CAPITOLUL XII 12.1 MICROPROPAGAREA SPECIILOR HORTICOLE, ORNAMENTALE I FORESTIERE 12.1.1 Micropropagarea a cri!

a"#e$e %Chrisanthemum morifolium&

I"#ro'(cere Crizantemele (Dendranthema grandiflora Tzelev, sinonim cu Crysanthemum morifolium Robat) fac parte din cea mai rspndit specie floricol cultivat att pentru mpodobirea spaiilor verzi ct i pentru utilizarea lor ca plante ornamentale n g ivece sau flori tiate! Crizantemele, cu originea n "rientul #ndeprtat, fac acum parte din culturile cele mai importante n multe ri ale lumii! $a%oritatea, din cele cteva sute de cultivare, este propagat comercial prin butire convenional, dar multe dintre cultivare au fost micropropagate cu succes prin te nica de lstrire adventiv (organogenez), din variate tipuri de esut i prin cultur de calus! &nele protocoale de regenerare pot fi folosite pentru obinerea de plante libere de virusuri (cultura de meristeme) la ma%oritatea cultivarelor, pentru obinerea unui numr mare de plante n timp scurt la plantele elit, pentru nlturarea mutaiilor induse c imic sau fizic i n transformrile genetice n scopul obinerii unui nou colorit al florii sau pentru inducerea rezistenei la boli! Crizantemele pot fi folosite pentru a demonstra funcionarea mai multor te nologii i concepte n protocoalele de regenerare bazate pe organogeneza direct! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or $aterialul biologic necesar n realizarea unei culturi de esuturi poate fi ac iziionat sub form de butai ce vor fi cultivai n g ivece de plastic de apro'imativ () cm diametru, pentru nrdcinare, cu cca * sptmni nainte de nceperea e'perimentului! +e recomand luarea n cultur a ct mai multor soiuri pentru a reui observarea diferenelor ce apar ntre genotipuri n ceea ce privete capacitatea de regenerare n cultura in vitro! Condiiile de cretere a plantelor donor prezint o mare importan de aceea se recomand cultivarea acestora fie n camere de cretere fie n sere iluminate cu becuri fluorescente incandescente ntr,un regim de fotoperiodism (-.

de (/ ore lumin, la o temperatur de 00,0. oC! #n cazul n care plantele sunt cultivate primvara sau toamna se va suplimenta iluminarea pentru a asigura condiii de zi lung, ce vor in iba nflorirea plantelor! +e recomand prelevarea vrfurilor principale de cretere (folosirea lor ca surs nou de butai) pentru inducerea ramificrii secundare i producerea de frunze tinere! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) 1entru realizarea unor rezultate notabile, se recomand selectarea, pentru realizarea e'plantelor doar a frunzelor tinere, parial dezvoltate, de culoare verde desc is, de 0,. cm lungime! +e realizeaz sterilizarea frunzelor folosind ),0/2 ipoclorit de sodiu, timp de .,() minute cu agitare continu, urmat de cltiri repetate n ap distilat steril! +e plaseaz cte o frunzuli cu parte superioar n sus, ntr,o cutie 1etri steril i se elimin surplusul de ap prin rsturnarea vasului i apsarea cu finee a frunzuliei! +e poate folosi i rtie de filtru steril pentru absorbirea surplusului de ap de la suprafaa frunzei! 1artea superioar a fruzuliei se poate identifica uor datorit culorii mai nc ise i a prezenei periorilor ntr,un numr mare! +e va fasona frunzulia, nlturndu,se marginile acesteia, folosind un bisturiu, izolndu,se fragmente de cca ),.,( cm0! 3ragmentele rezultate vor fi plasate la suprafaa mediului de cultur cu suprafaa inferioar a frunzei n contact cu mediul! $ediul bazal de cultur este compus din srurile specifice mediul $+ ((-/0), la care se adiioneaz *) g4l (55m$) za aroz, ( g4l (),.. m$) mioinozitol, .mg4l (0,- 6$) tiamin 7Cl i agar 5g4l, stabilindu,se un p7 de .,8! +tabilirea p7,ului se realizeaz nainte de adugarea agarului i de autoclavare, reglarea p7,ului fcndu,se, n funcie de caz, cu o baz sau un acid! 9up autoclavare (la (0( oC), timp de 0*,*) minute (n funcie de volumul de mediu), mediul de cultur se repartizeaz n vase 1etri sterile, n condiii aseptice, la ota cu flu' de aer steril! 3ito ormonii necesari vor fi adugai, n funcie de tipul de cultur dorit, dup autoclavare! 12.1.2 Micropropagarea a pe#("ie %Petunia hybrida& Petunia hybrida 7ort! :ilm,;ndr! este petunia comun de grdin! ;re un fond genetic comple' alctuit din ibrizi provenii din trei sau patru specii de Petunie! <ste considerat un =cultigen> deoarece este rezultatul ameliorrii artificiale i nu ibridrilor slbatice! 1etunia este una dintre cele mai populare flori utilizat n organizarea ornamentelor stradale, n grdini sau parcuri! +e nmulete n special prin semine, dar la unele cultivare se poate realiza i nmulirea prin stoloni! 1etunia face parte din familia Solanaceae! $ulte dintre studiile realizate in vitro au fost efectuate pe specii aparinnd acestei familii, deoarece (-/

regenereaz uor n condiii artificiale de cultur! 9intre membrii acestei familii de plante, petunia este cel mai receptiv la culturile in vitro,putnd regenera din antere, protoplati, ipocotile, cotiledoane, fragmente de tulpin, frunze i alte tipuri de esuturi i organe! 1etunia este ideal n realizarea de e'erciii n scop didactic deoarece rspunde cu uurin la cultura de esuturi, seminele fiind uor de obinut, pstrat i germinat! ?starii cresc repede i pot fi utilizai ca surse de e'plante tot timpul anului! 1etunia poate regenera in vitro att prin organogenez direct ct i prin organogenez indirect n funcie de balana ormonal utilizat! "rganogeneza direct are loc atunci cnd lstarii se formeaz direct pe e'plantele inoculate pe mediu! "rganogeneza indirect implic trecerea prin faza de calus, lstarii regenernd din celule de calus! #n ambele cazuri, celulele generatoare de lstari trebuie s se ntoarc n stadiul meristematic! Celulele fiice, ce formeaz un meristem, devin gradat specializate i difereniaz n celule ce vor alctui organele unei noi plante! @alana ormonal influeneaz direcia n care va decurge diferenierea! Celulele specializate sau difereniate trebuie s devin mai puin specializate pentru a forma un meristem! ;cest proces este invers procesului de difereniere i poart denumirea de =dedifereniere>! 9e aceea, celulele generatoare de lstari trebuie s dediferenieze nainte, pentru a fi capabile s reiniieze un proces regenerativ! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or Rspunsul n cultura in vitro este genotip dependent, cultivare diferite vor genera rspunsuri diferite i vor avea necesiti variate n ceea ce privete balana ormonal pentru a fi capabile s induc neoformarea de plantule! Totui, marea ma%oritate a cultivarelor de petunie regenereaz prin formarea de lstari, fie adventivi fie prin lstrire a'ilar multipl! +e recomand luarea n cultur, n general, a cultivarelor de tipul Aradiflora, deoarece cele de culoare roie sunt recalcitrante la cultura in vitro! Cu apro'imativ opt sptmni nainte de iniierea culturii de esuturi, seminele vor fi semnate n sere sau camere de cretere, n pmnt steril sau n perlit, n vase de vegetaie de apro'imativ () cm n diametru, sau n g ivece dreptung iulare! +eminele de petunie sunt de dimensiuni mici, de aceea, se recomand semnarea lor mai la suprafa! +e pot face nulee de apro'imativ ( cm adncime i semna la o densitate de 0 sau *4cm liniar! +e recomand a nu se semna prea des deoarece vor rezulta plantule subiri, firave i greu de separat! Temperatura n camera de cretere trebuie s fie de apro'imativ 0(, 0BoC, e'plantele foliare provenite de la plante crescute la temperaturi de *) oC nu vor rspunde la cultura in vitro! (-8

