Los tipos de reacciones de precipitacin son: a) En medio lquido: Cualitativa: se usa poco ya que existen mejores mtodos para

detectar presencia o ausencia, adems, debido a lo que mencionamos antes sobre la posible existencia de ms de un complejo en la mezcla, para utilizar este mtodo debemos asegurarnos de que uno de los reactivos este puro. Semicuantitativa: tampoco se usa, constituye un mtodo poco prctico. Cuantitativa: esta es la primera tcnica que permiti medir en masa la cantidad de Ag. o Ac. Presente en una solucin. Por ej. Queremos medir la masa de Ac. anti neumocccico en un suero. Disponemos del polisacrido purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un solo sistema reaccionante). Se colocan en una serie de tubos cantidades crecientes del antisuero y constantes del polisacrido, se incuba la mezcla 1hr a 37C y luego se centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las protenas contaminantes y lo resuspendemos, finalmente medimos la cantidad de protenas por ej. por absorbancia a 280nm. En este caso como el Ag. no es proteico, la medida obtenida corresponder solo a los Ac. presentes en el suero. Si ambos reactivos fueran proteicos, el clculo se hara restando la cantidad agregada del reactivo conocido. Para obtener la masa debemos tener una curva de calibracin: masa de protena vs DO y, a partir de la DO medida en nuestros tubos, obtenemos la masa incognita. La medicin de DO se realiza en el tubo de mximo precipitado, donde sabemos que todo el Ag. y Ac. presentes formar parte del mismo. b) En medio slido ( precipitacin en gel) : Se usa como soporte de la reaccin un gel de manera que las molculas difundirn libremente a travs de l de manera que, a lo largo del recorrido se ir formando un gradiente de concentraciones que har que en un determinado punto los reactivos se encuentren en su relacin de equivalencia, en ese punto se producir un precipitado que sobre el gel se ver como una ntida banda blanca que permanece estable mientras un mayor flujo de reactantes no provoque su re disolucin. Como se recordara, en la precipitacin en medio lquido no era posible distinguir en el precipitado la presencia de ms de un sistema reaccionante, en el caso de que las molculas estn disueltas en un medio gelificante sumamos a los fenmenos de la precipitacin, los de la difusin simple, de manera que aquellos complejos cuyos coeficientes de difusin sean distintos formaran bandas en distinta posicin. De esta manera podemos resolver la existencia de ms de un complejo reaccionante en la mezcla. Sin embargo no podremos separar complejos con igual coeficiente de difusin, y decimos que cada banda que se forme estar compuesta por lo menos por 1 sistema . Como soporte se usan medios semi slidos como agar blando (agar 1% en solucin salina) agarosa 0,5% etc. Todos aquellos que permitan una libre difusin de macromolculas.

La precipitacin en gel puede ser: Cualitativa: existen diferentes esquemas que nos permiten detectar la presencia de un Ag. o un Ac. (segn el caso). - Difusin simple monodimensional ( mtodo de Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia de un Ac.) Se deja solidificar y se aade la solucin de Ag., este va a difundir por el agar formando, como dijimos, un gradiente de concentracin decreciente hacia el fondo del tubo, significa que en determinada zona Ag. y Ac. alcanzarn la relacin de equivalencia, formndose ah la banda de precipitado. Se formarn tantas bandas como sistemas haya, siempre que la velocidad de difusin sea distinta para cada uno de ellos. Se ha intentado utilizar este sistema con fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se forma la banda es directamente proporcional a la concentracin del reactivo que difunde, entonces mediante distintas frmulas matemticas se puede calcular la concentracin en funcin de la distancia recorrida. - Difusin doble monodimensional ( mtodo de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag. Tanto el Ag. como el Ac. migrarn hacia la zona media de menor concentracin, de manera que, otra vez, se formarn gradientes que harn que en deteminado punto los reactivos estn en equivalencia y precipiten. Vemos ac, que si la concentracin de Ag. y Ac. estn en relaciones ptimas (equivalentes) la banda se formar en un punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad de Ag. esta en exceso necesitar recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilucin tal que se encuentre en equivalencia con el Ac. y as la banda se formar ms cerca del fondo. Lo contrario ocurrir cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en exceso. Fig. 6

- Difusin doble bidimensional (mtodo de Ochterlony) : Constituye un mtodo muy completo ya que permite obtener mas informacin que los anteriores.

Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeas cantidades de Ag. y Ac. En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitacin cuyas caractersticas dependern de varios factores.

