MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Tema 12

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II. ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES
Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras.

1. Recuento de microorganismos ia!"es tota"es. Muestras lquidas u homogenei!adas". # $e trata de conocer el n%mero total de microorganismos presentes en el alimento. Este n%mero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. # &ependiendo de las caractersticas del medio utili!ado medio rico' medio limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados" y de las condiciones de incubacin mesfilos' psicrfilos" los microorganismos anali!ados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes anaerobios facultativos"( aunque' en ciertas situaciones alimentos envasados al vaco"' puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales. # $e han desarrollado tcnicas que hacen posible la automati!acin del proceso. # )ay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables*. +.# ,onta-e en .laca $tandard $tandard .late ,ount". /.# &eterminacin del n%mero ms probable. 0.# Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables. 1.# ,onta-e microscpico directo. +.# ,onta-e de .laca* ,onsiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se anali!a. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo' el tipo de microorganismo' el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. 2os cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie' aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. ,ada bacteria viable formar una

colonia' el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra. /.# 3iltros de membrana* utili!ados cuando el n%mero de bacterias es ba-o. $on filtros con un poro de 4'15 mm que retienen las bacterias. $e filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. 2a muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente' lo que facilita el recuento la epifluorescencia se puede provocar con naran-a de acridina que ti6e especficamente los cidos nucleicos". 0.# Microcolonias en &E37* &E37 son las iniciales en ing6ls de &irect Epifluorescence 3ilter 7echnique tcnica deepifluorescencia directa en filtro". En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente como la naran-a de acridina" para te6ir las clulas bacterianas se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas". 2a deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos' las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 1. ,onta-e de microcolonias al microscopio* $e a6ade un peque6o volumen de agar#cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.# 8otitas de agar* $e hacen diluciones de la muestra solucin madre" y se depositan gotitas de +4 ml en una placa .etri gotitas de cultivo 9 agar". $e examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. :.# 3ilms secos .etrifilm"* $on pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita + ml de la muestra que rehidrata el medio. 7ras la incubacin se hace el recuento. ;.# Mtodo del n%mero ms probable* <asado en series de diluciones y clculo estadstico del n%mero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. $e puede hacer con 0 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. =.# Mtodos basados en la reduccin de colorantes* >sando a!ul de metileno o resa!urina. ,olorantes reducidos por las bacterias( al reducirse cambian de color y esto es medible. >sado en medios lquidos lcteos". ?.# 7ubos rodantes* son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. >tiles para recuento de anaerobios. +4.# ,onta-e microscpico directo* >sando cmaras de cuenta' se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. ################ @ ################

# Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable tcnicas biolgicas" hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas' fsicas e inmunolgicas.

2. M#todos $%sicos &ara "a detenci'n de microorganismos. A" Bmpedancia* Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcan!ar unos valores de impedancia correspondientes a +4: # +4; clulas por ml#+. B&7* Bmdepedance &etection 7ime". Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin CescalonesD. <" Microcalorimetria* Estudio de los peque6os cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. 2os diferentes tipos de microorganismos metaboli!an los substratos de forma diferente y' por ello' se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento* usando un medio de cultivo con una composicin definida de a!%cares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metaboli!acin de los a!%cares presentes en el medio. ," ,itometria de flu-o* Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin( este sistema puede contener un detector capa! de medir diferentes parmetros diferentes tipos de fluorescencia' absobancia' dispersin de lu!' etc." lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

(. M#todos )u%micos de detecci'n de microorganismos. A" Eucleasa 7ermoestable* S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapide! y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. 2a endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado ba-as para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. <" 2isado de 2imulus* >sado para deteccin de endotoxinas derivadas del lipopolisacrido 2.$ de las bacterias 8ram negativas". $e basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus cangre-o de mar" producido por cantidades del orden de picogramos de 2.$. .uede detectar 044 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no#viables. Es muy rpido.

," $ondas de cidos nucleicos* $irven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. &" .,R* Mtodo para detectar n%mero extremadamente ba-os de microorganismos con una cierta rapide! basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin. E" Medida de A7.#* $e detecta la presencia de A7. usando luciferasa' aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. 3" Radiometria* Medida de la transformacin de un substrato con +1, en +1,F/* el tiempo necesario para detectar el +1,F/ es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. 8" $ubstratos 3luoro y ,romognicos* $e a6aden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos.

*. M#todos inmuno"'gicos. Eormalmente se usan antisueros que detectan flagelos responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias" A" Anticuerpo fluorescentes* $e utili!a anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que recono!ca el primero. $e pueden usar antisueros comple-os en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para ,lostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapide!. <" $erologia de enriquecimiento* En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella' el antisuero no se a6ade al alimento sino que se efect%a un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. ," 7est + # / de Salmonella* $istema con dos cmaras de agar blando. >na de las cmaras la de siembra" contiene un medio selectivo para Salmonella' las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. &" Radioinmunoensayo* se basa en el marca-e con un radioistopo de un antgeno determinado toxina producida por una bactera patgena" y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fi-ados sobre un soporte slido. E" E2B$A* El mtodo es similar al radioinmunoensayo* el antgeno se fi-a en un soporte slido' se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se

detecta mediante una actividad marcadora peroxidesa" unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de $almonellas. 7oxinas de $ aureus' micotoxinas' toxinas de C. botulinum' enterotoxinas de E. coli. 3" &ifusin en gel* Mtodo de Fuchterlony para deteccin de antgenos.

+. E,amen de su&er$icies. # Mtodos dirigidos a detectar y medir los n%meros de microorganismos presentes en superficies contaminadas. # Algunas veces es necesario a6adir agentes neutrali!antes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utili!ados para limpiar la superficie. # El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico. 2as muestras se recogen en seco o en h%medo y se depositan sobre medios de cultivo lquido generales o de enriquecimiento". # En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la -eringa de agar. -. Recuento de mo.os / "e aduras. $e reali!a o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a //G, o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario a6adir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias' que es ms rpido que el de los mohos.

REC0ENTOS
<a-o este nombre se incluyen las determinaciones cuantitativas de biomasa microbiana. Estas se pueden reali!ar de diferentes formas' y se propone la siguiente clasificacin*

1. Determinaci'n de" n1mero de microorganismos

Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado. Mtodo de las diluciones m%ltiples o del E%mero Ms .robable. 3iltracin por membrana e incubacin de sta sobre medio de cultivo slido. Recuento microscpico directo de los microorganismos' ya sea en frotis o en cmaras. 3iltracin por membrana' coloracin del filtro' y conteo al microscopio. ,onteo electrnico'usando contadores de partculas.

2. Determinaci'n de "a masa ce"u"ar

Medida de la masa. Medida del volumen. &eterminacin del contenido de E. 7urbidimetra. Eefelometra.

(. Determinaci'n de "a acti idad ce"u"ar

&eterminacin de una actividad en!imtica. &eterminacin de un metabolito. Medida del consumo de oxgeno. Medida de A7.. ,alorimetra. Medida de impedancia. Radiometra de ,F/". A los efectos de llevar a cabo cualquier tcnica de recuento' hay que tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a traba-ar' por cuanto es posible que algunos de los mtodos no sean aplicables. ,uando es necesario llevar a cabo diluciones' la toma y preparacin de la muestra se reali!a de la manera descripta en el repartido sobre toma de muestra. En las descripciones que siguen se denominar homogenei!ado a la muestra preparada para su anlisis microbiolgico.

