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HAMMOUDI R., HADJ MAHAMMED M., RAMDANE F. et KHODIR A. A.

ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES EXTRAITS PHENOLIQUES DE LA PLANTE Teucrium polium geyrii

HAMMOUDI Roukia1, HADJ MAHAMMED Mahfoud1, RAMDANE Farah1 et KHODIR Abed Allah2
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Universit Kasdi Merbah-Ouargla, laboratoire de biogochimie des milieux dsertiques 30000 Ouargla, Algrie 2 Laboratoire rgional de contrle de qualit (CAQE) 30000 Ouargla, Algrie E-mail : rokia1811@yahoo.fr

Rsum- Ce travail prsente une contribution la valorisation de lune des plantes de la famille Lamiaces issue de la rgion de Tamanrasset (Sahara mridional Algrien), en loccurrence Teucrium polium geyrii, Il sagit dune mise en vidence de lactivit biologique de certains de ses mtabolites secondaires. La plante a t soumise deux types dextraction des composs phnoliques, par macration et au Soxhlet. L'analyse semi-quantitative des phnols totaux et des flavonodes des extraits phnoliques, ralise par colorimtrie, a montr que lextrait dactate dthyle obtenu par macration renferme plus de phnols totaux soit 89.050.50 mg/g en quivalent dacide gallique, au mme titre que le taux des flavonodes avec 0.450.001 mg/g en quivalent de vitexine. Lactivit antibactrienne ralise sur des souches bactriennes pathognes et daltration dont Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus cremoris, Clostridium perfringens, Klebsilla pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, par la mthode daromatogramme, a montr que les extraits tests sont dous dactivit antibactrienne apprciable avec des zones dinhibition pouvant atteindre 3.40.3 cm de diamtre sur Proteus mirabilis. Mots cls : Teucrium polium, plante mdicinale, polyphnols, activit antibactrienne, aromatogramme.

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF PHENOLIC EXTRACT FROM Teucrium polium geurii PLANT

Abstract- This work presents a contribution to the detection of biological activity of some secondary metabolites of Teucrium polium geyrii, which is a Lamiaceae plant family of Tamanrasset (southern Algeria). The plant was subjected to two types of phenolic compounds extraction, maceration and Soxhlet apparatus. The semi-quantitative analysis of total phenols and flavonoids (phenolic extracts), was performed by colorimetry. It showed that the ethyl acetate extract obtained by maceration contains the largest amount of total phenols, 89.050.50 mg/g equivalent of gallic acid, as well as the rate of flavonoids with 0.450.001 mg/g equivalent of vitexin. The antibacterial activity carried on bacterial strains pathogenic and alterations, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus cremoris, Clostridium perfringens, Klebsilla pneumoniae, Escherichia coli and Proteus mirabilis, by Aromatogram method, showed that the extracts tested are endowed interesting antibacterial activity with inhibition zones can reach 3.40.3 cm in diameter on Proteus mirabilis. Keywords: Teucrium polium geyrii, medicinal plant, polyphenols, antibacterial activity, aromatogram.