+e recomand e'ecutarea periodic de fertilizare cu azot, dup ncolirea seminelor! Crigarea se va face cel mai bine pe baz de capilaritate sau prin sistem de picurare la rdcin! " irigare prea abundent poate duce la contaminri fungice sau bacteriene la iniierea culturilor in vitro! Trebuie avut n vedere realizarea unui control strict asupra rspndirii musculiei albe de ser, care poate determina, de asemenea, infecii fungice sau bacteriene la iniierea culturii in vitro! +e recomand aplicarea de tratamente mpotriva musculiei albe de sere sptmnal sau ori de cte ori este necesar i folosirea, n cultura de celule, a unui ec ipament adecvat constituit din alate, bonete, mnui! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) Recoltarea e'plantelor foliare se poate realiza pe toat durata formrii frunzelor pn la stadiul de nflorire! +e pot folosi i frunzele tinere de la plante nflorite, e'istnd ns pericolul contaminrilor fungice i bacteriene atunci cnd se iniiaz cultura de esuturi! +e evit prelevarea e'plantelor de la plantele crescute n aer liber deoarece acestea pot fi foarte contaminate, iar sterilizarea se e'ecut cu dificultate! $ediul de cultur necesar este alctuit, n general, din elementele minerale ale mediul bazal $+, la care se adaug *2 za aroz i ),8 2 agar, iar p7,ul mediului trebuie s fie .,5! 9up autoclavare mediul de cultur se repartizeaz n vasele de cultur, fiecare vas fiind inoculat cu e'plante foliare! 12.1.- Micropropagarea a *io e#e e 'e Par$a %Saintpaulia ionantha& Saintpaulia cunoscut cu denumirea popular de violete de 1arma sau violete africane, este un gen ce cuprinde ase specii de plante erbacee perene, aparinnd familiei Gesneriaceae, ce provine din Tanzania i DenEa, cu cea mai mare concentraie de specii n munii Fguru din Tanzania! ;cest gen se nrudete cel mai bie cu genul Streptocarpus! Fumele lor vine de la asemnarea dintre florile acestui gen i cele ale genului Viola, familia Violaceae, adevratele violete (9arbEs ire, 0))/)! Fumele genului este dat dup baronul Galter von +aint 1aul Cllaire ((5/),(-()), un distins misionar, care a descoperit aceast planta n Tanzania n (5-0 i i,a trimis semine tatlui su, un botanist nfocat, care tria n Aermania! Aenul Saintpaulia i specia S. ionantha, au fost prima dat descrise de H!C!Gendland n (5-*! :ioletele de 1arma sunt plante cu o talie de /,*) cm, cu frunzele de la rotunde la ovale, cu o lungime ntre 0,.,5,.cm i peiol de 0,() cm, pubescente i te'tura crnoas, de culoare verde nc is, prezint de curnd i varieti cu frunze bicolore, verde nc is cu dungi albe, de forme i consistene diferite! 3lorile cu diametrul de 0,* cm i o corol cu cinci petale lobate de culoare violet cresc n ciorc ini de *,() sau c iar mai multe! Culoare florilor speciilor (-5

slbatice poate varia de la violet, la purpuriu, albastru desc is, roz sau c iar alb, unele varieti fiind c iar bicolore! +unt n general plante de interior, crescute n g ivece de dimensiuni mici, dar e'ist c iar i varieti agtoare, perfecte pentru g ivecele fi'ate pe ziduri sau perei! $ulte dintre speciile i subspeciile genului Saintpaulia sunt pe cale de dispariie datorit reducerii abitatului lor natural n favoarea agriculturii ()! +peciile genului Saintpaulia se preteaz cu uurin la multiplicarea in vitro, fiind una dintre plantele e'emplu mai ales pentru sistemul de multiplicare prin organogenez direct, i anume, inducerea de muguri adventivi! #n cadrul acestui sistem de multiplicare, se induce formarea mugurilor adventivi direct pe e'plantele inoculate (fragmente de limb foliar, fragmente de peiol, fragmente de tulpin), sau indirect n calusuri! Cea mai folosit n multiplicare este inducerea direct pe e'plante, deoarece parcurgerea fazei de calus presupune i inducerea variabilitii somaclonale! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or Te nica de multiplicare prin inducerea de muguri adventivi presupune parcurgerea mai multor etape astfelI iniierea culturilor, inducerea formrii mugurilor adventivi, creterea lstarilor pe acelai mediu, sau pe un mediu de alungire, nrdcinarea lstarilor pe un mediu cu au'in sau pe un mediu lipsit de fito ormoni! 1lantele donor vor fi crescute n sere climatizate, nivelul potrivit al intensitii luminii este cel mai important factor de care trebuie inut cont n ngri%irea violetelor africane! ;cestea au nevoie de lumin puternic, dar indirect! <le cresc e'celent i n lumina fluorescent a neonului! &n alt factor important este udatul! :ioletele se ud imediat dup ce solul din g iveci ncepe s se usuce! ;cesta nu trebuie lsat s se usuce prea mult, i nici nu se va aduga ap n e'ces! 1entru a menine umiditatea la un nivel optim, g ivecele pot fi aezate n tvi pe fundul crora se pune un strat subire de pietri! ;pa din sol se va scurge n tav, iar stratul de pietri va mpiedica rdcinile s stea direct n ap! Treptat, apa din stratul de pietri se va evapora meninnd astfel constant nivelul de umiditate! ;pa de robinet se va ine 0B de ore ntr,un vas desc is, la temperatura camerei, nainte de a fi folosit la udarea plantei! #n acest fel apa este adus la temperatura camerei, apa rece fiind duntoare plantelor! 9e asemenea, nivelul clorului coninut de apa de la robinet se reduce prin evaporare! +e fertilizeaz de dou ori pe lun cu un fertilizant solubil n ap! #n comer se gsesc fertilizani speciali pentru aceast specie! +olul trebuie s fie un sol bogat n materie organic, i s asigure un bun drena% al apei i o bun aerare a rdcinilor! Temperatura ntre 0),05oC este temperatura ideal pentru violetele africane! +e va evita supunerea plantelor la sc imbri brute de (--