1. Determinaci'n de" n1mero de microorganismos

REC0ENTO EN 2LACA
.ermite la determinacin de los microorganismos presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo' en placa' formando colonias. .or lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas HBA<2E$ en las condiciones de traba-o nutrientes' atmsfera' temperatura". ,omo las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas' se utili!a el trmino* >EB&A&E$ 3FRMA&FRA$ &E ,F2FEBA$ u.f.c." Adems' a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes' y que los errores del mtodo sean menores' se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 04 y 044

colonias por placa o menos seg%n el caso. ,uando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimacin del recuento' y si es posible se repite hasta caer en las condiciones ptimas. Procedimiento: 2a preparacin de la muestra se reali!a como para cualquier mtodo utili!ando diluyentes adecuados. $e preparan diluciones de + en +4 sucesivas' partiendo en general de +4 gramos de muestra para la primer dilucin' y tomando + m2 de sta descargndolo en ? m2 de diluyente y as sucesivamente. ,ada ve! que se prepara una dilucin se carga y descarga la pipeta tres veces' descargndola finalmente sobre el tubo con diluyente estril. $e descarta la pipeta luego de preparada cada dilucin. $eg%n la carga esperada' o permitida' se eligen las diluciones a sembrar. 8eneralmente' se siembran no menos de tres diluciones consecutivas E-.* +*+4 +4#+"' +*+44 +4#/"' +*+444 +4#0". >na ve! preparadas las diluciones' se siembra dentro de los +5 minutos siguientes . AE7E$ &E .RF,E&ER A 2A $BEM<RA $E RF7>2AE 2A$ .2A,A$' EE E2 3FE&F' ,FE 2F$ $B8>BEE7E$ &A7F$* Bdentificacin de la muestra* Eombre yIo E%mero de lote &ilucin Holumen sembrado $uperficie o incorporado 3echa Fperador $iembra en superficie* $e deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo' 4.+ m2 de cada dilucin. $e reali!a duplicado para cada dilucin. $e emplea la misma pipeta para todas las diluciones y se comien!a por la ms diluda. 2uego de reali!ada la descarga de la muestra' se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas' usando rastrillo estril' en el mismo orden que la siembra o sea de la ms diluda a la ms concentrada". $iembra incorporada* $e procede de la dilucin mayor a la menor' y se deposita + m2 de cada dilucin en placas estriles' vacas' por duplicado. .osteriormente' se agrega a cada placa +5 a /4 m2 del medio de cultivo a emplear' previamente fundido y termostati!ado a 15J, en ba6o o estufa. $e agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular' horario 1 veces o ms para polvos insolubles" y antihorario 1 veces" y movimiento hacia arriba y hacia aba-o siempre sin levantar la placa de la mesa". En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente' en general no ms de /.5 m2 por placa. Medio de cultivo: $e elige seg%n el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubacin: >na ve! enfriado el agar en el caso del incorporado' y secada la muestra en el caso de superficie' las placas se invierten' y se ponen en la estufa que corresponde seg%n los microorganismos a contar' incubndose el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente. Interpretacin: 3inali!ado el perodo de incubacin' observar con buena lu! a efectos de visuali!ar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partcula de muestra que pueda haber. $i molesta' borrar la escritura. ,ontar las colonias desarrolladas por placa. $e cuentan como colonias individuales' todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms peque6a. ,uando se utili!an medios EF $E2E,7BHF$ se procede de la siguiente forma* $e cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 04 y 044 colonias. $e hace el clculo promediando los valores y multiplicando por la inversa de la dilucin. $i slo hubiera placas con menos de 04 colonias' se informa igualmente el resultado' expresndolo por g o m2 de muestra.

$i no hubiera colonias en ninguna de las placas' se informa como* Menor que + o +4 seg%n sea incorporado en superficie" por la inversa de la dilucin menor. $i en todas las placas hubiera ms de 044 colonias' se E$7BMA el resultado contando las colonias en una superficie conocida de la placa y luego llevando a la superficie total de la placa* :5 cm/ para las de vidrio comunes' o 5; cm/ para las de plstico. $e siguen las siguientes reglas* +" $i hay menos de +4 colonias por cm/' se cuentan +0 cuadrados de + cm de lado* ; consecutivos hori!ontales y : consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 1.1 seg%n el tipo de placa' para estimar el n%mero de colonias en toda la placa. /" $i hay ms de +4 colonias por cm/' se cuentan 1 cuadrados de + cm de lado' y el promedio se multiplica por :5 o 5; seg%n el tipo de placa. 0" $i hay ms de +44 colonias en + cm/' no se cuentan sino que se estima el resultado como Mayor de :544 o 5;44 por placa. >na ve! estimado el n%mero de colonias por placa' se aplica el factor de correccin para expresar el resultado por gramo o m2 de muestra' de acuerdo al mtodo incorporado o superficie"' y a las diluciones plaqueadas. Es frecuente que desarrollen colonias extendidas' sobre la superficie' o el fondo y bordes de la placa' o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina KspreadersK y se cuentan como uno. ,uando el spreader cubre ms del 54L de la placa' esta no debe contarse. ,uando el spreader cubre una superficie menor del 54L' se cuentan las colonias en el resto de la placa' $F2F si estn uniformemente distribudas. $i en todas las placas hay spreaders se informa * $preaders 7odas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores' e-* contaminacin' mal funcionamiento del medio"' se informa como* KAccidente de laboratorioK .ara alimentos se utili!an los lmites de /5 a /54 ufcIplaca. ,uando se emplean medios $E2E,7BHF$' el n%mero de colonias que se considera ptimo para contar' suele ser menor de 044' es necesario referirse a la tcnica correspondiente de referencia" a los efectos de la interpretacin de los resultados. Expresin de los resultados: $e informan los resultados de recuento con slo &F$ ,B3RA$ $B8EB3B,A7BHA$' redondeando los valores cuando corresponda. E-* +1/ se informa +14 +55 se informa +:4 El informe debe decir* Recuento de microorganismos tipo"* @ u.f.c. Ig o m2 Ventajas desventajas de ambos m!todos: Incor&orado Su&er$icie Mayor cantidad de Menor cantidad de muestra muestra. Menor error Mayor error Me-or aprovechamiento de .eor aprovechamiento de nutrientes nutrientes &ificultades al subcultivar 3acilidad para subcultivar colonias colonias incorporadas. Hisuali!acin de colonias 3cil visuali!acin dificultada 7emperatura del agar Eo se afectan las clulas termosensibles a puede afectar ciertos microorganismos En aerobiosis slo crecen aerobios y &esarrollan microaerofilicos anaerobios facultativos

N0MERO MAS 2ROBABLE o METODO DE LOS T0BOS M0LTI2LES

$e basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo en funcin de que cre!can o de que produ!can determinada reaccin en el medio o no"' en diferentes cantidades de muestra. $e anali!an en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada ve! menores que se de-an crecer en medio lquido. .or e-emplo se utili!an un total de nueve tubos con medio de cultivo' en tres de los cuales se siembra 4.+ g. de muestra' en tres 4'4+ g. y en los otros tres 4.44+ g. 2uego de la incubacin' se observan y cuenta el n%mero de tubos positivos. $eg%n el tipo de microorganismo que se desea contar se utili!an medios de enriquecimiento selectivo' o medios de propagacin. En funcin de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que* a" hubo crecimiento b" hubo crecimiento y se produ-o gas que se ve en campana invertida &urham" c" hubo crecimiento y se produ-o vira-e de indicador d" hubo crecimiento y se produ-o pigmento Fcasionalmente' es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos' o sospechosos de serlo a placa' o a otro tubo a efectos de confirmarlo. El n%mero de tubos positivos" que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmacin' siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. ,ada tubo positivo' significa que en la cantidad de muestra en l sembrada haba por lo menos + microorganismo de los que se est contando. 2a interpretacin de los resultados' se hace en base a una distribucin de tipo .oisson' y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo ": EG de tubos sembrados* 5 5 5 Holumen de muestra en cIu m2"* +4 + 4'+ E%mero de tubos positivos* / 4 4 dos tubos positivos para la primera dilucin' ninguno en las siguientes" &e la tabla adecuada surge el valor* 5 en +44 m2 $e informa* E%mero ms probable de tipo de microorganismo" M 5I+44m2 Ejemplo #: EG de tubos sembrados* 0 0 0 Holumen por tubo m2" + + + &ilucin de la muestra* +4#/ +4#0 +4#1 Equivalente en gramosItubo 4.4+ 4.44+ 4.444+ 7ubos positivos 0 / 4 El resultado 0#/#4 se busca en tabla y se obtiene un valor de ?0Igramo' cuando en la primer serie de tubos se siembra 4.+ g' como en nuestro caso sembramos 4.4+ gramos debe aplicarse el factor de correccin M 4.+I4.4+ o sea +4 por lo que el resultado a informar es* EM. de tipo de microorganismo" M ?04Igramo Es de fundamental importancia antes de leer la tabla' asegurarse que est construda para condiciones similares a las de traba-o' que sea para igual n%mero de tubos por serie' y para cantidades de muestra que sean m%ltipo o subm%ltiplo. 2a correccin se hace utili!ando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un ndice de la carga microbiana' y se conocen los lmites de confian!a para cada valor. ,uando no se traba-a en las condiciones ms comunes para las que existen tablas' es posible calcular aproximadamente el valor de EM. usando la siguiente ecuacin*

