Sunteți pe pagina 1din 70

ELECTROFOREZA Definiii Teoria Electroforezei Tehnici Electroforetice Proceduri generale Electroforeza capilara Aplicatii

Electroforeza
Migrarea substanelor incrcate electric dizolvate ntr-un mediu lichid si supus unui cmp electric Multe molecule biologice au grupe ionizabile de exemplu: aminoacizi, proteine, nucleotide, acizi nucleici Sub un cmp electric particule nccate migreaz la anod (+) sau catod (-) Se poate determina marimea, forma si sarcina unei molecule. Se utilizeaza diferite variante ale electroforezei 2 pentru a determina diverse proprietati.

Electroforeza
Definitie: Migrarea ionilor prin atractie sau respingere intr-un camp electric.

Separarea componentilor unui amestec prin aplicarea unui camp electric extern
v = viteza moleculei E = intensitatatea campului electric Q = sarcina moleculei f = coeficientul de frecare
3

v=EQ/f

Electroforeza: aspecte teoretice


Forta electromotoare (emf)

+
Analitul

V Q Femf EQ d Fdrag 6r cand Femf Fanalit , vitezaconsa nta

TEORIA ELECTROFOREZEI Multe molecule biologice exist ca: (a) anionii sau (b) cationi Soluie cu pH < pI => Amfolitul are sarcina +ve Soluie cu pH > pI => Amfolitul are sarcina ve

ntr-un cmp electric: Cationii migreaz la catod (-) Anionii migreaz la anod (+)
5

Viteza de migrare depinde de: Sarcina electric net a moleculei Dimensiunea si forma moleculei Puterea cmpului electric Proprietile mediului (electrolitului) Temperatura de separare

CONSIDERAII TEHNICE Electro-endo-osmoza / Endo-osmoza suport n contact cu apa = ioni hidroxil adsorbii => sarcin negativ (solvatare) Sarcina negativ de pe suport atrage ionii pozitivi n soluie => potenial Stern crete distana de la suprafaa ncrcat negativ crete numrul de ioni negativi potenial zeta () numrul eventual de ioni - = nr. ioni +
7

Endosmoza
-

+
-

+
Mari, extrem de incarcate, proteinele pot migra intre electrozii incarcati (polarizati) diferit

Cnd se aplic curent sistemului sarcinile - rmn fixate pe suport norul de ioni din soluie se muta la electrozi foarte hidratai odat cu micarea norului ionic, solventul se mic de asemenea Micarea relativ a solventului de pe suportul fix => endosmoz Micarea apei ntr-o singur direcie Macromolecule se deplaseaz n direcia opus fluxului de ioni + hidratai => pot rmne imobile sau s fie atrase la polul opus
9

n acetat de celuloz i gel de agaroz Reducerea endo-osmozei prin: - Eliminarea / modificarea grupurilor incrcate de pe suport - Adugarea de zaharoz sau sorbitol => cretere a osmolalitatii
10

Electroforez Zonal Migraia moleculelor ncrcate Mediu de migrare depus pe un suport Medii poroase de exemplu: acetat de celuloza sau agaroz Pot fi uscate i reutilizate Acelai pH i domeniu de rezisten electrica Separare bazat pe mobilitate electroforetic Separ coloizi macromoleculari de exemplu: proteine n ser, urin, LCR, eritrocite, acizi nucleici
11

Ionoforez
Migrarea ionilor mici Sistem electrolitic discontinuu - Electrolit (L-ioni) - Electrolit (T-ioni) Aplicarea soluiei la suprafaa interfazei dintre L i T Aplicarea unui cmp electric fiecare tip de ion se aranjeaz ntre ionii L i T zone discrete Separarea anionilor, cationilor, acizi organici si aminici, peptide, nucleotide, nucleozide, proteine
12

