Citologa bacteriana

Son clulas procariotas que se distinguen de las eucariotas por su tamao inferior, ausencia de membrana nuclear y por el mecanismo de divisin. Morfolgicamente no hay mucha disparidad entre las distintas bacterias. Presentan una forma cilndrica o esfrica de ,!"# micras. Estructura de la clula bacteriana. $sta formada por las envueltas celulares y el citoplasma. %. $nvueltas celulares. &onstituida por' %. a $nvuelta e(terior' ) veces no e(iste. $s viscosa y bastante difusa. Si est* perfectamente delimitada constituye la c*psula. $n ciertas cepas esta c*psula, corrientemente gruesa y de naturale+a polisac*rida, sirve como defensa frente a cierto tipo de agresiones. )lgunas bacterias llevan cirios o flagelos que son rganos locomotoras. $st*n fi,ados a los polos o sobre toda la clula. %.b Pared -uncin' $s el esqueleto rgido de la clula d*ndole su forma caracterstica. $s muy slida y resiste la presin osmtica intracelular. Sin la pared, la bacteria en un medio hipotnico, estallara. .tra funcin es la de soportar antgenos especficos y receptores para los fagos. /os nutrientes y agua la atraviesan libremente. $structura' 0ara m*s que la membrana citoplasm*tica y permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias' /as 1ram positiva y las 1ram negativa. 1ram positivas. $l 2nico constituyente es el pptidoglucano. ) su superficie est*n unidos los *cidos teicoicos a. Pptidoglucano' $sta formada por cadenas lineales y paralelas de polisac*ridos formados por residuos alternativos de *cido 3"acetil mur*mico43)M5 y 3.acetil glucosamina43)15 unidos mediante enlaces 64%!5. $l numero de unidades de 3)1 y 3)M que forman estas cadenas oscilan entre % y % )l 3)M se une un tetrapptido formando la unidad mucopeptdica. /os amino*cidos de este tetrapptido varan seg2n la especie bacteriana 7n pentapptido formado por 8 residuos de glicina une la cadena polisac*rida a travs del tetrapptido. $l tercer amino*cido esta unido por la pentaglicina al cuarto amino*cido de la unidad mucopeptdica siguiente b. 9cidos teicoicos' Son polmetros lineales de glicerol, manitol o ribitol fosfato que se fi,an a la superficie del pptidoglucano. Pueden alcan+ar hasta el 8 : del peso de la pared y representa el % : del peso seco de la bacteria. Se unen a nivel de la unidad 3)M"pptido Son el soporte de la especificidad antignica y son los sitios receptores de los fagos Participara en la actividad de en+imas de sntesis y degradacin de la pared al crear condiciones favorables a su actividad

3)1

3)1

3)1

a"a"a"a"3)M a"a"a"a"3)M a"a"a"a"3)M 1"1"1"1"1 1"1"1"1"1 3)1 3)1 3)1

1 ; 1licina a ; )mino*cido a"a"a"a"3)M ; 7nidad mucopeptdica 3.<)' -altan enlaces pues no se como ponerlos

1ram negativas' $n este caso es menor el espesor del pptidoglucano y adem*s est* recubierto por la membrana e(terna /a membrana e(terna es de naturale+a lipdica. /as molculas bases son fosfolpidos, lipoprotenas y lipopolisac*ridos. <iene estructura de doble capa. $l lipopolisac*rido esta formando parte de la ho,a interna pero solo su regin lipdica. 7nido a este lpido esta una parte central oligosac*rida basal y unida a sta una cadena especfica polisac*rida hacia el e(terior de la membrana. $s el responsable de la especificidad antignica y ,uega un papel en la defensa frente a fagos. /a lipoprotena une esta doble capa con el pptidoglucano subyacente. /a membrana e(terior tiene asimismo canales proteicos denominados porinas los cuales permiten un r*pido intercambio de molculas %.c $spacio peripl*smico. =gual que en caso de las levaduras %.d Membrana citoplasm*tica Su estructura es igual a la de las levaduras -unciones' )l contrario que la pared la membrana controla el intercambio de sustancias. $sta permeabilidad selectiva permite el mantenimiento de un medio intracelular constante. >egula principalmente el p? interno. $s el #

asiento de la biosntesis de molculas de la pared. $sta implicado en las reacciones del metabolismo energtico. /as en+imas respiratorias necesarias para la fosforilacin o(idativa est*n asociadas a la membrana que ,uega de hecho un papel importante en el metabolismo energtico. #. &itoplasma. &ontiene en+imas, ribosomas, sustancias de reserva en forma de granulaciones de polmeros org*nicos y minerales y material gentico $l material gentico se compone de' a. &romosoma' <iene un 2nico cromosoma siendo una molcula 2nica de )@3 situada en la parte central pero parece ligada a muchos puntos de la membrana plasm*tica principalmente a nivel del mesosoma. b. Pl*smidos' $s un material gentico e(tracromosmico siendo molculas circulares de )@3. 3o son vitales pero cumplen las siguientes funciones en el caso de bacterias l*cticas' )similacin de ciertas sustancias. Produccin de polisac*ridos, bacteriocinas y permeasas. >esistencia antibiticos, fagos y metales pesados. @egradacin de compuestos. Se replican de un modo independiente al cromosoma. Pueden perderse en las sucesivas generaciones pero corrientemente para ciertos pl*smidos las bacterias tienen muchas copias. Sirven como vectores para la manipulacin gentica. Multiplicacin de las bacterias. /as bacterias se multiplican por escisin. $sto implica la divisin del material nuclear y por otra parte un con,unto de sntesis para la construccin de nuevas envueltas celulares y del citoplasma. /a replicacin del )@3 se hace en un punto de enganche al mesosoma. /a separacin de los cromosomas hi,os tiene lugar en el momento de la divisin del mesosoma. Por otro lado se forma, por sntesis de la membrana plasm*tica un septum, el cual poco a poco va a partir a la clula madre y delimitar el contorno de la clula hi,a. $l con,unto de estos mecanismos provoca la divisin de la clula y la separacin de los cromosomas. Sin embargo son independientes. Seg2n las condiciones de crecimiento una clula puede contener muchos n2cleos en el caso de que la separacin de la clula sea m*s lenta que la de los cromosomas

BACTERIAS LCTICAS
$n el vino e(isten tres gneros de bacterias l*cticas 1. LACTOBACILLUS /as especies vnicas son' Plantarum, Brevis, &ellobiosus4equivale a -ermentum5, ?ilgardii, Buchneri, <richodes 4equivale a -ructivorans5, Mesenteroides, &asei, CunDee, 3agelii -orma' Son bacilos pero su forma vara. Pueden ser largos, rectos, media luna, curvados. <ambin pueden ser bacilos cortos y se puede confundir con .enococcus. ) veces me+cla de largos y cortos como por e,emplo /.brevis y /.fermentum /a longitud del bacilo y grado de curvatura depende de la edad del cultivo, la composicin del medio 4por e,emplo disponibilidad de *cido oleico y sus steres5 y de la tensin de o(geno. Sin embargo las principales diferencias morfolgicas entre las especies permanecen claramente reconocibles. /a formacin de cadenas es algo com2n. /a tendencia a formar cadenas vara entre especies e incluso entre cepas. @epende de la fase de crecimiento y del p?. &olonias y crecimiento $n agar las colonias son generalmente pequeas hasta 8 mm de di*metro, conve(as, suaves aunque a veces *speras, relucientes, opacas, contornos netos o discretamente irregulares, blanquecinas, no pigmentadas pero en raros casos son amarillentas o ro,i+as. $n medio lquido el crecimiento ocurre en toda la masa de lquido pero enseguida cuando cesa el crecimiento sedimenta. $l sedimento es suave y homogneo raramente granular o viscoso. 3o forman nunca velo. 1ram positivas. Enicamente clulas muertas pueden dar resultados variables. Motilidad. 3o es com2n. Si se presenta es por flagelacin peritrtica. . $sto ocurre en pocas especies y depende mucho de la composicin del medio y de la edad del cultivo, y a veces se observa slo durante el aislamiento pues a menudo pierde los flagelos despus de varias repicaciones en un medio artificial. &atalasa negativa /. plantarum y especialmente ba,o limitacin de glucosa puede tener una pseudocatalasa Microaerfilas. $l crecimiento sobre agar es estimulado por anaerobiosis o reducida presin de o(igeno y 8"% : de di(ido de carbono aunque la mayora es claramente aerotolerante. -actores' <emperatura. $l rango oscila entre # "8AF& y la temperatura ptima vara entre A "! G&. )lgunos crecen por deba,o de %8G & y otros, como por e,emplo /.plantarum y /.saDe, crecen, aunque lentamente, incluso a temperaturas pr(imas al punto de congelacin. /os bacilos termfilos pueden tener un lmite superior de 88G& y no crecen por deba,o de %8G& )cide+' $l p? optimo 8,8 H I,#. ) p? entre A,I y ! cesa el crecimiento dependiendo de cepa y especie >equerimientos nutritivos'

Son e(tremadamente e(igentes los lactobacilos. >equieren carbohidratos, nucletidos, amino*cidos, vitaminas, sales, *cidos grasos y steres de *cidos grasos. 3o asimilan al amonio /os requerimientos son generalmente caractersticos de cada especie y a menudo para cada cepa. $stos requerimientos son cumplidos con medios conteniendo carbohidratos, peptona, e(tracto de carne, e(tracto de levadura. Suplementos con manganeso, <Jeen K y +umo de tomate son estimulantes e incluso esenciales para la mayora las especies. )lgunos requieren especficos factores de crecimiento como por e,emplo *cido melavonico en caso de /. saDe. Metabolismo &lasificacin seg2n metabolismo de a+ucares 1rupo = ?omofermentativas estrictas. Son las antiguas <hermobacterias seg2n la clasificacin de .rla"Lensen. 3o e(isten en el vino /a glucosa es fermentada casi e(clusivamente a l*ctico por la va $mbden" Meyerhof. /as pentosas no son fermentadas as como tampoco el glucnico &recen a !8F& pero no a %8F& /as especies pertenecientes a este grupo serian' %. Producen @4"5 l*ctico' /.delbruecDii /.leichmanii /.,ensenii /.lactis /.bulgaricus #. Producen @/"l*ctico' /.helveticus /.acidophilus A. Producen principalmente /4M5"l*ctico' /.salivarus 1rupo == ?eterofermentativas facultativas. )ntiguamente llamadas Streptobacterias. Son homofermentativas para las he(osas pero ba,o ciertas condiciones como limitacin de glucosa y para ciertas especies pueden rendir l*ctico, actico, etanol y frmico Son heterofermentativas para las pentosas rindiendo l*ctico y actico &recen a %8F& siendo variable su crecimiento a !8F& Presentan aldolasa actividad =nducible I fosfogluconato deshidrogenasa <ienen glucosa I fosfato deshidrogenasa $(isten varias especies dentro de este grupo %. Producen principalmente /4M5"l*ctico y fermentan a la ribosa /.casei subespecies rhamnosus /.casei subespecies tolerans /.(ylosum #. Producen @/"l*ctico y fermentan a la ribosa /.casei subespecie pseudoplantarum /.plantarum /.curvatus

