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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

FRANCISCO GARCA SALINAS

UNIDAD ACADMICA DE AGRONOMA

EFECTO DE TEMPERATURAS ALTAS EN LA EXPRESIN DE Hsp70 DE EMBRIONES DE FRIJOL

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:

INGENIERO AGRNOMO
PRESENTA:

GRACIELA GONZLEZ BEZ

ZACATECAS, ZAC., NOVIEMBRE 2006.

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

FRANCISCO GARCA SALINAS

UNIDAD ACADMICA DE AGRONOMA EFECTO DE TEMPERATURAS ALTAS EN LA EXPRESIN DE Hsp70 DE EMBRIONES DE FRIJOL

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:

INGENIERO AGRNOMO
PRESENTA:

GRACIELA GONZLEZ BEZ

ASESORES:

M. en C. EDGAR LEN ESPARZA IBARRA Dr. en C. MIGUEL ANGEL SALAS LUVANO Dr. en C. FRANCISCO AVIER CABRAL ARELLANO
ZACATECAS, ZAC., NOVIEMBRE 2006.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Franc !c" #a$ %r Ca&ral Ar%llan", '"r la ( r%cc )n * a'"*" +,% -% &r n() (,ran.% la r%al /ac )n (% %!.% .ra&a0". Al M. %n C. E(1ar L%)n E!'ar/a I&arra, '"r !, 1ran a*,(a, a!%!"r2a * c"la&"rac )n a'"r.a("! (,ran.% %l (%!arr"ll" (% %!.% .ra&a0". Al Dr. M 1,%l An1%l Sala! L,3$an", '"r %l a'"*" &r n(a(", '"r !,! $al "!"! c"-%n.ar "! * '"r !, c""'%rac )n %n la r%$ ! )n (%l 'r%!%n.% .ra&a0". A la M. %n C. Mar an(r%a Ca&ral Enc !", '"r !, a'"*" 'r%!.a(" %n la r%$ ! )n (% %!.% .ra&a0". Al M. %n C. #"!3 4a.r"c n " G)-%/ D%l1a(", '"r la r%$ ! )n * a'"*" %n la 'r%!%n.% .%! !. A M. %n C. Man,%la C56$%/ C5a2r%/, '"r la a*,(a 'r%!.a(a %n %l la&"ra."r ". A la 7n (a( Aca(3- ca (% B "l"12a E8'%r -%n.al, a!2 c"-" a la 7n (a( Aca(3- ca (% A1r"n"-2a (% la 7n $%r! (a( A,.)n"-a (% Zaca.%ca! '"r !, a'"*" n!. .,c "nal.

DEDICATORIAS

A D "!9 4"r c"nc%(%r-% %l ("n (% la $ (a. A - E!'"!"9 #"!3 Al:r%(", '"r !, 1ran a'"*", c"-'r%n! )n, 'ac %nc a * -". $ac )n nc"n( c "nal %n ."(" l" +,% 5% %-'r%n( (".

A - ! ; 0"!9 C3!ar A(r 6n, #a$ %r Al%0an(r" * Er c<, c"n ."(" - a-"r, '"r !, -". $ac )n, '"r+,% !"n - :"r.al%/a * %!.an a - la(" %n ."(" -"-%n.".

A la -%-"r a (% - ! 4a(r%!9 A'"l"n " * #,an .a => En r%c,%r(" c"n a-"r * car ?", '"r !,! !acr : c "! * %!:,%r/"!. Grac a!.

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FINANCIAMIENTO

El presente trabajo de tesis se realiz en el Laboratorio de Biologa Molecular de Plantas de la Unidad Acadmica de Biologa

Experimental de la Universidad Autnoma de "inanciamiento del pro#ecto de FUNDACIN

acatecas! bajo el PRODUCE No.

