Analisis de Microorganismos en Agua

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ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS
PRACTICA N1
ANALISIS DE MICROORGANISMOS EN AGUAS
I. INTRODUCCIN
En relacin con el estndar de calidad del agua. La presencia de ms de un organismo Coliforme por 100 ml. es suficiente para que el agua se considere como no potable. Las bacterias coliforrnes, corno grupo, no tienen el mismo significado en los alimentos que en el agua. Se han instituido normas de coliformes para determinados alimentos, Como es el caso de la leche cruda certificada y la leche pasteri ada. !uchos bacterilogos consideran que la in"estigacin del grupo coliforme en los alimentos tiene escasa significacin y que #nicamente se debe "alorar desde el punto de "ista de la calidad, la presencia de Colifomes $ecales %E. coli&. MARCO TEORICO E. coli se acepta de modo general como el indicador ms positi"o de contaminacin fecal' una poblacin de coliformes fecales es posible que contenga una alta proporcin de E.coli o sus "ariantes probablemente de origen fecal reciente. Los colifomes comprenden, adems de E. coli, las di"ersas especies de Enterobacter %(erobacter& y )lebsiella, algunas de las cuales pueden multiplicarse. o persistir en hbitat no fecales durante largos per*odos. Estos microorganismos proporcionan una indicacin ms e+acta de las contaminaciones posteriores a los tratamientos industriales y de la eficacia de los sistemas de limpie a y desinfeccin en las industrias, en los alimentos que han sido sometidos a tratamiento o procesos suficientes para inacti"ados. La aplicacin de fecales que se aplican estos organismos tiene un significado importante. La contaminacin de un alimento por E. coli lle"a impl*cito el riesgo de que tambi,n hayan podido llegar al alimento microorganismos ent,ricos
GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II
Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egus ui!a
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patgenos, haciendo su consum peligroso. Esta contaminacin se produce de modo general por deficiencias en la limpie a y desinfeccin de las industrias. AGUA" UNA SUSTANCIA ESENCIAL # COMPLE$A El agua es esencial para la "ida y se considera como un alimento. Es la #nica sustancia que en nuestro planeta se puede presentar en los tres estados f*sicos. Es imprescindible para la "ida por "arias ra ones' estabili a la temperatura corporal, porta nutrientes y productos de desecho, es reacti"o y medio donde se producen reacciones, es el disol"ente uni"ersal, estabili a la conformacin de los pol*meros, etc. El agua inter"iene en nuestra alimentacin, en la preparacin de alimentos, pero, adems, puede ser un "ector de g,rmenes peligrosos. El agua es indispensable para el organismo humano, que diariamente necesita una cantidad de uno y medio a dos litros. -arte de esta agua se ingiere en los alimentos. otra porcin se forma en el organismo por las combustiones de las grasas, los hidratos de carbono y las prote*nas. y el d,ficit, a "eces considerable, hay que cubrirlo con el agua de bebida. Como se indica en el prembulo de la Ley de (guas. el agua es un recurso natural, escaso, indispensable para la "ida y para el e/ercicio de la inmensa mayor*a de las acti"idades econmicas, y es irreempla able, no ampliable por la mera "oluntad del ser huma no. -or tanto, es un recurso unitario, que se renue"a a tra",s del ciclo hidrolgico. 0esde este punto de "ista, no cabe distinguir entre aguas superficiales y subterrneas. 1nas y otras estn *ntimamente relacionadas, tienen identidad de naturale a y funcin y, en su con/unto, deben estar subordinadas al inter,s general y puestas al ser"icio de la nacin. Se trata de un recurso que ha de estar disponible, no slo en la cantidad necesaria, sino tambi,n con la calidad precisa, en funcin de las directrices de la planificacin econmica. 0e acuerdo con as pre"isiones %le la ordenacin territorial y en la forma en que la propia dinmica social demanda.
