Microalgas como biomonitores de contaminacin

L. M. Gmez Luna, Z. Ramrez Carmenate Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado, Laboratorio de Ecotoxicologa Marina, Universidad de Oriente

Resumen
Las microalgas, trmino tcnico usado ms por biotecnlogos y bioqumicos para designar a los dos tipos celulares de organismos microscpicos que forman parte del fitoplancton y realizan fotosntesis oxignica: procariotas (cianobacterias) o eucariotas, han sido tiles para ofrecer informacin sobre la calidad del agua, y son consideradas como el ms promisorio de todos los indicadores de alerta temprana de cambios en las caractersticas ecolgicas de sistemas acuticos. stas constituyen el primer eslabn de la cadena trfica, y se destacan por su sensibilidad a los efluentes industriales, de aqu que constituyan una herramienta vlida en el monitoreo y control de la contaminacin, de la que se pueden considerar indicadores primarios. En este trabajo se hace referencia a las principales especies indicadoras de contaminacin en ecosistemas acuticos, y se hace particular nfasis en experiencias propias de sensibilidad a hidrocarburos de una especie local de Scenedesmus acuminatus, la que es parte de un protocolo de anlisis de la contaminacin por fluidos en ecosistemas costeros. Palabras clave: biotecnologa, microalgas, fitoplancton.

Abstract
Microalgae, for some specialists like biotechnologists and biochemists are both cellular types: prokaryotes (cyanobacteria) and eukaryotes, forming part of the phytoplanckton that are phtotosynthetic organisms which carry out an oxygenic photosynthesis. They are useful to inform about the water quality and are considered a very promissory early alert indicator of ecological changes in aquatic ecosystems. Microalgae are basic in the trophic chain and are very sensitive to industrial wastes. Therefore they are a usual monitoring and control tool for pollution, of which they can be considered as primary indicators. In this work the principal pollution indicator species are mentioned with particular focus on experiences of Scenedesmus acuminatus local species with high hydrocarbon sensitivity, which is part of fluid pollution analysis protocol in coastal ecosystems. Key words: biotechnologists, microalgae, phytoplanckton.

Introduccin

La creciente cantidad de contaminantes en los sistemas acuticos, especialmente en el medio marino, se produce como consecuencia del vertimiento de residuos industriales, agrcolas y como resultado de la actividad minera y portuaria, entre otras. La actividad antropognica es una constante amenaza para la estabilidad de los ecosistemas, y en

este sentido, los sistemas acuticos son receptores de toda clase de desechos urbanos que, en su mayora, son orgnicos; detectndose, adems, la presencia de compuestos txicos, generalmente considerados agresivos por su persistencia en los sedimentos. Los contaminantes generados por las actividades urbanas, industriales y agrcolas son descargados, en muchas ocasiones, en zonas costeras sin un adecuado tratamiento previo, lo cual constituye un grave problema a nivel de ecosistema.

34

Vol. XVI, N 2, 2004

La mayora de los contaminantes tiene un efecto directo sobre diferentes procesos fisiolgicos y biolgicos de la biota, manifestndose algunos de sus efectos txicos, ejemplo, la reduccin del crecimiento, inhibicin de la fotosntesis, variacin en el contenido de pigmentos fotosintticos celulares, inhibicin de la actividad enzimtica y degeneracin de cloroplastos y mitocondrias, entre otros. En los ltimos aos se ha acrecentado la degradacin del medio marino, la cual puede resultar de distintas fuentes, siendo muy importantes las actividades relacionadas con el vertimiento de un grupo de sustancias extremadamente nocivas, entre las que se encuentran los efluentes industriales, que son residuos provenientes de la industria y pueden ser clasificados ampliamente de acuerdo con sus propiedades fsicas y qumicas, por su comportamiento en las aguas receptoras y la forma en que stos afectan el medio acutico, causando disturbios a nivel poblacional y de comunidades /1/. Generalmente, los efluentes industriales se consideran como mezclas complejas que contienen sustancias orgnicas disueltas, incluyendo txicos, materiales biodegradables y persistentes, sustancias inorgnicas disueltas, nutrientes, sustancias orgnicas insolubles y solubles /1/, con un impacto negativo sobre el ecosistema. Los ecosistemas aportan bienes a la sociedad muy superiores a todo lo que el hombre es capaz de generar si se suman todas sus actividades. Su preservacin requiere la conservacin de la integridad fsica, qumica y biolgica, haciendo nfasis en aquellos ecosistemas que se encuentran daados en forma creciente, debido, fundamentalmente, a la contribucin de los efluentes industriales, que favorecen la degradacin de la calidad de las aguas superficiales /2/. El medio marino, expuesto a contaminacin directa sobre la biota y a aquella que proviene de actividades desde tierra, est siendo severamente afectado, y dentro de ste las zonas costeras se destacan por su vulnerabilidad. Las zonas costeras estn habitadas por gran variedad de especies marinas, al menos durante las primeras etapas de crecimiento, cuando son ms vulnerables. Adems, contienen hbitats

diversos y productivos de gran importancia para los asentamientos humanos, el desarrollo y la subsistencia local. Se conoce que ms de la mitad de la poblacin del mundo vive a menos de 60 kilmetros de la costa, y que esta proporcin podra elevarse a tres cuartas partes para el ao 2020.

Microalgas y contaminacin
El fitoplancton es tal vez el ms promisorio de todos los indicadores de alerta temprana de cambios en las caractersticas ecolgicas de los humedales, causados por productos qumicos. Dadas sus necesidades nutricionales, su posicin en la base de las tramas alimentarias acuticas y su capacidad de responder de forma rpida y previsible a un amplio espectro de agentes contaminantes, Adems, su sensibilidad a las variaciones de los niveles de nutrientes hace que represente un indicador ideal para evaluar la eutrofizacin. El fitoplancton puede emplearse en varios tipos de bioensayos de toxicidad, en ensayos de toxicidad de respuesta rpida y en la evaluacin directa de la toxicidad. Estos mtodos son rpidos, poco onerosos y sensibles y se pueden aplicar en el laboratorio o sobre el terreno empleando algas cultivadas en el laboratorio o agrupaciones naturales de fitoplancton. Por ejemplo, los bioensayos de fraccionamiento de algas (BFA) evalan los efectos de los agentes contaminantes en relacin con parmetros funcionales (por ejemplo absorcin de C14, biomasa), dentro de fracciones de distinto tamao de una agrupacin de algas naturales. Se ha comprobado que los indicadores estructurales, como las variaciones de la composicin por especies y cambios de tamao de las agrupaciones, tambin pueden ser particularmente sensibles /3/. Durante muchos aos los ensayos con algas se han utilizado para mostrar la disponibilidad de nutrientes para las plantas en los ros, lagos y embalses. De manera general, los bioensayos pueden usarse para determinar el estado de eutrofizacin, la limitacin de nutrientes y la influencia txica de residuales industriales. Para la proteccin de la vida acutica y la salud humana se ha comprobado que mediante ensayos de toxicidad apropiados (ejemplo ensayos con embriones

