient. Dans un mlange de dioxines, on multiplie la concentration en g de chaque constituant par son TEF, et la somme de tous les produits partiels obtenus donne le TEQ. Une faon de comparer la toxicit d'un mlange htrogne celle du compos de rfrence, pour les dioxines le 2,3,7,8-TCCD. Un mlange de 1 pg TEQ est aussi toxique que 1 pg de 2,3,7,8-TCCD. TEV (Protase) - Protase cystine du Tobacco Etch Virus, outil d'analyse en biochimie des protines : topologie des polypeptides et des protines membranaires, hydrolyse entre glutamine et srine la squence Glu-x-x-Tyr-x-Gln-Ser. Cette squence introduite dans une construction polypeptidique (notamment en chromatographie d'affinit) permet de la scinder spcifiquement. Terpnes - Hydrocarbures d'origine vgtale, tirs des huiles essentielles. Par extension, leurs drivs alcooliques, aldhydiques et ctoniques. Ttrahydrofolate - Cofacteur transporteur dunits mono-carbones chez les eubactries et les eucaryotes, aux niveaux doxydation du formiate (10-formyl-FH4 ou 5,10-mthnyl-FH4), du formaldhyde (5,10-mthylne-FH4) et du mthanol (5-mthyl-FH4). Dans la formule partiellement dtaille du ttrahydrofolate, les deux positions hydrognes substituables en 5 et 10 sont en gras, les diffrentes combinaisons sont reprsentes schmatiquement :
OH N H2N H FH4 formyl-FH4 H2O CHO N O H N 5 N H CH FH4 5,10-mthnyl-FH4 H N 10 C NH (glutamate)n CH2 FH4 5,10-mthylne-FH4 H FH4 H
2 e + H+
2 e + H+
CH3 FH4
5-mthyl-FH4
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Point d'entre important des units mono-carbones dans le mtabolisme cellulaire, le stade mthylne-FH4 se rencontre par exemple dans le cycle srine des mthylotrophes. Le FH4 drive de l'acide folique et contient dans sa formule une partie PABA (voir PABA). Ttrahydromthanoptrine - Cofacteur particulier des mthanognes, ressemblant au ttrahydrofolate et fonctionnant sur le mme principe dans les rductions successives de lunit mono-carbone. Terprdoxine - Ferrdoxine de la famille de la putidardoxine, trouve chez un Pseudomonas, participant l'oxygnation du terprnol. Thermophile - Micro-organisme dont la temprature optimale de croissance est au-dessus de 60C . Il n'y a gnralement pas de croissance au-dessous de 40C. Voir aussi Hyperthermophile. Parmi les eucaryotes, lespce la mieux connue est Cyanidium caldarium (40 57C), apparente aux rhodophytes et prsente dans les sources chaudes acides du monde entier. Thiamine-pyrophosphate - Voir PLP. Thio-autotrophe - Organisme tirant son nergie de l'oxydation du soufre et des produits sulfurs, et son carbone partir du CO2. C'est un chimiolitho-autotrophe. Thiocyanate - Voir Cyanate (et son analogue thiocyanate). Thiordoxine - Protine d'oxydorduction faible masse molculaire, comportant l'tat rduit deux thiols proches l'un de l'autre formant un pont disulfure l'tat oxyd. Les lectrons proviennent du NADPH par une thiordoxine rductase, et sont transmis une enzyme acceptrice, par exemple la ribonuclotide rductase. Thiosulfate - S2O32 (SSO32). C'est l'hyposulfite des photographes. Titane - Le citrate de Ti(III) est utilis exprimentalement dans les ractions anarobies ncessitant le maintien d'un trs bas potentiel. Il est prpar pH 8 partir de TiCl3 et de citrate de Na en milieu totalement dsar. Le potentiel de demi-rduction varie avec le pH. Il est de 480 mV pH 7. Une lvation du pH entre 2 et 10 abaisse progressivement le potentiel en fonction de la loi de NERNST. En jouant sur le pH et le rapport Ti(IV)/Ti(III), on dispose d'un moyen pour conduire des tests anarobies diffrents potentiels redox. TMAO - Trimthylamine-N-oxyde. Produit rgulateur du volume cellulaire et stabilisateur des protines contre laction de lure chez les poissons, se dpose sur les cailles, rduit par les bactries en trimthylamine qui est responsable de lodeur de poisson avari. TMAO rductase - Systme enzymatique molybdne utilisant le TMAO comme accepteur terminal dans une chane respiratoire anarobie. Dans E. coli, est aussi une DMSO rductase. TMMO - Voir TMAO. TMPD - 2,3,5,6-Tetramethyl-1,4-phenylene diamine. Rducteur des cytochromes c, son oxydation par les chanes respiratoires bactriennes comportant un cytochrome c le colore en bleu. Base des tests "oxydase +" (prsence dune cytochrome c oxydase) dans les tests microbiologiques. TNT - 2,4,6-Trinitrotolune. Tolune - Mthylbenzne. Topo-isomrase - Enzyme capable d'introduire ou d'enlever des supertours dans l'ADN. Les topo-isomrases de type 1 fonctionnent par coupures un seul brin et change le nombre de supertours d'une unit par cycle catalytique, tandis que les topo-isomrases de type 2, dont la gyrase, font des coupures sur les deux brins, changent les supertours de deux units par cycle. Tourbe - Matire organique accumule par lente dcomposition des dbris vgtaux en anarobiose permanente et en milieu gorg deau. La tourbe est poreuse, peut dense, renferme des fibres vgtales et de la lignine faiblement transformes. La tourbe des cuvettes mal draines des montagnes provient de dbris de mousses (sphaignes), est gnralement trs acide et pauvre en azote. Ailleurs la tourbe est souvent forme partir de gramines et cyprasses, peu acide, plus riche en azote et en constituants minraux.
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TPP - Thiamine-pyrophosphate. Coenzyme driv de la vitamine B, activateur des groupes aldhydiques comme celui qui nat par dcarboxylation sans oxydation du pyruvate ou du 2-oxoglutarate. Le TPP forme une liaison transitoire avec les aldhydes substrats et sert d'activateur dans le transfert sur un accepteur du groupe aldhydique pouvant comporter un seul atome de carbone (formaldhyde), deux (actaldhyde, glycolaldhyde) ou davantage. Lorsque le substrat est ctonique, la molcule est rompue en librant un fragment aldhydique qui se lie transitoirement au PLP, notamment dans la raction des transctolases. Traduction - Assemblage dun polypeptide par les ribosomes, selon une squence traduite partir de lARN messager en fonction du code gntique. Transaminase - Autre nom donn une aminotransfrase. Transamination - Raction catalyse par les transaminases ou aminotransfrases, o un acide amin et un oxoacide (ctoacide) ragissent rversiblement selon : R1CH(NH2)COOH + R2COCOOH R1COCOOH + R2CH(NH2)COOH Transcription - Synthse d'ARN dont la squence reproduit celle de l'un des deux brins de l'ADN modle. La quasi totalit de l'ARN cellulaire est engendr par transcription. La transcription d'un segment d'ADN en ARN est amorce par l'ARN-polymrase en aval immdiat d'un promoteur, reconnu par un facteur d'amorage ou facteur sigma. Le mcanisme de cette reconnaissance dtermine le sens dans lequel l'ARN-polymrase va progresser le long de l'ADN, en fabriquant un ARN complmentaire de l'un des brins d'ADN. La squence reproduite est celle du brin signifiant not "+" sur le schma. L'ARN-polymrase se sert de la squence complmentaire marque "" comme modle, comme le ngatif d'un clich photographique permet de raliser des preuves positives. Le dmarrage de la transcription qui suit le mcanisme de reconnaissance du promoteur ncessite une micro-dnaturation locale de l'ADN pour la mise en place du premier nucltide de l'ARN, correspond au "complexe ouvert". La fonction des activateurs de transcription est souvent de favoriser l'tablissement de celui-ci. L'ARN-polymrase parcourt alors le brin modle de 3' vers 5' (de gauche droite sur le schma), alors que le brin signifiant, qui est orient en sens inverse, est parcouru de 5' vers 3'.
1 +1 zone transcrite en ARN messager
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squence du promoteur
3 5
lARN-polymrase reproduit cette squence sous forme dARN en utilisant celle-ci comme modle
LARN form est utilis directement comme ARN messager (protobactries) ou aprs plusieurs modifications dans le noyau des eucaryotes (et parfois chez les archaebactries), lune delles tant llimination ou pissage des introns. L'ARN messager bactrien reprsente la squence d'un ou plusieurs gnes (un opron), alors que chez les eucaryotes le messager reprsente gnralement un seul gne. Le produit primaire de la transcription subit alors de nombreuses modifications avant de devenir un ARN messager fonctionnel : apparition d'une structure spciale ou coiffe l'extrmit 5', pose d'un segment de poly-A l'extrmit 3', limination des introns, mthylation certaines positions. Ces changements ont lieu en grande partie dans le noyau cellulaire. Lorsque le brin signifiant de l'ADN est pris comme modle d'une transcription, l'ARN form est complmentaire de l'ARN messager normal et peut s'apparier lui (comme les deux brins d'ADN) en bloquant son fonctionnement. Ce type d'ARN est dit ARN anti-sens et peut avoir une fonction rgulatrice. Transduction - Transmission d'information gntique d'une cellule l'autre par l'intermdiaire d'un phage. La transduction est gnralise (n'importe quel gne est transport) ou limite (seuls sont transmis des gnes adjacents au site d'intgration du prophage).
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Transformation - Modification gntique d'une cellule par pntration d'ADN libre et intgration de celui-ci dans le gnome. Les cellules capables d'tre transformes sont dites comptentes, certains stades (Bacillus subtilis) ou permanente (Haemophilus influenzae). Translocon - Complexe membranaire multiprotique permettant le passage de macromolcules travers une membrane. Dfini initialement dans l'tude du transport des polypeptides travers la membrane du rticulum endoplasmique, il comprend une signal peptidase, une protine de reconnaissance du signal (voir rubiques correspondantes), et une protine dsigne par Tram qui traverse 6 ou 8 fois la membrane et forme probablement un canal. Le terme de translocon a t tendu au complexe assurant le transport d'ADN entre deux cellules au cours de la conjugaison bactrienne. Cet appareil de transport bactrien est peuttre un dispositif ancestral amnag chez diverses espces pathognes qui ont en commun d'injecter de l'ADN ou des protines chez des eucaryoyes : Agrobacterium, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila. Les spcialistes dsignent ce mode de "scrtion" vers un cellule partenaire comme scrtion de type IV (CHRISTIE PJ (2001) Mol. Microbiol. 40 : 294-305). Transport actif - Mcanisme permettant un compos substrat de traverser la membrane en remontant un gradient de concentration, ce qui ncessite un apport d'nergie ATP ou p. Exemple : pompage d'un substrat extrieur et accumulation dans la cellule. Voir aussi Permase, Synporteur, Antiporteur. Transporteurs ABC - ATP-binding cassettes. Systmes de transport actif rpandus chez les procaryotes et les eucaryotes. Fonctionnent comme importateurs dans la cellule chez les procaryotes, archaebactries comprises, fonctionnent dans l'un ou l'autre sens (efflux) chez les eucaryotes. Les pices fondamentales sont deux domaines transmembranaires, fusionns ou non en une mme protine et responsables du passage du substrat travers la membrane, et deux domaines hydrophiles capables de lier et d'hydrolyser l'ATP. L'hydrolyse est l'agent moteur du transport. En association sont une ou plusieurs protines extracytoplasmiques (dans le priplasme chez les Gram-ngatifs). Le transporteur ABC le plus connu est celui qui importe le maltose chez E. coli. Une protine de liaison priplasmique (MalE), deux protines membranaires (MalF et MalG) et deux molcules de l'ATPase MalK composent ce systme. Les protines transporteurs ABC de cette catgorie sont trs rpandues chez toutes les bactries, font partie d'une vaste famille caractrie par des homologies structurales entre les diffrents domaines, s'exercent sur des sucres, des acides amins, des vitamines, des phosphates et des ions mtalliques. Les transporteurs ABC de type efflux exportent le plus souvent des molcules organiques complexes ou varies, notamment des peptides dans le rticulum endoplasmique de la cellule animale. Chez les bactries ce sont des antibiotiques, des polysaccarides capsulaires, des lipopolysaccharides et constituants de la paroi, des protines de la couche S, des sidrophores et des toxines. Tous ces transporteurs se ressemblent par leur domaine de liaison des nuclotides et sont apparents diverses enzymes spcialises dans des modifications de l'ADN, comme les hlicases (LINTON KJ & HIGGINS CF (1998) Molecular Microbiol. 28 : 5-13 ; YOUNG J & HOLLAND IB (1999) Biochim. Biophys. Acta 1461 - 177-200). Transposase - Enzyme code par un transposon, catalyse l'excision de celui-ci (effet cis) et l'insertion dans le nouveau site en agissant comme intgrase. Transposition - Dplacement dun segment dADN dune position une autre, soit dans la mme molcule dADN, soit entre deux molcules diffrentes (par exemple entre plasmides ou entre chromosome et plasmide). Transposon - Squence dsoxyribonuclique ayant la proprit de se dplacer sur l'ADN, soit en bloc (excision puis insertion ailleurs), soit aprs avoir subi une rplication (une copie reste en place, l'autre s'installe ailleurs). Les squences mobiles sont appeles IS (squences d'insertion), renferment les gnes d'une ou plusieurs enzymes ncessaires la transposition, ou transposases, et sont bordes aux extrmits par deux courtes squences rptes et inverses (15 25 bp). Un transposon peut loger des gnes trangers (par exemple des gnes de rsistance) dans un lment IS (transposon simple) ou avec deux IS de mme orientation ou orients en sens opposs.