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2odas estas peculiaridades implican a necesidad de que los instrumentos /ur*dicos regulen, actuali adas, las instituciones necesarias, sobre la base de la imprescindible planificacin hidrolgica y el reconocimiento, para el recurso, de una sola calificacin /ur*dica, como bien de dominio p#blico estatal. (s*, en el 30E 145, de 4 de agosto de 1546, se public la nue"a Ley de (guas, que sustituy la publicada el 17 de /unio de 1485. El ob/eto de esta ley es la regulacin del dominio p#blico hidrulico, del uso del agua y del e/ercicio de las competencias atribuidas al Estado en el marco de las competencias delimitadas en el art*culo 195 de la Constitucin. Se denomina agua potable a aquella que posee cualidades f*sico:qu*micas, organol,pticas y microbio lgicas que la hacen apta para el consumo humano. Se diferencia de las aguas medicinales en el hecho de que ,stas son aguas con propiedades terap,uticas reconocidas por la ley. Las diferencias entre unas aguas y otras dependen de las sustancias que lle"en disueltas en suspensin. (l caer y atra"esar la atmsfera, el agua %la llu"ia disuel"e el o+*geno, el nitrgeno y el cido carbnico, y arrastra los g,rmenes que flotan Si, accidentalmente, en el aire hay otros gases, como cido nitroso, amoniaco, gas sulf#rico, etc., ,stos tambi,n son disueltos, aunque el agua de llu"ia es muy pura y slo contiene indicios de las #ltimas sustancias. La principal minerali acin del agua comien a al ponerse en contacto con el terreno, lo cual "aria seg#n la naturale a y las condiciones de ,ste' as*, no es lo mismo que el agua atra"iese un terreno gran*tico que un terreno rico en selenio. El agua atra"iesa las capas porosas del terreno y llega hasta las capas impermeables. -uede reaparecer en forma de manantial o de fuente. 0e este modo, as aguas de los r*os, riachuelos, arroyos, etc., que corren al descubierto,
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tienen condiciones muy distintas a tas de las aguas subterrneas y, por tanto, tambi,n difieren en su composicin. El agua se puede clasificar en' ; (guas de consumo' en este grupo estn el agua de distribucin p#blica, el agua potable, las aguas de captacin indi"idual y las aguas en"asadas. ; (guas no destinadas a consumo' son aguas para la preparacin de hielo de uso industrial, aguas para el la"ado de material, aguas recicladas y aguas para agricultura. El estudio de las aguas ofrece un gran inter,s desde el punto de "ista higi,nico, tanto ms cuanto que, en muchos casos, el consumo de ciertas aguas constituye un "erdadero peligro para la salud p#blica. Las aguas de distribucin p#blica corresponden a lo que se considera agua potable. Son captadas a partir de las aguas superficiales, de "etas de agua o de aguas subterrneas y, antes de su distribucin, se someten a tinos procesos de depuracin. Estos procesos son' $iltracin, decantacin y floculacin, desinfeccin por o oni acin o cloracin por cloro o un deri"ado de ,ste. Las aguas de captacin indi"idual proceden de fuentes o yacimientos subterrneos sir"en para abastecer casas de campo o industrias que no reciben aguas de distribucin p#blica. Este tipo de aguas deben ser tratadas para su posterior uso. Las aguas en"asadas proceden de yacimientos subterrneos protegidos de la contaminacin y no se someten a ning#n tratamiento desinfectante si se en"asan en condiciones de higiene para su consumo.
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Con respecto a las aguas no destinadas al consumo y que tienen otros fines, como en la industria alimentar*a, han de tener una calidad bacteriolgica satisfactoria. DE%INICIONES DE AGUA # &IELO Se ha reglamentado una serie de definiciones aplicables a los distintos tipos de aguas o hielo para unificar criterios y mane/ar una terminolog*a com#n' a. Aguas 'e (e(i'a e)*asa'as Son las distintas aguas caracteri adas corno minerales naturales, de manantial y potables preparadas, que se comerciali an en"asadas. 2ambi,n se incluyen aqu* aquellas aguas que, por circunstancias accidentales, se distribuyen en"asadas e+cepcionalmente %<eal 0ecreto =>9?l 551&. (. Aguas +i)e,ales )a-u,ales e)*asa'as Estas aguas son bacteriolgicamente sanas, tienen su origen en un estrato o yacimiento subterrneo y brotan de un manantial en uno o "arios puntos de alumbramiento, naturales perforados. Se distinguen de las restantes aguas potables en' Su naturale a, caracteri ada por su contenido en minerales,
oligoelementos y otros componentes y, en ocasiones, por determinados efectos. Su pure a original, se ha conser"ado intacta, dado su origen subterrneo, mediante la proteccin del acu*fero contra todo riesgo de contaminacin. Estas aguas tienen en el etiquetado unas e+igencias complementarias a las generales.
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c. Aguas 'e +a)a)-ial e)*asa'as Se trata de aguas potables de origen subterrneo que emergen
espontneamente a la superficie de la tierra o que se captan mediante labores practicadas al efecto, con las caracter*sticas naturales de pure a que permiten su consumo, pre"ia aplicacin de los m*nimos tratamientos f*sicos requeridos para superar los elementos materiales inestables. '. Aguas .,e.a,a'as e)*asa'as Se trata de aguas que, pre"ia autori acin de la autoridad sanitaria competente, se someten a unos tratamientos necesarios para reunir las caracter*sticas establecidas. Se diferencian dos tipos' -otables preparadas, que proceden de un manantial o por captacin. 0e abastecimiento p#blico preparadas, en el su puesto de que tengan esta procedencia. e. Aguas 'e co)su)-o ./(lico e)*asa'as Son aquellas aguas que, de manera puntual, se en"asan para una distribucin domiciliaria de modo gratuito, cuando hay que suplir deficiencias en el suministro de la red general y con autori acin pre"ia. 0. Aguas Po-a(les 'e Co)su)-o ./(lico Estas aguas son las destinadas para este fin, cualquiera que sea su origen, ya sea en su estado natural o despu,s de un tratamiento adecuado. Se pueden utili ar para el consumo o para la industria alimentar*a, de forma que no pueda afectar a la salubridad del producto final %<eal 0ecreto 1174?1 550&.