Vol. XVI, N 2, 2004

35

de vida acutica) es posible anticipar potenciales efectos adversos de un efluente industrial para un ecosistema dado con un error de tan solo el 10 %. Otros modelos denominados dinmicos permiten anticipar con mucha precisin la exposicin, sobre la base de la informacin disponible /2/. La alteracin positiva o negativa de la calidad ambiental, provocada o inducida por cualquier accin antropognica se conoce con el trmino impacto ambiental. Es un juicio de valor sobre un efecto ambiental, un cambio neto (bueno o malo) en la salud del hombre o en su bienestar. Segn Clark /4/, existen varios tipos de impactos: directos, indirectos, acumulativos, socioeconmicos, con implicaciones ecosistmicas y naturales. El vertimiento de residuales industriales directamente a las zonas costeras provoca un severo impacto negativo sobre la biota, mientras que uno de los impactos indirectos ms serios del desarrollo costero es el declive de la calidad del agua. De forma general, los efluentes industriales son las fuentes ms comunes de efectos adversos en ecosistemas marinos y costeros /2/. Uno de los contaminantes que tiene mayor impacto sobre los ecosistemas marinos y que es vertido anualmente en grandes cantidades al mar es el petrleo, ocasionado por accidentes, choques entre buques, incendios a bordos, huracanes, conflictos blicos, etc. Los accidentes se han incrementado en el mar por el aumento del trfico (ya sean barcos, buques de carga, etctera). No solamente el petrleo crudo es txico, todo subproducto refinado como, el kerosene o el fueloil, utilizados en los motores de barcos, lanchas y plataformas de perforacin o produccin, son aun ms txicos. Estos combustibles contienen elementos txicos solubles en agua que son de difcil y lenta degradacin, por lo que tienen un impacto directo negativo sobre la biota marina.

xenobiticos, y por tanto, evaluar de manera integral el riesgo potencial que estos representan para un organismo y posiblemente para el ecosistema /5/. Los efectos de los contaminantes pueden ser observados en los diferentes niveles de organizacin biolgica, extendindose desde el nivel molecular y la respuesta fisiolgica global del individuo, hasta los niveles supraorgansmicos como: poblacin, comunidad y ecosistema. Las alteraciones moleculares son usualmente las primeras respuestas detectables y cuantificables, destacndose por su capacidad para sealar la presencia de contaminantes an a niveles subletales. Tal conjunto de seales recibe la denominacin de biomarcadores /5/. Segn la clasificacin general los biomarcadores pueden ser: Biomarcadores de la condicin fisiolgica. Razn oxgeno-nitrgeno, que mide la utilizacin de reservas energticas en diferentes condiciones ambientales, especialmente utilizada para evaluar la exposicin a situaciones de baja calidad ambiental. Biomarcadores de la condicin celular. Especialmente se ha considerado el metabolismo lisosomal intracelular. Los contaminantes ambientales afectan dicho metabolismo produciendo desechos que se acumulan en los lisosomas (grnulos de lipofuscina) o afectando la permeabilidad de las membranas (estabilidad lisosomal), que puede llevar al rompimiento de stos y a la liberacin de sus enzimas para finalmente producir un proceso de autodigestin celular. Biomarcadores especficos para metales. Se destaca la utilizacin de concentracin de metalotionenas (MT) como ndice de respuesta biolgica en los organismos acuticos y terrestres, las cuales son protenas especficas para fijar metales presentes en los organismos vivos y que son utilizadas como un mecanismo de defensa frente a la exposicin a concentraciones elevadas de metales /5/. Sin embargo, antes de estudiar cualquier efecto molecular, hay evidencias de un efecto negativo sobre una poblacin dada en macro-parmetros como por ejemplo, el crecimiento, lo que estara vinculado a determinaciones de dosis y/o concentracin letal,

Biomarcadores y bioindicadores decontaminacin

La deteccin y evaluacin de los efectos biolgicos resultantes de la contaminacin industrial son esenciales para determinar su alcance. En particular, permiten evidenciar la biodisponibilidad de tales

36

Vol. XVI, N 2, 2004

dosis y/o concentracin efectiva, entre otras. Para ello es imprescindible el uso de especies bioindicadoras de contaminacin. Como regla general, los ensayos de toxicidad son experimentos de laboratorio utilizados para evaluar los efectos txicos potenciales de contaminantes en muestras de agua o sedimentos de un cuerpo receptor o bien de efluentes industriales sobre los organismos vivos. Los efectos se evalan a travs de respuestas letales (mortalidad), a travs de estudios de toxicidad aguda o sub-letales (fertilizacin, crecimiento, comportamiento general) o bien a travs de estudios de toxicidad crnica. Estos ensayos estn siendo utilizados en el mundo con mayor frecuencia, como herramienta de control y prevencin de la contaminacin /6/.

