CAROLINA DE QUEIROZ MOREIRA PEREIRA

Identificao de espcies de fungos causadores de onicomicoses em idosos institucionalizados no municpio de So Bernardo do Campo

Dissertao apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Programa de: Dermatologia Orientadora: Profa. Dra. Cidia Vasconcellos

So Paulo 2012

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Pereira, Carolina de Queiroz Moreira Identificao de espcies de fungos causadores de onicomicose em idosos institucionalizados no municpio de So Bernardo de Campo / Carolina de Queiroz Moreira Pereira. -- So Paulo, 2012.

Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Dermatologia.

Orientadora: Cidia Vasconcellos.

Descritores: 1.Idoso 2.Dermatfitos 3.Onicomicose 4.Leveduras 5.Fungos filamentosos

USP/FM/DBD-108/12

Aos meus pais Jos Pereira Junior e Abigail de Queiroz Moreira Pereira por sempre estarem presentes nos bons e maus momentos, por fornecerem as ferramentas necessrias para a construo do meu carter e por todo seu amor, compreenso e suporte. Ao meu marido Ademir Rosa de Oliveira que por tantas vezes cedeu seu tempo de descanso para me auxiliar na pesquisa e nos meus estudos e acima de tudo pelo seu amor e apoio incondicional.

Agradecimentos

Primeiramente a Deus que me deu o dom da vida. minha orientadora Prof Dr Cidia Vasconcellos por sua pacincia e por tantas vezes ceder seu tempo de descanso para tirar minhas dvidas. A Roseli Santos Freitas e Natalina Takahashi por serem sempre solcitas e compartilharem seus conhecimentos em micologia. A Prof Dr Marta Cristina Souza por me fazer apaixonar pela micologia. Aos funcionrios do Laboratrio de Investigao Mdica 53 por me socorrer por tantas vezes no laboratrio. Ao meu irmo Marcos pelas oraes e apoio mesmo a distncia e pelos livros que consegui em sua loja. Meus avs Francisco e Hulda Moreira e Tia Ester Queiroz Siqueira por me estimularem a estudar e por investirem em minha vida. Aos funcionrios dos Asilos de So Bernardo do Campo: Casa So Vicente de Paulo e Casa de Velinhos Dona por terem aberto as portas e confiado em mim para a realizao do trabalho. Aos idosos que aceitaram fazer parte desse trabalho, sempre me incentivando. A tantos quantos me fizeram sentir no aprendizado da vitria, o que significa perseguir e conquistar objetivos.

Procura o conselho dos mais velhos, pois seus olhos contemplaram a face dos anos.

Esta dissertao est de acordo com:

Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).

Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Diviso de Biblioteca e Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria Vilhena. 3a ed. So Paulo: Diviso de Biblioteca e Documentao; 2011.

Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

Sumrio

Lista de abreviaturas e siglas Lista de Smbolos Resumo Summary 1. Introduo .............................................................................................................. 1 2. Reviso Bibliogrfica ............................................................................................ 6 2.1 Caractersticas gerais dos fungos ................................................................. 6 2.2 Onicomicoses .................................................................................................. 7 2.3 Dermatfitos ..................................................................................................... 8 2.4 Leveduras do gnero Candida ..................................................................... 12 2.5 Fungos fillamentosos no dermatfitos (FFND) ......................................... 14 3. Objetivos Gerais e Especficos .......................................................................... 19 3.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 19 3.2 Objetivos Especficos .................................................................................... 19 4. Mtodos ................................................................................................................ 21 4.1 Aspectos ticos ............................................................................................. 21 4.2 Casustica ....................................................................................................... 21 4.3 Critrios de Incluso ..................................................................................... 23 4.4 Critrios de Excluso .................................................................................... 24 4.5 Coleta das Amostras ..................................................................................... 24 4.6 Processamento das Amostras .................................................................... 25 4.6.1 Exame Direto ............................................................................................... 25 4.6.2 Isolamento Primrio ................................................................................... 25 4.6.3 Isolamento Secundrio .............................................................................. 26 4.6.4 Microcultivo em Lmina (Tcnica de Ridell) para Fungos Filamentosos (Dermatfitos e FFND) ......................................................................................... 26 4.6.5 Provas Fisiolgicas e Bioqumicas para Identificao de Dermatfitos 27 4.6.6 Re-Isolamento Pureza do Isolado Clnico e Identificao Presuntiva de leveduras .............................................................................................................. 27 4.6.7 Micromorfologia - Cultivo em Agar Fub-Tween-80 ................................ 28 4.6.8 Assimilao de Carboidratos .................................................................... 29 4.6.9 Fermentao de Fontes de Carboidratos ................................................. 30 5. Resultados ........................................................................................................... 32 5.1 Caracterizao da Populao Geral ............................................................. 32

5.2 Caracterizao dos pacientes com leso que apresentaram exame micolgico direto positivo .................................................................................. 33 5.3 Caracterizao dos pacientes com leso que apresentaram cultura positiva independente do resultado do exame direto ...................................... 35 5.4 Caracterizao dos pacientes com interdgito ntegro (Grupo controle) . 43 6. Discusso ............................................................................................................ 46 7. Concluses .......................................................................................................... 51 8. Anexos ................................................................................................................. 53 9. Referncias Bibliogrficas ................................................................................. 65

Lista de abreviaturas e siglas

Lista de abreviaturas e siglas

C.

Candida

CAPPesq Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa CID Cdigo Internacional de Doenas DMSO Dimetilsulfxido et al e outros

DM Diabetes Mellitus DPOC Doena Pulmonar Obstrutiva Crnica FFND Fungos filamentosos no dermatfitos HCFMUSP Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

IMTSP Instituto de Medicina Tropical de So Paulo INSS Instituto Nacional do Seguro Social KOH Hidrxido de potssio

LIM Laboratrio de Investigao Mdica M. MD MOC Microsporum Exame micolgico direto Microscpio ptico Comum