Ventajas

desventajas del m!todo:

Este mtodo es especialmente %til para determinar cargas microbianas ba-as' menores de +4 por gramo' pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utili!ando las diluciones apropiadas. Asimismo' es el %nico mtodo a utili!ar en el caso de muestras como por e-emplo polvos insolubles' en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni recomendable el de placas debido a la presencia de partculas. $e prefiere tambin este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento' o cuando han sido sometidos a condiciones adversas temperatura alta' desecacin' etc.". Es posible enumerar tambin por este mtodo microorganismos anaerobios utili!ando en los tubos medio prerreducido' que se tapan con vaselina#parafina luego de inocular' e incuban en condiciones aerobias.

3ILTRACION 2OR MEMBRANA

Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida' o solucin en agua o en solvente apropiado miristato de isopropilo" a travs de un filtro de membrana estril dimetro 54 mm' poro 4.15 m"' colocado en un equipo de filtracin. 2uego de en-uagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro' y se lo coloca sobre la superficie de una placa de .etri con el medio de cultivo a utili!ar e incuba. 2os filtros pueden ser de distintos materiales( en microbiologa se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente' y pueden tener bordes hidrofbicos' que minimi!an la adsorcin de conservadores y antimicrobianos. 2uego de transcurrido el tiempo de incubacin' se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. $e considera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre /4 y /44 colonias en el filtro. $e utili!an filtros reticulados' y existen reglas para el conteo* +" $i hay + o / colonias por cuadrado del retculo' o menos' se cuentan todas./" $i hay entre 0 y +4 por cuadradito' se cuentan +4 cuadrados' y se promedia' multiplicando por +44 para obtener el n%mero de colonias en el filtro se multiplica por +44 porque el area del cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro". 0" $i hay entre +4 y /4 se cuentan 5 cuadrados y promedia' multiplicando luego por +44. 1" $i hay ms de /4 se considera N/444 por filtro 7oda ve! que se utilice el promedio por cuadrado' el recuento se informa como E$7BMA&F. Ventajas desventajas: +. $irve para determinar cargas muy ba-as' pues se puede filtrar vol%menes de +44 y hasta 544 m2 por ve!. /. Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos' por cuanto no es necesario neutrali!arlos. Expresin de los resultados: >na ve! conocido el n%mero de colonias por filtro' se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresndolo por gramo' o mililitro de muestra.

REC0ENTO MICROSCO2ICO DIRECTO

Este mtodo permite determinar el n%mero de clulas microbianas' por observacin a travs del microscopio. 2a muestra puede utili!arse tal cual' leche' o cultivos puros en medio lquido"' o puede prepararse una dilucin tal como se reali!a para otros mtodos de recuento.

$e basa en contar microorganismos en una cantidad conocida de muestra utili!ando frotis coloreados' cmaras del tipo de las de contar glbulos' o las especialmente dise6adas para contar hongos en alimentos como la cmara de )oOard. $e determina el n%mero 7F7A2 de clulas presentes HBA<2E$ P EF HBA<2E$". Fcasionalmente se pueden utili!ar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. .or e-emplo en un recuento en cmara de un cultivo de levaduras con a!ul de metileno' se pueden distinguir las clulas HBA<2E$ no absorben el colorante' se vern transparentes" de las EF HBA<2E$ absorben el colorante y se vern a!ules". Recuento so!re $rotis co"oreado $e marca sobre un portaob-etos limpio y desengrasado' un cuadrado de + cm de lado. $obre la superficie opuesta del portaob-etos' se deposita en el centro 4.4+ m2 de muestra ya sea con ansa calibrada o con pipeta. $e extiende por todo el cuadrado con ansa. $e de-a secar en posicin hori!ontal. $e fi-a y colorea' ya sea por 8ram o con a!ul de metileno + minuto mtodo de <reed para leche". $e observa por inmersin' contando los microorganismos en cada uno de varios campos. El n%mero de campos a contar depende del n%mero de microorganismos por campo y del factor del microscopio. $e transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche $tandard Methods for the Examination of &airy .roducts A.)A". E%mero de campos a contar seg%n el factor del microscopio y el n%mero de microorganismos*

3actor de" 044444 144444 544444 :44444 microsco&io microorganismos &or cam&o menos de +4 + a +4 04 /4 14 /4 54 /4 :4 04

ms de +4 +4 +4 +4 /4 C$lculo del %actor del microscopio ,on ob-etivo de 14 o +44 x' se mide el radio del campo utili!ando un portaob-etos calibrado' o el retculo de una cmara cuenta glbulos. $i se utili!a el de 14 x' luego debe hacerse la correccin utili!ando el factor 14I+44 para llevarlo al aumento de traba-o. $e calcula el rea del campo* r / El n%mero de campos por cm/ es* + I r / $i se extendi en + centmetro cuadrado 4'4+ m2 de muestra' el n%mero de campos por mililitro' llamado 3actor del Microscopio 3M"' se calcula de la siguiente forma* 3M M +44 I r/ donde r se expresa en cm' o 3M M +4444I r/ con r en mm Expresin de resultados >na ve! contado el n%mero de microorganismos en los campos que corresponde' se promedia' y multiplica por el 3actor del microscopio( de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en trminos de* Recuento microscpico directo M E microorganismos por m2 Recuento en c4mara de Neu!auer Es una cmara que se utili!a para contar glbulos y est dise6ada de manera de contener una cantidad fi-a de lquido. ,onsta de un cuadrado central de + mm de lado dividido en /5 cuadraditos. ,ada uno de ellos est' a su ve!' dividido en +: cuadrados.

$e coloca un cubreob-etos sobre la !ona cuadriculada' apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos' queda una distancia de 4.+ mm entre el cubreob-etos y la cmara. Esto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 4.+ mm0.

5enta6as de" m#todo7 Des enta6as de" m#todo7 Es rpido 2a cantidad de muestra anali!ada es poca 2os frotis se pueden guardar .rovoca cansancio del operador 2as exigencias de equipo son $lo sirve para muestras con cargas superiores a mnimas +4.444 por m2. $e pueden observar las diferentes Es difcil distinguir los microorganismos de las morfologas de los microorganismos. partculas de muestra $e observan tanto los >na inadecuada distribucin de la muestra sobre microorganismos viables como los no la superficie del portaob-etos puede ocasionar viables serios errores.

2. Determinaci'n de "a masa ce"u"ar

T0RBIDIMETR8A Este mtodo da informacin sobre el contenido de macromolculas' y no sobre el n%mero de clulas. En el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro' o un espectrofotmetro y se mide la absorbancia de la suspensin de microorganismos en comparacin con un blanco que es el medio esterili!ado' y sin sembrar. ,uanto mayor es el n%mero de clulas en suspensin' tanto menor es el porcenta-e de lu! que atraviesa el medio. $e cumple una ley similar a la de 2ambert#<eer y expresando la relacin en trminos de masa microbiana y absorbancia' la ecuacin es la siguiente* AM Q x R*

donde* A* Absorbancia Q* constante R* masa celular

2a grfica correspondiente construda con valores reales muestra una desviacin a medida que aumenta la masa microbiana. .ara utili!ar la medida de la absorbancia como mtodo de recuento' es necesario hacer para cada microorganismo una curva de calibracin' midiendo el n%mero de microorganismos por otro mtodo de recuento. El mtodo se emplea fundamentalmente para preparar inculos' cuando se traba-a con cultivos puros. Esca"a de Mac 3ar"and Existe la posibilidad de estimar cargas altas de microorganismos' comparando a simple vista con una escala formada por tubos numerados de + a +4 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario. $e conoce la cantidad aproximada de clulas bacterianas a que corresponde cada tubo' y de esa forma se puede estimar la cantidad de microorganismos presentes. 7ubo Millones de bacteriasI m2 + 044 / :44 0 ?44 1 +./44 5 +.544 : +.=44 ; /.+44 = /.144 ? /.;44 +4 0.444 Este mtodo slo da una estimacin del n%mero de m.o. viables y no viables" y sirve slo para cargas altas. .or otra parte' es muy rpido.

CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE BACTERIAS

INTRODUCCION
Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino microorganismo no tiene un significado ta onmico preciso sino !ue agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (" #.$ mm) aun!ue presenten grandes diferencias entre si. %s& por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. 'ambin difieren notablemente en el tama(o aun!ue sean todos microscpicos) en una escala comparativa tenemos* +rotozoarios , levaduras , bacterias , virus -%.'E/0%1 %un!ue e isten miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes* 2 elipsoidal o esfrica 2 cil&ndrica o en forma de bastn 2 espiral o helicoidal. Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan .3.31. 4uchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin !ue derivan de los diversos planos de divisin celular. %s& tenemos* 5 cocos en pares (diplococos)22222222222 Ej. 6eisseria 5 cocos en cadena 2222222222222222222222 Ej. 1treptococcus 5 cocos en racimo 2222222222222222222222 Ej. 1taphylococcus 5 cocos en ttradas 22222222222222222222 Ej. +ediococcus 5 cocos en cubos 22222222222222222222222 Ej. 1arcina 5 cocos sin distribucin especial Las clulas bacterianas cil&ndricas se denominan -%.0L31 o -%1'36E1 y presentan otros modelos de agrupacin. %s& tenemos* 5 bastones en cadena 22222222222222222222222222222222 Ej. -acillus 5 bastones en letras chinas o empalizadas 222222222222 Ej. .orynebacterium 5 bastones sin distribucin especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales, independientes) pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, n7mero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

DESCRIPCION DE LA MORFOLOGA DE COLONIAS DE BACTERIAS

OBSER5ACION 9 E:AMEN MICROSCO2ICO

2a observacin y examen de las bacterias se puede reali!ar de dos maneras fundamentales* Sobservando los microorganismos vivos sin te6ir. S observando las clulas fi-adas' te6idas con colorantes 2as bacterias vivas' en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del agua y' por lo tanto' son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se ti6en las bacterias' con lo que se hacen ms visibles. $in embargo' para muchos fines es preferible evitar la coloracin debido a que frecuentemente altera y mata a las clulas. En los casos en los que se quieren observar los microorganismos vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o en su defecto un microscopio de campo claro en iluminacin mnima. Tsta se logra ba-ando el condensador minimi!ando la iluminacin. El movimiento de traslacin de algunas bacterias puede observarse en preparaciones h%medas del material' es decir con los microorganismos vivos. &ebe distinguirse claramente el movimiento independiente de las bacterias mviles del movimiento por arrastre con corrientes de conveccin y el movimiento broOniano de las bacterias inmviles. ,uando el movimiento se realice por propulsin flagelar' el tipo de movimiento variar con la disposicin de los flagelos en el cuerpo celular. Aunque las bacterias no difieren en sus propiedades pticas del medio externo' si son muy diferentes desde el punto de vista qumico( esto es lo que permite distinguir las bacterias por tincin' pues generalmente el colorante reacciona con la clula bacteriana pero no lo hace con el medio. 2a coloracin de las bacterias tiene como fines* S aumentar el contraste de las clulas con el medio que las rodea. Esto implica me-orar la visuali!acin de las bacterias y permitir la distincin de formas y tama6o. S diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes. S revelar la presencia de distintas estructuras internas. 2os colorantes utili!ados son sales en las que el anin o el catin es el responsable del color( en el primer caso se trata de un colorante cido o aninico y en el segundo' bsico o catinico. 2a clula bacteriana tiene una dbil carga negativa cuando el medio externo tiene un p) cercano a la neutralidad. ,omo la diferencia de carga elctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la clula' las bacterias tendrn afinidad por los colorantes bsicos e-.* cristal violeta y a!ul de metileno". ,uando se utili!a un solo colorante bsico el mtodo se denomina coloracin simple' mientras que se llama coloracin compuesta cuando se usan dos o ms( la coloracin diferencial es un caso particular de coloracin compuesta. ,uando a una preparacin bacteriana se le aplica un colorante cido tal como eosina y la nigrosina' este no se une a las clulas cargadas negativamente'

pero si se deposita alrededor de ellas quedando as un fondo coloreado donde contrastan las clulas incoloras. Eo es' por lo tanto' una verdadera tincin y se denomina tincin negativa o indirecta. En algunas ocasiones es necesario utili!ar un mordiente' es decir' alguna sustancia que contribuya a la fi-acin del colorante a la clula' por e-emplo* cido tnico' sales de Al' 3e' etc. 2re&araci'n de un $rotis ,omprende las siguientes etapas* +" extendido del material en un portaob-etos transparente. /" $ecado. 0" fi-acin. El propsito de la fi-acin es matar los microorganismos' coagular el protoplasma de la clula y adherir la preparacin al portaob-etos. $in el proceso previo de fi-acin se lavara la capa de clulas durante el proceso de tincin. El agente fi-ador ideal preserva las estructuras de la clula con su forma y posicin sin que apare!can estructuras que no existan en la clula original. El calor es el mtodo de fi-acin utili!ado para la observacin de la morfologa de clulas microbianas. ,uando adems de los microorganismos interesa la observacin de clulas animales' se utilia un mtodo qumico como la fi-acin por metanol y por formol que altera menos que el calor' la morfologa de las clulas animales. ,oloracin simple >na ve! fi-ada una preparacin' puede emplearse para te6ir las clulas los siguientes colorantes bsicos* a!ul de metileno' cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicacin sern distintos. ,oloracin 8ram 2a tincin simple se basa en que las clulas bacterianas difieren desde el punto de vista qumico de su medio externo y por eso se ti6en' contrastando con el. 2os microorganismos tambin difieren fsica y qumicamente entre si y por eso reaccionan de una manera diferente frente a un determinado proceso de tincin. Esto constituye el fundamento de las tinciones diferenciales. 2a tincin de 8ram' la ms empleada en bacteriologa' es una tincin diferencial. .or este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos* 8ram positivos 8ram 9" y 8ram negativos 8ram #"' en funcin de su reaccin frente a la coloracin. $eg%n este procedimiento' las clulas previamente fi-adas' se ti6en con solucin de cristal violeta' se lavan y se tratan con lugol. El iodo forma un comple-o con el cristal violeta' que sirve para fi-ar ste a la clula. 2uego se agrega un agente decolorante alcohol' acetona o me!clas de ambos" en el cual el comple-o iodo#cristal violeta es soluble. Algunos microorganismos son decolorados 8ram # mientras que otros no 8ram 9. 2uego de la decoloracin se aplica un colorante de contraste' generalmente safranina' que hace visibles los microorganismos 8ram # que