070/FP /!00"# UA $ 0%0&&"' ( DGIP $ UA No. !00" ) &'%%$

I. INTRODUCCIN
En Mxico! existen %%& millones de 'ect(reas potencialmente agrcolas # de las cuales )* millones son laborables$ +e esta super"icie! slo ,$- millones de 'ect(reas son de riego # %-$) millones son de temporal. # de stas! %/$& millones son tierras laborables! de las cuales unos ,$/ millones reciben una precipitacin menor a los ,// mm anuales. &$0 millones de 'ect(reas son tierras improductivas! principalmente por su aridez 1Lpez! %22%3$ +ada la importancia 4ue tiene el pas con respecto a una gran cantidad de suelos 4ue son de temporal! es indispensable contar con cultivos 4ue sean tolerantes a estas condiciones clim(ticas predominantes$ +e esta manera! se tendra una ma#or produccin en el campo! mejorando las posibilidades del agricultor # su "amilia de sobrevivir en sus lugares de origen$ En este sentido! la investigacin biotecnolgica de plantas! o"rece la oportunidad de encontrar mejoras en los cultivos a "avor del campesino 1Lindse# # 5ones! %2-23$

El "rijol es considerado junto con el maz! como uno de los elementos m(s importantes en la dieta de la ma#ora de los mexicanos! su cultivo data desde 'ace 0!/// a6os a$ 7$ 18idalgo # +ebouc9! %2-03$ Mxico es uno de los pases con ma#or consumo! #a 4ue cultiva una super"icie de ) millones de 'ect(reas principalmente en el ciclo primavera:verano. obteniendo una produccin nacional de %! /;)! 2&* toneladas en el a6o agrcola )///<)//%$ En general! la ma#ora de los estados siembran "rijol! # las principales zonas productoras son= acatecas con */,! /-%! +urango con %%%! ;2)! >inaloa con -0! 0,%! 7'i'ua'ua con -*! ;-- # 7'iapas con &%! )2, toneladas 1?@EA?! )//)3$

acatecas es el principal productor 1con */B de la produccin nacional3 en di"erentes variedades adaptadas a la regin # de consumo nacional como el= @egro acatecas! Ba#o acatecas # Clor de Ma#o entre otros 1>AAAD! %22;. >ECEA! %22; # Ertiz! %22-3$ Estas cantidades de produccin! representan la demanda de

un alto consumo generalizado entre la poblacin! produccin 4ue se ve a"ectada por la carencia de recursos econmicos disponibles por parte de los ejidatarios. as como tambin de los apo#os "inancieros por parte del gobierno$ Adem(s intervienen otros "actores 4ue in"lu#en en 4ue la produccin promedio sea baja! # esto es debido= %3 a 4ue se cultiva principalmente en terrenos de temporal. )3 a 4ue no se usan variedades mejoradas! *3 al uso incorrecto de "ertilizantes. ,3 a la presencia de plagas # en"ermedades # al inadecuado control de stas. 03 a "actores ambientales importantes como la temperatura! #a 4ue puede causar estrs en pocos minutos a di"erencia de la "alta de agua del suelo! 4ue toma das o semanas en actuar como estresor # a los nutrientes minerales! 4ue tardan 'asta meses en ser estresantes 17sermel# # La9'otia! %22-3$

El estrs ambiental! implica la respuesta de un sistema biolgico "rente a la exposicin a condiciones "sicas # 4umicas extremas en el medio ambiente! ante la cual! dic'o sistema debe ajustarse para llevar a cabo sus "unciones de manera normal$ La temperatura del aire! la radiacin solar indirecta # una pobre nutricin! son los principales "actores 4ue a"ectan el balance energtico de los sistemas biolgicos en las zonas (ridas 1>ilani9ove! %2-&3$ La radiacin solar es el e"ecto de la energa radiante del sol # la radiacin trmica del medio ambiente circundante 17#mbalu9 # 7'ristison! %22/3! # es el principal "actor 4ue causa estrs calrico e incrementa la ganancia de calor! tanto directo como indirecto 1>'earer et al$! %22%3$ +urante las 'oras de luz del da! casi todo el calor obtenido del medio directo o indirectamente del sol! puede reducir la e"iciencia reproductiva en un nic'o! # esto se debe probablemente a la energa gastada en liberar al organismo del exceso de la carga calrica! mediante un incremento en la respiracin # otras actividades relacionadas 4ue alteran el metabolismo de un ser vivo 1Cu4ua#! %2-%3$