A. Producen @/"l*ctico y la fermentacin de la ribosa variable /.coryniformis subespecie coryniformis !. Producen@4"5"l*ctico y no fermentan a la ribosa /.coryniformis subespecie torquens /.homohiochii 1rupo === ?eterofermentativas obligadas. )ntiguamente llamadas Betabacterium /as he(osas son fermentadas va he(osa monofosfato a @/"l*ctico, acticoNetanol y &.# /as pentosas fermentadas a actico y l*ctico )ldolasa no demostrable )ctividad glucosa I fosfato deshidrogenasa =gual o menor actividad I fosfofluconato deshidrogenasa $species' /.brevis /.hilgardii /.Buchneri /.fermentum /.fructivorans4<richodes5

ESCRI!CIO" E LAS ES!ECIES #S I#!ORTA"TES

1. !lantaru$% Bacilos cortos y cilindrico con los e(tremos redondeados, aislados, en pares o cadenas cortas. $n vino o en otros medios restrictivos las clulas pueden alargarse mucho $n agar las colonias tiene un di*metro de A mm, levantadas, redondas, suaves, compactas, blancas aunque ocasionalmente amarillo claro u oscuro $n medio lquido presentan una fuerte y uniforme turbide+ 3o crecen a !8F& )lgunas reducen al nitrato cuando la concentracin de glucosa es limitada y ph superior a I .casionalmente y especialmente ba,o condiciones limitantes de glucosa, presentan una pseudocatalasa ?eterofermentativas facultativas. /a glucosa fermentada a l*ctico y las pentosas son fermentadas a actico y l*ctico <emperatura ptima' A "A8F& /a mayora de las cepas no soportan m*s del I: de alcohol 3o producen amonio a partir de arginina $l crecimiento a %8F& es positivo y variable a !8F& aunque generalmente no crecen a esa temperatura Produccin de *cido a partir de amigdalina, celobiosa, esculina, fructosa, galactosa, glucosa, gluconato, lactosa, maltosa, manosa, melibiosa, rafinosa,

ribosa, sorbitol, sacarosa, trehalosa, mientras que es variable para la (ilosa, rhamnosa y arabinosa <ipo de *cido l*ctico' @/ -ructosa %,I difosfato aldolasa presente &. Casei% Bacilos cortos o largos, bordes cuadrados. <endencia a formar cadenas &olonias suaves en forma de lente o diamante $n medio liquido fuerte y uniforme turbide+ /a fructosa %,I difosfato aldolasa presente $(isten cuatro subespecies a. &asei. Produce /"/actico b. Pseudoplantarum. Produce @/"/actico c. >hamnosus. $s el 2nico lactobacilo homofermentativo que crece bien a %8F& y !8F&. Produce /"/*ctico. Merecera ser una especie distinta !. <olerans. -ermenta poco carbohidratos y aguantan O#F& ! segundos -ermentacin &asei )migdalina M )rabinosa " &elobiosa M $sculina M -ructosa M 1alactosa M 1lucosa M 1luconato M /actosa d 4M5 Maltosa M Manitol M Manosa M Mele+itosa M >afinosa " >hamnosa " >ibosa M Sorbitol M Sacarosa M <rehalosa M Pilosa " Pseudoplantarum M " M M M M M M M M M M M " " M M M M " >hamnosus M " M M M M M M M M M M M " M M M " M " <olerans " " " " M M M " M " " " " " " " " " " "

3inguna subespecie forma amonio a partir de arginina '. Bre(is% 1eneralmente cortos y rectos, bordes redondeados. )islados o en cortas cadenas

/as colonias son rugosas, aplastadas, pueden ser casi transl2cidas y generalmente no pigmentadas, en caso contrario el color va del naran,a al ro,o $s difcil separar a esta especie de buchnerii, hilgardii, Defir o collinoides en base a la fermentacin de carbohidratos. Producen @/"/*ctico /a temperatura ptima es de A F& y crecen a %8F& pero no a !8F&. hay algunas cepas que crecen a !8F& y pueden ser confundidas con /.fermentun, particularmente aquellas que fermentan a la arabinosa yNo (ilosa /a diferencia es que estas cepas crecen a %8F& y la /.fermentun no -ermentacin. Son heterofermentativas 1lucosa' $s metaboli+ada 2nicamente aerbicamente. -ructosa' Metaboli+ada anaerbicamente a *cido y gas >ibosa' Metaboli+ada a actico y l*ctico sin desprendimiento de &.# Pir2vico. )naerbicamente rinde l*ctico, actico y &.#. )erbicamente rinde lentamente actico y &.# -ermenta a arabinosa, gluconato, maltosa melibiosa, (ilosa y ribosa 3o fermenta a amigdalina, celobiosa, manitol, manosa, mele+itosa, rhamnosa, sorbitol, rafinosa y trehalosa @epende de las cepas la fermentacin de galactosa, lactosa y sacarosa 3o forma acetona /a fructosa %,I difosfato aldolasa ausente Produce manitol a partir de la fructosa ). Buc*neri. Bacilos con e(tremos redondeados, aislados o en cortas cadenas. <emperatura optima A F& .3o crecen a !8F& pero si a %8F& Son pr*cticamente idnticos a /.brevis e(cepto que fermenta a la mele+itosa y que sus /"/@? y @"/@? migran m*s lentamente en electroforesis +. ,er$entun o Cellobiosus % Bacilos espesos y variables en longitud aunque son generalmente cortos. )islados, a veces en pares o en cadenas &olonias' 3o est*n levantadas, circulares o irregulares, a menudo transl2cidas. 3o est*n pigmentadas pero cepas poco frecuentes producen un pigmento anaran,ado ?eterofermentativas -ermentacin de otros compuestos' -ermenta a la fructosa, fructosa, galactosa, glucosa, gluconato, lactosa, maltosa, manosa, melibiosa, rafinosa, ribosa, sacarosa 3o fermenta a la mele+itosa, manitol, rhamnosa, sorbitol -ermenta seg2n las cepas a la arabinosa4generalmente no5, celobiosa, trehalosa4generalmente no5 y (ylosa -ermentan a la ribosa a l*ctico y actico sin desprender &.# Produce manitol a partir de la fructosa K

Son bacterias que crecen a !8F& pero no a %8F&. Su temperatura ptima es de !%"!#F& Producen amonio a partir de arginina 3ota' /a cellobiosus se diferencia de la fermentun en que fermenta a la celobiosa y escinde a la esculina, pero podra ser considerada una subespecie de fermentun -. ,ructi(orans o Tric*odes Bacilos con e(tremos redondeados muy largos, m*s o menos curvados y a menudo se observan filamentos enrollados, aislados, en pares o cadenas 3o crecen a !8F& Son acidoflicos siendo un p? favorable el de 8"8,8. Muy e(igentes nutricionalmente, al menos al aislarlos por primera ve+. Seg2n su h*bitat e(igen *cido melavnico, +umo de tomate o etanol. )quellas cepas aisladas de fuentes sin etanol crecen bien en M>S y son menos fastidiosas en el momento del repicado &recen a %8F& Produce amonio a partir de arginina Producen @/ l*ctico Solo fermentan a la fructosa, glucosa y ribosa y la fermentacin de la maltosa, gluconato y sacarosa es variable dependiendo de las cepas .ar(ie di/erencia entre /ructi(orans 0 tric*odes ). &aractersticas seg2n 1arvie de /.trichodes Bacilos muy largos, cadenas y filamentos formando una masa enmaraada &olonas y crecimiento. Son pequeas, blanco cremosas, rugosas e irregulares en la forma. Se desarrollan lentamente. Sembradas en superficie su desarrollo es muy escaso $n medio liquido y despus de tres a cinco das cuando se agitan aparecen nubes, ondas. ) veces aparece un depsito floculento mientras el lquido se mantiene claro. Son heterofermentativas fermentando a la glucosa a l*ctico, actico, etanol y &.# y a la fructosa a l*ctico, actico, manitol y &.# $l resto de los carbohidratos no suelen ser fermentados 3o metaboli+an al m*lico ctrico y tart*rico. /a temperatura ptima se encuentra entre #8"A F& en un medio sin etanol y de # "#8F& en el vino. $l p? inicial ptimo se encuentra entre !,8"8,8. 1eneralmente no crecen por deba,o de un p? inferior a A. &recen en un vino con un de # : de alcohol

Slo se obtenido un crecimiento vigoroso en vino y en un medio conteniendo autolisado de levaduras y un # : de etanol. 3o crecen en caldo nutritivo, glucosa peptona, caldo de e(tracto de levadura y mosto de uva. B. &aractersticas seg2n 1arvie de /.fructivorans Son bacilos m*s o menos largos curvados o filamentos enrollados. Se encuentran aislados, en pares o a menudo en cadenas. $l crecimiento es lento y no se ven a menudo hasta el !"8 hasta dos semanas. da o incluso

$n medio lquido forman un sedimento con el sobrenadante claro durante alg2n tiempo. -ermenta a la fructosa, glucnico /a fermentacin de la glucosa, sacarosa, y maltosa es variable o negativa seg2n las cepas. 3ing2n otro a+2car fermentado @bil actividad sobre el m*lico 3o metaboli+a al ctrico. /a temperatura ptima se encuentra entre #8"A G.& 3o crecen a !8G& ni tampoco a %8F& . $l p? inicial ptimo se encuentra entre !,8 y 8,8. &recen en un %8: de etanol. 1. 2ilgardii Son bacilos con bordes redondeados y frecuentemente forman largos filamentos con un tamao de ,8" ,K ( #"! micras. Se encuentran aislados o en cortas cadenas /as colonias son hialinas, crecimiento moderado. blancas o cremosas, levantadas y presentan un

