UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOGICAS
METODOLOGA PARA EL ASLAMENTO DE ADN Y EXTRACCN DE
PROTENAS EN MAGUEY MEZCALERO (Agave salmiana)
T E S I S
PARA OBTENER EL NVEL DE
ICENCIADO EN BIOOG!A
" R E S E N T A
S#r$io %#rr#ra Da&

Zaca'#cas( Zac) S#*'i#+,r# -#l ./01
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS
Francisco Garca Salinas
UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOGICAS
METODOLOGA PARA EL ASLAMENTO DE ADN Y EXTRACCN DE
PROTENAS EN MAGUEY MEZCALERO (Agave salmiana)
T E S I S
PARA OBTENER EL NVEL DE
ICENCIADO EN BIOOG!A
" R E S E N T A
S#r$io %#rr#ra Da&
DIRECTOR DE TESIS2 M) #n C) E-$ar #3n Es*ar&a I,arra
Dr) #n C) Francisco 4a5i#r Ca,ral Ar#llano
CO6DIRECTOR DE TESIS2 Dr) #n C) 4or$# 7is A8ala 79an

Zaca'#cas( Zac) S#*'i#+,r# -#l ./01
AGRADECIMIENTOS
La presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,
participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, tenindome
paciencia, dando nimo, acompaando en todo momento.
A la Universidad Autnoma de Zacatecas: en especial a
la Unidad Acadmica de Ciencias Biolgicas por
darme la formacin profesional de Licenciado en Biologa.
A mis asesores: Al M. en C. Edgar Len Esparza
Iarra y al !r. "rancisco #avier Caral Arellano por la
direccin de este trabajo, todo el apoyo brindado y las facilidades para trabajar en
el Laboratorio de Biotecnologa.
A la Unidad Acadmica de Ciencias $umicas en
especial al !r. #orge Luis A%ala Lu&an y a la M. en C.
Marisa 'ern(ndez Barrales integrantes del Laboratorio de
Patologa y Diagnstico Molecular.
A todos a)uellos que de alguna manera contribuyeron en la realizacin
de este trabajo, as como a la M. en C. Lucia !elgadillo *uiz y
a la $"B. +erla Ivonne ,allegos "lores por el apoyo
brindado.
DEDICATORIA
A mi padre:
Sergio Herrera Leos por el apoyo incondicional, por los valores que me
ha inculcado y que ha contribuido en mi formacin como profesionista.
A mi madre:
Genoveva Daz Zamora por darme la oportunidad de seguir adelante y
tener fe en m en este trayecto.
A mi Hijo:
Khalid Alejandro Herrera Quiones, por ser el motor en mi vida.
A mi hermana:
Yadira Gisela Herrera Daz por darme apoyo a lo largo de la carrera.
A mis amigos:
Los que han pasado y los que han quedado. Gracias por su amistad, adems de
todos aquellos momentos de debate o discusin que tambin contribuyeron a mi
formacin.
INDICE DE FIGURAS
Pgina
1 Representacin simplificada de las membranas celulares. 9
2 Solubilizacin de los lpidos. 10
3 Rotura de la membrana celular y extraccin del ADN genmico. 11
4 Corte transversal y toma de muestras para extraccin de protenas. 20
5 Material usado para extraccin de ADN. 22
6 Espectrofotmetro UV (Q 5000 de Quawell). 26
7 Cmara utilizada para electroforesis en geles de agarosa. 27
8 Cmara utilizada para Electroforesis en geles de poliacrilamida. 33
9 Gel de agarosa del ensayo con DNAzol. 34
10 Gel de agarosa con 2 L de ADN total por muestra, usando CTAB-
STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent mas RNasa.
36
11 Gel de agarosa con 2 L de ADN total por muestra, usando Miniprep
CTAB. 38
12 Gel de agarosa con 2 L de ADN total por muestra, usando
PlantDNAzolReagent mas RNasa. 39
13 Gel de poliacrilamida 41
14 Curva patrn de albmina srica bovina y ecuacin para la
cuantificacin de muestras de protena. 43
15 Gel de poliacrilamida con 15 L de muestra preparada. 44
16 Gel de poliacrilamida con 20 L de muestra preparada. 44
INDICE DE CUADROS
1 Valores para realizar la curva patrn de protenas. 30
2 Cantidades de reactivo para preparar el gel concentrador y gel
separador.
32
3 Datos promedio del anlisis con espectrofotmetro UV de ADN
aislado con el protocolo PlantDNAzolReagent.
34
4 Datos del anlisis con espectrofotmetro UV del protocolo CTAB-
STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent mas RNasa
35
5 Descripcin de la electroforesis usando CTAB-STE y segundo
ensayo con PlantDNAzolReagent mas RNasa.
36
6
Datos del anlisis con espectrofotmetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo mini-prep CTAB.
37
7 Datos del anlisis con espectrofotmetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo PlantDNAzolReagent.
37
8 Estimacin del tiempo requerido para procesar las muestras para
aislamiento de ADN.
40
9 Lectura de absorbancia por espectrofotometra de las muestras de
protena extradas usando buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
40
10 Lectura de absorbancia por espectrofotometra de las muestras de
protena en Agave salmiana de yema apical, pia y hoja, usado
para la extraccin buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
42
11 Cuantificacin de protena, sustituyendo valores en la ecuacin de
la curva patrn.
43
12 Cantidades necesarias, para realizar un gel separador a diferentes
concentraciones de poliacrilamida.
62
13 Lecturas del espectrofotmetro UV (Q 5000 de Quawell por
ensayo.
65
RESUMEN
En este trabajo se determin una metodologa adecuada para el
aislamiento del cido desoxiribonucleico (ADN) y la extraccin de protenas en
Agave salmiana, como apoyo a investigaciones proyectadas en la regin
mezcalera del Altiplano Potosino - Zacatecano.
Para el aislamiento de ADN se realiz el ensayo y compararon tres
protocolos, el mtodo mini-prep usando CTAB (Bromuro de cetiltrimetilamonio), el
mtodo modificado CTAB-STE y el producto comercial PlantDNAzolReagent.
Para la extraccin de protenas se compararon dos metodologas, la primera
mediante el buffer de extraccin NET-2 y el mtodo por precipitacin salina
usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio.
El mtodo que permiti mayor cantidad (hasta 660 ng a partir de 0.5 g de
tejido fresco) y calidad del ADN fue el de CTAB-STE, (aunque lleva mayor tiempo
en procesar las muestras) y le sigui el producto comercial PlantDNAzolReagent
con RNasa, que reduce el tiempo de tratamiento de las muestras con resultados
cercanos al optimo en Absorbancia (A260/280) y ambos ADN con capacidad de
amplificacin.

Para la extraccin de protenas se consider adecuado el mtodo adaptado
de Gorinstein et por precipitacin salina usando buffer Tris-HCL y acetato de
amonio ya que permiti observar con buena resolucin dos bandas de protena de
entre 25 kDa y 40 kDa aproximadamente. La presencia dependi del tipo de tejido,
siendo la parte de la yema apical, el tejido que permiti mejor extraccin.
ABSTRACT
n this work was determined an appropriate methodology for the isolation of
deoxyribonucleic acid (DNA) and protein extraction in Agave salmiana, designed
as a support to research in the region mezcal Potosi-Zacatecas Altiplano.
For isolation of DNA testing was performed and compared three protocols, the
mini-prep method using CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), modified
method CTAB-STE and PlantDNAzolReagent commercial product. For protein
extraction compared two methods, the first through the extraction buffer NET-2
(Nambara et al., 1992) and the method by salt precipitation (Gorinsteinet al. 1999;
Silos et al., 2003) using buffer Tris-HCL and ammonium acetate.
The method allowed a greater amount (up to 660 ng from 0.5 g of fresh tissue) and
DNA quality was that of CTAB-STE, (although it takes more time to process the
samples) and followed the commercial product PlantDNAzolReagent with RNase
, which reduces the processing time of the samples with near optimal performance
in absorbance (A260/280) and both DNA having amplification capability.
For protein extraction method was considered adequate adapted from
(Gorinsteinet al. 1999; Silos et al., 2003) by salting out using Tris-HCl buffer and
ammonium acetate since it possible to observe with good resolution two protein
bands between 25 kDa and 40 kDa. The presence depends on the type of tissue
being part of the heart, tissue allowing better extraction.
INDICE GENERA
. ntroduccin........................................1
1.1. Diversidad y problemticas del gnero Agave...........1
1.2 El Agave en el Altiplano Potosino-Zacatecano ............. 4
1.2.1 El Agave salmiana........................4
1.2.2 Clasificacin botnica ......................5
1.2.3 Distribucin geogrfica .....................6
1.2.4 Usos...............................7
. Revisin de literatura.............................8
2.1 Aislamiento de ADN .......................8
2.2 Mtodos de aislamiento ..........................9
2.2.1 CTAB (Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio) ...............9
2.2.1.1 Principios de mtodo CTAB .........................9
2.2.1.2 Lisis de la membrana celular....................9
2.2.1.3 Extraccin ...........................12
2.2.1.4 Precipitacin ......................... 12
2.2.2 PlantDNAzolReagent ................... 12
2.2.2.1 Descripcin general ..................... 12
2.2.2.2 Beneficios y caractersticas .................15
2.3 Cuantificacin de ADN por espectrofotometra............. 13
2.4 Electroforesis en Gel de agarosa ................. 14
2.5 Extraccin de protenas por precipitacin salina ..........15
2.6 Cuantificacin de protenas por el mtodo Bradford ..........16
2.7 Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida ........16
. Justificacin................................17
. Hiptesis ..............................18
V. Objetivos ....................................19
3.1 Objetivo general..........................19
3.2 Objetivos especficos.......................19
V. Materiales y mtodos ........................20
5.1 Colecta y conservacin de muestras ................. 20
5.2 Aislamiento de ADN ......................20
5.2.1 Protocolo CTAB-STE ....................21
5.2.2 Protocolo Miniprep CTAB .............. ..... 23
5.2.3 Protocolo PlantDNAzolReagent ................ 23
5.3 Cuantificacin de la concentracin de ADN ............25
5.4 Electroforesis en geles de agarosa .................26
5.5 Extraccin de protenas ..................... 28
5.5.1 Extraccin con NET-2 ..................... 28
5.5.2 Extraccin por precipitacin con acetato de amonio ........ 28
5.6 Cuantificacin de la concentracin de protena ........... 29
5.6.1 Curva patrn de protena .....................29
5.6.2 Determinacin por mtodo Bradford ...............30
5.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida .............31
5.7.1 Tincin de bandas de protena .................. 32
V. Resultados ...........................34
Aislamiento de ADN en Agave salmiana ............... 34
6.1.1 Ensayo usando PlantDNAzolReagent ...............34
6.1.2 Ensayo con CTAB-STE y PlantDNAzolReagent ...............35
6.1.3 Ensayo por Mini-prep CTAB ...... .......... 37
6.1.4 Ensayo con PlantDNAzolReagent sobre diferentes tejidos ..... 38
6.2 Extraccin de protenas en Agave salmiana............. 40
V. Discusin ............................46
7.1 Asilamiento de ADN de Agave salmiana.............. 46
7.2 Extraccin de protenas de Agave salmiana............. 46
V. Conclusiones ..........................48
8.1 Recomendaciones ........................ 48
X. Bibliografa ..........................50
X. Anexos ............................55
I) INTRODUCCIN
0)0 Di5#rsi-a- 8 *ro,l#+:'icas -#l $;n#ro Agave
En Mxico se encuentran 150 de las 200 especies que pertenecen al
gnero Agave ms 36 taxa infraespecficos, siendo adems endmico de Amrica
(Garca, 2002). Mxico no es solo su centro de mayor riqueza, con el 75% de las
especies del gnero sino tambin su centro de domesticacin (Gentry 1982).Se
estima que la diversificacin bajo cultivo y seleccin humana, comenz hace 9 000
aos por lo menos (Callen, 1965), este tiempo se a dividido en tres periodos, de
acuerdo a su utilizacin y que a determinado el criterio para seleccionar las
variedades en cada etapa: 1) alimento, 2) bebidas fermentadas y 3) bebidas
destiladas (mezcales) (Colunga y Zizumbo, 2006). Las variedades cultivadas de
forma tradicional o comercial durante los 9 000 aos que lleva su aprovechamiento
en Mxico no han sido descritas acadmica o legalmente, por lo que las unidades
taxonmicas ms utilizadas para describir la diversidad de estos recursos
fitogenticos en Mxico han sido hasta ahora, especie, subespecie y variedad
botnica (CONABO, 2009).