se considera uno de los indicadores ms importantes de las alteraciones del medio marino /9/. Se ha verificado su sensibilidad a los efluentes industriales y han demostrado ser una herramienta vlida en el monitoreo y control de los programas de reduccin de toxicidad /10/, considerndose indicadores primarios de contaminacin /11/. Varios experimentos han dado a conocer algunas microalgas como bioindicadores de contaminacin. Selenastrum capricornutum es una de las especies ms sensibles entre las algas verdes unicelulares y un buen indicador como organismo de ensayo a la exposicin de hidrocarburos petrognicos /9/. Tambin, el alga verde Scenedesmus sp. ha sido utilizada como organismo de ensayo para valorar el efecto de concentraciones significativas de petrleo /2/, encontrndose que ste provoca un decremento en la concentracin de clorofila a, materia seca y el nmero de clulas. De forma general, se ha citado el uso de las microalgas Selenastrum capricornutum y el Scenedesmus quadricauda /1/ para ensayos de toxicidad; as como Dunaliella sp., Monochrisis y Dunaliella tertiolecta /2, 10, 13/, entre otras. Por otra parte, las normas de la OECD (1984) para el test de inhibicin del crecimiento algal establece el uso de Selenastrum capricornutum ATCC 22662, Scenedesmus subspicatus 86.81 SAG y Chlorella vulgaris CCAP 211/11b. Selenastrum capricornutum tambin ha sido utilizada conjuntamente con Ankistrodesmus gracilis en bioensayos con el efluente puro de una textilera en Argentina, /15/, demostrndose que el efluente afecta significativamente el crecimiento de estas microalgas. Otro uso importante de las microalgas como bioindicadores de contaminacin, consiste en la bsqueda de una prueba sencilla para evaluar los posibles efectos txicos o deletreos de metabolitos de cianobacterias, y se han obtenido resultados alentadores con el uso de Dunaliella sp. como bioindicador frente a Microcystis aeruginosa, alga cianofita potencialmente txica. Dunaliella sp. ha sido usada adems como bioindicador frente a una cepa de Nostoc affinus. minutum. El Nostoc es una cianofita, para la cual existen algunas evidencias

Especies bioindicadoras
La idea de que un organismo puede indicar la calidad de su medio ha sido muy bien aceptada desde el siglo XVI /7/. Sin embargo, no ha sido fcil establecer una definicin clara del trmino bioindicador de la larga lista de publicaciones en torno al tema en las ltimas dcadas. Segn la definicin de Wittig en 1993, en la cual ha tenido en cuenta la opinin de la generalidad de los autores de artculos relevantes en Europa, la bioindicacin es el uso de un organismo, parte de un organismo, o una asociacin de stos, para obtener informacin sobre la calidad del medio. Siendo los organismos que poseen esta facilidad denominados bioindicadores o biomonitores /7/. Algunos ensayos ecotoxicolgicos han sealando el impacto del aceite y los hidrocarburos en algas. Los hidrocarburos petrognicos en el medio acutico pueden afectar la abundancia relativa de especies de algas, inhibiendo el crecimiento de algunas especies sensibles y promoviendo el crecimiento de otras que sean tolerantes, por lo que muchas de stas se han considerado como bioindicadores /9/. En los sistemas acuticos, las microalgas constituyen el primer eslabn de la cadena trfica. En su condicin de productor primario, el fitoplancton permite la entrada de energa al ecosistema, regula el rgimen gaseoso y tiene accin depuradora, por lo que

Vol. XVI, N 2, 2004

37

bibliogrficas de su capacidad para producir hepatotoxinas del tipo de las microcistinas /16/. Otro estudio realizado para estos ensayos es la utilizacin de Tetraselmis chuii para evaluar contaminacin petrognica mediante la evaluacin de su autofluorescencia /17/. Otro de los usos de las microalgas como indicadores es la evaluacin de sustancias qumicas potencialmente txicas, como la morfolina, con la cual se ha experimentado para conocer su toxicidad. Esta sustancia se comporta qumicamente como una amina secundaria; en condiciones ambientales y fisiolgicas, como resultado de la reaccin de las soluciones de nitrito o de xidos de nitrgeno gaseosos con las soluciones diluidas de morfolina, se forma Nnitrosomorfolina (NMOR), conocido carcingeno para los animales. Entre los microorganismos acuticos enfrentados a sta, se encuentran determinadas cianobacterias (Microcystis ) y algas verdes unicelulares (Scenedesmus), que al parecer son las especies ms sensibles; empleando como criterio la inhibicin del crecimiento de la poblacin con una duracin de la exposicin de 8 das /18/. De modo general, muchas especies de microalgas, han permitido el estudio del impacto que puede provocar determinada sustancia al ambiente, as como la evaluacin de la toxicidad de sustancias que se incorporan al mercado y que deben ser autorizadas por los organismos pertinentes. Teniendo en cuenta todos los aspectos anteriormente sealados, en este trabajo se realiza un estudio para evaluar la sensibilidad de una especie local de Scenedesmus acuminatus frente a efluentes industriales, residuos que afectan seriamente al medio acutico causando trastornos en el ecosistema donde son vertidos.

incipientes, es posible la anticipacin de medidas efectivas, antes de que ocurran efectos drsticos o irreversibles /19/. Desde 1980, los ensayos de toxicidad en algas se han visto incorporados en distintas regulaciones, como en la Directiva de Valoracin de Riesgo (DVR) de sustancias industriales nuevas y existentes, o en la de productos sanitarios, ofreciendo con ello pautas para otras valoraciones, como la de residuos qumicos peligrosos, aguas superficiales y profundas contaminadas, o de efluentes de depuradoras; adems, las algas se han utilizado tambin como sensores biolgicos en estudios de biorremediacin y suelos contaminados (Aguayo et al., 1999). El aumento de la contaminacin en los sistemas naturales se ha evidenciado con la reduccin de la poblacin de animales residentes o en la desaparicin de especies migratorias de peces, trayendo como consecuencia la introduccin en muchos pases de una legislacin sobre el control de nuevos productos qumicos, principalmente pesticidas, metales pesados, hidrocarburos y en general, derivados del petrleo. Para evitar que estos productos continen siendo fuente de contaminacin del ambiente acutico, se ha incrementado el uso de un amplio rango de pruebas de toxicidad, utilizando peces, crustceos, moluscos y algas de gran importancia comercial. En estudios ambientales y trabajos de contaminacin, los bioensayos han sido el mtodo tradicional para documentar la presencia o ausencia de efectos aparentes de los contaminantes sobre los sistemas vivos. Como regla general, los ensayos de toxicidad son experimentos de laboratorio utilizados para evaluar los efectos txicos potenciales de contaminantes en muestras de agua o sedimentos de un cuerpo receptor, o bien de efluentes industriales sobre los organismos vivos. Los efectos se evalan a travs de respuestas letales (mortalidad), a travs de estudios de toxicidad aguda o sub-letales (fertilizacin, crecimiento, comportamiento general) o bien a travs de estudios de toxicidad crnica. Los organismos involucrados en estos ensayos son seleccionados segn su respuesta en situaciones controladas /13/. Por otra parte, a diferencia de otros mtodos vinculados con estudios qumicos, los