$n medio lquido el crecimiento es moderado apareciendo al cabo de A"! das turbide+. /uego sedimenta Son heterofermentativas. -ermentan a la fructosa, gluconato, ribosa y (ilosa /a fermentacin de la glucosa rinde @/"l*ctico4apro(imadamente el 8 :5, actico, glicerol y &.# . $n el caso de la fructosa tambin rinde manitol. 3o fermentan a la arabinosa, celobiosa, manitol, manosa, melibiosa, rafinosa, rhamnosa, sorbitol y trehalosa. /a fermentacin es menor o variable seg2n las cepas en el caso de la glucosa, galactosa, lactosa, mele+itosa, maltosa y sacarosa. Metaboli+an al *cido m*lico y ctrico $l p? ptimo se encuentra entre !,8"8,8. &recen con %8"%K: de etanol. Son 1ram positivas pero con edad se convierte en un 1ram negativas. %

$l aislamiento est* favorecido si inicialmente se incuban con un 8: de di(ido de carbono Produce en amonio a partir de la arginina. &recen bien entre #K"A!G&. Pueden crecer a ! "!AF& pero no a !8F&. 3o crecen o muy poco a %8F& 3. "agelii Se han aislado de mostos que han sufrido una parada de fermentacin o bien esta se estaba desarrollando de un modo muy lento Son bacilos de apro(imadamente ,8 ( %"%,8 micras &olonias en M> agar opacas, con bordes suaves y tienen un di*metro apro(imado de # milmetros al cabo de !"8 das de crecimiento a #8F& )naerobias facultativas &atalasa negativa Producen @ y / l*ctico a partir de glucosa sin desprendimiento de gas 1ram positivo 3o forman manitol a partir de fructosa $n presencia de glucosa utili+an ctrico o m*lico 3o producen amonio a partir de arginina 3itrato no es reducido ) partir de sacarosa producen de(trano -ermentan @"glucosa, @" fructosa, galactosa, @" manosa, /"sorbosa, rhamnosa, manitol, sorbitol, 3"acetilglucosamina, amigdalina, celobiosa, maltosa, sacarosa, trehalosa. ?idroli+an a la esculina 3o fermentan al glicerol, eritritol, @"arabinosa, /"arabinosa, ribosa, @"(ilosa, /" (ilosa, dulcitol, inositol, arbutina, lactosa, melibiosa, inulina, mele+itosa, glucgeno, fucosa, tagatosa. )rabitol, gluconato, #"cetogluconato y 8" cetogluconato &recen en caldo M> conteniendo un 8: pNv de cloruro sdico a p? !,8 &recen a un p? mnimo de A,O &recen desde %8F& hasta !8F&. ) 8F& crecen dbilmente Se parece /.casei 4. 5un6eei Se han aislado de mostos que han sufrido una parada de fermentacin o bien esta se estaba desarrollando de un modo muy lento Son bacilos de un tamao apro(imado de ,8 ( %"%,8 milmetros &olonias sobre M> agar son opacas, cncavas y de apro(imadamente de %"# milmetros de di*metro despus de A das de crecimiento a #8F&

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) diferencia de otras bacterias que crecen en el vino esta especie crece relativamente r*pido en caldo M> requiriendo solo #"A das en comparacin con los 8"% das que requieren otras especies de lactobacilos, pediococos y oenococos @bil actividad catalasa positiva Produce /"l*ctico y gas a partir de glucosa -ermentan pocos carbohidratos tales como @"glucosa, @"fructosa, sacarosa, y dbilmente a @"la rafinosa. $l manitol fue fermentado cuando se empleo el medio &?/ usado en las galeras )P= pero no cuando se empleo el medio modificado de Lensen y $dJards -acultativa anaerobia creciendo bien en una atmsfera enriquecida en di(ido de carbono $n presencia de glucosa utili+an ctrico o m*lico Producen manitol a partir de fructosa &recen bien en caldo M> a p?; A,O o superior &recen entre %8F& y AOF& a un p? de !,8 3o crecen ni a 8F& ni a !8F& &recen dbilmente en presencia de un 8:pNv de cloruro sdico 3o hidroli+an a la esculina 3o producen amonio a partir de arginina 3itrato no es reducido 1ram positivo &. !E IOCOCCUS $(isten tres especies' @amnosus Pentosaceus Parvulus =nopinatus /as m*s comunes son damnosus y parvulus -orma' $sfricas, multiplic*ndose en dos planos en *ngulo recto para formar ttradas. Sin embargo a veces no forman ttradas sino solamente pares. &lulas aisladas son raras. 3o forman cadenas, aunque a veces se ven cortas cadenas y stas est*n formadas por pares de clulas unidas y no por la divisin en el mismo plano /as clulas dentro de un mismo cultivo son uniformes en tamao. )lgunas cepas forman pequeas clulas de ,I micras di*metro mientras que otras son m*s largas. $n el caso particular de la damnosus su tamao varia entre ,I H % micra y la pentosaceus entre ,K H % micras &olonias y crecimiento )' 1eneral' %#

/as colonias tienen un tamao es uniforme y entre % H #,8 mm de di*metro. Son redondas, suaves, gris"blanquecinas. &uando se siembra en estra crecen poco en la superficie $n medio lquido presentan una turbide+ uniforme B. &asos particulares %. @amnosus $l crecimiento es a menudo lento y se requiere de #"A das a ##F& para un buen crecimiento. Sobre agar y en superficie el crecimiento es pobre a menos que se incuben anaerbicamente en atmsfera de ?# M % : &.# $n medio liquido pueden multiplicarse sin condiciones anaerbicas pero si se aade del , 8" ,%: de hidrocloruro de cistena me,ora el crecimiento $l color de sus colonias pasa posteriormente a amarillento"marrn en 1lucosa"peptona"e(tracto levadura")gar. )lgunas cepas forman colonias viscosas #. Parvulus /as colonias en <L")gar son muy pequeas pero si se incuba anaerbicamente en atmsfera de ?# M % : &.# las colonias pueden resultar grandes. Se requieren usualmente # das a A F& $n medio lquido se me,ora el crecimiento si se aade hidrocloruro de cistena y <Jeen K pero puede necesitar dos das de incubacin, presentando una turbide+ uniforme A. Pentosaceus /a morfologa y colonias igual a la descripcin general Sobre agar y sembrada en superficie no hace falta incubarla anaerbicamente y las colonias deberan de ser visibles despus de incubacin aerbica durante % da a A F& $n medio lquido pueden crecer muy r*pidamente 1ram M 3o son mviles &atalasa negativa. P. Pentosaceus puede dar falsos positivos ya que posee una pseudocatalasa. $s m*s frecuente cuando en el medio hay poca glucosa <emperaturas optimas' Parvulus A F&, @amnosus #8F& y Pentosaceus #K H A#F& )naerobias facultativas. /a resistencia al o(igeno varia seg2n las especies. Por e,emplo P.pentosaceus aguanta m*s o(igeno )cide+' %. @amnosus' $l rango esta entre A,8 H I,#. $l ptimo es de 8,8 #. Parvulus' $l optimo I,8 A. Pentosaceus' I H I,8 Metabolismo' &arbohidratos' %. 1lucosa' Son homofermentativas %A

/a glucosa es probablemente fermentada a @/ o /"4M5 lactato por la va $mbden"Meyerhof. $l ratio @N/ lactato varia con las condiciones de crecimiento. $n condiciones casi ptimas el lactato es el principal producto de este metabolismo. Sin embargo ba,o ciertas condiciones el pir2vico que se forma como producto intermedio puede ser metaboli+ado hacia otros productos que no sean l*ctico como por e,emplo diacetiloNacetona como a menudo ocurre con P.damnosus aunque raramente en otras especies <ambin una cepa de P.pentosaceus ba,o limitacin de glucosa degradan al glicerol a piruvico y este es posteriormente metaboli+ado a actico o a diacetiloN#,A butanodiol a travs del etanal activo $n muchas bacterias l*cticas la reduccin de pir2vico a l*ctico esta controlada por el requerimiento de 3)@. &uando crecen con un adecuado nivel de glucosa pero hay un dficit en otros nutrientes puede causar la desviacin del pir2vico hacia la formacin de diacetiloNacetona /a produccin de diacetilo se ha empleado para diferenciar a la P.damnosus pero esto no es fiable #. Pentosas' Solo fermentadas por P.pentosaceus A. .tros a+2cares y compuestos carbonados' /a mayora fermenta a la fructosa, galactosa, manosa, celobiosa, amigdalina, esculina y salicina y la mayora no fermenta a la sorbosa, melibiosa, inulina, dulcitol e inositol. /a rafinosa puede ser fermentada por P. pentosaceus M*lico' Pueden atacarlo pentosaceus y damnosus &trico. 3o estudiado $l sorbitol y el almidn no son fermentados 3ecesidades nutritivas' >equieren un medio rico e(igiendo amino*cidos y factores de crecimiento. 3o asimilan al amonio. P.pentosaceus requiere la mayora de los amino*cidos. )lgunas cepas de P.damnosus requieren *cido mevalonico

'. OE"OCOCCUS )ntiguamente se llamaba /euconostoc /a 2nica especie que consideramos es la .enococcus oeni -orma' $n su forma influye el medio y la cepa. $n medio lquido son elongadas, parecindose m*s a bacilos que a cocos. $n medio slido tienen forma lenticular, rara ve+ cocos. )isladas, en pare,as o cadenas retorcidas $n general cocos o lenticulares de ,8 H % ( ,O H %,8 micras $n pares o cadenas &olonias y crecimiento' Son pequeas de di*metro inferior a % mm, gris"blanquecinas, suaves y redondas. &recimiento pobre y lento incluso en anaerobiosis precisando de 8 H O das a ##F& %!