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g. Agua .o-a(le El agua potable re#ne las caracter*sticas f*sico:qu*micas y microbiolgicas que se indican en la <eglamentacin 2,cnico Sanitaria de aguas. h. Agua -,a-a'a Se trata del agua que, habiendo sido sometida a un tratamiento adecuado, tiene las caracter*sticas propias de las aguas potables. i. Agua )o .o-a(le Esta agua presenta unas condiciones f*sico:qu*micas y caracteres
microbiolgicos o de radiacti"idad tales, que impiden su inclusin en alguna de las clases anteriores. 1. Agua 'e (a2o Son aguas de ba@o las de carcter continental, corrientes, estancadas o embalsadas, en la que se autori a e+presamente el ba@o, o en Aas que, sin estar prohibido, se practica habitualmente por un n#mero importante de personas %<eal 0ecreto 879?1 544&. 3. &ielo )a-u,al Es hielo natural aquel que se obtiene mediante procedimientos no mecnicos, es decir, apro"echando los agentes atmosf,ricos de la naturale a o las condiciones climatolgicas propias de los per*odos in"ernales, que congelan el agua procedente de llu"ias, torrentes, estanques, etc. %Brden de 1 > de agosto de 15>9&.
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+. &ielo a,-i0icial El hielo artificial se consigue congelando agua mediante un procedimiento f*sico:mecnico %Brden de 1> de agosto de 15>9&. ). &ielo ali+e)-icio Es, #nicamente, el hielo artificial fabricado a partir de agua potable que tiene los siguientes caracteres' Es inodoro, incoloro, ins*pido y est e+ento de impure as "isibles. 0ar por <isin un l*quido que satisface las condiciones de pure a y potabilidad e+igidas para las aguas.
CARACTERISTICAS %ISICAS # ORGANOLEPTICAS DE LAS AGUAS POTABLES Los caracteres organol,pticos recogidos en la <eglamentacin 2,cnico Sanitaria que deben cumplir las aguas potables son los que siguen a continuacin. T,a)s.a,e)cia El agua potable ser transparente' peque@as sustancias suspendidas la hacen opalina. Colo, Las aguas incoloras no e+isten en la naturale a, aunque, cuando se considera un peque@o "olumen, su color sea nulo. El color de ciertas aguas naturales es a ul, a ul "erdoso, amarillo, pardo e incluso, ro/i o' esto se debe a m#ltiples circunstancias' desde el reflu/o de la lu del cielo hasta la presencia de algas o de sustancia orgnicas.
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Olo, Las aguas son inodoras' la e+istencia de olor es s*ntoma de que presentan impure as. Sa(o, El sabor es un carcter muy sub/eti"o. Cuando en el agua se sobrepasa una cierta cantidad de sales disueltas, aparece mal sabor. Cunto a estos caracteres organol,pticos, la legislacin tambi,n establece las caracter*sticas f*sico:qu*micas que deben cumplir las aguas potables, que son las Siguientes. Te+.e,a-u,a 4 ,eacci5) La:temperatura de un agua potable debe oscilar entre 8DC y 11DC. Slo el agua fresca es agradable al paladar. En cuanto a la reaccin de las aguas ,sta debe ser neutra o ligeramente alcalina. Ni-,i-os6 )i-,a-os 4 a+o)iaco La presencia de nitrgeno combinado, disuelto en las aguas potables, indica una posible contaminacin. Las aguas potables no deben contener nitritos, nitratos ni amoniaco, si bien el agua de llu"ia tiene indicios de estas sustancias. En algunos casos, su presencia no implica que el agua est, contaminada. (s*, por e/emplo, el cemento que se emplea para re"estir las paredes de los -BEBS B de los acueductos puede contener nitratos solubles. igualmente, las aguas ferruginosas o manganosos reducen os nitratos disueltos a nitritos y amon*aco.