Ensayos de toxicidad
Una de las metas primarias de la ecotoxicologa es determinar o predecir los efectos adversos de los agentes qumicos sobre los organismos. Es de suma importancia poder descubrir la presencia de un agente (simple o compuesto) en un sistema natural antes que ste alcance el nivel de umbral ecotoxicolgico de la especie ms sensible. Formalmente, cuando el nivel de exposicin de uno o varios receptores en un sistema acutico o terrestre produce efectos adversos

38

Vol. XVI, N 2, 2004

bioensayos, al igual que los criterios de calidad, emplean rigurosamente el mtodo cientfico, por cuanto sus resultados cuantitativos son precisos y confiables. Estos ensayos sirven de base para tomar decisiones sobre las concentraciones o diluciones de un efluente dado, los ndices de descarga sin riesgo, y de esta manera evitar o por lo menos reducir al mnimo los impactos en el medio acutico /21/, siendo utilizados con mayor frecuencia en el mundo, como herramienta de control y prevencin de la contaminacin /6/.

la vida de cualquier ecosistema acutico /15 /es el fundamento bsico del ensayo propuesto. De forma general, el estudio revela cambios en la curva de crecimiento de cultivos de S. acuminatus, al exponer las clulas a diferentes concentraciones de efluentes procedentes de la refinera de petrleo Hermanos Daz. Este ensayo se hizo con el propsito de evaluar las potencialidades de la especie aislada a partir del medio natural como bioindicador de contaminacin por efluentes industriales y a su vez, valorar el impacto de los efluentes de la refinera sobre el fitoplancton. Una de las bondades de la especie es que su mantenimiento en condiciones de laboratorio resulta fcil y tiene una velocidad de crecimiento poblacional relativamente alta, una vez que alcanza la fase exponencial de crecimiento. Por otra parte, de forma general, se cita en la literatura la preferencia de usar especies de Scenedemus en estos ensayos, por su representatividad en los sistemas acuticos /20/. En el caso de la temperatura, otra de las modificaciones introducidas, se trabaja a valores mayores que los referidos en la normativa de la OECD, lo cual se justifica si tenemos en cuenta que el valor promedio de temperatura registrado en la baha (segn los resultados de los experimentos de campo) fue 31,67 0,47 C. Trabajar con esta temperatura de ensayo constituira un riesgo (referido ello a la validez del experimento) si se trabajara con un microorganismo al que fuera necesario adaptar previamente, pero en este caso se trabaja con una especie local aislada a partir del medio natural, adaptada a altos valores de temperatura; de aqu que, adems, sea improcedente realizar los experimentos a 182 C sin haber aclimatado previamente la cepa al menos durante tres meses. Se utiliz la luz continua con el objetivo de evitar fenmenos de aclimatacin a bajas intensidades, caractersticos de clulas cultivadas en ciclos nictimerales /22/. Las refineras de petrleo pertenecen al grupo de las industrias ms consumidoras de agua, y en consecuencia, vierten grandes cantidades de aguas

Scenedesmus acuminatus comobioindicador de contaminacin por hidrocarburos

El gnero Scenedesmus como tal se ha empleado en el Instituto Colombiano del Petrleo (ICP) como bioindicador en bioensayos con efluentes y derivados del petrleo (ICP; sitio Web). El alga Scenedesmus acuminatus fue aislada por Gmez y Espinosa del medio natural local en estanques de agua de la parte suroriental de Cuba. Utilizar una cepa local ha sido la primera modificacin del ensayo recomendado por la OECD. La especie de microalga aislada del medio natural, est adaptada a altos valores de irradiancia espectral y temperatura. Se prepararon cultivos en medio lquido, a 27 2 C, iluminacin continua artificial (lmpara fluorescente Dayligth, PHILIPS 20W, F20T12/D), intensidad de 58,59 E m-2s-1 y aireacin (flujo de 5 mL h-1 L-1). Se ensayaron concentraciones en el rango del 1 al 8 %, siguiendo un arreglo de serie geomtrica (x = 2n), segn recomendaciones /14/. Cuando la densidad celular fue 14 veces mayor que la inicial, se aadi el efluente en cuestin. Fueron valorados los efectos de varios efluentes sobre el crecimiento a las 24, 48, 72 y 96 h. Se hicieron ANOVAS de clasificacin simple y anlisis de regresin para comparar los porcentajes de mortalidad obtenidos, utilizando el paquete estadstico SPSS 9.1. Dada la importancia de las algas como productores primarios, cualquier alteracin producida en el medio por sustancias contaminantes, como es el caso de los efluentes afectara la red trfica, poniendo en peligro

Vol. XVI, N 2, 2004

39

residuales al medio ambiente, siendo muy diverso el espectro de sustancias qumicas contaminantes contenidos en ellas, entre las cuales los hidrocarburos son predominantes /23/. De forma general, los efluentes de la refinera varan dependiendo del origen del crudo, por ello siempre que se realizaron los ensayos se refiere la fecha de muestreo y las caractersticas del efluente, lo que permite explicar cualquier variacin en los resultados.

Se utilizaron dos efluentes de la refinera, los que fueron previamente caracterizados. En la tabla 1 se presenta una comparacin entre los valores obtenidos en la caracterizacin del efluente a la salida del separador API, con los valores promedios de la norma de vertimiento industrial a baha abierta, establecidas por el Centro de Investigaciones de Produccin del Petrleo (CIPP) /23/.

TABLA 1. COMPARACIN DE ALGUNOS PARMETROS DEL EFLUENTE CARACTERIZADO EN EL MES DE MAYO DEL AO 2000 CON LAS NORMAS DE EFLUENTES DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES DE PRODUCCIN DEL PETRLEO (CIPP)

Parmetros

pH Aceites y grasas (mg/L) Hidrocarburos (mg/L) Fenol (mg/L) DQO (mg/L)

Valores de la caracterizacin del efluente refinera "Hermanos Daz" 7,9 58,6 40 5,2 1947

Normas de vertimiento

6-9 50 20 0,5 300

En ambos anlisis se observa que ninguno de los parmetros comparados se encuentra dentro del rango establecido en las normas para el vertimiento de efluentes en un ecosistema, a excepcin del pH. La concentracin de hidrocarburos, excede la recomendada, la del fenol est muy por encima de lo establecido en las normas, al igual que la Demanda Qumica de Oxgeno (DQO) del efluente estudiado, con un valor de 1947 mg/L, 6 veces por encima de lo que se recomienda en las normas nacionales establecidas por el CIPP. De forma general, al enfrentar el microorganismo al efluente rico en hidrocarburos se observaron cambios en la curva de crecimiento de los tratamientos con respecto a los controles establecidos en este primer ensayo de toxicidad. En la figura 1 se presenta la grfica de las curvas de crecimiento para los distintos tratamientos y el control (valores medios). Asimismo, los valores de densidad celular obtenidos evidencian la sensibilidad de la especie S. acuminatus frente al efluente ensayado.