El estrs calrico se de"ine como cual4uier combinacin de condiciones ambientales! 4ue causan 4ue la temperatura de la zona termoneutral de los organismos sea superior$ >in embargo! es di"cil especi"icar cu(l es la exacta combinacin de condiciones ambientales para 4ue se origine el estrs calrico para 2

cual4uier tipo de organismos! #a 4ue existen varias di"erencias entre los mismos 1Bu""ington et al$! %2-%3$ Fambin se 'a se6alado 4ue la importancia de la variacin en la radiacin solar para producir respuestas "isiolgicas! es comparable bajo condiciones de campo con las variaciones en la temperatura del aire! # considerablemente ma#or 4ue la de presin de vapor # la velocidad de los vientos 18arris et al$! %2;/3! existiendo escasa in"ormacin sobre la carga calrica extra de la radiacin solar sobre el balance energtico! el consumo de nutrientes # el metabolismo 'drico de un organismo 1Mac"arlane et al$!%2;; # >ilani9ove! %2-&3$ Por otra parte! las zonas semi(ridas! se caracterizan por condiciones estacionales extremas! con lluvias relativamente escasas # perodos mu# prolongados de se4ua$ Las "luctuaciones diarias # estacionales con respecto a la temperatura son mu# amplias casi todo el a6o! con una intensa radiacin solar por la atms"era seca # los cielos despejados 1>'arma! %22%3$

7on respecto a la respuesta celular generada por las agresiones ambientales! stas propician el replegado inapropiado de las protenas! lo cual es mu# peligroso para la clula$ Por m(s de */ a6os 'a sido reconocido 4ue la lenta elevacin de la temperatura! puede inducir la respuesta llamada de c'o4ue calrico en todas las clulas 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ Esta respuesta de estrs! se caracteriza por un r(pido aumento en la sntesis de un grupo de polipptidos llamados protenas de c'o4ue trmico calrico 8sp 18eat s'oc9 proteins3$ Mismas 4ue se clasi"ican en cinco "amilias con"orme al peso molecular aproximado con respecto a sus di"erentes miembros= 8sp%//! 8sp2/! 8sp&/! 8sp;/! 8spGs pe4ue6as de %0 a ,/ 9ilodaltones$ Por a6os! las "unciones de stas protenas "ueron desconocidas! pero estudios recientes las 'an de"inido como los compuestos moleculares centrales en la ma4uinaria del plegado de las protenas 18artl! %22;3$ Muc'as de las 8sp est(n asociadas a c'aperonas! las cuales son expresadas constitutivamente en todas las clulas. donde se expresan genes para las "amilias de las 8sp con distintos grados de variacin respecto a la secuencia # a sus patrones de expresin$ Adem(s! participan en la sntesis de protenas! en la traduccin e interaccin protena< protena! en la degradacin de protenas! en el transporte # en la termotolerancia$

As! la respuesta al estrs es la adaptacin evolutiva para corregir r(pidamente el replegado e4uivocado de las protenas # restaurar el plegado ambiental normal de la clula 1Pa'l et al$! %22&3$

En trminos generales! las 8sp "uncionan previniendo la acumulacin de protenas da6adas por el estrs en dos "ormas= %3 algunas participan como c'aperonas moleculares! promoviendo el adecuado redoblamiento de las protenas # evitando su desnaturalizacin. # )3 es 4ue "acilitan la degradacin de protenas anormales$ Esto conlleva a detallar el conocimiento bio4umico # molecular de la "uncin de las 8sp necesario para integrarse con un entendimiento "isiolgico Hnico de cual4uier organismo en particular! #a 4ue estos responden a di"erentes niveles # tipos de estrs empleando di"erentes 8sp 1Parsell # Lind4uist! %22,3$

