Roteiro de aula prtica de anlises fsico- qumicas de leite fluido Msc.

Janaina Costa Feistel

MTODOS QUALITATIVOS LCOOL/ALIZAROL CLORETOS FOSFATASE ALCALINA PEROXIDASE NEUTRALIZANTES DA ACIDEZ - Mtodo A: cido Roslico PERXIDO DE HIDROGNIO

LCOOL/ALIZAROL 1. Princpio Ocorrncia de coagulao por efeito da elevada acidez ou do desequilbrio salino, quando se promove desestabilizao das micelas pelo lcool. O alizarol atua como indicador de pH, auxiliando a diferenciao entre o desequilbrio salino e a acidez excessiva. 2. Material 2.1. Vidraria, utenslios e outros: Tubo de ensaio. 2.2. Reagentes: Soluo de 1,2 dihidroxiantraquinona (C14H8O4) a 0,2 % (m/v) em lcool etlico (C2H5OH) neutralizado de concentrao varivel entre 68 a 80 % (depende do tratamento trmico a ser aplicado ao leite e a vida de prateleira que se pretende obter do produto a ser elaborado). Estas concentraes de alizarina ou do lcool etlico neutralizado, podem variar de acordo com especificaes da legislao sanitria ou o interesse da indstria. Neutralizao do lcool etlico (C2H5OH): transferir o volume de lcool etlico desejado para um bquer. Adicionar 5 gotas de soluo alcolica de fenolftalena (C20H14O4) (m/v) a 1 %. Agitar lentamente com um basto de vidro. No ocorrendo alterao de cor, gotejar soluo de hidrxido de sdio 1 N ou 0,1 N at leve colorao rosada. Agitar lentamente com o basto. Desaparecendo a cor, continuar com a adio de soluo de hidrxido de sdio 0,1 N at leve colorao rsea persistente. 3. Procedimento Misturar partes iguais da soluo de alizarol e de leite fludo em um tubo de ensaio, agitar e observar a colorao e o aspecto (formao de grumos, flocos ou cogulos grandes). 4. Resultado

Leite com resposta normal (boa resistncia): colorao vermelho tijolo. Aspecto das paredes do tubo de ensaio sem grumos ou com uma ligeira precipitao, com poucos grumos muito finos. Leite cido: tendncia a um esmaecimento da cor, passando para uma tonalidade entre o marron claro e amarelo. Na acidez elevada ou no colostro, a colorao amarela, com coagulao forte. Leite com reao alcalina (mamites, presena de neutralizantes): colorao lils a violeta.

CLORETOS 1. Princpio Fundamenta-se na reao do nitrato de prata com os cloretos em presena de cromato de potssio como indicador. 2. Material 2.1. Vidraria, utenslios e outros: Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL; Tubo de ensaio de 20 x 200 mm. 2.2. Reagentes: Soluo de cromato de potssio (K2CrO4) a 5 % (m/v); Soluo de nitrato de prata (AgNO3) 0,1 N. 3. Procedimento Em tubo de ensaio colocar 10 mL de leite, adicionar 0,5 mL de soluo de cromato de potssio a 5 % e 4,5 mL de soluo de nitrato de prata 0,1 N e agitar. 4. Resultado Positivo: colorao amarela. Observao: O resultado positivo de colorao amarela indica a presena de cloretos em quantidades superiores faixa normal (0,08 a 0,1 %).

FOSFATASE ALCALINA 1. Princpio A verificao da atividade enzimtica feita mediante a adio amostra do substrato especfico da enzima em condies ideais para sua atuao. A presena do indicador permite identificar a atividade enzimtica pela reao colorimtrica com os produtos de degradao. 2. Material 2.1. Equipamento: Banho-maria. 2.2. Vidraria, utenslios e outros: Pipeta graduada de 5 mL; Rolha de borracha; Tubo de ensaio. 2.3. Reagentes:

Catalisador: dissolver 0,2 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5 H2O) p.a. em 100 mL de gua. Soluo reagente: pesar 0,150 g de 2,6- icloroquinona cloroimida (C6H2Cl3NO) p.a., dissolver em 50 mL de lcool etlico p.a., transferir para frasco mbar e estocar em geladeira. A colorao da soluo recentemente preparada amarelo-citrina, passando a amarelo-ouro e tendendo a escurecer, adquirindo tons amarronzados com o envelhecimento. Recomenda-se usar a soluo por um perodo mximo de duas semanas, desde que conservada sob refrigerao e ao abrigo da luz. Substrato: pesar 0,5 g de fenilfosfato dissdico dihidratado (C6H5Na2O4P.2 H2O) p.a. em um bquer, dissolver com o tampo diludo, transferir para balo volumtrico de 500 mL e completar o volume com o tampo diludo. Recomenda-se usar esta soluo durante um perodo mximo de duas semanas. Tampo carbonato: pesar 46,89 g de carbonato de sdio anidro (Na2CO3) p.a. e 37,17 g de bicarbonato de sdio (NaHCO3) p.a., dissolver e levar ao volume de 1000 mL (soluo estoque). Retirar uma alquota de 25 mL da soluo estoque, transferir para balo volumtrico de 500 mL e completar o volume. O pH deste tampo diludo dever situarse entre 9,5 e 9,7. 3. Procedimento Transferir 0,5 mL da amostra a analisar para um tubo de ensaio, adicionar 5 mL do substrato, tampar com rolha de borracha, agitar ligeiramente e levar ao banho-maria mantido a 39-41C durante 20 minutos. Esfriar o tubo de ensaio em gua corrente, adicionar 6 gotas de soluo reagente e 2 gotas do catalisador. Levar o tubo novamente ao banho-maria a 39 41C por 5 minutos. Repetir o mesmo procedimento acima descrito, usando, em lugar da amostra e em diferentes tubos, 0,5 mL de leite cru e 0,5 mL de leite fervido. 4. Resultado Positivo: colorao azul intensa leite cru. Negativo: colorao cinza leite pasteurizado. Observao: A tonalidade do azul vai ficando tanto mais intensa, quanto maior for a deficincia de pasteurizao. Os tubos de ensaio e as rolhas de borracha devem encontrar-se perfeitamente limpos e sem qualquer vestgio de detergentes, em decorrncia do processo de lavagem do material. As rolhas de borracha, em particular, devero ser fervidas durante 5 minutos depois de lavadas, visando eliminar quaisquer resduos de fenol eventualmente presente em detergente ou outro material de limpeza. As provas positivas devem ser repetidas cuidadosamente, principalmente se forem usados reagentes com algum tempo de preparo. A amostra dever sofrer cuidadosa agitao antes de ser analisada, visando distribuir a gordura ou a camada de creme pelo lquido. A retirada de uma alquota da amostra a partir da sua camada superior poder levar a resultado positivo ou suspeito, ainda que o leite tenha sido adequadamente pasteurizado. A fosfatase alcalina encontrasse adsorvida aos glbulos de gordura. A fosfatase alcalina poder sofrer reativao aps algum tempo de pasteurizao do leite. No comum encontrar esse tipo de interferncia, mas o analista dever ter em conta a vida de prateleira do produto ao ser analisado,

principalmente se o teste for conduzido depois de 24 horas de o leite ter sido processado.

PEROXIDSE 1. Princpio A peroxidase, ao hidrolisar o perxido de hidrognio, libera oxignio, o qual transformar o guaiacol da sua leucobase para a forma corada. 2. Material 2.1. Equipamento: Banho-maria. 2.2. Vidraria, utenslios e outros: Pipetas de 2 e 10 mL; Tubo de ensaio. 2.3. Reagentes: Soluo de perxido de hidrognio (H2O2) a 3 % (v/v); Soluo hidroalcolica de guaiacol (C7H8O2) a 1 % (v/v): em bquer de 50 mL, colocar 1 mL de guaiacol, adicionar 10 mL de lcool etlico p.a. e agitar para dissolver. Transferir para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua. Guardar em frasco mbar. 3. Procedimento Transferir 10 mL da amostra para um tubo de ensaio, aquecer em banho-maria a 45C por 5 minutos, para ativao da enzima. Acrescentar 2 mL da soluo hidroalcolica de guaiacol a 1 % ao tubo de ensaio, pelas suas paredes, seguindo-se a adio de 3 gotas da soluo de perxido de hidrognio a 3 %. 4. Resultado Positivo: desenvolvimento de um alo de colorao salmo. Observao: Aguardar no mnimo 5 minutos