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Trichome - Range de cellules restant attaches les unes aux autres aprs divisions successives, et mobiles dun seul tenant. Les trichomes servent souvent la dissmination des cyanobactries filamenteuses et des cellules du genre Beggiatoa. Tungstne - De numro atomique 74 (W), analogue chimique du molybdne (Mo, n 42), prsent dans les archaebactries hyperthermophiles et mthanognes, dans certains Grampositifs (Clostridium thermoaceticum), des Gram-ngatifs anarobies (Desulfovibrio gigas) ou arobies (Methylobacterium). Dans 4 sries denzymes : formiate dshydrognase, formylmthanofurane dshydrognase, actylne hydratase, oxidorductases catalysant rversiblement loxydation des aldhydes (comme le formaldhyde et le glycraldhyde-3-phosphate) en prsence dune ferrdoxine. Toutes les enzymes tungstne catalysent une insertion d'oxygne partir de H2O dans une liaison C-H. Le tungstne est l'lment caractristique des aldhyde-ferrdoxine oxydorductases, log dans un cofacteur de type molybdoptrine et associ un groupe [4Fe-4S]. Le tungstne de la formyl-mthanofurane dshydrognase peut tre li un dinuclotide MGD. Les tungsto-enzymes sont prsentes surtout chez des organismes thermophiles ou hyperthermophiles, et le tungstne y est toujours li un cofacteur similaire celui des enzymes molybdne (comme mononuclotide), tandis que Mo dans les espces msophiles est le plus souvent au sein dun cofacteur dinuclotidique. Lorsque le tungstne intervient dans une raction o s'observe galement le molybdne, il opre potentiel redox plus bas que celui-ci, souvent bien au-dessous de 400 mV. Le tungstne peut remplacer le molybdne dans les molybdo-enzymes, et conduit en gnral une forme inactive. Cette action inhibitrice du tungstate constitue un indice exprimental utile. Turbidostat - Culture continue faite avec un montage analogue celui du chmostat, le volume tant constant, mais l'apport de milieu et le prlvement sont effectus vitesse variable contrle par asservissement automatique de faon maintenir la densit cellulaire un niveau constant. UAS - Upstream activating sequence. Zone d'attachement spcifique d'un activateur de transcription en amont d'un promoteur, souvent plus d'une cinquantaine de pdb. L'activateur sur l'ADN n'est ventuellement plac en contact avec le complexe d'amorage (ARNpolymrase, facteur sigma, rgion du promoteur) qu' la faveur d'une courbure en pingle cheveux sur l'ADN, avec l'aide d'un lment supplmentaire du type IHF (voir IHF). UASB - Upflow Anaerobic Sludge Blanket, ou flux ascensionnel dans un lit de boues anarobies. Procd d'puration des effluents par mthanisation. Ubiquinols - Voir Ubiquinones. Ubiquinones - Quinones respiratoires trs lipophiles (Q), portant une chane latrale comportant un nombre variable d'units isoprnodes 5 atomes de C (les plus courantes sont les ubiquinone-8 et ubiquinone-10, ou UQ8 et UQ10), rduites rversiblements en ubiquinols (hydroquinone QH2). Transporteurs d'lectrons souvent placs entre une dshydrognase et un cytochrome, notamment le complexe bc1. Possibilit de transmettre les lectrons un un : Q + e + H+ QH (semiquinone) ; QH + e + H+ QH2 (ubiquinol). UQ - Abrviation pour ubiquinone. Urase - Enzyme Ni dcomposant l'ure selon : OC(NH2)2 + H2O CO2 + 2NH3. Uridylase - (ou uridyl transfrase). Enzyme catalysant une uridylation. Uridylation - Fixation sur un accepteur (en gnral une protine) d'un nuclotide uracile (UMP), par son phosphate. Le donneur est l'UTP, la liaison libre du pyrophosphate. Uroporphyrinogne III - Compos ttrapyrolique linaire (Up III) intermdiaire cl de la synthse de toutes les porphyrines, dont il est le prcurseur. 1. 5-aminolvulinate ( porphobilinogne Up III) form de deux faons, soit partir de glycine + succinyl-CoA soit partir de glutamyl-ARNt. Les voies qui divergent partir de lUp III : 2. coproporphyrinogne III protoporphyrine IX qui sera lorigine de lhme B, de lhme C de la chlorophylle ; 3. sirohme, par CysG, une sirohme synthase complexe (EC 2.1.1.107) ;
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4. prcorrine hme D1, par une cascade denzyme codes par le groupe des gnes nirE et nirFDLGHJ ; 5. la synthse des corrinodes, cobalamines (B12). Pour un schma gnral et des rfrences, voir larticle de WG ZUMFT (1997) Molec. Microbiol. 61 : 533-616. Vadose - Rgion du sol non sature en eau place entre la nappe phratique et la surface du sol. Vanadium - Prsent dans certaines peroxydases et nitrognases. Vanilline - 3-Mthoxy-4-hydroxybenzaldhyde. Vanillique (acide) - Acide 3-mthoxy-4-hydroxybenzoque. Vecteur navette - C'est un plasmide construit par recombinaison artificielle, dans lequel on a mnag deux origines de rplication diffrentes drives de E. coli et de la levure ou de E. coli et de cellules humaines. Permet de transfrer des gnes entre cellules trs diffrentes en contournant les barrires de spcificit qui entravent la propagation des plasmides courants. Vriatraldhyde - 3,4,5-Trimthoxybenzaldhyde. Vriatrole - 1,2-Dimthoxybenzne. Violognes - Colorants doxydorduction trs bas potentiel, utiliss exprimentalement dans des ractions anarobies comme accepteurs d'lectrons. Les plus courants sont le mthyl-viologne (1,1-dimthyl-4,4-bipyridinium2+), dont le potentiel E' est de 446 mV, et le benzyl-viologne. Le premier est utilis comme herbicide sous le nom de Paraquat. Son action est celle dun poison de la photosynthse. Vitamine B12 - (Voir Vitamines). l'origine des cobamides. Vitamines - Facteurs nutritifs organiques requis par les cellules pour leur croissance ou leur maintenance cellulaire, servant de coenzymes ou de prcurseurs de coenzyme. Biotine H Coenzyme de carboxylases, li fortement par l'avidine Cobamide B12 Renferme du cobalt, mthylations, rarrangements Acide folique F Prcurseur du FH4*, transferts d'units en C1 Niacine Nicotinamide et nicotinate, prcurseur de (NAD(P)+ Acide pantothnique Prcurseur du coenzyme A Acide p-aminobenzoque Prcurseur du FH4*, transferts d'units en C1 Pyridoxine B6 Prcurseur du pyridoxal-P, mtabolisme des acides amins Riboflavine B2 Prcurseur des flavines : FAD, FMN Thiamine B1 Prcurseur du thiamine pyroP (TPP), transferts d'aldhydes Vm - La vitesse d'une raction enzymatique crot avec la concentration en substrat limitant, jusqu' atteindre un plateau de saturation. La vitesse Vm atteinte est une valeur suprieure limite quand la concentration en substrat est suppose infinie. Cette valeur dpend en fait des conditions du test, mais elle est directement proportionnelle la constante catalytique kcat qui exprime le nombre de molcules de substrat par seconde. Vm est en quelque sorte le miroir de l'efficacit du site actif de l'enzyme. Voir Km et MICHAELIS (loi de). Xanthine oxydase - Molybdo-enzyme animale catalysant les oxydations successives : hypoxanthine xanthine acide urique. Celui-ci est un produit dexcrtion azot insoluble, abondant dans le guano des oiseaux, mtabolis selon les espces en diffrents produits de dgradation dont lure. Lenzyme contient, outre le cofacteur molybdne deux centres fersoufre et du FAD. XAS - X-ray absoption spectroscopy. Xnobiotique - Compos tranger la chimie des tres vivants, habituellement engendr par les activits humaines. XXR - Dans un super-intgron, squence rpte (70-80% d'identit) servant de cible l'intgrase IntI correspondante. Nomenclature destine rpertorier les diffrents types de squence. La premire lettre X dsigne l'initiale du nom de genre, la deuxime celle de l'espce R veut dire repeat (rptition). Ainsi pour Vibrio cholerae c'est VCR, pour V. mimicus
GLOSSAIRE
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VmiR, pour V. metschnikovii VmeR pour Listonella pelagia LPR et ainsi de suite. Une nomenclature sur le mme principe dsigne l'intgrase, le nom tant termin par intlA, ou intlA et intlB (quand il y en a deux). Xylanes - Htropolymres de xylose abondants dans les parois vgtales secondaires des dicotyldones et dans les tissus primaires des monocotyldones. Dans le bois leur proportion peut atteindre 25%. Les xylanes purs constitus uniquement d'un enchanement d'units xylose par liaisons -1,4 sont relativement rares. En gnral ces polymres sont ramifis, plus ou moins irrgulirement, par des chanons latraux renfermant de l'arabinofuranose, de l'acide O-mthylglucuronique, de l'arabinose et autres constituants. Les xylanes ont des liens covalents avec la lignine. Xylnes - ortho-, mta- et para-dimthylbenzne. Xyloglucanes - Htropolysaccharides abondants dans les hmicelluloses de la paroi primaire des dicotyldones. Enchanement d'units de glucose lies en -1,4 comme dans la cellulose, et portant latralement d'autres units glucidiques formant des motifs priodiques. La prsence de ces derniers permet des pontages complexes entre les chanes, empchant la formation d'difices cristallins par ponts hydrogne comme dans la cellulose pure. L'intrt de la structure ponte des xyloglucanes vient surtout de leur rle dynamique dans la croissance de la paroi. Les barreaux entre chanes sont hydrolyss puis reforms des endroits diffrents par des enzymes, notamment une glycosyl transfrase dont l'action permet ainsi de remanier le maillage. Zinc - Oligo-lment indispensable tous les tres vivants, ncessaire au fonctionnement de nombreuses enzymes, qui sont le plus souvent des dshydrognases et oxidorductases, et surtout des hydrolases. Le mtal [Zn(II)] ne change pas de degr doxydation. Intervient de deux faons, soit comme stabilisant de la structure tertiaire des protines, soit comme ple ractif. Dans le premier cas, Zn2+ est le plus souvent ttracoordonn par des atomes dazote (histidine) de soufre (cystine), ou doxygne. Dans le second cas, il stabilise le positionnement dun substrat dans le site enzymatique par des liaisons de coordinence, intervient dans le cycle catalytique (comme acide de Lewis). Ces effets sont souvent plus ou moins simultans. Dans lappareil gntique, le zinc log dans les "doigts zinc" participe la construction de mtalloprotines lies lADN et actives dans la rgulation de lexpression des gnes. Le zinc intervient aussi comme anti-oxydant direct ou indirect. Notre organisme contient 2-4 g de zinc, soit presque autant que de fer, et dans le sang la plus grande partie est lie lanhydrase carbonique des globules rouges. Une homostasie rgle la teneur du zinc dans les cellules. La capture du zinc se fait par des transporteurs dcouverts chez les bactries, levures, plantes et mammifres, appartenant une mme superfamille structurale, les protines ZIP. Chez Escherichia coli, le zinc est import par un transporteur de type ABC : une protine priplasmique ZnuA, une ATPase ZnuC et une protine membranaire ZnuB. La levure a galement un transport de zinc, mais plus complexe que celui du colibacille.
INDEX
2,4,5-T 2,4-D voir trichlorophnol (2,4,5-) voir dichlorophnol (2,4-) adipique (acide) voir adipate ADN mobile 85-115 ADP sulfurylase 175-177 ADP-ribosylation 263 AEPn 601 Aerobacter aerogenes 648 arobactine 648 Agrobacterium 123,415,624,683 AHL 119 Alachlor 598 alanine 25,291,397,663 Alcaligenes denitrificans 468,526 A. faecalis 688 A. xylosoxidans 185,674 alcane 538-550,560-564 alcne 535,538,560-564 aldolase 455,457,460,472 aldrine 615 Alexandrium minutum 248,312 alginate 672 alkapton 494 AlkB (hydroxylase) 543 alkBAC (opron) 543,544 alkylbenzne 307 alkylbenzne sulfonate 630 alkylperoxyde rductase 293 alkylsuccinate synthase 516 alkylsulfatase 631 Allocasuarina 251 allophycocyanine 63,64,66 allostrie 683 Alnus 251 Alopecurus myosuroides 628 alpha-oxydation 506,507 aluminium 656 amicyanine 653 aminoazobenzne (p-) 393 aminomuconate (2-) 483 aminomthyl-phosphonate (2-) 603 aminophnol 1,6-dioxygnase (2-) 483 aminosalicylate (5-) 393,491 aminotransfrase 149 ammoniac 22,26,46,131-149, 160-165,185-187,201,217, 245-269,300,303,343,565
AadR 274,520 ABS (site d'activation) 422,423 acnaphtne 505 actate 21,25,205-220,229-236, 328,339,342-358,593,598 Acetobacter diazotrophicus 249,258 Acetobacterium dehalogenans 157 Acetobacterium woodii 234 actoclastique (mthanognse) 214, 219,229-233 actogne 25,157,168,205-213, 327-330,351-354,566 actophnone 378 actyl transfrase 208 actylcholine estrase 492,606,607 actyl-CoA voir actyl-coenzyme A actyl-CoA synthase 208-211,230, 231,354,654 actyl-coenzyme A 16,207-213,230-232, 235,338,366,414,415,508, 522,549,562,593,597,618,654 actylne 143,161,253,257,269,308,679 actyl-phosphate 25,26,213,235 Achromobacter cycloclastes 307 acides gras 124,217,328,404,513,520, 522,535,539,541,544,550,561 Acinetobacter 117,415,422,424,428, 430,433,444,471,473,599 A. calcoaceticus 417,418,422, 424,428,429,444 AcrAB/TolC 547 Actinomyces 537 actinomycte 124,126,490,557 activateur de transcription 120,121, 260-262,271,325,326,419,422,671 acyl-CoA 541,544,550 adamantane 556 adaptation chromatique 65 adnosyl-mthionine (S-) 122,156 adhrence 116 adipate 421,548
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ammoniac mono-oxygnase 143,144, 159-165,269,565 ammonification 264,266,301 ammonium voir ammoniac AMO voir ammoniac mono-oxygnase AMP cyclique 121,274,519 AMPA 603 Amycolaptopsis methanolica 147 Anabaena 249,251,612 A. flos-aquae 58 A. variabilis 58 anarobie facultatif 342,345,527,563 anarobie strict 22 anarobiose 195-235,244-276,285-311, 317-359,475,489,501-523, 560-562,568-570,627-633 analogue de l'tat de transition 433 anammoxosome 166 anaplrotique (voie) 22 anatoxine-a 58 anhydrase carbonique 57,187,232,685 anhydride arsnieux 685 anilide 627 aniline 391,482 aniline dioxygnase 391 anisole 374,379 annamox 165,166 ANR (protine) 274 anthracne 464 anthranilate 403 anthranilique (acide) voir anthranilate anthraquinone-disulfonate (2,6-) 347 antibiotique 73,74,84,87,89,107, 110-117,123-126,386,601-637,680 antimoine 655,685,687 antimycine A 46,168,169,270 antiporteur 229,323,660 anti-sens (ARN) 100,101 APS 175-177,334,354 APS rductase 175-177,354 aquachline 650 Aquifex aeolicus 74 Arabidopsis thaliana 71,683,684 ArcA/ArcB 43,280 archaebactrie 72,74,89,218-236,249, 266,327,331,335,339,340 Archaeoglobus fulgidus 335 argent 672 argile 590 ARN 16S 74,114,233,344 ARN-polymrase 81,101,204,259,271, 277,423,242,462,544,556,654,676,683 Aroclor 470,473,474 ars (opron) 685 Ars (protines) 686 ArsA (protine) 686
arsniate 660,685-688 arsenic voir arsniate arsnite oxydase 688 Arthrobacter 251,388,415,471, 479,481,493,539,570,621 arylsulfatase 593-597,611, 613,618,630-632 Ascophyllum nodosum 637 aspartate 273,323,326,576, 580,654,661,662 Aspergillus niger 440,442,593 association anarobie 135,136 association bactrienne 125,154, 187,527,608 ATP synthase 26-31,63,225,229, 296,319,339,354 ATP (synthse d') 15,20-30,235 ATPase 15,26,28,74,169,289, 354,521,654,660-663,670,686 de type P 661,662,668 Na/K 654 atrazine 623-627 atrazine chlorohydrolase 624,625 attC (site) 109-112 attI (site) 108-112 atzA,atzB,atzC 590 AtzA,AtzB,AtzC 625 auto-inducteur 120-122 autophosphorylation 277,326 autotrophe 37-60,131-133,151,162, 168,172,187,197,206,365,328 azide voir azoture azobenzne 392 Azolla 247,251 azorductase 482 Azorhizobium caulinodans 263 Azospirillum brasilense 249 Azospirillum lipoferum 249 azote (cycle de) 160-163,246-252,264 azote (fixation de l') voir nitrognase azote diatomique 249-264 Azotobacter 247,249,252, 255-259,261,415,419 A. chroococcum 249,255 A. vinelandii 188 azoture 521 azurine 33,295,298,300,301
