Chitosane : un nouvel outil pour lutter contre Brettanomyces et prserver les qualits aromatiques des vins

Lucile Pic-Blateyron(1), Daniel Granes(1), Nathalie Sieczkowski(2), Aur lie Bornet(!) (1) Grou"e #$% (#nstitut $oo" rati& 'u %in) La (asse 'e )aurin !*+,- Lattes, .rance (2) Lalle/an' SAS, 01D 2enolo3y, 1+ rue 'es Bi4uetiers BP5+ !1,-2 Bla3nac, .rance (!)6ito7y/e sa Parc #n'ustriel 'es 8auts-Sarts, 7one 2, rue 8aute $laire *, *-*- 8erstal, Bel3i4ue aurelie9:ornet;kitozy/e9co/ Article publi loccasion du Symposium international OENO 2 !!" #ordeau$" %ai 2 !!

%ots&cls : Brettanomyces, chitosane, vin 'ntroduction

La dcouverte des levures du genre Brettanomyces remonte 1904, lorsque que Clausen les isolent dans un mot de brasserie. Depuis, les Brettanomyces sont dcrits comme un agent de contamination de nombreux produits de fermentation incluant le vin, le cidre, la bire, le kombucha, le kefyr, la tquila, etc [1-6]. Limpact des levures de contamination Brettanomyces a t prouv par de nombreux auteurs sur des vins de diffrents pays de rgions de France [7-15], des vins mousseux allemands [16] des vins jaunes dArbois [17] ou des vins du midi de la France. En 1965, Domercq dans son tude a rapport lisolement des Brettanomyces dans des mots des appellations Saint Emilion et premires ctes de bordeaux et dans des vins rouges ou blancs en cours de conservation des appellations Mdoc, Graves et Saint-Emilion. Des levures Brettanomyces ont aussi t isoles sur des vins en provenance du Brsil, dItalie, de la Nouvelle-Zlande, du Royaume uni, dAustralie, du Portugal, dans des vins californiens et bordelais conservs dans des barriques neuves. Quant aux cpages le pinot semble tre le plus touch ; en Bourgogne par exemple pour le millsime 2000 50% des vins en fermentation issus de ce cpage et 25% aprs embouteillage avaient t infects [18]. Dans le milieu viticole, la dtection de ces levures de contamination au vignoble est rendue dlicate par le fait quelles sont ce stade minoritaires. Toutefois la fermentation alcoolique va entraner une vritable slection de ces microorganismes. En effet, les Brettanomyces sont particulirement rsistantes lthanol sont capables de subsister dans le milieu malgr son appauvrissement en sucres. De plus, certaines techniques ou certains protocoles de vinification peuvent favoriser le dveloppement des Brettanomyces dans le vin, comme llevage sur lies. Pour que les Brettanomyces puissent se dvelopper, moins de 500 mg de sucre leur suffisent. L'agent de conservation chimique le plus courant utilis est le dioxyde de soufre, cependant il y a actuellement une tendance rduire les niveaux SO2 dans les vins. Le SO2 est gnralement utilis pour contrler la contamination microbienne. Son efficacit dpend du pH et de la composition polyphnolique du vin [19]. Certains auteurs ont trouv que Brettanomyces taient sensibles des concentrations de SO2 libre dpassant 30 mg/l et des teneurs en SO2 actif suprieur 0.7mg/l [28]. Un autre agent de conservation est dicarbonate de dimthyle (DMDC) est autoris aux Etats-Unis pour une dose maximale cumule de 200 ppm [20], en Australie jusqu' 200 mg / kg [21] et en Europe avec la limite maximale de 200 mg / l [22] uniquement dans les vins contenant au moins 5 g / l et avant l'embouteillage. Le DMDC galement commercialis sous le nom Velcorin a t valu pour l'inhibition de la levure Brettanomyces. Il a t constat que DMDC la dose de 250mg/l permet dinhiber la croissance de

Brettanomyces bruxellensis. Cependant, il a t prouv quune dose de 400mg/l de DMDC ne permet pas dinhiber que la souche Brettanomyces anomalus [23]. Le chitosane est un polysaccharide naturel compos de la distribution alatoire le long de la chaine polymre des units de rptition D-glucosamine (unit dsactyle) et N-actyl-D-glucosamine (unit actyle). De nombreuses activits biologiques du chitosane sont rfrences incluant des activits antitumorales [24], des effets anti-cholestrol [25] mais galement des activits antimicrobiennes [26] et antifongiques [27]. Le chitosane peut tre issu de deux origines : (1) par dsactylation (hydrolyse des groupements N-actyl) de substrats issus des dchets des industries de la pche (les carapaces des crustacs telles que les crevettes, les calmars, et les crabes) ou (2) par production partir dune source fongique (Aspergillus niger) : technique rcemment mise au point par KitoZyme (BE). Seule cette dernire origine est autorise en nologie. Le chitosane est un polymre non toxique, biocompatible et biodgradable, ce qui en fait un candidat intressant pour les applications nologiques.