Durante la fase lag el crecimiento no fue significativo (figura 1); ste fue evidente a partir del quinto da de cultivo, tanto para los controles como para los diferentes tratamientos, lo cual es caracterstico en la curva de crecimiento de la especie. Este comportamiento podra explicarse si se tiene en cuenta que son cultivos de una especie aislada a partir del medio natural, por lo que en condiciones de laboratorio el factor iluminacin podra ser limitante. Si bien, se trabaja con una calidad espectral dentro del PAR (Radiacin Fotosintticamente Activa, 400700 nm) /24/ similar a las condiciones naturales, los cultivos han sido mantenidos en condiciones de laboratorio por un perodo de aproximadamente dos aos, por lo que la respuesta observada debe ser consecuencia de un proceso de aclimatacin, aunque pudiera asociarse a un crecimiento en condiciones que no son ptimas para la especie en cuestin. Hay que tener en cuenta, que los organismos acuticos fotosintetizadores provenientes de un medio natural, expuestos a altas intensidades de luz,

40

Vol. XVI, N 2, 2004

700

600

N m e r od ec l u l a s/ m Lx1 0 E 4

500

400

300 CONTROL 200 1% 100 2% 4% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

das

Fig. 1: Curvas de crecimiento de los cultivos de Scenedesmus acuminatus durante los diez das del ensayo. La flecha indica el momento en que se aade el efluente de la refinera.

generalmente contienen un patrn pigmentario que difiere de aquellos que crecen a bajas intensidades; stos tienden a absorber un bajo porcentaje de luz incidente y contienen altas concentraciones de enzimas y transportadores electrnicos involucrados en las reacciones no fotoqumicas de la fotosntesis /25/, por lo que si bien no es un fenmeno adaptativo, no puede dejarse de considerar la predisposicin gentica que garantiza su crecimiento en condiciones naturales. En todos los casos, el efluente se aadi al segundo da de la fase exponencial (7mo da), siendo el crecimiento en este momento unas catorce veces mayor que la densidad inicial. Despus de aadir el efluente se observ un decremento significativo del nmero de clulas en todos los tratamientos, respecto a los controles. La concentracin que provoc un mayor efecto negativo sobre el crecimiento de S. acuminatus fue la del 4 %, donde se obtuvieron valores significativamente menores de densidad celular a las 48 h de exposicin (49,37 104 clulas. mL -1) (p < 0,01) respecto al control (0 %) y el resto de las concentraciones ensayadas, lo que indica el efecto negativo que tuvo el efluente sobre los cultivos a los porcentajes preestablecidos. Se encontraron adems diferencias significativas entre todos los tratamientos (p < 0,01), demostrndose

que al 4 %, el crecimiento de las clulas en cultivo de la especie Scenedesmus acuminatus fue mucho ms afectado. Por otra parte, se determin en cada caso el porcentaje de mortalidad, para expresar los resultados de forma tal que fuera evidente el impacto producido por el efluente sobre el crecimiento celular. En la tabla 2 se presentan los porcentajes de mortalidad para cada tratamiento respecto a los controles para los diferentes tiempos de ensayo (24, 48 y 72 h). En la figura 3 se presentan las grficas con las correspondientes lneas de tendencia y las ecuaciones que describen el comportamiento de la mortalidad con las diferentes concentraciones de efluente ensayadas. De forma general, el comportamiento del porcentaje de mortalidad (p < 0,05) respecto a la concentracin del efluente, puede describirse con ecuaciones lineales para las 24, 48 y 72 h, con coeficientes de correlacin: (r2 ) de 0,9689; 0,9460; 0,9825; respectivamente. En las condiciones de ensayo, fue factible establecer las ecuaciones que describen dicho comportamiento para una poblacin de S. acuminatus a los diferentes tiempos de exposicin.

Vol. XVI, N 2, 2004

41

TABLA 2. EFECTO DEL EFLUENTE SOBRE CULTIVOS CON LA ESPECIE SCENENEDESMUS ACUMINATUS EXPRESADO EN PORCENTAJE DE MORTALIDAD RESPECTO A LOS CONTROLES
Concentracin de efluente % (v:v) 1 2 4 Hidrocarburos (mg/L) 0,4 0,8 1,6 24 h 41 62,18 84,34 Mortalidad 48 h 56,38 75,25 91,47 72 h 66,73 71,1 87,5

Fig. 3: Comportamiento de la mortalidad de Scenedesmus acuminatus respecto a la concentracin del efluente de la refinera de petrleo.

42

Vol. XVI, N 2, 2004

Uno de los propsitos de este experimento fue determinar la concentracin efectiva que produce un efecto sub-letal en el 50 % de la poblacin del microorganismo de ensayo (EC50 ), excepto para 72 h, ya que este tiempo slo es aceptable para un ensayo sub-letal de corta duracin /20/. La EC50 se determin para cada tiempo de exposicin de acuerdo con la ecuacin que describe cada comportamiento en particular (figura 3).

En la tabla 3 se presentan los valores de la EC50 a las 24 y 48 h; se establece una analoga entre los porcentajes de efluentes incorporados al cultivo de S. acuminatus y la concentracin de hidrocarburos en mg/L (al igual que en la tabla 3); sta se calcula teniendo en cuenta la composicin del efluente. De esta forma, se establecen los resultados de EC50 a las 24, 48, no siendo viables los valores obtenidos a las 72 h en el rango ensayado.

