BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS Annie Villegas - Luis Enrique Quinchia Universidad Icesi Facultad de Ciencias

Naturales Laboratorio de Bioqumica Santiago de Cali, Colombia 7 de noviembre de 2013 Anlisis de resultados: Las levaduras pertenecen al reino de los Fung (hongos) microscpicos unicelulares. Su importancia radica en la capacidad de fermentar diversos tipos de compuestos orgnicos, en general azcares e hidratos de carbono. A nivel estructural las levaduras poseen en su membrana plasmtica una protena que es una bomba ATPasa de H+ que consume casi el 25% del ATP que produce la clula. Esta bomba se copla por la hidrlisis del ATP por un bombeo de protones hacia a fuera de la clula, al igual que otro tipo de bombas de membrana esta inhibe concentraciones de un producto o una sustancia de un lada y lo pasa al otro. Esto produce un gradiente electroqumico que genera un trasporte de nutrientes al interior celular.

FIGURA1. Esquema de la Sntesis de ATP en la mitocondria.

No obstante como se muestra en la figura 1, en la membrana plasmtica mitocondrial las levaduras al igual que muchos otros organismos, poseen una bomba llamada ATPsintetasa, que es la encargada de sintetizar ATP que al contrario de la ATPasa que con el flujo de protones rompe ATP, este paso de H+ induce a su sntesis. Segn esto se puede deducir que a medida que las levaduras consumen glucosa, se observara una disminucin progresiva de su concentracin en el medio de cultivo con el tiempo y que sucedern cambios en el pH extracelular. Para confirmar de una manera experimental de esto se prepararon tres tubos de muestra en el laboratorio, el primero es una muestra de control, el segundo una muestra con DNP y el tercero con una muestra de Azida de sodio. Cada tubo contena diferentes reactivos pero las mismas concentraciones de levadura. Como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Parmetros para la preparacin de 3 muestras de suspensin de levadura al 20% TUBO 1: TUBO 2: TUBO 3: Reactivo Muestra Muestra con DNP Muestra con azida control Suspensin de levadura al 20% 5 5 5 (mL) Agua destilada (mL) 40 40 40 Solucin de DNP 80 mM (mL) 0,2 Solucin de azida de sodio 800 0,5 mM (mL) DNP 2,4-Dinitrofenol

Figura 2. Estructura qumica del 2,4-dinitrofenol

El 2,4-dinitrofenol, figura 2, es un desacoplante muy empleado, debido a que puede actuar cerca de la membrana interna y protonarse. Esto, se fundamenta en que al estar en una zona con un pH muy bajo, al protonarse se incrementa la hidrofobicidad del DNP y permita que se difunda en la membrana e incluso atravesarla. Al estar ya dentro de la matriz, el pH que es ms alto provoca que el hidroxilo fenlico se desprotone. Por ende, el desacoplador posee el efecto de transporte de H+ de vuelta hacia la matriz, evitando el canal protnico Fo y, por tanto, evitando la sntesis de ATP, figura 3.

Figura 3. Mecanismo del DNP

Azida de sodio

Figura 4. Estructura qumica de la azida de sodio La azida de sodio, figura 4, es el compuesto inorgnico con la frmula NaN3. Esta sal incolora es el componente formador de gas en muchos automviles airbag sistemas. Adems, es un sustancia inica, altamente soluble enagua , y es muy txico.

Figura 1. Estructura en 3D de la azida de sodio. La toxicidad de la azida radica en su forma aninica, pues forma un enlace irreversible con el cofactor hemo de la enzima Citocromo C oxidaxa, inhibindola de una manera similar de como lo hace el monxido de carbono, este Citocromo C oxidasa es el complejo IV de la Figura 1. Adems de los desacoplantes que se utilizaron en la prctica tambin existen diversas molculas que actan como inhibidores de la cadena de transporte electrnico como por ejemplo la rotenona, amital, antimicina A, cianuro y monxido de carbono ya antes nombrado. A continuacin se explicara un poco su efecto y de donde provienen. Inhibidores de la cadena transportadora de electrones Los inhibidor de la CTE son sustancias que es el caso de unirse con algn componente de esta cadena bloquean la de forma de cambiar de manera reversible desde su forma oxidada hasta su forma reducida. Debido a que en presencia de estos inhibidores no se libera energa, la sntesis de ATP tambin se detiene. El Amital y la Rotenona

Figura 6. Estructura qumica del Tiopentato de Sodio (Amital)

