Dr.

Santiago Sherwell Cultivo Celular IBT Octubre 2007

Temas
Definicin Historia y evolucin. Tipos de cultivo celular. Componentes del cultivo celular. Ventajas y desventajas. Usos. Seguridad.
Imagen of Primary Culture, www.javeriana.edu. 13/0ct/06

Definicin

Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas, Fusenig (1986). Mtodo para el estudio del comportamiento de las clulas animales libres de las variaciones sistmicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrs de un experimento, Prez y col. (2001). Propagacin de clulas fuera del organismo de origen. Tcnica de crecimiento de clulas in vitro, que permite reproducir las condiciones existentes in vivo.

Imag

Imagen Technique in vivo and in vitro, www.javeriana.edu. 13/0ct/06

Fusenig, N.E. (1986). "mammalian epidermal cells in culture". En "Biology of the ingument", edit. por. J. Bereiter.hahn, A.G. Matolsky y K.S. Richards, Springer-Verlag, pp409. Prez, A., Rodrguez, N., Gil, J. y Ramrez, G. (2001).Cultivo Celular. Unidad de epidemiologa clnica y bioestadstica. Facultad de Medicina .

Resea Histrica

1880-1910: Primeros ensayos de sobrevivencia de clulas fuera de organismos enteros 1912: Burrows y Carrel establecen las primeras lneas celulares. Desarrollan tcnicas aspticas de trabajo y material especfico 1920-1940: Se establecen lneas celulares de diversos rganos animales y de mantenimiento de las condiciones estriles. 40s : aparicin de antibiticos 1940-1955:
Se replican virus sobre clulas cultivadas, se producen las primeras vacunas virales en cultivos celulares. 1948 Earle y col. Demostraron que para que una clula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos. Se definen las condiciones para congelar clulas en nitrgeno lquido (Alan Parks, 1949)
*Pontn y Westermarck (1980). "Cell generation and aging of nontransformed glial cells from adult humans". En Fedoroff S., Hertz L. (eds.) "Advances in Cellular Neurobiology", vol 1. New York, Acad. Press., pp. 209-227. *Hay y Strehler (1967). "The limited growth span of cell strains isolated from the chick embryo". Exp. Gerontol. 2 : 123

Resea Histrica
1952. Gey y col. Establecen la primera lnea celular continua

(HeLa). Dulbecco: clulas en monocapa y generacin de clulas por tripsinizacin. 1955 Eagle. Realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos nutritivos de las clulas en cultivo. 1960s: Se desarrollan las tcnicas de hibridizacin en cultivos 1970s: * Los cultivos celulares se incorporan a la ingeniera gentica * Desarrollo de grandes reactores de cultivos en suspensin Reciente: Modificacin gentica controlada de clulas Desarrollo de medios de cultivo libres de suero Desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales
*Fusenig, N.E. (1986). "mammalian epidermal cells in culture". En "Biology of the ingument", edit. por. J. Bereiter.hahn, A.G. Matolsky y
K.S. Richards, Springer-Verlag, pp- 409-442. *Michalopoulos, G. y Pitot, H.R. (1975). "Primary culture of parenchymal liver cells on collagen membranes". Fed. Proc. 34 : 826

Biologa del Cultivo Celular.

En un cultivo celular la mayora de las clulas crecidas

a partir de un tejido slido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse. Esta adherencia celular es mediada por receptores celulares especficos de superficie. El crecimiento de las clulas en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de stas a las diferentes tcnicas de disgregacin y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensin.

 El crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo,

ya que unas clulas detienen su crecimiento, mientras que otras lo incrementan (Freshney, 1995). Las clulas de humanos y tejidos se pueden obtener de biopsias, post-mortem, placentas o de procedimientos quirrgicos. Se pueden cultivar una amplia variedad de cultivos de clulas, as como clulas de cncer y sangre humanas para investigar cmo los virus provocan infecciones. Los cultivos de clulas y tejidos pueden ser altamente sensibles a las sustancias qumicas y permitir a los investigadores estudiar partes del cuerpo especficamente identificadas.