3. TEHNICI ELECTROFORETICE 3a. Instrumente i reactivi Cutii tampon cu plci tampon => conine soluia tampon Electrozi de carbon sau platin => conectati la sursa de curent electric continuu Suport pentru electroforeza => cu fitil pentru contactul cu soluia tampon Capac => minimalizeaz evaporarea
13

3b. Surse de alimentare


Surs de alimentare: curent continuu ntre 2 electrozi Flux de curent => cldura produs Creterea vitezei de migraie => extindereaprobe separate Formarea de curenti de convectie => amestecarea probelor Instabilitate termic a probelor sensibile la cldur Evaporarea apei => concentrarea ionilor => crete vscozitatea soluiei tampon => scade rezistena Pentru a minimiza problemele: se utilizez surse de alimentare cu putere constant si mare
14

3c. Soluii Tampon Pentru a transporta curentul electric aplicat i a stabiliza valoarea pH-ului determin sarcina electric si gradul de ionizare electrodul la care s migreze Forta ionic a soluiilor tampon [ion] => norul ionic => micarea moleculelor - Grosimea norului ionic => viteza de migrare => claritatea zonelor electroforetice Soluii tampon barbital i acid triboric-EDTA
15

3d. Spoturile de proteine


Pentru a vizualiza / localiza fraciunile separate de proteine Colorani: intensitatea colorarii depinde de: Tipul proteinei Gradul de denaturare a proteinelor prin agenii de fixare
16

4. PROCEDURI GENERALE 4a. Separarea


Plasarea materialului de suport n camera PE Indeprtarea excesului de soluie tampon de pe materialul de suport Plasarea suportului n contact cu soluia tampon n camera electrodului Aplicarea probei pe suport Separarea componentelor prin tensiune constant sau curent constant pentru o durat de timp
17

ndeprtarea suportului, apoi uscarea sau aplicarea unui fixator tratarea cu un fixator de colorare splarea colorantului n exces uscarea (agaroz) sau adugarea unui agent de splare

18

4b. Detecie i cuantificare Rapid ca: -% din fiecare fraciune prezent sau - concentraia absolut Prin densitometrie: - Benzile electroforetice se trec printr-un sistem optic de masurare - Absorbana fiecrei fraciuni afisat pe o diagram
19

5. TIPURI DE ELECTROFOREZA a. Electroforez n gel de agaroz b. Electroforez n acetat de celuloz c. Electroforez n gel de poliacrilamid d. Concecntrare izoelectric e. Electroforez bidimensional
20

21

5a. Electroforez n gel de agaroz (AGE) Folosete agaroz ca mediu de migrare - Concentraie sczut => dimensiunea porilor mare - Concentraie mai mare=> dimensiunea porilor mic Proteine serice, variante de Hb, lactat de hidrogenaza, izoenzimele CK, fraciunile LP Agaroza pur => nu are grupuri ionizabile => nu are loc endo-osmoza

22

Avantaje: - Afinitate sczut pentru proteine - Prezint fraciunile clar dup uscare - Temperatura de topire sczut re-lichiefiere la 65oC Dezavantaje: - Slab elasticitate - Nu este potrivit pentru un sistem cu bare
23

5b. Electroforez n acetat de celuloz (CAE)


anhidrid acetic + celuloz => CA Are 80% spaiu aerian => se umple cu lichid atunci cnd este scufundat n tampon Pot fi fcute transparente pentru densitometrie Avantaje: - Viteza de separare - Posibilitatea de a stoca membrane transparente Dezavantaje: - Presoaking nainte de utilizare - Curare pentru efectuarea densitometriei
24

Metoda: - CA umed n tampon PE - Se incarc proba pn la aproximativ o treime din lungul benzi - CA se ntinde n benzi peste un pod - Podul se plaseaz n camera PE =>benzile se scufund direct n zona-tampon - Dup EP, colorare, decolorare, vizualizarea proteinelor Pentru diagnosticul bolilor Schimbare n profilul de proteine serice