SAB Sabouraud-Dextrose T. Trichophyton World Wide Web

WWW

Lista de Smbolos

Lista de Smbolos

% por cento = igual a C graus Celsius N tamanho da amostra em nmeros absolutos

Resumo

Resumo PEREIRA, C.Q. M. Identificao de espcies de fungos causadores de onicomicose em idosos institucionalizados no municpio de So Bernardo do Campo. [Dissertao]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo, 2012. 86p. INTRODUO: Infeces fngicas superficiais podem ser causadas por dermatfitos, leveduras ou fungos filamentosos no dermatfitos. O tipo de leso desenvolvida eventualmente se correlaciona ao agente etiolgico, capacidade de resposta imunolgica do hospedeiro, ao stio anatmico da leso e tecido afetado. A proposta desse trabalho isolar e identificar agentes de onicomicose em pessoas idosas (acima de 60 anos de idade), que frequentemente apresentam alterao da resposta imune. CASUISTICA E MTODOS: A tcnica de identificao de fungos foi a anlise do resultado conjunto do exame micolgico direto, isolamento e microcultura do raspado ungueal. Escamas subungueais e escamas interdigitais foram coletadas de 35 pessoas idosas, com suspeita clnica de onicomicose, institucionalizados em duas casas assistenciais no municpio de So Bernardo do Campo, SP, Brasil. RESULTADOS: Os materiais coletados foram analisados e, no raspado ungueal, observou-se 18 (51,40%) resultados positivos no exame direto e 15 (44,40%) no isolamento. Os dermatfitos foram evidenciados em 8 (44,40%) dos isolados, identificando-se 5 (27,80%) como Trichophyton rubrum e 1 (5,60%) de cada um como Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum gypseum. O segundo grupo mais isolado foram 7 (38,90%) leveduras, identificadas como: 3 (16,70%) Candida guilliermondii, 2 (11,10%) Candida parapsilosis e 1 (5,60%) Candida glabrata, 1 (5,60%) Trichosporon asahii. O ltimo grupo foi representado por 3 (16,70%) isolados de fungos filamentosos no dermatfitos, identificados como: Fusarium sp, Aspergillus sp e Neoscytalidium sp, 1 (5,60%) de cada um. Trinta (85,70%) dos raspados interdigitais foram negativos e em 5 (14,30%), a identificao dos agentes coincidiu com o fungo causador da onicomicose (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii e 1 Fusarium sp). No grupo controle (9 pessoas idosas clinicamente sem leso ungueal) realizou-se coleta interdigital, isolando-se Candida guilliermondii em apenas 1 (11,0%). CONCLUSES: Pelo mtodo de identificao empregado, observou-se que os fungos causadores de onicomicoses encontrados neste trabalho esto de acordo com relatos da literatura recente; a apresentao clnica da unha com onicomicose por fungos filamentosos no dermatfitos foi indistinguvel daquela por dermatfitos ou candidoses e, do ponto de vista etiolgico, no se observou

diferena entre a onicomicose de pessoas idosas institucionalizadas com os dados da ocorrncia de onicomicose na populao geral divulgados pela literatura.

Descritores: Idoso; Dermatfitos; Onicomicose; Leveduras; Fungos filamentosos.

Summary

Summary

PEREIRA, C. Q. M. Identification of species of fungi that cause skin lesions in institutionalized elderly in So Paulo state [Dissertation]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2012. 86p.

INTRODUCTION: Superficial fungal infections can be caused by dermatophytes, yeasts or filamentous non-dermatophyte fungi. The type of injury eventually correlates to the the etiologic agent, the ability of the host immune response, the anatomical site of the lesion and the kind of the affected tissue. The purpose of this study is to isolate and identify agents of onychomycosis in the elderly (people over 60 years old), who often have alterations in the immune response. MATERIAL AND METHODS: The technique for the identification of fungi was the analysis of the combined result of mycological examination, isolation and microcultures of nail scrapings. Subungual and interdigital scales were collected from 35 elderly with a clinical suspicion of onychomycosis, institutionalized in two care houses in the city of Sao Bernardo do Campo, SP, Brazil. RESULTS: The collected materials were analyzed and the nail scrapings displayed 18 (51.40%) positive results on direct examination and 15 (44.40%) in isolation. Dermatophytes were found in 8 (44.40%) isolates, 5 (27.80%) beeing identified as Trichophyton rubrum and 1 (5.60%) of each others as Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum gypseum. The second more isolated group were composed by 7 (38.90%) yeasts, identified as: 3 (16.70%) Candida guilliermondii, 2 (11.10%) Candida parapsilosis, 1 (5.60%) Candida glabrata, and 1 ( 5.60%) Trichosporon asahii. The last group was represented by 3 (16.70%) isolated of non-dermatophyte filamentous fungi, identified as Fusarium sp, Aspergillus sp and Neoscytalidium sp 1 (5.60%) of each. Thirty (85.70%) of the interdigital scrapings were negative and 5 (14.30%) positive, being the agents coincident with the onychomycosis causing fungi (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii and 1 Fusarium sp) . In the control group (9 elderly with clinically uninjured nail) interdigital collecting was held, isolating Candida guilliermondii in only one (11.0%). CONCLUSIONS: Using this identification method, it was observed that the fungi that cause onychomycosis found in this study are consistent with the reports in the recent medical literature, the clinical presentation of toenail onychomycosis caused by non-dermatophyte molds was indistinguishable from that due to candidosis or dermatophyte and, in terms of etiology, no difference was observed between the onychomycosis of the

institutionalized elderly from the occurrence of onychomycosis in the general population disclosed in the literature.

Descriptors: Elderly; Dermatophytes; Onychomycosis Yeasts; Filamentous fungi.

Introduo

1. Introduo A microbiota fngica alterada no mundo periodicamente em sua composio quantitativa e qualitativa, em funo de fatores ambientais, como o desenvolvimento urbano, a industrializao, a localizao geogrfica e condies climticas, tais como a temperatura e tempo de exposio radiao ultravioleta. (Araujo et al.,2003a) A transio demogrfica associada a transio epidemiolgica, segundo Nasri, 2008 o principal fenmeno demogrfico do sculo XX sendo conhecido como envelhecimento populacional, o que tem levado a uma reorganizao do sistema de Sade. Essa populao exige cuidados que so um desafio para os atores do sistema de sade devido s doenas crnicas que apresentam, alm do fato de que incorporam disfunes nos ltimos anos de suas vidas. O envelhecimento da populao um fenmeno amplo, a Organizao Mundial de Sade (OMS) prev que, em 2025, existiro 1.2 bilhes de pessoas com mais de 60 anos, sendo que, grupos com 80 ou mais anos constituiro o grupo etrio de maior crescimento. No Brasil, estima-se que haver cerca de 34 milhes de idosos em 2025, o que levar o Brasil 6 posio entre os pases mais envelhecidos do mundo (Davim et al., 2004). Estima-se que 10 a 15% da populao humana podero ser infectadas no decorrer da sua vida (Costa et al., 2002). De maneira geral, as onicomicoses so consideradas uma micose de adultos e estas tem sido relatados com relativa frequencia em maiores de 60 anos (Rodrigues-Soto, et al.,1993). Os fatores que poderiam contribuir com o aumento de prevalncia dessas infeces, principalmente na populao de terceira idade seria a reduo da taxa de crescimento da lmina ungueal ao longo da vida (0,5% de reduo para cada ano de vida) e o aumento da possibilidade de traumas. (Araujo et al.,2003a). Dessa forma, o crescimento da populao idosa no pas deve merecer, cada vez mais interesse dos rgos pblicos, das polticas sociais e da sociedade em geral, levando-se em considerao, principalmente as