temperatur, sau la temperaturi e'treme, c iar i pentru o perioada scurta de timp! " bun circulaie a aerului n ncperea n care sunt meninute g ivecele va preveni apariia unor boli precum mucegaiurile! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) Ca material biologic se utilizeaz fragmente de limb i peiol de Saintpaulia ionantha! +e detaeaz limbul mpreun cu peiolul de pe o plant din g iveci! +terilizarea se face astfelI presterilizarea J splarea n ap de robinet i imersie n alcool 8)o timp de 0) secunde, sterilizarea n ipoclorit de calciu .2 timp de (0 minute i poststerilizarea prin cltiri repetate n ap distilat steril (. cltiri)! $ediul de cultur folosit pentru aceast te nic de multiplicare este $uras ige,+Koog ($+) cu diferite concentraii ale fito ormonilor! #n general se urmrete ca raportul citoc inin,au'in s fie favorabil citoc ininelor! #n condiii sterile, la ota cu flu' de aer steril, se pregtesc materialele necesare i vasele cu mediul de cultur pentru inducerea multiplicrii! #ntr,o cutie 1etri steril i utiliznd instrumentar steril se scot frunzele, din vasul utilizat la cltire i se detaeaz limbul de peiol! 3ragmentarea limbului se face sub forma unor ptrate cu latura de ( cm, iar peiolul sub forma unor fragmente cu lungimea de ( cm ! Cnocularea se face cu partea inferioar pe mediu, n cazul fragmentelor de limb i paralel cu suprafaa mediului n cazul peiolului! +e izoleaz vasele cu parafilm i se incubeaz n camera de cretere n regim de fotoperioad, la 0.oC! ;pariia mugurilor adventivi, din care se vor forma lstari, se poate observa dup (B,(/ zile de la inoculare! 9up B,/ sptmni de la inoculare, lstarii formai se fragmenteaz, urmnd ca acetia s fie subcultivai fie pe acelai tip de mediu, pentru multiplicarea n continuare, fie pe mediu de cultur $+ cu au'in sau fr ormoni, pentru nrdcinare! 12.1.. Micropropagarea a or/i'ee %ge"( Cymbidium& 3amilia or ideelor este format din apro'imativ *)!))) de specii, dar dac se iau n considerare i ibrizii pe care i au i dezvolt cultivatorii din toate colurile lumii, numrul or ideelor probabil c depete 0))!)))! "r idee se gsesc pe fiecare continent n afar de ;ntarctica i e'ist specii endemice n fiecare col al lumii! "riginare din zonele cu clima temperat i tropical din Cndia, Fepal, C ina, Haponia i pn n $alaiezia i ;ustralia, cEmbidium sunt probabil cele mai mult cultivate or ideeL de asemenea, florile lor dureaz cel mai mult! 9in cele B),.) de specii s,au creat sute de ibrizi, cu flori de diferite culori, de la alb, galben i portocaliu, pn la rou, maro i verdeL dimensiunile variaz de la . pn la () cm n diametru! 0))

"r ideele CEmbidium apar pentru prima dat n scrieri n C ina i Haponia, n cntece populare c inezeti compuse nainte de perioada lui Confucius (..(,B8- C !)! 1rima lucrare scris despre or idee a fost publicat n C ina n (0** dC i cuprindea descrierile a peste 00 specii de or idee! 1rima descriere sistematic i clasificare formal a genului a fost fcut de "laf +Martz, n (8--! 1rima or idee cEmbidium a fost adus n ;nglia din C ina de ctre Hames 3ot ergill, n (885, iar primul ibrid al acestei specii a fost cultivat n (55-! Fumele CEmbidium provine din cuvntul grecesc kymbe, care nseamn barc i e legat de forma florii! 1oate prea incredibil, dar nu mai mult de 8 sau 5 specii sunt NresponsabileN de -)2 din miile de ibrizi cEmbidium care e'ist astzi! #n perioada anilor (-*) i (-B), cei mai populari ibrizi erau cei creai n ;merica, pentru ca n ani (-/) s domine cei din $area @ritanie! CEmbidium standard are frunzele lungi, subiri i drepte sau pendulare, de .) cm sau mai mult n lungimeL la ibrizii n miniatur frunzele sunt mai scurte i mai nguste! 3lorile apar la captul unor tulpini viguroase, fr frunze i multe dureaz pn la 0 luni, fie pe plant, fie ca flori tiate! 9e cnd Dnudson ((-B/) a pus la punct o metod de cultur in vitro pentru inducerea germinrii seminelor de or idee, cultura de esuturi in vitro a %ucat un rol important i foarte semnificativ n cultivarea, nmulirea, ameliorarea i conservarea speciilor i ibrizilor acestei specii! Cniial, culturile in vitro aveau ca scop obinerea unui grad de germinare mai mare a seminelor ce cdeau din fructele mature ale speciilor sau ibrizilor de or idee! Totui, pe la mi%locul secolului trecut s,a nceput recoltarea fructelor imature (verzi) i realizarea de culturi aseptice n ideea de a depi unele bariere de incompatibilitate i a produce astfel noi ibrizi! "dat ce $orel ((-/)) i Gimber ((-/*) au demonstrat aplicabilitatea culturilor de esuturi in vitro pentru obinerea unei multiplicri clonale rapide la or idee, aceast te nologie a nceput s fie aplicat cu succes pe scar industrial pentru a produce or ideele selecionate n scopuri comerciale! "binerea de cantiti mari de plante de nalt calitate, realizarea de ibrizi noi, multiplicarea i conservarea germoplasmei sunt unele dintre beneficiile derivate din aplicarea acestor te nici de cultur! 9ei se consider c or ideele sunt plante uor de nmulit prin cultura in vitro, datorit numrului mare de lucrri tiinifice publicate pe aceast tem, atta timp ct familia Orchidaceae cuprinde peste B.) de genuri i (.!))) de specii i este e'trem de eterozigotic, n urma culturii pe mediu aseptic se poate obine o varietate mare de rspunsuri! $ai mult, atta timp ct de la iniierea culturii de esuturi pn l maturitatea plantei obinute pot trece mai muli ani, datele asupra uniformitii, stabilitii i fidelitii transmiterii n descenden a informaiei genetice sunt foarte rare! 0)(

Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or +terilizarea materialului donor se realizeaz n 0 sau * pai, folosind fie ipoclorit din comer, fie ipoclorit de sodiu n diferite concentraii ((),0)2) pe perioade variabile de timp ((.,0) minute) i TMeen 0) (0,* picturi4())ml), un detergent cu rolul permite creterea aderenei agentului de sterilizare la suprafaa materialului biologic! #ndeprtarea agentului de sterilizare se face prin cltiri repetate n ap distilat steril! 9ac materialul biologic donor este foarte contaminat, lstarii de la care se vor preleva e'plantele se in sub %et continuu de ap timp de *) minute pn la 0 ore! &n tratament mai eficient, dar i mai dur, ce ar putea duce la necrozarea unora dintre e'plante, este imersia lstarilor donori n alcool etilic 8)2, timp de ( minut urmat de cltirea n ap distilat steril nainte de trecerea la sterilizarea propriu,zis cu agentul de sterilizare corespunztor! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) <'plantele sunt prelevate fie din lstari pornii n vegetaie, fie din inflorescene tinere, fie din frunze sau rdcini! 9e preferat sunt mugurii a'ilari i apicali ai lstarilor aflai n vegetaie provenii de la plante sntoase! $ugurii apicali conin meristemul apical plus *,B noduri cu frunzele adiacente! <'plantele radiculare sunt constituite din *,B mm din vrful rdcinii! +e cunosc mai multe medii de cultur bazale utilizate n cultura or ideelor (;rditti, (-88), dar cele mai utilizate sunt mediul bazal Dnudson C (Dnudson, (-B/) i :acin,Gent (:acin i Gent, (-B-), ce au incorporat n compoziia mediului i aditivii organici i fitoregulatorii de cretere! Totui, de preferat este utilizarea mediului :acin,Gent la care se poate aduga lapte de cocos! 9ac mediul este preparat cu atenie a%ustarea p7,ului se va realiza cu uurin, stabilindu,se la valoarea optim de B,5,.,)! ?aptele de cocos ((.2 v4v) este adugat n mediu atunci cnd acesta este destinat iniierii i multiplicrii or ideelor! ;tunci cnd se dorete nrdcinarea e'plantelor se pot aduga n mediu banane verzi omogenizate (.),())g4l)! Oa aroza se adaug n concentraie mic sau deloc n mediile destinate iniierii i multiplicrii monopodiale a or ideelor i adugat n concentraii normale n mediile destinate proliferrii i nrdcinrii lstarilor! #n cazul n care laptele de cocos nu este disponibil pentru a fi adugat n mediul de cultur se pot aduga ali fitoregulatori de cretere! Culturile aseptice vor fi incubate n regim de iluminare continu furnizat de lmpi de neon cu lumin rece la o temperatur de apro'imativ 0., 05o! +e poate institui i un regim fotoperiodic de (/ ore lumin! Culturile lic ide vor fi plasate fie pe agitatoare verticale, fie pe agitatoare orizontale! 0)0

CEmbidium face parte din or ideele cu cretere simpodial, cu dou a'e de cretereI una orizontal care este nedeterminat i una vertical determinat i care se termin cu inflorescena! ?a speciile cu cretere simpodial cele mai optime sisteme de cultur in vitro sunt cultura de meristeme i lstrirea a'ilar multipl! 12.1.0 Micropropagarea a pi" %Pinus silvestris L& +uprafeele destinate agriculturii, ct i cele destinate pdurilor, au descrescut rapid n ultimele decenii datorit creterii populaiei pe Terra i industrializrii masive! ;ceast depreciere a pdurilor, foarte valoroase, a dus la apariia necesitii rempduririi, mai ales n zonele predispuse eroziunii i alunecrilor de teren, ceea ce implic creterea necesitii produciei de puiei sntoi, rezisteni la boli, ce vor constitui material biologic folosit pentru rempduriri! Aimnospermele, n special genul Pinus, sunt cele mai pretabile pentru renfiinarea zonelor mpdurite, datorit ciclului lor de via ndelungat i a polenizrii alogame, fiind pretabile att n zonele calde, subtropicale, ct i n zonele temperate! 9e aceea, micropropagarea in vitro a speciilor din genul Pinus au o semnificaie considerabil n obinerea rapid de material semincer sntos! +peciile genului Pinus acoper marea ma%oritate a zonelor colinare din numeroase ri, reprezentnd baza de c erestea i rin n industria lemnului! C eresteaua este tot mai mult folosit n industria mobilei, pentru construcia cilor ferate, uilor, ferestrelor i producia de celuloz! Pinus ro burghii, un pin de esen tare i Pinus !allichiana, un pin de esen moale, sunt cele mai rspndite surse de c erestea! 9in rinile uleioase ale unor specii din genul Pinus se e'trag uleiuri folosite n diferite ramuri ale industriei, iar miezul seminelor unor specii nordice de Pinus sunt comestibile, constituind o surs important de calorii n sezonul rece! +,au realizat multe ncercri pentru micropropagarea speciilor genului Pinus, e'plantele de le care s,a pornit au fost constituite, n general, din embrioni imaturi, embrioni maturi sau embrioni de%a germinai! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or $aterialul biologic poate fi constituit din vrfuri de cretere verzi, foarte tinere sau semine, ce vor constitui sursa de embrioni, imaturi, maturi sau germinai! 1entru sterilizare, vrfurile de cretere sunt imersate n alcool i flambate, urmate de incubare n 70"0 (2 la BoC timp de 0B de ore! 9up realizarea mai multor cltiri n ap distilat steril, vrfurile de cretere vor fi 0)*

tratate cu miostatin (()!))) uniti4ml), pentru B. de minute! +e cltesc din nou foarte bine i se imerseaz n soluie de ipoclorit de sodiu ()2 timp de (. minute, urmat de imersie n clorur mercuric ),(2 timp de . minute i 0 minute imersie n etanol 8)2! 9up cltirea final, n ap distilat steril, rmurelele de pin se deco%esc i se fragmenteaz n segmente de /,5 mm! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) 3ragmentele de vrfuri de cretere (lstari) se inoculeaz pe mediu $+ cu mai multe variante ormonale, deoarece fiecare genotip poate da un rspuns diferit la cultura in vitro! +e recomand realizarea de combinaii ntre o au'inI 0,B9 sau ;F; i o citoc ininI Din sau @;1! ;stfel, pentru obinerea de calus embriogen, fragmentele de lstari vor fi inoculate pe mediu $+ cu 0,B9 (B.6$) i Din (0* 6$)! Calusul va fi subcultivat pe mediu de germinare fr ormoni sau va constitui baza de pornire pentru realizarea de suspensii celulare! 1e aceast variant ormonal rezultatele vor putea fi observate n apro'imativ trei sptmni! " alt variant ormonal ce ara putea fi folosit este constituit din ;F; (0,. n$) i @;1 (0) 6$), ce va genera calus ntr,o perioada mai lung de timp! Calusul obinut va putea constitui rezerva de germoplasm, material biologic de pornire n realizarea unor suspensii celulare sau pentru regenerarea de plante noi prin embriogenez somatic sau c iar organogenez somatic, n funcie de rspunsul in vitro al genotipului cultivat! +eminele sunt sterilizate n soluie de ipoclorit de sodiu ()2 timp de (. minute, urmat de tratament cu miostatin (()!))) uniti4ml) i tetraciclin (()mg4ml) timp de *) de minute cu agitare continu! ;poi sunt imersate n soluie de clorur mercuric ),(2 pentru . minute, urmat de imersie n etanol 8)2 pentru 0 minute! 1ost,sterilizarea const n efectuarea de cltiri repetate cu ap distilat steril (*,. ori)! <mbrionii e'cizai vor fi inoculai pe mediu bazal $+, n poziie orizontal, mediu mbogit cu lapte de cocos (C$ ),(2), asparagin (/.) 6$) i glutamin (/.) 6$)! 9e asemenea, se pot testa mai multe variante ormonale, n diferite concentraii, indivizi i4sau diferite combinaii! 1ornind de la e'plante embrionare, fragmente cotiledonare sau de ipocotil, se pot obine, pe mediu $+ adiionat cu asparagin (/.) $), glutamin (/.) 6$), ;F; (),.6$), @;1 (0) 6$) i lapte de cocos ((2), att calus din radicel, ct i lstari prin lstrire a'ilar multipl! Rezultatele vor putea fi observate dup apro'imativ patru sptmni de cultur! #nainte de autoclavare, se a%usteaz p7,ul mediului la .,/ cu acid clor idric sau idro'id de sodiu, n funcie de caz! ;utoclavarea se realizeaz la (0(oC, (atm, timp de (.,0) minute, n funcie de cantitatea de mediu din 0)B