Fig.7

Igual que en el caso anterior, cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estn cerca de la de quivalencia la banda se formar a mitad de distancia entre ellos. Adems, nos permite tener idea de los PM de cada reactivo ya que al tratarse de una difusin radial, la concavidad de la banda estar hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM, y viceversa, si ambos PM son semejantes la banda ser recta. Por otro lado, la posibilidad de hacer varios pocillos en una placa permite obtener informacin sobre similitud de los Ag. reaccionantes. Recordemos que las macromolculas antignicas tienen en su superficie zonas llamadas determinantes antignicos y que son los sitios reconocidos por el Ac. As, dos Ag. emparentados ( por ej. dos albminas de distinta espcie) tendrn probablemente determinantes antignicos comunes a ambos. Mediante la tcnica de Ouchterlony podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes entre Ag. segn las caractersticas de las bandas formadas. Fig.8

La reaccin de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes antignicos, es decir que estamos ante la misma molcula, en la de no identidad (II), ningn determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintos mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en comn, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto se ve como un espoln dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Notese que en este caso ltimo, ab es una sola molcula Ac, otra vez nos referimos a un sistema reaccionante con un determinado coeficiente de difusn. En caso de que los sistemas sean varios tendremos tambien distintas bandas segn las velocidades de difusin de cada uno. Esto nos va a permitir determinar la pureza de una solucin antignica, recordando siempre que cada banda corresponder a, por lo menos, un sistema. Fig.9

En este esquemas vemos, en el caso I, que en el pocillo ac , hay 2 sistemas reaccionantes (a y c) uno de los cuales ( a) presenta reaccion de identidad con el otro pocillo a (ya que se trata del mismo Ag.), mientras que el sistema c da una banda separada ( es decir que su concentracin y su coeficiente de difusin son distintos, por lo tanto es otra molcula antignica). En el caso II, se enfrenta la solucin ab con la solucin b, ac vemos la banda de no identidad correspondiente a los Ag a y b de cada pocillo, y la banda de identidad correspondiente a b, presente en los dos. La diferencia con el caso I radica en que en II, a esta en mayor concentracin relativa de lo que esta c en el I. En el esquema III, vemos la identidad parcial de ab y b, y las bandas c y d que no presentan identidad ni con a ni con b. Notese que en este ltimo caso ab es tambien una sla molcula. Evaluacn de los pasos de purificacin de albumina srica humana. Fig. 10

Otra utilidad de este mtodo es la de testear los pasos de purificacion por ej. de una protena , a partir del material a purificar ( 1) vemos la desaparicin de bandas en los distintos pasos, asi el resultante del 1 paso, pocillo 2, presenta una banda menos que el 1, y en el pocillo 3 ya vemos solamente la banda continua correspondiente a la albmina, es decir que el paso 4 no sera necesario. En el pocillo central debemos colocar un antisuero total que nos revele todas las protenas del suero a purificar. En este ejemplo ser antisuero humano total. Como control debemos colocar un pocillo con albumina humana purificada para verificar su identidad con la banda presente en el ultimo paso de purificacin. La banda de albumina esta representada por la linea continua que rodea el pocillo central. Semicuantitativo:En este tipo de pruebas se busca determinar la cantidad de un determinado reactivo . Cuando la cuantificacin es relativa, el resultado depende del mtodo usado, los reactivos empleados etc., entonces hablamos de ensayos semicuantitativos. En inmunologa el resultado de estos ensayos se expresan como ttulo. El ttulo se define como la inversa de la ltima dilucin que da resultado positivo. La metodologa empleada consiste en colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en sol. fisiolgica y sobre l realizar perforaciones delimitanto pocillos en los que se colocarn los reactivos, uno de ellos en concentracin constante y el otro, el que se va a cuantificar, en diluciones crecientes. Fig. 11

En este caso, el ttulo del antisuero 1 es 8, y el del anti suero 2 es 4. Cuantitativo: En estos casos la cuantificacin se realiza en masa, es decir que el resultado obtenido no debe variar de una tcnica a otra ya que representa una medida absoluta. La tcnica de precipitacion usada en este caso es una difusin simple en placa o inmunodifusin radial ( Mancini ). Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solucin salina, en el que se encuentra disuelto el Ac.Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras a dosar. Como mencionamos en prrafos anteriores, la distancia a la que difunde un Ag. hasta alcanzar la relacin de equivalencia con su correspondiente Ac. y precipitar, es proporcional a la concentracin del mismo. Entonces, cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor del pocillo un circulo de precipitacin. Debido a que la concentracin del reactivo disuelto en el agar es constante, el dimetro del crculo descripto por la banda de precipitacin ser directamente proporcional a la concentracion del reactivo que difunde. Para realizar el ensayo, se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un estandar del Ag. a dosar y en los otros la o las muestras incgnitas. Luego se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el dimetro de los halos no se modifique (48-72 hs). Se mide el dimetro de los halos y con aquellos correspondientes a los estandares se construye una curva de calibracin relacionando la superficie de los mismos (elr2 o d2) con la concentracin. Con la medida de los halos de las muestras incgnitas y mediante esta curva, se calcula la concentracin de las mismas.