>e tienen antecedentes en el laboratorio! de 4ue existe 'omologa entre las 8sp expresadas en mam"eros # las de "rijol! #a 4ue al utilizar anticuerpos de ratn cu#o blanco son las 8sp! se pueden localizar # puri"icar los componentes protecos de las 8sp de "rijol$ 7abe mencionar 4ue no se encuentra estudio alguno reportado sobre estas protenas en embriones de "rijol$ Para la realizacin de este trabajo! se consider relevante estudiar la protena de c'o4ue trmico 8sp&/. en virtud de su disponibilidad a interactuar con polipptidos 4ue no se encuentran plegados en su estado natural! # 4ue desempe6an una "uncin vital plegando protenas tanto en el estado normal! como en el de estrs calrico dentro una clula. siendo la "amilia m(s conservada de las 8sp entre los organismos 1Cr#dman! )//%3$

Por otro lado! la caracterizacin de las variedades de "rijol se 'ace de manera tradicional! a travs de una descripcin mor"olgica # agronmica 1"enotpica3 de las plantas cultivadas$ >in embargo! desde el punto de vista bio4umico<molecular! es interesante explorar metodologas 4ue permitan obtener in"ormacin b(sica! 4ue pueda ser utilizada para entender los mecanismos de adaptacin e inadaptacin de las variedades cultivadas en la regin! a las cuales se les re4uiera incorporar alguna caracterstica especial para alterar su capacidad productiva! as como C

seleccionar las variedades de "rijol! 4ue mejor se adapten a las condiciones ambientales de la regin$

El modelo universal para el estudio molecular de plantas es la Arabidopsis taliana 1considerada maleza en Europa3! cu#o punto de atraccin 'a sido su pe4ue6o genoma 1%0 cromosomas3 # su ciclo biolgico de corta duracin$ >in embargo! existen otras especies de alto inters econmico como el maz! trigo # cebada! donde se aplican grandes cantidades de dinero para su investigacin a nivel mundial en mejoramiento gentico$ 7abe mencionar! 4ue no todos los estudios de modi"icacin gentica basados en modelos se6alados para la caracterizacin de genes # de su control! se pueden extrapolar a otras especies! ni en el caso de Arabidopsis! aun cuando sta es una planta dicotilednea al igual 4ue el "rijol 1CujiIara et al$! )//)3$

Las 8sp se expresan! precediendo las posibilidades de aclimatacin! proteccin # supervivencia$ +e a' la relevancia de estudiar el comportamiento de las mismas en la germinacin! el cual es un evento crtico en la agricultura! siendo Htil desde el punto de vista de la produccin # del cultivo del "rijol # al mismo tiempo para obtener in"ormacin b(sica de su "isiologa celular # molecular$ El conocer algunos aspectos moleculares de los eventos bio4umicos involucrados en el proceso de germinacin! permitira contar con la in"ormacin b(sica sobre los mecanismos de adaptacin de la planta a las condiciones climatolgicas de la regin "rijolera del Estado$ >i bien este conocimiento de momento no impacta directamente sobre los procesos productivos! si genera in"ormacin b(sica del comportamiento molecular de las protenas inducibles por estrs ambiental e in"ormacin 4ue expli4ue algunos aspectos "isilogicos del ciclo de vida del "rijol$ 7onocer la din(mica de la expresin de las 8sp inducibles por calor! podra ser tambin de gran utilidad en un "uturo! #a 4ue se podra utilizar como un indicador de adaptacin al estrs ambiental$ Adem(s! permitir( extrapolar detalles del comportamiento molecular del "rijol sobre la "uncin espec"ica de estas protenas! comparando con las #a

existentes en otras especies productoras de grano #Jo modelos biolgicos 1Miern#9! %2223$

La propuesta de un modelo alternativo basado en algunas de las caractersticas relevantes del "rijol como= variedades de amplia utilizacin en la regin! semillas relativamente grandes! gran disponibilidad de material gentico! conservacin de las caractersticas de la especie! embriones con alto porcentaje de germinacin! es en s! una propuesta original$