haban sido decolorados. ,uando se observa una preparacin as te6ida se ven bacterias a!ul violeta 8ram 9 y rosadas 8ram #. En los 8ram # el comple-o es extrado por el alcohol mientras que en los 8ram 9 no. 2as bacterias 8ram 9 poseen paredes gruesas de peptidoglicano' se deshidratan por el alcohol. Esto provoca que se cierren los poros de la pared' impidiendo que el comple-o iodo#cristal violeta se escape. En las bacterias 8ram #' la fina capa de peptidoglicano no evita el pasa-e del solvente y el escape del comple-o yodo#cristal violeta de la clula. 2as levaduras' que poseen una pared celular gruesa pero de una composicin qumica totalmente diferente' se ti6en como 8ram 9. Eo son los constituyentes qumicos' sino la estructura fsica de la pared lo que le confiere la 8ram positividad. ,oloracin de cido resistentes 2a tincin de cido#resistentes es una tincin diferencial que demuestra la resistencia de la clula a ser decolorada por los lcalis' cidos y alcohol. En algunos microorganismos de los gneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad cido resistente est relacionada con su alto contenido en lpidos. 2a tincin de estas bacterias debe hacerse con colorantes que tengan alta afinidad por tales clulas y en caliente. El mtodo general consiste en te6ir el frotis en caliente' decolorar con alcohol cido no se decoloran los cido resistentes" y luego te6ir con un colorante de contraste. &e esta forma quedan las bacterias cido resistentes con el color inicial y las dems con el color de contraste. ,oloracin de estructuras S Esporas ,iertas especies bacterianas' en particular de los gneros <acillus y ,lostridium' producen elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de la clula' a ra!n de una por clula. A diferencia de la clula vegetativa que la produce' la espora es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura' ba-a humedad' radiaciones y agentes qumicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos perodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas pueden germinar. 7ambin puede inducirse esa germinacin mediante' por e-emplo' un shocQ trmico' es decir un calentamiento a =4G,. 2as esporas son altamente impermeables a los colorantes' de manera que con las tcnicas de coloracin comunes aparecern como regiones sin te6ir dentro de las clulas coloreadas. .or lo tanto' para te6ir las esporas especficamente' deben usarse mtodos de coloracin especiales( por otra parte' una ve! coloreada' la espora resiste fuertemente la decoloracin y el contraste. 2os datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloracin son* presencia o ausencia de esporas. deformacin o no del cuerpo celular. posicin dentro del cuerpo celular. En base a la posicin de la espora dentro de la clula se las clasifica en* terminales espora en el extremo del cuerpo celular"

centrales espora en el centro del cuerpo celular" centrales a terminales o subterminales posicin intermedia" S 3lagelos Muchas bacterias son mviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe generalmente a la presencia de estructuras especiales' los flagelos. $on apndices largos' delgados' de forma helicoidal' libres en un extremo y unidos a la clula por otro. $on tan delgados que solo se pueden ver al microscopio com%n luego de una coloracin especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fi-acin de las molculas de colorante al flagelo dando lugar a la formacin de un precipitado a lo largo del flagelo' hacindolo visible. 2a clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en* # polar* flagelo en un extremo del cuerpo celular # anfitrica* flagelos en ambos extremos # lofotrica* penacho de flagelos en un extremo # peritrica* flagelos alrededor de toda la clula sin distribucin.

En las fotos se observan flagelos' te6idos con cido tnico mordiente" y fucsina bsica' en disposicin peritrica. S ,psula ,iertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacridos' polipptidos o comple-os glucoproteicos. ,uando este material se dispone de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cpsula. 2a me-or forma de observarla es con tincin negativa' aunque existen tcnicas especiales' para la coloracin especfica de la cpsula. Medicin de tama6o 2a medicin del tama6o longitud y dimetro" de las bacterias' no se puede reali!ar con la precisin y exactitud deseables debido a dificultades tcnicas inevitables. 2os lmites del microorganismo se ven difusos en el microscopio com%n y en el de contraste de fases( el problema se reduce si se coloca la

muestra sobre un medio con ndice de refraccin mayor' como por e-emplo gelatina. 2os microorganismos en preparaciones fi-adas y coloreadas sufren deformaciones que hacen que las medidas sean solo aproximadas. Adems los preparados secos' fi-ados a%n con formol" y coloreados no revelan la pared celular. Eo se debe medir el tama6o con coloracin negativa en caso de organismos encapsulados( adems' debido a que tanto la bacteria como el colorante tienen carga negativa' este se seca a una peque6a pero significativa distancia de la bacteria' lo que hace que esta apare!ca ms grande' a%n cuando no tenga cpsula.

TECNICAS
Manipulacin asptica de cultivos 7omar el tubo de cultivo con la mano i!quierda' de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar que el tapn est libre' girndolo sin destapar. 7omar el ansa con la mano derecha' con los dedos pulgar' ndice y mayor' de-ando libres el anular y el me6ique. Uuemar el ansa introduciendo la punta en el cono fro de la llama del mechero' en posicin vertical y luego ir levantndola hasta que quede toda al ro-o. .asar el ansa por la llama en un ngulo de :4G con la vertical' mantenindola siempre en posicin paralela al cuerpo. 3lambear el metal adyacente al ansa. 7raba-ando cerca del mechero' tomar el tapn de algodn del tubo con los dedos anular y me6ique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo( flambear la boca del tubo. Bntroducir el ansa tocando la pared fra dentro del tubo sin soltar el tapn de algodn" para que se enfre el ansa y luego introducirla en el cultivo lquido o desli!arla sobre la superficie del cultivo slido de aba-o hacia arriba' para tomar las clulas a transferir inculo". $acar el ansa as cargada del tubo' flambear la boca del tubo y taparlo. 7ransferir el inculo' ya sea a un portaob-etos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Uuemar nuevamente el asa. $iempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse seg%n tcnica asptica descrita' con el fin de no introducir contaminacin en el cultivo y en la muestra.

Fbservacin de preparado fresco. .ara observar movilidad' forma' etc" A" Mtodo de la gota pendiente ,olocar una gota de muestra usando tcnica asptica en el centro de un cubreob-etos limpio. Bnvertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresin de una lmina excavada' de manera que no deslice la gota por el cubreob-eto. 2a gota no debe tocar el fondo de la depresin. Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Fbservar con el lente seco de mayor aumento. <" Mtodo de lmina#laminilla ,olocar una gota de la muestra usando tcnica asptica con ansa o con pipeta estril" sobre un portaob-etos limpio y cubrir con un cubreob-etos. .ara prevenir las corrientes de conveccin y el secado de la preparacin' se puede sellar poniendo en los bordes del cubreob-etos Haspar' petrolato o esmalte de u6as incoloro. Fbservar igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visin es mucho me-or.

.reparacin de un frotis ,olocar con un ansa una gota de muestra' si es lquida' sobre un portaob-etos limpio. $i la muestra proviene de un cultivo en medio slido' colocar primero una gota de agua sobre el porta' tomar la muestra con el ansa' tocar la gota' quemar el ansa y luego de enfriada' me!clar bien con el agua. $ecar al aire. .uede acelerarse el secado' manteniendo la lmina encima de la llama del mechero a +5 cm o ms de distancia. Es conveniente sostener el portaob-etos con la mano' ya que si la mano no soporta el calor de la llama' las clulas pueden deformarse y te6irse defectuosamente". 3i-ar. ,on el frotis seco' pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fi-ar. ,oloracin simple

.reparar un frotis seg%n la tcnica habitual antes descrita. ,olocar el porta sobre un soporte para tinciones. ,ubrir la preparacin con / o 0 gotas de solucin de a!ul de metileno y de-ar +min o de cristal violeta y de-ar 04s". 2avar con agua. $ecar con papel de filtro o encima del mechero. Fbservar al microscopio con lente de inmersin y determinar forma' disposicin y relacin de tama6os de las distintas bacterias. ,oloracin de 8ram 7cnica de )ucQer" .reparar un frotis seg%n la tcnica antes descrita. ,olocar el porta sobre un soporte para tinciones. ,ubrir con solucin de cristal violeta y de-ar actuar + min. 2avar suavemente con agua de la canilla. ,ubrir con lugol y de-ar actuar + min. 2avar de la misma manera. ,ubrir con etanol ?5L y de-ar 04 s moviendo suavemente la lmina. $eguir lavando con etanol hasta que este no arrastre ms colorante. 2avar con agua . ,ubrir con solucin de safranina y de-ar + min. 2avar y secar. Fbservar por inmersin. 2as bacterias 8ram 9 se vern de color a!ul#violeta y las 8ram # rosadas. &eterminar forma' disposicin y tama6o relativo y reaccin al 8ram de las distintas bacterias presentes. ,oloracin de esporas .reparar un frotis pasando +4 veces por la llama para fi-ar. ,olocar la lmina sobre una plancha para tinciones. ,ubrir con peque6os tro!os de papel de filtro' impregnar stos con solucin de verde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturado con verde de malaquita mediante agregado de solucin. 2avar suave pero abundantemente con agua. &ar contraste con solucin de safranina durante 04 s. 2avar con agua y secar. Fbservar por inmersin. $e vern las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. $i se dispone de un microscopio con contraste de fases' se puede observar la endospora sin te6ir como una estructura densa' blanca dentro de la clula. Fbservacin de cpsula ,olocar una ansada de tinta china en un portaob-etos limpio y me!clar con una ansada de cultivo. ,ubrir con un cubreob-etos. Fbservar por inmersin. 2as cpsulas aparecen como !onas claras alrededor del organismo refrctil

sobre fondo oscuro. ,oloracin de bacterias cido resistentes tcnica de Viehl#Eeelsen" .reparar un frotis. ,olocar el porta sobre un soporte para tinciones. ,ubrir con solucin de fucsina bsica y calentar' por deba-o' con el mechero hasta que se desprendan vapores sin hervir". Mantener as durante 5 min. con calentamiento intermitente seg%n sea necesario. Eo recalentar. 2avar con agua de la canilla hasta que no apare!ca colorante en el agua de en-uague. ,ubrir con solucin decolorante alcohol#),l"' lavar inmediatamente con agua de la canilla y repetir la operacin hasta que el preparado quede rosa plido. ,ubrir con solucin de contraste a!ul de metileno" y de-ar durante /4#04 s. 2avar con agua de la canilla' secar con papel de filtro. Fbservar por inmersin. 2as bacterias cido resistente se vern ro-o#rosadas y las dems a!ules.