25

5c. Electroforez n gel de poliacrilamid (PAGE)


Celula PE n form tubular Se toarn gel de separare cu pori mici Se adaug gel cu pori mari n partea de sus Soluie de monomer cu pori marei + proba deasupra celui de-al doilea gel Electroforeza Toi ionii proteinelor migreaza prin gelurile cu pori mari Se concentreaz n gelul de separare Se separ din cauza denaturrii unor proteine Dimensiunea medie a porilor n 7,7% din gelul de separarea PAGE este de aproximativ 5nm Permite proteinelor serice s migreze Impiedic migrarea proteinelor mari de exemplu: fibrinogen, 1-lipoproteine, 2-macroglobuline

26

Avantaje:

- Termostabil, transparent, puternic, chimic inert - Gama larga de dimensiuni ale porilor - Neacoperite => nu are loc endo-osmoza Dezavantaje: - Cancerigene
27

Denaturarea
Se fierbe o proba timp de 5 minute n soluia tampon ce conin b-mercaptoethanol & SDS b-mercaptoethanol: reducere puntile disulfitice (S-S) SDS: se leaga puternic de proteinele i le denatureaz Proteine denaturate -> se rup structurile n form de tij =>ghem sunt separate n funcie de dimensiunea lor

Utilizare: - Pentru a evalua puritatea proteinei - Pentru a determina MW proteinelor

28

Utilizarea unor condiii non-denaturare => nu SDS sau -mercaptoethanol => proteinele nu denatureaz Separarea proteinelor se bazeaz pe: - Mobilitile electroforetice diferite - Efectul de sitare al gelului Utilizare - Pentru a obine proteine native / enzime - Pentru a studia activitatea biologic

29

5d. Concentrarea izoelectric (isoelectrofocusing)


Pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine) Proteinele se deplaseaza n zona n care: pH-ul mediu = pI => sarcina = 0 pI este limitat ntr-un domeniul de pH ngust =>zone ascuite pentru proteine Metoda: - Folosirea gelurilor orizontale pe sticl / folii de plastic - S introduc amfoliii n gel => se creaz gradientul de pH
30

- Se aplic o diferen de potenial n gel - Anod => zona cu pH-ului cel mai mic - Catod => zona cu pH-ului cel mai mare - Proteinele migraeaz pn cnd se ajunge la pH = pI - Se spal cu soluie de fixare pentru eliminarea amfoliilor - Colorare, decolorare, vizualizare
31

5e. Electroforeza bidimensinal (2D) (ISO-Dalt) prima dimensiune utiliznd IEF EP ntr-un mediu cu pori mari amfoliii formeaz gradientul de pH a doua dimensiune utiliznd EP-dependent de greutatea molecular in poliacrilamid liniar sau gradient Metoda: O'Farrell: - Folosirea -mercaptoethanol (prima D) i SDS (a doua D) Detecteaz proteine folosind colorani Coomassie, radiografie, fluorografie Separ 1100 de culori (autoradiografie)
32

Princiipiile electroforezei capilare


Cum separarea diferitilor compusi farmaceutici reprezinta o problema de actualitate, s-au pus la punct diverse tehnici de a realiza acest lucru Una dintre cele mai eficiente tehnici de separare este electroforeza capilara(CE)

33

Electroforeza capilara bazele instrumentatiei


Electroforeza ce are loc in tuburi capilare ce contin un electrolit Fiecare tub capilar are un diametru interior de circa 25-100 m. Cand se aplica o tensiune solutiei, moleculele migreaza catre electrodul de sarcina opusa In functie de sarcina acestora, moleculele pot migra cu viteze diferite
In final are loc separarea componentilor
34

Se utilizeaza un fotoreceptor pentru a masura absorbanta moleculelor in timp ce acestea migreaza in solutie

Semnalul analitic este analizat de catre 35 un computer si reprezentat grafic

Migrarea diferitelor specii (ionizate sau neionizate) de analii sub influena fluxului electro-osmotic