caractersticas demogrficas, econmicas, sociais e de sade (Davim et al., 2004). A expectativa de vida mdia dos brasileiros aumentou aproximadamente 25 anos, nos ltimos 50 anos, sem melhoras significativas nas condies de vida e de sade da populao e presenciando o envelhecimento da populao idosa (Nasri, 2008). Segundo a Pesquisa Nacional por amostra de domiclios (PNAD), a porcentagem de pessoas com 60 anos ou mais na populao alcanou 9,1% em 1999. De 1995 a 1999, o nmero de idosos aumentou em 1,8 milho. Dados do censo de 2010 informam que a populao total de brasileiros 190.732.694 habitantes e destes 20.590.599 milhes tem 60 anos ou mais (IBGE/Censo, 2010). O Censo 2010 apurou ainda que existiam 23.760 brasileiros com mais de 100 anos. Os resultados mostram que existem 95.9 mulheres para cada 100 mulheres, ou seja existem mais 3,9 milhes de mulheres mais que homens no Brasil. Essa diferena se acentua com o aumento da idade,na distribuio por sexo, segundo os grupos de idade observamos 11.434.487 mulheres com 60 anos ou mais e 9.156.112 homens (IBGE/Censo, 2010). Segundo Compndio estatstico 2005 da Prefeitura de So Bernardo do Campo h 775.099 habitantes sendo que 6.88 % dessa populao tm mais de 60 anos e destes 0,4% moram em asilos assistenciais da cidade. Hoje h grande preocupao com o idoso nas diversas reas, pois ele constitui um grupo bastante diferenciado entre si e em relao aos demais grupos etrios, e os custos econmicos e sociais decorrentes de seu grupo vem transcendendo as projees numa situao vigente do sistema espoliado de sade pblica (Davim et al., 2004). Entre as alteraes que ocorrem na terceira idade deve ser notada a queda da imunidade, isto , a diminuio das defesas imunolgicas, o que favorece o aparecimento de infeces e de tumores. A deficincia do sistema imunolgico leva a conseqncias devastadoras ao organismo. As infeces so provocadas por uma grande variedade de organismos, como bactrias, vrus, parasitas e fungos (Coltram et al., 2000).

As infeces bacterianas so uma das principais causas de morte na terceira idade, com destaque para a pneumonia. As viroses em geral provocam infeces menos graves, sendo responsveis pelo resfriado. As micoses tambm so freqentes, mas no so molstias graves na terceira idade. A infeco mais freqente no idoso, do que no jovem devido a queda imunidade que ocorre com o avanar da idade. As hospitalizaes aumentam muito a probabilidade de se contrair infeces. A queda localizada das defesas como, por exemplo, nas leses da pele por eczema servem de porta de entrada de bactrias. Pessoas submetidas hemodilise para tratamento da insuficincia renal esto mais sujeitas a infeco devido s inmeras punes em veias e artrias com agulhas. A utilizao de sondas urinrias pode tambm ser um fator de infeco. Uma infeco mal tratada, como uma sinusite, pode gerar graves infeces no idoso. O alcoolismo tambm um fator que facilita a instalao e o desenvolvimento de doenas infecciosas. A utilizao contnua de corticides produz um estado de queda resposta imunolgica a processos infecciosos e consequentemente da capacidade de cicatrizao e facilita o desenvolvimento de infeces (Veronezi e Focaccia, 2002). A pele, com seu epitlio queratinizado possui uma superfcie firme, geralmente seca, que atua como uma barreira mecnica e impede a invaso de agentes infecciosos como os fungos. Protege o organismo de radiaes ultravioletas do sol e a sede de algumas reaes imunolgicas relacionadas com a defesa do organismo. Tanto dermatfitos como leveduras encontram na pele seu primeiro obstculo para a colonizao; devido ao processo de descamao continua, tal colonizao persistentemente rechaada (Veronezi e Focaccia, 2002). Mudanas nas caractersticas da pele humana durante o envelhecimento so frequentemente determinadas por foras ambientais, tais como radiao ultravioleta, assim como fatores intrnsecos, alguns deles relacionados com alteraes do tecido conjuntivo da derme (Ori et al.,2003). Ocorre tambm uma diminuio no nmero de vasos sangneos e tambm de sua funo imunolgica, o que facilita as infeces. H

diminuio no crescimento das unhas que se tornam mais quebradias e os distrbios da pele so facilmente reconhecidos e se apresentam atravs de erupes, eczemas, manchas, bolhas e vesculas, pstulas, urticria, coceiras, ndulos ou tumores, que podem ter como agentes fungos de diversas etiologias (Coltram et al., 2000). Onicomicoses podem agravar outras afeces clinicas, especialmente no individuo idoso, causando seqelas como amputaes de membros inferiores em portadores de Diabetes mellitus. A onicomicose crnica, em idosos, portanto, pode ser um fator de aumento de custos e cuidado com a sade (Araujo et al.,2003a). Muitos estudos devem ainda ser realizado a esse respeito, uma vez que em todos os pases a populao de idosos tem aumentado. Por outro lado espcies de fungos e bactrias do meio ambiente esto surgindo com potencial patognico devido capacidade dos seres vivos em adaptar-se no meio em que vivem e no poderamos negar que as mudanas ambientais devido poluio do planeta alteram efeitos climticos e ambientais que poderiam tornar esses seres essencialmente saprfitas em patgenos em potencial, especialmente em populaes que apresentam uma resposta imunolgica baixa como os idosos.

REVISO BIBLIOGRFICA

2. Reviso Bibliogrfica 2.1 Caractersticas gerais dos fungos

O Reino Fungi compreende um conjunto de organismos eucariticos, heterotrficos, essencialmente aerbicos, com limitada capacidade anaerbica e que podem sintetizar lisina pela via biossinttica do cido L--aminoadpico. Acumulam glicognio como material de reserva, so desprovidos de clorofila e possuem ncleo rodeado por membrana nuclear. Sua reproduo por esporos. Eles apresentam parede celular rgida e quitinosa, retculo endoplasmtico, mitocndrias semelhantes s de clulas de plantas e animais, alm de vacolos, microtbulos e ribossomos. A membrana plasmtica contm ergosterol, rRNA 80s e microtbulos compostos de tubulina. O aparelho de Golgi nem sempre est presente. So seres ubiqitrios e importantes na decomposio da matria orgnica. Podem ser unicelulares ou multicelulares e divididos basicamente em filamentosos e leveduras, conforme sua morfologia (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). O sistema vegetativo dos fungos filamentosos constitudo de hifas ou miclio, contendo septos, regulares ou no. As hifas so oriundas, em geral, de esporos que germinam sob condies adequadas de temperatura e umidade. As hifas podem ser vegetativas, para absorverem nutrientes, ou especializadas, para originarem o sistema reprodutor para formao de esporos. A observao microscpica do sistema reprodutivo fundamental para a classificao desses fungos, permitindo a identificao do gnero e, muitas vezes, da espcie (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). Nas leveduras, por exemplo, as caractersticas morfolgicas so muito semelhantes, isto , tanto em parasitismo como nos isolamentos primrios. Esses fungos no apresentam grande variao na estrutura micromorfolgica, necessitando, portanto, de provas fisiolgicas e bioqumicas para determinao do gnero e espcie (Sidrim e Rocha, 2004). A estrutura bsica das leveduras , em geral, unicelular com reproduo por gemulao ou brotamento, por blastocondios. Algumas delas tm capacidade para produo de hifas. Estas hifas podem surgir diretamente de um blastocondio, a partir da formao de um tubo germinativo, e neste caso so denominadas hifas verdadeiras; outras, ditas pseudo-hifas, surgem da conjuno de vrios blastocondios, que se mantm unidos aps sua formao (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). Os fungos apresentam grande capacidade de colonizao e explorao de substratos orgnicos vivos e em decomposio. Essa capacidade diferenciada de explorao dos substratos est intimamente relacionada com as caractersticas ambientais e fsicas as quais o fungo exposto, bem como as exigncias nutricionais inerentes a cada espcie fngica, fundamentais para o seu desenvolvimento (Sidrim e Rocha, 2004).