TABLA 3. RESULTADOS DE LA EC50 PARA LAS 24 Y 48 H DE EXPOSICIN DE LOS CULTIVOS DE SCENEDESMUS ACUMINATUS FRENTE AL EFLUENTE DE LA REFINERA HERMANOS DAZ

Efluente EC50 (24) EC50 (48) 1,50% 0,04%

Concentracin de hidrocarburos 0,56 mg/L 0,24 mg/L

La concentracin de hidrocarburos en el efluente ensayado es de 40 mg/L la cual est por encima de los 20 mg/L que se recomienda /26/. Sin embargo, dentro de la mezcla compleja la EC50 los hidrocarburos estaran por debajo de 1 ppm (mg/L). Por otra parte, es necesario sealar que la concentracin efectiva que produce un efecto subletal, disminuye con el tiempo de exposicin, por lo que sera necesario evaluar, definitivamente los efectos letales, aumentando el tiempo de exposicin, lo cual constituye un hecho en la segunda parte de este trabajo, donde se establecen los ensayos de toxicidad. Se realizaron anlisis de correlacin (p < 0,05) entre la mortalidad y la concentracin de efluentes, encontrndose que existe una fuerte correlacin lineal entre estas; los valores de los coeficientes obtenidos 2 fueron: r2 = 0,984; r = 0,973 y r2 = 0,991, para las mortalidades a las 24, 48 y 72 h, respectivamente. Por otra parte, se detect una fuerte correlacin entre la mortalidad a las 24 h y a las 48 h (r2 = 0,998), y entre la mortalidad a las 24 h y a las 72 h (r2 = 0,952). Lo que evidencia que los anlisis a las 24 h pueden ser suficientes para estimar de forma rpida el efecto de estos efluentes sobre los productores primarios. Al hacer el anlisis de correlacin se encontr tambin que sta exista entre la mortalidad a las 48 h y a las 72 h (r2 = 0,933).

Previo a este estudio se realizaron otras investigaciones en las que se pone de manifiesto la utilidad de algunas especies de microalgas como bioindicadores de contaminacin; sin embargo, hasta la fecha, no aparece citada la especie Scenedesmus acuminatus para el ensayo de mezclas complejas, slo para evaluacin de pesticidas /1/. Selenastrum capricornutum ha sido tambin muy utilizada en experimentos donde se comprob el efecto daino de los hidrocarburos petrognicos /8/, exponiendo los cultivos a stos a los siete das de desarrollo. Asimismo, existen otros ejemplos de especies indicadoras de contaminacin: Scenedesmus sp. /12/, Nostoc sp. y Dunaliella sp. /1/. La contaminacin con petrleo e hidrocarburos, constituye, es un peligro permanente para los ecosistemas costeros /14/; sin embargo, pocos pases tienen adecuados planes, contingencia y procedimientos de respuesta ante emergencias. El efecto del petrleo y compuestos similares en el ambiente marino es cada vez ms visible, sobre todo en sistemas semi-cerrados /26/, que es el caso de las bahas de bolsa. La complejidad de los sistemas biticos y la interrelacin entre sus componentes requiere que

Vol. XVI, N 2, 2004

43

cada ecosistema costero sea manejado de forma integral /26/. Es por ello que se hace necesario conocer el efecto de cualquier sustancia o mezcla de sustancias en los diferentes niveles de la cadena trfica, comenzando por el primer eslabn. El conocimiento de las estrategias adaptativas de aclimatacin, y las respuestas de los productores primarios, en sentido general, ante la presencia de cualquier contaminante, contribuye al entendimiento del funcionamiento general de un ecosistema. Antes de estudiar cualquier efecto molecular, es importante considerar que existan evidencias de efectos negativos sobre una poblacin dada, en los llamados macro-parmetros como por ejemplo, el crecimiento; lo que estara definitivamente vinculado a determinaciones de dosis y/o concentracin letal,

dosis y/o concentracin efectiva, entre otras. Para ello es imprescindible el uso de especies bioindicadoras de contaminacin. Los efluentes industriales son mezclas complejas de sustancias qumicas, que al ser vertidas en cuerpos de agua, generalmente causan disturbios a nivel de poblaciones y comunidades presentes en un ecosistema. La sensibilidad de especies fitoplanctnicas a efluentes industriales ha sido demostrada, constituyendo una herramienta til para el monitoreo y control en los programas de descontaminacin, reduccin de toxicidad, estudios de evolucin y recuperacin de ecosistemas. En la tabla 4 se presenta la caracterizacin del segundo efluente utilizado de la refinera, el cual fue colectado despus de salir del separador API.

TABLA 4. CARACTERIZACIN DEL EFLUENTE DE LA REFINERA HERMANOS DAZ. COMPARACIN CON LOS VALORES ESTABLECIDOS POR LAS NORMAS DEL CIPP Y LAS DE VERTIMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE LA REFINERA DE PETRLEO (THE WORLD BANK GROUP WBG; SITIO WEB)
mg/L
DQO DBO Grasas y aceites Fenoles Sulfuros Fsforo total Hidrocarburos Nitrgeno total Slidos suspensin pH en

Salida separador API

406 61,2 3,8 < 10 4,5 0,86 2,2 2,24 106 6,5

Lmite mximo segn las normas WBG/ CIPP

150-300 30 10-50 0,5-1 20 10 30 6-10

Es evidente que hay una disminucin brusca del contenido de hidrocarburos respecto al efluente anterior. Es importante considerar que el separador API, despus de ser evaluado el efecto de sus residuales sobre la biota fue reparado, de aqu que su funcionamiento en estos momentos sea mucho mejor. De hecho, estos resultados constituyen un aval para el mtodo que se propone, ya que los resultados de la primera etapa contribuyeron a la toma de decisiones respecto a mejorar la eficiencia del mismo.

En este experimento se presenta la variabilidad en la densidad celular en todos los tratamientos con respecto al control (figura 4). El efluente analizado es el que sale del separador API; ste tiene una capacidad de 300m3 /h, y un tiempo de residencia de 2 h, est provisto de un dispositivo flotador especial para la recoleccin de los hidrocarburos. De forma general, stos pasan a un colector de aceite, de donde se succionan a la bomba QP 24, para enviarse a los tanques 121 y 122. El agua

44

Vol. XVI, N 2, 2004

de estos tanques drena, incorporndose de nuevo al separador, mientras que los hidrocarburos se envan hacia los tanques de slop (123 y 124), a travs de la bomba NP 22, de donde se toman para incorporarlos de nuevo al proceso de destilacin, y lograr su recuperacin definitiva.