Introduction Les mtabolites secondaires dont font partie les composs phnoliques contiennent des substances trs recherches par les industries des cosmtiques, de la pharmacie et de la phytothrapie [1]. Teucrium polium geyrii de la famille Lamiaceae, nomme Takmazzut par les Touareg, est une plante vivace souvent prenne, recouverte de poils laineux qui lui donnent une couleur grise bleute et sa taille varie entre 20 et 30 cm [2, 3, 4]. C'est une plante mditerranenne, commune l'Atlas saharien. Elle pousse surtout dans les lits pierreux des oueds et dans les roches, en altitude entre 1200 et 2600 m [3, 5]. En mdecine traditionnelle africaine, cette espce est utilise en priodes de stress. Elle possde galement une action bnfique sur la 49
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digestion. Ses proprits anti-stress et anti-oxydantes permettent de lutter contre le vieillissement de la peau [6]. Elle est utilise pour parfumer le th. C'est l'aspirine des touaregs. En mdecine traditionnelle, elle a une place importante en raison de ses indications thrapeutiques. Toutefois, elle semble navoir pas t suffisamment tudie chimiquement, contrairement dautres sous espces du mme genre [2]. Cette tude sintgre dans le contexte plus global de la mise en valeur de la biodiversit des plantes aromatiques algriennes pour leurs proprits tant mdicinales qualimentaires. 1.- Matriel et mthodes 1.1.- Rcolte du matriel vgtal Le matriel vgtal est constitu du la partie arienne de la plante Teucrium polium geyrii, rcolte Tamanrasset (Hoggar centre) en Novembre 2007. Les chantillons sont schs l'abri de la lumire et de lhumidit, temprature ambiante et stocks soigneusement dans un endroit sec en vue de leur analyse. La plante est t identifie par S. BENHOUHOU, botaniste linstitut national agronomique (INA) El-Harrach-Alger (Algrie). 1.2.- Etude des composs phnoliques de Teucrium polium geyrii 1.2.1.- Extraction par macration Un chantillon de 5 g de poudre vgtale est soumise macration dans un mlange hydroalcoolique (mthanol/eau 80/20: v/v) durant 36 heures temprature ambiante et l'obscurit, avec renouvellement du solvant toutes les 24 heures. Les extraits hydro-alcooliques sont vapors sous vide une temprature de 40C. Aprs traitement lther de ptro le pour liminer les pigments [7], la phase aqueuse est extraite lactate d'thyle. L'addition de 4 ml du mlange: sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 20% (m/v) et l'acide orthophosphorique (H3PO4 2%) facilite le passage des composes phnoliques de la phase aqueuse vers le solvant organique. La phase organique obtenue est sche sur sulfate de sodium anhydre (Na 2SO4) suivie dune vaporation sous vide 40C [8,9]. 1.2.2.- Extraction au Soxhlet Un chantillon de 50 g de la partie arienne de Teucrium polium geyrii est soumis lextraction par le mthanol au Soxhlet, pendant 7 heures. Aprs vaporation totale du solvant, 100 ml deau chaude sont additionnes au rsidu sec puis conserv durant une nuit. L'extraction liquide-liquide a t ensuite ralise avec un systme de solvants de polarit croissante: ther de ptrole, lhexane et le chloroforme, lactate d'thyle et enfin le n-butanol [10]. 1.3.- Quantification des composes phnoliques Le dosage des phnols totaux a t effectu par une mthode adapte de SINGLETON et al. avec le ractif de Folin-Ciocalteu, tandis que les flavonodes sont quantifis par dosage direct par le trichlorure daluminium [11,12]. 1.3.1.- Dosage des phnols totaux A partir d'une solution mre aqueuse prpare de l'acide gallique de concentration 50
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massique 10mmol/l, des solutions filles sont prpares des concentrations allant de 0.2 mmol/l jusqu' 1.2 mmol/l. 50 l de chaque solution, ou de l'extrait des polyphnols, sont introduits dans des tubes essais. 100 l de ractif de Folin-Ciocalteu et 1 ml d'eau bidistille est ajoute. Aprs 10 minutes, on ajoute 500 l de carbonate de sodium Na2CO3 20% (m/v). Les solutions sont maintenues l'obscurit pendant 2 heures temprature ambiante. Les concentrations sont dtermines laide d'un spectrophotomtre UV/Visible type LNICAM-DISCPD2000-1, une longueur d'onde de 765 nm. 1.3.2.- Dosage des flavonodes Lanalyse quantitative des flavonodes est effectue par la mthode de VENSKUTONIS et al. (2003). A partir de la solution mre de la vitexine (utilise comme talon) prpare dans le mthanol une concentration de 1 mmol/1, des solutions filles de concentrations allant de 0.01 0.06 mmol/1 sont prpares. 1 ml de chaque solution fille de la vitexine ou de l'extrait, est ajout 1 ml de trichlorure d'aluminium (AlCl3) 20 % (m/v) dans l'eau. Aprs incubation l'obscurit pendant 40 minutes temprature ambiante, le dosage seffectue par spectrophotomtrie UV/Visible 415 nm. 1.4.- Activit antibactrienne des extraits La mthode des aromatogrammes est utilise pour rechercher lactivit antibactrienne au laboratoire de bactriologie de lhpital Mohamed Boudiaf et au laboratoire de contrle de qualit de la localit de Ouargla. Le milieu de culture utilis est la glose Mueller-Hinton (4mm dpaisseur). Les souches bactriennes choisies sont: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus cremoris, Clostridium perfringens, Klebsilla pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis. Lensemencement de linoculum de 1 ml est ralis en surface. Les disques pour aromatogrammes des extraits dissous dans le DMSO ( 0.5 cm), sont dposs la surface de la bote. Chaque disque est imprgn dune quantit variable (entre 1 et 10 l) de lextrait slectionn. La bote est incube ltuve 37 durant 12 18 heures. A la sortie de ltuve, labsence de la croissance microbienne se traduit par un halotranslucide autour du disque, identique de la glose strile, dont le diamtre est mesur et exprim en centimtre. Le tmoin est une bote de Ptri ensemence dans les conditions de lexprience, sans disque. 2.- Rsultats et discussion Une investigation phytochimique prliminaire a t entreprise et a permis de mettre en vidence divers mtabolites secondaires. Le Tableau I, regroupe les rsultats des tests chimiques raliss, aprs broyage de la plante Teucrium polium geyrii. Au vu des rsultats, on dduit que la plante tudie, comme dautres espces de la famille des Lamiaces, est riche en divers mtabolites secondaires, ce qui explique lintrt et lattention particulire porte cette plante par plusieurs chercheurs [13] Tableau I.- Tests chimiques prliminaires de la plante Teucrium polium geyrii Test chimique Tanins Saponosides Huiles essentielles Cardnolides 51
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Prsence + + + +