Existen indicios de que se han generado gran cantidad de variantes durante
el tiempo de utilizacin de los agaves, aunque son pocos los estudios sobre la
diversidad agromorfolgica a nivel infraespecfico. En un anlisis sobre la
diversidad de agaves cultivados para producir bebidas destiladas (mezcales),
realizado al sur de Jalisco, se encontraron ms de 20 cultivares tradicionales de
los cuales hay evidencia de su diferenciacin agromorfolgica y gentica (Colunga
y Zizumbo 2006; Vargas et al. 2007, 2009).
-
Colunga et al., (2007) infiere que hay alrededor de 832 variedades
tradicionales de agaves usadas en Mxico como alimento animal, alimento
humano, bebidas fermentadas, bebidas destiladas y fibra. Esta inferencia la
realizan a partir de los resultados obtenidos en la revisin de 180 fuentes
bibliogrficas y ocho herbarios, en donde encontraron 832 nombres asignados
tradicionalmente a 98 taxa (Gentry, 1982). Entre estos hay 72 especies, 13
subespecies y 13 variedades que reciben estos usos. Es necesario confirmar esta
cifra ya que puede representar una estimacin errnea de los datos. Seguramente
al realizar estudios regionales a profundidad se incrementara el nmero de
variedades tradicionales en ciertas regiones. Su revisin taxonmica tambin
podra incrementar el nmero de taxa en ciertas reas, y establecer sinonimias
que lo disminuiran en otras (CONABO, 2009).
Los estudios sobre su diversidad gentica tambin son escasos. Los datos
disponibles indican que las variedades cultivadas tradicionalmente mantienen una
diversidad gentica similar a la encontrada en poblaciones silvestres (Vargas et
al., 2009). En contraste, en las poblaciones manejadas en plantaciones
comerciales su diversidad ha disminuido cada vez ms, hasta llegar prcticamente
a la homogeneidad gentica. Esta tendencia ha sido favorecida por la posibilidad
de propagar vegetativamente las variedades seleccionadas y, ms recientemente,
por la utilizacin de tcnicas de propagacin clonal (micropropagacin). Tal es el
caso del henequn (Galindo et al., 2004) y el agave tequilero (Gil et al., 2006).
Las especies de agave en Mxico se distribuyen de manera natural en
todos los estados con excepcin de Tabasco. Desde el nivel del mar hasta los 3,
000 m, siendo ms abundantes entre los 1, 000 y 2, 000 m. Crecen en dunas
costeras, matorrales xerfilos, selvas bajas caducifolias, bosques de pino-encino e
incluso en los bosques mesfilos de montaa. Las regiones de mayor riqueza de
especies son el Valle de Tehuacn-Cuicatln, la Sierra Madre Occidental, la zona
rida entre Tamaulipas y San Luis Potos, la zona rida hidalguense, el Eje
Neovolcnico en los lmites de Michoacn y el Estado de Mxico, el centro de
.
Jalisco, las montaas de Oaxaca y Chiapas, y los lmites de la Altiplanicie y la
Sierra Madre Oriental (Garca, 1995).
La mayor parte de la diversidad de los recursos genticos del gnero es
utilizada por los agricultores tradicionales, tanto para autoconsumo como para
comercializacin. Solo pocos agricultores y compaas la utilizan con fines
comerciales sin hacer un consumo directo de ella. Los agricultores tradicionales
emplean una gran cantidad de variedades locales en forma habitual y mantienen
una amplia base gentica de ellas. En contraste, las agroindustrias hacen un uso
muy restringido de la diversidad y mantienen una base gentica muy estrecha.
Como ejemplo, se ha encontrado que un solo productor mantena 11 variedades
mezcaleras dentro de su parcela, mientras que la agroindustria del tequila solo
utiliza la variedad azul de A. tequilana en la misma zona, y en toda su rea de
distribucin. Lo mismo ocurre en la agroindustria henequenera, que solo utiliza la
variedad tradicional sackide A. fourcroydes (Colunga y Zizumbo, 2006).
Dada la estrecha base gentica de algunos cultivos, debido a su
propagacin vegetativa, se est buscando incrementar su diversidad por medio de
tcnicas biotecnolgicas. Estos programas no contemplan la utilizacin de la
diversidad existente en los acervos genticamente cercanos, como los parientes
silvestres y otros cultivares derivados del mismo acervo ancestral (CONABO,
2009).
Dado que muy poco del germoplasma disponible en el gnero Agave ha
pasado a un cultivo comercial, es de esperarse que sus niveles de diversidad se
hayan mantenido altos. Las acciones de generacin y conservacin de la
diversidad se han llevado a cabo, principalmente, por los agricultores tradicionales,
quienes mantienen en sus parcelas la seleccin continua de germoplasma
silvestre, el manejo de poblaciones del gradiente silvestre domesticado y la
conservacin de cultivares antiguos, como ha sido documentado para el
germoplasma mezcalero en el sur de Jalisco (Colunga y Zizumbo, 2006).
/
La conservacin y generacin de nuevo germoplasma ser relevante para
el futuro de las industrias que cobran cada vez ms importancia, como la de los
mezcales y la del tequila, y que ya han enfrentado problemas fitosanitarios debido
a la homogeneidad gentica de los cultivos. Se requiere, sin embargo, un cambio
en su enfoque productivo y legal, que busque la diversificacin en lugar de la
homogenizacin (CONABO, 2009).
0). El Agave #n #l Al'i*lano "o'osino6Zaca'#cano
Los agaves se distribuyen en una amplia regin del rido mexicano con
gran diversidad de especies. En los lugares donde se localiza se hace uso del
agave como alimento, forraje, fibras textiles o como materia para otro proceso,
segn sus caractersticas y abundancia (Ramrez et al., 2000). En el Altiplano
Potosino-Zacatecano el maguey mezcalero (Agave salmiana) ocupa grandes
extensiones y es utilizado principalmente para su industrializacin en la
elaboracin de la bebida alcohlica conocida como Mezcal (Aguirre et al., 2001).
La elaboracin de Mezcal entre los poblados de esta regin es de gran
importancia social y econmica como generadora de empleos directos o
indirectos, por lo que numerosas instituciones han dirigido esfuerzos para el
estudio de esta planta desde su diversidad, fisiologa y componentes bioqumicos,
hasta los procesos actuales de cultivo e industrializacin con el objeto de
mejorarlos o sustentarlos adems de la comercializacin y legalizacin.
0).)0 El Agave salmiana
El agave mezcalero potosino (Agave salmiana) forma parte de la familia
Agavaceae, es endmico de Amrica y se distribuye desde el sur de Canad
hasta el Caribe pasando por Estados Unidos, Mxico, Centroamrica y norte de
Sudamrica; ha sido una de las especies ms importantes en la historia del pas,
0
debido particularmente al aprovechamiento de su sabia fresca (aguamiel) o
fermentada (pulque), lo que motiv su cultivo y dispersin (Garca, 1992).
El Agave salmiana es una planta robusta, monocotilednea, de tamao
mediano a grande, compuesta por hojas o pencas que se insertan en espiral,
dndole la forma de una roseta, posee una raz fibrosa y revestida de escamas, en
general forma rosetas macizas de 1.5 a 2 m de alto e igual o el doble de ancho.
Sus hojas son carnosas y macizas; de jvenes son rectas y ligeramente
separadas en su eje central, de adultas se curvan hacia el suelo y adquieren una
coloracin verde griscea, son profundamente convexas por el enves y cncavas
por el haz; son largas, acanaladas, simples, enteras, ms o menos lanceoladas,
con el pice agudo de color verde oscuro, presentan una espina terminal pungente
de 5 a 8.5 cm de largo y con abundantes espinas laterales.
La inflorescencia es una pancula, robusta, de 6 a 8 m de altura, quiote con
15 a 24 pednculos o ramas laterales, el escapo floral presenta brcteas carnosas
y suculentas. Sus flores son hermafroditas, tienen ovario nfero, perianto de 6
piezas, androceo de 6 estambres largos, gineceo constituido por un ovario
oblongo y cilndrico, trilocular, multiovalado, estilo central y con los frutos
superpuestos. El fruto es una cpsula oblonga con 6 casillas longitudinales y 3
lbulos. Las semillas son negras, triangulares, con el embrin recto y el
endospermo carnoso. Su periodo de floracin ocurre entre los meses de mayo a
julio; por otro lado, se estima que el periodo de vida del agave mezcalero potosino
es de 16 aos a partir de que emerge la plntula de semilla o del hijuelo, hasta su
recoleccin como cabeza de maguey (Aguirre et al., 2001)
0).). Clasi<icaci3n ,o':nica
Reino: Plantae
Divisin: Magnolio!yta
Clase: "iliosida
1
Subclase: "iliidae
Orden: Asaragales
Familia: Agavaceae
Gnero: Agave
Especie: Agave #almiana $tto ".