Los embriones de "rijol permiten contar con un sistema estable de molculas! las cuales pueden ser puri"icadas para su estudio # utilizacin! #a 4ue podran ser monitoreadas in vivo e in vitro a travs del proceso de germinacin o durante el ciclo biolgico de la planta$ Ensa#os preliminares 'an demostrado 4ue es viable la utilizacin de este modelo biolgico! puesto 4ue permite la manipulacin molecular a un bajo costo si se compara! por ejemplo! con el costo del cultivo de clulas animales o vegetales! el cultivo de protoplastos o el del cultivo de tejidos vegetales$ Adem(s! existe una gran cantidad disponible de este material biolgico para su caracterizacin bio4umico:molecular! con lo cual se estudiaran los productos de los genes expresados en el ambiente natural de las plantas # se aportaran elementos novedosos al conocimiento de la din(mica molecular de los genes 1genmica3 # sus productos 1protemica3 para su mejor entendimiento$

7on base a lo anterior # ante los escasos estudios sobre las protenas de c'o4ue calrico 18sp&/3 en "rijol 1Phaseolus vulgaris L3! el objetivo general! objetivos particulares e 'iptesis. "ueron los siguientes=

O*+,-./o 0,1,234 +eterminar la expresin del AD@m # de la protena 8sp&/ en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrs calrico$

O*+,-./os p32-.56432,s %$ 7onocer la relacin de un rango de temperatura de )0K7 a ,/K7! con la expresin del AD@m # de la protena de c'o4ue trmico 8sp&/! en embriones de Phaseolus vulgaris en el proceso inicial de la germinacin$ )$ 7uanti"icar los niveles de la expresin in vitro! del AD@m # de la protena de c'o4ue trmico en embriones germinados de Phaseolus vulgaris! sometidos a estrs calrico$

H.p7-,s.s

El AD@m # la protena 8sp&/! muestran un patrn de expresin di"erencial en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrs trmico$

II. RE8ISIN DE LITERATURA

!.9 C3235-,2:s-.53s 0,1,234,s ;,4 <2.+o4 =Phaseolus vulgaris L.> El "rijol es un cultivo de gran importancia tanto por la produccin nacional # regional. como por el consumo generalizado del mismo entre la poblacin$ Es una planta anual! 'erb(cea intensamente cultivada desde las zonas tropicales 'asta las templadas$ >e le conoce con di"erentes nombres= poroto! 'aricot! caraota! juda! alubia # 'abic'uela$ El "rijol pertenece a la "amilia Leguminoceae # es una semilla "ormada por una cubierta! dos cotiledones # un embrin 1Cigura %3! el cual esta "ormado por las estructuras de la radcula! epictilo! plHmula e 'ipoctilo 18idalgo # +ebouc9! %2-03$

Cigura %$ 7orte transversal de una semilla de "rijol$ 8idalgo # +ebouc9! %2-0 A nivel mundial se conocen %-/ especies del gnero Phaseolus! de las cuales aproximadamente %); son originarias del continente Americano. 0, del sur de Asia # oriente de A"rica. ) de Australia # tan slo % de Europa$ En Mxico! se 'an identi"icado m(s de ;& especies del gnero Phaseolus! de stas slo cuatro se cultivan con el propsito de usarse en la alimentacin 'umana= P. coccineus! P$

lunatus! P$ acutifolius # P$ vulgaris$ >iendo sta Hltima la m(s utilizada! es originaria del (rea comprendida por Mxico<Auatemala 1Lpez! %22%3$ El "rijol es cultivado con el "in de cosec'ar grano seco 1contiene alrededor de )0B de protena3 # en menor proporcin para la produccin de vaina! es decir! "rijol ejotero! el cual puede consumirse "resco! enlatado o congelado$ La semilla # vainas se usan como alimento! en la produccin de "orraje para el ganado # en el mejoramiento de suelos como abono$ Adem(s! es rico en lisina pero de"iciente en los amino(cidos azu"rados= metionina! cistina # tript"ano. por lo 4ue una dieta adecuada en amino(cidos esenciales se logra al combinar "rijol con cereales como maz! arroz # otros 1Ertiz! %22-3$