&recen me,or en medio *cido a p? entre !,# y !,K y con +umo de tomate $l crecimiento es lento en % : de alcohol a p? de !,K $n medio liquido turbide+ uniforme, pero a veces sedimento cuando forma largas cadenas 1ram M 3o son mviles &atalasa H <emperatura. $l rango se encuentra entre % y A8F&. /a optima %K H #!F& )naerobias facultativas. Prefieren condiciones anaerobias &apaces de crecer en vinos con %!: de alcohol 3ecesidades' >equiere un comple,o de amino*cidos y la falta de alguno puede impedir el crecimiento. )lgunas cepas requieren un factor del +umo de tomate, posiblemente el /"."4R"glucopiranosil5 @ 4>5*cido pantotnico. 3o asimilan al amonio Metabolismo 1lucosa. Son heterofermentativas. )lgunas cepas forman actico en ve+ de etanol. $n cultivo no ,oven el desprendimiento de &.# puede ser imperceptible. $l tipo de l*ctico formado es el @4"5 l*ctico $n la siguiente tabla viene refle,adas otras caractersticas metablicas nd significa no determinado 9cido a partir de' )migdalina )rbutina &elobiosa -ructosa 1alactosa 1lucosa /actosa Maltosa Manitol Manosa Melibiosa >afinosa >ibosa Salicina Sacarosa *cido pueden resultar positivas5 <rehalosa Pilosa ?idrlisis esculina 3ecesario para crecer' 7racil >iboflavina ..oeni nd d d M d M " " " d d " nd d "4ciertas cepas en medio M d M " M %8

Pirido(al 9cido folico -actor +umo tomate -ormacin de(trano @esasimilar citrato en presencia carbohidratos @esasimilar malato' 3o carbohidratos presentes Si carbohidratos presentes &recimiento a' p? inicial de !,K p? inicial de I,8 AOF& Producen manitol a partir de fructosa

M M d " d nd M M d d

&trico' /o metaboli+an a actico, diacetiloNacetonaN#,A butanediol M*lico' /o degradan a l*ctico y di(ido de carbono @e 8A cepas estudiadas # producan polisac*ridos e(tracelulares en un medio que contena #8: de mosto. $stos polisac*ridos pueden afectar a la filtrabilidad y calidad del vino >ecientemente se ha descubierto que poseen en+imas glucosidasicas con lo que estas bacterias pueden influir en las caractersticas sensoriales varietales

). LEUCO"OSTOC /a 2nica especie que consideraremos el la mesenteroides Son clulas esfricas o lenticulares, en pares o cadenas generalmente cortas /as colonias son pequeas y grises, siendo el crecimiento es muy pobre en medios sin e(tracto de levadura. -orma un de(trano viscoso a partir de sacarosa y favorecido por temperaturas comprendidas entre # H #8F& Son heterofermentativas. /a fermentacin de % mol de glucosa da lugar a % mol de @4"5 l*ctico, % mol de etanol y % mol de di(ido de carbono )lgunas cepas tienen un metabolismo aerobio o(idativo' 1lucosa M .# S /*ctico M actico M &.# a partes iguales Produce *cido a partir de la arabinosa, glucosa, fructosa, galactosa, maltosa, manosa, sacarosa y trehalosa /a produccin de *cido es variable seg2n las cepas en el caso de la celobiosa, lactosa, manitol, melibiosa, rafinosa, y (ylosa /a fosfocetolasa esta presente $sta ausente la fructosa%,I difosfato aldolasa /a temperatura optima esta entre # "A F& y el rango entre % y AOF& 3o le hace falta para crecer el factor +umo de tomate. %I

/a necesidad de riboflavina, pirido(al y *cido flico para crecer es variable, dependiendo de la cepa Metaboli+an al m*lico

%O

#ETABOLIS#O .E"ERAL LACTICAS

E A7UCARES

E LAS BACTERIAS

%. ?e(osas %.a -ermentacin homofermentativa4homol*ctica5 /a glucosa se transforma en pir2vico por la va ya conocida de la gliclisis4ver fermentacin alcohlica5. $ste pir2vico es reducido a *cido l*ctico 1lucosa S Pir2vico S /*ctico 0er =magen T Bacterias homol*cticasU 7na molcula de glucosa rinde dos molculas de l*ctico y dos de )<P 1eneralmente no producen el % pueden ser homofermentativas : de l*ctico. Produciendo el K :

$n ocasiones, seg2n las condiciones de crecimiento la bacteria P. damnosus puede desviar el pir2vico hacia acetonaNdiacetilo /os lactobacilos homofermentativos cuando hay limitacin de glucosa pueden formar actico a partir del pir2vico /os Pediococos, e(cepto la especie pentosaceus, pueden atacar 2nicamente a la glucosa %.b -ermentacin heterofermentativa4heterol*ctica5' 0a de las he(osas fosfato. 0er =magen TBacterias heterol*cticasU a. 1lucosa 1lucosa S 1lucosa IP S Se o(ida a glucnico IP S Se o(ida a >ibulosa 8P con desprendimiento de &.# S Pilulosa 8PS )qu se escinde en dos molculas por la presencia de una fosfocetolasa' a. 1liceraldehdo AP S Se convierte en pir2vico por la va de la gliclisis $l pir2vico se reduce a l*ctico4m*s del 8 :5. <ambin a partir del gliceraldehdo puede dar acido fosfoglicrico S glicerol S %,A propanodiol. @e ah que algunas cepas e(creten glicerol. /a sntesis de %,A propanodiol es tpica de /. brevis b. )cetil"P. Seg2n sea el balance redo( puede dar actico o etanol. b.% )cetil"P S )ctico M )<P b.# )cetil"P M &o) S )cetil&o) S Se reduce a $tanal S Se reduce a $tanol Por tanto los productos finales de la fermentacin de la glucosa son *cido l*ctico4mnimo el 8 :5, &.#, y actico o etanol /as condiciones en la que aparecer* actico en ve+ de etanol son' %. $n condiciones incluso ligeramente o(idativas, es decir cuando hay presencia de o(igeno, ste o(ida al 3)@? dando 3)@ reducindose a su ve+ a agua. )l no haber ya 3)@? el acetil"P no puede reducirse a etanol con lo que se convierte en

%K

actico. Por tanto en el caso de ..oeni en situaciones de aerobiosis forma preferentemente actico mientras que en condiciones de anaerobiosis etanol #. Si hay fructosa y sta coge el 3)@? para reducirse a manitol el acetil P no puede reducirse a etanol rindiendo actico. b. -ructosa. Presentan dos vas metablicas b.% -ermentacin' /a fructosa pasa a fructosa IP y luego a glucosa IP entronc*ndose en la va de las pentosas fosfato. b.# >educirse a manitol Por esta va se produce una molcula de )<P ya que en este caso el acetil"P no puede reducirse a etanol y se convierte en actico rindiendo una molcula de )<P /a mayora de los lactobacilos heterofermentativos pueden utili+ar a la fructosa no 2nicamente como fuente de carbono4va a5 sino como aceptador de electrones reducindose a manitol4va b5 #. Pentosas #.a ?eterofermentatitvas. /a mayora las metaboli+an. 7na e(cepcin seria /euconostoc gracile4ahora se llama /euconostoc oenos. /as pentosas por en+imas especficas se convierten en (ilulosa 8P entronc*ndose en la va de las ?e(osa fosfato, rindiendo actico y l*ctico #.b ?omofermentativas. $n Tsensu estrictoU no pueden fermentarlas, sin embargo en muchas cepas de Pediococos las pentosas inducen la sntesis de fosfocetolasa rindiendo actico y l*ctico. Por tanto son para las he(osas homofermentativas y para las pentosas heterofermentativas. Por tanto distinguiremos a las homofermentativas obligadas, las cuales no fermentan a las pentosas 4/.delbruecDii, la cual no es vnica5 de las facultativas las cuales fermentan a las pentosas aunque en algunas especies ba,o limitacin de glucosa4/. casei y /.plantarum5. /as pequeas cantidades de estos a+ucares presentes en el vino hace que su degradacin no suponga una grave alteracin de los vinos, sin embargo unido al metabolismo de las he(osas contribuye a acentuar la alteracin del picado l*ctico >esumen ?eterofermentativas obligadas ..oeni y /.brevis, /.hilgardii, /.fructivorans y /. DunDeii ?omofermentativos obligados' Pediococos, /.delbruecDii ?eterofermentativos facultativos' /.casei, /.plantarum

%Q

/neas continuas' fermentacin homol*ctica /neas discontinuas' fermentacin heterol*ctica

AISLA#IE"TO $(isten tres mtodos para aislarlas del vino' %. @ebido a que hay pocas bacterias l*cticas en el vino, e(cepto durante la fermentacin malol*ctica, se enriquecen primero en un caldo nutritivo y luego se siembran en un medio agari+ado. /a principal desventa,a es que 2nicamente suministra informacin sobre la presencia o ausencia de bacterias l*cticas y no permite un an*lisis cuantitativo. $(iste tambin el peligro de que algunas especies puedan multiplicarse en demasa y enmascarar a otras que estaban inicialmente presentes. #. Sembrar directamente ,% ml de la muestra de vino sobre un medio con agar que se encuentra en una placa Petri. <iene la desventa,a de que no es posible detectarlas cuando su n2mero sea inferior a % clulas por mililitro. 7na forma de superar este lmite de detectabilidad es aumentar su concentracin por centrifugacin. $n ambos casos la siembra puede ser en superficie o en profundidad a. $n profundidad' Se hace la siembra con el medio todava lquido y, una ve+ solidificado aadir una nueva capa de medio a fin de asegurar la anaerobiosis b. $n superficie. $n este caso es imperativo incubarlo en una ,arra de anaerobiosis4os la mostrare en el laboratorio5 o en la estufa que est* en el laboratorio y que permite mantener una atmsfera de di(ido de carbono a diferentes concentraciones. Se recomienda a,ustarlo a una concentracin del 8" % : A. -iltracin por membrana. $(plicare este mtodo en el laboratorio en donde tenemos un equipo de filtracin Para inhibir a las levaduras emplearemos ciclohe(imida a ra+n de % mgNl

#E IOS E CULTI8O ?ay muchos medios para el cultivo de las bacterias l*cticas pero sorprendentemente a hay pocos estudios comparativos entre los distintos medios. -leet y Pan despus de comparar varios medios han concluido que no hay ning2n medio que permita el aislamiento de todas las especies que puedan encontrarse en un vino. /o ideal seria sembrar la muestra en varios medios pero esto no es pr*ctico. 3o hay una opinin un*nime acerca de cual es el me,or medio, variando los medios recomendados seg2n autores escri9ci:n de los distintos $edios. $n principio habra que emplear varios medios pues no hay ninguno en los que cre+can todas las bacterias l*cticas ya que sus requerimientos nutritivos son a veces fastidiosos 1. .uitonneau $odi/icado Peptona de casena ,O g $(tracto de carne ,A g $(tracto de levadura ,% g /actosa %g )gar %,K g )gua destilada % ml Se calienta a fuego directo hasta total disolucin, de,ar enfriar y a,ustar el p? a O,# con carbonato sdico al % :. $sterili+ar a vapor fluente durante % hora A das seguidos #%