recipient! Culturile sunt incubate n regim de fotoperiodism de () ore lumin ((/)) luci) la o temperatur de 0.P0oC i o umiditate relativ de ..P.2! 12.1.1 Micropropagarea a 2#e3ar %Quercus robur& Quercus robur L! este o specie divers, cu multe forme i varietiI dup forma frunzelor (glabra (Aod) +c ur!, pendula (?asc ) +c ur, etc!)L dup forma g indei (brevipes (7euff!) @ecK, e tensa +c ur!, perrobusta @org!, etc!) i dup atributele coroanei (fastigiata (?am) +c ur!, pendula (?oud) 9C)! ;rborele este de tipul C, cu valoare special datorat calitii lemnului, produciei mari i unei regenerri relativ uoare (9oni et al, 0))B)! +te%arul ("uercus robur), este un arbore din zona temperat, nalt de (. , 0) m, cu ramuri puternice, noduroase, coroan larg i bogat! +coara ste%arului este de culoare brun,negricioas, aspr, adnc brzdat, adpostind adesea o micro,faun activ (n special furnici i anumite specii de gndaci)! 3runzele sunt lobate, cu B,5 perec i de lobi de culoare verde nc is! 1eiolul este scurt (B, 5 cm)! +te%arul nflorete n luna mai! 3ructul este ac en (g ind)! +e ntlnete mai ales la cmpie i n zonele colinare, foarte rar la deal! #n afar de pdurile curate de ste%ar, numite ste%rete, ste%arul se gsete i n amestec cu alte foioase, n aa,numitele pduri de leau! ;re pretenii moderate fa de umezeala din aer i din sol, prefer solurile profunde, permeabile, reavene, dar vegeteaz destul de bine i pe soluri compact argiloase! +uporta bine gerurile! 9in punct de vedere ornamental este apreciat datorit formei piramidale a coroanei i a coloritului de toamn a frunzelor , maroniu glbui! &til n aliniamente pe marginea aleilor i drumurilor, poate fi plantat i izolat sau n biogrupe (* , . buc!) n parcuri i grdini! Termenul ste%ar este probabil de origine tracic! #n trecut lingvitii romni i,au atribuit, eronat, origine mag iar sau bulgreasc, ns 9imitrie Cantemir l menioneaz n Descrierea #oldovei ca fiind un cuvnt ine'istent n mag iar sau bulgar! 1rincipalele metode de micropropagare a ste%arului pornesc de la semine, ceea ce rezult ntr,o surs important de variabilitate, necesar atunci cnd se dorete ameliorarea unei specii! Totui, posibilitile de reproducere generativ sunt limitate de durata lung de via a acestei specii, de necesitatea unei perioade lungi de timp pn la atingerea maturitii plantei, de calitatea i productivitatea sczut a seminelor i de depozitarea dificil a g indelor! +eminele de ste%ar prezint diferite grade de recalcitran i pot fi pstrate o scurt perioad de timp datorit predispoziiei lor la des idratare! #n plus, metodele convenionale de nmulire vegetativ a arborilor maturi prin butire prezint dificulti n nrdcinarea lstarilor! 1roblemele aprute n nmulirea ste%arului din material biologic %uvenil sau matur ar putea fi rezolvate prin utilizarea te nicilor in vitro! $icropropagarea in vitro pornind de la muguri dorminzi recoltai din arbori maturi prezint o mare importan mai ales pentru 0).

obinerea de puiei n scop comercial, pentru nmulirea clonal a genotipurilor selecionate pentru calitatea lemnului i4sau pentru rezistena sau tolerana la boli i poluare (+an,HosQ i colab!, (-55)! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or <mbrionii imaturi sau maturi, ce vor constitui e'plantele pentru iniierea culturilor in vitro la ste%ar, se vor e'ciza din semine de ste%ar, recoltate nainte de maturizarea acestora, respectiv de cderea g indelor (1alada,Ficolau, 0))()! A indele se sterilizeaz prin imersie n alcool etilic 8)2, timp de un minut, dup care se imerseaz n ipoclorit de sodiu B,/2 cu adaos de TMeen 0) ((,0 picturi la ())ml), timp de 0) minute, procedur urmat de cltiri repetate cu ap distilat steril (. reprize a cte trei minute fiecare)! 9up sterilizare g indele se vor seciona, n condiii aseptice, la ota cu flu' de aer laminar steril, i se vor e'ciza embrionii ce vor fi inoculai pe medii aseptice! <mbriogeneza somatic la ste%ar poate fi indus i din e'plante foliare provenite de la lstari epicormici! 1entru obinerea acestor lstari se preleveaz, n luna $artie, ramuri de ste%ar, de la un arbore matur, i se plaseaz pe un substrat steril, de obicei constituit din sol sau perlit! +egmentele de ramuri vor induce formarea de lstari din mugurii laterali e'isteni, iar din frunzele acestor lstari se vor fasona e'plante! ;ceste e'plante, inoculate pe medii de cultur aseptice adiionate cu fito ormoni vor genera formarea de embrioni somatici! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) +e pot utiliza ca e'plante embrioni zigotici imaturi triai pe . stadii de dezvoltare! Cnducia embriogen are loc, n general, la nivelul cotiledoanelor, pe toat suprafaa acestora, n cazul e'plantelor reprezentate prin embrioni imaturi n stadiul C, respectiv predominant n zona bazal, la e'plantele mai avansate! Randamentele medii ale induciei embriogene, pe stadii, pot fi cuprinse ntre ()2 i /* 2, cu variaii semnificative n funcie de stadiul de dezvoltare al embrionului zigotic imatur n momentul inoculrii, randamentul induciei scznd de la /.2 la stadiul C, la sub (.2 la stadiul CCC i la ) , (* 2 n stadiile C: i :! Resuturile embriogene se subcultiv pe mediu 10B cu ),. , )!0 mg4l @;1 i pe mediu 10B fr fito ormoni, medii care s,au dovedit propice pentru multiplicarea esutului embriogen n condiiile conservrii capacitii embriogene pe timp ndelungat! Cnducia embriogen poate fi predominant direct, realizndu,se mai ales la baza i pe suprafaa cotiledoanelor embrionilor zigotici imaturi! Conform observaiilor microscopice, embriogeneza direct are loc pe baza unor proliferri epiteliale n urma crora se organizeaz nodulii 0)/