2.2 Onicomicoses

As onicomicoses so infeces fngicas freqentes que acometem as unhas, responsveis por 30% das infeces superficiais e 50% de todas as desordens de unha, com aumento de incidncia em idosos. Estima-se sua prevalncia em mais de 10% da populao em geral e 40% em indivduos idosos, provavelmente, devido queda da imunidade, inatividade, e inabilidade em manter um bom cuidado dos ps (Shemer et al., 2008). A infeco inicia-se pela borda livre, podendo atingir superfcie e rea subungueal. As unhas tornam-se branco-amareladas, porosas e quebradias (Araujo et al., 2003). considerada a mais importante, das micoses superficiais humana, representando 20% das doenas das unhas em todo o mundo (Lacaz et al., 2002; Sidrim et al., 2004). uma infeco que deve ser considerada por sua importncia no dano que acarreta. Prejudica a qualidade de vida do paciente, auto-estima e a capacidade funcional por vezes so afetadas

interferindo nas atividades rotineiras (Martins et al., 2007). A infeco nas unhas pode ser determinada por vrias espcies de fungos como: dermatfitos, leveduras e fungos filamentosos no dermatfitos (FFND) [Lacaz et al., 2002; Sidrim e Rocha, 2004].

A classificao das onicomicoses baseada nos quatro tipos clnicos especficos de alteraes ungueais (Zaias, 1972; Zanardi et al., 2008). 1. Onicomicose subungueal distal e lateral: variedade clinica mais freqente (90%); a invaso comea no hiponquio (fina camada da epiderme e faz a ligao entre o leito ungueal e a polpa digital da unha) e na borda distal e lateral da lamina ungueal, estendendo-se de forma lenta e progressiva at a borda proximal da unha; 2. Onicomicose branca superficial: representa dois a 5% das onicomicoses dermatofticas. Caracteriza-se pela penetrao in situ de estruturas fngicas em direo ao interior da lamina ungueal, podendo ser facilitada por traumas anteriores. comumente observada nas unhas dos ps; 3. Onicomicose subungueal proxima: a variante clinica de menor frequncia, sendo observada em indivduos com sndrome da imunodeficincia adquirida. Inicia-se pela invaso do fungo no estrato crneo da dobra ungueal proximal e subseqentemente, na lamina ungueal; 4. Onicodistrofia total: e o estagio final das onicomicoses por dermatfitos, Fungos Filamentosos no dermatfitos e leveduras. Verifica-se acometimento da matriz ungueal, e a totalidade da unha esta alterada.

2.3 Dermatfitos

A denominao dermatfito s pode ser utilizada para espcies representantes dos gneros que so queratinoflicos, ou seja, que utilizam a queratina como fonte de nitrognio, e que so causadores de patologias em homens e animais (Sidrim e Rocha, 2004). A infeco causada por dermatfitos, dependendo da localizao, pode ser classificada em diferentes modalidades: dermatofitoses de couro cabeludo, pele glabra, ps e mos, granuloma (inguinal e axilar), rosto ou barba em homens, e onicomicoses (Mezzari, 1998). A taxonomia dos dermatfitos e sua identificao rotineira em laboratrios de micologia clnica baseiam-se fundamentalmente em critrios morfolgicos, macro e microscpicos, relacionados com a fase de reproduo assexuada desses fungos. Desse modo, com base nesses critrios, as espcies de dermatfitos podem ser classificadas em trs gneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton (Lacaz et al., 2002). O gnero Epidermophyton apresenta uma nica espcie de importncia: E. floccosum. O gnero Microsporum compreende espcies como M. canis, M. gypseum, M. audouinii, M. cookei e M. nanum. O gnero Trichophyton tem como espcies mais importantes T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, T. schoenleinii. T. violaceum e T. verrucosum (Santos et al., 2002). A distribuio geogrfica dos dermatfitos se mostra bastante varivel; enquanto alguns so cosmopolitas, a distribuio de outros depende dos seguintes fatores: adaptao ao meio ambiente, deslocamentos humanos, convvio com animais domsticos, aspectos scio-econmicos, sexo, idade e imunidade do hospedeiro, promovendo assim, variaes no espectro destes fungos, de regio para regio, fazendo-se inquestionvel a necessidade de pesquisas epidemiolgicas, clnicas e laboratoriais que relatem dados reais, no tocante a incidncia das dermatofitoses no nosso meio (Brilhante et al., 2005). Tais fungos podem ainda ser divididos em trs grandes grupos, em relao ao seu habitat, sendo classificados como geoflicos, zooflicos e antropoflicos (Costa et al. 2002, Lacaz et al. 2002, Santos et al. 2002, Sidrim e Rocha, 2004). As espcies geoflicas tm como habitat natural os solos e podem produzir processos patolgicos tanto em homens como em animais, da mesma forma as espcies zooflicas e por fim, as espcies antropoflicas que so adaptadas ao ser humano (Lacaz et al. 2002, Santos et al. 2002, Sidrim e Rocha, 2004).