/a cantidad de lactosa se debe de reducir a ,%g cuando el medio se emplee para mantenimiento especialmente cuando la cepa sea una gran productora de *cido l*ctico. $n este medio crecen poco algunos lactobacilos &. #edios ;ue e$9lean <u$o de to$ate &.1 #edio to$ate seg=n Llaguno Vumo de tomate Peptona 3a&l 1lucosa $(tracto de levadura )lmidn soluble )gar )gua p? ; I,K ! ml %,8 g %,8 g #g %g , 8g %g % ml

$sterili+ar # minutos a %# F& $l almidn soluble es para adsorber inhibidores Preparacin del +umo de tomate. @esler 8 gramos de tomate en % litro de agua. @e,ar reposar Q minutos y luego calentar a fuego lento hasta ebullicin. Por ultimo filtrar. &.& T>?Agar o To$ato >uice Agar. $st* disponible comercialmente siendo un medio para el aislamiento y mantenimiento de lactobacilos. Seg2n la casa que lo comercialice tendr* una composicin u otra. Pondr dos casos' a. Primer caso Peptona carne Peptona de casena $(tracto de levadura 1lucosa 3a&l )lmidon <Jeen K $(tracto de tomate )gar )gua $sterili+ar a %%8F& durante A minutos Segundo caso. /o comerciali+a la casa .(oid Vumo de tomate slido 4a partir de ! Peptona /eche peptoni+adaW )gar )gua p? final I,% a #8F& ml5solids from ! ml % g % g %% g ?asta % litro # g O,8 g O,8 Ig # g 8g , 8g % ml %I g %I g ?asta % litro

WLeche peptonizada: Digerido pancretico de leche en polvo descremada. Suspender 8# gramos en % litro de agua destilada y llevar a ebullicin. ##

$sterli+ar %# F& durante %8 minutos 3ota' 7na empresa que comerciali+a el <L")gar tambin vende *cido srbico con el fin de conseguir un medio selectivo y as ser empleado en el aislamiento y numeracin de lactobacilos. Se procede del siguiente modo' 7na ve+ estril el <L")gar y tras enfriarlo hasta 8 F& se le aade ,!gNl de *cido srbico preparado como solucin estril y a,ustar el p? a 8 Preparacin de la solucin de *cido srbico. )adir ,! g de *cido srbico a % ml de agua destilada estril, calentar a 8 "I F& y aadir apro(imadamente A ml de 3a.? %3 hasta disolucin completa &.' Caldo To$ate Acido @Acid To$ato Brot*A 1lucosa % g Peptona % g $(tracto de levadura 8g MgS.!.O?#. .# g MnS.!.!?#. . 8g Vumo de tomate filtrado #8 ml )gua destilada O8 ml ),ustar el p? a !.K 7na ve+ estril aadir aspticamente ,8 ml de una solucin al %: de hidrocloruro de cistena esterili+ada por filtracin &.) 7u$o to$ate agar seg=n ,ugelsang %. )adir % gramo de e(tracto de hgado a % ml de agua y esperar como mnimo A minutos. /uego filtrar a travs de un papel de filtro Xhatman nF % #. &entrifugar #8 ml de +umo de tomate a A g durante A minutos y escoger el sobrenadante. $ste sobrenadante 4suero5 puede ser almacenado en pequeos vol2menes a "# G& hasta su empleo. $l +umo de tomate que hay que emplear es el obtenido a partir de tomates frescos o bien +umo de tomate comercial pero que no contenga preservativos ni se haya obtenido a partir de concentrado A. Preparar el siguiente medio <riptona Peptona $(tracto levadura 1lucosa -ructosa Suero de +umo tomate <Jeen K 4solucion al 8: pNp5 )gua destilada # g 8g 8g 8g Ag # ml. % ml. O ml.

!. )adir a esta solucin el e(tracto de hgado filtrado y a,ustar a p? 8,8 empleando *cido fosfrico al 8 : vNv yNo hidr(ido pot*sico IM 8. )adir # gramos de agar I. $sterili+ar a % atm durante %8 minutos Si se desea que el medio sea selectivo e impedir el crecimiento de las Saccharomyces aadir % mg de ciclohe(imida a % ml de agua destilada y

#A

esterili+ada por filtracin. Se aade esa solucin al medio una ve+ autoclavado y fro. '. Rogosa Agar B Rogosa SL o $edio SL $stos tres medios son muy seme,antes y son selectivos para aislamiento y mantenimiento de lactobacilos. $s selectivo debido a la alta concentracin de acetato y el ba,o p? lo que ocasiona la inhibicin de otras bacterias l*cticas acidas. Pero estos medios no es estrictamente selectivos y pediococcus, oenococcus y levaduras pueden crecer. Para inhibir a las levaduras aadiramos % mg por litro de ciclohe(imida. '.1 Rogosa Agar de OCoid &omposicin en gNl <riptona $(tracto de levadura )cetato sdico anhidro -osfato monopot*sico Sulfato de manganeso Sulfato de magnesio @4M5 glucosa Sulfato ferroso &itrato amnico <Jeen K )gar ),ustar a p? 8,!

% 8 %O I ,%# ,8O8 # , A! # % ml # g

Suspender K# gramos en % litro de agua destilada y llevar a ebullicin. )adir %,A# ml de acido actico glacial y homogenei+ar. ?ervir durante #"A minutos agitando frecuentemente. @ispensar en tubos de ensayo o placas Petri estriles. 3o autoclavar '.& Rogosa SL <riptona $(tracto de levadura @e(trosa )rabinosa Sacarosa )cetato sdico &itrato amnico -osfato monopot*sico Sulfato magnsico Sulfato de manganeso Sulfato ferroso Polisorbato K )gar )gua % g 8g % g 8g 8g %8 g #g Ig ,8O g ,%# g , Ag %g %8 g ?asta % litro

&alentar y de,ar hervir % minuto. 7na ve+ fro aadirle %,A# ml de *cido actico glacial y luego hervir durante #"A minutos. 3o autoclavar #!

'.' #edio SL Peptona de casena $(tracto de levadura C?#P.! &itrato diamnico MgS.!.O?#. MnS.!.!?#. -eS.!.O?#. <Jen K 1lucosa )cetato sdico trihidrato )gar %8 % g 8g Ig #g ,8 g ,# g , !g % # g #8 g

@isolver el agar separadamente en 8 ml de agua mediante calentamiento. @isolver los otros componentes sin calentar en otros 8 ml. ),ustar con *cido actico glacial a p? igual a 8,!. /uego aadir el agar disuelto y hervir durante cinco minutos. ). A!T Agar Medio para aislamiento y mantenimiento de bacterias l*cticas heterofermentativas incluyendo lactobacilos y leuconostoc, con altos requerimientos de tiamina &omposicin en gNl Peptona @4M5 glucosa $(tracto de levadura -osfato dipot*sico Sulfato ferroso Sulfato magnsico &loruro de manganeso4==5 &loruro sdico &itrato sdico ?idrocloruro de tiamina )gar p? final %#,8 % O,8 8 , ! ,K ,%! 8 8 , % %A,8 I,O a AOF&

+. #RS Agar Son las iniciales de @e Man, >ogosa y Sharpe. $sta disponible comercialmente. Su composicin viene indicada en el envase as como la dosis de empleo $s un medio para lactobacilos. Peptona % g $(tracto de carne Kg $(tracto de levadura !g 1lucosa # g <Jeen4Polisorbato5 K % ml -osfato dipot*sico #g )cetato sdico 8g &itrato triamnico #g Sulfato magnsico heptahidratado # mg Sulfato de manganeso tetrahidratado 8 mg #8

)gar )gua destilada % litro ),ustar el p? del medio a I,#"I,I.

%!

-. #RS Caldo. Es idntico al MRS Agar excepto que no lleva agar 1. #RS con to$ate M>S 9cido m*lico Vumo de tomate )gua destilada 8g ,8 g A ml % ml

3.a #RS con &DE de <u$o de to$ate 0 aFustado el 92 a +B+ 3.b #RS G&DE <u$o de $an<ana 0 aFustado el 92 a +B+ 4. Elli6er Medio para el cultivo de lactobacilos &omposicin en gNl )cido ascrbico <riptona @e(trosa 1elatina /actosa Sacarosa )cetato sdico &loruro sdico $(tacto de levadura p? final I,K a #8F& 1D. HL Agar o Hallerstein Laborator0 Agar $s un medio recomendado para bacterias &omposicin en gNl ?idroli+ado en+im*tico de casena $(tracto de levadura @e(trosa -osfato monopot*sico &loruro pot*sico &loruro c*lcico Sulfato de magnesio &loruro frrico Sulfato de manganeso 0erde de bromocresol )gar p? final de 8,8 a #8F& $sterili+ar %#%F& durante %8 minutos

,8 # 8 #,8 8 8 %,8 ! 8

8g !g 8 g ,88 g ,!#8 g ,%#8 g ,%#8 g , #8 , #8 , ## #

11. HL Agar o Hallerstein i//erential Agar $s igual al X/ )gar e(cepto en que se le ha aadido &aptan a ra+n de , para inhibir a las levaduras. Por tanto es un medio selectivo

! gN

#I

1&. HL "utrient Brot* o Hallerstein Laborator0 "utrient Brot* $s igual en composicin al X/)gar e(cepto en que no lleva agar 1'. HL Brot* $s un medio selectivo y es igual al X/@ )gar e(cepto en que no lleva agar 1). Ra6a?Ra0 Agar Medio selectivo para el aislamiento de bacterias l*cticas &omposicin en gNl 3"acetil glucosamina ,8 ?idrocloruro de botaina # ?idroli+ado en+im*tico de casena # &itrato diamnico # -ructosa 8 1lucosa 8 &oncentrado de hgado % Sulfato de magnesio # Maltosa % Sulfato de manganeso ,II -osfato monopot*sico # )spartato pot*sico #,8 1lutamato pot*sico #,8 $(tracto de levadura 8 )gar %O p? final de 8,! a #8F& 1+. #edio #LO Caldo $s un medio apropiado para ..oeni <riptona $(tracto de levadura 1lucosa -ructosa MgS.!.O?#. MnS.!.?#. &itrato diamnico ?idrocloruro de /"cistena Vumo de tomate filtrado <Jeen K )gua destilada ),ustar el p? a !,K % g 8g % g 8g ,# g , 8 A,8 g ,8 g % ml % ml Q ml