Figura 7. Estructura qumica de la Retenona

El primero es un barbitrico (figura 6), y el segundo (figura 7) es un producto vegetal obtenido de las plantas que se usa como insecticida y pesticida. Ambos, bloquean la cadena de transporte electrnico entre la NADH deshidrogenasa (Complejo I) y la CoQ. Como consecuencia, ellos evitan la utilizacin del NADH como donante de equivalentes de reduccin a la cadena respiratoria. Sin embargo, el flujo de electrones que resulta de la reduccion-oxidacion del Complejo II no es afectado, ya que los electrones entran en un punto posterior al bloqueo, a travs de la Coenzima Q. El efecto del Amital ha sido observado in vitro, ya que la intoxicacin con amital y otros barbituratos afecta principalmente alSistema Nervioso Central al actuar sobre los canales de iones sensibles al GABA, un efecto no relacionado con la accin del amital sobre el Complejo I. Por otra parte, cabe destacar que la Rotenona y el MPTP (una neurotoxina), que tambin afecta al Complejo Respiratorio I, cuando se administran de forma intravenosa, causan sntomas y signos muy parecidos a la enfermedad de Parkinson. Estas substancias afectan primariamente a las neuronas de la substancia nigra. Aparentemente la secuencia de eventos es: afectacin del Complejo I, afectacin del metabolismo mitocondrial, acumulacin de radicales libres, muerte celular, liberacin de substancias toxicas y destruccin de otras clulas. Antimicina A La Antimicina A es un antibitico producido por Streptomyces griseous que ha sido usado como veneno para controlar alguna especies de peces. La Antymicina A interfiere con el flujo de electrones desde el citocromo bH en el Complejo III (Qcytochromo coxidoreductasa). En presencia de esta sustancia, el citocromo bH puede ser reducido pero no oxidado, y consecuentemente, el citocromo c permanece oxidado, al igual que los citocromos a y a3 del Complejo IV. Monxido de carbono El monxido de carbono (CO) es responsable a nivel mundial por ms del 50 % de las muertes por ao. La intoxicacin por monxido de carbono causa trastornos en la entrega de oxgeno a los tejidos y en su utilizacin celular. La afinidad de la Hemoglobina por el monxido de carbono es casi 300 superiores a la que tiene por el oxgeno. Un ambiente en el cual hay apenas 100 ppm de CO es suficiente para que la formacin de Hemoglobina llegue a 16 %.

La situacin empeora adems ya que la unin de CO a uno de los grupos Hemos de la Hemoglobina aumenta la afinidad por el oxgeno de los otros tres grupos Hemos de la molcula, por lo cual la entrega o liberacin del oxgeno a los tejidos est muy afectada. Debido a su alto consumo de oxgeno, el cerebro y el corazn son los rganosms afectados. La mioglobina tiene ms afinidad aun por el CO que la Hemoglobina, por lo que el musculo cardiaco est severamente afectado y el paciente presenta una marcada hipotensin. Como ya fue descrito anteriormente, la intoxicacin por CO es una importante causa de muerte en todo el mundo.

Figura 8. Efecto del monxido de carbono en los hemates. El CO se une a la forma reducida del hierro (Fe ++) de los grupos Hemos de la Citocromo Oxidasa como se muestra en la figura 8. Cianuro

Figura 9.Estructura qumica del cianuro La intoxicacin por cianuro (figura 9) es frecuente por inhalacin de fuegos industriales residenciales o en personas que profesionalmente trabajan con el y con sus derivados. Este afecta a todas las metal enzimas, pero su principal efecto toxico es la unin al Fe++ en los grupos Hemos de la Citocormo C oxidasa.

Azidas Retomando el tema de las azidas, como ya se indag, se puede inferir que afectan a la cadena respiratoria de una forma muy similar al cianuro, ya que inhiben a los grupos Hemos de los citocromos en la Citocromo Oxidasa (Complejo IV). Las azidas son usadas en los airbags, en la produccion de detonantes (explosivos) y como preservativo d el suero y de algunos reactivos quimicos y biologicos. Se han reportado casos de intoxicacion por azida en humanos. Para terminar, podemos decir que la accin de cualquiera de estos inhibidores, puede detener las reacciones redox de la cadena respiratoria. En estas, no se libera energa, las bombas de protones no funcionan, por lo que no hay protones que regresen a travs del complejo V, y la produccin de ATP cesa. Con los tubos preparados se procedi a evaluar el pH de cada una de las muestras en intervalos de 3 minutos durante 6 minutos obteniendo los siguientes resultados: Tabla 2. Determinacin del pH en las muestras de levadura control, con un desacoplante (DNP) y un inhibidor (Azida) Tiempo (min) TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 0 5,36 5,26 5,70 3 5,46 5,38 5,72 6 5,45 5,37 5,73 Despus de dejar en reposo cada muestra se adiciono 5mL de glucosa al 10% y se volvi a determinar el pH, esta vez en intervalos de 5 minutos durante un cuarto de hora y luego de 20 minutos ms en intervalos de 10. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Determinacin del pH con la adicin de glucosa al 10% Tiempo (min) TUBO 1 TUBO 2 0 5,45 5,37 5 4,94 5,21 10 4,61 5,06 15 4,45 4,99 25 4,48 5,02 35 4,41 4,97

TUBO 3 5,74 5,70 5,61 5,57 5,59 5,56

Grfica 1
5.8 5.7

5.6

pH

5.5 5.4 5.3 5.2 0 2 4 6 8

control

DNP
Azida

Tiempo (min)
Grafica 1. pH en funcin de tiempo de solucin control , DNP 80Mm y azida de sodio 800Mm.

