REACTOR ANAHEROBIO RAFAEL CASTILLO BONILLA LIC.

EN INGERNIERIA EN ECOLOGIA UNIVERSIDAD PARA EL DESARROLLO DEL ESTADO

La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicas asociadas al principio de retencin selectiva. Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Posee: Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico). Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase mvil. Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. La cromatografa engloba a un conjunto de tcnicas basadas en la separacin de los componentes de una mezcla y su posterior deteccin. Tipos de cromatografa La cromatografa puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. As la cromatografa puede ser de (1) adsorcin, (2) particin, (3) intercambio inico, (4) exclusin, y (5) afinidad. 1. Cromatografa de adsorcin La fase estacionaria es un slido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase mvil puede ser un lquido (cromatografa lquido-slido) o un gas (cromatografa gas-slido); los componentes se distribuyen entre dos fases a travs de la combinacin de los procesos de adsorcin y desorcin. La cromatografa de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografa por adsorcin en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte slido en un plato inerte. 2. Cromatografa de particin La fase estacionaria de la cromatografa de particin es un lquido soportado en un slido inerte. Otra vez, la fase mvil puede ser un lquido (cromatografa de particin lquidolquido) o un gas (cromatografa de particin gas-lquido, GLC). La cromatografa en papel es un tipo de cromatografa de particin en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel.

La cromatografa de gases es la tcnica a elegir para la separacin de compuestos orgnicos e inorgnicos trmicamente estables y voltiles. La disponibilidad de detectores verstiles y especficos, y la posibilidad de acoplar el cromatgrafo de gases a un espectro de masas o a un espectrofotmetro de infrarrojo, amplan an ms la utilidad de la cromatografa de gases. Un cromatgrafo de gases consiste en varios mdulos bsicos ensamblados para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase mvil), 2) permitir la introduccin de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme efluyen de la columna, y 6) proveer una seal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Slo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografa de gases, ya sea porque son insuficientemente voltiles y no pasan a travs de la columna, o porque son trmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separacin. La cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra con ambas fases, mvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase mvil para la cromatografa de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin. El recobro de la muestra es fcil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente cuantitativo (exceptuando la adsorcin irreversible en la columna) y los componentes separados son fcilmente asilados del disolvente de la fase mvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgnicos, la cromatografa lquida en columna puede manejar separaciones de compuestos inicos, productos lbiles de origen natural, materiales polimricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular. En el modo normal de operaciones de particin lquido-lquido, una fase estacionaria polar (p. ej. agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la retencin de compuestos polares y la elusin de compuestos no polares y se le conoce como cromatografa fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase mvil polar, entonces los

solutos no polares sern retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como cromatografa por fase reversa. El mecanismo de separacin en cromatografa de fase reversa depende de interacciones hidrofbicas entre las molculas de soluto en la fase mvil y el ligando hidrofbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unin hidrofbica asume que la interaccin de unin es el resultado de un efecto entrpico favorable. Las condiciones iniciales de unin de la fase mvil usadas en la cromatografa de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las molculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofbico inmovilizado disminuye el rea hidrofbica expuesta hacia el disolvente. As, el grado de organizacin de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropa en el sistema. 3. Cromatografa de intercambio inico La separacin en la cromatografa de intercambio inico depende la adsorcin reversible de molculas de soluto cargadas, a una resina con grupos inicos de carga opuesta. El mecanismo de separacin se basa en un equilibrio de intercambio inico. Muchos de los experimento de intercambio inico se llevan a cabo en cinco etapas. La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador inico se encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza inica, lo que permitir la unin de las molculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarn estn asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio). En una segunda etapa se encuentra la aplicacin de la muestra y su adsorcin, en la cual las molculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contraiones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eludas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial. En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorcin de la muestra cambiando las condiciones de elusin, al desfavorecer la formacin del enlace inico de las molculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza inica del buffer de elusin o cambiando su pH. En la cuarta y quinta etapas corresponden a la remocin de sustancia no eludas bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificacin. La separacin de diferentes sustancias se lleva a cabo porque stas tienen diferentes grados interaccin con el intercambiador inico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza inica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos biolgicos son a menudo considerables, y tomando

en cuenta que la cromatografa de intercambio inico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes. Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio inico en una columna, mediante un procedimiento en lote o por adsorcin en cama extendida. La matriz Un intercambiador inico consiste de una matriz slida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones mviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz. La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contraiones tambin. Los intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aninicos. Intercambiadores cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores catinicos. La matriz puede estar hecha de compuestos inorgnicos, resinas sintticas o polisacridos. Las caractersticas de la matriz determinan sus propiedades cromatogrficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperacin, as como su estabilidad qumica, fuerza mecnica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectar su comportamiento hacia sustancias biolgicas y el mantenimiento de la actividad biolgica.

BIBLIOGRAFIA Instituto de biotecnologa, UNAM, Cromatografa, Curso de mtodos, Romero Garca Aida Susana.