embriogeni, care sunt n realitate embrioni n stadiul globular (C alupa, (-55)! ;cetia evolueaz pn n stadiul cotiledonar precoce (cotiledoane translucide foliacee i clorotice) i se multiplic prin embriogenez adventiv repetitiv, formnd colonii de embrioni precotiledonari i cotiledonari, mai mult sau mai puin compacte! ;glomerrile embriogene se subcultiv pe mediu $+(40 sau 10B cu ),0 mg4l @;1, iar ntr,o faz mai avansat a stabilizrii, pe mediu fr fito ormoni! #n acelai timp cu multiplicarea se va efectua i purificarea mecanic, prin eliminarea calusului neembriogen compact! Culturile embriogene de ste%ar, se prezint sub form de mici agregate de embrioni cotiledonari n diferite stadii de dezvoltare, n care embrionii sunt mai uor sau mai greu separabili! 1entru realizarea unei culturi permanente de linii embriogene se efectueaz lunar noi subculturi, pe mediu 10B lipsit de fito ormoni! ?a fiecare subcultur, embrionii somatici cotiledonari de peste 0,* mm se izoleaz i triaz dup mrimea i consistena cotiledoanelor, cei mai avansai fiind trecui n condiii de maturare! ?a ste%ar, conversia embrionilor n plantule are loc cu un randament sczut fata de cel al germinrii! ;tunci cnd se iniiaz cultura de embrioni din e'plante foliare se vor fasona fragmente ptrate cu latura de apro'imativ ( cm ce vor fi plasate pe mediu nutritiv cu faa inferioar la suprafaa mediului! #nainte de fasonare i inoculare e'plantele se sterilizeaz prin imersie n alcool 8) o timp de () secunde, urmat de imersie n ipoclorit de calciu .2 timp de () minute! #nlturarea agentului de sterilizare se face prin cltiri repetate n ap distilat steril (. cltiri)! <'plantele se vor inocula pe mediu A9 (Aupta i 9urzan, (-5.) cu 10M/l 2,4-D i 2M/l BAP sau GD cu 5M/l ANA i 5M/l BAP. Vasele de cultur v r !i i"cu#ate $" c "di%ii c "tr late de te&'eratur (22-24 )*, u&iditate (+0-+5,* i lu&i" (! t 'eri ad 1- re lu&i"*. Cniierea culturilor in vitro din material biologic %uvenil permite producerea unui numr mare de plante cu o vitalitate crescut la diverse genotipuri necesare pentru meninerea diversitii genetice n ecosistemele forestiere! +ursele poteniale de e'plante pentru iniierea unei culturi de esuturi la ste%ar ar putea fi constituite din embrioni zigotici maturi i imaturi! Culturile de embrioni zigotici reprezint cele mai practice i eficiente te nici de micropropagare in vitro la ste%ar! ;ceste te nici permit evitarea avortului embrionilor zigotici rezultai n urma polenizrii libere sau controlate i, de asemenea, induc ieirea lor din starea de laten! 12.1.4 Micropropagarea a ar5ore e 'e a ea %Liriodendron tulipifera& ;rborele de lalea este un arbore originar din zona tropical i subtropical a ;mericii de Ford, unde reprezint unul dintre cei mai distinctivi 0)8

i valoroi arbori de esen tare i unde a%unge la B),.)m nlime! ?a noi n ar este cultivat ca arbore ornamental n parcuri i grdini! <ste un arbore nalt, cu tulpina dreapt, cilindrica, bine legat cu scoara gri nc is! Coroana are forma ovoidal, cu frunze n form de lir, mari de 8 , (0 cm lungime au patru lobi dispui simetric, doi cate doi! 1e fa au culoarea verde lucitor, iar pe dos verzi desc is sau verzi albstrui! Toamna se coloreaz n galben , auriu! 1eriantul de culoare galben,verzuie are forma de lalea sau de crin (din grecescul leirion S crin i dendron S arbore), florile sunt ermafrodite cu gineceul n poziie superioar! #nflorete la sfritul lunii mai i n luna iunie! 3ructele au forma de conuri alungite! +pecia prefer inuturi cu clima moderat! +uport bine gerurile dar, n tineree, este puternic afectat de ng eurile trzii! <ste indicat n cultura pe soluri profunde, trofice, afnate, %ilave, pe ct posibil cu apa freatic la mic adncime! Fu este rezistent la secete prelungite! 1rezint o deosebit valoare ornamental datorita frunzelor sub form de lir, formei i coloritului florilor, i c iar a trunc iului! <ste indicat a se folosi n parcuri i grdini, de,a lungul aleilor, pe peluze n plin lumin, izolat, n grupuri, la marginea grupurilor arborescente, cu un aspect ornamental deosebit n amestec cu unele specii de $agnolia! 1rezint o rezisten mare la poluarea cu o'idul de sulf! 9eoarece mai puin de ()2 din seminele de arbore de lalea sunt fertile s,au depus importante eforturi pentru a pune la punct un protocol optim de producere de material clonal, care s constituie materialul semincer n nfiinarea de noi pepiniere! +,au raportat mai multe modaliti de micropropagare la arborele de lalea, cum ar fi microbutirea, cultura de rdcini i lstrirea a'ilar multipl! Fu s,au obinut rezultate notabile din microbutire dect atunci cnd s,au prelevat vrfuri de cretere de la plante aflate la intrarea n vegetaie! Cele mai mari succese, n micropropagarea arborelui de lalea, s,au obinut atunci cnd s,a indus embriogeneza somatic! 9ar, ca la toate speciile lemnoase la care s,a reuit regenerarea in vitro prin embriogeneza somatic, cel mai mare impediment implicat de aceast metod este faptul c iniierea culturilor de esuturi n vederea inducerii embriogenezei somatice la arborele de lalea presupune folosirea embrionilor zigotici imaturi, a cror valoare genetic nu este cunoscut cu e'actitate! Totui, c iar i n ciuda impedimentului descris mai sus, acest sistem de cultur este optim pentru arborele de lalea, fiind un important instrument n transformarea genetic prin metoda biolistic sau de a genera protoplati (Rug i colab, (--5)! $icropropagarea arborelui de lalea prin sistemul de embriogenez somatic, presupune trecerea culturilor embriogene printr,o faz intermediar, rar raportat la speciile lemnoase, i anume prin faza de mas preembriogen (7alperin, (-//)! +tadiul de mas preembriogen se crede a fi caracterizat de e'istena unor preembrioni ntr,un stadiu incipient de dezvoltare, i trecerea lor 0)5

prin cicluri repetitive de proliferare, ceea ce duce la formarea unei mase mari de preembrioni! ;ceast proprietate, face ca arborele de lalea s fie pretabil la nmulirea clonal prin sistemul embriogen i la transformarea genetic prin metoda biolistic! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or Cele mai multe dintre culturile embriogene la speciile lemnoase, pornesc de la esuturi embrionare sau plantule n stadiul incipient de dezvoltare, cu doar dou frunzulie! &nul din factorii ce se dovedesc a fi cei mai importani i critici n iniierea cu succes a culturilor embriogene la multe specii, dar mai ales la speciile lemnoase, este stadiul de dezvoltare al embrionului zigotic sau seminei, atunci cnd se inoculeaz pe mediul de cultur! #n ma%oritatea cazurilor, s,a observat c embrionii imaturi prezint cea mai mare rat de regenerare i de producere a embrionilor somatici comparativ cu embrionii zigotici maturi sau seminele ncolite! 3ructele imature de arbore de lalea, de culoare verde,glbuie, se recolteaz la apro'imativ opt sptmni de la nflorire! +e taie agregatele semincere n dou, pe lungime! +e izoleaz seminele, care sunt samare i se ndeprteaz aripioarele! +eminele, de la care vor fi e'cizai embrionii imaturi, n vederea iniierii culturii in vitro, se sterilizeaz prin imersie n alcool 8)2 timp de 0) secunde urmat de imersie n ipoclorit de sodiu ()2 timp de (0,(. minute i apoi de cltiri repetate (*,. reprize) n ap distilat steril, a cte trei minute fiecare, dup care se imerseaz n acid clor idric ),)(F timp de * minute! +e cltesc din nou n ap distilat steril, trei reprize a cte trei minute fiecare! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) +amarele se secioneaz cu a%utorul unui bisturiu ascuit pentru a izola coninutul lor, i anume embrionul i endospermul! <mbrionii imaturi mpreun cu endospermul se plaseaz la suprafaa mediului de cultur bazal $+ adiionat cu 0mg4l 0,B 9 i ),0.mg4l @;1 i transferai pe acelai tip de mediu proaspt o dat pe lun! :asele de cultur vor fi bine izolate la gur i incubate n camerele de cretere, la 0.oC, la ntuneric! ?a sfritul primei luni de subcultur, se observ, la unele e'plante, apariia unor formaiuni calusare de dimensiuni mici, care de obicei nu sunt morfogenice! ;cestea mpreun cu embrionii care le,au generat se vor transfera pe acelai tip de mediu de cultur! ?a sfritul celei de,a doua luni de cultur, va aprea un ciorc ine nodular de celule, de culoare glbuie, care formeaz masele preembrionare! 9ac se dorete continuarea proliferrii de celule, masele preembrionare se vor subcultiva pe acelai tip de mediu, iar dac se dorete 0)-

