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Soumis le : 28 Mars 2011 Forme rvise accepte le : 09 Janvier 2012 Email de l'auteur correspondant : djenane5@yahoo.fr

Nature & Technologie

Utilisation des composs de feuilles dolivier comme agents antimicrobiens; application pour la conservation de la viande frache de dinde
Djamal DJENANE1, Javier YANGELA2, Fariza DERRICHE1, Lydia BOUARAB1, Pedro RONCALES2
1

Facult des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques. Dpartement de Biochimie et de Microbiologie. Universit Mouloud Mammeri. BP 17, 15000-Tizi-Ouzou, Algrie.
2

Facult Vtrinaire. Dpartement de Production Animale et Science des Aliments. Universit de Zaragoza. C/Miguel Servet, 177, 50013-Zaragoza. Espagne

Rsum Des extraits de feuilles dolivier de la varit azerradj sont prpars et leffet antimicrobien de ces composs est dtermin par la mthode de diffusion sur glose vis--vis de trois souches bactriennes: Staphylococcus aureus (S. aureus), Salmonella enterica srotype Enteritidis (S. Enteritidis) et Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ces composs se sont rvls trs actifs contre lensemble des bactries testes. Cependant, une forte activit de lextrait polyphnolique vis--vis de S. aureus (diamtre dinhibition=30,18 mm) est enregistre. Lactivit antimicrobienne de ces extraits est confirme par la mthode de microdilution (Concentrations Minimales Inhibitrices: CMIs). Les mmes extraits sont additionns des escalopes fraches de dinde qui sont exprimentalement inocules avec les mmes bactries cibles une charge initiale de 2105 ufc/g. Tous les chantillons de viande sont stocks lair libre 82 C pendant 7 jours en simulant les conditions pratiques relles en Algrie. Les rsultats obtenus ont montr que les extraits de feuilles dolivier appliqus sur la viande ont exerc une remarquable activit antimicrobienne durant toute la phase de stockage du produit. Lanalyse sensorielle a rvl aussi que lajout de ces extraits sur la viande naffecte pas ngativement lodeur de cette dernire. Les rsultats obtenus sont trs encourageants et ouvrent une voie prometteuse pour lutilisation des feuilles dolivier comme agents antimicrobiens naturels pour la prservation des viandes.
Mots cls : Feuilles olivier, Extrait brut, Pathognes, CMIs, Activit antibactrienne, Dinde

Abstract In this study, an aqueous crude extract and oleuropein were obtained from the leaves of the azerradj variety of olive tree. The antimicrobial effect of these compounds has been determined via the diffusion method on agar, against three common pathogenic bacterial strains: Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis and Pseudomonas aeruginosa. These compounds have proven to be very active against all of the bacteria tested. However, oleuropein has demonstrated a much greater activity against Staphylococcus aureus (inhibition diameter = 30.18 mm). The antimicrobial activity of these two compounds was confirmed by the microdilution method (Minimum Inhibitory Concentrations: MICs). The same compounds have been added to fresh turkey escalopes that have been experimentally inoculated with the same target bacteria, at an initial load of approximately 2105 cfu/g. All samples of meat were stored in the open air at 8 2 C for 7 days, simulating the real-life storage conditions in Algeria. The results demonstrated that the two compounds exhibited remarkable antimicrobial activity throughout the whole storage phase. However, oleuropein showed bactericidal activity against Staphylococcus aureus. Sensory analysis revealed that the smell of the meat with these compounds added remained acceptable at the threshold antimicrobial concentration used. The results obtained are very encouraging and it can be suggested that the leaves from the olive tree contain compounds that have significant antimicrobial properties, which can be applied to use in the meat industry. Thus, we have proposed that the leaves of the olive tree can be exploited in order to control pathogenic bacteria in fresh turkey meat.
Keywords : Olive tree leaves, Crude extract, Oleuropein, Pathogens, MICs, Antimicrobial activity, Turkey