Los efluentes libres de hidrocarburos pasan por reboso a colectarse en una cmara del separador API, siendo trasegados mediante dos bombas a la laguna de oxidacin. En caso de fallo de las bombas o de gran afluencia de agua al separador, los efluentes son descargados a una laguna auxiliar /23/

700

600

N m e r od ec l u l a / m Lx1 0 E 4

500

400

300

control 1%

200 2% 100 4% 8% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

das

Fig. 4: Curvas de crecimiento para los cultivos de Scenedesmus acuminatus durante los doce das del ensayo con el efluente de la refinera Hermanos Daz.

En este caso, se ha detectado que el efluente de ensayo, el cual es tomado del separador API, antes de ser descargado en la laguna, no tiene la composicin qumica adecuada, si bien su mejora es notable. Con el transcurso del tiempo, las instalaciones de almacenaje de productos, y fundamentalmente las tuberas soterradas, han sufrido deterioro, lo que provoc la sobrecarga del separador API, al enviar al mismo mayor cantidad de efluentes, lo que impeda el trabajo eficiente del separador, equipo fundamental del sistema de tratamiento de residuales /23/; problema que hoy ha sido parcialmente resuelto. En este ensayo fue evidente que todos los cultivos mostraron un comportamiento significativamente diferente al control, excepto los que se expusieron a un 8 % de efluente. Asimismo no existen diferencias significativas en el comportamiento de los cultivos expuestos al 1, 2 y 4 % de efluente, pero s entre stos y los expuestos al 8 % (p < 0,05).

Este comportamiento no puede compararse con el obtenido en los primeros ensayos debido a que la composicin qumica del efluente era diferente; si bien se observa un decremento significativo de la densidad celular de los cultivos de Scenedesmus acuminatus respecto a los controles. En el caso del 8 % puede haber una aclimatacin intensa por sobreexposicin, lo cual es caracterstico de algunas especies, cuyo metabolismo es muy flexible, o bien una atenuacin del efecto del efluente por un incremento en la concentracin de algn compuesto nitrogenado contaminante, que alcance valores significativos cuando se aade el efluente a una concentracin del 8 %. Para los tiempos de exposicin de 24, 48, 72 y 96 h se calcul la mortalidad respecto a los controles, logrando un ajuste cbico en cada uno de los casos con r2 = 1 (figura 2).

Vol. XVI, N 2, 2004

45

TABLA 5. EFECTO DEL EFLUENTE DE LA REFINERA SOBRE CULTIVOS CON LA ESPECIE SCENENEDESMUS ACUMINATUS, EXPRESADO EN PORCENTAJE DE MORTALIDAD RESPECTO A LOS CONTROLES
Conc. efluente % (v:v) 1 2 4 8 Mortalidad 48 h 72 h 18,00 48,00 38,00 46,45 35,18 42,63 35,00 2,00

24 h 15,00 25,00 36,00 14,00

96 h 23,03 12,95 18,95 -21,22

40

40

Mortalidad 24 h (%)

Mortalidad 48 h (%)

30

30

20

20

Observed
10

Observed Cubic 0 2 4 6 8 10

10 0 2 4 6 8 10

Cubic

Concentracin de efluente (%)

Concentracin de efluente (%)

50

40

30 40

Mortalidad 72h (%)

Mortalidad 96h (%)

Observed

20

10

30

-10 20 -20 Observed -30 0 2 4 6 8 10 Cubic

10 0 2 4 6 8 10

Cubic

Concentracin de efluente (%)

Concentracin de efluente (%)

Fig. 5: Comportamiento de la mortalidad de los cultivos de Scenedesmus acuminatus al enfrentarlo al segundo efluente de la Refinera.

Es evidente que en este caso el comportamiento no permite determinar la EC50 en el rango ensayado. La disminucin en la agresividad del efluente puede haber influido de forma determinante sobre este comportamiento, pero quizs el factor que determina prcticamente esta tendencia es la temperatura.

La mayora de los reportes a nivel internacional sugieren trabajar con temperaturas entre 18 y 21 C. Sin embargo, S. acuminatus tuvo un mejor comportamiento a 27 2 C.Al analizar la correlacin entre la mortalidad y la concentracin de efluente (p < 0,05), se observ que slo existe una fuerte correlacin

46

Vol. XVI, N 2, 2004

negativa (r2 = -0,969) entre la concentracin y la mortalidad a las 72 h y, cierta correlacin inversa entre sta y la mortalidad a las 96 h (r2 = - 0,870). Existe, adems, una correlacin directa no significativa entre las 72 y 96 h (r2 = 0,860). Se demostr que el residual de la cervecera es menos agresivo que el de la destilera. De forma general, este comportamiento no permite anlisis rpidos, sino que habra que ensayar uno a uno los tiempos, debido a la heterogeneidad de respuestas. El petrleo es considerado un compuesto agresivo y conocido como un gran contaminante de las aguas, causante de desastres en los ecosistemas marinos, que acta provocando severas modificaciones en algunos procesos bioqumicos y fisiolgicos /27, 28/. La penetracin de los componentes txicos del petrleo puede traer como consecuencia la inhibicin del metabolismo, acumulacin de txicos a nivel de la membrana celular, provocando la inhibicin de los intercambios entre la clula y el medio exterior; as como modificaciones de las propiedades fsicas del medio tales como la tensin superficial, el pH, la temperatura, el potencial xido reduccin; la precipitacin de elementos minerales (nitrgeno, fsforo, hormonas, oligo-elementos, vitaminas, etctera.) indispensables para la vida de los microorganismos y del plancton en general; por lo que podra existir un efecto de sinergia entre todos los componentes txicos del efluente que le hacen pueden hacer muy daino, o bien pueden neutralizarse mutuamente. Existen considerables dificultades al discernir o identificar las causas de determinada respuesta asociada a una variedad de sustancias con efecto txico o que, sencillamente, causan estrs. Este es el caso de las mezclas complejas, donde adems existe la desventaja de todo anlisis a escala de laboratorio. Las interacciones que ocurren entre distintos agentes qumicos en los medios terrestres y acuticos son complejas y no han sido bien estudiadas. De hecho, este estudio no tiene precedentes en el pas, y sobre el ensayo de mezclas no se ha encontrado literatura que reporte anlisis similares, por lo que no se dispone de informacin de los posibles efectos

adversos de varios estresantes combinados. Si bien Gutirrez et al. /19/ han explicado que dos o ms txicos combinados pueden provocar efectos adversos antagnicos, aditivos e incluso sinrgicos en sistemas naturales. La compleja interaccin entre efectos directos e indirectos cuando un organismo presente en un medio dado es expuesto a mltiples agentes estresantes, como por ejemplo un efluente industrial, debe tenerse en cuenta para interpretar cualquier resultado, y tratar de entender la respuesta obtenida en condiciones de laboratorio /29/. Estas interacciones van ms all de la combinacin de dosis o efectos, porque todo ello estara condicionado por variables ambientales.