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7ci'o ca,(5)ico El cido carbnico se encuentra en las aguas de tres formas' como cido carbnico combinado fuertemente, como cido semi:carbnico y como cido libre. Se entiende por cido carbnico libre aquel que est sin saturar y del cual el mayor porcenta/e se halla en forma de di+ido de carbono. Las aguas naturales contienen cantidades "ariables de CB las que son muy ricas en ,l se denominan acidulas y tienen un gran "alor minero:medicinal. El di+ido de carbono disuelto est presente en las aguas de forma natural como resultado de la respiracin de las plantas y los animales, la destruccin de materia orgnica y de la descontaminacin de ciertos minerales. Es la mayor fuente de acide de las aguas no polucionadas. Las aguas superficiales contienen menos de 10 ppm de CBF disuelto, mientras que las aguas subterrneas, en particular, si son profundas, pueden contener "arios cientos de ppm. En aguas superficiales, altos contenidos de CB pueden ser indicios de descomposicin orgnica o mineral anormal. O8ige)o El o+*geno est disuelto en las aguas superficiales hasta la saturacin. en las profundas, puede faltar por procesos de reduccin, como sucede cuando hay sales ferrosas. El o+*geno disuelto no tiene "alor alguno en la alimentacin humana. Sin embargo, los peces y otras formas de "ida acuticas s* son muy sensibles a su ausencia. El ni"el de o+*geno disuelto en las aguas naturales es, con frecuencia, una indicacin directa de su calidad, dado que las plantas acuticas producen o+igeno, mientras que los microorganismos normalmente lo con sumen. (
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temperaturas ba/as, la solubilidad del o+igeno aumenta, frente al "erano, en que los ni"eles de saturacin ba/an. $inalmente, hay que se@alar que el o+igeno desempe@a un papel importante, /unto con el cido carbnico, en la corrosin de algunos metales en las aguas agresi"as. Sul0a-os Los sulfatos estn ampliamente distribuidos en la naturale a. 2ienen su origen en las sales que se encuentran en el suelo o en los procesos de o+idacin de los sulfuros naturales. Son muy abundantes en aguas de terrenos muy cargados de yeso, denominadas aguas selenitosas. Estas aguas producen incrustaciones de yeso en las calderas y son malas conductoras del calor. Se ha designado a los sulfatos, contaminantes de segundo ni"el. a ciertas concentraciones en aguas potables, afectan al sabor. Clo,u,os El cloruro es el in ms com#n en aguas y desagGes. La sal, aunque es un nutriente "ital para nuestros cuerpos, pasa por el sistema digesti"o sin cambiar, para con"ertirse en la principal fuente de cloruros de los desagGes primarios. La cantidad de cloruros que contiene un agua sir"e para conocer su calidad' si el terreno es gran*tico y las aguas estn muy cargadas de sal, es posible que haya contaminacin por orina de animales o humana' si es un r*o, la causa puede estar en "ertidos industriales.
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&ie,,o 4 +a)ga)eso El hierro se encuentra disuelto en el agua en forma de carbonato cido de hierro. En presencia de aire se o+ida y precipita como hidr+ido f,rrico. por esta ra n el hierro prcticamente desaparece de las aguas. Si el agua es poco aireada, su presencia le comunica un sabor desagradable. En las aguas ferruginosas se desarrollan unas algas t*picas que pueden llegar a obturar las conducciones. =o es con"eniente este tipo de aguas en la industria alimentar*a, porque per/udica notablemente la calidad de los productos. (ltas concentraciones en agua superficiales pueden ser indicati"as de la presencia de efluentes industriales o de desechos de operaciones mineras. <especto al magnesio, hay que destacar que se encuentra unido al hierro y que fa"orece el crecimiento de algas, ocasionando las mismas complicaciones que el hierro. Du,e!a La dure a de as aguas se debe a la presencia de sales de calcio y de magnesio que estn en disolucin. Los bicarbonatos de estos elementos constituyen lo que se denomina dure a temporal. Btras sales, cloruros y sulfatos de los alcalinot,rreos forman la dure a permanente. el con/unto se conoce como dure a total. 0ependiendo de la cantidad de carbonato clcico, las aguas se clasifican en duras y blandas. Las aguas blandas o poco minerali adas tienen un sabor menos agradable que las duras, Las aguas duras no son apropiadas para usos dom,sticos %procesos de coccin, la"ado, etc.&.
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Ma-e,ia o,g9)ica Las sustancias orgnicas estn en las aguas en peque@a proporcin, de tal modo que se "aloran y cuantifican en funcin de la cantidad de o+*geno o permanganato potsico que necesitan para su o+idacin ba/o ciertas condiciones. -ara medir la materia orgnica se reali a la determinacin de la 0emanda Hu*mica de B+igeno %0HB&, que permite conocer el ni"el de contaminacin orgnica en aguas residuales. Con ella se determina la cantidad equi"alente de o+*geno requerido para o+idar la materia orgnica de la muestra. S:lice El silicio es el segundo elemento ms com#n de la corte a terrestre. Est presente en la mayor*a de los suministros de agua natural en forma de silicatos. Es posible encontrar mayores concentraciones de s*lice en aguas salobres o residuales.
AGUAS MINERALES NATURALES La 0raft European <egional Standard %$(B?B!S, 1 558& establece una serie de diferencias que separan el agua mineral natural del agua %le bebida ordinaria' ; -rocede directamente de un manantial o de una perforacin subterrnea hasta llegar a la bolsa de agua. Se ha de recoger en unas condiciones que garanticen su pure a bacteriolgica original. ; =o se debe someter a ning#n tratamiento, e+cepto los de decantacin, sustitucin de gas o embotellado.