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2. Matriel et mthodes 1. Introduction 2.1. Matriel vgtal Lolivier (Olea europaea L.) est une espce largement cultive dans le bassin mditerranen depuis la plus haute antiquit. Lutilisation la plus connue de lolivier est sans nul doute la production de lhuile dolive utilise des fins alimentaires, cosmtiques et thrapeutiques. Par ailleurs, les proprits mdicinales de lolivier sont galement attribues ses feuilles qui font aujourdhui lobjet de nombreuses recherches scientifiques. En effet, lutilisation des feuilles dolivier en phytothrapie remonte trs loin dans lhistoire. Lolivier est considr donc comme tant une plante aromatique et mdicinale, rservoir de composs naturels aux effets bnfiques. Certains composs identifis dans les extraits de feuilles, tels que les composs phnoliques sont dous dactivits biologiques extrmement importantes [5]. Les recherches ralises "in vitro" par plusieurs auteurs [7] [32] ont dmontr que les polyphnols sont les principaux composs antimicrobiens des plantes, ayant des modes daction divers et des activits inhibitrices et ltales vis-vis de nombreux microorganismes. Loleuropine des feuilles dolivier est le principal compos antimicrobien. Il prsente une activit antimicrobienne suprieure par rapport dautres substances testes [5] [32]. Malgr lexistence de plusieurs travaux raliss "in vitro" sur lactivit antimicrobienne des extraits de feuilles dolivier et leurs composs, le nombre de travaux publis concernant une application des ces composs sur des aliments reste ngligeable [9]. Lobjectif de ce travail est de mettre en vidence lactivit antibactrienne des extraits de feuilles dolivier appliqus sur la viande de dinde stocke 82C. Des feuilles fraches dolivier azerradj, varit cultive en Algrie et en particulier dans la rgion de Tizi-Ouzou sont cueillies en pleine priode de floraison (Mars-Avril 2010) dans la rgion de Boghni (Tizi-Ouzou) une altitude de 400 m du niveau de la mer. La collecte des feuilles tait effectue le matin, juste aprs vaporation de la rose. Aprs rcolte, les feuilles taient transportes au laboratoire puis intensment nettoyes avec de leau distille 20 C, gouttes laide dun tamis et sches temprature ambiante lair libre et labri de la lumire. 2.2. Extrait brut des feuilles dolivier Les feuilles sont broyes dans un mixeur (Blender 8011E, Model 38 BL 41). 100 g de broyat sont additionns 900 ml deau chaude (45C) de faon obtenir une concentration de 10% (p/v). Linfusion est laisse reposer pendant 24 h lobscurit et temprature ambiante. Aprs agitation laide dun agitateur magntique, deux filtrations successives sont effectues sur papier Wattman n1. Une solution aqueuse dextrait brut est donc obtenue. Celle-ci est conserve en rfrigration dans un flacon hermtique labri de la lumire et de lO2. 2.3. Extrait des Polyphnols Lextraction des polyphnols est ralise selon la mthode dAkowuah et ses collaborateurs [1]. La premire tape dextraction est celle dcrite prcdemment pour lobtention dun extrait brut de feuilles dolivier sur laquelle une deuxime tape dextraction est applique pour lobtention dun extrait polyphnolique. Pour cela, une phase de dpigmentation est ralise pour liminer les traces de pigments. La solution dpigmente obtenue est purifie. Les traces dH2O et des solvants utiliss durant les diffrentes tapes sont limins respectivement laide de sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) et par vaporation sous vide 30 C. Lextrait phnolique ainsi obtenu est conserv dans les mmes conditions dcrites prcdemment pour lextrait brut. 2.4. Activit Antibactrienne 2.4.1. Souches bactriennes et conditions de culture Les souches S. enterica srotype Enteritidis, P. aeruginosa (Gram ngative) et S. aureus (Gram positive) sont utilises dans cette tude. Les souches Gram

Figure 1. Structure chimique de loleuropine, compos majeur de lextrait de feuille dolivier [9]