Bacillus 123,125,267,291,294,342,388, 390,415,417,457,479,651,661,681,687 B. cereus 382 B. megaterium 558 B. methanolicus 147 B. subtilis 39,72,86,89,123,125, 267,275,291,547,651,661,687
INDEX
bactrie prosthque 146 bactrie du fer 179,180,345 bactrie nitrifiante 143,144,164,268 bactriochlorophylle 48 bactriophage 100,106,110,111 Mu 100,106 bactrode 250 bande SORET 161 Beggiatoa 172,331 benABCD (opron) 420 BenM (protine) 418,420 benz(a)pyrne 464 benzne 138,307,345,365-377, 384,389,394-397,465,471, 472,492,503,507,509,610 benzoate 394,398,402,404,414, 417-421,427,434,438-465,472, 474,490,508-513,518,520,527 benzoate-CoA ligase 510 benzoque (acide) voir benzoate 388 benzoquinone (p-) benzoyl-CoA 506-511,520-523 benzoyl-CoA rductase 520 benzoylsuccinate synthase 512-514 benzylique (alcool) 117,369,378,461 bta-oxydation 44 ,513,521,522, 539,544,546,550,593 bi-mtallique (centre) 137-142,153,231, 295,305-308,370,375,376,543,653 biochanine A 204 biofilm 115-119 biolixiviation 182,183 bioluminescence 119,120 biomasse 57,355,508 bioptrine 689 biotine 23 biphnyle 354,394-398, 470-476,485-487,614 bismuth 655 Blastobacter 493 bleu de mthylne 168 bote Fur 651 bote Lux 621 bore 122 boues actives 10 BOYER (thorie de) 28,29,66,69 bph (opron) 471,475 BphC (protine) 476,480,481 Bradyrhizobium japonicum 274 Brassica oleracea 156 Brevibacterium fuscum 430 brome 405,444,557,570,618 bromobenzne 394 bromomthane 157 Bromoxynil 617,618 BTEX 507 Burkholderia
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369,376,395, 396,415,444,473,476 B. cepacia 381,382,444,565,617 Butoxythanol (2-) 536 Butyrivibrio fibrisolvens 580
CadA (protine) 662,663,668 cadmium 654,655,661,674,683 cadre de lecture 85,97,100 Caenorhabditis elegans 71 calcium 303,344,358,654,656 Caldariomyces fumago 636 CALVIN-BENSON (cycle de) 136,143, 151,169-172,180,204-206 Calyptogena 151 camphre 540,550-557 Campylobacter 329 CamR (rpresseur) 556 Candida 399,537,538,540,541 Candidatus 166 CAP (protine) voir CRP carbamate 620-622 carbaryl 491-493,620-622 carbazole 484 carbocation 210,564 carbofuran 622 carboxydotrophe 167,168,303 carboxymuconate cyclo-isomrase 416,442 carboxysome 57,172 carotnode 48,54,61,66,538 carvone 549,550 cassette (de gnes) 107-114 Casuarina 251 CatA (protine) 416-419,425,428 catalase 207,636,648 catBCA (opron) 422 catchol 367,370,383-387, 402-405,411-446,453,455, 464-487,490,492,517,558 catchol 1,2-dioxygnase 414-422,429, 430,433,434,446,466,481,487,629 catchol 2,3-dioxygnase 478 catcholate 648 CatR (protine) 422-424,428,595 Caulobacter 72,96,146 C. crescentus 72,96 CCl2F2 voir chlorofluorocarbones CCl3F voir chlorofluorocarbones centre mono-mtallique 368,374,376 centres P (nitrognase) 253,254 centre ractionnel 51-56,62 cercle roulant (rplication en) 91,93 cruloplasmine 673 CFC 155,157,158,557
778
chane respiratoire 16-20,30-45,52, 60,136,168-170,172,176, 197,228,252,294,300,304 chalcopyrite 182 chalcosine 182 champignon 13,115,135,217,235, 236,251,270,288,309,310,370, 371,381,382,393,415,424,438,440, 442,445,464,466,468,487-489,655 chimio-autotrophe 143,172,328 chimio-htrotrophe 172,328 chimio-lithotrophe 131,133,197 Chlamydia trachomatis 72 chloral 140,153 chlorate 357,358,507 chlordane 610,615 chlorite dismutase 358 chloro-2,4-dinitrobenzne (1-) 599 chloro-4-hydroxyphnylactate (3-) 356 chloro-4-nitrobenzne (1-) 482 chloroactamides 598 chloroaniline (2-) 629 chlorobenzne 394-396 chlorobenzoate (2-) 425,474 chlorobenzoate (3-) 351-353,425,426, 474,528,593,595,620 chlorobenzoate (4-) 473,474,505, 507,524-527,612,614 Chlorobium 47,51,55,184 C. limicola 51,55,184 C. tepidum 55 chlorocatchol 1,2-dioxygnase 425 chlorocatchols 425-428, 444-446,593,611,621 Chloroflexus 47 chlorofluorocarbones 134,155,158,557 chloroforme 139-141,144,152, 154,219,527,565,569 chloromthane 155,156 chloroperoxydase 636,637 chlorophnols 355,394,436,446,619 chlorophylles 48,57,61 chlorosome 53,54 chlorottrafluorothane 159 chlorotoluron 628 chlorpyrifos 607 chlorure de vinyle 354,355,564,565,568 cholra 87,112 cholestrol 151,549 Chromatium 47,175,184,335 C. vinosum 175,184,335 chrome 180,349,655,657,674 chromosome bactrien 71-119,414,417, 429,445,479,593,671,687,688 Chrysanthemum cinerariaefolium 622 ciliatine 601
cintique rapide 141,310 cis,cis-muconate 415,419-423,439,446 cis-benzne dihydrodiol 367 citrate de titane 207,234,521 Cladosporium resinae 542 Clavibacter michiganese 625 ClcA (protine) 425,428 Clostridium 24,25,200,205-211, 231,249,253,329,335,342, 482,514,517,567,620,633 C. pasteurianum 25,200,201,205-211, 231,249,289,253,335,633 C. sticklandii 25 C. thermoaceticum 205,209-211 CnrA,B,C 675 CO dshydrognase 168-170,206-212, 230,231,308,354 cobalamine voir corrinode cobalt 157,180,209,211,225,226,231, 341,349,513,535,567,674,679,683 cobamide voir corrinode CODH voir CO dshydrognase codon 74,75,85,97 coenzyme A 23,505-528,206,211,212, 235,455,505-508,513-528,544,562 coenzyme B 226,227 coenzyme M 224-227,230,231,546,629 co-intgrat 105 colibacille voir Escherichia coli colicine 652 comtabolisme 140,142,145,152,154, 354,355,468,469,471,473,527, 537,546,548,574,598,613,614,633 ComK 123 Comomonas testosteroni 457, 471,475,490 comptence (de la transformation) 123 complexe antennaire 52-55,61-66 complexe bc1 18,19, 33-39,46,291,304,347 complexe I, II (peroxydase) 634 complexe multi-protique 80-83 ComX (dcapeptide) 123 congnre 470-475,486 conjugaison 463,621 conservation de l'nergie 16-45,50-55 constante de HAMMETT 434 cop (opron) 669 CopA, B (protines) 662,668-672 CorA (protine) 647 corrinode 157,209,224-226,231, 234,356,566,567,654 Corynebacterium 526,537,538,571,573 COS 325 COT (C organique total) 10 coton 608
INDEX
courant d'lectrons inverse 16,37,50,169 C-P lyase 602-605 crosote 467,486 345,376,385,505 crsols (m-,o-,p-) CRP voir CAP crufomate 600,601 CS, ICS 109,110 CSF 123 CueO (protine) 673 cuivre 39,40,42,46,137-144,150,154, 180-184,269,293-309349,653-672,683 culture continue 595 culture mixte 473 Cunninghamella elegans 466 cuprdoxine 300 Curvularia inaequalis 637 CusS/CusR 672 Customblen 536 cyanase 185,186,188 cyanate 184,185,186-188,253 Cyanidium caldarium 57 cyanobactrie 19,34,48,56-65,126, 232,247-263,291,306,344, 382,539,604-622,630,650 cyanobactrine 59 cyanohydrine 184,186,188 cyanure 32,39,42,43,131,133,158,168, 184-188,231,253,257,304,308,437,618 cyanurique (acide) 625,626 cycle de KREBS voir KREBS (cycle de) cyclodextrines 602,622 cyclohexane 518,522,545-548 cyclohexane-carboxylate 522 cyclohexanol 505,548,563 cyclohexanone-1,2-mono-oxygnase 548 cyclo-isomrase 221,222,416,420, 422,426,439-442,446,593 Cylindrocarpon tonkinense 270 CymA (protine) 346,347 cypermthrine 622 cystine 198-200,272,296,375, 380,515,655,682,683 cytochrome 18,24,30-46,51,62,63,198, 202,204,227,228,231,249,274, 323,325,335-341,347,353,354, 358,370,382,391,467,540,541,550, 551,555-558,564,626,633-636,648 a1c1 163 b 34,36,42,143, 227-231,291,304,346 b2 228,231 b6f 19 bc1 voir complexe bc1 bd 42-45 bo 42-45 c 18,30-39,43,46,51,62,63,136, 137,162,163,168,173-175,249,
779
274,293-308,336,337,340,346, 347,353,354,358,370,634,636 c1 34-37 c3 336-339 cbb3 173,249,250,263 cd1 294,295,299,300,307 P450 30,138,309-311, 370,371,382,391,467, 540-542,550-558,564,633 P450nor 309 P460 1912,162 P468 165 cytochrome c oxydase 18,33,38-41,46, 137,163,231,294,295, 304-308,370,375,376,653 Cytophaga 172 CzcA, B, C 675
Dam (systme) 77,101,103 DAPI 166 DBO5 10 DCDD 489 DCO 10 DcuA,B 323 DDE 613,614 DDT 610-614 dazaflavine 222,227 dcarboxylase 23,209,416,460,516 dchloration rductrice 471,489,595,616 dchloration 153,233,354,395,396,436, 447,471-475,526,570,611,615,616,626 Dechloromonas 358,510 dfluoration 405,406,608 Dehalobacter restrictus 354,565,567 Dehalospirillum multivorans 354,356,357 Delftia 391 dmthylation 558 dnitrification 44,45,218,232,246,248, 249,249,264-279,287-312,341, 358,503-508,514,516,519,522, 523,527,563,569,627,633,653 dphosphorylation 263,661 dshalognase 353-356,404,438,524, 527,564-580,611,620 dshalognation 163,234,353,354,404, 435,438,525-527,555,557, 567-574,579,593,608,616,619 rductrice 438,593,616,619 respiratoire 351 dshydrognase 18,25,43,207-209, 221-223,228,230,235,236,246, 268,287,288,289,304,321,354,367, 370,378,389,395,400,402,418,455, 459,460,471,472,483,514,522,540, 544,556,563,572,593,611,614,654 dshydrognation voir dshydrognase
780
dsulfinase 633 Desulfobacter 328 Desulfobacterium 356 D. autotrophicum 234,328 Desulfobulbus propionicus 329 dsulfofuscidine 335 Desulfomicrobium baculatum 200 Desulfomonas 328 Desulfomonile tiedjei 351-354,570,620 Desulfonema 328,329 dsulforubidine 335 Desulfosarcina 328 Desulfotomaculum nigrificans 328 Desulfovibrio 198,205,288,294,301,302, 328,329,335-340,342,345,354,392 D. baarsii 328 D. desulfuricans 200,294,301, 302,328,329,335-339 D. vulgaris 337 dsulfoviridine 335,354 dsulfuration des hydrocarbures 632 Desulfurolobus ambivalens 340 Desulfuromonas 327,329,339,340 D. acetoxidans 329,339 D. succinoxidans 339 DFP 608,609 dianisidine (o-) 139 diatomes 246,251,252,382,650 diazinon 606 dibenzofurane 484,486-488 dibenzofurane-4,4a-dioxygnase 488 486-488 dibenzo-p-dioxine dibromo-3-chloropropane (1,2-) 573 dibromomthane 565 dibromo-propane (1,2-) 571 dichloro-1-propne (2,3-) 563,564 dichloroaniline (3,4-) 628,629 dichlorobenzne 394-396, 558,559,628,629 dichlorocatchol (3,5-) 394,593-598 dichlorothane (1,2-) 152,234, 571,572,575 dichlorothane dshalognase 572 dichlorothylnes 354,565 dichlorohydroquinone (2,6-) 437 dichloromthane 139,140,565 dichloromuconate (2,4-) 595 dichlorophnol (2,3-) 356 dichlorophnol (2,4-) 394 dichlorophnol (2,5-) 374 dichloropropne (1,3-) 574 dichlorprop 600 dichrosme circulaire 307 dine hydrolase 426 dine-carboxylate dshydrognase 460 dine-CoA 521
dine-lactone 427,428,444,445,593 dine-lactone hydrolase 428,444,445,593 dihydrodiol 367-369,382,396 dihydroxybiphnyle (2,3-) 476,485 di-isopropylfluorophosphate 608,609 di-isopylphosphate 609 dimercaptopropanol (2,3-) 685 dimthoxyphnol (2,6-) 673 dimthylmercure 678 dimthylsulfonium-propionate 177 dimthylsulfoxyde 19,178,323,342,379 dimthylsulfure 145,161,177, 178,288,323,379,629 dimthylsulfure mono-oxygnase 179 dinitrognase voir nitrognase dinitrognase rductase 253,254,263 dinitrophnol (2,4-) 387 Dinophysis 312 dioxine 470,485-489 dioxyde de chlore 357,358,486 dioxyde de manganse 340-349 dioxyde de soufre 171,178 dioxygnase 367-378,386,390,395,396, 403-406,413,419,425,429-438, 445-447,457,460,464,465,471-475, 479,482,484,488,491,492,523 dioxygnase ortho 413,429-435,445,479 dioxygnation angulaire 484,488 dissimilation 205-213,264-270,301,327, 333,335,339,341,342,351 disulfure de carbone 171,179,188 dithiol 656,681,686 DMS 177,178 DmsA,DmsB,DmsC 323 DMSO voir dimthylsulfoxyde DMSP 177 DNR 274 dodcane 561,562 dodcylsuccinique (acide) 561 doubles hybrides 81 draT,draG 263 Dryas 251 DsbB/DsbA 656 DTT dchlorase 613
voir colibacille 634,635,636,637 621 133,134,215,248, 265,267,307,312,344 Eichornia crassipes 135,150 Elaeagnus angustifolia 251 lment d'insertion 594 mulsifiant 539 nantiomres 371,377,600,601,615 E. coli eau oxygne ectomycorhizes effet de serre
INDEX
nol-lactone 418,427,443 Enterobacter aerogenes 602,603 entrobactrie 266,458,631 entrobactine 648,652,673 Enterococcus faecalis 96,123 Enterococcus hirae 662,668 Enteromorpha intestinalis 178 poxydation voir poxyde poxyde 140,153,161,370, 371,466,467,546,573 puration 10 puration par le fer 343 Erwinia carotovora 123,126 Escherichia coli 46,72-96,81-88,116, 122,224,233,274-278,289-291, 321-325,371,373,395,396,542-548, 301,569,604,605,611,630,631,648, 651,660-666,676,677,680,687,688 espce symbiotique voir symbiose ester-phosphates 604 ester-phosphites 604 tain 659 thanol 21 thylbenzne 366,372,376-379, 505,507,508 thylcyclopentane 516 euglne 235 volution 75-115,198,200,217,237, 279,304,309,321,344,359,370, 376,396,428,431,440,445,480, 481,482,490,491,606,608,688 exciton 52-54,63 exonuclase 79 exotoxine 123
781
320,329,330,339-343,352,354,507, 511,514,517,562,566,580,620,654 lactique 20,58 propionique 507,562 ferrdoxine 55,62,209-211,230,231, 235,236,249,253,254,272,300,309, 323,335,338,367-369,395,401,403, 460,465,472,488,492,507,514,519, 521,543,551,556,558,566,626,656 ferrdoxine-nitrite rductase 269 ferrirductase 650 ferritine 650 ferrozine 341,351 fer-soufre 30-37,43,55,61,198,200, 209-212,221,223,235,253-255,258, 259,272,274,287,290,291,300,321, 335,339,368,369,374,377,380,381, 465,488,514,517,520,551,566,567,654 frulate 342 FH4 voir ttrahydrofolate Filao 251 fimbriae 115 firmicute 89 fixation de l'azote voir nitrognase FixJ (protine) 262,263,274 FixK (protine) 262,272-274 FixL (protine) 262,263,274 flavine 138,170,176,209,222, 368,399,401,519,520,681 flavine rductase 120 Flavobacterium 437,617,618 flavocytochrome 175,370,648 flavonode 175,370,648 fleur d'eau 59 floc 10,115,119 fluor 404,405,427,444,447,557,579,657 fluoranthne 468 fluoroactate 404,579,580 fluoroactate dshalognase 580 fluorobenzne 394 fluorobenzoate (3-) 405,406,427,444,526 fluorobenzoate (4-) 404,405 fluorocarbone 267 fluorocatchol (4-) 404,405 fluoromthane 157 fluoromuconate (3-) 427,444 fluoromuconolactone (4-) 444 fluorophnol 448 fluorothronine (4-) 404 fluorotolune (3-) 405 FMO (trimre) 54,55 FNR (protine) 44,271-279, 325,519,528,648 F0F1 (ATPase) 27-29,319,374,386,563,565 Fomes 156 force protonmotrice 16,17,25-30,330, 353,354,674,686
222-228,236,547 225,226,234,654 108,110, 113,663,674 facteur de virulence 87,107,123,651 Fe/Mo (noyau) 254,255 Fenamifos 607 FENTON (raction de) 293,651 FepA (protine) 652 fer 30-34,39,42,133-142,161, 172,179-183,198-200,211, 231-233,253-274,289,293-305, 310,319,320,321,330,335-351,358, 368-380,396,397,419,429-436,455, 477-483,488,491,542,551-553,555, 576,593,635,636,647-651,660,665,685 (coordinence) 341 (dosage) 341 (rductase) 346 fermentation 15,20-26,30,58,197, 198,205,213-220,229,235,249,319,
F420 F430 facteur de rsistance
782