!.! E4 p2o5,so ;, 0,2?.135.71);o2?315.3 Las semillas son un componente vital de la dieta en el mundo! siendo los granos de cereales los 4ue comprenden aproximadamente el 2/B de todas la semillas cultivadas. 4ue contribu#en con la mitad de la ingesta de energa per capita$ L no es de sorprenderse! de 4ue la biologa de las semillas es una de las (reas de la "isiologa de las plantas con ma#or investigacin$ Pero! a pesar de la gran cantidad de publicaciones sobre germinacin # dormancia! aHn no se pueden responder dos cuestiones "undamentales= %3 M7mo emerge el embrin de la semilla para una completa germinacinN # )3 M7mo la emergencia del embrin es blo4ueda! de tal manera 4ue las semillas pueden mantenerse en estado de dormanciaN 1BeIle#! %22&3$

Una semilla viable de "rijol! germina a los pocos minutos de 'aber embebido agua! siempre # cuando la temperatura sea la apropiada # exista adem(s un suministro adecuado de oxgeno$ La germinacin del "rijol es epgea 1Cigura )3! donde los cotiledones salen a la super"icie sostenidos por el 'ipoctilo 4ue se alarga # se endereza por encima del suelo durante el desarrollo de la planta$

Cigura )$ Aerminacin epgea de una semilla de "rijol$ BeIle# # Blac9! %22,$ La planta de "rijol 1Cigura *3! "lorece cuando cambia de la "ase vegetativa a la "ase reproductiva! donde aparecen in"lorescencias 4ue al madurar en vainas! stas se abren # dejan escapar las semillas propag(ndose as por de'iscencia$

Cigura *$ Planta de "rijol$ Cuente= BeIle# # Blac9! %22,$

A0

En cuanto a lo 4ue respecta a la germinacin! se sabe 4ue sta incorpora varios eventos 4ue comienzan con la imbibicin de agua por una semilla seca # 4uiescente! # termina con la elongacin de los ejes embrionarios 1BeIle# # Blac9! %22,3$ El signo visible de 4ue la germinacin se llev a cabo! es la penetracin de las estructuras 4ue rodean el embrin por la radcula$ Los eventos subsecuentes inclu#endo la movilizacin de las reservas almacenadas! se asocia con el crecimiento # desarrollo de la pl(ntula$ Fodos los eventos metablicos # celulares 4ue ocurren 'asta antes de la germinacin en semillas no dormantes! ocurren en las semillas en dormancia inclu#endo la imbibicin! pero stas Hltimas "allan en la elongacin de los ejes embrionarios$ Por otro lado! el "enmeno de dormancia sucede en la Hltima etapa de la embriognesis! cuando la semilla est( totalmente "ormada # madura! es decir! des'idratada # con capacidad para sobrevivir de manera independiente de la planta 1Bentsin9 # Ooornnee"! )//)3$

!.& I?*.*.5.71 ( 2,.1.5.o ;,4 ?,-3*o4.s?o ,1 43 0,2?.135.71 La toma de agua por la semilla madura 1seca3! tiene tres "ases= la "ase ? en la cual 'a# un ingreso inicial r(pido del agua! seguido de una "ase de meseta 1"ase ??3. en tanto 4ue el incremento posterior 1"ase ???3 slo ocurre despus de 4ue la germinacin se 'a completado$ La toma de agua durante el inicio de la "ase ?! resulta en perturbaciones estructurales particularmente de membranas! 4ue permiten la salida de solutos # metabolitos de bajo peso molecular$ Esto es sintom(tico de las membranas bilipdicas en "ase de gel en la maduracin # des'idratacin! a la "ase normal de 'idratacin # "ase l4uida cristalina 17roIe # 7roIe! %22)3$ +entro de un tiempo corto de re'idratacin las membranas cortan la "uga de solutos$ 7abe mencionar 4ue a nivel molecular aun no se conoce como se reparan las membranas plasm(ticas # las de organelos 1>andoval et al$! %2203$