NEUTRALIZANTES DA ACIDEZ - Mtodo A: cido Roslico 1. Princpio A presena de alcalinizantes na amostra revelada pela ao do cido roslico usado como indicador. 2. Material 2.1. Vidraria, utenslios e outros: Pipetas graduadas de 5 e 10 mL; Tubo de ensaio. 2.3. Reagentes: lcool etlico (C6H5OH) p.a. neutralizado; Soluo de cido roslico (C19H14O3) a 2 % (m/v) em lcool etlico neutralizado

3. Procedimento Em tubo de ensaio, colocar 5 mL de leite e adicionar 10 mL de lcool etlico neutralizado, agitar e adicionar 2 gotas de soluo de cido roslico a 2 %. Fazer um branco com lcool etlico e soluo de cido roslico a 2 % e comparar as cores. 4. Resultado Positivo: colorao vermelho-carmim.

PERXIDO DE HIDROGNIO - Mtodo B: Guaiacol 1. Princpio A peroxidase do leite age sobre o perxido de hidrognio, liberando oxignio, transformando o guaiacol da forma leuco para sua forma corada. 2. Material 2.1. Equipamento: Banho-maria. 2.2. Vidraria, utenslios e outros: Pipetas graduadas de 5 e 10 mL; Tubo de ensaio. 2.3. Reagente: Soluo hidroalcolica de guaiacol (C7H8O2) a 1 % (v/v): em bquer de 50 mL colocar 1 mL de guaiacol, adicionar 10 mL de lcool etlico p.a., e agitar para dissolver. Transferir para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua. Guardar em frasco mbar. 3. Procedimento Transferir 10 mL da amostra para tubo de ensaio e aquecer em banhomaria at 35C, adicionar 2 mL da soluo hidroalcolica de guaiacol a 1 % e 2 mL de leite cru. Agitar. 4. Resultado Positivo: desenvolvimento de colorao salmo.

MTODOS QUANTITATIVOS ACIDEZ TITULVEL DE LEITE FLUDO - Mtodo B DENSIDADE A 15C DEPRESSO DO PONTO DE CONGELAMENTO LIPDIOS - Mtodo C: Butiromtrico para leite fludo

ACIDEZ TITULVEL DE LEITE FLUDO - Mtodo B 1. Princpio Consiste na titulao de determinado volume de leite por uma soluo alcalina de concentrao conhecida, utilizando como indicador a fenolftalena. 2. Material 2.1. Vidraria, utenslios e outros: Bquer de 100 mL; Bureta de 10 ou 25 mL ou acidmetro de Dornic; Pipeta volumtrica de 10 mL. 2.2. Reagentes: Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,1 N ou soluo Dornic (0,11 N ou N/9); Soluo alcolica de fenolftalena (C20H14O4) a 1 % (m/v); Padro de colorao para acidez titulvel: dissolver 0,12 g de rosanilina (fucsina C.I. 42510) (C20H20ClN3) p.a. em 50 mL de lcool etlico (C2H5OH) p.a. contendo 0,5 mL de cido actico (CH3COOH) p.a., completar o volume para 100 mL com lcool etlico p.a. (soluo estoque). Diluir 1 mL dessa soluo para 500 mL com uma mistura de lcool etlico p.a. e gua em iguais propores por volume (soluo de trabalho). Ambas as solues devem ser estocadas em local escuro, em garrafas mbar tampadas com rolhas de borracha. Adicionar 1 mL da soluo de trabalho a 10 mL da amostra a ser titulada, agitar bem e adotar a colorao obtida como referncia para o trmino da titulao. 3. Procedimento Transferir 10 mL da amostra para o bquer e adicionar 4 - 5 gotas da soluo de fenolftalena a 1 % e titular com soluo de hidrxido de sdio 0,1 N ou com a soluo Dornic, at aparecimento de colorao rsea persistente por aproximadamente 30 segundos. 4. Clculos 4.1. Usando soluo de hidrxido de sdio 0,1 N: Acidez (Dornic) = V x f x 0,9 x 10 Onde: V = volume da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N gasto na titulao, em mL; f = fator de correo da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N; 0,9 = fator de converso do cido ltico; 10 = transformao de cido ltico para grau Dornic. 4.2. Usando Soluo Dornic: 1 mL de NaOH 0,1 N = 0,0090 g de cido ltico Acidez (Dornic) = V x f x 10 Onde: V = volume da soluo de hidrxido de sdio 0,1 N gasto na titulao, em mL; f = fator de correo da soluo de hidrxido de sdio 0,11 N ou N/9. 10 = transformao de cido ltico para grau Dornic