%atriel et mthodes
Les souches de levure La souche de Brettanomyces bruxellensis utilise pour linoculation artificielle du vin est la souche identifie comme majoritaire sur le vignoble mditerranen et a un gnotype 100% A [28]. Elle provient de la collection des souches ICV-ADNid. Elle est conserve 4C sur milieu glos inclin (milieu YAC) aprs 7 jours dincubation 28C. Le milieu et les conditions de culture du levain Le levain est un milieu dacclimatation dans lequel les levures peuvent crotre et atteindre une population de lordre de 107UFC/ml, tout en sadaptant un environnement peu favorable (pH acide, taux en thanol lev) Techniques analytiques de dnombrement - La croissance des Brettanomyces viables est contrle par une mise en culture sur un milieu slectif Brettanomyces (milieu YAC : YEPD + cycloheximide + chloramphnicol). Aprs ensemencement, les botes sont ensuite incubes 28C pendant 10 jours. - la RT-PCR consiste amplifier, par une raction enzymatique rpte, une rgion spcifique de lADN de Brettanomyces, balise par deux amorces. Il est alors possible de quantifier lADN par lutilisation dun fluorophore - Observation microscopique par pifluorescence permet : (1) dune part de visualiser des levures considres comme vivantes car possdant une activit estrase; lors de lobservation microscopique ces dernires sont colores en vert grce au CFDA et (2) dautre part, de visualiser des levures considres comme mortes car ayant une membrane cellulaire endommage; lors de lobservation microscopique ces dernires sont colores en rouge grce lIP

(sultats et )iscussion
De nombreux travaux scientifiques ont dmontr lefficacit du chitosane contre les Brettanomyces. Ainsi, dans le cadre dtudes ralises en laboratoire ou dexprimentations en caves (Graphique 1) menes sur des vins de cpages et de millsime diffrents, les rsultats montrent lefficacit du chitosane la dose de 4g/hl sur des populations pouvant atteindre 105-106 UFC/mL. Lanalyse des lies par microscopie pifluorescence 10 jours aprs le traitement dmontre que dans les tmoins non traits aucune cellule morte nest comptabilise. A contrario dans les modalits traites au chitosane la dose de 4g/hl, une forte proportion de levures dtectes est morte et le pourcentage de levures vivantes est trs faible (tableau 1). La figure 1 permet dillustrer les observations microscopiques en montrant quelques exemples. Il convient de souligner que des gradations dintensit de colorations peuvent tre visualises. Par ailleurs, de nombreux essais industriels ont t raliss avec la collaboration de lICV (Institut Coopratif du Vin) pendant les trois campagnes de vinification en France dans le cadre de la drogation des 50000hl accorde par la DGCCRF. Ainsi une quarantaine de cuves ont t traites entre 2008 et 2010, reprsentant plusieurs milliers dhectolitres. Ces vins, prsentant un risque li la prsence de germes

daltration de type Brettanomyces, ont t traits la dose de 4g/hl. Les rsultats (graphique 2) ont permis de valider lefficacit du traitement en grands volumes sur les Brettanomyces. Pour le suivi de lefficacit, des prlvements ont t effectus avant le traitement, 10 jours puis 20 jours et 30 jours aprs lintroduction du chitosane et soutirage. L'valuation des populations viables a t dtermine pour chaque prlvement soit par mise en culture sur milieu glos uniquement soit par analyse RT-PCR et mise en culture sur milieu glos. Les rsultats sont prsents dans le tableau 2 pour un des essais ou le suivi a t effectu par RT-PCR et mise en culture sur milieu glos. Ils montrent une diffrence en fonction de la mthode d'analyse : alors que par mise en culture sur milieu glos, la population viable est estime moins de 10 units formant colonies ds le premier contrle (10 jours post traitement), il faut attendre 30 jours post traitement avec l'analyse par RT-PCR pour obtenir ce rsultat. Ceci illustrerait que le chitosane interagit vraisemblablement avec la paroi membranaire des cellules de Brettanomyces entrainant une dstructuration de cette dernire; ce mcanisme induirait une rponse des cellules comparable un tat sub-ltal, prcdant leur mort. Dans cet tat sub-ltal, les cellules seraient identifies comme viables par la PCR quantitative pendant plusieurs jours avant leur mort totale alors que l'analyse sur milieu glos les identifierait de suite comme non cultivables. Nos programmes de recherche visent confirmer cette hypothse. Ainsi dans le cas de contrles par RT-PCR de populations rsiduelles de Brettanomyces post-traitement au chitosane, il convient dattendre 20 30 jours aprs le soutirage avant de raliser lanalyse. Un risque de rsultats faussement positifs par cette technique a t mis en vidence si ce dlai nest pas respect.

Conclusions
Aujourdhui pour lutter contre les Brettanomyces diffrents moyens sont mis en uvre avec plus ou moins de succs (bonne gestion du SO2 molculaire en fonction du pH, bonne conduite des fermentations alcoolique et malolactique, gestion des lies, hygine du chai et des barriques, flash pasteurisation) mais ils ne suffisent pas toujours et il nexiste donc pas doutil entirement satisfaisant pour liminer ces microorganismes daltrations. Admis comme pratique nologique par lOIV en juillet 2009 et par lUnion Europenne en dcembre 2010 le chitosane dorigine fongique reprsente un outil innovant et efficace de lutte contre les Brettanomyces.

(*rences biblio+raphiques
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