46,136,143, 146-148,152,208,383 formiate 21,157,185,206-209,218-221, 230,328,342,345,351-354, 457,514,565,570,619,654 formiate dshydrognase 208,209 formylglycine 630 formyl-mthanofurane 221,230 fosfomycine 605 fourche de rplication 77,93,101 Frankia 247,251,281,284 frdABCD (opron) 276,321 fumarate 22,198,201,251,273-276, 319,321-323,326,327,339,342,347, 358,442,490,491,512-515,561,569 Fur (protine) 653 Fusarium oxysporum 270,309 Fusarium roseum 624 formaldhyde
glyoxylate 565,593,597 glyoxylique (acide) voir glyoxylate glyphosate 601-605 goethite 346 granules 115,218,331,332,350,351 greigite 350 groupe d'incompatibilit (plasmides) 90
Gallionella ferruginea 180 gamma-butyrolactone 123 Garlon 599 GATC (squence) 77-79 gazole 179,560,561 418,421 gnes ben gnes cat 418,420,422,428 gnes pca 418,421 593 gnes tfd gnome 71-126,218,278,429,663 gnomique voir gnome gentisate 385,411,413,455,490-493 gentisate 1,2-dioxygnase 491 Geobacter 320,342,344,345,348 G. metallireducens 342,345,348 G. sulfurreducens 346 gosmine 58 Giardia intestinalis 236 Glicladium 621 GlnB (protine) 260,261 GlnK (protine) 260,261 glucosinolate 177,187 glutamate 229,246,440,477,479,654,662 glutamate dshydrognase 246 glutamate synthase 246 glutamine 246,260-262,303,375,654 glutamine synthtase 246,260,275 glutamyl transfrase (-) 598 glutathion 335,437,438,491,527,598, 611,616,624,634,636,681,689 glutathion rductase 681 glutathion S-transfrase 598 glycrate kinase 149 glycine 25,514,662 glycine rductase 25 glycosaminoglycanes 629
H2S voir Hydrogne sulfur Haemophilus influenzae 527,571,573,575 halidohydrolase 579 haloacide (2-) 575 haloacide dshalognase 402,403 halobenzoate 398,401,403 halobenzoate dioxygnase 402,403 halogne 140,152,156 halomthane 155,156,527,571 Halomonas aquamarina 650 halon 156,159 haloperoxydase 156,636,637 vanadium 636,637 halorespiration 353 Hansenula 537 H. polymorpha 145 HAP 377,385,464,467-469 haut spin 305,442 HbaR (protine) 519,520 HCFC 158 HCN voir cyanure hlicase 79,93 Heliobacterium 47 hmagglutinine 113 hme A 31,32,39-42,305 hme B 31,32,34,305,551 hme C 31,34,35,161,295,296, 298,301-305,325,337,347 hme CD1 295,296 hme D 32,295,297 hme O 31,32 hmrythrine 648 hmocyanine 306 hmolytique (souche) 88,357,651 heptadcane 561 Herbaspirillum seropedicae 249 herbicides 424,357,365,475,485, 592-606,623-629,678 chlor 598-601 htro-actogne 205 htrocycliques (dioxygnation) 378 htrocyste 58,126,250,251 htrodisulfure rductase 227,228,231 htrodisulfure 226-231 htrotrophe 58 Hevea brasilensis 538 hexachlorobenzne 394,395
INDEX
hexachlorocyclohexane 610 hexadcane 233,539,540,542,560,561 hexadcanol 398,540 hexulose monophosphate (cycle) 145,148 hexulose-6-phosphate synthase 148 histidine 17,29,31,161,203,262,296, 301,302,305,308326,337,380,431, 477,479,543,580,625,635,651,672 homo-actogne 157,205,206 homocitrate 254,259 homogentisate 503 homosrine lactone 122 Hormonema 549 HQNO 36,169,353 humus 144,312,319,320, 341,346,347,598,630,647 HupT/HupR 202,203 HupU,HupV 202 hybridation molculaire 145,257 hydratase 457,460,522,563 hydrate de mthane 134,214,215 hydrazine 165,254 hydrazine hydrolase 166 hydrocarbure alicyclique 547,548 hydrocarbure aliphatique 142,309,366, 503,522,538-550,560-564 hydrocarbure aromatique 366,373,377, 385,386,464-469,505,536,537 hydrocarbure aromatique polycycliquevoir HAP hydrochlorofluorocarbone 158 hydrognase 18,197-204,208-211, 221-224,227,228,231,235,256, 329,335-340,354,566,648,654,676 [Fe] 198-201,336 [NiFe] 198-200,336 [NiFeSe] 198-200,336 hydrogne 17,20-22,46,133, 135,168,197-236,245,252-256,320, 328-358,388,398,404,435,437,441,477, 514-527,552,555,619,634,648,676,685 hydrogne sulfur 22,72,86,131-141, 151,171,177,180,188,324, 328,340,171,173,184,329 hydrognosome 235-237 hydrognotrophe 219,328,330 hydrolase 443 hydroquinone 389 hydrosulfite 173,333,338 hydrosulfure 158,171,173,175,343 hydroxamate 351,577 hydroxybenzoate (3-) 385,490,520 hydroxybenzoate (4-) 383,398,399,404, 418,421,432,436,465,505,509, 516,517,518,519,524,526,527 hydroxylamine 143,159-161,165,268, 269,298,300,302,303,437,521,565,577 hydroxylation
783
voir mono-oxygnase,dioxygnase hydroxymuconic semialdhyde hydrolase (4-) 460 hydroxyperoxyde 401 hydroxyphnylpyruvate (4-) 493 hydroxypyruvate rductase 149 Hyp (protines) 202 hyperthermophile 74,175,221, 266,287,328,344 Hyphomicrobium 146,157 H. chloromethanicum 157 hypochlorite 357,358 Hyppophae 251
IBS (site de liaison) 424 Ideonella dechloratans 358 IHF 103,204,259,271,275,277,462,463 lot de pathogncit 85-88,114 immuno-dosages 589,590 indne 372 indigo 372,373,377,378 indolactique (acide 3-) 592 indole 372,503 induction/rpression 117,118,250,417, 419,421,520,596,605,685,688 inhibiteur suicide 405,609 Inipol EAP22 536 insecticides 492,600-616,622 insertion (squence d') voir IS intgrase 108-114 intgration (plasmide) 94 intgrons (classes 1 et 2) 111 iode 405,437,444,570 iodobenzne 394 iodobenzoate (2-) 403,526 iodophnol (2-) 437 iodopropane (1-) 571 ionophore 17 IRL,IRR 97 IRMS 215 IS 76,86,95-106,395,464,594 IS150 96 IS50R,IS50L 101,103 isoalloxazine (noyau) 401 iso-enzyme 415,541,575 isonicotinique (acide) 433 iso-octane 545 isothiocyanate 177 ISP 34-37,368-369,374,377 ITR 104 kanamycine krogne 101 504
784
krosne Klebsiella aerogenes Klebsiella pneumoniae Koc KRAFT (procd) KREBS (cycle de) 536,545 249 258-260,291,614 voir log Koc 357 319,321,413, 442,483,513,596
magntotactique (bactrie) 349,350,351 mas 95,608,623 malate 207,251,270,323, 327,339,366,442,541 malylactate 443,445,491 malylactate rductase 445,593 malylactoactate (4-) 494 malolactique (fermentation) 24 malyl-CoA lyase 149 mandlate racmase 440,442 manganse 62,183,232,289, 340-349,393,439,440,441,458, 479,481,489,517,636,654,661 mare noire 467,505,535,545 mare verte 312 MCD 170 mgaplasmide 546,674 membranes internes 142 mnaquinone 19,321,323,346,353 menthol 549 mer (opron) 680-683 Mer (protines) 680 MerA 681 MerB (lyase) 680 MerR (protine) 660,683 mercure 180,678-684 Mesembryanthemum 156 MET 10 mta (ouverture et voie) voir voie mta mtallothionine 655,656,659,683 mthane 131-165,168,172,188,197,205, 207,213-236,257,324,329,331,332,343, 352,489,504,535,537,564,565,603,619 anthropognique 215 du rumen 217 mthane mono-oxygnase 137,140,152, 135-144,152-154,160,188,564 mthanesulfonate 179 mthanethiol 145,155,177,178,325 mthanethiol oxydase 179 mthanisation 213,216,219,392 Methanobacterium thermoaceticum 218 Methanococcus jannaschii 218 Methanococcus maripaludis 249 mthanofurane 221,230 mthanognes 134,135,209,211-235, 236,249,287,324,327-332,339,341, 351-355,489,527,546,560,566,570,619 mthanogense, voir Mthanognes mthanol 46,136,144,145,188, 206,208,218,219,221,224,227 mthanol dshydrognase 151 mthanophnazine 227,228,231 Methanosarcina barkeri 157,221,223, 224,231,234,249,339 Methanosarcina mazei 219,224,227,228
laccase lactate
653,673 20,43,207,320,328,329, 338,339,342,345,576,577 Lactobacillus plantarum 123 Lactobacillus sake 123 Lactococcus lactis 72,96,123 lactoferrine 650 ladderane 166 lagunage 10 lauryl-phosphate 536 LCM 64 Lemna minor 135,150 Leptothrix 180 L. discophora 183 L. ochracea 180 levure 270,311,415,442,487, 488,537,538,539,540,542 levure mthylotrophe 148,150 LH1,LH2 voir complexes antennaires liaison thiophosphoryle 607 lichen 252,637 ligase 79,506-511,517-520,524,528,543 lignine 365,382,384,393,403, 414,438,445,489,628,634,636 limonne 549 limonne mono-oxygnase 549 LinA,LinB,LinE 611 lindane 610-612 LiP (peroxydase) 489 lipoamide rductase 681 Listeria monocytogenes 88 litho-autotrophe 268 lixiviation 182,660 log Koc 538,606 lucifrase 120 lux (opron) 120 LuxR (protine) 120,121 lysozyme 217 LysR (protine) 422,424 macrolide magnsium 124 26,40,48,61,199,200, 344,350,351,654,656,661 magntite 350,351 magntosome 350,351 Magnetospirillum magnetotacticum 349,351
INDEX
Methanosarcina thermoautotrophicum 340 Methanosarcina thermophila 229,232 Methanospirillum 352 mthanotrophe 135,136, 139-160,162,331,653 mthanotrophe symbiotique 151 mthimazole 388 mthionine 31,308,327, 397,631,633,654 mthionine synthase 157 mthylamine 219,493 mthylase 77,101,103 mthylation 678 mthylbenzylique (alcool) 375 mthylcatchol (3-) 370,376,406, 434,455,458,478 mthylchlorofome 141 mthyl-coenzyme M 654 mthyl-dichlorprop 600 mthyl-octanoyl-CoA (4-) 562 mthyle transfrase 509 mthylne-FH4 149,157,209 mthyl-FH4 157,210 mthylgentisate (3-) 491 mthylhopane 56 mthylhydroxylase 509 mthylmalonyl-CoA 23,562 mthyl-mercure 678,682 Methylobacter 145,148 Methylobacterium 157 M. extorquens 147 M. thiocyanatum 187,188 Methylococcus 136,137,145,146,162 M. capsulatus 137,146,162 Methylocystis 145,148 Methylomonas 145,148 Methylosinus 140,142,145,148, 153,154,376,565 M. trichosporium 140,142,153,154,376 mthylotrophe 46,144-152, 156-189,206,219,622 mthyl-parathion 608 mthylphosphonate 603,604 mthyltransfrase 156,157, 208-210,227,383 mthylviologne 521 metolachlor 598,600 MGD 221,323,324,654 mica 590 microcystine 58 Microcystis aeruginosa 58 Microcystis flos-aquae 59 Microthrix parvicella 119 mispickel 685 mitochondrie 31-34,321 MNK (maladie de MENKES) 662 MnP (peroxydase) 393,489,654 Mo/Fe (protine) modulon molybdne
785
253-256 273,279 162,168,170,175, 221,252-256,259,263, 287-291,323-325,518,654,688 molybdoptrine 175,221,289,323,517,518 mono-oxygnase 269,309,368-376, 382-390,400,401,436,459,467, 593-597,617,626,632,648,653 monoterpne 505,549 monoxyde de carbone 23,32,133-136, 140,143,147,152,161,167-171, 180,188,198,200,202,206-213, 218-221,224,229-231,253,294,308, 328,339,343,352-354,514,551,565 monoxyde de chlore 155 Moraxella 388,471,558,579,580,629 Mssbauer 272 MPTH4 220-225,229,230,547 MtrB 346,347 muconate cyclo-isomrase 420,422, 439-442,446 muconolactone isomrase 416 mutation 75-81,107,116,274, 277,291,339,381,401,403, 420,424,438,459,477,611,663,683 MutH (endonuclase) 78 MutL (ATPase) 78 MutS 77-79 Mycobacterium 415,468,469,537, 538,545,565,573,617,630,649 Mycoplasma genitalium 72 mycoplasme 72,73,85 mycorhize 160 myxobactries 126 myxothiazol 36
N-acyl-L-homosrine-lactone NADH dshydrognase
119 18,43,46, 228,275,304 NADH oxydase 207,554,555 nah (opron) 492 NAH7 373,464,465,466,492 naphtalne 139,366,371-385,395,414, 463-468,478,481,491-493,505,555,556 naphtalne dioxygnase 371-374,377, 380,465,488,492 naphtol 139,381,466,493 naphtoquinone voir mnaquinone naproanilide 628 NarL 273-277 NarX 273-277 nbzABCDE (opron) 483 NDH voir NADH dshydrognase Neisseria gonorrhoeae 86 Neisseria meningitidis 72,652
786
nmaticide 622 Neurospora crassa 71,287,415,440,442 nickel 198-202,211,213,222,223, 226,231,336,337,349,654,674,676 nif (opron) 258-262 NifA 259-262 nifHDK (gnes) 3 NifL 259-261 NifS 259,273 NIH-shift 493 nisine 123 nitrapyrine 269 nitrate 44,144,159-166,172,178,198, 201,221,233,245-248,264,265-277, 287-294,301-304,309-312,320-324, 328,330,339-343,345,358,505-507, 523,527,536,560,563,612,627,654 nitrate rductase 267-269,274,277, 287-292,323,324,358,612,654 nitrification 143,159-165,246, 247,268,269,312,565,653 nitrile 187,188,618,623 nitrite 143,158-165,172,200,247, 265-269,270,273-277,291-304,307, 309,311,328,330,335,340,342,345 nitrite rductase 166,265,267,274, 277,293-302,307,309,335,648,653 Nitrobacter 159,162-164 N. winogradski 163 nitrobenzne 140,482-484 nitrocatchol (4-) 388 nitrognase 145,150,188,204, 247-265,274,287,304,308,511,522,654 fer seul 255,256 vanadium 255 nitronium 389 nitrophnol 386-388,393,482 nitrorductase 482 Nitrosomonas 114,143,268,269,303 N. europeae 143 Nitrosovibrio 163 Nitrospina,Nitrospira 163,164,328 nitrotolune 374,386,389,482,484 NNR 274 NO rductase 303-310,648 Nocardia 293,367,415, 419,446,471,537,538 N. corallina 367 Nodularia spumigena 59 nodularine 59 nodule racinaire 250 NorB,NorC,NorE 304,305,304,305 Nostoc 57,249,252,612 N. commune 57 N. punctiforme 57
NosZ (protine) 304,307 noyau bi-mtallique 305,307,376,542,653 noyau fer-soufre voir fer-soufre noyau P (nitrognase) voir centres P NrfA (protine) 301 NtrC (protine) 260,261 nuclase de restriction 76,95 Nyctotherus ovalis 237
OLAND (conditions) 268 Oligotropha carboxydovorans 168,170 omega-oxydation 539 OmpT (protine) 87 ORF voir cadre de lecture organochlor 610,612,615 organomercurique 678,680,681 organophosphate 607 origine de rplication 91-93 oriT voir origine de rplication ortho (ouverture et voie) voir voie ortho ortho (voie modifie) voir voie ortho modifie Oscillatoria terebriformis 58 oxaloactate 22,149,153 oxne 554 oxo-4-hydroxypentanoate (2-) 472 oxoadipate (3-) 414-443,445,489, 526,593,594,607,611,618 oxoadipate nol-lactone hydrolase (3-) 416, 418,427,443,444 oxocaproate (5-) 563 oxocrotonate dcarboxylase (4-) 460 oxocrotonate tautomrase (4-) 460 oxoglutarate (2-) 246,596-598,632 oxydase cbb3 305 oxyde du chlore (comme accepteur) 357 oxyde nitreux 246-248,253,257,265-270, 274,292,302,303,307,308-312,330 oxyde nitreux rductase 269,274 oxyde nitrique 247,248,265-270, 274,292-300,303-311,330,388,648 oxydorduction du phosphore 606 oxygnase voir mono-,di-oxygnase oxygne-18 539,576,580 OxyR (protine) 280 ozone 134,155,167, 248,267,270,404,678 Paracoccus denitrificans 38,39,45,188, 274,291-307,345,633 parahyphoplasme 166 paraoxon 608,609 parathion 607,608 PAS (module) 43
INDEX
passage l'anarobiose 321 pathogne 71-96,107, 110-114,120,613,651,672 pathotype 88 PbrA,PbrT 666,667 PCB voir polychloro-biphnyle PCE 564,566,568 PCP voir pentachlorophnol PCR 71,74,144,251,555 PCP-4-mono-oxygnase 617 Pelodictyon 47 pnicilline 117 Penicillium 270,605,624 P. digitatum 549 P. notatum 605 pentachlorophnol 270,605,624 pentadcane 561 pentanochlor 628 peptidoglycane 57 Peptostreptococcus productus 207 perchlorate 357,358 perfluorobutane 159 perfluoropropane 159 prillylique (acide) 550 Periplaneta americana 237 priplasme 39,143,174,274, 289,292,307,321,325,336, 337,354,370,656,672,676,680 permase 16,123 peroxydase 142,156,207,274,393,396, 488,489,555,593,598,634,636,648,654 vanadium 634,637 peroxyde 370,401,432,651 peroxynitrite 293 peroxysome 235,540,541 pesticides 312,386,424,470, 491,492,589-638,689 ptrole 215,347,365,464, 467,492,504,505,508,632 Phanerochaete chrysosporium 393,489,593 Phanerochaete sordida 489 Phellinus 156 phnanthrne 377,385,464,478 phnatole 374 phnazine mthosulfate 168 phnol 138,342,345,366, 373-376,379-384,394,414, 503,516-518,563,617,622 phnol hydroxylase 375,376 phnoxyactate 394,592,593 phnoxybenzoate (3-) 622 phnylactate 505-507 phnylactyl-CoA 506 phnylalanine 365,375,503,507, 525,556,571,601 phnylalanine-ammoniac lyase 365 phnyl-alcanoate 596
787