Clases de Cultivo Celular

Los cultivos de clulas animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia), y si han sido aisladas recientemente de un rgano determinado o si provienen de clulas que han sufrido modificacin. De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensin respectivamente.

 Cultivo Primario: conservan la morfologa de las

clulas del rgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un nmero diploide, su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin por contacto. En la produccin son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.

Lneas Celulares: estn formadas por clulas que se

diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de no tener inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a lnea se denomina transformacin.

 Cultivo Monocapa.
Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que

mejor crecen en sta condicin. La formacin de una monocapa cubrir la superficie de crecimiento (confluencia). Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri y frascos Roux; su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolticos como la tripsina.

Cultivo en Suspensin:
Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con

requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus de un perodo de adaptacin. El cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboracin de productos extracelulares, el cultivo en suspensin es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de clula.

Componentes de un cultivo
Fase Gaseosa Soporte

Clula

Medio de Cultivo

Soporte
Tipo de crecimiento celular en soporte: Lquido y Slido

Lquido: Clulas en suspensin

Soporte
Slido: Clulas adheridas a vidrio o distintos tipos de

materiales sintticos.

POLICUBETAS

FRASCOS ESTTICOS

BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)

Soporte
Superficies cubiertas con sustancias que favorecen

el crecimiento celular

CLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DAS SOBRE SOPORTE PLSTICO DESNUDO

CLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DAS SOBRE SOPORTE PLSTICO CON COBERTURA DE COLGENO I

Fase gaseosa
La concentracin de oxgeno necesaria depende de los requisitos de las clulas La concentracin de dixido de carbono depende de la capacidad buffer del medio de cultivo

 El equilibrio dixido de carbono (en la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase lquida) acta como buffer del cultivo

Medios de cultivo celulares

CUALIDADES:
Especfico para la clula a cultivar Nutritivo pH adecuado Capacidad buffer Isotnico Estril

Medios de cultivo celulares

COMPONENTES:

Agua Sales Glucosa cidos grasos Vitaminas Suero Pptidos

Micro y oligoelementos Aminocidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de pH Indicador de pH Antiespumante Antibiticos?

Ventajas
Categora
Ambiente fisicoqumico Cond. Fisiolficas Microambiente Caracterizacin Preservacin y conservacin Validacin y Acreditacin. Replica y Reactivos

Ventaja
pH, TC, Gases, Presin Atmosfrica, oxgeno y CO2. Provisin de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras. Regulacin de matrix,interac. Cel-cel, difus. de gases. Citologa realizado fcilmente Medios y N2 liquido (-80C). Origen, historia, pureza autentica y grabada Cuantificacin fcil y vol. reducido. Acceso directo a clulas, bajo costo
Freshney, I. R.,( 2005). Culture of Animal Cell. 5 Edition. WILEY. 6 p.

Desventajas y/ Limitaciones
Categora Ejemplo:
Experiencia Manipulacin (Estril), Contaminacin: Qumica, Microbiolgica o Cruzada. Lugar de trabajo, Incub, pH. Equipo, medio, sueros, consumibles Diferenciacin, Adaptacin, Selectividad (hormonal)

Control del medio ambiente Cantidad y costo Inestabilidad Gentica y Fenotpica

Identificacin del Tipo de Expresin de marcadores, Clula Histologa, microambiente.

Freshney, I. R.,( 2005). Culture of Animal Cell. 5 Edition. WILEY. 6 p.

Para qu cultivar clulas in vitro?

Investigacin
Comprender la fisiologa celular Toxicologa, virologa, etc. Piel, hgado Hueso y cartlago

Ingeniera de tejidos

Produccin de biolgicos

Anticuerpos monoclonales Hormonas Enzimas Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)

Niveles y Normas de Seguridad

American Type Culture Collection (ATCC)

http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm

Nivel 1. No presentan peligros reconocidos cuando se utilizan en condiciones normales. Nivel 2. Se emplean para materiales de origen primario humano que no se conoce el riesgo de infeccin o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patgenos. Nivel 3. Su manejo pueden presentar un riesgo potencial. Nivel 4. Extremadamente peligrosos.