O grupo de antropoflicos so os de maior incidncia no homem, pois nesse caso o contgio se d por contato direto com piscinas, banheiros pblicos e objetos de uso comum. O importante que o simples contato no o causador da infeco e para que esta exista devem existir fatores predisponentes locais, como uma alterao da barreira tegumentar, alm de fatores que fazem com que a patologia persista ou se agrave, tais como: diabetes, corticoterapia, atopia, etc (Veronesi e Focaccia, 2002). O equilbrio na relao parasita-hospedeiro alcanado ao longo da convivncia entre ambos. Quando ocorre uma boa adaptao, a resposta imune pode ser mnima, o processo no to agudo, mas a conseqncia dessa permissividade a tendncia a cronificao. Assim, as dermatofitoses por espcies antropoflicas podem produzir quadros mais crnicos, que as produzidas por espcies zooflicas, j que as ltimas tm se adaptado mais recentemente, quando o ser humano incorporou sua vida animais domsticos e peridomsticos (Rubio et al., 1999). As manifestaes clnicas decorrentes da infeco resultam tanto da colonizao e multiplicao dos dermatfitos na camada crnea da pele, quanto pela conseqente reao dos hospedeiros (Santos et al., 2002). Assim, o tipo de leso desenvolvida depender da espcie de dermatfito, da resposta imunolgica do hospedeiro, da localizao anatmica da leso e o tipo de tecido lesionado. Geralmente, as leses so pruriginosas, afetam pele, plo e unhas e produzem placas descamativas, vesiculosas ou supurativas. As leses inicialmente podem ser nicas ou mltiplas e, sem tratamento, evoluem de forma lenta e progressiva. A infeco pode disseminar-se para outros locais em conseqncia de auto-inoculao e tambm podem aparecer novas leses por re-infeces devido manuteno da fonte de contgio (Larruskain et al., 2005). Em virtude disso, a velocidade na obteno do diagnstico um aspecto fundamental, j que tambm possibilita a prescrio de um tratamento antifngico especfico que permite o seu uso racional e limita o desenvolvimento de resistncias a essas drogas. (Pontn, 2002). Porm, para alcanar o xito no diagnstico micolgico fundamental realizar adequadamente a coleta da amostra, seu transporte e processamento, o isolamento em meios e temperatura adequadas, assim como a identificao e identificao correta dos isolados (Lopez et al., 2001). A cura espontnea das dermatofitoses rara, por isso necessrio instaurar tratamento (Palacio et al., 1999). O tratamento das dermatofitoses tem sido aprimorado acentuadamente nos ltimos anos com o desenvolvimento de novos agentes antifngicos de aplicao tpica ou administrao oral. Dermatofitoses so micoses cutneas, endmicas na America Latina e um problema de sade pblica mundial (Bergston et al., 2001).Elas cresceram muito nos ltimos anos. Atualmente observamos que o diagnstico das micoses superficiais apresentam melhor avaliao clnica, devido a especializao profissional e acurcia diagnstica, promovendo aumento da sobrevida de pacientes com doenas imunossupressoras e que utilizem medicamentos que exeram uma presso seletiva e permitam a instalao de micro-organismos convencionalmente saprfitos. Desta maneira, os dermatfitos emergem como uma possibilidade de causar processos infecciosos em stios anatmicos no convencionais (Sidrim et al., 2004). As dermatomicoses no requerem a notificao compulsria pelo Sistema nico de Sade (SUS) sendo desconhecidas sua incidncia e prevalncia na populao mundial (Scher, 1994). Com base numa prevalncia estimada em estudos cientficos atuais estima-se que 10 a 15% da populao humana podem ser infectadas no decorrer de sua vida, sendo encontrada no Brasil uma predominncia do gnero Trichophyton como um dos agentes de maior incidncia nas dermatomicoses (Lacaz et al., 2002). Outros estudos demonstram que a prevalncia de onicomicoses aumenta com a idade, sendo rara em crianas e aumentando significativamente em maiores de 55 anos e alcanando uma incidncia de at 48% entre a populao de 70 anos ou mais.

12

2.4 Leveduras do gnero Candida

Leveduras so fungos unicelulares pertencentes ao reino Fungi caracterizada pela presena de parede celular rgida, ncleo organizado com membrana nuclear, nutrio heterotrfica, reproduo sexuada e assexuada por brotamento ou cissiparidade. Elas so ubiquitrias em nosso meio, podem ser isoladas de frutas, vegetais e de plantas em geral. As leveduras possuem capacidade fermentativa quanto assimilativa, sendo capazes de crescer em uma variedade de substratos orgnicos, aspectos utilizados inclusive para identificao de gnero/espcie (Meyer et al., 1998; Lacaz et al., 2002; Sidrim e Rocha, 2004). As leveduras do gnero Candida membro do Filo Ascomycota; Subfilo Ascomycotina; Classe: Ascomycetes ordem Saccharomycetales; Famlia Saccharomycetaceae (Meyer et al., 1998; Lacaz et al., 2002; Sidrim e Rocha, 2004; Summerbell, 1997). Algumas fazem parte da microbiota da superfcie da pele, mucosas bucal e vaginal e tratos intestinais de homens e animais, podendo tambm ser isolada de espcimes clnicos e no ter qualquer significado patolgico. As leveduras consideradas como microbiota normal do homem condicionam a doena, clinicamente manifesta somente se existir alteraes nas condies do hospedeiro (Lacaz et al., 2002; Sidrim e Rocha, 2004; Summerbell, 1997). bem conhecido que alteraes no mecanismo da imunidade sejam congnitos, adquiridos ou mediados por tratamentos com imunosupressores, assim como a presena de doenas associadas (diabetes e linfomas) condicionam o aparecimento de micoses graves, s vezes por agentes nopatognicos em condies normais (Veronezi e Focaccia, 2002). Alm disso, tratamento com corticosteroides, agentes citotxicos, antibiticos de amplo espectro e contraceptivos orais tambm predispem o indivduo a esse tipo de infeco (Wagner e Sohnle, 1995). A histria natural das doenas causadas por leveduras melhor compreendida luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivduo considerado sadio apresenta mecanismos de defesa inespecficos e

13

especficos, tais como barreiras anatmicas e fisiolgicas e resposta inflamatria e imunolgica, que, juntos, representam obstculo ao estabelecimento da infeco fngica, seja por fungos filamentosos, seja por leveduras. Esses mecanismos de defesa podem ser sobrepujados por fatores intrnsecos ou extrnsecos, que causam seu desequilbrio, resultando no supercrescimento da populao residente de leveduras, seguido pela invaso e leso dos tecidos vivos (Milan e Zaror, 2004). As espcies do gnero Candida mais freqentemente responsveis por infeces incluem C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C.guilliermondii, C. kefyr, C. rugosa e C. stellatoidea (Ghammoum, 2001), sendo o espectro dessas infeces bastante extenso, indo desde a colonizao de mucosas, pele e unhas, at quadros sistmicos, com a invaso de vrios rgos (Sidrim e Rocha, 2004). Essa variedade de apresentaes da doena leva necessidade de utilizao de diferentes mtodos diagnsticos e esquemas teraputicos (Crocco et al., 2004). Os mtodos de identificao das leveduras so diferentes daqueles utilizados para fungos filamentosos. Em relao s caractersticas morfolgicas, consideram-se aspectos macroscpicos da colnia e microscpicos da levedura. Presena de cpsula, ascos, blastocondios, clamidocondios, artrocondios, hifas, pseudo-hifas e formao de tubo germinativo devem ser pesquisadas atravs de metodologia especifica, e no pela simples observao do isolamento primrio (Milan e Zaror, 2004). Quanto ao metabolismo, muitas espcies de Candida apresentam habilidade fermentativa e oxidativa, enquanto outras so estritamente oxidativas. Fontes de carbono so assimiladas, conforme a espcie estudada, porm nem todas as espcies com habilidade assimilativa so tambm fermentativas (Lacaz et al., 2002). Um avano importante na identificao de fungos leveduriformes so os meios diferenciais, j que permitem a identificao sugestiva, pela cor e morfologia das colnias. Quando so utilizados como meios de isolamento primrio, pode-se realizar a identificao presuntiva de algumas espcies do gnero Candida em 24-48 horas (Pontn, 2002).

14

Ao contrrio de C. albicans espcies classificadas como no-albicans, mais comumente isoladas, so menos susceptveis aos derivados azlicos, dificultando o tratamento dessas infeces. Embora a susceptibilidade das leveduras do gnero Candida aos antifngicos disponveis seja varivel e previsvel, nem sempre uma determinada amostra isolada segue o padro geral (Crocco et al., 2004).