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; El cierre de la botella ha de hacerse en origen, al salir el agua del manantial. ; Se caracteri a por el contenido en ciertas sales minerales y en sus proporciones relati"as, as* como en la presencia de indicios de ciertos elementos u otros constituyentes. El agua mineral natural debe contener, el menos, 1 .000 mg por litro de sales disueltas, tasa que puede ser inferior en las aguas carbonadas. El agua mineraI =atural, tras su salida del manantial y posterior embotellado, contiene pocos microorganismos, de lB? ml a 100? ml. Esta microflora autctona o natural se compone, principalmente, de bacterias J:, especies de los g,neros $la"obacterium, Cytophaga, !icrococus y =ocardia. Se trata de una flora aerobia y psicrtrofa, con ba/as necesidades de nitrgeno. Eras el embotellado, comien an a multiplicarse las bacterias autctonas, debido al paso de un sistema abierto a otro cerrado. Se produce un crecimiento cr*tico, es decir, aumentos y descensos alternati"os en el n#mero de bacterias, y cada nue"a poblacin de bacterias se compone, a menudo, de especies distintas a las anteriores, ya que utili an como nutrientes los microorganismos muertos de la poblacin anterior. Este crecimiento es completamente normal. Btro tipo de flora de las aguas minerales procede de una fuente e+gena. son las denominadas bacterias autctonas, producidas por el almacenamiento pre"io al embotellado, del aire del entorno o del propio, embotellado. Las bacterias ms resistentes son mesfilas J:, especies de -seudomonas cepacia, -seudomonas fluorescens y -seudomonas aeruginosa. <especto a los microorganismos patgenos, hay que se@alar que, seg#n in"estigaciones. La inoculacin de especies patgenas en el agua mineral natural y su posterior almacenamiento a F0DC ocasiona un lento pero definido descenso de la lasa bacteriana t*as "arias semanas. La epidemia del clera que hubo en -ortugal en 1589 tu"o en el agua mineraI no carbonatada uno de sus principales "eh*culos, lo que e"idencia la necesidad de seguir m,todos de
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fabricacin adecuados y de aplicar un control microbiolgico efica produccin de estos tipos de agua.
en la
La carbonatacin del agua mineral a unos ni"eles de tres a cinco "ol#menes de CB, tiene un efecto bactericida sobre la mayor*a de las bacterias, debido al descenso del p< que acompa@a a la carbonatacin y al efecto per se del di+ido de carbono. Las aguas minerales no deben contener microorganismos patgenos. en general los criterios que se han de seguir son los mismos que para agua de bebida. &IELO Si partimos de la <eglamentacin 2,cnico Sanitaria %Brden de 1 > de agosto de 15>9&, "eremos que el hielo se define como el agua con"ertida en cuerpo slido por un descenso suficiente de la temperatura. Se distinguen dos tipos de hielo' natural y artificial. El hielo natural es el que se obtiene por procedimientos no mecnicos, apro"echando agentes atmosf,ricos de la naturale a o las condiciones climatolgicas propias de los per*odos in"ernales, que conducen a la congelacin del agua. El hielo de tipo artificial es el que resulta de congelar agua mediante alg#n proceso f*sico:mecnico. Se denomina hielo alimenticio al hielo artificial fabricado a partir de agua potable, y que re#ne los siguientes caracteres' ; Es inodoro, incoloro e ins*pido y est e+ento de impure as "isibles. ; 0a por fisin un l*quido que satisface las condiciones de pure a y potabilidad e+igidas para las aguas.
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Kay "arias clases de hielo alimenticio' ; !ate u opaco' se elabora congelando agua potable en reposo. su aspecto es lechoso. ; Claro o semitransparente' se fabrica congelando agua potable, agitada mecnicamente durante el proceso. Es transparente en todo su espesor, e+cepto en el n#cleo, que ser opaco. ; Cristalino' se prepara e+clusi"amente con agua destilada o desiono ada y pri"ada de aire. 0ebe ser transparente en toda su masa. 2eniendo en cuenta la definicin de hielo alimenticio, slo nos queda se@alar que las condiciones de calidad son las mismas que las referidas al agua potable.
CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLGICO DE LAS AGUAS # EL &IELO El control microbiolgico de las aguas se reali a en los suministros de agua o en los propuestos como tales, a fin de probar la potabilidad del agua. En la unidad de traba/o se han anali ado los aspectos microbiolgicos de las aguas, y se ha se@alado la e+istencia de tres Lpos de bacterias' bacterias autctonas, microorganismos procedentes del suelo y bacterias que habitan el intestino del ser humano y de otros animales. (simismo, se ha indicado que la mayor*a que estas bacterias acuticas son J: %-seudomonas, $la"obacterium, etc.&, aunque tambi,n pueden encontrarse JM %!icrococcus y 3acillus&. El recuento de g,rmenes "iables que se espera, seg#n el medio empleado, depende de la naturale a de la muestra de agua. Comparati"amente, 1os r*os sin polucin muestran recuentos ms ba/os, aunque, despu,s de una llu"ia fuerte, los arrastres que legan al r*o cont7enen ele"ado n#mero de
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microorganismos que "i"en, en el suelo, si bien los recuentos tambi,n dependen del estado trfico del r*o. Los recuentos de las aguas aba/o de las ciudades son mucho ms ele"ados a causa de las descargas de aguas residuales y de efluentes industriales hacia los r*os. (unque estos altos recuentos de g,rmenes "iables hacen pensar en la contaminacin del agua yen la presencia de bacterias diferentes de las acuticas, no indican necesariamente contaminacin por heces, aguas residuales no tratadas, etc., ya que estas bacterias pueden ser saprofitos del suelo, si bien no son deseables, pues pueden contribuir a incrementar problemas de alteracin de los alimentos. La contaminacin fecal del agua origina la presencia de bacterias deri"adas del intestino' Escherichia coli, Streptcoccus faecalis y Clostridium perfrigens y, posiblemente, patgenos intestinales como Salmonella y Nibrio cholerae. Con el ob/eti"o de determinar la potabilidad de un suministro de agua, es necesario determinar que no est contaminada por las bacterias patgenas mencionadas. Como los patgenos intestinales s* se hallan presentes, ser*an sobrepasados en n#mero por los microorganismos que habitan normalmente en el intestino' resulta ms satisfactorio si se identifican estos microorganismos. 2anto en el recuento de colonias totales como en los recuentos de coliformes y de Streptococcus faecalis la siembra se puede reali ar en placa, en tubo y mediante el m,todo de filtracin por membrana, aun que el m,todo oficial es el recuento en tubo a tra",s de la t,cnica del =#mero !s -robable %=!-&. El m,todo de filtracin por membrana tiene la "enta/a de que se pueden detectar peque@as cantidades de microorganismos, y la cantidad de la muestra tambi,n es peque@a. 1na "e filtrada una determinada cantidad de agua %100 ml de la muestra&, la membrana se incuba en una placa con caldo y temperatura apropiados. Si no se obser"a crecimiento bacteriano, el agua es satisfactoria. en caso contrario, las bacterias se identificarn haciendo una resiembra. 20
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Las muestras de agua deben ser siempre simples y se han de recoger en frascos est,riles de boca ancha con tapones de "idrio esmerilado. Se tendr mucho cuidado durante el muestreo para pre"enir a contaminacin de la muestra. Si ,sta se toma de un grifo, deben limpiarse completamente el interior y el e+terior de la boca con agua o con alcohol, despu,s de lo cual el grifo se abrir unos minutos para reno"ar el agua contenida en la tuber*a. despu,s, se proceder a la toma de la muestra.
TOMA DE MUESTRA 1. MUESTREOS EN GRI%OS O LLA;ES El grifo no deber tener airendores o presentar escapes de agua. (ntes de la recoleccin de la muestra se debe her"ir el grifo y de/ar correr el agua durante F o 7 minutos para eliminar impure as o agua acumulada en el interior de la ca@er*a. !uestreos en r*os, arrobos, lagos, etc.' Sumergir rpidamente el frasco deba/o de la superficie del agua %de 16 a F0 cm.& para e"itar recolectar materiales flotantes y dirigir una boca del mismo en sentido contrario de la corriente para pre"enir el contacto del agua con las manos. El frasco debe ser tapado inmediatamente.
<. IDENTI%ICACIN DE LA MUESTRA En la etiqueta que se adosa el frasco de agua se debe anotar claramente' :El lugar del muestreo :$echa y hora e+acta del mismo
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:En caso de una muestra de agua potable se debe anotar tambi,n el cloro residual %total y libre& encontrado a la hora del muestreo. Bbser"acin especial que sugiere contaminacin %da idea de las diluciones a reali ar& =. EN;ASE PARA LA RECOLECCIN DE LA MUESTRA Se debe utili ar frascos de "idrio neutro o plsticos, no t+icos, esterili ables, de boca ancha, con tapa protectora y cierre herm,tico, para e"itar escapes de agua. Las botellas de "idrio deben ser de 3orosilicato u otro "idrio neutro, de preferencia pro"istas de tapa de rosca hecha de metal o plstico. Las tapas de metal deben ser forradas con un protector no to+ico que e"iten el contacto directo entre el metal y la muestra. Las botellas de platinos ofrecen las "enta/as de ser li"ianas y resistentes. Se recomiendan que estas sean de -olipropileno o -olicarbonato. El polipropileno no es aconse/able porque no resiste bien la esterili acin en el autocla"e. >. ;OLUMEN DE MUESTRA La capacidad de las botellas debe ser, por lo menos, de 1F0 ml. Con el ob/eto de tomar una muestra de lBB ml. O de/ar un espacio "aci que facilita la agitacin del agua del e+amen. Las botellas que se emplean para el muestreo de 100 ml. 0e agua potable deben contener, antes de su esterili acin, 0,1 ml. 0e una solucin al 10P de 2iosulfato de Sodio %para que reaccione con los "estigios de cloro libre. Cuando se tenga que in"estigar -.aeroginosa y?o Salmonella, se debe tomar un "olumen mayor de la muestra.