Bajo la imbibicin! las semillas secas # 4uiescentes rapidamente reinician la actividad metablica$ Las estructuras # enzimas necesarias para reiniciar tal

AA

actividad! se encuentran en la semilla seca! las cuales sobreviven por lo menos parcialmente intactas al proceso de desecacin 4ue termina en la semilla madura$ La introduccin de agua permite la actividad metablica sin sntesis de nuevas enzimas! 4ue en pocas 'oras son remplazadas por el metabolismo completo$ Uno de los primeros cambios con la imbibicin! es el reinicio de la actividad respiratoria! la cual es detectada en minutos despus del incremento inicial en el consumo de oxgeno$ La tasa respiratoria se reduce 'asta 4ue la radcula penetra las estructuras 4ue la rodean! gener(ndose un nuevo incremento de la actividad respiratoria 1BeIle# # Blac9! %22,3$ La va glicoltica # la ruta de las pentosas "os"ato se reinician en "ase ?! as como tambin se activan las enzimas del ciclo de Orebs$ >e conoce tambin de la existencia de mitocondrias en los tejidos embrionarios! pero con poca di"erenciacin los cuales en unas cuantas 'oras se redi"erencian # permiten la generacin de nuevas mitocondrias! en donde se expresan los primeros genes nucleares 1E'rens'a"t # Brambl! %22/3$

!." S:1-,s.s ;, p2o-,:13s ;6231-, 43 0,2?.135.71 Foda la ma4uinaria para el reinicio de la sntesis de protenas durante la imbibicin! est( presente en las clulas de los embriones maduros! donde no se detecta la presencia de polirribosomas$ >in embargo! en los primeros minutos de la re'idratacin se disminu#e la presencia de ribosomas simples # se detectan complejos de sntesis de protenas en polirribosomas$ La sntesis inicial depende de ribosomas existentes! pero! se sintetizan nuevos ribosomas en unas 'oras despus de 4ue se detecta la asociacin en polisomas$ Los AD@m 4ue son traducidos inicialmente! existen en el embrin seco # maduro 1Cigura ,3. por ejemplo! los 4ue codi"ican para las protenas ribosomales despus de su traduccin son remplazados por nuevos AD@Gs mensajeros 1Beltr(n et al$! %2203$ El almacenamiento de los mensajeros en las semillas! apunta a 4ue se almacenan asociados con protenas en "orma de ribonucleoprotenas mensajeras 1D@Pm3 en el citoplasma! o bien almacenados en el nHcleo 1Peumans et al$! %2&23$ A2

Cigura ,$ Cormacin de AD@Gs mensajeros durante el desarrollo completo de la semilla$ Peumans et al$! %2&2$ !.' E4 ,s-2@s El estrs es todo a4uello 4ue no causa bienestar al organismo # es provocado por diversos "actores! 4ue implica la respuesta de ste "rente a una amenaza ante la cual necesita ajustarse 1Pon! %2203$ En plantas! usualmente es de"inido como el "actor 4ue ejerce una in"luencia de desventaja en stas$ El estrs puede ser bitico! impuesto por otros organismos! o abitico despertado por un exceso o de"iciencia en el ambiente "sico o 4umico 17uadro %3$

AB

7uadro %$ Cactores 4ue causan estrs$ Cuente= Pon! %220$ A*.7-.5oA 7alor Cro >e4ua >al Aire Exidativo Anaerbico Metales pesados Lesiones Calta de nutrientes Exceso de luz Patgenos 8erbvoros