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ngative sont dorigine clinique (isoles et identifies par le Service de Bactriologie, CHU Mohamed Nadir de Tizi-Ouzou), par contre S. aureus est dorigine alimentaire (isole et identifie par le Centre Vtrinaire Rgional de Dra Ben Khedda Tizi-Ouzou). Toutes ces souches bactriennes sont identifies et confirmes lorigine selon des mthodes normalises (ISO). ISO 6888-2 pour S. aureus, ISO 16266 pour P. aeruginosa et ISO 6579-2002 pour S. Enteritidis. Les souches bactriennes sont cultives pendant 12 h 37 C dans un milieu glos Mueller Hinton (MHA, Oxoid, Basingstoke, UK). Deux ensemencements successifs sont raliss pendant 24 h 371C dans des tubes contenant 9 ml de Bouillon Infusion Cur-Cervelle (BHIB; Oxoid, Basingstoke, UK). Aprs 24 h, 100 l de la suspension bactrienne sont ensemencs dans un bouillon BHI puis incubs 371 C pendant 12 heures pour obtenir une suspension bactrienne frache contenant approximativement une concentration de 2-3105 ufc/ml, dtermine laide de la mesure de transmittance 600 nm (Spectro-photomtre Spectronic 20 Bausch & Lomb). Les souches taient conserves dans un milieu cryoprotecteur - 80C. Plusieurs revivifications sont ralises avant chaque test. 2.4.2. Test de diffusion sur glose Lvaluation de lactivit antibactrienne des composs de feuilles dolivier est dtermine par la technique de diffusion sur glose dcrite par Djenane et ses collaborateurs et Hazzit et ses collaborateurs [13] [17]. Des boites de Ptri contenant 15 ml du milieu glos Mueller Hinton en surfusion taient places dans une hte flux laminaire vertical une temprature de 25 C/30 minutes jusqu' solidification du milieu. 0,1 ml de la solution standardise dinoculum (2-3105 ufc/ml) est vers dans chaque boite puis uniformment rparti. Toutes les boites sont laisses scher pendant 5 minutes. Des disques striles en papier (6 mm de diamtre, Filter LAB ANOIA, Barcelona, Espagne) sont imprgns respectivement avec 5 l de des deux extraits laide dune micropipette capillaire (Finnpipette, Thermo Fischer Scientific Inc.). Les boites de Ptri taient maintenues pendant 15 min une temprature de 25 C puis incubes 37 C/24h. Lactivit antibactrienne est apprcie par la mesure laide dun pied coulisse (Wiha dialMax ESD-Uhrmessschieber, CH) des diamtres des zones dinhibition (mm) formes autour des disques. La sensibilit des bactries cibles envers les diffrents composs est classe selon les diamtres des halos dinhibition [27]: <8 mm: bactrie non sensible; 9<<14 mm: bactrie sensible; 15<<19 mm: bactrie trs sensible et >20 mm: bactrie extrmement sensible. Un traitement avec leau est utilis comme tmoin ngatif. Un antibiotique de rfrence, le chloramphnicol (10 g/disque), est utilis comme tmoin positif. Chaque essai est rpt trois fois.

2.4.3. Concentration minimale inhibitrice: test de microdilution Les CMIs sont aussi dtermines vis--vis des bactries cibles. Linoculum de chaque bactrie teste est obtenu partir dune prculture de 12 h dincubation, la charge microbienne tait ajuste 5103 ufc/ml laide dune turbidit standard 0,5 McFarland. Des dilutions en srie sont prpares dans une gamme de concentration de 32 0,3125 l/ml dans des tubes essai striles contenant de bouillon MH. Les CMIs des diffrents composs vis--vis des souches bactriennes sont dtermines par la mthode de microdilutions en puits. Des plaques contenant 96 puits (Iwaki brand, Asahi Techno Glass, Japan) sont prpares en distribuant dans chaque puits 95 l de bouillon MH et 5 l dinoculum. 100 l de chaque solution dextrait prpar pralablement des concentrations de 320,3125 l/ml sont verss dans les premiers puits de chaque plaque. 100 l de chaque dilution en sries sont transfrs dans les puits successifs. Les derniers puits contenant uniquement 195 l de bouillon MH et 5 l dinoculum taient utiliss comme tmoins ngatifs. Le volume final de chaque puit tait de 200 l. Le chloramphnicol, un antibiotique standard, est utilis comme tmoin positif. Des concentrations de 32 0,3125 l/ml sont prpares dans le bouillon MH. La mme dmarche cite ci dessus est adopte. Tous les contenus des puits sont homogniss (300 rpm/20s). Les plaques sont incubes sous agitation 37C/1824h. Aprs incubation, tous les puits sont examins et la CMI (%: v/v) est dtermine en prenant en compte la plus faible concentration en extrait qui inhibe tout dveloppement bactrien (absence de turbidit). LH2O distille strile est utilise comme tmoin ngatif. Chaque test est rpt deux fois. 2.5. Application des extraits de feuilles dolivier sur la viande de dinde 2.5.1. Prparation de la viande Des escalopes de dinde (Pectoralis major: pH initial 5,7; 24 h post-mortem) sont achetes chez un boucher local dans la ville de Tizi-Ouzou (Algrie) puis transportes dans une enceinte rfrigre (31C) au Laboratoire Rgional Vtrinaire de Dra Ben Khedda (Tizi-Ouzou) dans les 30 mn qui ont suivi lachat. 2.5.2. Inoculation de la viande par des souches bactriennes Avant inoculation avec les diffrentes souches bactriennes et laddition des diffrents extraits de feuilles dolivier, les escalopes sont aussi pralablement analyses pour dterminer une ventuelle prsence de bactries