MICROSCO2IA 3L0ORESCENCIA

DE

2a microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica que la microscopa com%n' con diferencias en el mane-o y el dise6o relacionadas con la generacin y transmisin de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visuali!ar' ya sean propios de la muestra o de la coloracin utili!ada. 2os procesos de excitacin generalmente requieren longitudes de onda cortas' en el >H cercano lmpara de halgeno#cuar!o' arcos de mercurio' etc." 2as lentes deben ser de alg%n material generalmente fluorita" que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersin de ser no fluorescente. $e encuentran diversos e-emplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas' esteroides' porfirinas' etc. >n e-emplo de estudio de bacterias por visuali!acin directa de fluorocromos naturales es la observacin de bacterias metanognicas con lu! >H. Estas fluorescen con lu! >H en preparaciones sin coloracin debido al la presencia de coen!imas fluorescentes 3 1/4 y 3 054' relacionadas con el metabolismo del , y la metanognesis. Ftros compuestos que fluorescen rodamina' auramina' fluorescena' colorantes de acridina" se utili!an en distintas tcnicas de tincin( por e-emplo la tincin de microorganismos cido#resistentes con auramina#rodamina en muestras de te-ido y esputo.

7ambin se utili!an las tcnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicacin a la muestra' de una solucin de un Ac marcado con una sustancia fluorescente( si la muestra tiene el Ag que se busca' este reaccionar con el Ac fluorescente y as se locali!ar el Ag. 7al es el caso' por e-emplo' de la deteccin de $almonella con Ac marcados con fluorescena y la deteccin de 7reponema pallidum. ,oloracin fluorescente de microorganismos cido#resistentes 7cnica K.rocedures for the isolation and Bdentification of MycobacteriaK' .ublic )ealth $ervice .ublication EG +??5' +?:?" .reparar un frotis 3i-ar' calentando a :5#;5J, durante' por lo menos / horas. ,ubrir con solucin de auramina#rodamina y de-ar +5 min a temperatura ambiente. 2avar con agua. ,ubrir con solucin de WMnF1 4.5L solucin de contraste" y de-ar no ms de /#1 min. 2avar con agua. $ecar al aire y observar con microscopio de fluorescencia. ,on este sistema los organismos cido#resistentes emiten una fluorescencia amarillo#naran-a. 2as partculas fluorescentes no especficas son' usualmente de color amarillo plido. .reparacin de las soluciones $olucin de auramina#rodamina Auramina F .............. +.54 g Rodamina < ............. 4.;5 g 8licerol ..................... ;5.4 m2 3enol ......................... +4 m2 Agua destilada ......... 54.4 m2 Me!clar y de-ar toda la noche. 3iltrar con lana de vidrio para clarificar. Esta solucin se mantiene varios meses a 1G, o a temperatura ambiente. Almacenar en frasco oscuro. $olucin decolorante ),l conc. ............... 5 m2 Etanol ;4L .............. +44 m2 $olucin de contraste WMnF1 ................... 4.5 g Agua destilada csp ...... +44 m2 8uardar en frasco oscuro.

TECNICAS DE 2RE2ARACION DE LAS SOL0CIONES COLORANTES ,oloracin simple

S ,ristal violeta 3rmula de )ucQer" ,ristal violeta ........................... / g Etanol ?5L vIv" ...................... /4 m2 Fxalato de amonio +L vIv" ......=4 m2 &isolver el cristal violeta en etanol. Agregar el oxalato de amonio y de-ar 1= horas antes de usar. S A!ul de metileno 3rmula de 2oeffler" ,loruro de a!ul de metileno ................ +.: g Etanol ?5L vIv" ............................... +44 m2 )idrxido de potasio 4.4+L OIv"...... +44 m2 .reparar una solucin alcohlica saturada de a!ul de metileno agregando el colorante al alcohol. Agregar 04 m2 de esta solucin a la de WF). ,oloracin de 8ram tcnica de )ucQer" S ,ristal violeta frmula de )ucQer" S 2ugol Podo ................................. + g Poduro de potasio ............. / g Agua destilada ................. 044 m2 &isolver el yodo y el WB en el agua. &e-ar de un da para el otro si es necesario' para disolver completamente. Almacenar en frasco oscuro. S $afranina $afranina /.5L OIv" en alcohol ?5L .. +4 m2 Agua destilada .................................... +44 m2 ,oloracin de cido resistentes tcnica de Viehl#Eeelsen" S ,arbofucsina 3ucsina bsica ....................... 4.0 g Etanol ?5L vIv" .................... +4 m2 3enol cristales fundidos" ......... 5 m2 Agua destilada ........................ ?5 m2 &isolver la fucsina bsica en el etanol( luego agregar el fenol disuelto en el

agua. Me!clar y de-ar varios das' filtrar antes de usar. S Alcohol#cido Etanol ?5L vIv" .................. ?; m2 ),l conc. ............................. 0 m2 S A!ul de metileno ,loruro de a!ul de metileno ..... 4.0 g Agua destilada ....................... +44 m2 ,oloracin de esporas S Herde de malaquita Herde de malaquita ................. 4.5 g Agua destilada ....................... +44 m2 S $afranina $afranina /.5L OIv" en alcohol ?5L .. +4 m2 Agua destilada .................................... +44 m2

A; M<TODOS DE ESTERILI=ACI>N

Fb-etivos* Adquirir experiencia en el mane-o de equipos de esterili!acin y aplicar mtodos de desinfeccin y esterili!acin empleando distintos agentes fsicos o qumicos. Agentes $%sicos Ca"or .1medo ?autoc"a e; El alumno se familiari!ar con el uso del autoclave que incluye* +# .reparacin del material a autoclavar. /# ,arga del autoclave con el material a esterili!ar o decontaminar. 0# ,ierre del autoclave y encendido. 1# Eliminacin del aire contenido en su interior hasta emisin de chorro continuo de vapor por la espita o vlvula de descarga". 5# ,ierre de la vlvula de descarga y control hasta llegar a la presin de esterili!acin deseada. :# ,ontrol del tiempo de esterili!acin requerido. ;# Apagado del autoclave. =# Apertura de la vlvula para igualar presiones. ?# Retirado y secado del material autoclavado. $e esterili!arn distintos materiales de vidrio y otros que resistan la temperatura' como as tambin soluciones y medios de cultivo. 7ambin se decontaminar material que contenga cultivos bacterianos en especial cultivos de microorganismos que forman esporas". $e harn controles de esterilidad despus del autoclavado para verificar que el proceso fue eficiente. Ca"or seco ?.orno; +# .reparacin del material a hornear. /# ,arga del horno. 0# ,ontrol hasta llegar a la temperatura de esterili!acin. 1# ,ontrol del tiempo de esterili!acin. 5# Apagado' enfriado y apertura del horno. $e esterili!arn materiales que no puedan ser autoclavados yIo que resistan altas temperaturas. Incineraci'n &or ""ama El alumno adquirir prctica en el flameado de la boca de botellas' frascos y tubos y en la esterili!acin y decontaminacin del ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos. Radiaci'n u"tra io"eta $e emplear la radiacin ultravioleta como agente desinfectante o esterili!ante. $e pondrn deba-o de la lu! >.H. ob-etos que no puedan autoclavarse ni hornearse E-* tapas plsticas' membranas filtrantes' etc.". 3i"traci'n $e proceder a esterili!ar lquidos que contienen componentes sensibles al calor como protenas' vitaminas' antibiticos y soluciones salinas definidas.