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Alcalodes Anthraquinones libres Strodes et drives de strodes Flavonodes Polyphnols

+ + + + +

2.2.- tude des composs phnoliques de Teucrium polium geyrii 2.2.1.- Extraction des flavonodes Le tableau II est not l'aspect, la couleur et le rendement de chaque extrait phnolique. Les rsultats montrent un rendement lev pour lextraction ralise par lhexane au Soxhlet (7.50%) et le moins important est obtenu avec celle pour le chloroforme (2.66%). Cette diffrence peut tre attribue la prsence de composs lipophiles (acides gras, carotnodes, chlorophylles) de poids molculaire lev, plus solubles dans l'hexane. Toutefois, ces extractions peuvent tre considres comme complmentaires dans la mesure o les produits naturels prsentent des polarits assez diffrentes. Tableau II.- Caractristiques des extraits phnoliques obtenus par macration et au Soxhlet de la plante Teucrium polium geyrii Extraits Hexane (soxhlet). Chloroforme (soxhlet) Actate d'thyle (soxhlet) n-butanol (soxhlet) Actate d'thyle (macration) Couleur Vert fonc Vert Jaune Jaune Jaune marron Jaune vert Aspects Visqueux visqueux poudre poudre poudre Rendement (%) 7.50 2.66 5.31 5.58 3.70

2.2.2.- Analyse quantitative des polyphnols La teneur en composs phnoliques de chaque extrait de plante est exprime en milligrammes quivalents en acide gallique par gramme de la matire sche. La quantification des flavonodes est exprime en milligrammes quivalents en vitexine par gramme de la matire sche. Les rsultats sont regroups dans le tableau III. Tableau III.- Phnols totaux et flavonodes des extraits de la plante Teucrium polium geyrii Extrait Phnols Totaux (mg/g) quivalent en acide gallique 89.050.50 1.810.05 49.870.004 8.480.07 7.520.02 Flavonodes (mg/g) quivalent en vitexine 0.450.001 0.060.097 0.160.001 0.160.035 0.120.008

Actate d'thyle (macration) Actate d'thyle (soxhlet) n-butanol (soxhlet) Chloroforme (soxhlet) Hexane (soxhlet)

La teneur en polyphnols dans la plante Teucrium polium geyrii tudie varie dun extrait un autre. Lextrait lactate dthyle obtenu par macration renferme la plus grande quantit de phnols totaux (89.050.50 mg/g) au mme titre que le taux des flavonodes (0.450.001 mg/g). La plus faible teneur en phnols totaux avec 1.810.05 mg/g est observe dans le cas dextrait lactate dthyle au Soxhlet. DJERIDANE et al. (2006) et PROESTOS et al. (2006), rapportent que la plante Teucrium polium geyrii provenant de Tamanrasset, est riche en 52
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composs phnoliques. 2.3- Activit antibactrienne des extraits La figure 1 indique les rsultats des tests dactivit antimicrobienne des extraits issus de la plante Teucrium polium geyrii sur les souches bactriennes suivantes : Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus cremoris, Clostridium perfringens, Klebsilla pneumoniae, Escherichia coli et Proteus mirabilis.