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testes ainsi que la dtermination de la charge bactrienne initiale (flore arobie totale) (rsultats non prsents). Pour valuer leffet antimicrobien des diffrents composs de feuilles dolivier, plusieurs escalopes de dinde sont prpares selon les bonnes pratiques de manipulation. Au total, 54 escalopes sont prpares (2 escalopes/chantillon). Les escalopes du premier groupe (18505g) taient places dans des sachets striles individuels Stomacher, puis inocules avec S. aureus (5103 ufc/g). Le deuxime et le troisime groupe 2(18505g) dchantillons descalopes sont prpares de la mme manire, puis inocules respectivement avec P. aeruginosa et S. Enteritidis (5103 ufc/g). Tous les chantillons inoculs taient soigneusement homogniss pour assurer une bonne distribution de la charge bactrienne travers toute la surface. Six (06) chantillons de chaque groupe sont additionns dextrait brut de feuilles dolivier, les 06 autres chantillons sont additionns dextrait polyphnolique et enfin les 06 derniers chantillons de chaque groupe sont traits avec lH2O distille strile (tmoins). Les chantillons ayant reus ces diffrents traitements taient placs dans des barquettes en polystyrne puis recouverts avec des sachets en plastique (polythylne/polyamide; Sidlaw PackagingSoplaril, Barcelona, Espagne). Les chantillons de viande taient stocks lair libre et lobscurit pendant 7 jours 82 C, simulant les mmes conditions pratiques appliques en Algrie. Les analyses microbiologiques sont ralises pour un intervalle de 3 jours sur une dure de stockage de 7 jours. 2.6. pH-mtrie Le pH de la viande est mesur laide dun micro pHmtre modle 2001 (Crison Instruments, Barcelona, Espagne) aprs avoir homognis 3 g du produit dans 27 ml deau distille pendant 10 s 1300 rpm laide dun Ultra-Turrax T25 macevator (Janke & Kunkel, Staufen, Germany). Chaque valeur est la moyenne de trois dterminations. 2.7. Analyse bactriologique chaque intervalle danalyse, des chantillons de 25 g sont placs individuellement dans des sachets striles contenants 225 ml deau peptone tamponne. Lensemble est homognis temprature ambiante pendant 1 minute dans un Stomacher (Stomacher 400Circulator. Seward. Worthing, U.K.). Des dilutions dcimales sont prpares dans de leau peptone strile (0,1 %). 0,1 ml de chaque dilution est ensemenc dans le milieu appropri pour chaque souche bactrienne. Toutes les boites de Ptri taient incubes en arobiose 37 C/24-48h. Le milieu glos Salmonella-Shigella (GSS, BD, 274500; Oxoid) est utilis pour le dnombrement de

S. Enteritidis. Le milieu slectif utilis pour le dnombrement de S. aureus est la glose Baird-Parker (Oxoid; CM275) additionn dune mulsion de Jaune d'uf-tellurite (Oxoid; SR054C). Les rsultats sont exprims en log10 ufc/g. 2.8. Analyse sensorielle Lanalyse sensorielle de la viande est value par un panel entrain constitu par six personnes appartenant notre dpartement (enseignants et tudiants post gradus). Des tests pralables dentrainement taient raliss selon la mthode: "American Meat Science Association guidelines" [2]. Lattribut acceptabilit est valu selon les 5 chelles: 1=trs inacceptable, 2=inacceptable, 3=ni acceptable, ni inacceptable, 4=acceptable; 5=trs acceptable [10]. Les rsultats ont t exprims selon les scores prdominants octroys par les panelistes. 2.9. Analyse Statistique Ltude de la variance est utilise [32]. Les diffrences entre les moyennes sont dtermines travers LSD. Les valeurs de p<0,05 sont considres comme significativement diffrentes.

3. Rsultats et discussion

3.1. Activit antibactrienne (diffusion sur glose) Lactivit antimicrobienne des extraits de feuilles dolivier vis--vis des trois souches pathognes communment associes aux maladies d'origine alimentaire est value qualitativement et quantitativement par la mthode de diffusion sur glose et la dtermination des CMIs, respectivement. Selon les rsultats reprsents sur le Tableau 1, lextrait brut et les polyphnols de feuilles dolivier ont prsent une forte activit antibactrienne (Figure 2). Les rsultats obtenus pour ces composs sont comparables ceux obtenus pour le chloramphnicol, un antibiotique utilis comme tmoin positif. Les diamtres dinhibition enregistrs vis--vis de S. Enteritidis taient de 16,201,2 mm et 13,702,10 mm, respectivement pour les polyphnols et lextrait brut. Tandis que les diamtres dinhibition enregistrs pour S. aureus taient de 30,182,10 mm et 16,331,80 mm, respectivement pour les polyphnols et lextrait brut. Enfin, les diamtres dinhibition enregistrs vis--vis P. aeruginosa taient de 15,572,15 mm et 15,291,90 mm, respectivement pour les polyphnols et lextrait brut aqueux.