393 phnylne diamine (p-) phnylglyoxylate 506,507 phnylpropioniate 503 phromone 119,126 Phlebia radiata 393 phn (opron) 603,604 PhoR (protine) 605 Phormidium 612 phosphonolpyruvate 149 phosphonolpyruvate carboxylase 149 phosphoglycrate 149,597 phosphokinase 654 phosphonatase 603 phosphonate 601-606 phosphore(oxydorduction) 606 phosphotransfrase 654 photohtrotrophe arobie 48 photolyse de l'eau 62 photosynthse 15,47-66,203,246,252, 253,262,306,341,344,518,523, 528,623,627,629,653,654,684 non oxygnique 47-55 oxygnique 56-66,306,344,654 photosystme 58-64 phototrophe 197,198,247,251, 252,262,335,513 phototrophe anarobie 47-55,172,197 phtalate 399 phtalate dioxygnase (4,5-) 399 phycobiline 63-65 phycobiliprotine 63-65 phycobilisome 62-65 phycocyanine 63 phycorythrine 63,66 phycorythrocyanine 63 phylloquinone 61 phytochrome 63 phytohormone 592,600 phytoplancton 177,178,246, 248,312,323,650 phytoremdiation 683,689 Pieris ensiformis 689 pimlyl-CoA 522 planctomycte 166 plantaricine 123 plasmide 72-126,142,154,170,370-397, 414,426-429,444,445,455,458-466, 472,478,479,483,484,492,493,543,544, 551,571,573,580,593-596,608,621,626, 648,660-663,670,671,680,682,685-688 CAM 551 de virulence 87 F 92,96 NAH7 373,464,465,492 OCT 543,544 pJP4 593 pUO2 580
788
SAL 464 TOL 369,458-463 plastocyanine 653 plastoquinone 63 plomb 180,571,655-659,666 polychlorobenzne 558 polychloro-biphnyle 354,470-476, 489,523,613,616 polychlorophnol 620 polythionate 332,333 population mixte 122,213,214,517,548 porine 547,651 porphyrine 22,31-42,63, 162,262,274,295,297,302,303, 310,337,552,635,636,650-653 potentiel de l'hydrogne 22 potentiel lectrochimique (membranaire) 15-23,30,38,170,173,177,218, 224,225,230,235,264,317,319, 322,329,336,566,570,660,674,686 potentiel redox 22 pourriture blanche 393,489 PQQ 147,418,572 promoteur 73,81,95-113,121,202, 204,259,271-275,422-424,461-463, 595,604,669,675,680,683,684,688 propachlor 598,599 propanil 627,628 propanochlor 627 prophage 106,112,688 propionate 320,330,358 Propionigenium modestum 22,229 propionique (acide) 217,254 propionyl-CoA 562 propoxur 622 propylne 546 protase srine 571-609 protine L20 des ribosomes 114 protobactrie 34,145,221,233, 259,266,335,358,596 protomique 80,84 Proteus mirabilis 124,358,599,636 Proteus vulgaris 124,288,614 protocatchuate 383,385,398-401, 404,411,413-419,429,432,434, 441,457,458,473,478,481,490,517 2,3-dioxygnase 457,478 3,4-dioxygnase 414-418,430 4,5-dioxygnase 458,478,481 protonophore 17 protoporphyrine IX 295 protozoaires cilis du rumen 235 PS1 61,62,654 PS2 61-63,250 PsbA,PsbD 62 pseudo-azurine 294,300
Pseudomonas 46,72,73,96,110-123, 142,153,154,184-187,232,266, 268,274,289,291,294,300,304, 307,342,367-399,403-406,415-446, 455-483,492,493,505-512,524,527, 536-580,607-633,660,674,676,680 P. acidovorans 490 P. aeruginosa 33,72,73,96, 110,111,115,123,274,291,294, 307,380,390,401,403,421,430, 536,539,630,649,660,674,676 P. alcaligenes 491 P. cepacia voir Burkholderia cepacia P. cichorii 574 P. fluorescens 184,185,390, 399,425,494,649 P. mendocina 369,376 P. oleovorans 542,544 P. paucimobilis 458,468 P. pseudoalcaligenes 482 P. puckettii 375 P. putida 117,183,268,368-387, 396,415,419-430,436,439,442, 458,464,471,474,475,483,491,492, 549-551,558,563,565,575,580,618 P. savastanoi 390 P. stutzeri 304,307 P. syringae 671 putidardoxine 488,551,556 pWW0 (plasmide) 369,458,461,463,465 pyochline 649 pyomlanine 494 pyoverdine 649 pyralne 470 pyrthrode 610,622 pyrite 181,183,350,647 Pyrococcus furiosus 175 pyrolusite 348 pyrophosphate 510,511 pyruvate 20,21,25,169,186,209,211, 235,270,338,339,342,345,354,455, 457-459,472,490,492,507,514,654 pyruvate-ferrdoxine oxydorductase 208 pyruvate-formiate lyase 273,513,514
quinate 417 quinol oxydase 38,40,43-46,305,306,653 quinone voir quinone respiratoire quinone respiratoire 38,143,227,292, 304,321,354,391,494,507 quorum sensing 120,122,126 radical glycyle radical hydroxyle 155,167,514,515,518 293,651
INDEX
Ralsonia metallidurans 659 Ralstonia solanacearum 72 Ralstonia eutropha 292,393,398, 434,439,444-447,458,471, 481,593,595,660,674,676 RAMAN (spectre) 211,307 RBS (site de rpression) 422,423,424 recombinaison 73,82,87,90,94, 105,108,109,114,401,463 rductase 367-371,374,395, 401,426,427,436,443,445,465, 472,482-484,488,492,511-521, 648,651-656,679,681,682,686 443,488, (voie ortho) 514,654,681,682 flavinique 137,367,465,540,651 mercurique 680,681 RegA 203,204 rgulateur de transcription 44,45, 119-123,202,203,259,270-272,275-277, 325,326,422,423,461-463,483,484,513, 544,556,595,596,670,671,676,677,683 rgulation deux composants 43,204, 273,274,276,326,438 rgulon 44,273,278,279, 548,605,630,651 relaxosome 93 rep (squence) 99,604 rptition inverse 611 rplicon 90-105,108 rpresseur 276,423,556,669,670,680 rpression catabolique 415,626 rpression voir induction-rpression res (site) 104 rsistance des antibiotiques 87,88,95,99 rsistance multiple 84-88,107, 110,111,547,659 rsolvase 104,105,484 respiration anarobie 18,218,247,279, 317-320,329,330,342,523,527,654 respiration sur nitrate voir dnitrification respiration (dfinition) 15-19 Rhizobium 247,250,251,262, 265,415,575,604,621 R. huakuii 606 Rhizosolenia 246 rhizosphre 150,216,246,330,414,598 rhodanse 184,185,187,339 Rhodobacter 47,200-204,249,255,256, 262,263,288,292,294,300,323,325,359 R. capsulatus 51,53,200,202,249, 255,256,262,263,323 R. sphaeroides 38,39,50-52,184, 288,292,294,300 rhodochrosite 348
789
Rhodococcus 372,393,396,415, 444-448,471,481,538,539,545,549, 571,573,617,618,624,626,629,633 R. erythropolis 393,444,549,571,633 R. globerulus 458 R. rhodocrous 372,546 Rhodopseudomonas capsulatus 53,274 Rhodopseudomonas palustris 503,510, 517,519,521,522,528 Rhodospirillum rubrum 51,53,184,211,255 ribonuclotide rductase 306,513,514 ribulose-5-phosphate (cycle) 148 Richelia 247 RIESKE (protine de) 34,35,367,368, 374,377,380,465,488,492,689 Riftia 151 rizire 133,173,216,251,329,330,622 RMN 29,71,432,651 du fluor-19 447 RND (transporteur) 673 rotnone 168,169,270 Roundup voir glyphosate RPE 31,40,137,138,141,175, 211,231,255,291,297,298, 307,309,432,491,514,552,654 RpoH 677 RpoN 271,277,462 Rubisco 57,145,151,180,654 rubrdoxine 300,335,338,543,648 rubrrythrine 335 ruelne 600 rumen 217,235
Saccharomyces cerevisiae 72 sakacine 123 Salicornia 156 salicylate 384,385,436,464, 465,490-492,503,516,621 salicylate 5-hydroxylase 492,465,436 Salmonella 88,115,122,293,674 S. enterica 88 S. typhimurium 293 sarcosine 602 Sarin 609 scatole 503 Schizosaccharomyces pombe 72 Scytonema hofmanni 59 slnium 25,170,171,198,209, 289,336,337,349,683 slnocystine 25,200,289,337 slnure de carbonyle 171 semiquinone 19,35,36,40,43,222 squenage 72-88,94,377,418 squences d'insertion 74,76,86,95-114
790
srine (cycle de la) 145,148-152,188, 291,324,397,609,630,662 srine-hydroxymthyl transfrase 148 Serratia 112,123,660,680 Sesbania 263 Sevin 621 Shewanella 320,323-326,342-348,351 S. alga 348 S. colwiellana 495 S. frigidimarina 342,343,345 S. oneidensis 325 S. putrefaciens 345,346 SHI-1,SH-2 87,88 Shigella 88,112,680,682 shikimate 417,418 shikimate-3-phosphate 601 shuffling (de l'ADN) 608 sidrophore 347,648,650,351 SigK (facteur d'amorage) 687,688 sigma-54 271,277 sigma-E 676,677 simazine 623 Sinorhizobium 604 sodium dodcylsulfate 630 solvant chlor 152,354 sonde nuclique 76,145,163, 257,331,545,625 SOS (rponse) 77,107 soufre 31,68,128,129,170-188, 198-200,211,233,238-240,242, 255,259,281,282,284,288,289-301, 307,313-317,326-346,359-365,376, 379,397,403,407-411,432,449-452, 484,495-500,529-532,543,552,567 581-586,629-643,659,678,688,691-694 soufre (cycle du) 332-340 soufre lmentaire 333,335,339,342 SoxR,S 280 Spartina 156,177 spciation 657 spectre diffrentiel (cytochromes) 30 spectromtrie de masse 71,82,83,468, 473,483,513,614 Sphaerotilus 180 Sphingomonas 487,488,491 S. chlorophenolica 436 S. paucimobilis 610 spin (tat de) 551 SpoA 123 spore 547 Sporomusa ovata 565 sporulation 123,126,687 ssuEADCB (opron) 631 Staphylococcus aureus 110,123, 660,661,666,687
Staphylococcus xylosus 687 STICKLAND (fermentation de) 24-26 Streptococcus pyogenes 72 Streptomyces 72,123,301, 415,605,624,626 S. griseus 123 S. thioluteus 301 stress (tat de) 88,107,116,236,548, 637,647,648,651,655 stromatolite 56 styrne 140,368,371,372,377,379 succinate 18,22,23,43,236,319, 321,327,339,366,414,415, 513,528,562,593,596,597,654 succinate dshydrognase 321 succinyl-CoA 416,513,618 sulfane 333 sulfatase 630,631 sulfate voir sulfato-rducteur sulfato-rducteur 135,136,171, 172,177,200,205,232,275,326-342, 345,348-351,354,538,560,561,620 sulfite 328,329,333-340,353 sulfite oxydase 163,175,177 sulfite rductase 335,336,338,339 Sulfolobus 340 sulfonates 629-631,633 sulfone 333,629 sulfo-rducteurs 327,339 sulfoxydation 374,379 sulfures 56,60,135,145,151, 155,161,171-183,187,188,233,288, 327,328,331-343,349,350,630,685 sulfure d'allyle 161 sulfure de carbonyle 171,178, 187,188,253,325 sulfure de mthyle 325 sulfures (oxydation des) 151,174,332 Sulfurospirillum deleyianum 301,302 superintgron 112-114 superoxyde 207,235,251,293, 554,555,635,651,653 superoxyde dismutase 207,251,648,653 superoxyde dismutase (Fe) 648 superoxyde dismutase (Zn/Cu) 653 surexpression 604 surpopulation 119 swarming 124 symbiose 88,150,151,235, 237,247-251,262,263,265 symporteur 329 Synechococcus 57,60,291,650,662,670 Synechocystis 72,96,670 synthse d'ATP 15,20-30,235 syntrophisme 218,233,234
INDEX
Syntrophus gentianae 521 systme deux composants voir rgulation deux composants systmique (herbicide) 592 systmique (insecticide) 620
791
Thiocapsa 47 thiocarbamate 626 thiocyanate 158,177,184-188,253,576 thiolase 416 thiolyse 508,513,523,524 thiordoxine 25,656,686 Thiospirillum 47 thiosulfate 173-175,185-188,328, 329,332,333,339-342,351,353 thiosulfate dshydrognase 174 Thiothrix 173 TMAO 19,275,323-326,654 TMMO voir TMAO TMPD 304 Tn10 (transposon) 96-101 Tn3 (transposon) 99-104 Tn5 (transposon) 99-103 tocophrol 494 todABC1C2 (opron) 373,374 TodC (tolune dioxygnase) 396,397 TOL (plasmide) voir plasmide TOL tolune 138,140,154,342,345,366, 368-378,384,386,390,395-398, 403,405,414,446,458-463,466, 471,472,481,505-508,512-516,527 tolune dioxygnase 373-377,378,396, 403,405,446,557,563,565 tolune 2-mono-oxygnase 369 tolune 2,3-dioxygnase 369,373-376,386 tolune-3-mono-oxygnase 369 tolune-4-mono-oxygnase 369 tolunesulfonate 630 TonB 651 torECAD (opron) 325,326 TorS,TorR (protines) 325,326 Torulopsis 537 tourbire 146 toxine 113,117,312,651 trans-cinnamate 365 transcription 81,89,93,97-109,113, 119-123,202,203,259,270-277, 325,326,423,461-463,483,484, 513,595,596,670,671,676,677,683 divergentes 108 transduction 87 transfert gntique horizontal 84,85,86, 89,397,401,618 transformation 126 translocation de protons 15-18,26-28, 30,34-43,199,209,218,219,227-229, 254,257,296,304-306,319,322,329, 336,339,342,354,511,566,660,674,675 translocon 93 transport 52,57,58,117,124, 202,218,227,236,289-291,329, 351,421,517,519,540,603-612,622, 630,632,661-663,668-671,680,682
Tabun 609 tanins (tannins) 382 TAP-tag 82 tauABCD (opron) 631 taurine (dgradation) 629,631,632 TCDD 486,488,489 TCHQ dshalognase 437,438 TecA (tolune dioxygnase) 396 technecium 346 TEF,TEQ 486 terbuthylazine 623 trphtalate 399 terpnes 535,538,547-551,563 terpinne 549 terprdoxine 556 Terrabacter 488,613,614 terres arctiques 146 ttrachlorobenzne 394,395,397,560 ttrachlorothylne 140,354, 356,564,566,570 ttrachlorohydroquinone 437 ttrachloromthane 233 ttradcane 540,542,561 486 ttra-dibenzo-p-dioxine (2,3,7,8-) ttrahydrofolate voir FH4 ttrahydromthanoptrine 158, 220,221,527 ttrathionate 173,174,187,329,332,333 tfd (opron) 594 TfdA,TfdB 597 TfdK (transporteur) 595 TfdR,TfdS 594,595 Thauera aromatica 503,506, 512-517,520-522 Thauera selenatis 508 thermocline 49,60,217 Thermodesulfovibrio yellowstonii 335 thermophile 74,85,205,328,340 Thermotoga martima 72,344 Thermus aquaticus 74 thioautotrophe 151 Thiobacillus 172-179,660,666,680 T. acidophilus 172 T. caldus 174 T. denitrificans 172,176 T. ferrooxidans 172,182 T. novellus 175 T. thiooxidans 172 T. thioparus 172,178,187,188 thiocamphre 556
792
transport du cuivre 61 transporteur ABC 124,289,632,652,664 transposase 95,97-104,458,484 transposition 86,94-107,111,463,595 conservatrice 102,106 rplicative 104 transposon 85,87,95-119,395, 397, 428,458,465,484,621,680,682 TraS,TraT 92 Trebouxia 252 Treponema pallidum 72 triaminotolune 392 triazine 623 tribromopropane (1,2,3-) 573 trichloro-thane 140 trichloro-thylne 137,140,142,150-155, 373,374,563,564,565,566,567 trichloromthoxypyridine 599 trichloropyridinol 599 Trichodesmium 57,247 Trichomonas vaginalis 235 Trichosporon cutaneum 415,440,445 triclopyr 599 trithyl-phosphate 154 trihydroxybiphnyle (2,2',3-) 488 trimthylamine-N-oxyde voir TMAO trimthylbenzne 378,458 trinitrotolune (2,4,6-) 386,390,393 trithionate 174,333 trwAABCD (opron) 91,92 tryptophanase 654 tryptophane 365,373,397, 503,525,572,577,636 tubuline 654 tungstne 221 type ABC (transporteur) 652 type K,r 164 tyrosine 293,297,365,438, 493,494,503,618,636
vanillate 383 VCR (squence) 112-114 Veillonella alcalescens 22 VhoAG (protine) 227 Vibrio 113,121-123,325,342,537 V. cholerae 87,96,112,495 V. fischeri 122 V. metschnikovii 113 V. mimicus 113 vie primitive 343 viologne 168 virulence 120,123,651 vitamine B12 652 voie de l'actyl-CoA 206-213,233,234 voie du 3-oxoadipate voir ortho voie du gentisate voir gentisate voie glycolytique voir glycolyse voir mta voie mta voie ortho voir ortho
WND (maladie de WILSON) Wolinella succinogenes WOOD-LJUNGDAHL (voie de)
662 301,303, 307,321,358 206-213,233,234
UAS UASB ubiquinol ubiquinone up-welling uranium urase uridylation vanadate vanadium
462 392 35,37,42 38,40,43 49 182,655,658 217,254 260,261 voir vanadium 253,256,258,289, 366,636,654,659,661
xanthine dshydrognase 391 xanthine oxydase 163,170,391,518,654 Xanthobacter 376,546 X. autotrophicum 571,575 Xanthomonas 113,114 Xanthoria parieti 637 xnobiotique 88,232,378, 382-389,394,403,637,660,688 xyl (opron) 459 xylnes 375,458,512,513 xylne dioxygnase 460 xylnol (p-) 375 XylF (protine) 461 XylR (protine) 461-463 XylS (protine) 461-463 XylT (protine) 460 xylulose-5-phosphate (cycle du) 150 Yersinia pestis 87,123 647,654,655,664 662-664 665
Y Z
zinc ZntA (protine) Zur (protine)
TABLE DES MATIRES