4 Conclusiones
Con todo este razonamiento, se pretende llegar a la conclusin de que, si bien estos experimentos a escala de laboratorio son necesarios para evaluar el efecto de un efluente dado, y resultan muy valiosos en cuanto a la informacin que de ellos se obtiene, es indispensable complementar esta informacin con estudios de campo precedentes, que definitivamente ayudaran a establecer variables de comparacin con los resultados obtenidos en el ensayo y el ecosistema en cuestin.

& Bibliografa
Abalde, J.; Cid, A.; Fidalgo, P.; Torres, E. & Herrero, C. 1995. Microalgas: Cultivo y aplicaciones. Universidade da Corua, A Corua. 210 pp. Aguayo S., Roset J, de la Torre A.I., Cullar, M.L. y Muoz, M.J. 2000. Ensayo de ecotoxicidad miniaturizado en Chlorella vulgaris utilizando diferentes parmetros de expresin. Rev. Toxicol. 17: 41-45. Ante - proyecto de Normas CIPP (Centro de Investigacin de Produccin del Petrleo). 1997. Vertimiento de Aguas Residuales. La Habana. Asselborn, V., Zalocar de Domitrovic, Y. 2000. Aplicacin de bioensayos algales uniespecficos para evaluar los efectos de un efluente textil y la calidad de las aguas receptoras. Universidad Nacional del Nordeste. Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas. Clark, R.J. 1992. Integrated Management of Coastal Zone. ISBN- 92-5-103275-0. Edit. FAO. pp-167. Clark, R.J.1998. Coastal Seas. The Conservation Challenge. Blackwell Sc. Ltd, London, U.K. pp- 134. Convencin de humedales. Los humedales artificiales como

Vol. XVI, N 2, 2004

47

tratamiento terciario de bajo coste en la depuracin de aguas residuales urbanas. Disponible en: www.gem.es/materiales/ document/documen/g01/d01203/d01203.htm Criterio de Salud Ambiental (OMS) N 179 morfina. 1998. Acta Toxicol. Argent. 6 (2): 57-61. Di Marzio, Walto D. 1998. Definir el uso de protocolos de ensayos ecotoxicolgicos de alcance nacional. Universidad Nacional de Lujn. I Reunin de la SETAC. Buenos Aires, Argentina. El Edib, M. A., Abou- Waly, H. F., El- Naby, A. M. H. 1997. Impact of Fuel Oil Freshwater Alga Selenastrum capricornutum. Bull. Environ. Contam. Toxicol 59: 438-444. Fargasova, A. 1997. Comparative study of triorgatonim compounds on various biological subjects. Ectoxicol ? Environ. Saft. 38 42. Gutirrez, P., Ongay, J.P y Vercesi, Ma. L. 2000. Pruebas de toxicidad y niveles de seguridad ambiental. Gerencia Ambiental. 65: 394-399. Hechevarra, R. C. y Barthelemy del Toro, C. 1999. Trabajo Extraclase (Modulo 1). Diplomado de Saneamiento Ambiental. ISPJAE, Ciudad de La Habana. Herkovits, J. 1998. Evaluacin ecotoxicolgica de efluentes industriales. Acto de Apertura de la I Reunin de la SETAC, Buenos Aires, Argentina. Kettrup. A. y Marth, P. 1998. Specimen Banking as an Environmental Surreillance Tool. Ed. Gerrit Schrmann & Bernard Market. John Wiley & Sons, Inc. (Part 2. Chemicals in the Environment). pp. 413-438. Laboratorio de Ecotoxicologa. Disponible en: www.caece.edu.ar Loza lvarez, S. 1994. El nanofitoplacton de las plantas de las bahas de Vita y Jurur, Cuba. 27: 90 106. Munkittrick K.R & McCarty L.S. 1995. An integrated approach to aquatic ecosystem health: top-dowm, bottom-up or middleout? Journal of Aquatic Ecosystem Health 4: 77-90.

OECD. 1984. Guideline For Testing of Chemicals. Alga, Growth Inhibition Test. Pereira, S., Nascimiento. I., Silva, C., Rodrgues, A. Impact of petrochemicals on the photosynthesis of Tetraselmis chuii using chlorophyll fluorescence. Disponible en: www.setac.org/ files/poster.pdf Porta, A. 1998. Desarrollo y aplicacin de indicadores bioqumicos (Biomarkers) de exposicin a metales pesados en diagnsticos de calidad de aguas superficiales. Resmenes Reunin de la SETAC, Buenos Aires, Argentina. Ramsar. 1999. Marco para evaluar el riesgo en humedales. 7a. Reunin de la Conferencia de las Partes Contratantes de la Convencin sobre los Humedales (, Irn, 1971),San Jos (Costa Rica). Senz M. E, Di Marzio. W. D, Tortorelli M, Alberdi J. 1998. Toxicidad de efluentes industriales sobre microalgas (Chlorophyceae). Universidad de Lujn. I Reunin de la SETAC, Buenos Aires, Argentina. Senz M. E. Di Marzio. W. D, Tortorelli M, Alberdi J. 1998 a. Efectos de plaguicidas sobre algas verdes de agua dulce. Universidad de Lujn. Resmenes Reunin de la SETAC, Buenos Aires, Argentina. Toro, JE. 1989. The growth rate of two species of microalgae used in shellfish hatcheries cultured under two light regimes. Acuacult. Fish. Manag. 20: 249-254. Tukaj Z. 1987. The effect of crude and fuel oil on the growth, chlorophyll (a) content and dry matter production of algal Scenedesmus quadricauda (Berb). Environ Pollut 47: 9 24. Vardeleumen, J.H. Ahern, T.P. 1976. Effect of petroleum hydrocarborns on refined oils in the unicellular algae Chlamydomonas reinhardtii. Bull Environ Contam Toxicol 36: 250 253. Zachleder V, Abarzua S, Wittenburg E. 1983. Effect of 3, 4 benzopyrene on the course of cell cycle events in the chlorococcal alga Scenedesmus quadricauda. Planta 157: 432 440

48

Vol. XVI, N 2, 2004