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P. aeruginosa
.

S. Enteritidis

S. aureus

Figure 2 : Effet inhibiteur des extraits vis-vis de P. aeruginosa, S. Enteritidis et S. aureus

Les zones d'inhibitions du chlor-amphnicol taient de 15,250,8 mm, 16,351,8 mm et 16,150,7 mm, respectivement vis--vis de S. Enteritidis, S. aureus et P. aeruginosa.
Tableau 1 : Activit Antibactrienne de lextrait brut aqueux et des polyphnols des feuilles dolivier (mthode de diffusion sur glose), exprime en diamtre dinhibition (mm) (Moyennecart type). (mm) Polyphnol S. Enteritidis S. aureus P. aeruginosa 16,151,2a 30,182,10a 15,572,15a Extrait brut 13,702,10b 16,331,8b 15,291,9a chloramphnicol 15,250,8a,b 16,351,8b 16,150,7a

: zone d'inhibition exprime selon le diamtre autour des disques imprgns avec les deux composs. Le diamtre (6 mm) du disque est inclus dans les calculs. Tous les tests ont t rpts trois fois. Les valeurs suivies par la mme lettre dans la mme ligne, ne sont pas significativement diffrentes (p > 0,05).

La forte activit antimicrobienne de ces deux composs est confirme par la mthode de microdilution (Tableau 2).
Tableau 2: Les Concentrations minimales inhibitrices exprimes en pourcentage (v/v) CMI% Polyphnols S. Enteritidis S. aureus P. aeruginosa 0,1 0,05 0,1 Extrait brut 1,2 0,9 1,2

Il ressort de ce tableau que les polyphnols sont plus performants par rapport lextrait brut en termes de valeurs de CMIs. Les polyphnols ont exhib une valeur de CMI

(0,05%) infrieure de 18 fois celle obtenue avec lextrait brut (0,9%) vis--vis de S. aureus. Cependant, vis--vis de S. Enteritidis et P. aeruginosa, lextrait polyphnolique est 12 fois plus performant que lextrait brut. Il est aussi important de souligner que notre groupe a aussi ralis des travaux sur lactivit antimicrobienne de deux extraits bruts de feuilles dolivier de deux varits Kabyles (chemlal et azerradj) et dun extrait polyphnolique vis-vis dE. Coli. Les rsultats (non publis) ont montr que ladite bactrie prsente certaine rsistance aux extraits tests. En effet des diamtres dinhibition de 9,60 mm, 10,97 mm et 9,5 mm sont enregistrs respectivement pour les extraits bruts chemlal et azerradj et lextrait polyphnolique. Selon certains auteurs, les molcules polyphnoliques comme loleuropine pourraient shydrolyser, ce qui provoque une baisse dans lactivit antimicrobienne [6]. En accord avec nos observations, Tassou et Nychas [33] ont dj confirm la rsistance dE. coli envers loleuropine purifie. Selon Cowan [7], les polyphnols sont les principaux composs antimicrobiens des plantes possdants des modes daction divers et des activits inhibitrices et ltales vis--vis dun nombre important de microorganismes. Ces dernires annes nous avons ralis plusieurs travaux portant sur lvaluation de lactivit biologique dextraits issus de plusieurs plantes mditerranennes (bourrache, romarin, tomate, sauge, origan, lentisque, etc.,) appliqus sur des produits alimentaires divers [11,12]. Les rsultats obtenus ont montr que dans la plupart des cas, ces extraits ont dmontr une certaine activit antimicrobienne. Rcemment, nous avons aussi dmontr lefficacit antimicrobienne de plusieurs huiles essentielles obtenues partir des espces locales (lentisque, lavande, menthe, sarriette, eucalyptus, inule etc.,) contre plusieurs bactries pathognes: E. coli, Listeria monocytogenes, S. aureus, S. Enteritidis, Campylobacter jejuni [13] [14] [15]. Les effets antimicrobiens observs dans ce travail sont comparables dans la plupart des cas ceux rapports dans la littrature scientifique. Dans une tude rcente, Lee et Lee [23] ont constat que loleuropine est de loin le compos le plus efficace vis--vis de S. Enteritidis