AVERTISSEMENT INTRODUCTION CHAPITRE 1 - LA COLLECTE DE L'NERGIE
1.1 - Respirations et fermentations 1.2 - Le rle des fermentations 1.3 - ATPases - ATP synthases 1.4 - Cytochromes 1.5 - Complexes de type bc1 1.6 - Oxydases respiratoires terminales 1.7 - Phototrophie non-oxygnique 1.8 - Les cyanobactries Conclusion 5 7 13 15 20 26 30 34 38 46 56 66 71 71 80 84 90 95 99 107 115 119 126
CHAPITRE 2 - GNOMES - ADAPTATIONS - COMMUNICATIONS

2.1 - La gnomique des micro-organismes 2.2 - Protomique et complexes multi-protiques 2.3 - Transferts gntiques horizontaux 2.4 - Plasmides 2.5 - Squences d'insertion - Transposition 2.6 - Les transposons simples et composites 2.7 - Intgrons et cassettes 2.8 - La biologie particulire des biofilms 2.9 - Communication et bioluminescence Conclusion rapide
794
CHAPITRE 3 - OXYDATIONS MINRALES

3.1 - Un cycle naturel du mthane 3.2 - Le mthane, source de carbone et dnergie 3.3 - Croissance sur mthane et mthanol 3.4 - Mthanotrophes contre organochlors 3.5 - Halomthanes 3.6 - L'oxydation de l'ammoniac 3.7 - Monoxyde de carbone et carboxydotrophes 3.8 - Du sulfure au sulfate 3.9 - limination de composs soufrs simples 3.10 - L'oxydation du fer et du manganse 3.11 - Cyanure - cyanate - thiocyanate Conclusion brve
133 133 135 144 152 155 159 167 171 177 179 184 189 197 197 201 205 213 218 227 229 232 235 237 245 245 248 252 258
CHAPITRE 4 - HYDROGNE - ACTATE - MTHANE

