Determinacin del contenido de fenoles totales Los mtodos tradicionales para la determinacin del contenido total de fenoles se basan

en la medicin directa de la absorcin de radiacin electromagntica ya sea en la regin ultravioleta o en la regin visible-infraroja cercana. Entre estos ltimos el ms comnmente empleado es el ensayo colorimtrico que utiliza el reactivo Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). Para calcular el contenido total de fenoles, se usan curvas de calibracin obtenidas con la eleccin de un determinado compuesto fenlico como estndar. Los resultados son expresados en trminos de equivalentes molares del compuesto fenlico que es el ms abundante en la muestra de origen vegetal analizada (Antolovich et al, 2000). Por ejemplo, como estndar se ha utilizado cido glico (Alonso et al, 2002; Atoui, 1999; Cadaha et al, 1998; Donovan et al, 1998, Emmons y Peterson, 1999, Fernndez de Simn et al, 1996; Fogliano et al, 1999; Khknen et al,1999; Khknen et al, 2001; Lando y Meyer, 2001; Meyer et al, 1998; Mozetic et al, 2002; Singleton y Rossi, 1965; von Gadow et al, 1997; Wolfe y Liu, 2003; Yu et al, 2004; Zheng y Wang, 2001), catequina (Balasinska y Troszynska, 1998; Duh y Yen, 1995; Fitzpatrick et al, 2000; Gamez-Meza et al, 1999; Murthy et al, 2002; Yen y duh, 1994; Zielinski y Kozlowska, 2000), quercetina (Conde et al, 1997), cido tnico (Larraurri et al, 1997; Lee et al, 2003; Singh et al, 2002), cido clorognico (Moure et al, 2000) y cido trans-sinpico (Amarowich et al, 2000). El cido glico, cido 3,4,5-trihidroxibenzico (C7H6O5), ha sido extensamente usado como estndar en la determinacin de compuestos fenlicos de diversas muestras de origen vegetal. Con el objeto de facilitar la comparacin del contenido de fenoles en distintas muestras de residuos slidos del procesamiento de bayas, manzanas, apio, pimentn y raps se emplear el cido glico, como nico estndar, por ser ste un compuesto monomrico abundantemente distribuido en el reino el vegetal. Adems, esta eleccin se justifica por la elevada pureza, satisfactoria solubilidad, adecuada estabilidad y bajo precio del cido glico (Chun y Kim, 2004). Procedimiento:. 1. Se colocan 3.75 ml de agua destilada en un tubo de ensayo 2. Se adicionan 0.5 ml de la muestra que contiene el compuesto fenlico, previamente diluido en metanol ( en el solvente en que se encuentre la muestra). 3. Se agregan 0.25 ml del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 2 veces con agua destilada. 4. Se homogeneiza y se adicionan 0.5 ml de una solucin de Carbonato de sodio 10% p/v 5. Se espera 1 hora a temperatura ambiente 6. Se realiza un blanco mediante el mismo procedimiento, reemplazando la muestra por el solvente. 7. Se mide la absorbancia de las muestras, a 765 nm.

Entonces, el contenido de fenoles totales en la muestra se determina interpolando el resultado en la curva patrn de absorbancia en funcin de la concentracin de cido glico. Evaluacin de la actividad antioxidante La actividad antioxidante de los extractos obtenidos a partir de desechos agroindustriales del procesamiento de bayas, manzanas, pimentn, apio y raps se evaluar por tres diferentes mrodos; dos destinados a evaluar la capacidad secuestradora de radicales libres y uno que analiza la capacidad para minimizar la prdida de -caroteno en un sistema de emulsin acuosa de cido linolico/ -caroteno. Mtodo de captacin del radical DPPH Se seguir el protocolo de anlisis propuesto por von Gadow et al, 1997. Procedimiento: 1. Se prepara una disolucin del radical DPPH de concentracin 3,610-5 M en metanol. 2. Se mide su absorbancia a 515 nm (At=o) 3. Se coloca en un tubo de ensayo una alcuota de 2 ml de esa solucin. 4. Se aaden 50 l de una disolucin en metanol de la muestra a analizar (extracto antioxidante) y se homogeniza bien la mezcla. 5. Se mide la absorbancia del ensayo luego de 16 minutos (A t=16), contra blanco del solvente orgnico Entonces, el porcentaje de inhibicin (PI) se calcula como:

PI

Absorbancia t 0 min - Absorbancia t 16 min Absorbancia t 0 min

100

Mtodo de captacin del radical ABTS Se seguir el protocolo de anlisis propuesto por Re et al, 1999. Procedimiento: 1. Se prepara una solucin stock de ABTS a una concentracin de 7 mM. 2. Se genera el radical catin ABTS (ABTS +) por la reaccin de la solucin stock de ABTS con persurfato de potasio a una concentracin de 2.45 mM. 3. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente y protegida de la luz por 12 16 h antes de su uso. 4. Se diluye la solucin de ABTS + con etanol hasta obtener una abosrbsancia de 0.700 ( 0.020) a 734 nm y se equilibra a 30C.

5. Se mezcla 1 ml de solucin de ABTS + diluda (A734nm = 0.700 0.020) con 10 l de muestra a analizar. 6. Se monitorea la absorbancia durante 6 minutos. El descenso de la absorbancia despus de los 6 minutos se emplea para calcular el valor TEAC.

4.2.3.3 FRAP (Poder antioxidante o de reduccin del hierro)

Este mtodo se basa en reacciones de transferencia de electrones. En l se usa como reactivo una sal frrica, Fe(III)(TPTZ)2Cl3 (TPTZ =2,4,6-trripiril-s-triazina). El poder reductor de esta sal de Fe(III) (0.7 V)es comparable al radical ABTS (=.68 V) Por lo tanto, esencialmente, no hay muchas diferencias entre el anlisi ABTS y el FRAP, excepto que el ABTS se realiza a pH neutro y el FRAP en condiciones de pH cido (pH 3.6), para mantener la solubilidad inica (la reaccin a pH cido reduce el potencial de ionizacin que conduce la transferencia electrnica e incrementa el potencial redox, causando un cambio en el mecanismo dominante de la reaccin).

El reactivo FRAP se prepara con una mezcla de TPTZ en HCl, tampn acetato y FeCl 3*6 H2O. La solucin final tiene 1.67 mM de Fe (III) y 0.83 mM de TPTZ. La concentracin de TPTZ es deficiente ya que la reaccin estequiomtrca ideal entre Fe (III) y TPTZ es 1 a 2.Las sustancias antioxidantes sufren una reaccin de oxidacin en medio cido, durante la cual el Fe+3 se reduce a Fe+2. El complejo (Fe(II)TPTZ2)+2 es de color azul intenso y se determina colorimtricamente a 593 nm.

Realizando el protocolo de anlisis propuesto por Benzie y Strain, 1996

Procedimiento: 1. Se prepara tampn acetato 300 mM pH 3.6 2. Se prepara una disolucin 10 mM de TPTZ en 40 mM de HCl 3. Se prepara una disolucin 20 mM de FeCl3*6 H2O 4. Se combinan el tampn acetato y las disoluciones 10 mM de TPTZ en 40 mM de HCl y 20 mM de FeCl3*6 H2O en proporcin 10:1:1 para obtener el reactivo FRAP. 5. Se mide la absorbancia inicial del reactivo a 593 nm. 6. Se colocan 3.0 mL del reactivo FRAP en un tubo de ensayo.

7. Se adicionan 0.1 mL de la muestra que contiene el compuesto fenlico, previamente diluida en metanol (o en solvente en que se encuentra la muestra). 7. Se realiza un blanco mediante el mismo procedimiento, reemplazando la muestra por agua 8. Se lee la absorbancia de las muestras luego de 6 minutos a temperatura ambiente a 593 nm. Entonces, el poder antioxidante o de reduccin del hierro de las muestras se determina interpolando el resultado en la curva patrn de absorbancia en funcin de la concentracin de cido ascrbico.