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(23,50,8 mm), par contre lacide cafique a montr une efficacit modre (9,8 mm - 10,4 mm) vis--vis de Bacillus cereus, E. coli et S. Enteritidis. Cependant, ces deux composs phnoliques nont exerc aucune action antimicrobienne vis--vis de S. aureus. Dans cette mme optique, ces mmes auteurs ont indiqu que dautres composs de feuilles dolivier comme la rutine et la vanilline nont exerc aucune activit antimicrobienne contre des bactries Gram positif et Gram ngatif (B. cereus, E. coli, S. Enteritidis et S. aureus). Sudjana et ses collaborateurs [32] ont test un extrait aqueux de feuilles dolivier contre 122 espces microbiennes. Ils ont constat que cet extrait a exerc un effet antimicrobien trop restreint, car, parmi lensemble des microorganismes tests, uniquement C. jejuni, Helicobacter pylori et S. aureus ont manifest une certaine sensibilit envers cet extrait. Les valeurs de CMIs enregistres taient comprises entre 0,31-0,78 % (v/v) pour ces 03 souches bactriennes. Cependant, pour le reste des microorganismes, entre autres P. aeruginosa, leurs MICs sont situes entre 6,25 et 50 % (v/v). Dans une tude rcente, Lee et Lee [23] ont indiqu que les feuilles dolivier possdent une grande capacit biologique naturelle. En effet, ces deux auteurs ont test individuellement et sous forme combine leffet antioxydant et antimicrobien de deux composs phnoliques propres aux feuilles dolivier (Oleuropine et acide cafique). Les rsultats ont montr que ces deux composs phnoliques avaient exerc une activit antiradicalaire potentielle. En termes dactivit antimicrobienne, les deux composs taient aussi efficaces. Cependant, leffet antimicrobien observ est beaucoup plus important lorsque les deux composs taient appliqus sous forme combine. En accord avec ces observations, Benavente-Garcia et ses collaborateurs [4] ont suggr que les extraits de feuilles dolivier peuvent exercer une action synergique grce la prsence de loleuropine et autres composs phnoliques. Un grand nombre dauteurs ont rapport que loleuropine est parmi les composs phnoliques des feuilles dolivier le plus puissant pour ses proprits antimicrobiennes [3] [5] [24] [26]. Il serait donc probable que les rsultats obtenus dans ce travail dcoulent de la prsence de loleuropine dans les diffrents extraits de feuilles doliviers utiliss. Medina et ses collaborateurs [25] ont dj signal le spectre bactricide trs largie contre plusieurs microorganismes de plusieurs composs phnoliques: loleuropine, lhydroxytyrosol et le tyrosol. Lefficacit antimicrobienne dj dmontre par ces composs laisse supposer quils peuvent constituer une trs bonne alternative dans la lutte contre certaines maladies infectieuses [34]. Confirmant les rapports prcdents, il a t constat que la force et le spectre d'activit antimicrobienne varient

selon le type dextrait et le Gram des bactries. Cependant, les bactries Gram positif sont gnralement les plus sensibles aux effets de ces extraits polyphnoliques. Cette rsistance gnrale plus leve chez les bactries Gram ngatif est attribue la prsence dune membrane externe impermable aux composs lipophiles. L'absence de cette barrire chez les bactries Gram positif permet le contact direct des constituants hydrophobes des extraits avec la bicouche phospholipidique de la membrane cellulaire bactrienne, entranant une augmentation de la permabilit aux ions et la fuite des constituants intracellulaires vitaux ou l'altration des systmes enzymatiques bactriens [35]. En outre, les activits antimicrobiennes de ces extraits sont difficiles corrler un compos spcifique en raison de leur complexit et leur variabilit. Nanmoins, certains chercheurs ont signal qu'il existe une relation troite entre la composition chimique en lments les plus abondants et l'activit antimicrobienne. Les valeurs de CMIs indiquent que lextrait polyphnolique est plus efficace que lextrait brut. Kim et ses collaborateurs [21] ont dj indiqu quen raison de la variation dans la diffusion et des proprits de solubilit des diffrents composs dans les diffrents milieux, les rsultats obtenus par la mthode des disques ne peuvent pas tre directement comparables ceux obtenus par la mthode de microdilution. Nos rsultats ont montr que lextrait polyphnolique qui a provoqu dimportantes zones d'inhibition vis--vis de S. aureus est celui qui a donn la plus faible valeur de CMI (0,05%). Pour des raisons de rendements et de qualit finale du produit, lextraction par des fluides supercritiques (CO2) et les ultrasons dynamiques tait la plus utilise pour les composs vgtaux comme alternative aux mthodes conventionnelles existantes [16] [18]. Cependant, des diffrences de compositions chimiques peuvent tre observes entre les diffrents extraits de feuilles doliviers. Ces diffrences de composition sont dues principalement aux variations climatiques, pdologiques et agronomiques dont sont issus les oliviers. Les facteurs environnementaux tels que la gographie, la temprature, la longueur du jour, les lments nutritifs, etc., devraient tre examins pour leur rle cl dans la composition chimique des extraits obtenus partir des feuilles doliviers. Ces facteurs influent sur les voies de biosynthse de la plante et par consquent sur la proportion relative des composs principaux caractristiques. Cela conduit l'existence de chmotypes diffrents reprsentatifs des extraits de diffrentes origines. 3.2. Application sur des escalopes de dinde et efficacit antibactrienne En raison de la vocation olicole de la rgion Kabyle et lutilisation des feuilles dolivier en mdecine traditionnelle dans tout le territoire algrien, cette tude a pour objectif en premier lieu dterminer lefficacit antibactrienne "in vitro" des composs de feuilles dolivier