$e emplearn filtros de celulosa utili!ando vaco o presin positiva. Agentes )u%micos $e emplearn distintos agentes germicidas y desinfectantes soluciones de hipoclorito de sodio' cloroxilenol' formaldehido' etc." para desinfectar superficies. $e anali!ar la reduccin de la cantidad de microorganismos presentes en una mesada de traba-o' pasando un hisopo con el que se sembrarn placas conteniendo agar nutritivo' antes y despus de haber sido tratada con el desinfectante en cuestin. Bi!"iogra$%a7 $eeley' ).R.Xr.( HandermarQ' ..X. ' 2ee' X.X.' YMicrobes in action. A laboratory manual of microbiologyY. Editores R. ). 3reeman and ,ompany' ,uarta Edicin' ,aptulo 5' +??+. 7ortora 8.X.' 3unQe <.R.' ,ase ,.2. Bntroduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia $A' Varago!a Espa6a' +??0. Hullo &.2.' Rachsman M.<.' Alch 2.E. Microbiologa en .rctica. Editorial Atlante $.R.2. <uenos Aires' /444. B; T<CNICAS MICROBIOL>GICAS B@SICAS F<XE7BHF$ Adquirir experiencia en el mane-o de los materiales y tcnicas bsicas que se utili!arn a lo largo del curso de traba-os prcticos. Refor!ar los conocimientos previos sobre el traba-o de laboratorio en condiciones de esterilidad. ,oordinar la operativa de traba-o en el laboratorio y las normas de seguridad. &esarrollo del traba-o prctico # En todos los prcticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe' en primer lugar' limpiar el rea de traba-o de la mesada con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. # .reparar placas de .etri con agar nutritivo fundido y mantenido a 15 J,. # Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 0; J,. #.reparar y rotular tubos de hemlisis para reali!ar diluciones seriadas al dcimo desde +4#+ hasta +4#1. # ,olocar en cada tubo +'= ml de solucin fisiolgica estril siguiendo las instrucciones del docente en cuanto al traba-o en esterilidad. A Agregar al tubo rotulado +4#+ '4'/ ml de una solucin de colorante estril. &escartar la pipeta. )omogenei!ar en agitador. ,on una nueva pipeta tomar

4'0 ml del tubo anterior y descargar 4'/ ml de esta dilucin +4 #+" en el tubo rotulado +4#/. ,ontinuar haciendo las diluciones hasta +4 #1. # A partir de la dilucin +4#1 sembrar* a" con ansa por estriado sobre agar nutritivo b" con pipeta 4'+ ml" y posterior rastrillado sobre agar nutritivo' 2 # Bncubar las placas sembradas a temperatura ambiente hasta la clase siguiente.

.rocedimiento para preparar una placa por volcado profundidad".

aislamiento en

A" 3undir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mano sin quemarse. <" 3lamear el ansa ," y &" 7ransferir microorganismos al medio con el ansa. E" Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogeinice bien. 3" Holcar en una placa de .etri estril.

8" Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribucin. )" Bncubar boca aba-o. >n mtodo alternativo muy usado es volcar en la placa vaca una suspensin bacteriana y luego con el medio fundido y enfriado seg%n A" volcarlo y efectuar los pasos 8" y )".

2rocedimiento &ara o!tener co"onias ais"adas estriando en &"aca7 A" 3lamear el ansa <" Fbtener un inculo con ella en forma estril" ," Estriar con el ansa en medio estril contenido en una placa de .etri siguiendo uno de los modelos mostrados en &.

Siem!ra en agar inc"inado ?&ico de $"auta; &or estr%a. A" 3lamear el ansa <" Fbtener material a sembrar ,"Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el dise6o mostrado en &"

Bnoculacin por puncin A" 3lamear un ansa recta <" $umergirla una ve! fra' en una suspensin bacteriana ," .un!ar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino que para la inoculacin. &" 3lamear el ansa E" Bncubar el tubo

T.2.NB2 DI5ERSIDAD MICROBIOL>GICA 2a microbiologa es el estudio de los microorganismos' grupo grande y diverso de formas de vida libre que existen como clulas aisladas o formando grupos. As pues' las clulas microbianas son diferentes de las clulas de los animales y las plantas que son incapaces de vivir aisladas en la naturale!a' en vista de que %nicamente pueden sobrevivir como parte de organismos multicelulares. 7odas las clulas contienen protenas' cidos nucleicos' lpidos y polisacridos. &ebido a que estos componentes qumicos son comunes a todo el mundo vivo' se piensa que todas las clulas descienden de un ancestro com%n. A travs de millones de a6os de evolucin se ha originado la extraordinaria diversidad de tipos celulares que existen en la actualidad. 2os microorganismos pueden dividirse para su estudio en cinco grupos principales* algas' hongos' proto!oarios' bacterias y virus. Estos cinco grupos pueden dividirse a su ve! seg%n su organi!acin celular en eucariotas algas' hongos y proto!oarios" y procariotas bacterias"( los virus no presentan estructura celular. A continuacin se mencionan algunas de las caractersticas ms importantes de los grupos de organismos eucariticos* A"gas* ,on-unto grande y variado de organismos eucariticos que contienen clorofila y otros pigmentos fotosintticos en estructuras membranosas llamados cloroplastos. 2levan a cabo una fotosntesis oxignica . Eo deben confundirse con las cianobacterias antiguamente llamadas Kalgas verde# a!uladasK"' nombre que recalca su forma procaritica". $on unicelulares o coloniales. ,uando las clulas se acomodan extremo con extremo se las llama filamentosas. Algunas llegan a medir varios metros de longitud. &entro de los principales grupos de algas podemos mencionar* ,lorophyta algas verdes"' Euglenophyta euglnidos"' ,hrysophyta algas pardo#doradas' diatomeas"' .haeophyta algas pardas"' .yrrophyta dinoflagelados"' Rhodophyta algas ro-as". Congos* En contraste con las algas' los hongos carecen de clorofila. $e diferencian de las bacterias porque las clulas f%ngicas son mucho mayores y contienen un n%cleo' vacuolas y mitocondrias' tpicas de las clulas eucariticas. 7odos los hongos son organotrficos. 2os habitats son muy diversos* acuticos' terrestres' patgenos de plantas y animales. 7res grupos de hongos tienen una importancia prctica* mohos' levaduras y setas. 2os mohos son hongos filamentosos se desarrollan sobre el pan' queso o fruta". ,ada filamento %nico se llama hifa' y su con-unto se denomina micelio. .resentan esporas asexuales conidios" y sexuales. 2as levaduras son hongos unicelulares. 2as clulas son esfricas' ovales o cilndricas y en general la divisin celular se lleva a cabo por gemacin. 2as levaduras florecen en habitats donde hay a!%cares' por e-emplo' frutas' flores y la corte!a de los rboles. Algunas especies viven en simbiosis con animales' sobre todo insectos y algunas son patgenas para los animales y el hombre. 2as ms importantes comercialmente pertenecen al gnero Saccharom ces. 2as setas

son hongos filamentosos que forman estructuras grandes llamadas cuerpos fructificantes' que es la parte comestible de la seta. 2rotoDoarios* $on microorganismos eucariticos unicelulares que carecen de paredes celulares. .or lo general son incoloros y mviles. 2os proto!oarios se encuentran en una variedad de habitats de agua dulce y de agua de mar' gran cantidad de ellos son parsitos de otros animales' incluyendo al hombre y algunos se encuentran sobre la tierra o en habitats areos' por e-emplo las superficies de los rboles. $e alimentan ingiriendo partculas o macromolculas. 2os proto!oarios que se mueven con movimientos ameboideos se denominan $arcodina' los que utili!an flagelos son los Mastigforos' y los que utili!an cilios' los ,iliforos. 2os Esporo!oos' generalmente no son mviles y son parsitos de otros animales. En el traba-o prctico se observar material fresco de diverso origen* agua o sedimento proveniente de lagos' arroyos y rios' como as tambin a partir de cultivos de laboratorio a fin de identificar algunos de los microorganismos pertenecientes a los grupos descriptos anteriormente. 7ambin se observarn preparados permanentes. 2ARTE A7

MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE

?OBSER5ACI>N MACROSC>2ICA; F<XE7BHF$ # Fbservar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente laboratorio de 7..."' determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen. #.oner de manifiesto la necesidad de traba-ar en estricta esterilidad en microbiologa debido a la gran facilidad con que se puede contaminar el material de traba-o. &E$ARRF22F &E2 .RZ,7B,F +# Exponer placas con agar nutritivo al medio ambiente durante distintos tiempos. /# Estriar con un hisopo previamente pasado por la mesada de traba-o sobre una placa con agar nutritivo. 0# Bncubar las placas a temperatura ambiente hasta la clase siguiente. 1# Fbservar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes caractersticas*

.3orma* puntiforme' circular' ri!oide' irregular' filamentosa. .7ama6o* grande ms de 0 mm"'mediana /#0 mm"' peque6a +#/ mm" .,olor .<orde* entero' ondulado' lobulado' filamentoso' ondeado .Elevacin* plano' elevado' convexo' pulvinado' umbonado .$uperficie* suave' brillante' rugosa' plegada' seca' polvorienta

2ARTE B7 E5AL0ACI>N DE LA DI5ERSIDAD MICROBIANA EN 0NA M0ESTRA NAT0RAL

Co"umna de EinogradsF/
Bntroduccin A diferencia de los estudios reali!ados por 2uis .asteur y Roberto Woch sobre cultivos puros' dos famosos microbilogos* $ergei E. RinogradsQy +=5:# +?50" y Martinus Rillem <ei-erincQ +=5+#+?0+"' fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos que conviven en un mismo habitat y cuyas poblaciones se me!clan. >na demostracin simple de laboratorio # la columna de RinogradsQy# ilustra cmo diferentes microorganismos interact%an entre s' de forma tal que la actividad metablica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas' que llevan el nombre del microbilogo ruso que las

utili! por primera ve!' son sistemas completos autoreciclables' puestos en marcha solamente por energa lumnica. Bnicialmente' todos los microorganismos estn presentes en muy ba-a proporcin' pero cuando la columna se incuba por / o 0 meses' los distintos tipos de microorganismos proliferan y ocupan distintas !onas en donde las condiciones ambientales favorecen sus actividades especficas. 2a columna de RinogradsQy es una demostracin clsica de cmo los microorganismos ocupan micrositios altamente especficos de acuerdo a sus tolerancias ambientales y sus requerimientos de carbono y energa. Adems' la columna permite ver cmo los elementos minerales son reciclados tal como ocurre en los ambientes naturales. En este traba-o prctico' se enfoca principalmente la utili!acin del a!ufre por los distintos microorganismos' pero reali!ando peque6as modificaciones se pueden estudiar ciclos equivalentes para el nitrgeno' carbono y otros elementos. Materia" de "a!oratorio Muestra de barro de un arroyo' lago' pantano o costa de mar o ro aproximadamente +44 [+54 gr de sedimento superficial o subsuperficial". Recipiente alto de paredes trasparentes y rectas botellas plsticas o probetas de vidrio. 7apn de goma o cobertura plstica. .ipetas de vidrio' portaob-etos' cubreob-etos' ca-as de .etri. Medios de cultivo de enriquecimiento' selectivos y diferenciales' colorantes' reactivos para reali!ar pruebas bioqumicas. .apel de filtro o en su defecto papel de diario finamente cortado. 5 gr de cada una de las siguientes sales* ,a,F 0 ' ,a$F1 ' ,a).F1.

OBGETI5OS 2os alumnos debern* +# Armar una columna de RinogradsQy. /# Fbservar y describir la sucesin temporal de microorganismos en la columna. 0# 7omar muestras a distintos niveles de la columna para identificar la composicin microbiana grupos de microorganismos". 1# A distintos tiempos' retirar y preparar los portaob-etos sumergidos para observar los distintos microorganismos adheridos a su superficie. 2rocedimiento +# ,olectar una cantidad de tierra o barro para llenar el recipiente hasta una altura aproximada de +4 cm. Remover las piedras' ramas o partculas grandes del material en estudio. Me!clarlo con las sales y el papel finamente cortado. /# ,olocar la me!cla en un recipiente adecuado en nuestro caso una probeta de vidrio de 544 ml" y a6adir suficiente agua destilada hasta

aproximadamente 0 [ 5 cm del borde. Revolver la me!cla para eliminar burbu-as de aire. 0# ,olocar 0 o 1 portaob-etos en una posicin vertical sobre el sustrato inclinados contra la pared del recipiente. 1# Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plstica para reducir la evaporacin. .uede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original. 5# Bncubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad de lu!' pero no excesiva. O!ser aciones +# /# Fbservar la columna semanalmente' anotando cualquier cambio de aspecto color' crecimiento microbiano' etc.". Remover los portaob-etos a intervalos prefi-ados das o semanas" para observar la sucesiva aparicin de los distintos microorganismos. &ado que los microorganismos pueden coloni!ar ambos lados de los portaob-etos' es necesario limpiar una de sus caras. Fbservar los especimenes sin te6ir con ba-o aumento. 2uego fi-ar los portaob-etos con calor' te6ir con una tincin simple a!ul de metileno" o tincin diferencial coloracin de 8ram" y observar con ob-etivo de inmersin. &ibu-ar lo que se ve. Anotar los cambios que tienen lugar a lo largo del tiempo. .uede ser que sea necesario modificar las tcnicas de fi-acin y coloracin dependiendo del tiempo transcurrido. Recordar que las bacterias son los primeros organismos en coloni!ar los portaob-etos' seguidos por las algas' proto!oarios e invertebrados. >tili!ando una pipeta larga de vidrio' tomar muestras a distintos niveles de la columna y hacer preparados en portaob-etos. Fbservar especimenes sin colorear. 2uego secar y fi-ar por calor. 7e6ir y observar con ob-etivo de inmersin. .ueden hacerse preparados frescos preparados h%medos" utili!ando porta y cubre y colorearlos o no con a!ul de metileno. $e prefieren los preparados frescos sin colorear especialmente si se est muestreando la !ona aerbica superior' donde se encuentran con mayor probabilidad algas y cianobacterias. Es importante en-uagar la pipeta con agua corriente entre las distintas tomas de muestra. Examinar tambin muestras frescas para detectar motilidad. Fbservar y hacer dibu-os de los distintos tipos de organismos. Estriar material sobre ca-as de .etri con agar nutritivo u otros medios seg%n corresponda. Anali!ar las colonias aisladas aspecto macroscpico' tinciones' pruebas bioqumicas' etc."

0#

1# 5# :#

Gu%a &ara "a inter&retaci'n de "a co"umna de EinogradsF/ >na columna ideal de RinogradsQy se podra representar con el siguiente esquema*

A&#ndice Medios de enriquecimiento y condiciones de cultivo para aislar las especies representativas de uno o ms grupos fotosintticos. Frganismos a ser enriquecidos <acterias verde a!uladas <acterias verdes del a!ufre <acterias p%rpuras del 3uente de , orgnica ninguna ninguna ninguna $ales inorgnicas ninguna E)1,l* +'4 Ea/$.?)/F* /'4 Ea),F0* 5'4 E)1,l* +'4 Ea/$.?)/F* +'4 Atmsfera aerobia o aerobia 9 5L,F/ ninguna ninguna p) :'4 # ='4 ;'5 ='4 # ='5

a!ufre <acterias p%rpuras

malato de sodio* 5'4 extracto de levadura* 4'5

Ea),F0* 5'4 E)1,l* +'4

ninguna

;'4 # ;'5

El medio basal contiene* Mg$F1.;)/F................................... 4'/ W/).F1........................................... +'4 3e$F1.;)/F.................................... 4'4+