2.5 Fungos fillamentosos no dermatfitos (FFND)

Onicomicose uma infeco crnica das unhas, considerada como um srio problema de sade pblica. Sua prevalncia provavelmente superior ao citado na literatura, devido dificuldade de diagnstico clinico micolgico, coleta inadequada do material para anlise, bem como um tratamento ineficaz torna difcil determinar o verdadeiro perfil das onicopatias (Araujo et al., 2003b). O padro epidemiolgico da etiologia das onicomicoses, nas ltimas dcadas, apresenta mudanas, principalmente pelo crescimento de indivduos imunossuprimidos, propiciando que fungos anteriormente considerados anemfilos, ou seja, contaminantes, serem considerados como potencial invasor do tecido ungueal. Esta mudana na viso est levando a uma integrao entre mdicos e laboratrios para adequado diagnstico e tratamento. Em geral h a concepo que o diagnstico das onicomicoses simples, entretanto a falta de critrio no diagnstico pode gerar problemas, tais como preveno de uma terapia ineficaz e dispendiosa, recidiva da doena, alm de riscos da exposio do paciente a drogas, com efeitos adversos importantes (Arrese e Pirard, 2003). A incidncia de onicomicoses causadas por fungos no dermatfitos varia com a regio geogrfica e com o clima. As razes da discrepncia na incidncia das infeces por FFND e nas infeces mistas so mltiplas, mas refletem a dificuldade em provar o agente etiolgico em tais infeces. Outras razes incluem reas geogrficas diferentes, diferentes tipos de amostra, diferentes tipos de como os organismos so isolados e identificados e as diferenas individuais de cada paciente. Os FFND so mais prevalentes em locais quentes e com umidade como nas reas subtropical e tropical, sendo esses organismos mais fceis de serem identificados nessas reas endmicas, do que quem vive em reas de clima temperado (Straten et al. 2002). Muitas espcies de FFND so isoladas de unhas, porm somente algumas espcies so identificadas como agente de onicomicose. Estes incluem Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium sp., Acremonium sp, Aspergillus sp., Scytalidium sp., Onichocola canadensis (Tosti et al.,2000). FFND ocorre em aproximadamente 10% da populao mundial, com onicomicose e devido sua rara ocorrncia o diagnstico baseia-se na apresentao clinica, epidemiologia e estratgias de tratamento, pois at o momento so raras; alm de diagnstico criterioso (Gupta et al., 2001). Clinicamente, as leses cutneas e ungueais causadas por Scytalidium spp no diferem daquelas causadas pelos dermatfitos; em cerca de 97 % das vezes,os membros inferiores so os mais acometidos (Cursi et al.,2011) Importante ressaltar que em casos de suspeita clnica de FFND lembrar-se que esses fungos so saprfitas e na natureza alimentam-se de matria orgnica em decomposio, considerado agentes de onicomicoses, os gneros que possuem capacidade de degradar a queratina. Oyeka e Gugnani (1998) estudaram a capacidade de Neoscytalidium dimidiatum var. dimidiatum, N. dimidiatum var. hyalinum, N. japonicum e Fusarium solani em degradar a unha e demonstraram que as diferentes espcies de Neoscytalidium e F. solani. Eles verificaram que o gnero Neoscytalidium degrada substratos das unhas em 42-43% e especificamente a queratina em 24-26%, enquanto no Fusarium degradam 40% dos substratos das unhas e 20% da queratina; enquanto nos dermatfitos estes processos representam 70-73% dos substratos das unhas e 42-52% de queratina, demonstrando assim que os FFND possuem potencial como agente primrio de onicomicoses. O gnero Fusarium tem como caracterstica principal a produo de condios multiseptados em forma de fuso, com as extremidades afiladas. A taxonomia desse gnero complexa, devido ao grande nmero de espcies que existem na natureza e complicada conidiognese, que diferencia uma espcie da outra (Araujo et al., 2003b). Souza et al. (2010) utiliza-se dos critrios de identificao de onicomicose por FFND estabelecidos por Gupta (2001): a) microscopia utilizando soluo de KOH em escamas subungueais; b) isolamento em cultura para confirma um diagnstico de onicomicose por FFND para demonstrar a viabilidade de estrutura fngicas observadas no exame micolgico direto, em gar Sabouraud-dextrose acrescido de antibiticos por um perodo de 5 dias a 6 semanas a uma temperatura de 25C a 37C; c) ausncia de isolamento de dermatfito em cultura, a partir das escamas

subungueais inoculadas em cultura, para considerar o FFND como patgeno; d) o isolamento de FFND a partir de diferentes inculos de escamas, com crescimento do organismo como um patgeno verdadeiro. Neste mtodo a necessidade de coletas sucessivas do material sugestivo de onicomicose, com intervalo de 1 a 2 semanas, com crescimento em 2 ou 3 tubos; d) Walshe e English (1966) descrevem o mtodo para distinguir fungos contaminantes do verdadeiro. Este mtodo envolve inculo de 5 a 20 fragmentos de escamas subungueais, no meio de cultura e presume que a espcie que isolar dos fragmentos o agente. Gupta et al. (2001) utilizando o procedimento de isolamento sucessivo verificaram que infeco por FFND em pacientes no tratados, apresentaram sucesso no isolamento do agente causal da onicomicose, enquanto a metodologia utilizada por Wash e English (1966) era apenas preditiva de onicomicose por FFND; e) o exame histopatolgico pode ser utilizado como uma alternativa quando o micolgico direto, com KOH e cultura esto associados com resultado falso-negativo, devido ser tcnica que apresenta maior sensibilidade, alm da vantagem de demonstrar que o fungo est invadindo o tecido e no s colonizando-o. A desvantagem da histopatologia de tratar-se de uma tcnica que exige laboratorista preparado, alm de um custo maior que o micolgico direto e cultura; sendo que a maioria dos estudos utiliza trs ou mais mtodos associados (Gupta et al., 2001) e f) o diagnstico molecular, utilizando o PCR (Polymerase chain reaction) pode ser usado por rapidamente amplificar pequena quantidade do DNA fngico obtido da amostra clnica. Analise desse fragmento ampliado de DNA altamente especfico na identificao da espcie do fungo. Entretanto apesar de ser uma tcnica mais sensvel e produzir resultados mais rapidamente ela requer laboratrio especializado, com equipamentos e reagentes caros, alm de no diferenciar o agente da infeco de contaminantes. Souza et al. (2010) relata que estudo de 205 pacientes, atendidos no Ambulatrio de Dermatologia da FMUSP, com suspeita clnica de onicomicose, foi diagnosticado 8,4% de casos de FFND. De acordo com o aumento da incidncia de onicomicose por FFND de extrema importncia que mais estudos sejam realizados no Brasil, se possvel em todas as regies, para que se possa ter uma atual e real prevalncia desta doena em nosso pas.

18

OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS

19

3. Objetivos Gerais e Especficos

3.1 Objetivo Geral

Caracterizao da onicomicose em pessoas idosas institucionalizadas.