Grfica 2
6.0 5.5

pH

5.0 4.5 4.0 0 10 20 30

Control DNP Azida

Tiempo (minutos) Grafica 2. pH en funcin de tiempo de solucin control , DNP 80Mm y azida de sodio 800Mm. Despus de 5 minutos

Como se observa en la grfica 1, la muestra con el 2,4 dinitrofelnol (DNP), se encuentra a un pH ms bajo con respecto al control y la azida, esto se da porque este compuesto es un transportador de protones, soluble en lpidos y con un pKa de 4,1 que se reparte entre sus formas acidas y bsicas, ambas pueden difundir fcilmente por la membrana y disipan el

gradiente de protones, el resultado de esto es un menor flujo de protones por la ATP sintasa y por lo tanto la disminucin de la produccin de ATP, sin que se detenga el paso de protones a travs de la membrana. El mecanismo por el cual funciona este compuesto se muestro en la figura 3 anteriormente. Si observamos nuevamente la grfica 1, el comportamiento de la muestra que contena azida es totalmente diferente a la muestra control y a la muestra con DNP, esto se debe a que la azida actua como un inhibidor, por lo tanto se unen al complejo IV de la cadena de transporte electrnico y bloquean el transporte electrnico, por ello estos compuestos reducidos se acumulan antes del punto de bloqueo y compuestos oxidados despus del bloqueo, por eso no se puede bar el bombeo de protones y no se forma el gradiente de protones y el pH permanecer casi constante durante el tiempo, lo que conllevara a que no se de la produccin de ATP . El mecanismo por el cual inhibe consiste en formar un enlace covalente con el cofactor Hemo a3, este se da la acumulacin de especies reducidas y oxidadas y no se produce la fuerza proton motriz para la sntesis de ATP. Otra caracterstica importante es que la azida en su forma anionica tiene un caracter bsico, lo que explica porque el pH experimental fue mayor en comparacin con la muestra control y con la muestra con DNP. Posteriormente, se realiz una prueba con glucosa y cada una de las sustancias inhibidoras. En la grafica 2 se observa el cambio de pH a medida que pasa el tiempo en cada muestra, para la muestra de control que no contiene ningn tipo de inhibidor el pH disminuye, es decir que la concentracin de hidrogeniones (H+) aumenta. El proceso de glicolisis esta activo por la concentracin alta de glucosa, que despus pasa al ciclo de kreps en donde la concentracin de NADH y FADH2 aumenta, luego estas molculas pasan a la cadena de trasporte (fosforilacion oxidativa) activando los complejos de los cuales los 1,3 y 4 ayudan a general el gradiente de protones, con lo cual aumenta la concentracin de H+ en la zona intermembranal de la mitocondria. Al igual que lo ocurrido en la grafica 1, el DNP y la azida tienden a que la cadena de transporte no ocurra, con lo cual la concentracin de H+ no aumenta. Teniendo en cuenta que debido al bombeo de protones, el espacio intermembrana de la mitocondria tiene una diferencia de H+ de 1,4 y es 0,14 veces ms positivo con respecto a la matriz, se puede cuantificar la energa asociada a un gradiente de protones. Para esto se debe recordar que el incremento de energa libre asociado al movimiento de una sustancia de un lado de la membrana esta dado por la Ecuacion 1. G= RTln (1) ) + ZFV

Donde R vale 8,32 x 10 -3kJ/ (mol)K), T es la temperatura en kelvin (310 k), es la carga de la sustancia transportada (1), F es la constante de Faraday (96,48 Kj/ molv) y G es el potencial a travs de la membrana en voltios. G= (8,32 x 10 -33kJ/ mol K) (310 K)(1.4)=(1) (96,48 kJ/mol V) (0,14 V) G= 21,8 kJ/mol Este valor de energa libre nos quiere decir que por cada protn transportado desde la matriz al lado citoplasmico representa una energa libre de 21,8 Kj/mol. Por consiguiente la cantidad de ATP generado por el ADP y el Pi a partir del gradiente de protones, es de 30 molculas netas de ATP.

Conclusiones Se identific la variacin en el pH en el tiempo de acuerda al consumo de la glucosa. Se identific la importancia del bombeo de protones en los organismos biolgicos para mantener la homeostasis equilibrando en nivel de pH. Se identifico la diferencia por medio de graficas del comportamiento de un desacoplante y un inhibidor, con respecto a un control.

Bibliografa. 1. MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO. Facultad de medicina. Universidad UNAM. http://www.facmed.unam.mx/fm/pa/2010/practicas/practicas_bioquimica.pdf. Consultado el 7 de noviembre de 2013. 2. Ming Yeong L.; Lo esencial en metabolismo y nutricin: 1ra Edicin 2010; Editorial Elsevier Mosby, Espaa; paginas 30-35. 3. BERG. M. Jeremy; TYMOCZCO. L. John; STRYER Lubert. BIOQUMICA; 6ta edicin; Editorial Reverte 2007; Capitulo 18. 4. http://www.ciencias.unal.edu.co/unciencias/web/grupoinv/index.php?op_=7 visitada el 7 noviembre de 2013.