0).)1 Dis'ri,7ci3n $#o$r:<ica
El Agave salmiana se puede encontrar en el rea central de Mxico,
principalmente en los estados de Durango, Zacatecas, San Luis Potos, Morelos,
Michoacn, Guanajuato, Quertaro, Hidalgo, Puebla y Tlaxcala. En Zacatecas y
en San Luis Potos constituye el maguey mezcalero ms importante, mientras que
en Durango es el segundo o tercero en importancia para la elaboracin de mezcal.
El Agave salmiana es el principal maguey pulquero del altiplano mexicano;
prospera con xito entre los 1,000 a 2,250 msnm, en climas que van de semiseco
a seco y con una precipitacin pluvial de 320 a 720 mm anuales; del 90 al 95%
incide en verano y el resto en invierno.
El rgimen trmico puede ser de templado a semiclido extremoso y la
temperatura promedio anual puede ser de 16 a 22C, en primavera y verano tolera
temperaturas promedio de 26C o extremas diarias de hasta 35C. Pueden crecer
en pisos de valles rocosos laderas de cerro, bajadas o abanicos aluviales, excepto
en lugares propensos a inundaciones o con problemas de sales o sodio en el
suelo.
El agave mezcalero potosino en altitudes de 2,300 msnm se acompaa con
bosque de pinos y encinos con suelos derivados de yeso y carece de limitaciones
para establecerse casi en cualquier medio fsico o bitico de los climas secos o
semisecos; no obstante la mayor productividad se logra en los suelos derivados de
rocas gneas que comprenden las reas ptimas para su desarrollo. Actualmente
este agave se distribuye en la regin de Pinos-Zacatecas, en un rea de
2
aproximadamente 60,000 ha y prcticamente en la totalidad del altiplano Potosino
(Aguirre et al., 2001).
0).)= Usos
A lo largo y ancho del territorio mexicano, la utilizacin que se le da a los
agaves es muy variada y depende tanto del lugar y la especie como de la estacin
del ao. Como su nombre lo indica, el uso principal del agave mezcalero potosino
(Agave salmiana) es la produccin de mezcal que se elabora a partir de los
carbohidratos concentrados en la pia de la planta (actividad que constituye la
base econmica de las localidades donde se explota). Otro uso importante del
agave es la produccin de aguamiel, a partir de cuya fermentacin se elabora el
pulque, que adems de emplearse como bebida alcohlica, tambin se utiliza en
la elaboracin del conocido pan de pulque. Las hojas o hojas que forman parte de
los residuos agrcolas del cultivo, as como todas aquellas pias que no son
captadas por la industria mezcalera, son utilizadas como forraje para la
alimentacin de animales de corral, principalmente vacunos, caprinos, ovinos y
equinos.
Tan solo en el estado de San Lus Potos, se estima que entre 2 a 8 mil toneladas
de agave se utilizan anualmente como forraje (Martnez et al., 2005). Las hojas se
utilizan para obtener la fibra que se utiliza para fabricar cuerdas, telas, redes y
bolsas; anteriormente tambin se empleaban como relleno de colchones y sillones
para autos, etc.; el quiote ha sido usado como material de construccin (Gentry,
1982). Por otro lado, en el estado de Puebla se han utilizado los agaves como
barreras naturales inmensas alcanzando una altura de 1.8 a 2.1 m y 4.5 a 6 m de
ancho, filas de 2 a 3 agaves sirven como rompe vientos y barreras contra la arena
del desierto (Martnez et al., 2005).
3
II) REVISIN DE ITERATURA
.)0 Aisla+i#n'o -# ADN
Existe gran variedad de protocolos eficientes y convencionales para el
aislamiento de ADN, fciles de usar y en poco tiempo (Bruss et al., 2000). Por
mencionar algunos mtodos clsicos, se encuentran los descritos por Doyle y
Doyle (1987) tiles en hojas maduras, independientemente de las condiciones de
crecimiento y edad (Weir et al., 1996).
Murray y Thopsom (1980); Wang et al., (1993); Henry (1997); Jewit et al.,
(1998); Lefort y Douglas (1999); Han usado al bromuro de hexadeciltrimetilamonio
(CTAB) para aislamiento de ADN de hojas maduras. Para estudios de
caracterizacin de especies con la tcnica de RAPD (ADN Polimrfico Amplificado
Aleatoriamente). El CTAB, se pega fuertemente al ADN, desplaza las protenas,
previene la degradacin y solubiliza muchos polisacridos. Adems, funciona
como detergente que destruye las membranas al momento de moler el material
vegetal y se remueve mediante extracciones con cloroformo (Valadez y Kalh,
2000).
Weir et al., (1996) que tambin menciona a Edwards et al., (1991), utilizan
SDS (Dodecil sulfato de sdio) como detergente que disocia protenas de ADN y lo
hace ms accesible a la degradacin por proteinasas usadas durante la tcnica
del aislamiento (Valadez y Kahl, 2000). El ARN es un contaminante, por lo que es
necesaria la adicin de RNasa e incubacin al final de la extraccin, a diferente
concentracin y temperatura dependiendo del mtodo a utilizar (Weir et al., 1996;
Csaikl et al., 1998; Stange et al., 1998).
4
.). M;'o-os -# aisla+i#n'o
.).)0 CTAB >Bro+7ro -# %#?a-#cil'ri+#'ila+onio@
.).)0)0 "rinci*ios -# +;'o-o CTAB
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos
nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos
fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la
concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol (Somma, 2007).
.).)0). isis -# la +#+,rana c#l7lar
La primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana celular y
nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn
(buffer) de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las
membranas biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por
molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes.
Tal como muestra la Figura 1, las molculas lipdicas estn ordenadas en
una doble capa continua, en la que las molculas protenicas estn disueltas. Las
molculas lipdicas estn formadas por extremos hidrfilos, denominados cabezas,
y extremos hidrfobos, denominados colas.
5
Figura 1. Representacin simplificada de las membranas celulares
1
.
En este mtodo, el detergente (CTAB) contenido en el tampn de
extraccin provoca la lisis de la membrana. Dado que la composicin de los lpidos
y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampn de extraccin
captura los lpidos que integran la membrana celular y nuclear. La Figura 2 ilustra
el mecanismo de solubilizacin de los lpidos con un detergente.
Figura 2. Solubilizacin de los lpidos
1
.
La Figura 3 ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente
captura los lpidos y las protenas al entrar en contacto con la membrana celular y
el tampn de extraccin con CTAB. Con una concentracin salina (NaCl)
determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos.
El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros
metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio
al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl
confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior
-
Las ilustraciones proceden de: %enetic #cience "earning &enter, Univ. de Utahhttp://gslc.genetics.utah.edu.
-6
daa el ADN). Es importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan
fcilmente en esta fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo
transcurrido entre la homogeneizacin de la muestra y la adicin de la solucin
tampn con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los
orgnulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los
cloroplastos), se purifica el ADN (Somma, 2007).
Figura 3. Rotura de la membrana celular y extraccin del ADN genmico
1
.
.).)0)1 E?'racci3n
En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el
CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems
lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente importante
eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden inhibir
numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl< 0,5
M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y
pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo
desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica.
La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es
densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems,
si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los
cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la
extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por
completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los
cidos nucleicos, puede retro extraerse la fase orgnica con una solucin acuosa,
--
que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los
complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa
del procedimiento (Somma, 2007).
-.
.).)0)= "r#ci*i'aci3n
En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo
cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin
compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl> 0,8
M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado
de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de
NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms
soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los
cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite
una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual
(Somma, 2007).
.).). PlantDNAzolReagentA
.).).)0 D#scri*ci3n $#n#ral
nvitrogen Corporation (2004), describe que el protocolo
PlantDNAzolReagent (NVTROGEN) contiene una solucin detergente llamado
guanidina la cual hidroliza el RNA y selecciona el ADN precipitado. El protocolo
es rpido y permite el aislamiento del ADN genmico para diferentes tejidos de la
planta. El procedimiento que utiliza PlantDNAzolReagent, cuando se muele el
tejido con nitrgeno lquido y es homogenizado, realiza la extraccin y con una
centrifugacin se precipita el ADN y el sobrenadante es lavado con etanol. Dando
como resultado una pelotilla de ADN.
.).).). B#n#<icios 8 carac'#rs'icas
El protocolo completo puede realizarse de 30 a 60 minutos.
Con solo 0.3 ml PlantDNAzolReagent se puede extraer ADN de 0.1 g de
tejido de plantas.
-/
Este producto puede ser usado en clonacin molecular, PCR, mapeos de
molculas, y otras tcnicas de biologa y sus aplicaciones.
PlantDNAzolReagent se encuentra estable a temperatura ambiente
durante un ao despus de abierto.
Con el reactivo PlantDNAzolReagent se pueden extraer ADN hasta de 50
mg de tejido vegetal (nvitrogen Corporation, 2004).
.)1 C7an'i<icaci3n -# ADN *or #s*#c'ro<o'o+#'ra
El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mono nucletidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, D$) de luz ultravioleta (tambin
puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la
medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases
es sencillo y exacto. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa
concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan idneos. La concentracin
de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un
blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un
cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente
A'()*A'+) para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes
respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de
carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente
A'()*A',) de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente (Somma, 2007).
Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede
emplearse el mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite
calcular la cantidad de cidos nucleicos a partir de la intensidad de la
fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparndola
con unos patrones de concentracin (Somma, 2007).
-0
.)= El#c'ro<or#sis #n G#l -# A$arosa
La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar
macromolculas en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades
fsicas. El trmino electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas
bajo la influencia de un campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y
foresis, del griego !oros, significa trasladar. As pues, la electroforesis en gel
es una tcnica consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que
atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensin
elctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de
una molcula determinan la velocidad con que un campo elctrico puede
desplazarla a travs de un medio gelatinoso. Muchas macromolculas biolgicas
importantes (por ejemplo, los aminocidos, los pptidos, las protenas, los
nucletidos y los cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH
determinado, existen en solucin como especies cargadas elctricamente, sean
cationes (+) o aniones (-). Segn la naturaleza de la carga neta, las partculas
cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo. As, por ejemplo, cuando se
aplica un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN
cargados negativamente lo harn migrar hacia el nodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza
para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una tcnica
sencilla y rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden
separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede
localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que
es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante (Sambrook et
al., 1989; Somma y Querci, 2007).