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et en deuxime lieu une application sur des escalopes de dinde. Les Figures 3, 4 et 5 montrent respectivement les rsultats du dveloppement de P. aeruginosa, S. Enteritidis et S. aureus sur les escalopes de dinde conserves 82 C en prsence dun extrait brut de feuilles dolivier et dun extrait polyphnolique. Les mmes figures montrent que le nombre de bactries dans les escalopes tmoins est significativement (p<0.05) suprieur par rapport au nombre de bactries dans les chantillons traits avec les extraits (sauf pour le cas dextrait brut vis--vis de Salmonella). En effet, chez le tmoin, la charge moyenne bactrienne atteinte pour les 3 espces au 4me jour de stockage tait de 6,66 log10 ufc/g et, trois jours plus tard (7me jour), la charge moyenne a atteint une valeur de 7,42 log10 ufc/g. Il ressort de ces rsultats que dans tous les cas de figures, lextrait polyphnolique exerce un effet antibactrien significatif (p<0,05). Pour P. aeruginosa et S. Enteritidis, cet effet est vident ds le 1er jour de stockage. En effet, une rduction de 2,23 et 1,56 log10 ufc/g (30,38 % et 21,56 %) est enregistre au dernier jour de stockage. Quant lextrait brut, il est important de signaler aussi son activit antimicrobienne modre vis--vis de ces deux bactries. En effet, une rduction de 1,5 et 0,47 log10 ufc/g est enregistre au dernier jour de stockage respectivement contre P. aeruginosa et S. Enteritidis.

Figure 4 : Inhibition de S. Enteritidis par les extraits de feuilles dolivier (azerradj) additionns des escalopes de dinde stockes 82 C: ( ) Tmoin; ( ) Extrait brut; () Extrait polyphnolique

La Figure 5 rsume leffet anti-Staphylococcus aureus des deux composs appliques sur les escalopes. Une trs forte rduction du nombre de S. aureus a t enregistre. En effet, une rduction de 100% (effet bactricide) a t observe partir de 4me jour de stockage.

Figure 3 : Inhibition de P. aeruginosa par les extraits de feuilles dolivier (azerradj) additionns des escalopes de dinde stockes 82 C: ( ) Tmoin; ( ) Extrait brut; () Extrait polyphnolique

Figure 5 : Inhibition de S. aureus par lextrait brut de feuilles dolivier (azerradj) et de lextrait polyphnolique additionns des escalopes de dinde stockes 82 C: ( ) Tmoin; ( ) Extrait brut; () Extrait polyphnolique

Ces dernires annes, certaines tudes ont dmontr avec succs les applications potentielles de diffrents composs vgtaux pour rduire ou matriser la prsence d'agents pathognes dans les produits alimentaires, tels que le lait [20], le poisson [22], les fruits [29] et la viande [13]. L'activit antimicrobienne de lextrait brut de feuilles dolivier observe dans cette tude pourrait tre attribue la prsence de concentrations leves doleuropine,