3ota' Si se desea preparar este medio con agar disolver los ingredientes en la mitad del volumen requerido y a,ustar el p? a !,K. $n el agua restante disolver # gNl de agar. $sterili+ar por separado el agar y los nutrientes a %%8F& durante #8 minutos. /uego una ve+ estril me+clarlos 1-. #edio selecti(o 9ara aisla$iento seg=n 8i(as $(tracto de levadura 3eopeptona 9cido @/ m*lico MgS.! 8g 8g % g , 8g #O

MnS.! , #g Vumo de tomate #8 ml )gar # g )gua ?asta % litro p? !,8 H !,K $sterili+ar a %# F& durante %8 minutos Para inhibir a las levaduras se aade ciclohe(imida. Se prepara una disolucin de 8 mgNml de ciclohe(imida y se aaden ,# ml de esa disolucin a % ml del medio qu 11. #edio de $anteni$iento seg=n 8i(as ?idroli+ado de casena $(tracto de levadura C?#P.! C&l &a&l# MgS.! MnS.! 1lucosa 9cido @/ m*lico <Jeen K )gua p? !,8 H !,K 13. #edio de aisla$iento 9ro9uesto 9or La/on ?idroli+ado de casena $(tracto de levadura C?#P.! C&l &a&l#.#?#. MgS.!.O?#. MnS.!.?#. 1lucosa 9cido @/ m*lico Vumo de tomate ),ustar a p? !,8 8g !g ,88 g ,!#8 ,%#8 ,%#8 , #8 8g % g %ml ?asta % litro

8g !g ,I g ,!8 ,%A ,%A , A ! g # g % ml

)adir 8 ml de este medio, ,unto con ,% ml de ciclohe(imida al ,8: a una placa Petri. Me+clar cuidadosamente con % ml de la muestra y 8 ml de agar fundido al A:. $ncubar a #OF& durante K"% das en ,arra de anaerobiosis 14. "a6agaIa $n este medio crecen bien los cocos $(tracto de levadura Peptona 3a&l 1lucosa )gar )gua p? $sterili+ar a % atmsfera durante %8 minutos

% g % g 8g A,# % % ml I

#K

&D. AR@A99le RogosaA Rogosa <u$o de $an<ana. %. )adir % gramo de e(tracto o concentrado de hgado a % ml de agua y esperar como mnimo A minutos. /uego filtrar a travs de un papel de filtro Xhatman nF % #. Preparar el siguiente medio <riptona Peptona $(tracto levadura 1lucosa Vumo de mana+ana <Jeen K 4solucion al 8: pNp5 )gua destilada # g 8g 8g 8g # ml. % ml. O ml.

A. )adir a esta solucin el e(tracto de hgado filtrado y a,ustar a p? 8,84-ung ponia !,8 pero creo que es un error5 empleando *cido fosfrico al 8 : vNv yNo hidr(ido pot*sico IM !. $sterili+ar a % atm durante %8 minutos Si se desea agari+ado aadir # gramos de agar antes de esterili+ar Si se desea que el medio sea selectivo e impedir el crecimiento de las Saccharomyces aadir % mg de ciclohe(imida a % ml de agua destilada y esterili+ada por filtracin. Se aade esa solucin al medio una ve+ autoclavado y fro. 3ota' $(iste una variante en la que no emplea el e(tracto de higado y en ve+ de emplear % ml de <Jeen K emplea , 8 ml &1. #edio !lasencia $s un medio de mantenimiento $(tracto de carne Peptona $(tracto de levadura -ructosa o glucosa )gua destilada

,A g ,8 g ,! g %g % ml

&&. #RS $odi/icado $s un medio M>S suplementado con 8 gN/ de *cido @,/"m*lico, % : de +umo de tomate, ,8 gN/ de /"cistena, 8 mgN/ de nistatina, % mgN/ de a+ida sdica y # gN/ de agar, a un p? 8, . /a nistatina es para inhibir a las levaduras

I E"TI,ICACIO"
1. Identi/icaci:n de gneros seg=n Singleton %.a Pediococcus' -*cilmente reconocidos por su forma esfrica. 1eneralmente se encuentran en pares. @e todas formas se pueden distinguir de aquellos .enococcus cuyas

#Q

formas sean de cocos elongados porque los pediococos son homofermentativos produciendo 2nicamente @/ /*ctico a partir de la glucosa %.b /actobacillus. Ser*n lactobacilos en los siguientes casos' a. &uando la relacin longitudNanchura sea mayor de # b. &uando son cocos alargados o bacilos cortos de relacin longitudNanchura menor de # y homofermentativos c. &uando son cocos alargados o bacilos cortos de relacin longitudNanchura menor de #, heterofermentativos que producen @" lactato y producen amonio a partir de la arginina Si producen /"lactato o @/"lactato ser*n lactobacilos y no har* falta hacer la prueba de la arginina ya que no pueden confundirse con oenococos %.c .enococcus. Son m*s bien cocos alargados y la dificultad de diferenciarlos de los lactobacilos es cuando stos son cocos elongados heterofermentativos productores de @"l*ctico ya que los oenococcus son heterofermentativos y producen 2nicamente @"l*ctico. Para ello se reali+a la prueba de la formacin de amonio a partir de arginina. /os oenococos no producen amonio mientras que los lactobacilos si que lo producen@I$9ortante% 8er co$entarios en la 9rueba de la arginina en el aneCo corres9ondienteA /as pruebas para determinar si son homofermentativos o heterofermentativos, si producen amonio a partir de arginina y el tipo de ismero del *cido l*ctico est*n e(plicadas en el )ne(o &. Identi/icaci:n de es9ecies ?ay una gran variabilidad con lo que la identificacin de especies es difcil y para algunos no tiene valor, m*(ime cuando puede tener m*s importancia la cepa que la especie en ciertas caractersticas de importancia enolgica Si se sigue el Bargey el proceso es largo y tedioso. $l proceso de identificacin se ha simplificado gracias al empleo de galeras )P= 8 &?/48er AneCo e9gra/e +5 en las que la identificacin se basa en el perfil de la fermentacin de carbohidratos. ?ay programas disponibles para procesar la informacin. Se usa ampliamente aunque algunos dudan de su fiabilidad. $n este test r*pido el control del p? y el tiempo de incubacin tiene que ser riguroso. $s importante darse cuenta que la reaccin de fermentacin de carbohidratos en el )P= no son lo mismo seg2n las cepas. ?ay una fuerte variabilidad en general entre cepas. Modernamente se emplea la biologa molecular para identificar a las bacterias l*cticas 3osotros emplearemos las siguientes claves %. =dentificacin especies de Pediococcus. 3os basaremos en su tolerancia a la temperatura, p? y 3a&l &recimiento @amnosus Parvulus Pentosaceus A8F& " M M ! F& " " M p? O,8 " M M p? K,8 " " d !: de 3a&l " M M

#. =dentificacin de especies de /actobacillus ). ?omofermentativos. )ldolasa presente. /a fosfocetolasa puede ser inducida &recimiento sobre <ipo *cido l*ctico Manitol Melibiosa Bavaricus / " &asei sub casei / M ?omohiochii @/ " " &urvatus @/ " " SaDe @/ " M Plantarum @/ M M /as importantes son la /.plantarum y la /.casei 1alactosa )rabinosa " " " M M M M

B. ?eterofermentativos. )ldolasa no presente. -osfocetolasa siempre inducible %8F& -ermentum " BrevisW M M " BuchneriiW M M M -ructivoransW M " ?ilgardiiW M " Cefir M M /as marcadas con asterisco son las importantes A"EJOS 1. !rueba 9ara deter$inar si son *o$o/er$entati(os o *etero/er$entati(os Podemos emplear los siguientes medios ' 1a #edio se$is:lido de .ibson. Ya no esta disponible comercialmente. $n este medio la leche descremada vena en un envase aparte. Su composicin era la siguiente en gNl $(tracto de carne $(tracto de levadura Peptona &loruro sdico @e(trosa Sulfato manganoso )gar $n frasco aparte' /eche descremada p? a punto de uso I,8 apro(. Modo de operar' @isolver 8K gramos del polvo en 8 ml de agua destilada y llevar a ebullicin. $sterili+ar al autoclave %8 minutos a %#%F& en un frasco de % litro. Mantenerlo en bao mara a I F&4paara otros son !8"8 F&5 apro(imadamente. @esler % gramos de leche descremada que se ad,unta en 8 ml de agua A% ,# g Ag %g %g 8 g , !g A % g &recimiento Melibiosa Mele+itosa Pilosa Bacilos cortos 3o Si Si 3o 3o

" M

destilada templada. $sterili+ar al autoclave durante % minutos a %#%F&. 0erter la leche descremada caliente sobre la base del medio, homogenei+ar y distribuir % ml en tubos de ensayo de %I ( %I mm estriles. 7na ve+ preparado el medio completo evtese cualquier sobrecalentamiento. Preparar agar al A:, aadirlo a un tubo de ensayo y esterili+arlo a %# F& durante # minutos. =ntroducirlo en un bao termost*tico para que alcance una temperatura de !8"8 F& Se siembra el medio semislido de 1ibson del siguiente modo' /as bacterias que queremos anali+ar deben de encontrarse en caldo M>S. &on la pipeta Pasteur cogemos una muestra de ese medio M>S y a continuacin pinchamos hasta el fondo en el tubo que contiene el medio de 1ibson y al sacarlo vamos de,ando salir la muestra $nfriamos en posicin vertical ba,o una corriente de agua. &ubrimos la parte superior de este medio sembrado y enfriado con el agar todava lquido, apro(imadamente un dedo, para formar un tapn. $nfriar en posicin vertical. =ncubar a AIG & muchos das. $valuacin' $n caso de que las bacterias sean heterofermentativas producir*n di(ido de carbono y ste har* subir al tapn de agar 1.b #edio 2,A@2etero,er$entati(oArgininaA Caldo &on este medio tambin podremos evaluar la produccin de amonio a partir de arginina y manitol a partir de fructosa. &omposicin' <riptona Peptona $(tracto levadura 1lucosa -ructosa Suero de 0"K <Jeen K 4solucion al 8: pNp5 /")rginina )gua destilada 8g 8g 8g 8g # g # ml. % ml. Ig K ml.