Extrait d'hexane

Extrait de Chloroforme

Extrait de butanol

Actate d'thyle soxhlet

Actate d'thyle macration

3.5 3 2.5 2 1.5 1

0.5
0

Figure 1.- Effet des extraits de Teucrium polium geyrii sur les diffrentes souches bactriennes Il apparat un effet antibactrien de la plante Teucrium polium geyrii sur diffrentes souches bactriennes Gram positif ou ngatif. Cette efficacit est due la prsence des flavonodes qui sont des mtabolites secondaires rputs pour leurs effets antibactriens [14,15]. De mme, il est remarqu leffet significatif de l'extrait butanolique de Teucrium polium sur les souches tudies. Leffet de cet extrait est notable par rapport aux autres extraits tests, avec un maximum dinhibition de 3.40.3 cm de diamtre chez Proteus mirabilis (fig. 2). Lextrait lactate d'thyle possde un large spectre daction couvrant les bactries Gram positifs et ngatifs, de la prsente tude. Les extraits au chloroforme et lhexane, exercent des effets similaires mais avec des zones dinhibitions diffrentes (fig. 2 et 3). Les essais sur Proteus mirabilis montrent que les extraits prsentent des diamtres dinhibition suprieurs 1 cm. Tous les extraits tudis inhibent la croissance des souches de S. aureus en milieu glos. Une tude de OGANESYAN et al. a note leffet antimicrobien de lextrait mthanolique de Teucrium polium sur Klebsilla pneumoniae et Escherichia coli [15].

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Extrait d'actate d'thyle

Extrait de n-butanol

Figure 2.- Activit des extraits du Teucrium polium geyrii sur Proteus mirabilis Conclusion

Figure 3.- Activit des extraits du Teucrium polium geyrii sur Klebsilla pneumoniae

Afin disoler de nouvelles substances naturelles permettant de mettre au point de nouvelles voies dapplications tant dans les domaines de la pharmacie, de la cosmtique, ce travail est une contribution ltude dactivits biologiques de certains mtabolites secondaires de la plante Teucrium polium geyrii issue de la rgion de Tamanrasset (Algrie). La plante tant soumise deux types dextraction, la macration et au Soxhlet, l'analyse quantitative ralise par spectrophotomtrie a rvl des teneurs apprciables en polyphnols avec des quantits notables en flavonodes. Le test de lactivit antibactrienne des diffrents extraits a montr que toutes les souches microbiennes testes sont inhibes par les extraits, dont l'extrait butanolique prsente un effet plus marqu par rapport aux autres extraits tests, avec un maximum de zone dinhibition de 3.40.3 cm de diamtre sur Proteus mirabilis. Rfrences bibliographiques [1].- Gurib-Fakim A., 2006.- Medicinal plants: Traditions of yesterday and drugs of tomorrow. Molecular Aspects of Medicine, vol. 27: 1-93. [2].- Benchelah A C., Bouzian H., Maka M., 2004.- Fleurs du Sahara, arbres et arbustes, voyage au coeur de leurs usages avec les Touaregs du Tassili. Phytothrapie, vol. 6: 191-197. [3].- Abdallah H. et Sahki R., 2004.- Le Hoggar promenade botanique. Espces herbaces. Edition sope, 311 p. [4].- Ashnagar A., Gharib N., et Foroozanfar S., 2007.- Isolation and identification of the major chemical components found in the upper parts of Teuc.rium polium plants grown in Khuzestan province of Iran. Chinese Journal of Chemistry, vol. 25:1171-1173. [5].- Ozenda P., 1979.- Flore du Sahara. CNRS, Paris, 423 p. [6].- Panovska T. K., Kulevanova S., Gjorgoski I., Bogdanova M., et Petrushevska G., 2007.Hepatoprotective effect of the ethyl acetate extract of Teucrium polium L. against carbontetrachloride-induced hepatic injury in rats. Acta Pharm, vol. 57: 241-248. 54
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