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Utilisation des composs de feuilles dolivier comme agents antimicrobiens

hydroxytyrosol et verbascoside. Ces trois polyphnols sont considrs par certains auteurs comme des antibactriens et antifongiques potentiels [3] [5] [32]. Les extraits bruts de feuilles dolivier sont constitus de mlanges complexes de nombreuses molcules chimiques. On peut se demander si leurs effets antibactriens ne sont pas le fruit d'une synergie entre toutes les molcules ou au contraire, ils ne refltent que les molcules majeures prsentes. Les mcanismes par lesquels les microorganismes sont inhibs par ces composs semblent impliquer diffrents modes d'action. Les composants phnoliques prsents dans ces extraits ont t reconnus par plusieurs auteurs pour leur activit antimicrobienne [5] [24]. Le pH dun aliment est aussi un facteur important affectant l'activit dune substance antimicrobienne. faible pH, l'hydrophobicit de certaines molcules augmente et par consquent, elles se rpartissent convenablement dans la phase lipidique du produit. Ces molcules peuvent aussi se dissoudre plus facilement dans la phase lipidique de la membrane bactrienne et renforcer ainsi leur action antimicrobienne [18]. Nos rsultats ont dmontr que les valeurs de pH ne diffrent pas significativement (P>0,05) entre lensemble des chantillons au cours du stockage (rsultats non prsents). En effet, les valeurs du pH pour tous les chantillons taient de lordre de 5,6 5,8. Ce fait pourrait sexpliquer par le pouvoir tampon de la viande. En rgle gnrale, la sensibilit des bactries aux susbstances antibacteriennes semble aussi augmenter avec la diminution du pH de l'aliment. Concernant la nature de la matrice alimentaire, Smith-Palmer et ses collaborateurs [30] ont montr que les composs actifs prsents dans diffrents extraits vgtaux exercent une forte activit antimicrobienne contre L. monocytogenes dans les produits maigres par contre des observations contraires sont faites dans les produits riches en matires grasses. Ces aspects numrs ci-dessus devraient tre considrs pour toute application optimise des extraits vgtaux dans les produits alimentaires. En rgle gnrale, les principales composantes de ces extraits vgtaux sont le reflet de leur activit antibactrienne. Ainsi, les fonctions synergiques des diffrentes molcules contenues dans les extraits par rapport l'action d'un ou deux composants principaux de l'extrait semblent discutables. Toutefois, il est possible que l'activit des composants majeurs soit module par d'autres molcules mineures. En fait, les effets synergiques des divers constituants majeurs et mineurs prsents dans les extraits vgtaux bruts doivent tre pris en considration pour rendre compte de leur activit biologique. Selon des tudes concernant les mcanismes daction antimicrobienne de ces molcules, il semblerait que suite une dsintgration de la membrane cellulaire bactrienne provoque par ces substances, la fuite des mtabolites intracellulaires provoque la mort de la cellule [8] [28].

Des tests danalyses sensorielles ont t aussi programms. Des concentrations variables en extraits brut et polyphnolique sont utilises dans cette tude pour tudier limpact de leffet de la concentration (optimisation) sur les proprits organoleptiques du produit. Lapplication de ces extraits vgtaux sur des escalopes de dinde aux concentrations indiques semble amliorer la stabilit antimicrobienne de ces produits. Il faut galement souligner que le panel des consommateurs n'a pas peru dodeur extrme lie la prsence de ces extraits dans la viande (rsultats non prsents). Par consquent, les proprits sensorielles en termes dacceptabilit des escalopes traites avec ces composs sont acceptables pour les panlistes. Des tudes prliminaires ont montr que la combinaison des diffrents composs des feuilles dolivier avait une trs bonne activit antimicrobienne contre les agents pathognes d'origine alimentaire [23]. Cependant, des recherches supplmentaires seront ncessaires pour mieux valuer lactivit antibactrienne de ces extraits de feuilles doliviers. Des combinaisons de ces extraits avec dautres substances naturelles (exemple: bactriocine...) ou avec un conditionnement de la viande sous atmosphre modifie riche en CO2 pourrait constituer une alternative prometteuse pour la conservation et la scurit sanitaire du produit. En conclusion, les deux extraits de feuilles dolivier tests dans ce travail ont montr une bonne activit antimicrobienne vis--vis des bactries testes. Par consquent, ces rsultats suggrent que les feuilles dolivier peuvent constituer un potentiel antimicrobien non ngligeable pour la conservation de la viande.

Remerciements Remerciements au Ministerio de Asuntos Exteriores y Cooperacin d Espagne (AECID) pour avoir financ ces travaux rentrant dans le cadre dun accord programme PCI/MED Algeria-Spain (grant ALI A/023365/09; A/033506/10).

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