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?. TRANSPORTE # PRESER;ACIN DE LA MUESTRA -ara muestra de agua potable al tiempo de transporte al laboratorio no debe ser mayor a 94 horas, y de preferencia, no ms de 70 horas. Se recomienda refrigerado %9 : 10DC& de las muestras, especialmente si se requiere un recuento total en placa o si se sospecha que el agua esta contaminada con organismos patgenos. En muestras de aguas superficiales, incluyendo muestras de agua potable, reser"orios y aguas de balnearios, el tiempo de transporte al laboratorio no debe e+ceder ms de > horas.
ANE@OS
AN7LISIS DE AGUAS POTABLES6 INDUSTRIALES # RESIDUALES MICROORGANISMOS Bac-e,ias e) ge)e,al MEDIOS DE CULTI;O 0EN (gar nutriti"o (gar 2JE (gar -late Q Count !ercRoplate (gar -late Q Count $luorocult (gar -late Q Count Jelatina nutriti"a 0EN Jelatina nutriti"a 0EN (gar gelatina
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Esche,ichia coli 4 coli0o,+es No*e'a'
0EO Caldo glutamato Caldo EC. Caldo 3<SL( Caldo fucsina Q lactosa Caldo !c CB=)EO Caldo Lauril sulfato $luorocult Caldo 3<SL( $luorocult Caldo Lauril tiosulfato $luorocult Caldo L!T Caldo lactosa peptona seg.E1)!(= 0EN Caldo lactosa peptona $luorocult Caldo lactosa peptona 0EN Caldo E=0B para filtros de membranas 0EN (gar E=0B:C
Esche,ichia coli 4 co)i0o,+es
(gar E=0B : C (gar E!3 Q LENS=E (gar !c CB=)EO !ercRo -late (gar !c CB=)EO $luorocult (gar EC0 0EN Caldo glucosa 0EN Caldo triptofano 0EN (gar citrato SS!!B=S 0EN (gar lactosa ChromocuL2 (gar Col formes
E)-e,e(oc-e,iaceas Lac-osa Nega-i*os
(gar !c CB=)EO !ercRoplate (gar !c CB=)EO (gar 0CLS
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E)-e,ecocos
Caldo ( ida Jlucosa Caldo -#rpura de 3romocresol a ida (gar canamicina esculina a ida (gar )$ para estreptococos (gar selecti"o para Enterococos para filtracin por membrana seg. L(=E2E y 3(<2LEO %base& Caldo esculina
Legio)ellas No*e'a'
Legionella Combi : pacR Caldo "erde de malaquita
Pseu'o+o)as
Caldo Nerde de !alaquita (gar JS(gar 3)S=J (gar E para -seudomonas (gar - para -seudomonas (gar CE2<S!S0E
Esclie,ichia coli 4 co)i0o,+es Ae,o+o)as ;i(,io chole,ae
Solucin nutriti"a de acetamida (gar JS(gar 2CS7S (gar 0CLS
Bac-e,ias ,e'uc-o,as 'e sul0a-o
(gar para recuento de g,rmenes reductores de sulfato
A)ae,o(ios 0o,+a'o,es 'e Es.o,as
Caldo de diferenciacin para Clostridios %0<C!& (gar : Sangre %base&
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Ca,ac-e,:s-icas +ic,o(iol5gicas 'e aguas .o-a(les 'e co)su+o ./(lico. Caracteres !icrobiolgicos
!,todo de membranas -armetros =i"el gu*a filtrantes Concentracin m+ima admisible !,todo de tubos m#ltiples
68 Coliformes totales Coliformes 64 65 fecales Estreptococos fecales >0 Clostridium sulfitorreducores
100
=-!U1
100 100
: :
0 0
=-!U1 =-!U1
F0
=-!U1
VEste "alor en la red de distribucin podr ser rebasado en un 6 por 100 de las muestras como m+imo, siempre que ninguna muestra contenga ms de 10 bacterias coliformes por lBB ml de agua y que en ning#n caso se encuentren bacterias coliformes en lBB ml de agua en dos muestras consecuti"as.
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; Las aguas potables de consumo p#blico no debern contener organismos patgenos.