inducerea formrii embrionilor somatici se vor transfera pe medii cu o concentraie foarte mic de au'in sau c iar fr fito ormoni! <mbrionii aflai n stadiul globular pot fi cu uurin identificai datorit aspectului lor neted i lucios, comparativ cu masele preembrionare ce au aspect neregulat, rugos! 1entru germinarea embrionilor somatici i obinerea de plantule, acetia vor fi transferai pe mediul de cultur proaspete, fr ormoni i c iar fr idrolizatul de cazein! Culturile de embrioni vor fi incubate n condiii controlate, la temperatura de *)oC i fotoperiodism de (/ ore lumin! Rezultatele pot fi cuantificate dup apro'imativ dou sptmni, cnd se observ c unii embrioni au format rdcinue i4sau frunzulie! 9up aclimatizare, plantulele crescute n g ivece mici trebuie s produc n medie o frunz pe sptmn i s dezvolte, dup apro'imativ ase sptmni, un sistem radicular bogat ramificat, cu rdcini de .,()cm lungime! 12.1.6 Micropropagarea a car#o7 %Solanum tuberosum L& Cartoful este una din cele mai importante plante n alimentaia omului i a animalelor, ocupnd locul patru n lume, dup orez, gru i porumb! <ste o specie la care metodele biote nologice au fost aplicate cu succes! 1lante libere de boli, somaclone, aploizi i ibrizi somatici, plante rezistente la man, nematozi, tolerante la erbicide, microtuberculi obinui in vitro au ieit din laborator, n cmp i astfel o serie de soiuri de cartof nmulite clonal au fost propagate pe scar larg n diferite ri (@a%a%,(-58 )! #n consecin, la cartof, te nologia in vitro, combinat cu practicile tradiionale de producere a tuberculilor, a permis producerea comercial de Tsmn> liber de boli (microtuberculi i minituberculi)!<forturile au fost ndreptate i n direcia perfecionrii metodelor in vitro pentru depozitarea pe termen lung a germoplasmei la cartof, prin crioconservare! $anipularea genetic prin culturi de celule i ;9F recombinat sunt cteva ci folosite n ameliorarea in vitro a calitilor nutriionale ale tuberculilor de cartof, precum i pentru creterea produciei culturilor de cartof! $icropropagarea cartofului se poate face pe mai multe ciI formarea lstarilor adventivi, lstrirea a'ilar multipl i embriogeneza somatic! ?starii adventivi pot fi obinui prin organogenez direct sau indirect, ultimul tip fiind asociat ns cu o instabilitate genetic evident! #n cazul cartofului, rata de multiplicare este mai rapid n mediu lic id comparativ cu mediul solid! $icrobutaii pot genera rdcini putnd fi plantai n cmp pentru multiplicare! "binerea de microtuberculi a constituit un aspect cu deosebit rezonan n producerea de material sditor la cartof! $icrotuberculii au dimensiuni mici (*,5 mm) i o greutate medie de ),).,),(.g fapt ce le permite s fie produi n laborator (in vitro) ntr,un numr mare indiferent de sezonL pot fi uor 0()

depozitai, mpac etai i e'pediai (@a%a%, (-58L C iru i colab, (--8L C iru, (--5)! Cultura in vitro de celule i esuturi, este utilizat n vederea multiplicrii i propagrii unor genotipuri valoroase, pe lng importante avanta%e economice, are i o deosebit nsemntate tiinific! 1ractic ntr,un an se pot obine zeci, sute de mii, c iar milioane de plante, utilizate ca material sditor sntos! ?a noi n ar preocupri privind micropropagarea in vitro a cartofului se cunosc din anul (-5*, cnd Cac i i colab! au nceput devirozarea i multiplicarea unor linii de cartof produse la C!C!1!C! @raov! #n lucrarea citat a fost prezentat posibilitatea devirozrii culturilor de cartof pornind de la e'plante din Toc i> de cartof, plantate n g ivece! 9e la plantele de cartof dezvoltate din aceti Toc i> au fost apoi prelevate meristeme caulinare, apicale i laterale! Cultivarea in vitro a anterelor, respectiv a polenului fenomen numit androgenez, a condus la obinerea de plante aploide la cartof! 1lante aploide au fost obinute i prin culturile de ovule sau saci embrionari in vitro, te nic denumit ginogenez! 1racticile moderne de multiplicare in vitro asigur nu numai obinerea n scurt timp a unui numr infinit de plante, ci i stocarea materialului vegetal i conservarea lui pe o durat mai lung sau mai scurt de timp n aa numitele bnci de gene! 1roblema principal care se ridic n cazul micropropagrii plantelor este aceea a obinerii unor clone identice cu planta mam donatoare, fr alterarea zestrei genetice i a calitii genotipului supus micromultiplicrii pentru ca n final s se nfiineze culturi omogene, de cea mai bun calitate, parametri imposibil de atins prin procedee tradiionale (Cac i, (-58)! Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or 1rincipalele tipuri de e'plante de la care se pornete n iniierea unei culturi de esuturi la cartof sunt constituite de mugurii din tuberculii de cartof sau coli, din care se pot regenera direct lstari sau din care sunt prelevate meristeme, n cazul n care se pornete de la material donor bolnav, reuindu,se astfel s se obin regenerani sntoi! 9e asemenea, izolarea de meristeme se poate face direct din vrfuri n cretere, cu dezavanta%ul c sterilizarea acestora se face mai greoi dect n cazul colilor! 1entru nmugurirea cartofului acesta trebuie s treac printr,o perioad de minim B sptmni de temperaturi sczute, fapt ce se poate realiza artificial prin inerea acestora la frigider (BoC), la ntuneric, dup care vor porni n vegetaie! " alt metode de stimulare a nmuguririi cartofilor prevede imersia tuberculilor n fito ormoni, din clasa giberelinelor, o perioad de timp determinat e'perimental! ;stfel, tuberculii de cartof se taie n fragmente de 0((