-1
.)B E?'racci3n -# *ro'#nas *or *r#ci*i'aci3n salina
Antes de iniciar el estudio de una protena, es necesario que esta se
encuentre pura: sin contaminacin con otras protenas u otras sustancias
celulares; por esta razn, el primer paso es separar las protenas de los dems
compuestos del extracto, ya sean de clulas vegetales, animales o humanas, y,
para lograrlo, se utilizan diversas tcnicas. Una de las tcnicas ms antigua,
simple y muy eficaz, se basa en la baja solubilidad que tienen las protenas en
diluciones salinas concentradas; la sal que ms se ha utilizado con este propsito
es el sulfato de amonio, (NH4)2SO4. El hecho de que una protena se disuelva en
un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrogeno con el
agua: a mayor cantidad de puentes de hidrogeno, mayor solubilidad. La accin de
la sal es liberar el agua unida a la protena por puentes de hidrogeno, lo cual
provoca su precipitacin (Quesada, 2007).
La precipitacin salina de las protenas es una tcnica en donde se logra la
de una fraccin de protenas mediante el aumento de la fuerza inica del medio.
Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de protenas, disminuye
la interaccin protena-H2O porque elimina la capa de solvatacin, predominando
la interaccin protena-protena y generando la precipitacin de las mismas. La
concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para todas las
protenas, lo que permite usar sta propiedad para la separacin y purificacin de
protenas particulares a partir de mezclas complejas. Comnmente se usa sulfato
de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato
de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C) y porque el in sulfato
divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas.
-2
.)C C7an'i<icaci3n -# *ro'#nas *or #l +;'o-o Bra-<or-
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva
Blue) a las protenas. El colorante, en solucin acida, existe en dos formas una
azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo
protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre.
Este mtodo es sensible (1-15g), simple, rpido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas.
.)D El#c'ro<or#sis -# *ro'#nas #n $#l#s -# *oliacrila+i-a
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados
para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas. La tcnica permite
separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les
somete a la accin de un campo elctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre
un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se
utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes
(p.e. SDS), catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2-mercaptoetanol, DTT).
Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin,
siendo el ms habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es
en funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso
molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf)
de la protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de
peso molecular conocido (Maldonado y Jorrin, 2008).
-3
III) 4USTIFICACIN
El presente trabajo surge ante la necesidad de identificar metodologas para
el aislamiento de ADN y la extraccin de protenas aplicables en especfico sobre
muestras de Agave salmiana. Para obtener ADN de buena calidad en una especie
en particular, frecuentemente se requiere de ensayo de diferentes mtodos de
aislamiento y aunque se cuenta con informacin sobre aislamiento de ADN en
Agave, la composicin qumica entre especies del mismo gnero suele ser muy
diversa, por lo que es necesario probar algunas metodologas en Agave salmiana
para garantizar aislar ADN de capacidad amplificable.
De igual forma es necesario definir un mtodo para la extraccin de
protenas en Agave salmiana al haber pocos estudios que informen sobre perfiles
de protenas de las especies de Agave. Para lo cual se requiere adaptar
metodologas aplicadas en otros gneros, como las efectuadas en el gnero
$untia.
Este trabajo servir como base para realizar estudios sobre la morfologa y
diversidad gentica en las poblaciones de Agave salmiana del Altiplano Potosino-
Zacatecano que al ser un importante recurso en esta regin, su demanda lo podra
poner en riesgo si no se cuenta con informacin que demuestre la necesidad de
un adecuado aprovechamiento y conservacin.
-4
IV) %I"TESIS
A partir de mtodos establecidos para el aislamiento de ADN y extraccin
de protenas, se establece una metodologa especfica para el aislamiento y
extraccin de ADN de calidad y protenas del Agave salmiana, reflejando su
concentracin, pureza y comportamiento electrofortico.
-5
V) OB4ETIVOS
B)0 O,9#'i5o $#n#ral
- Obtener una metodologa adecuada para el aislamiento de ADN y la
extraccin de protenas en Agave salmiana, mediante el ensayo y
comparacin de mtodos establecidos.
B). O,9#'i5os #s*#c<icos
- Comparar dos mtodos para el aislamiento de ADN en Agave salmiana en
trminos de su concentracin, pureza y comportamiento electrofortico.
- Comparar dos mtodos para la extraccin de protenas en Agave
salmiana en trminos de su concentracin y comportamiento electrofortico.
- Proporcionar herramientas e informacin til para las investigaciones en la
regin mezcalera del Altiplano Potosino - Zacatecano.
.6
VI) MATERIAES E MTODOS
C)0 Col#c'a 8 cons#r5aci3n -# +7#s'ras
El muestreo se realiz mediante un corte transversal del agave adulto
(Figura 4) y tomando una porcin de aproximadamente 100 gramos en cada parte
de tejido de tallo, yema apical y hoja para la extraccin de protena. Para el
ensayo de los mtodos de aislamiento de ADN adems se tomaron hijuelos
radiculares. Las muestras se conservaron de bolsas de plstico -imloc. dentro
de una nevera con hielo hasta ser almacenadas en el laboratorio. En laboratorio
las muestras que seran usadas en tejido fresco se almacenaron en refrigeracin a
4 C y las que requirieron ms tiempo para su uso se almacenaron en congelador
a -20 C, como fue el caso del ensayo con protenas.
Figura 4. Corte transversal y toma de
muestras para extraccin de protenas.
C). Aisla+i#n'o -# ADN
Para los ensayos de aislamiento de ADN, generalmente se tomaron
muestras de tejido fresco de hijuelos de Agave salmiana, en algunos se us tejido
refrigerado, para el ltimo ensayo se agregaron muestras de A. tequilana y A.
.-
americana. Lo anterior de acuerdo a los siguientes protocolos, con pequeas
modificaciones para plantas suculentas.
C).)0 "ro'ocolo CTAB6STE >Falc3n 8 Val#ra( .//D@
Se molieron 0.5 g de tejido fresco con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo
fino. Se trituro en un solo evento para no remoler la muestra excesivamente (esto
provoca que el ADN se fraccione).
Despus se agregaron 260 l de CTAB y 975L de STE (Sodio-Tris-EDTA),
agitando hasta obtener un jarabe. (La mezcla se pas a un tubo nuevo de 1.5 ml).
Posteriormente se le agrego 65 l de SDS al 20 % agitando vigorosamente por 5
min e incubo a 65 C por 10 minutos. Despus se le aadi 325l de acetato de
potasio 5M fro e incubo a -20 C por 40 min. Se centrifugaron los tubos a 12 000
xg por 30 min., y se filtraron las fases acuosas con un trozo de algodn (o gasa)
estril insertado en la boca del tubo y sobre ste recupero el sobrenadante en un
tubo nuevo.
Despus se le agregaron 2/3 del volumen de sobrenadante obtenido con
isopropanol fro (-20 C), se mezcla suavemente e incubo a -20 C por 1 h.
Posteriormente se mezcl suavemente y se centrifugaron los tubos a 12 000 xg a
6C por 10 min. Se descart el sobrenadante para dejar secar el botn de ADN y re
suspender en 500l de buffer TE. Se incubo a 65 C por 10 min.
Se centrifugo a 12 000 xg por 10 min y se transfiri el sobrenadante a un tubo
nuevo en el que se le agregaron 30l de acetato de sodio 3 M y 300l de
isopropanol fro (-20 C), mezclndolo suavemente. Se incubo a -20 C por 30 min.

Luego se mezcl suavemente y se centrifugo a 6 C por 10 min., (hasta formar un
botn pequeo traslcido), el cual es limpiado con etanol fro (-20 C) al 70 %,
mezclando con agitacin manual hasta soltar el botn. En algunos casos se
..
consider necesario repetir el lavado con alcohol al 70 %. Limpio el botn se
centrifugo a 1000 x g durante 10 min y se deshecha el sobrenadante. Se rehidrato
el ADN con buffer TE, el volumen de agua puede ir de 15l a 150L. (Las
extracciones realizadas se suspendieron en 70 l de buffer TE).
Notas:
Se recomend hacer ensayos previos para ajustar adecuadamente el
algodn o gasa, es importante para recuperar correctamente la mayor
cantidad de sobrenadante.
Ver soluciones para mtodo CTAB-STE en los anexos.
Material esterilizado para evitar degradacin del ADN (Figura 5).
Figura 5. Material usado para extraccin de ADN.
./
C).). "ro'ocolo Mini*r#* CTAB >E-Far-s( .//0G A,raHa+( .//I@
En un tubo frio de 1.5 ml se pesaron 0.05g de tejido pulverizado con nitrgeno
lquido y se le aadieron 500l de buffer de extraccin CTAB e incubaron por 15
min., en agua previamente calentada a 60C, con mezcla ocasional por inversin
para dispersar los grumos.
Despus se le aadieron 500l de cloroformo y se mezclaron por inversin hasta
formar una emulsin (20 veces).
Centrifugaron a 12000 /g durante 10 minutos a temperatura ambiente y se coloc
la fase acuosa en un tubo de 1.5ml para mezclar 2.5l de RNasa suavemente e
incubar a 37C durante 30 min., (dos veces).
Posteriormente se transfiere la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo y se le
aadieron 0.6 volmenes de isopropanol y se mezclaron por inversin para
precipitar el ADN.
Despus se coloc la muestra a -20 C durante 10 min. Centrifugada a 12000 /g
por 5 min. Se decant el sobrenadante.
Se lavo la pastilla con 500 l de etanol 70% fro. Agitando hasta despegar la
pastilla. Se centrifugo a 12 /g por 5 min. Para decantar el sobrenadante.
Se invirtio el tubo sobre papel absorbente y se dejo secar la pastilla a temperatura
ambiente entre 5-10 min. Para posteriormente re suspender en 30l de buffer TE
1X y almacenar a -20C.
C).)1 "ro'ocolo PlantDNAzolReagentA
Para la Extraccin se pulverizo el tejido con nitrgeno lquido en mortero, tratando
de moler en un solo evento y con una esptula se pesaron 0.3g pasando el
.0
pulverizado a un tubo de 1.5 ml que est sobre una balanza previamente tarada.
Luego se le agrego PlantDNA-$". en la siguiente proporcin: 300l de
PlantDNA-$". por cada 0.1 g de muestra de tejido. Se agita por inversin tres
veces y se puso a incubar durante 5 min a 25 C con agitacin manual moderada.
Se agregaron 300 l de Cloroformo y se agitaron manualmente para incubar
durante 5 min a 25 C.