II. OB$ETI;OS 0eterminar el =#mero !s -robable de microorganismos contaminantes en el agua a partir de una siembra en caldo, utili ando para ello tubos 0urham de fermentacin. Sdentificar la flora contaminante de las muestras de agua anali adas mediante su culti"o en diferentes tipos de agar. Bbtener como producto' anh*drido carbnico, que ser captado por el tubo de fermentacin. El microorganismo utili a el sustrato, utili a la lactosa y produce anh*drido carbnico. El ob/eti"o es traba/ar en soluciones diluidas y no concentradas. Es mucho me/or traba/ar con ms diluciones III. MATERIALES # REACTI;OS =.1 Ma-e,iales !uestras de diferentes tipos de aguas (sa de siembra con mango de Rolle 2ubos de ensayo -yre+ con tapa esteriles 2ubos de fermentacin 0urham -laca -etri -yre+ est,riles (gua destilada est,ril Jradilla de tubos Lunas de relo/, esptula y baguetas Nasos precipitados y Erlemmeyers -robetas y -ipetas est,riles
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!echero 3unsen Sncubadora Estufa (utocla"e 3alan a (nal*tica 3a@o !aria
=.< Reac-i*os 4 +e'ios 'e cul-i*os (gua -eptonada al 0.1P (gua destilada Caldo Laurel Sulfato Caldo 3rilla Caldo Lactosa Caldo ( ida:Jlucosa (gar !c. ConRey (gar !anitol Salado (gar =utriti"o (gar -late Count
I;. PROCEDIMIENTO -ara recoger muestras de agua de pantanos, estanques, fuentes o r*os es aconse/able utili ar alg#n depsito mecnico esterili ado para su/etar la botella y e+traer el tapn. En r*os o cursos de agua es preciso considerar di"ersos factores' profundidad, caudal, distancia a la orilla, etc. La muestra se tomar lo ms le/os posible de la orilla, procurando no remo"er el fondo y e"itando los remansos o as onas de estancamiento.
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PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTI;O a&.: P,e.a,aci5) 'e los aga,es.: -esar la cantidad indicada de cada agar %=utriti"o, !c ConRey, !anitol Salado, etc.& y disol"erlo en 100 ml de agua destilada. Licuarlo y esterili arlo y luego reali ar el plaqueado y sembrado de las muestras anali adas de acuerdo al protocolo utili ado en las prcticas de laboratorio de !icrobiolog*a S. b&.: P,e.a,aci5) 'e agua .e.-o)a'a.: -esar peptonada al 0.1P para 1F0 ml de agua destilada, es decir pesar 0.01F gr de peptona. Luego colocar tambi,n 50 ml en una botella y 5 ml en F tubos y luego lle"ar a esterili ar en la autocla"e a temperatura de 1F1W C por un espacio de 16 minutos. Se deben cumplir los requisitos necesarios para la preparacin de dilucin de la muestra. 1tili ar solucin amortiguadora de fosfato para la preparacin de las diluciones. c&.: P,e.a,aci5) 'e los Cal'os.: -esar la cantidad indicada de cada caldo %Lauril Sulfato, Lactosa, 3rilla, etc.& y disol"er en 100 ml de agua destilada. Luego colocar tambi,n 5 ml de cada caldo en 5 tubos de ensayo conteniendo los tubos de fermentacin 0urham y luego lle"ar a esterili ar en la autocla"e a temperatura de 1F1W C por un espacio de 16 minutos. 1. El protocolo para el anlisis microbiolgico de aguas de abastecimiento y en"asadas y de hielo que se debe cumplir es el siguiente' F. Los requisitos necesarios para la =umeracin de !icroorganismos (erobios !esofilos Niables. 7. Los requisitos necesarios para la =umeracin de Coliformes 2otales y Coliformes $ecales. %=!-, m,todo 1&.
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9. Los requisitos necesarios para la =umeracin de Enterococos %=!-&.
El protocolo de anlisis comprende' ; <ecuento de Colonias (erobias !esfilas %7 1X1 YC& ; Sn"estigacin y <ecuento de Escherichia coli ; Sn"estigacin de Salrnonella: Shigella. ; Sn"estigacin y <ecuento de Clostridium sulfito: reductores. ; Sn"estigacin y <ecuento de mohos y le"aduras. ; ( fin de completar, dado que es necesario, el e+amen microbiolgico de las aguas potables de consumo p#blico con"iene buscar, adems de los g,rmenes que figuran en el ane+o E, los g,rmenes patgenos, en particular' :Las salmonellas. :Los estafilococos patgenos. :Los bacterifagos fecales :Los entero"irus. ; -or otro lado, las aguas no debern contener' :=i organismos parsitos. :=i algas.
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;. RESULTADOS # DISCUCION ;I. CONCLUSIONES ;II. RECOMENDACIONES ;III. CUESTIONARIO 1. 0efina' tubos rodantes, microcalorimetr*a, 0!1 %0osis m*nimo infecti"a&, "alores microbiolgicos de referencia F. E+plique la 2,cnica !icrocolonias en 0E$2 %2,cnica de fluorescencia directo en (limentos 7. E+plique los m,todos qu*micos de deteccin de microorganismos 9. E+plique los m,todos inmunolgicos de deteccin de microorganismos 6. E+plique los principios de garant*a de la calidad en los alimentos
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Analisis de Microorganismos en Agua

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