36

37

Instrumente pentru realizarea electroforezei capilare

38

Curgerea electro-osmotica

O caracteristica importanta a CE este reprezentata de curgerea lichidului prin tuburile capilare. Acest fenomen poarta numele de electro-osmoza

39

Profilul de curgere al electro-osmozei


O alta caracteristica importanta a curgerii electroosmotice este profilul plan de curgere al acesteia, spre deosebire de cel parabolic, realizat de o pompa peristaltica Profilul acestei curgeri este plan datorita fortei uniform distribuite de-a lungul tubului capilar, ce pune in miscare particulele, ceea ce inseamna ca nu vom avea caderi de presiune, iar viteza de curgere va fi aceeasi pe toata lungimea tubului. Profilul plan al EOF(electro-osmosis flow) este important deoarece permite separari foarte eficiente.
40

41

Electroferograma
Datele furnizate de CE sunt prezentate sub forma unei electroforegrame aceasta fiind similara cu cromatograma. Electroforegrama reprezinta un grafic al timpului de migrare in functie de raspunsul detectorului. Raspunsul detectorului depinde de obicei de concentratie, cum ar fi aborbanta UV-vizibil sau fluorescenta.
42

Tub capilar

Echipament

De lungime variabile, in general intre 25-50 cm Diametrul mic al tubului si grosimea silicei joaca un rol important Folosind tuburi cu diametre mici si pereti grosi se previne aparitia incalzirii de tip Joule, datorate voltajului.

43

Detector
Absorbanta UV/Vizibil Fluorescenta Radiometric (pentru substante radioactive) Spectrometru de masa

44

Aplicatii
Analiza carbohidratilor Avantaje Metoda rapida Analiza anionilor Probe mici anorganici Metoda relativ ieftina Aparatura automatizata Identificarea de ADN Identificarea proteinelor Dezavantaje
Nu se pot identifica specii neutre Aparitia efectului Joule

45

1. CE se bazeaza pe principiile separarii electroforetice. 2. Viteza de migrare a speciilor este determinata de sarcina acestora dar si de marimea lor. 3. Particulele mici cu sarcina ridicata vor migra mai repede decat cele mari si cu sarcina scazuta. 4. Curgerea fluidului este cauzata de EOF. 5. Viteaza EOF poate fi ajustata prin modificarea pH-ului solutiei. 6. Profilul de curgere al EOF este plan, ceea ce reprezinta eficiente ridicate de separare/identificare. 7. Datele sunt reprezentate grafice sub forma unei electroforoegrame.
46

Separarea proteinelor plasmatice


Electroforeza
Amidon gel, agar gel, acetat celuloza, PAGE, EC

47

Optimizarea electroforezei
Separarile electroforetice optimizate trebuie sa fie echilibrate intre valorile vitezei si rezolutiei
Voltajul ridicat mareste viteza, dar temperatura cauzeaza evaporarea si poate denatura proteinele Rezistenta ionica ridicata mareste conductivitatea, dar imbunatateste efectele endo-osmotice
48

Albumin 1

Electroforeza proteinei serice


2

49

PRINCIPIUL CHIMIC
O proteina in solutie care are un pH inferior punctului sau izoelectric se va comporta ca o baza si va accepta protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata pozitiv. In mediu acid:

O proteina in solutie care are un PH superior punctului sau izoelectric se va comporta ca un acid si va ceda protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata negativ. In mediu bazic:

Prin electroforeza serului uman se obtin astfel sase fractii proteice: albumina, alfa1, alfa 2, beta 1 si 2 si gama globuline. Se realizeaza astfel o migrare reprezentata grafic 50 (electroforegrama).