DENSIDADE A 15C 1. Princpio A imerso de um densmetro de massa constante no lquido provocar deslocamento de uma quantidade deste, que ser, em massa, igual do densmetro utilizado e, em volume, proporcional densidade da amostra. Esse deslocamento far o lquido alcanar um valor na escala graduada em graus densitomtricos. 2. Material 2.1. Vidrarias, utenslios e outros: Proveta de 500 mL ou de 1000 mL; Papel toalha absorvente; Termolactodensmetro . 3. Procedimento Transferir cerca de 500 mL (ou cerca de 1000 mL) de leite para uma proveta de capacidade correspondente, evitando incorporao de ar e formao de espuma. Introduzir o termolactodensmetro perfeitamente limpo e seco na amostra, deixar flutuar sem que encoste na parede da proveta. Observar a densidade aproximada, erguer cuidadosamente o termolactodensmetro e enxugar sua haste com papel absorvente, retornando o aparelho posio anteriormente observada. Deixar em repouso por 1 a 2 minutos e fazer a leitura da densidade na cspide do menisco. Observar a temperatura sempre que possvel, fazer a leitura da densidade a 15C. Pode-se fazer a correo para 15C acrescentando leitura 0,0002 para cada grau acima de 15C ou subtraindo 0,0002 para cada grau abaixo. De qualquer forma no devero ser feitas leituras de densidade em amostras com temperatura inferior a 10C ou superior a 20C. Observao: Calibrao do termolactodensmetro: dessecar cloreto de sdio (NaCl) p.a. em forno mufla a 300C por 2 horas ou em estufa a 105C por 24 horas. Pesar rpida e exatamente 44 g de cloreto de sdio. Dissolver e transferir para balo volumtrico de 1000 mL, completando o volume com gua destilada. Esta soluo dever apresentar a densidade de 1,030 g/mL a 20C. Introduzir o termolactodensmetro na soluo a 20C e calcular a correo. C=DL Onde: C = fator de correo; D = densidade da soluo preparada (1,030) L = leitura no termolactodensmetro. O fator de correo dever ser adicionado ao valor da leitura da densidade da amostra de leite previamente a correo da densidade para 15C.