0)g, deinnd (,0 oc i! 3ragmentele astfel obinute sunt inute ntr,o soluie de A;* ()g4l timp de o or, pentru a scoate mugurii din repausul vegetativ, dup care sunt plantai n vermiculit steril! ?starii formai din oc i, dup ce ating lungimea de * centimetri servesc la prelucrarea de e'plante meristematice de ),. cm! Preg)#irea e+p a"#e or ,i a $e'i( (i 'e c( #(r) Ranalli ((--8) a raportat o metod tipic de multiplicare a cartofului i anume multiplicarea prin minibutai! $inibutaii sunt fragmente de lstari alctuite dintr,un singur nod, cu lungimi de .,() mm! ;cetia sunt inoculai pe mediu de cultur solidificat i vor genera din mugurii a'ilari cte plntu! 1lntuele vor fi multiplicate prin fragmentarea lor n segmente de B mm incluznd un nod i %umtate din internodurile vecine, i subcultivarea lor nc patru sptmni pe mediu de multiplicare! Rata multiplicrii este de *,. ori la fiecare patru sptmni! $ediul bazal pentru cultura fragmentelor uninodale este constituit din sruri $+ ($uras ige,+Koog, (-/0), za aroz, mioinozitol, tiamin 7Cl i agar! 3itoregulatorii sunt omii n general deoarece pot genera alte tipuri de esut (calus), iar p7,ul mediului este a%ustat la .,8, dar poate varia ntre .,0,/,. conform lui Hones ((-55)! ?strirea a'ilar multipl la cartof este o metod folosit i raportat pentru prima dat de 9odds i colab! ((--0)! 3ragmentele de tulpin de pe care s,au nlturat trei sau patru noduri bazale (deoarece frunzele acestora sunt prea mari) sunt plasate ntr,un vas adnc de ()) ml ce conine (. ml de mediu de cultur lic id! 9up 0,* sptmni, n fiecare vas se vor diferenia /),8) de noduri! :asele vor fi incubate n condiii controlate de temperatur, lumin i umiditate, pe un agitator la 5) rotaii pe minut! ?starii generai vor fi fragmentai n segmente ce vor conine / noduri fiecare i plasai n vase de plastic cu .) ml mediu solid urmnd a fi incubai n camera de cretere pe rafturi metalice! Cultura de muguri adventivi se face la cartof pe medii lic ide n bioreactoare cu Tair,lift> sau n vase plasate pe un agitator mecanic! <'plantele sunt constituite din lstari cu un singur nod provenii de pe plntue generate Tin vitro> n urma culturii de meristeme, care au primit certificarea c sunt libere de viroze! $ediul de cultur folosit este alctuit din macro i microelementele prevzute n reeta mediului $+, adiionat cu vitamine, in ibitori de cretere (etilena) i citoc inine, pentru a permite doar proliferarea numrului de lstari i nu creterea acestora! 9up *,B sptmni se observ obinerea unei mase de meristeme ce vor avea frunzele i tulpinile mult reduse! ?starii astfel obinui vor fi fragmentai i trecui n continuare n bioreactor pentru multiplicare sau pe un mediu solid fr citoc inine i in ibitori de cretere pentru alungire! <ventual 0(0

se poate aduga n mediu A;* (acid giberelic) pentru stimularea alungirii internodurilor! $icrotuberculii sunt tuberculi miniaturali produi n cultura Tin vitro>, iar minituberculii sunt tuberculi mici produi Te' vitro> n condiii controlate din propaguli provenii din cultura Tin vitro>! 9ei minituberculii sunt mai mari (()g) dect microtuberculii (),)0Bg), ambii sunt cu mult mai mici dect materialul semincer clasic ce cntrete ntre .),8)g4tubercul! $icrotuberculii se pot dezvolta n vase de cultur pe mugurii minibutailor (+eabrooK i colab!, (--*), pe lstari (?eclerc, (--B) sau pe muguri adventivi (Oiv i + emes , (--/) i pot fi produi pentru o larg palet de cultivare! Cea mai simpl i eficient metod de producere a microtuberculilor a fost descris de <strada i colaboratorii si n (-5/, i consta n cultivarea unor fragmente de tulpin n vase de 0.) ml cu 0) ml mediu de cultur lic id! $ediul de cultur conine macroelemente i microelemente $+L ),B mg4l tiamin 7ClL 0 mg4l pantotenat de CaL ),B mg4l A;*L ),. mg4l @;1L ),)( mg4l ;F;L ()) mg4l mEo,inositol i 02 za aroz! :asele de cultur sunt amplasate pe un agitator la /) rpm n condiiile unui fotoperiodism de (/ ore lumin! 9up 0,* sptmni plntuele dezvoltate sunt subcultivate pe un mediu specific pentru inducerea tuberizrii, ce conine pe lng srurile $+ i ),B mg4l tiaminL ()) mg4l mEo,inositolL . mg4l @;1L .)) mg4l CCC (clorid clorclorin), ),82 agar i 52 za aroz! Culturile vor fi incubate pe rafturi, la ntuneric, la temperatura de 00oC, timp de B) de zile! 3actorii care influeneaz iniierea tuberizrii sunt I genotipul, condiiile de mediu (lumina, temperatura), mediul de cultur, azotul i regulatorii de cretere! $inituberculii sunt tuberculi mici provenii din microtuberculi sau plntue care sunt plantate n densitate crescut pe paturi nutritive n casa de vegetaie, n condiii controlate! $rimea i numrul minituberculilor depind de soi, condiiile de mediu, anotimp, mediul de cultur, densitatea de plantare i modul de ngri%ire! Creterea densitii de plantare duce la creterea numrului de minituberculi pe m0 i la scderea dimensiunii acestora! Ui nfometrile repetate, dar nedistructive, duc la creterea numrului de minituberculi pe m0, dar scad de asemenea dimensiunile acestora! ;stfel, ?ommen i +taniK ((--0) au raportat c nfometarea n trei reprize duce la o producie de (5)) de minituberculi pe m0, cu o greutate de (,0 g, iar nenfometarea a dus la obinerea de *.) de minituberculi4m0, dar cu o greutate medie de .g! #n continuare minituberculii vor fi plasai n cmp conform unei sc eme de producere de smn, iar factorul ma%or pentru rezistena i performana acestora n noile condiii este mrimea lor! Tuberculii mici au o perioad de 0(*

laten mai lung, pornind mai trziu n vegetaie, cu lstari subiri i sensibili la factorii de stres i cu rezerve nutritive sczute! Areutatea minim necesar unui minitubercul n cmp este de ),. g! $inituberculii %oac un rol important n reducerea ciclurilor de producere a materialului semincer la cartof! 9e e'emplu, n Csrael, cartoful RV9 ?td, produce material semincer pentru comercializare n doi ani! #n primul an plntuele sau microtuberculii cu cte 0 lstari sunt plasai n casa de vegetaie la o densitate de .),0)) indivizi pe metru ptrat, n funcie de cultivar! 1lntuele produc ntre ())),0))) de minituberculi 4 m0 cu diametrul de 0),B)mm, iar microtuberculii produc cu .)2 mai mult dect acestea! #n anul al doilea, minituberculii sunt plantai n sol sub o plas impermeabil insectelor! Cultura este nfometat pstrat n condiii optime i apoi replantat n cmp n acelai an! +mna pentru comercializare este vndut n al treilea an cu 0.),*)) dolari pe ton, ceea ce este cu mult sub preul de cost al materialului semincer importat!

0(B