Para la Precipitacin del ADN se centrifuga a 12000 xg durante 10 min., se recoge
la fase acuosa y se agregan 225 l de etanol absoluto, se agito por inversin en 6
u 8 ocasiones y se dejaron reposar 5 min a 25 C.
Posteriormente se centrifugo a 5000 g durante 4 min., y se retir del
sobrenadante. (En algunos casos en ADN precipitado no es visible despus de la
centrifugacin).
Para el Lavado del ADN se prepar la soluci0n de lavado PlantDNA-$"12tanol:
Mezclando 1vol de etanol por 0.75vol de etanol absoluto.
Se mezclaron 300l de la soluci0n de lavado PlantDNA-$"12tanol con el ADN
precipitado y se agitaron con vortex para dejar reposar 5 min a 25 C.
Despus se centrifugo a 5000 xg durante 4 min. Y se elimin la solucin de lavado
PlantDNA-$"12tanol y la pastilla se lav con 300 l de etanol al 70% mezclando
vigorosamente.
Continuando se centrifugo a 5000 xg durante 4 min.
Luego se desech la solucin de etanol por decantacin para dejar secar la
pastilla. Despus se re suspendi la pastilla agregando 70 l de Buffer TE
Notas:
.1
Se mantuvo la proporcin en todas las soluciones respecto a la cantidad de
tejido usado.
En el segundo ensayo se agregaron 3l de RNasa (10 mg/ml).
Protocolo original (en ingls) en los anexos.
.2
C)1 C7an'i<icaci3n -# la conc#n'raci3n -# ADN
Se utiliz un espectrofotmetro (Figura 6) UV (Q 5000 de Quawell), posee
la ventaja de poder realizar lecturas con 2 l de muestra que se van archivando en
el software que incluye el equipo.
Al encender el equipo se limpi el punto de lectura con agua estril y papel, se
carg la muestra blanco (2l) y se cerr el brazo.
En la aplicacin (software) se identifica el nombre de la muestra (D sample) y se
da clic en blanco (Blank).
El brazo hace un movimiento de abertura y ajusta su posicin, en este momento
es. Se verifica la lectura en el software y se limpia el punto de lectura.
Despus se carga la muestra a medir. Nuevamente se identifica la muestra con un
nombre (D sample), ahora se da clic en medir (measure).
Corroborar que se forme la pelcula con la muestra a medir y limpiarla con papel
una vez registrada la lectura en el software.
Al terminar la medicin de muestras se hace clic en (Report to Exel) para obtener
un reporte en Exel y archivarlo para posterior anlisis.
Notas:
Se realizaron tres lecturas (repeticiones) por muestra y al final se
promediaron para tener menor margen de error.
Entre cada muestra, se hizo una lectura del blanco, para corroborar si se
presentan anomalas. Si cambiaba la curva que presenta el software entre
cada lectura de la muestra blanco se tena que volver a calibrar en (Blank).
.3
Tiene un puerto de conexin USB que debe estar bien ajustado para evitar
problemas de conexin.
Figura 6. Espectrofotmetro UV (Q 5000 de
Quawell).
C)= El#c'ro<or#sis #n $#l#s -# a$arosa
Se pesaron 0.8g de agarosa y se vacaron en un matraz Erlenmeyer disolviendo
en 100 ml de buffer TAE 1 X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) para obtener una
concentracin de 0.8%.
La solucin se caliento en el horno de microondas hasta que desaparecian los
grumos formados; observando continuamente el matraz y agitando hasta disolver
la agarosa.
Se dej enfriar hasta una temperatura cercana a los 60 C, y se adicionaron 4.5l
de bromuro de etidio (10 mg/ml).
Se mezclaron bien y se vaco el contenido a una cmara de electroforesis
sumergida (Figura 7), previamente armada con su peine y deja gelificar.
Cada muestra de ADN (100 g) se prepar con 10 l de la muestra ms 2l de
.4
buffer de carga para cidos nucleicos.
Despus se retira el peine del gel y se carga cada pozo o carril, con la muestra.
Se vierte con cuidado el buffer TAE 1X para el corrimiento y se aplica una
corriente constante de 80 Volts por 45 minutos.
Junto con las muestras se corri un marcador de longitud nucleotdica ()
poniendo 4l equivalentes a 25g de ADN, dando un total de 100 g.
Concluida la electroforesis, se llev el gel al trans iluminador y se encendi la
lmpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas teidas con el bromuro de
etidio.
Despus se realiz la captura de imagen en un foto documentador y se verifico la
integridad del ADN genmico.
.5
/6
Figura 7. Cmara utilizada para electroforesis en
geles de agarosa.
/-
C)B E?'racci3n -# *ro'#nas
Para la extraccin de protenas se realizaron ensayos con especies de
Agave americana y Agave tequilana en yema apical, tallo y hoja. Una vez definida
la metodologa se realiz la extraccin de protenas de las muestras colectadas de
Agave salmiana.
C)B)0 E?'racci3n con NET6.
Se realiz la extraccin con buffer NET-2 (ver ane/os) adaptando la
metodologa original de acuerdo a la disposicin de equipo en laboratorio,
desarrollndola como sigue:
Se agreg 1gr de tejido fresco en un tubo de 15 ml y verti buffer NET-2 hasta 14
ml.
Se pasaron por vortex hasta homogenizar la muestra e incubo tres min., en bao
Mara.
Se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y se recuper el sobrenadante.
Del sobrenadante recuperado se hicieron las pruebas de cuantificacin.
C)B). E?'racci3n *or *r#ci*i'aci3n con ac#'a'o -# a+onio
Se realiz el mtodo de extraccin usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio de
acuerdo a (Gorinstein et al., 1999; Silos et al., 2003), haciendo algunas
modificaciones de acuerdo a la disposicin de material y equipo en laboratorio,
desarrollando como sigue:
Se tomaron 75 gr de tejido fresco en trozos para licuar hasta homogenizar con
37.5 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 a 4C.
La suspensin se filtr con una gasa estril, el filtrado se centrifuga a 6000 rpm
/.
durante 10 min.
El sobrenadante se pas por papel filtro Whatman N 2 y se centrifug
nuevamente a 6000 rpm durante 10 min.
Se recogi el sobrenadante calculando el volumen y se adicion 80% de solucin
saturada de Sulfato de Amonio, se dej en reposo a 4 C durante 48 h.
El precipitado formado se recogi por centrifugacin a 6000 rpm durante 10
minutos y eliminando el sobrenadante.
Los grnulos o sedimento se re suspendieron en 5 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 a
4C.
La suspensin se dializ en un tubo de dilisis de celulosa (#ectra*Por) con un
punto de corte MW 6-8000 contra agua destilada durante 16 hrs a 25 C.
Se calcul el volumen de la suspensin y se prepararon alcuotas para concentrar
en Rota-evaporador a 45 C hasta reducir aprox. un 50% del volumen inicial.
Las alcuotas concentradas se almacenan a -20 C hasta su uso.
C)C C7an'i<icaci3n -# la conc#n'raci3n -# *ro'#na
C)C)0 C7r5a *a'r3n -# *ro'#na
Se prepar una solucin estndar de albmina srica bovina a una concentracin
de 1 mg por ml, para esto se pes 0.01g (10mg) de sta protena y se disolvi en
10ml de NaCl 150 mM; para hacer alcuotas de 1 ml y almacenarlas a -20 C, para
su posterior uso.
//
Se coloc en una serie de tubos de 1.5 ml diferentes concentraciones de la
solucin estndar de protena, adicionando el NaCl 150 mM (0.15 M) necesario
para tener un volumen de 800 l, como se muestra en la tabla. (Se realizaron por
triplicado).
Despus se midio la absorbancia de cada repeticin respecto al blanco y se
elabor la curva incluyendo la ecuacin de la lnea de tendencia.
Cuadro 1. Valores para realizar la curva patrn de protenas.
No) -# '7,o Clor7ro -# so-io
/)0B M
S'ocJ -# al,K+ina
>0+$L+l@
Conc#n'raci3n <inal
-# *ro'#na
0 (blanco) 800 l 0 l 0 g
1 799 l 1 l 1 g
2 795 l 5 l 5 g
3 790 l 10 l 10 g
4 785 l 15 l 15 g
5 780 l 20 l 20 g
6 775 l 25 l 25 g
7 770 l 30 l 30 g
8 765 l 35 l 35 g
9 760 l 40 l 40 g
10 755 l 45 l 45 g
C)C). D#'#r+inaci3n *or +;'o-o Bra-<or-
Se adiciono en varios tubos de 1.5ml la cantidades de 1.5 y 10l de muestra
ajustando a un volumen de 800 l con solucin de NaCl 150 mM (ver ane/os).
Se aadieron 200l de solucin de trabajo Bradford (Bradford, 1976) y se
mezclaron los tubos en vortex sobre la gradilla y se dejaron reposar por 3 min., a
temperatura ambiente.
Despus se transfirio la muestra a una cubeta de plstico y se leyo la absorbancia
/0
a una densidad ptica de 595 nm en la regin visible.
Se calcul la cantidad de protena, interpolando la densidad ptica obtenida en
una curva patrn de protena o sacando la regresin lineal y sustituyendo el valor
en la ecuacin de una recta (ver ane/os). Cada determinacin se realiz por
triplicado.
C)D El#c'ro<or#sis #n $#l#s -# *oliacrila+i-a
Se arm la mini cmara (Figura 8) y se prepar el gel separador (&uadro ' y
ane/os ara soluciones).
Despus se coloc la mezcla poco a poco en la cmara, dejando espacio para
poner el gel concentrador e inmediatamente se adiciona isopropanol 1:1 en agua
(v/v), para alinear el gel y para que gelifique ms rpido al estar en un ambiente de
anaerobiosis.
Se dej polimerizar por aproximadamente 20 min., y luego se decant el
isopropanol, posteriormente se seca con papel absorbente.
Luego se prepar y adiciono el gel concentrador (ver ta3la) colocando previamente
el peine con el nmero de pozos deseado en la cmara de electroforesis.
Una vez gelificado, se remueve el peine despacio y con cuidado.
Se aadi el buffer de corrida 1X (ver ane/os) y se cargaron los pozos con la
muestra de inters.
Se corri el gel en dos etapas, la 1 a 80 volts durante 15 min., para alinear las
muestras en su trayectoria y la 2 a 100 volts constantes por 140 min., usando una
fuente de poder PowerPac de Bio-Rad.
/1
Para finalizar la electroforesis, se tio el gel para visualizar las bandas de protena.