4.1 - Hydrogne et hydrognases 4.2 - Les hydrognases sont rgules 4.3 - Bactries actognes 4.4 - La gense du mthane 4.5 - Les tapes de la mthanogense 4.6 - Lnergie de lhtrodisulfure rductase 4.7 - De lacide actique au mthane 4.8 - Mthanognes et biodgradations 4.9 - Hydrognosomes Conclusion
CHAPITRE 5 - AZOTE ET ANAROBIOSE

5.1 - Le cycle biologique de lazote 5.2 - Ceux qui assimilent lazote 5.3 - La nitrognase 5.4 - Contrle de lassimilation de lazote
TABLE DES MATIRES
795
5.5 - Les voies du nitrate 5.6 - Le passage lanarobiose 5.7 - Une optimisation trs pousse Conclusion
264 270 275 280 287 287 290 293 301 303 307 309 311 319 319 326 332 340 35 1 359 365 365 366 368 373 377 382 386 394
CHAPITRE 6 - RDUCTION DES OXYDES D'AZOTE

6.1 - Nitrate rductases et molybdne 6.2 - Nitrate rductases varies 6.3 - La rduction des nitrites 6.4 - Le passage direct du nitrite lammonium 6.5 - De loxyde nitrique loxyde nitreux 6.6 - De N2O au diazote 6.7 - Des champignons dnitrifient En guise de conclusion
CHAPITRE 7 - OXYDATIONS ANAROBIES DIVERSES