),ustar a p? 8,8 empleando *cido fosfrico al 8 : vNv yNo hidr(ido pot*sico IM $sterili+ar a % atm durante %8 minutos "ota' $l suero de 0"K se prepara centrifugando el 0"K a A minutos. $l sobrenadante seria el suero g durante A

Se aade Q ml de este medio a un tubo de ensayo de %I(%8 mm en cuyo interior se encuentra una campanita @urham de Q,8(8 mm y autoclavar a % atm durante %8 minutos Siembra' /as bacterias se encontraban mantenidas en M>S suplementado con un un # : de +umo de man+ana a,ustado a p? 8,8. &on una pipeta estril se siembra el medio ?-) con ,% ml del cultivo bacteriano en fase de activo crecimiento Se incuba a ##" A F& hasta tres semanas Si son bacterias heterofermentativas aparecer* gas en la campanita

A#

.tra alternativa es aadir a la superficie del medio % cm de 0aspar fundido. $l vaspar es una me+cla de una parte de vaselina y I de parafina. Si son heterofermentativos el gas desprendido hace subir a la capa de vaspar 1.c #edio 9ro9uesto 9or EdIards ). Preparacin de los medios a. Me+clar y disolver siguientes ingredientes Peptona 8g $(tracto de levadura %,#8 g <Jeen K 4solucin al 8: pNp5 % ml 0erde de bromocresol 4solucin al %: pNp5 # ml Suero de +umo de tomate 8 ml )gua destilada # ml. ),ustar el p? del medio a 8,# con *cido fosfrico al 8 : vNv $l suero de +umo de tomate se prepara de la siguiente forma' ' &entrifugar #8 ml de +umo de tomate a A g durante A minutos y escoger el sobrenadante. $ste sobrenadante 4suero5 puede ser almacenado en pequeos vol2menes a "# G& hasta su empleo. $l +umo de tomate que hay que emplear es el obtenido a partir de tomates frescos o bien +umo de tomate comercial pero que no contenga preservativos ni se haya obtenido a partir de concentrado b. @ividir el medio en dos vol2menes de %#8 ml y aadir a un volumen %,#8 g de glucosa agitando para disolver el a+2car. Por tanto tendremos dos medios, uno con glucosa y otro sin glucosa. /a concentracin final de glucosa es apro(imadamente del ,8:pNv e(cluyendo la que pudiera tener el suero del +umo de tomate. &olocar estos dos medios en un bao Mara a !8"8 G&. c. )adir #,8 g de agar a #8 ml de agua destilada y disolverlo en el autoclave a %% G& durante % minutos. d. )adir %#8 ml de agar fundido que acabamos de preparar en cada uno de los dos medios e. @ispensar ambos medios en tubos de ensayo de %K ( %8 mm y esterili+arlos en el autoclave a %#% G& durante %8 minutos. B. Preparacin del agar que servir* como tapn a. Me+clar 8 g de agar en #8 ml de agua y disolverlo en el autoclave a %% G& durante % minutos. b. @istribuir 8 ml de este agar en tubos de ensayo de %I ( %#8 mm y esterili+arlos en el autoclave a %#% G& durante %8 minutos. 7na ve+ estril atemperarlos en bao Maria a !8"8 F& &. Preparacin del caldo basal. Peptona % g $(tracto de levadura #,8 g <Jeen K 4solucin al 8: pNp5 # ml )gua destilada K ml 7na ve+ disuelto aadir agua hasta % litro y a,ustar el p? a 8,# con *cido fosfrico al 8 : vNv y dispensarlo en frascos de % ml y esterili+arlos en el autoclave a %#%G& durante %8 minutos.

AA

@. Preparacin del inoculo a. =nocular una colonia en % ml de )>4)pple >ogosa o >ogosa +umo de mana+ana5e incubar durante siete das. b. &entrifugar a A g , eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento empleando una mnima cantidad de caldo basal ya estril. Zste seria el inculo $. Siembra. Sembrar los tubos de ensayo que contenan los dos medios, y que se encontraban a !8"8 F&, con ,% " ,8 ml de inculo. )gitar creando remolinos e inmediatamente enfriar en un bao de agua helada -. &reacin del tapn de agar &uando se encuentren completamente solidificados aadir el agar todava liquido para crear el tapn de agar. $ste tapn debe de tener una altura de 8 cm 1. $valuacin. =ncubar a #8F& durante #"A semanas Si son heterofermentativas subir* el tapn de agar en aquellos tubos que llevan el medio con glucosa $n el caso de que suba el tapn de agar en el medio que no contiene glucosa esto indica que el suero de +umo de tomate contena una elevada cantidad de a+2cares los cuales interfieren en el resultado. $n este caso reempla+ar el suero de +umo de tomate por ,# gNl de pantotenato calcico 1.d #RS Caldo Sembrar en un tubo de ensayo que contenga &aldo M>S con campana @urham. =ncubar a A F& durante !K horas 1.e #edio CST@Caldo de Tri9tona SoFaA. $n algunos cat*logos de casas comerciales, como por e,emplo MicroDit, este medio se denomina <SB4<ryptic Soy Broth5. /a cantidad de &.# producida a partir de la glucosa por las bacterias l*cticas heterofermentativas es muy pequea, por lo que para determinar su produccin se utili+ un procedimiento especial basado en el cultivo de las bacterias l*cticas seleccionadas en un medio bien tamponado. con contenido elevado de a+2car y cerrado con un tapn de agar bacteriolgico para atrapar el &. # formado. /as bacterias l*cticas se inoculan en tubos con caldo &S< modificado y se depositan # ml de agar bacteriolgico al ,O8: 4pNv5 en cada tubo. 7na ve+ solidificados los tapones, se incuban los tubos a A#F& durante A das. /a formacin de gas se detecta por el despla+amiento hacia arriba de los tapones de agar

&. !roducci:n de a$onio a 9artir de arginina. /as reacciones son las siguientes' )rginina M agua S /"citrulina M 3?A >eaccin catali+ada por la deiminasa

en+ima

/"citrulina M fosfato S /"ornitina M carbamil fosfato. >eaccin catali+ada por la ornitina transcarbamilasa &arbamil fosfato M )@P S )<P M &. # M 3?A. >eaccin catali+ado por la en+ima carbamato quinasa A!

0er =magen T Bacterias heterol*cticas amonio a partir de arginina U Por tanto si la bacteria tiene el equipo en+im*tico completo producir* por % mol de arginina # moles de 3?A y esto implica que por IgNl de arginina se producir*n %,%O gNl de 3?A. Si solo tiene la mitad del sistema en+im*tico dara solo % mol de 3?A por cada mol de arginina Podemos emplear uno de estos cuatro protocolos' ). Se pueden emplear uno de estos medios Primer medio M>S sin glucosa % ml )rginina ,A g Segundo medio &aldo arginina. $sta compuesto de &aldo )>4)pple >ogosa Broth5 con un ,I: de /"arginina. >epartir 8 ml del medio en tubos de ensayo y esterili+ar a %# durante # minutos. 7na ve+ fro inocularlo con la cepa a estudiar. =ncubar hasta que haya desarrollo abundante. &olocar ,8 ml de este medio ya incubado en un platillo de porcelana. )adir una gota de reactivo 3essler. Si se produce amonio aparecer* una coloracin naran,a ladrillo, amarillo oscuro . 7na ligera variante de este metodo consiste en transferir % ml del medio incubado a A#F& durante # das a un tubo de ensayo y aadir% ml de reactivo 3essler . /a hidrolisis de la arginina se manifiesta por el desarrollo de una coloracin marrn"anaran,ada y un precipitado $l reactivo 3essler esta disponible comercialmente B. Basado en el medio ?-) usado por Pilone pero sin fructosa %. )adir y disolver los siguientes ingredientes. <riptona 8g $(tracto de levadura 8g 1lucosa ,8 g )gua destilada K ml. 7na ve+ los ingredientes han sido disueltos aadir agua hasta % litro @ividir en dos vol2menes de 8 ml. ) uno de estos dos vol2menes aadirle %,8 g de hidrocloruro de arginina. ),ustar el p? de ambos vol2menes a 8,8 con *cido fosfrico al 8 :vNv o C.? IM Por tanto tendremos dos medios uno con arginina y otro sin arginina @ispensar ambos medios en tubos de ensayo de %K(%8 mm y autoclavar a %#% G& durante %8 minutos. #. Preparar el siguiente medio basal. Me+clar y disolver los siguientes ingredientes Peptona % g $(tracto de levadura #,8 g <Jeen K 4solucin al 8: pNp5 # ml )gua destilada K ml. 7na ve+ los ingredientes disueltos aadir agua hasta % litro y a,ustar el p? a 8,# con *cido fosfrico al 8 :vNv o C.? IM @istribuir en recipientes y autoclavarlos %#%G & durante %8 minutos. A. Preparacin del inculo. =nocular una colonia en % ml de )>4)pple >ogosa o >ogosa +umo de mana+ana5e incubar durante siete das.