El gel se carg con 60 g de protena por carril (15 l de muestra), esta se
prepar calculando la cantidad de muestra necesaria para 10 corrimientos y se
diluyo en un volumen de 150l de buffer de muestra para protenas, luego se puso
a hervir la muestra contenida en un tubo de 1.5ml por 5min., en un bao con agua.
Despus se centrifugo a mxima velocidad (14,000 rpm) por 10 segundos. Se
carg tambin 10l en un carril de un marcador de peso molecular.
/2
Cuadro 2. Cantidades de reactivo para preparar el gel concentrador y gel
separador.
Soluciones Gel separador
al 12 %
Gel concentrador
al 4.5 %
Acrilamida-bisacrilamida (30:0.8
%)
Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8
Tris-Cl 0.5 M, pH 6.8
H2O bidest. o tridestilada
SDS al 10 %
PSA al 10 %
Temed
4 ml
2.5 ml
0 ml
3.5 ml
200 l
70 l
10 l
0.6 ml
--
1 ml
2.32 ml
80 l
25 l
5 l
Modificado de Laemmli U. K. 1970.
C)D)0 Tinci3n -# ,an-as -# *ro'#na
Para realizar esta tincin, primero se coloca el gel de poliacrilamida en un
recipiente de plstico, al cual se le adiciona solucin fijadora para tincin de
Coomassie (ver ane/os) hasta cubrir totalmente el gel y se agita suavemente por
15 min., en un orbital rocket o shaker. Luego se decanta la solucin fijadora y se
cubre el gel con solucin de tincin rpida de Coomassie (ver ane/os) y se agita
suavemente por 2 hrs o hasta observar las bandas teidas. Despus se desecha
la solucin de tincin y se le coloca al gel en la solucin desteidora de cido
actico al 10 % (ver ane/os). Se agita suavemente, hasta que de un fondo claro y
se visualizaran las bandas de protena para posteriormente poder analizar el gel.
Figura 8. Cmara utilizada
Electroforesis en geles de
poliacrilamida.
/3
VII) RESUTADOS
D)0 Aisla+i#n'o -# ADN #n Agave salmiana
D)0)0 Ensa8o 7san-o PlantDNAzolReagentA)
Cuadro 3. Datos promedio del anlisis con espectrofotmetro UV de ADN
aislado con el protocolo PlantDNAzolReagent
Muestra A260/280 A260/230 Conc. ng/L Conc. g/L
S1 Dnazol 1.66 0.11 22.83 0.02
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio, de la
muestra de ADN S1(A. salmiana 1) aislado con el protocolo
PlantDNAzolReagent (Figura 9).
Figura 9. Gel de agarosa del
ensayo con DNAzol. (M) 4 l
Marcador Lambda DNA/Hind) (1)
2 l de ADN, (2) 4 l de ADN, (3) 6
l de ADN.
D)0). Ensa8o con CTAB6STE 8 PlantDNAzolReagentA
/4
Promedio de los datos del anlisis con espectrofotmetro UV de ADN
aislado con el protocolo CTAB-STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent
agregando RNasa (Cuadro 4). En negritas los valores ms acercados al cociente
ptimo.
Cuadro 4. Datos del anlisis con espectrofotmetro UV del protocolo CTAB-STE y
segundo ensayo con PlantDNAzolReagent mas RNasa.
Muestra Descripcin A260/280 A260/230 Conc. ng/l Conc.g/l
1 S1 CTAB-STE 0)D1 .).C 513.55 0.51
2 S2 CTAB-STE 0)M. .).1 661.07 0.66
3 S1 DNAzol 1.52 0.13 72.80 0.07
4 S2 DNAzol 0)DM 0.05 23.54 0.02
5 S3 DNAzol 0)M/ 0.05 30.55 0.03
6 S3 DNAzol 0)MB 0.07 33.52 0.03
7 Ctrl DNAzol 1.25 0.01 4.37 0.00
Se corri un gel (Figura 10) cargando cada pozo con 2 l de muestra
despus de resuspender el ADN en 70l de buffer TE al concluir el aislamiento,
usando el protocolo CTAB-STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent
agregando RNasa (Cuadro 5).
Figura 10. Gel de agarosa con2 l de ADN total por
muestra, usando CTAB-STE y segundo ensayo con
PlantDNAzolReagent mas RNasa.
/5
Cuadro 5. Descripcin de la electroforesis usando CTAB-STE y segundo
ensayo con PlantDNAzolReagent mas RNasa.
Carril Descripcin
Das de refrigeracin (4C) de la
muestra al momento de extraccin
M Marcador Lambda
DNA/Hind(4 l)
--
1 S1 por CTAB-STE 3 das
2 S2 por CTAB-STE 0 das
3 S1 por DNAzol+RNAasa 4 das
4 S2 por DNAzol+RNAasa 1 da
5 S3 por DNAzol+RNAasa 0 das
6 S3 por DNAzol (sin RNasa) 0 das
7 Control (Proced. DNAzol sin
muestra)
--
S1= Muestra 1 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
S2= Muestra 2 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
S3= Muestra 3 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
Notas:
El aislamiento por CTAB-STE fue a partir de 0.5 g de tejido.
El aislamiento por PlantDNAzolReagent fue a partir de 0.3 g de tejido.
D)0)1 Ensa8o *or Mini *r#* CTAB >E-Far-s( .//0@)
Los datos obtenidos con este mtodo se indican en el Cuadro 6 y Figura 11,
donde se puede observar buena concentracin de ADN y de buena calidad.
Cuadro 6. Datos del anlisis con espectrofotmetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo mini-prep CTAB.
Muestra Descripcin A260/280 A260/230 Conc. ng/l Conc. g/l
1 S4A 1.66 1.99 351.87 0.35
2 S4B 1.58 1.42 310.41 0.31
06
3 S4C 1.69 2.02 601.41 0.60
S4= Muestra 4 de Agave salmiana, yema apical de hijuelo.
Figura 11. Gel de agarosa con 2 l de ADN
total por muestra, usando mini-prep CTAB.
(M) Marcador (Lambda DNA/Hind
Marker), (1) S4A a partir de 0.1 g, (2) S4B a
partir de 0.3 g, (3) S4C a partir de 0.05g,
(4) S2 CTAB-STE.
D)0)= Ensa8o con PlantDNAzolReagentA so,r# -i<#r#n'#s '#9i-os)
El ltimo ensayo se realiz usando PlantDNAzolReagent, aislando ADN
de diferentes tejidos (yema apical, tallo, raz y hoja) de A. salmiana, se incluyeron
muestras de A. tequilana y A. americana para observas diferencias (Cuadro 7,
Figura 12).
Cuadro 7. Datos del anlisis con espectrofotmetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo PlantDNAzolReagent.
Muestra Descripcin A260/280 A260/230 Conc. ng/L Conc.g/l
1 Cogollo S5 1.69 0.25 102.82 0.10
2 Pia S5 1.39 0.05 35.93 0.03
3 Raz S5 1.63 0.05 34.35 0.03
4 Penca proximal S5 1.66 0.04 15.47 0.01
5 Penca distal S5 1.67 0.02 8.62 0.00
0-
6 Cogollo T1 1.67 0.34 269.78 0.26
7 Pia T1 1.57 0.31 222.53 0.22
8 Penca proximal T1 1.75 0.10 40.87 0.04
9 Cogollo A1 1.67 0.24 182.92 0.18
10 Pia A1 1.64 0.07 51.35 0.05
11 Raz A1 1.63 0.03 16.47 0.01
12 Penca proximal A1 1.62 0.08 55.15 0.05
13 Control 2.81 0.01 4.14 0.00
SB= Muestra 5 de Agave salmiana, hijuelo de edad media.
T0= Muestra 1 de Agave tequilana, hijuelo de edad media.
A0= Muestra 1 de Agave americana, hijuelo de edad media.
Figura 12. Gel de agarosa con 2 l de ADN total por muestra, usando
PlantDNAzolReagent ms RNasa.(M) Marcador (Lambda DNA/Hind Marker),
(1) Yema apical A. salmiana, (2) Hoja A. salmiana, (3) Raz A. salmiana, (4) Hoja
proximal A. salmiana, (5) Hoja distal A. salmiana, (6) Yema apical A. tequilana,
(7) Tallo A. tequilana, (8) Hoja A. tequilana, (9) Yema apical A. americana, (10)
Yema apical A. americana, (11) Raz A. americana, (12) Hoja proximal A.
americana, (C) Control negativo.
De acuerdo a los ensayos realizados se estimaron los siguientes tiempos
(Cuadro 8) para procesar las muestras para aislamiento de ADN, segn cada
protocolo, en base a los registros de la bitcora de trabajo en laboratorio.
Cuadro 8. Estimacin del tiempo requerido para procesar las muestras para
aislamiento de ADN.
"ro'ocolo Ti#+*o #s'i+a-o *ara *roc#sar 0/
0.
+7#s'ras
PlantDNAzolReagent+RNasa 1 hora 40 min
CTAB-STE 4 horas 30 min
Miniprep CTAB 2 horas 15 min
D). E?'racci3n -# *ro'#nas #n Agave salmiana
El primer ensayo se realiz con el buffer de extraccin NET-2 sobre
muestras de A. americana y A. tequilana, los resultados de las lecturas de
espectrofotmetro fueron negativas y por lo tanto se determin que no hubo
extraccin de protenas. Al hacer el primer ensayo por precipitacin salina usando
buffer Tris-HCl y acetato de amonio (Gorinstein et al., 1999; Silos et al., 2003), las
determinaciones de cuantificacin fueron similares al buffer de extraccin NET-2
(Cuadro 9), por lo que se decidi preparar una electroforesis SDS-PAGE para
corroborar que no haba protena en las muestras. Se carg el gel con 300 l de
muestra y al concluir la electroforesis y una vez teido del gel, se logr observar
bandas en las muestras 3, 4 y 5 (Figura 13). Esto nos confirm la presencia de
protena en la muestra, aunque a muy baja concentracin.
Cuadro 9. Lectura de absorbancia por espectrofotometra de las
muestras de protena extradas usando buffer Tris-HCl y acetato
de amonio.
Vol. de muestra >.@ >1@ >=@ >B@
1 l 0 0 0 0
5 l 0 0 0.002 0
10 l 0 0 0.007 0
0/
Figura 13. Gel de poliacrilamida. (M) 5 l de
marcador, (1) 10 l de albmina, (2) 300 l Hoja
A. americana, (3) 300 l Yema apical A.
americana, (4) 300 l Quiote A. americana, (5)
300 l Hoja A. tequilana.
Nota:
Preparacin de muestras y relacin de carga para la electroforesis SDS-PAGE.