3.2 Objetivos Especficos

1. Determinar a frequencia de leses dermatolgicas em pacientes idosos institucionalizados em duas casas de assistncia em So Bernardo do Campo; 2 . Identificar as espcies envolvidas nessas infeces; 3. Isolar e identificar fungos causadores de onicomicoses provenientes de pacientes idosos institucionalizados.

20

MTODOS

21

4. Mtodos

4.1 Aspectos ticos

O presente estudo foi desenvolvido nos Asilos: Casa dos Velhinhos Dona Adelaide (Anexo D) e Casa de So Vicente de Paulo (Anexo E), localizados em So Bernardo do Campo e considerados como entidades filantrpicas e de reconhecida utilidade pblica. Os materiais foram coletados da regio subungueal e interdgitos, de idosos institucionalizados, no perodo de ms de Maro de 2009 a ms Julho de 2010. O diagnstico micolgico foi realizado no Laboratrio de Micologia Mdica do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo (IMT/SP) e LIM/53 HCFMUSP. A aprovao do Protocolo de Pesquisa n 171/11, pela Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa CAPPesq da Diretoria Clnica do Hospital das Clnicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (Anexo F). A aceitao dos doentes ou seus responsveis foi documentado por meio de assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Tal consentimento foi obtido aps esclarecimento do estudo ao sujeito ou responsvel (Em muitos casos o idoso era representado por um funcionrio responsvel, da Instituio), pelo pesquisador executante. O TCLE foi elaborado com base no modelo pr-estabelecido pela CAPPesq (Anexo C).

4.2 Casustica

Foram realizados exames micolgicos (direto e cultura) em 44 indivduos, com 60 anos ou mais, idade limite estabelecida no Brasil pelo Estatuto do Idoso (terceira idade), moradores de duas casas assistenciais pblicas na cidade de So Bernardo do Campo, denominadas A e B. Caractersticas da casa assistencial A: localizada na rea central de So Bernardo do Campo, no qual moram 28 pessoas, com mais de 60 anos de idade, de ambos os sexos (17 homens e 11 mulheres), todos brasileiros. Conta com patrocnio financeiro de comerciantes da regio no Projeto

22

Amigos da Casa; doaes da comunidade; bazar e convnio de 18 vagas com a Prefeitura de So Bernardo do Campo. Segundo o estatuto do idoso a Casa tem direito a administrar 70% do beneficio dos moradores que recebem do INSS. A casa emprega 29 funcionrios (1 enfermeira no perodo da manh, 12 tcnicos de enfermagem - 8 durante o dia e 4 durante a noite, 2 cozinheiras, 2 auxiliares de cozinha, 1 coordenador de bazar, 1 gestora, 2 auxiliar lavanderia, 2 auxiliares de limpeza, 1 psicloga, 1 terapeuta ocupacional, 1 fisioterapeuta, todos os 3 cumprindo jornada de 44 horas semanais e 2 motoristas cumprindo jornada de 40 horas semanais). Um mdico geriatra funcionrio cumprindo jornada de 8 horas semanais. A Casa A mantm um programa de intercmbio com o curso de auxiliar e tcnico de enfermagem da Escola ETIP, em Santo Andr, que envia 10 alunos de ltimo semestre juntamente com 1 supervisora para aprendizado prtico no asilo, 6 pela manh e 4 tarde, tambm possui intercmbio com a Universidade Metodista de So Paulo recebendo 6 alunos de fisioterapia, 6 alunos de terapia ocupacional e 4 alunos de psicologia para estgio sempre acompanhados de superviso da instituio alternando-se em escalas no perodo da manh e tarde. Conta, ainda, com o auxlio no remunerado de trinta e seis pessoas voluntrias (1 podloga, 1 coordenadora de cozinha, 3 auxiliares na cozinha, 4 auxiliares de bazar, 1 cabeleireiro, 10 cuidadoras, que fazem atividades ldicas com os idosos internados,4 mdicos (1 ginecologista, 1 dermatologista, 1 psiquiatra e 1 oftalmologista que prestam atendimento sempre que necessrio) e 12 membros de diretoria, sendo composta por pessoas da comunidade. Os horrios de ateno destes voluntrios so variveis. Deste, todos os doentes que preencheram os critrios de incluso (17 no total, com 9 mulheres e 8 homens) foram escolhidos para participar do estudo. Caractersticas da Casa de Assistncia B: localizada na rea perifrica de So Bernardo, na qual moram 80 pessoas com mais de 60 anos de idade, de ambos os sexos (25 homens e 55 mulheres) e mantm-se atravs de convnio de 40 leitos da Prefeitura Municipal de So Bernardo do

23

Campo, bazar, 2 festas e 6 bingos anuais, doaes da comunidade. Segundo o estatuto do idoso ficam com 70% do benefcio dos moradores que recebem o benefcio do INSS e pela Ordem Religiosa Catlica de So Vicente de Paulo. A casa B fez recentemente uma parceria com a Prefeitura de So Bernardo do Campo, cedendo 20.000 m2 de sua rea para a construo do Hospital das Clinicas de So Bernardo do Campo com previso de entrega em 2012, recebendo em troca o pagamento de despesas fixas (gua, luz e telefone), a reforma do asilo (incluindo a construo de uma ala com posto de enfermagem para os moradores mais debilitados) e a renda do estacionamento que ser construdo para os usurios do hospital. A casa emprega 74 funcionrios (32 auxiliares e tcnicos de enfermagem, 6 auxiliares administrativos, 2 cozinheiras, 6 auxiliares de cozinha, 4 auxiliares de lavanderia, 2 motoristas, 2 auxiliares de estoque, 1 psicloga, 1 assistente social, 1 fisioterapeuta, 1 terapeuta ocupacional, 1 mdico geriatra, 1 nutricionista, 2 enfermeiros, 6 auxiliares de limpeza, 1 recepcionista, 2 seguranas, 1 porteiro, 2 auxiliares de manuteno, todos cumprindo jornada de 40 horas semanais). O asilo B recebe pessoas que cometeram crimes de menor valor ofensivo e que foram designados pelo juiz do estado de So Paulo a prestarem servios comunitrios. Os horrios de ateno destes voluntrios so variveis. Deste, todos os doentes que preencheram os critrios de incluso (27 no total, com 17 mulheres e 10 homens) foram escolhidos para participar do estudo.

4.3 Critrios de Incluso

Antes da realizao da coleta de amostras de raspado subungueal foi realizada uma avaliao de leses sugestivas de onicomicose para seleo. Foi coletado raspado subungueal, da rea de transio de tecido ntegro e com leso, do hlux direito ou esquerdo, associados ou no a outras unhas com leso, sendo a escolha baseada na unha com leso clinicamente mais afetada. Desses pacientes coletou-se tambm material da regio interdigital podal. Paralelamente, como controle da coleta, selecionou-se idosos sem leses ungueais sugestivas de onicomicoses, no qual a coleta ocorreu de escamas da regio interdigital podal.