A8

&entrifugar a A g, eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento empleando una mnima cantidad de medio basal ya estril. Zste seria el inculo =nocular en los tubos de ensayo a ra+n de ,%" ,# ml de inoculo por tubo de ensayo. <ambin aadiremos a tubos de ensayo ,%" ,# ml de medio basal sin inocular y estos seran los tubos testigo !. @eteccin de amonio. @espus de un periodo de incubacin de hasta tres semanas centrifugar # ml de los tubos inoculados tanto los que tienen como los que no tienen arginina. &olocar % ml de cada sedimento dentro de un platillo de porcelana blanco y aadir uno o dos gotas del reactivo 3essler. 0ariante' 7na ve+ que la observacin de gas es evidente o bien me,or despus de # semanas se aade a un platillo de porcelana % ml del medio y %"# gotas de reactivo 3essler. &omo en el caso anterior si aparece coloracin amarilla fuerte es que produce amonio C. #RS $odi/icado Sin e(tracto de carne y con arginina .A: JNv[ citrato de sodio .# :[ y glucosa . 8: @espus de cinco das de incubacin se agregaron cinco gotas del reactivo de 3essler para detectar la presencia de amonio . #edio base de descarboCilasa de #oeller Se siembra y se incuban a A#F& durante A das. -inali+ada la incubacin, la hidrlisis de la arginina se manifiesta por la aparicin de una coloracin viol*cea en los medios de cultivo. $l umbral de deteccin del 3?A por parte del reactivo 3essler esta algo por encima de ,AgNl . ) un nivel de ,IgNl de 3?A el reactivo 3essler lo detecta siempre. /a ra+n es que cuanto menos 3?A haya la coloracin tiende hacia el amarillo p*lido y se confunde con el propio color ambarino del medio ?-). $n agua la sensibilidad del reactivo 3essler es mayor ya que detecta 3?A a partir de . %# gNl Co$entarios' $sta prueba la utili+a Singleton para diferenciar los oenococos de los lactobacilos heterofermentativos productores de @"/*ctico y con forma de bacilos cortos. Pero la utilidad de esta prueba esta puesta en duda y para algunos no tiene valor ya que seg2n el medio que se emplee pueden variar los resultados. Por e,emplo cuando se emple el medio ?-) el OI: de las cepas de oenococos estudiadas produ,eron amonio y en teora los oenococos no lo producen. /a ra+n pudiera ser en que se han empleado IgNl de arginina en ve+ de AgNl lo cual es lo m*s habitualW. Si una cepa de oenococo tuviera activa la deiminasa dara por cada mol de arginina % mol de 3?A o lo que es lo mismo para IgNl de arginina dara ,I gNl de 3? A. $sta concentracin de 3?A si es detectada por el reactivo 3essler. $n cambio si hubiramos empleado un medio con AgNl de arginina esta cepa dara ,AgNl de 3? A y ya no seria detectable por el reactivo 3essler >esumiendo la sensibilidad de este test es ba,a y usando mayores niveles de arginina un n2mero significativo de oenococos dan resultados positivos W /a ra+n de emplear IgNl de arginina y no A gNl es que pudiera ser que algunos lactobacilos heterofermentativos tuvieran solo la deiminasa con lo que empleando A gNl el reactivo nessler no lo detectara. Pero como he comentado anteriormente esto trae el inconveniente de que pudiera ser que algunos .enococos tambin solo tuviera la deiminasa con lo que habra errores en la identificacin.

AI

'. eter$inaci:n iso$rica del Kcido lKctico a 9artir de glucosa% Se hace mediante an*lisis en+im*tico empleando especificas /" y @" lactato deshidrogenasas /os isomeros del *cido l*ctico sinteti+ado a partir de glucosa es especifico de las especies. )s .enococcus produce solo @"l*ctico, Pediococcus produce /" o @/" l*ctico y los lactobacillus @", /" o @/"l*ctico seg2n las especies Si es a partir del m*lico todas las especies producen /"lactico %. Me+clar ,8 g de e(tracto de hgado con 8 ml de agua destilada durante al menos A minutos. -iltrar la suspensin a travs de un papel de filtro Xhatman nF %. #. Me+clar y disolver los siguientes ingredientes. <riptona % g Peptona #,8 g $(tracto de levadura #,8 g <Jeen K 4solucin al 8: pNp5 ,8 )gua destilada !8 ml A. )adir el e(tracto de hgado al medio y a,ustar el p? a 8,8 con *cido fosfrico al 8 : vNv o con C.? I M !. @ividir el medio en dos vol2menes iguales de #8 ml y esterili+arlos en el autoclave a %#% G& durante %8 minutos. 8. )l primer volumen aadirle % ml de una solucin de glucosa al 8: pNv esterili+ada por filtracin con membrana de ,!8 micras. Por tanto tendremos dos medios uno con glucosa y otro sin ella I. @ispensar los dos medios en tubos de ensayo de %K( %8 mm a ra+n de % ml por tubo de ensayo. O. /os controles y tratamiento son los siguientes' &ontrol %' Medio sin glucosa 4<ubo )5 &ontrol #' Medio con glucosa4<ubo B5 &ontrol A' Medio sin glucosa inoculado con la bacteria a estudiar 4<ubo &5 &ontrol !' Medio con glucosa inoculado con la bacteria a estudiar 4<ubo @5 K. Preparacin del inculo. a. Sembrar en % ml de )>4)pple >ogosa5 e incubar durante siete das a #8 G&. b. )l cabo de ese tiempo centrifugar el cultivo a A g durante A minutos. c. $liminar aspticamente el sobrenadante y suspender el sedimento en % ml de solucin amortiguadora. $sta solucin amortiguadora se prepara disolviendo en un % litro de agua #,O% g de 3a? #P.! y K,%# g de 3a#?P.!.O?#. d. >ecentrifugar, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en peptona al ,%: pNv. Q. =nocular los tubos & y @ con % ml de este inculo. % . ) los tubos )y B se les aade % ml de la solucin de peptona al ,%: pNv. %%. =ncubar por un perodo de tiempo superior a dos semanas antes de determinar los ismeros de *cido l*ctico producidos a partir de glucosa. AO

%#. /a determinacin de los ismeros de *cido l*ctico se hace por mtodos en+im*ticos asociados a un espectrofotmetro. &oncentracin de @ o /"l*ctico ; \ <ubo @ H 4<ubo ) M <ubo B5] H \<ubo & H 4<ubo ) M <ubo B5] 3ota' )ltas concentraciones de *cido l*ctico sea cual sea su forma isomrica en los tubos ) o B indica contaminacin u otro problema con el an*lisis ). eter$inaci:n de la /or$aci:n de $anitol a 9artir de /ructosa %. Preparar caldo ?-) #. @ispensar Q ml de este medio en tubos de ensayo de %K(%8 esterili+ar en autoclave a %#%F& durante %8 minutos mm y

A. Preparacin del inculo y siembra Sembrar en caldo )>4)pple >ogosa5. . &uando estn en fase de crecimiento activo transferir ,% ml por tubo de ensayo !. =ncubar a ##"A F& hasta A semanas o cuando se observe la produccin de gas 8. 7na ve+ incubado se colocan K ml del medio en una placa Petri de pl*stico de Q mm y abierta. Se de,a a AOF& durante #"A das para que se deseque. )l cabo de este tiempo tiene una consistencia pega,osa y luego se de,a a temperatura ambiente4seg2n -ugelsang a #8F&5durante #"A das m*s para permitir eventualmente que se formen los cristales de manitol. $s imperativo seguir este protocolo de desecacin. I. Si las bacterias han formado manitol este se aprecia visualmente por la aparicin de cristales en forma de roseta Se emplea para corroborar que son bacterias heterofermentativas ya que las bacterias homofermentativas no producen manitol, aunque algunas pocas cepas de bacterias homofermentativas pueden producir pequeas cantidades de manitol

+. A!I +D C2. SISTE#A E I E"TI,ICACIO" E LACTOBACILOS a. Introducci:n /as galeras )P= 8 &? en combinacin con el )P= 8 &?/ Medium permite la identificacin de /actobacillus en base a ensayos de fermentacin de !Q diferentes carbohidratos y derivados4hetersidos, polialcoholes, *cidos urnicos5 &ada galera )P= 8 &? est* constituida por 8 filas conteniendo cada una % tubos numerados. /a composicin de cada uno de estos 8 microtubos viene detallada a continuacin.

AK

AQ

/as galeras se conservan a #"KF& hasta la fecha lmite de utili+acin indicada en el envase. /a composicin del )P= 8 &?/ Medium, necesario para la preparacin del inculo, es la siguiente'

b. !rinci9io Se pone en suspensin el microorganismo a estudiar en el medio y despus se inocula en cada tubo de la galera. @urante la incubacin, el catabolismo de los gl2cidos en anaerobiosis produce *cidos org*nicos que hacen virar el indicador del p?. $l primer tubo, sin principio activo, sirve como testigo negativo. /os resultados obtenidos constituyen el perfil bioqumico y permiten la identificacin del microorganismo con la ayuda de un programa inform*tico de identificacin llamado )piXeb, disponible 2nicamente en =nternet, al cual se accede previo pago de una licencia anual. c. #odo de e$9leo c.1 !re9araci:n de las galeras >epartir unos % ml de agua destilada o desminerali+ada en los alveolos del fondo de la c*mara de incubacin que viene incluida en el Dit, para crear una atmsfera h2meda. &olocar las filas de la galera en el fondo de la c*mara de incubacin. c.& !re9araci:n del in:culo &ultivar la bacteria a identificar durante #! horas en medio M>S )gar en condiciones de anaerobiosis a A F& )brir una ampolla de )P= Suspension Medium de # ml40er nota5 o utili+ar un tubo que contenga agua destilada estril sin aditivos. <omar todas las colonias del cultivo con la ayuda de un escobilln. >eali+ar una suspensin densa 4S5 en la ampolla. )brir una ampolla de )P= Suspension Medium de 8 ml40er nota5 >eali+ar una suspensin de turbide+ igual al patrn # de Mc-arland transfiriendo un cierto n2mero de gotas de la suspensin S' anotar dicho n2mero de gotas 4n5. )brir una ampolla de )P= 8 &?/ Medium40er nota5 e inocular con # veces el n2mero de gotas citadas 4es decir #n5. $sta suspensin debe utili+arse de inmediato. ?omogenei+ar. "ota%

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)ntes de su utili+acin, permitir que los medios contenidos en las ampollas alcancen la temperatura ambiente. )brir las ampollas del modo siguiente' =ntroducir la ampolla en el protege"ampollas. Su,etar verticalmente el con,unto en una mano 4tapn blanco hacia arriba5. $,ercer una presin hori+ontal con el pulgar sobre la parte estriada del tapn, para romper el e(tremo de la ampolla. >etirar la ampolla del protege"ampollas y conservarlo para un pr(imo uso. >etirar el tapn con cuidado.

c.' Inoculaci:n de la galera >epartir el )P= 8 &?/ Medium as inoculado slo en los tubos, no en las c2pulas, y con la ayuda de una pipeta estril. $vitar la formacin de burbu,as apoyando la punta de la pipeta en el borde de la c2pula Procurar no rebasar el lmite superior de los tubos con el fin de conservar una buena anaerobiosis. >ecubrir los ensayos con aceite de parafina para crear condiciones de anaerobiosis =ncubar a #QG& ^#G& AIG& ^#G&, en durante !K horas 4^ I horas5. d. Lectura e Inter9retaci:n d.1 Lectura de las galeras /a lectura de las galeras se reali+a una ve+ transcurrido las !K horas de incubacin $n cada tubo se investiga la acidificacin producida, que se traduce por el cambio de color a amarillo del p2rpura de bromocresol contenido en el medio. $n el ensayo de esculina 4tubo nG #85 se observa un vira,e de color de p2rpura a negro. )notar los resultados en la ho,a de resultados. d.& Inter9retaci:n $l perfil bioqumico as constituido sirve para la identificacin de los Lactobacillus con la ayuda del programa inform*tico de identificacin )piXeb

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