Este mtodo, en el cual el precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica, constituye la llamada determinacin de alta precisin. Se puede realizar una determinacin rpida de orientacin en la cual se incuba la placa entre 16 y 20 hs. y se grfica dimetro vs. log de la concentracin de Ag. Fig. 12 Curva de calibracin

Existen kits comerciales que traen la placa con el Ac. ya incluido en ella , un estandar de concentracin conocida y una tabla de concentracin en funcin de los dimetros o radios; de manera que slo sembramos ese estandar y nuestras muestras. Al cabo de la incubacin medimos el halo del estandar para verificar que corresponda a la concentracin establecida y, si es as, slo medimos los halos de nuestras incognitas y con esto obtenemos la concentracin en la tabla adjunta.

Para antgenos particulados: Aglutinacin: En la reaccin de aglutinacin, los principios son los mismos que en la precipitacn, la diferencia radica en que en este caso el Ag. no es soluble sino particulado ( ej. bacterias, clulas, glbulos rojos etc.) La formacin de las redes dar como consecuencia agregados en forma de grumos en el fondo del tubo. El Ag. no se encuentra en solucin sino en suspensin y al ser una partcula grande, se formen o no los agregados, sedimentar; la diferencia entre una reaccin negativa, donde lo que vemos en el sedimento es slo el Ag. yuna positiva, donde se

forman los complejos, esta dada por la caracterstica visual del sedimento que, en el primer caso ser un botn homogeneo de clulas y en el segundo sern grumos. Fig. 13

Cuando el anticuerpo est dirigido contra antgenos constitutivos de la partcula, se trata de una aglutinacin directa, por ejemplo la determinacin de grupos sanguneos o la deteccin de Ag. bacterianos, mientras que la interaccin del anticuerpo con un antgeno soluble cualquiera acoplado a una partcula inerte o a una clula, como por ej.un glbulo rojo, se denomina aglutinacin pasiva. Esta es ms sensible que la directa debido a la posibilidad de regular la densidad de los determinantes sobre la superficie de la partcula. La aglutinacin puede ser: Cualitativa: es la tpica reaccin de determinacin de grupo sanguneo, donde se ponen en contacto la sangre a determinar con sueros de distintos grupos, y se considera la produccin o no de aglutinacin.

Fig. 14

Cuantitativa: no es muy usada, al igual que en la precipitacin cuantitativa, consiste en medir protenas en el aglutinado; se puede utilizar por ej. para determinar los mg de anticuerpo contra un Ag. particulado, presente en un suero inmune. Para esto, se determina por micro Kjeldahl, el nitrgeno proteico correspondiente a un volumen determinado de antgeno puesto en contacto con el suero inmune y por otro lado, el nitrgeno correspondiente al mismo volumen de Ag. puesto en contacto con un suero normal de la misma espcie animal. La cantidad de protena correspondiente al Ac. especfico sera la diferencia entre ambas mediciones multiplicada por el factor de conversin 6,25. Como en el caso de la precipitacin, previo a la medicin de N, hay que lavar el aglutinado para eliminar toda protena no fijada especficamente y adems, como se trata de clulas se coloca EDTA para inhibir la fijacin de complemento. Semicuantitaviva: esta tcnica se realiza normalmente en microtubos o placas de fondo en U y consiste, al igual que en el caso de la precipitacin, en colocar concentraciones constantes de uno de los reactivos en contacto con concentraciones variables del reactivo a determinar. Asi, obtenemos el ttulo, que ser, igual que en todo ensayo semicuantitativo, la inversa de la mayor dilucin que da un resultado positivo. Debemos recordar que se trata de una medicin relativa y no absoluta, por lo cual puede variar de laboratorio en laboratorio y siempre debe ir acompaada de un control positivo y otro negativo, realizado en el mismo laboratorio y por el mismo mtodo. Es una tcnica muy til, rpida y econmica para determinar Ag. bacterianos y de hecho, se la us para clasificar serolgicamente enterobacterias como por ej. lasdel gnero Salmonella.