(1) 30 l de Albumina (1mg/ml) + 50 l de Buffer de protena
(2) 300 l de Hoja Agave americana4 + 200 l de Buffer de protena
(3) 300 l de Yema apical Agave americana44 + 200 l de Buffer de protena
(4) 300 l de Quiote Agave americana4*+ 200 l de Buffer de protena
(5) 300 l de Hoja Agave tequilana44 + 200 l de Buffer de protena
* Agave adulto
** Agave de edad media
Al corroborar el mtodo de extraccin de protenas de las muestras, se
00
realiz un segundo ensayo usando por precipitacin salina. En el Cuadro 10 y
Figura 14 se muestran los resultados de absorbancia por espectrofotometra de
las muestras de protena en Agave salmiana de yema apical, tallo y hoja extradas
usando buffer Tris-HCl y acetato de amonio de acuerdo a (Gorinsteinet al., 1999;
Silos et al., 2003). En la Figura 15 y 16 se observan los patrones de protenas
obtenidos a partir de diferente tejido del maguey, resultando la yema apical el
mejor tejido para el aislamiento de protenas.
Cuadro 10. Lectura de absorbancia por espectrofotometra de las
muestras de protena en Agave salmiana de yema apical, tallo y hoja,
usando para la extraccin buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
Muestra
Descripci
n
Absorbancia 5 l Absorbancia 10 l
1 Hoja P1 0.032 0.054
2 Tallo P1 0.052 0.065
3 Hoja S2 0.069 0.081
4 Tallo P2 0.053 0.096
5 Hoja P2 0.074 0.099
6 Tallo S1 0.023 0.049
7 Tallo S2 0.051 0.074
8 Hoja S3 0.011 0.036
9 Tallo S3 0.067 0.097
10 Yema S3 0.062 0.112
Las muestras 11,12,13,14,15 y 16 no se determinaron.
01

Figura 14. Curva patrn de albmina srica bovina y
ecuacin para la cuantificacin de muestras de
protena.
Cuadro 11. Cuantificacin de protena, sustituyendo valores en la ecuacin
de la curva patrn.
Muestr
a
[Protena
A] 5 l
[Protena B]
10 l
[Protena
A] g/l
[Protena B]
g/l
[Promedio
protena] (g/l)
(mg/ml)
1 1.241 5.315 0.248 0.531 /)1I
2 4.944 7.352 0.989 0.735 /)MC
3 8.093 10.315 1.619 1.031 0)11
4 5.130 13.093 1.026 1.309 0)0D
5 9.019 13.648 1.804 1.365 0)BM
6 -0.426 4.389 -0.085 0.439 /)0M
7 4.759 9.019 0.952 0.902 /)I1
8 -2.648 1.981 -0.530 0.198 6/)0D
9 7.722 13.278 1.544 1.328 0)==
10 6.796 16.056 1.359 1.606 0)=M
02
!
e
n
s
i
d
a
d

7
p
t
i
c
a

8
1
5
1

n
m
9
+rotena 8ul9
Figura 15. Gel de poliacrilamida con 15l de muestra preparada. (m) 5l
Marcador de bajo peso molecular, (1) Hoja P1, (2) Tallo P1, (3) Hoja S2, (4)
Tallo P2, (5) Hoja P2, (6) Tallo S1, (7) Tallo S2, (8) Hoja S3, (M) 5 l
Marcador de peso molecular.
Figura 16. Gel de poliacrilamida con 20l de muestra preparada. (M) 5l
Marcador de peso molecular,(9) Tallo S3, (10) Yema apical S3, (11) Yema
apical P1, (12a, 12b) Tallo L, (13) Yema apical P2, (14) Yema apical S2,
(15) Yema apical L, (16) Hoja L.
Muestras de Agave salmiana
03
S1= Muestra 1 Ejido Saldaa
S2= Muestra 1 Ejido Saldaa
S3= Muestra 1 Ejido Saldaa
P1= Muestra 1 Ejido Pendencia
P2= Muestra 1 Ejido Pendencia
L= Muestra Agave lec!uguilla
Marcador de peso molecular
>M@ Unstained Protein Molecular Weight Marker (ver Ane/os).
04
VIII) DISCUSIN
M)0 Aisla+i#n'o -# ADN -# Agave salmiana
De la relacin entre la Absorbancia a 260 nm y la Absorbancia a 280 nm, se
obtiene un cociente que refleja el estado de pureza del ADN. El valor optimo en el
cociente de A260/280 es de 1.8 aunque se considera libre de contaminantes
celulares si el valor se encuentra entre 1.7 a 2.0. Valores por debajo de 1.7,
indican contaminacin con protenas, fracciones de membranas o fenol y valores
por arriba de 2 significa que hay ARN disperso (Mller y Schweizer, 1994). Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de
carbono, pptidos, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente (Somma, 2007). Los
mtodos CTAB-STE y PlantDNAzolReagent+RNasa fueron quienes
representaron un aislamiento de mayor calidad de acuerdo a los cocientes de
pureza de mayor importancia, que son los de absorbancia A260/280. Cabe
mencionar que en el cociente de absorbancia A260/A230 solo el mtodo CTAB-
STE obtuvo valores ptimos. El mtodo mini-prep CTAB ha sido usado para aislar
y posteriormente amplificar ADN en Agave tequilana por (Abraham, 2009) pero los
resultados obtenidos en Agave salmiana no fueron favorables para garantizar la
amplificacin del material, estuvo prximo pero por debajo del valor mnimo (1.7)
en cociente A260/280, por lo que se requiere hacer algunas modificaciones al
protocolo, para evitar la presencia de protenas en la muestra.
La cantidad de ADN necesaria para una reaccin de amplificacin depende
de la complejidad y del tipo de secuencia a amplificar. Normalmente en plantas se
utilizan desde 10 ng hasta 200 ng dependiendo del rendimiento del ADN propio de
la tcnica de aislamiento y de la especie. En concentracin de ADN aislado, con
CTAB-STE se lleg a obtener hasta 660 ng a partir de 0.5 g de tejido fresco,
mientras en el mtodo mini-prep CTAB las concentracin fue muy semejante (600
05
ng) a partir de 0.05 g de tejido fresco, lo que sugiere que a partir de cantidades
menores a 0.1 g se obtienen mayores concentraciones.
En el ltimo ensayo con PlantDNAzolReagent+RNasa se realiz el
aislamiento sobre diferentes tipos de tejido a partir de 0.3 g y se observa que las
mayores concentraciones se obtienen usando la yema apical, aun en otras
especies de agave.
En el gel ensayo con CTAB-STE y PlantDNAzolReagent+RNasa se
comprob que el uso de material refrigerado (4C) no garantiza la integridad y
cantidad del ADN por aislar, por lo que se recomienda usar tejido fresco o
almacenando muestras en nitrgeno lquido.
M). E?'racci3n -# *ro'#nas -# Agave salmiana
Con el mtodo por precipitacin salina usando buffer Tris-HCL y acetato de
amonio, adaptando la metodologa en base a (Gorinstein et al., 1999; Silos et al.,
2003) logr la extraccin de protenas, comprobadas con la cuantificacin y
comportamiento electrofortico. Bajo el mismo tratamiento de las muestras, es
evidente que la mayor concentracin y posible diversidad de protenas del agave
se encontraron en la yema apical, que es el punto de crecimiento, en menor
cantidad en el tejido del tallo y fueron poco visibles en penca en la mayora de las
muestras al realizar la electroforesis, aunque si hubo medicin de concentracin.
En el gel de poliacrilamida, se observa que predominan dos bandas de
protena, entre los 25 kDa y otra aproximadamente los 40 kDa, siendo visibles en
los tres tipos de tejido muestreado. Esta observacin puede indicar que se tratan
de protenas de funcin estructural.
16
IN) CONCUSIONES
- El mtodo de eleccin para el aislamiento de ADN es el de CTAB-STE, que a
pesar de ser el que consume mayor tiempo en procesar las muestras, garantiza
una buena amplificacin, adems de que se obtienen mayores concentraciones de
ADN. Seguido del producto comercial PlantDNAzolReagent agregando RNasa,
que reduce el tiempo de tratamiento de las muestras con resultados cercanos al
optimo en A260/280 que es la de mayor relevancia.
- Se considera adecuado extraer protenas en Agave salmiana por el mtodo
adaptado de (Gorinsteinet al., 1999; Silos et al., 2003) por precipitacin salina
usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio, al observar favorables los resultados
obtenidos.
I)0 R#co+#n-acion#s
- La yema apical es el tejido recomendado para tomar la muestra para realizar el
aislamiento de ADN, seguido la hoja donde se lleg a obtener de calidad solo que
a menores concentraciones.
- El tejido refrigerado no garantiza ADN de calidad. Es preferible siempre usar
tejido fresco para iniciar un aislamiento de ADN, o tomar pequeas muestras de
tejido fresco contenidas en papel aluminio marcado y consrvalas en nitrgeno
lquido.
- Es importante tomar en cuenta que con mayor cantidad de tejido al iniciar el
aislamiento no precisamente se obtendr mayor concentracin de ADN. Por lo que
recomiendo realizar el aislamiento partir de muestras prximas a 0.1 g de tejido.
- En la metodologa para extraer protenas por precipitacin salina, se debe
reconsiderar el paso anterior al almacenamiento de las muestras, en el que se uso
1-
un Rota-evaporador a 45 C para concentrar. Debido a la posible presencia de
proteasas que a esta temperatura pudiesen ser activas y degradar algunas
protenas. Recomiendo liofilizar como lo indica (Gorinstein et al., 1999; Silos et al.,
2003) probar el uso de dispositivos de filtracin por centrifugacin con membranas
de celulosa o algn otro en el que se reduzca esta actividad enzimtica.
- Por la baja cantidad de protenas observadas en muestras de la hoja, se
recomienda concentrar ms las muestras en posteriores trabajos y visualizarlas
mejor en el gel.
1.