DEPRESSO DO PONTO DE CONGELAMENTO 1. Princpio O super congelamento de uma amostra de leite a uma temperatura apropriada e aplicao de uma agitao mecnica ocasiona um rpido aumento da temperatura at um patamar o qual corresponde ao ponto de congelamento da amostra. 2. Material 2.1. Equipamento: Crioscpio eletrnico. 2.2. Vidraria, utenslios e outros: Pipeta graduada de 5 mL; Tubo de vidro. 2.3. Reagentes: Solues de cloreto de sdio (NaCl) a 0,6859 % (m/v) (-0,422 H) ou (0,408C) e a 1,0155 %(m/v) (-0,621 H) ou (-0,600C): secar o cloreto de sdio p.a em forno mufla a 300 C por 5 horas ou em estufa a 130 C por 24 horas, esfriar em dessecador e pesar, exata e rapidamente 6,859 g e 10,155 g do sal. Dissolver e transferir para bales de 1000 mL, completando o volume com gua fervida e resfriada a 20 C. Estocar as solues em frasco plstico rgido, com tampa interna de presso e externa rosquevel. Conservar em geladeira. 3. Procedimento Seguir atentamente as instrues do fabricante do aparelho, especialmente no que se referir ao banho de refrigerao, o agitador e o procedimento de calibrao com as solues padres -0,422 H e -0,621 H ou as recomendadas pelo fabricante. Realizar calibrao com os padres na mesma temperatura das amostras. De modo geral o volume recomendado de soluo de calibrao e de amostra de 2,5 mL para cada determinao. Efetuar trs determinaes para cada amostra em 3 tubos distintos. Os resultados dos testes devem ser prximos, com uma tolerncia de mais ou menos 2 miligraus ( 0,002 H). Aps cada leitura, limpar cuidadosamente o sensor e o agitador com gua e secar delicadamente com papel absorvente fino. 4. Clculos Uma vez obtida as trs leituras, calcular a mdia aritmtica. Considerar apenas as leituras dentro dos limites de tolerncia de mais ou menos 2 miligraus. Equivalncia entre as escalas Hortvet (H) e Celsius(C) T(C) = 0,9656 x T(H) T(H) = 1,0356 x T(C) Observao: Uma soluo de cloreto de sdio (NaCl) 0,8646 % (-0,530 H ou 0,512 C) servir para verificar a calibrao do aparelho. Leite normal: -0,530H (-0,512C) a -0,550H (-0531C). LIPDIOS Mtodo C: Butiromtrico para leite fluido

1. Princpio Baseia-se no ataque seletivo da matria orgnica por meio de cido sulfrico, com exceo da gordura que ser separada por centrifugao, auxiliada pelo lcool amlico, que modifica a tenso superficial. 2. Material 2.1. Equipamentos: Banho-maria; Centrfuga de Gerber. 2.2. Vidraria, utenslios e outros: Butirmetro de Gerber para leite com rolhas; Medidores automticos de 1 e 10 mL; Pipeta volumtrica de 11 mL. 2.3. Reagentes: Soluo de cido sulfrico (H2SO4) densidade de 1,820 a 1,825 a 20C: adicionar 925 mL de cido sulfrico p.a. com densidade de 1,840 sobre 125 mL de gua, lenta e cuidadosamente, em banho de gelo. Esfriar at temperatura de 20C e conferir a densidade com o densmetro. lcool isoamlico (C5H12O) densidade = 0,81 a 20C. 3. Procedimento Adicionar a um butirmetro, 10 mL da soluo de cido sulfrico. Transferir 11 mL de amostra homogeneizada, para o butirmetro lentamente e pela parede deste, para evitar sua mistura com o cido. Acrescentar 1 mL de lcool isoamlico. Limpar as bordas do butirmetro com papel de filtro e fechar com rolha apropriada. Envolver o butirmetro em um pano, colocando o bulbo maior na palma da mo de forma tal que o dedo polegar exera presso sobre a tampa, impedindo sua projeo; agitar o butirmetro, de modo a promover a mistura completa dos lquidos no interior do aparelho, tomando precaues para evitar acidentes e mantendo o polegar sobre a tampa. Centrifugar durante 5 minutos de 1000 a 1200 rpm e transferir para banho-maria a 65C por 5 minutos; repetir as operaes de centrifugao e de incubao. 4. Clculos Ler a porcentagem de gordura diretamente na escala do aparelho e na base do menisco formado pela camada de gordura, imediatamente aps retirar o aparelho do banho-maria. Se a coluna no estiver bem delineada, misturar novamente o contedo do aparelho e repetir os procedimentos de centrifugao e aquecimento.