Albumina
Este proteina preponderenta din plasma (aproximativ jumatate din totalul de proteine)
sintetizata in ficat t=15-19 zile Mentinerea echilibrului fluidelor Transportator Activitate antioxidanta Tampon

Functii principale

51

Pre-albumina
Tirotoxina proteina (o forma incipienta a albuminei), denumita de asemenea si transtiretina sau TBPA
De asemenea complexe cu retinolproteina (RBP)

Numai proteina care migreaza anodal la albumina Markerul sensibil al starii nutritionale este de numai 2 zile

52

1-Antitripsina
Este un inhibitor proteic care leaga si inactiveaza tripsina Deficienta este asociata cu:
Emfizem pulmonar Ciroza

SPE este numai un test de screening pentru deficienta de AAT.


53

Alte 1 proteine
1-acid glicoproteic (orosomucoid)
Functia biologica este necunoscuta

1-Fetoproteina (AFP)

Este proteina fetala principala, utilizata in detectia anomaliilor fetale (defecte ale tubului neural)

54

2-Macroglobulina
Cea mai mare non-imunoglobulina din plasma Inhibitor proteic Increased in nephrotic syndrome (size) Dimensiune crescut in sindromul nefrotic Deficienta genetica este complet 55 necunoscuta.

(2) Ceruloplasmina
Transportul proteinei cuprice Participa la reactiile redox in plasma Nivelurile Cu fluctueaza cu o varietate de stari fiziologice, dar masurarea se realizeaza pentru depistarea bolii Wilson
Cu din plasma este scazut datorita inhibarii (bio)sintezelor.
56

(2) Haptoglobina
Se leaga si se pastreaza numai hemoglobina nu si mioglobina.
Complexul are de asemenea activitate peroxidazica si poate fi implicata in raspunsul inflamatoriu

Bolile hemolitice pot diminua nivelurile Hp

57

() Transferina
Transport proteina ferica si de asemenea leaga cuprul Transferina este crescuta in anemie deficitara de fier, in sarcina si terapie cu estrogen Este crescuta in inflamatii, malignitate sau boli ale ficatului.
58

2-Microglobulina
Proteina mica (MW=11.8K) BMG este filtrata in glomerule, dar este reabsorbita in tubii renali. Nivelurile BMG urinara sunt o masura a sensibilitatii functionarii tubilor renal Nivel crescut in cedarea renala
59

() Complementul proteinelor
C3 si C4 migreaza in regiunea . Complementul proteinelor este scazut in deficientele genetice si crescut in inflamatii.

60

-Regiune
Include imunoglobuline (IgG, IgA, IgM) si proteina C-reactiva Singurul pic ascutit indica o paraproteina asociata cu o gammopatie monoclonala (mieloma multipla) CRP este cel mai sensibil indicator al fazei acute de reactie
Inflamatie, trauma, infectie, etc.
61

Reactivii Fazei Acute


10 X upper limit of normal C-proteina reactiva

5 1-Antitripsina 1 1 2 3 Ziua 4 C3 5

Alti ACPs includ: 1-acid glicoproteina, haptoglobina si ceruloplasmina

62

SPE Normal

Albumin 1

63

Model de raspuns imediat


Scaderea in albumina Cresterea in APR haptoglobinei

Albumin 1

64

Model de raspuns intarziat


A scazut albumina A crescut haptoglobina Au crescut gamma globulinele

Albumin 1

65

Hipogammaglobulinemia
Au scazut gamma globulinele

Albumin 1

66

Sindromul nefrotic
A scazut albumina A crescut 2-macroglobulina Au scazut gamma globulinele

Albumin 1

67

Ciroza hepatica
A scazut albumina (sinteza) Au crescut gamma globulinele (Gammopatie policlonala) - bridging

Albumin 1

68

Gammopatie monoclonala
A scazut albumina Varful ascutit in regiunea gamma

Albumin 1

69

A scazut albumina Au scazut gamma globulinele A crescut 2-macroglobulina

Enteropatia pierderii de proteina

Albumin 1

70