4.4 Critrios de Excluso

Foi utilizado como critrio de excluso os pacientes que apresentaram unhas recm manicuradas ou que estavam sob tratamento de antifngico.

4.5 Coleta das Amostras

Foi preenchida uma ficha padro (Anexo B) em programa prprio com os dados do paciente nos ltimos 5 anos e assinatura dos responsveis no Termo de Consentimento Livre Esclarecido (Anexo C) aprovado pelo CEP. Foi coletado material da regio interdigital de ps, aparentemente sem leses, para estabelecer grupo controle, onde foram realizados exame direto e cultura. As leses das unhas dos pacientes foram documentadas fotograficamente antes da coleta. As coletas foram realizadas aps o banho matinal dos pacientes e aps a observao e caracterizao da leso, foi realizada assepsia com lcool isoproplico a 70%, para minimizar contaminaes secundrias e sujidades, e as escamas subungueais e/ou escamas da regio interdigital, ento, coletadas utilizando-se a cureta dermatolgica esterilizada. Os primeiros detritos coletado da poro distal foram descartados, j que so ricos em contaminantes. As escamas obtidas da regio de transio entre a unha normal e a afetada foram utilizadas para os exames micolgicos. Aps coleta as escamas foram acondicionadas entre duas lminas de microscopia e envoltas em papel laminado, devidamente identificado com o nmero do paciente, e enviado ao Laboratrio de Micologia LIM 53 Instituto Medicina Tropical da Universidade de So Paulo.

25

4.6 Processamento das Amostras

4.6.1 Exame Direto

Em at no mximo 24 horas, o material coletado foi processado, no Laboratorial de Micologia, sendo fracionado em duas partes e com uma delas clarificadas com KOH + DMSO [dissolver 10g KOH em 60 mL de gua destilada e acrescentar a soluo 40 mL de DMSO (dimetilsulfxido)] para visualizao de elementos fngicos em escamas de unhas e pele (interdgito) em microscpio ptico comum, com aumento de 40X.

4.6.2 Isolamento Primrio

Paralelamente, ao exame micolgico direto, as escamas foram semeadas em gar Sabouraud-dextrose (SAB) [DIFCO, Bencton Dickinson and Company Sparks, USA], acrescido de cloranfenicol para isolamento de leveduras e FFND e no meio seletivo gar Mycosel (DIFCO, Bencton Dickinson and Company Sparks, USA), que contm na sua composio ciclo-heximida para inibio de fungos anemfilos. Dissolveu-se meio (SAB ou Mycosel) em gua destilada sob aquecimento em banho-maria at dissolver completamente. Para o meio Mycosel aps total dissoluo preparou-se a soluo de cloranfenicol dissolvendo-se 100 mg de cloranfenicol em 10 mL de lcool etlico 95C (Lacaz et al., 2002; Sidrim et al., 2004). Distribuiu-se alquotas de 10 mL em tubos de ensaio com tampa de rosca estreis. Autoclavou-se, por 15 minutos, a 121C. Deixou-se solidificar em superfcie inclinada. As escamas foram inoculadas em gar SAB e Mycosel, em duplicata, e incubadas em estufa a 28C, durante quatro semanas com reviso peridica a cada cinco dias. Aps esse perodo, as culturas que estavam sem crescimento fngico foram descartadas. A identificao do agente foi realizada pela avaliao dos aspectos macroscpicos (aspecto, textura, tempo de desenvolvimento da colnia, pigmentao do verso e anverso dos cultivos) e micromorfolgico da colnia realizado pela tcnica de microcultivo em lmina, em meio de gar batata-dextrose para dermatfitos, fungos filamentosos no dermatfitos (FFND) e gar fuba-Tween 80, para leveduras. As provas fisiolgicas e bioqumicas foram realizadas quando necessrias. Na micromorfologia avaliamos a presena de macro e micro condios, espessura das hifas e disposio dos condios, para fungos filamentosos e nas leveduras a presena de hifas, pseudohifas, formato e disposio dos blastocondios, alm da presena clamidocondio. Na identificao das leveduras, alm da micromorfologia associou-se o comportamento fisiolgico e bioqumico (Lacaz et al., 2002; Sidrim e Rocha, 2004).

4.6.3 Isolamento Secundrio

As amostras que apresentaram crescimento de clulas fngicas no isolamento primrio foram submetidas ao microcultivo para avaliao das estruturas de reproduo. Nos casos duvidosos, por isolamento de FFND e foram realizadas novas coletas, com intervalo de 10 a 20 dias, e mantidos nas condies j descritas anteriormente para confirmao do resultado. Importante ressaltar que consideramos o isolamento de colnias puras.

4.6.4 Microcultivo em Lmina (Tcnica de Ridell) para Fungos Filamentosos (Dermatfitos e FFND)

Para os casos onde o isolamento em meio Sabouraud-dextrose no foi suficiente para demonstrar s estruturas necessrias a identificao foi aplicada a tcnica de microcultivo em lmina. A metodologia de microcultivo em lmina consiste em utilizar lminas de microscopia como suporte para pequenos blocos de gar batatadextrose, acondicionados no interior de placas de Petri, onde foram inoculados em suas extremidades fragmentos de cultura, e recobertos por lamnula. Estas placas foram incubadas a temperatura ambiente no perodo

27

de at 15 dias. Aps este perodo, pequenos fragmentos foram retirados e corados com lactofenol para observao microscpica. Esta tcnica permite a caracterizao dos isolados atravs da visualizao ntegra das estruturas de frutificao. A metodologia de microcultivo em lmina consiste em utilizar lminas de microscopia como suporte para pequenos blocos 5mm X 5mm de gar batata-dextrose, preparada a partir da infuso de batatas - 500 mL (200 g cozidas por 1hora em 500 mL de gua destilada. Em paralelo 15 g de Bacto Agar (DIFCO, Bencton Dickinson and Company Sparks, USA) em 500 mL de gua destilada estril dissolvido em banho-maria. Aps o cozimento a infuso filtrada em gaze e ao volume foi acrescentado ao Agar dissolvido e acrescido de 10g de dextrose (DIFCO, Bencton Dickinson and Company Sparks, USA). O meio foi distribudo em tubos e autoclavado a 121C por 15 minutos. Este bloco foi acondicionado no interior de placas de Petri, onde foram inoculados em suas extremidades fragmentos de cultura, e recobertos por lamnula. Estas placas foram incubadas a temperatura ambiente no perodo de at 15 dias. Aps este perodo a lamnula foi retirada e corada com lactofenol para observao microscpica. Esta tcnica permitiu a caracterizao dos isolados atravs da visualizao ntegra das estruturas de frutificao.

4.6.5 Provas Fisiolgicas e Bioqumicas para Identificao de Dermatfitos

Os isolados de dermatfitos foram repicados no meio de gar batata com intuito de observar a pigmentao no verso e anverso da cultura, alm da prova da urase na diferenciao de fungos do gnero Trichophyton.

4.6.6 Re-Isolamento Pureza do Isolado Clnico e Identificao Presuntiva de leveduras

O meio CHROMAgar Candida (DIFCO Becton, Dicknson and