7.1 - Des accepteurs varis et inattendus 7.2 - Du sulfate au sulfure 7.3 - Biochimie de la rduction du sulfate 7.4 - Le fer et le manganse comme accepteurs anarobies 7.5 - Dshalognation respiratoire - Oxyde de chlore Conclusion sommaire
CHAPITRE 8 - LOXYGNATION DES AROMATIQUES

8.1 - Introduction 8.2 - Loxygnation du benzne 8.3 - Lattaque du tolune et du styrne 8.4 - Des oxygnases aux cibles nombreuses et varies 8.5 - La naphtalne dioxygnase 8.6 - Labondance naturelle des phnols 8.7 - Drivs nitrs 8.8 - Haloaromatiques
796
8.9 - Le benzoate et les halobenzoates 8.10 - Aromatiques fluors Conclusion
398 404 406 413 413 414 422 424 429 435 439 443 445 448 455 455 458 464 467 470 476 482 485 490 495 503 503 507 512
CHAPITRE 9 - OUVERTURE INTRADIOL DU CYCLE AROMATIQUE

9.1 - Rupture arobie du cycle 9.2 - Voies ortho 9.3 - Rgulateurs 9.4 - Voies ortho modifies 9.5 - Les dioxygnases ortho 9.6 - Dshalognation arobie avec ouverture du cycle 9.7 - Les cyclo-isomrases 9.8 - Hydrolases et rductases des voies ortho 9.9 - Dshalognation arobie aprs ouverture du cycle Conclusion
CHAPITRE 10 - OUVERTURE EXTRADIO - VOIE DU GENTISATE

10.1 - Rupture extradiol du cycle aromatique 10.2 - Le plasmide TOL 10.3 - Naphtalne et salicylate 10.4 - Les polycycliques 10.5 - Biphnyle et PCB 10.6 - Dioxygnases de l'ouverture extradiol 10.7 - Aromatiques azots 10.8 - Dioxines ! 10.9 - Voie du gentisate Conclusion
CHAPITRE 11 - LES AROMATIQUES L'ABRI DE L'OXYGNE

11.1 - Attaque anarobie par les dnitrifiants 11.2 - Benzne - tolune - thylbenzne - crsol 11.3 - La voie du benzylsuccinate
TABLE DES MATIRES
797
11.4 - La dshydroxylation du cycle aromatique 11.5 - Les voies anarobies du benzoyl-coenzyme A 11.6 - Dshalognations arobies utilisant le coenzyme A Conclusion
516 520 523 528 535 535 537 542 547 550 560 563 568 571 575 580 589 589 592 598 601 606 610 616 620 623 627 629 633 638
CHAPITRE 12 - ALIPHATIQUES ET ORGANOHALOGNS

12.1 - Les tristes mares noires 12.2 - Bactries et levures sur aliphatiques 12.3 - L'intervention des bactries 12.4 - Alicycliques et terpnes 12.5 - Le cytochrome P450 du camphre 12.6 - Dgradation anarobie des aliphatiques 12.7 - Dcontamination de solvants chlors 12.8 - La dshalognation et ses divers modes 12.9 - Dshalognation hydrolytique des haloalcanes 12.10 - Le cas des 2-haloacides Conclusion
CHAPITRE 13 - HERBICIDES - PESTICIDES - RCALCITRANTS

13.1 - Quelques aspects gnraux 13.2 - Dgradation d'un herbicide 13.3 - Des herbicides chlors 13.4 - Les acides phosphoniques - le Roundup 13.5 - Organophosphates - Parathion et autres 13.6 - Organochlors - Lindane et DDT 13.7 - Le pentachlorophnol 13.8 - Carbamates et pyrthrodes 13.9 - Herbicides du groupe des triazines 13.10 - Anilides et analogues 13.11 - Sulfates - Sulfonates 13.12 - Les peroxydases, une arme absolue ? Conclusion
798
CHAPITRE 14 - LA CIRCULATION DES MTAUX

14.1 - Grer le taux de mtal 14.2 - Le fer - un mtal essentiel 14.3 - Quelques mtaux indispensables 14.4 - Mtaux et pollution 14.5 - Le pompage du cadmium et du zinc 14.6 - Le contrle du plomb 14.7 - La rsistance au cuivre 14.8 - Transport par potentiel membranaire 14.9 - Mercure et mercuriels 14.10 - Rsistances l'arsenic et l'antimoine Conclusion
645 645 647 653 657 661 666 668 674 678 685 689 695 775 793
GLOSSAIRE INDEX TABLE DES MATIRES

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DIRIGE PAR JEAN BORNAREL

Comit de lecture pour "Biodgradations et mtabolismes

ISBN 2-86883-745-X EDP Sciences, 2005

Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences

Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques

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CHAPITRE 1 LA COLLECTE DE L'NERGIE

Anarobiose (E. coli)

3 - Solubles dans le pentane ou l'hexane.

1.2 - LE RLE DES FERMENTATIONS

La voie glycolytique ordinaire

Grandes fermentations partir du pyruvate

COO C=O CH3 pyruvate

Variations du potentiel de l'hydrogne

succinyl-CoA + propionate succinyl-CoA (R)-mthylmalonyl-CoA (R)-mthylmalonyl-CoA (S)-mthylmalonyl-CoA (S)-mthylmalonyl-CoA + H+ propionyl-CoA + CO2

(1) (2) (3) (4)

CO2 H3CCH2 CSCoA ADP Pi n Na+ ATP

Mthylmalonyl-CoA dcarboxylase (P. modestum)

COOH C=O CH3 CO2 COOH CH3

2 ATP HOOC COOH H3C CH3 3 actates

Cycle de la glycine rductase

1.3 - ATPASES, ATP SYNTHASES

nergie d'hydrolyse de l'ATP croissante

ATPase/ATP synthase mitochondriale

complexe [enzyme-ATP] haute affinit.

ATP ADP ATP ADP Pi

Cycle de l'ATP synthase

abs. (rd. ox.)

Fe2+ N N CH2 CH2 COOH

Fe2+ N N C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH

Formules des hmes B, O et A

HO N Fe2+ N N N CH2 CH2 COOH

N N CH2 CH2 COOH

CH2 CH2 COOH

Oxyd, avec chanes latrales

1.5 - COMPLEXES DE TYPE BC1

hme C extrieur hmes B

Monomre bc1 mitochondrial

donneur face interne 2 H+

Cycle Q (interprtation simplifie

Modle simplifi du complexe bc1

1.6 - OXYDASES RESPIRATOIRES TERMINALES

Les deux types d'oxydases terminales

Parties I et II de l'oxydase de Parococcus denitrificans

Fe(II) Cu+ e O=O

Fe(IV) Cu2+ O2 H2O 2 H+ Fe(III) Cu+ O O e Fe(III) Cu2+ O O

Cycle de la cytochrome c oxydase

Chanes respiratoires de E. coli

H 292 PAS tat mtabolique dfavorable P

taux faible de O2 chute du potentiel redox

Le systme ArcB/ArcA du colibacille

enzymes diverses du mtabolisme anarobie

Cu2+ b a3 quinol oxydase

Paracoccus denitrificans en arobiose

1.7- PHOTOTROPHIE NON-OXYGNIQUE

II - Pourpres non sulfureuses

III - Vertes sulfureuses

IV - Vertes non sulfureuses

Heliobacterium, Heliobacillus, Heliochlorum

vertes sulfureuses P840* e A1 e

Bph h QA QB e Q e c bc1 c2 NADH NDH p P840+ h

Centre ractionnel de Rhodobacter sphaeroides