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13
NI) ANENOS
Reactivos para protocolo de aislamiento de ADN con CTAB-STE
(Esterilizar todas las soluciones)
Buffer de extraccin CTAB
Tris-HCl 100 mM pH8
NaCl 1.5 M
EDTA 20 mM pH8
CTAB 4%
PVP40 4%
Ac. Ascrbico 0.1%
DECA 0.1%
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento
de usar el buffer)
Buffer de extraccin ST
Tris-HCl 100 mM pH8
EDTA 50 mM pH8
NaCl 100mM
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de
usar el buffer)
SDS 20%
Acetato de potasio 5 M
Acetato de sodio 3 M
Tam!n T
10mL 1M Tris HCl pH 8.02 mL de EDTA 0,5 M Aumentar el volumen total de 1 L
con agua bidestilada
14
" # Tris $Cl !$ M)/
121,1 g de Tris Disolver en 700 mL de H2O. Llevar el pH hasta 8.0 mediante la
adicin de HCl concentrado (necesitar alrededor de 50 ml). Aumentar el volumen
total de 1 L con agua bidestilada
DTA %,& #
186,12g de EDTA Aadir 700 mL de H2O 16-18 g de perlitas de NaOH Ajustar el
pH a 8.0 agregando perlitas de NaOH, el EDTA no se disolver hasta que el pH
est cerca de 8.0 Aumentar el volumen total de 1 L con agua bidestilada
& # NaCl
292,2g de NaCl 700 mL de H2O Aadir NaCl poco a poco o nunca entrar en
solucin y llevar a 1 L agua bidestilada Protocolo original de mtodo con
PlantDNAzolReagent
15
FicHa T;cnica -#l R#ac'i5o "lan'DNA&olR#a$#n' >INVITROGEN( USA@
26
2-
Buffer TA &%'( Disolver 242 g de Tris base (40 mM) y 37.2 g de EDTA-Na2H2O
(2mM) en 900 ml de agua destilada. Adicionar 57.1 ml de acido actico glacial y
ajustar el volumen final con agua a 1 litro. Tomar 2 mL de este buffer 50X y aforar
en 100ml de agua para hacer TAE 1X. Almacenar a temperatura ambiente o a
4C.
Buffer de carga DNA
Buffer de carga 6X (Azul de bromofenol-Xilen-cianol)
0.05% (w/v) Azul de bromofenol
0.05% (w/v) Xilencianol
50% (v/v) Glicerol
Buffer de xtraccin NT)*
Mesclar 0.87 g de NaCl (150mM), 10 ml de Tris-HCl 500 mM pH 7.4 y 500 L de
Nonidet NP-40 gepal (0.5%). Aforar a 100 ml con agua destilada y esterilizar.
Almacenar a 4C.
Sol7ci3n -# Tris6Cl B// +M( *% D)=
Pesar 6.05 g de Tris base (0.5 M) y disolver en 50 ml de agua, luego ajustar a pH
de 7.4 con cido clorhdrico concentrado y aforar a 100 ml con agua destilada.
Almacenar a 4 C.
Solucin stoc+ Bradford,
Mezclar 10 ml de etanol al 95 %, 20 ml de cido fosfrico al 88 % y 35 mg (.035 g)
de azul brillante de Coomassie G-250. Almacenar en frasco mbar. Esta solucin
es estable indefinidamente a temperatura ambiente.
Solucin de tra-a.o Bradford
Mezclar 42.5 ml de agua destilada, 1.5 ml de etanol al 95 %, 3.0 ml de cido
fosfrico al 88 % y 3.0 ml de la solucin stock Bradford. Despus filtrar en papel
filtro (Whatman No.1) y almacenar a 4 C en un frasco mbar. Estable por un par
2.
de meses, luego debe se filtrada nuevamente, para su uso.
C/lculos !ara determinar concentracin de !rote0nas res!ecto a la curva
!atrn,
Hacer los siguientes clculos utilizando la ecuacin de una recta. Por ejemplo, si la
densidad ptica fue de 0.209, este valor hay que sustituirlo en la siguiente formula:
Y= a+bx; despejando nos quedara que x= y-a/b; luego sustituyendo los valores
obtenidos a partir de una regresin lineal de los valores de la curva patrn por el
mtodo de mnimos cuadrados, tendramos 0.209-0.1692/0.01474 = 2.7, luego
dividir este resultado entre la dilucin si es que la hay. Ej: 2.7/5 que son los
microlitros de la muestra problema, nos dara 0.54 g de protena por microlitro, y
por ltimo se calcula la concentracin total de protena por mililitro de muestra, la
cual para este caso sera de 540 g/ml = 0.54 mg/ml.
2/
Soluciones de electroforesis !ara se!aracin de !rote0nas
Cuadro 12. Cantidades necesarias, para realizar un gel separador a diferentes
concentraciones de poliacrilamida.
"orci#n'o -#l $#l

=)B O C O D O M O I O 0/ O 00 O 0. O
Acrila+i-a
(X/3=ml)
1.50 ml 2.00
ml
2.35 ml 2.70 ml 3.00 ml 3.35
ml
3.70
ml
4.00
ml
Tris6Cl 0)B M *%
M)M
2.50 ml 2.50
ml
2.50 ml 2.50 ml 2.50 ml 2.50
ml
2.50
ml
2.50
ml
A$7a (7.5-x/3=ml) 5.80 ml 5.50
ml
5.15 ml 4.80 ml 4.50 ml 4.15
ml
3.80
ml
3.50
ml
SDS al 0/ O 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l 200 l
"SA al 0/ O 50 l 50 l 60 l 60 l 65 l 65 l 70 l 70 l
T#+#- 6 l 7 l 8 l 8 l 9 l 9 l 10 l 10 l
Modificado de Laemmli U. K., 1970.
Sol7ci3n -# acrila+i-a >1/2/)M O@
Disolver 30 g de acrilamida, ms 0.8 g de bis-acrilamida y aforar a 100 ml con
agua destilada. Almacenar a 4 C en frasco mbar. Usar guantes y cubrebocas, ya
que la acrilamida es neurotxica en polvo solucin.
Sol7ci3n -# Tris6Cl 0)B M( *% M)M
Pesar 18.2 g de Tris base y disolver en 60 ml de agua. Ajustar a pH 8.8 con HCl
concentrado. Aforar a 100 ml con agua destilada y almacenar a 4 C.
Sol7ci3n -# Tris6Cl /)B M( *% C)M
Pesar 6.05 g de Tris base y disolver en 40 ml de agua. Ajustar a pH 6.8 con cido
clorhdrico concentrado. Aforar a 100 ml con agua y almacenar a 4 C.
SDS al 0/ O
Disolver 10 g del detergente duodecil sulfato de sodio en 90 ml de agua destilada.
Calentar a 68C para disolver bien y ajustar el pH a 7.2 con HCl. Aforar a 100 ml
con agua destilada y almacenar a temperatura ambiente.
"SA al 0/ O
Pesar 0.5 g de persulfato de amonio y disolver en 5 ml de agua. Almacenar
20
alicuotas de 500 microlitros en tubos de 1.5 mL cubiertos con papel aluminio para
proteger de la luz y almacenar a -20 C. Dejar un vial a 4 C para su uso.
Buffer de corrida electroforesis "% '
Disolver 30 g de tris base, ms 144 g de glicina en una cantidad de agua
destilada. Aforar a 1 litro y almacenar a temperatura ambiente.
B7<<#r -# corri-a 3 #l#c'ro<or#sis 0 N
Mezclar 100 ml de buffer de corrida 10 X, ms 900 ml de agua destilada y ms 1 g
de SDS. Almacenar a temperatura ambiente. Este buffer se puede reutilizar hasta
5 veces.
Buffer de muestra !ara !rote0nas
Para preparar 20 ml de buffer adicionar 2.5 ml de solucin de Tris-Cl 0.5 M, pH 6.8
(0.0625 M), 4.0 ml de SDS al 10 % (2 %), 1.0 ml de Bis-mercaptoetanol (5 %), 8.0
ml de glicerol (10 %), 20 l de azul de bromofenol al 1 % (0.001 %) y 4.5 ml de
agua destilada. Mezclar bien y hacer alicuotas de 1 ml. Almacenar a -20C.
Solucin fi.adora !ara tincin de Coomassie
Mezclar 125 ml de metanol isopropanol (25 %), con 50 ml de cido actico
glacial (10 %) y aforar a 500 ml con agua destilada. Almacenar indefinidamente a
temperatura ambiente.
Solucin de tincin r/!ida de azul de Coomassie
Mezclar 0.06 g de azul brillante de Coomassie G G-250 (0.006 %) con 100 ml de
cido actico glacial (10 %) y aforar a 1 litro con agua destilada. Almacenar
indefinidamente a temperatura ambiente en frasco mbar.
Solucin deste1idora de /cido ac2tico al "% 3
Mezclar 50 ml de cido actico (10 %) con 450 ml de agua destilada. Almacenar
21
indefinidamente a temperatura ambiente.
Pre!aracin de muestras de !rote0na(
Se tomaron 120 uL de muestra en tubos de 1.5 mL y se agregaron 24 uL de Buffer
de carga PAGE-SDS 6X, se pusieron en un bao de agua hirviendo durante 5
min.
Buffer de carga PA4)SDS 5'
2 mL Glicerol
2 mL SDS 10%
0.25 mg Azul de Bromofenol
2.5 mL Buffer 4X del gel concentrador
0.5 mL b-mercaptoetanol
Aforar con agua destilada a 10 mL.
22
Marca-or#s
Para protenas
Para ADN
23
Cuadro 13. Lecturas del espectrofotmetro UV (Q 5000 de Quawell por ensayo.
PlantDNAzolReagent!
*eport
!ate: 6-;-.;.6-6 -6:15:16 a.m.
<o. =ample I!
I!>
?
=ampl
e @%pe EC =A
=A
As
.26
As
.46
As
.26;.4
6
.26;./
6
Concentrati
on
- Agua - ds!<A16 ./6
6.63
4
6.6.
-
6.6.
3 6.333 6..25 -.61
. BuBBer @E - ds!<A 16 ./6
6.61
1
6.6-
0
6.6.
1 6.115 6..10 6.3
/ =- !nazol - ds!<A 16 ./6
0.-.
0
6.0/
0
6..0
5 -.30. 6.-61 .-.255
0 =- !nazol . ds!<A 16 ./6
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3
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2
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6./6
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6.65
-
>
6.60
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4 -..45 6.1/4 >..01-
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0./.
0
5.55
3 1.21 -.325 ../-- 055.405
0 =- C@AB . ds!<A 16 ./6
0.21
2
-6.-
5.
1.40
2 -.30/ ..-45 165.2
1 =- C@AB / ds!<A 16 ./6
0.0/
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-6./
1 2.6- -.3.. ../// 1-3.055
2 =- C@AB 0 ds!<A 16 ./6
0.01
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-6.0
-.
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3 -.3.- ..//3 1.6.2
3 =- C@AB 1 ds!<A 16 ./6
0.10
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6./1
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6.60
4
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6.66
-
6.6-
- >6.65- >6.6.- >6.61-
/. BuBBer @E . ds!<A 16 ./6
>
6.6-
4 6.6- 6.6. 6.1 >6.112 6.1
// =/ !<Azol - ds!<A 16 ./6
1..3
.
6.1.
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* Lecturas nulas
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