B.7-.5oA

Las plantas "recuentemente se en"rentan al estrs 1condiciones externas 4ue a"ectan adversamente el crecimiento! el desarrollo o la productividad3$ Qste despierta un amplio rango de respuestas en la planta! desde una alteracin en la expresin de genes # del metabolismo celular! 'asta cambios en las tasas de crecimiento # rendimiento de las cosec'as$ La duracin! severidad # el rango al cual el estrs es impuesto in"lu#en en la respuesta de la planta$ Algunas condiciones adversas en combinacin! pueden inducir una respuesta di"erente de a4uella proveniente de un solo tipo de estrs$ 7aractersticas de la planta inclu#endo identidad de los rganos # tejidos! la edad del desarrollo # el genotipo tambin in"lu#en en la respuesta al estrs$ Algunas respuestas claramente "avorecen la aclimatacin al estrs! mientras el papel "uncional de otras no es claro$ +e tal manera! 4ue identi"icar cu(les respuestas promueven o mantienen el crecimiento # desarrollo de las plantas durante este proceso! es de suma importancia para entender el proceso de respuesta al estrs$ >i se compara el rendimiento m(s alto con el rendimiento promedio! el impacto del medio ambiente sobre la productividad 4ueda de mani"iesto$ >i este crecimiento m(ximo se asume como el 4ue representa el desarrollo de las plantas bajo condiciones ideales! entonces! las prdidas asociadas con el estrs bitico # abitico! reducen la productividad media en ;0 a -&B dependiendo del tipo de cultivo 1Polla et al$! %22-3.

AC

Entre las condiciones ambientales 4ue causan el estrs! se encuentran el exceso de agua! se4ua! altas # bajas temperaturas! excesiva salinidad en el suelo! nutrientes minerales inadecuados en el suelo # exceso o de"iciencia de luz$ Fambin compuestos "itotxicos como el ozono! pueden ser da6inos a los tejidos de la planta$ En ese sentido la resistencia o sensibilidad al estrs depende de la especie! el genotipo! el desarrollo # la edad de la planta 17urrie! %22&3$

En la ma#ora de los casos el estrs es medido en relacin con la sobreviviencia! rendimiento # crecimiento de la planta! as como en la expresin de sus genes$ +ebido a 4ue el estrs es de"inido en trminos de la respuesta de la planta! se asocia ntimamente con la tolerancia al estrs! el cual consiste en la adecuacin de la planta a un ambiente des"avorable$ Un ambiente o "actor estresante para una planta puede no serlo para otra! por ejemplo= Pisum sativum crece bien a )/K7 # Glycine max a */K7$ Al incrementar la temperatura P. sativum presenta sntomas de estrs calrico m(s pronto 4ue la otra planta. por lo 4ue sta tiene ma#or tolerancia al estrs por calor$ >i la tolerancia se incrementa como resultado de la exposicin previa a un estrs! se dice 4ue la planta est( aclimatada$ La aclimatacin se debe di"erenciar de la adaptacin! donde sta se re"iere a un nivel de resistencia determinado genticamente # ad4uirido por un proceso de seleccin en varias generaciones 18o""mann # Parsons! %22%3$

Bajo condiciones naturales # de agricultura! las plantas son "recuentemente expuestas a estrs$ Algunos "actores ambientales! como la temperarura del aire pueden ser estresantes en pocos minutos! otros como el agua del suelo toman das o semanas # otros como los nutrientes minerales toman meses en ser estresantes 17urrie! %22&3$

!.B L3s p2o-,:13s ;, 5CoD6, 53472.5o =Hsp> En respuesta a temperaturas elevadas! las plantas sintetizan protenas de c'o4ue calrico 18sp3. estas protenas "ueron descubiertas primero en Drosophila # 'an AD

sido identi"icadas tambin en 'umanos! plantas # microorganismos$ 7uando las clulas o pl(ntulas de "rijol de so#a son sometidas de )0K7 a ,/K7 1justo debajo de la temperatura letal3! la sntesis de AD@m # protenas! es suspendida mientras se estimula la transcripcin # traduccin del grupo de protenas 8sp$ Los transcritos nuevos de AD@m 'an sido detectados de * a 0 minutos despus del c'o4ue calrico 1>ac's # 8o! %2-;3$

Los rangos de los pesos moleculares de las 8sp se encuentran entre los %0 a %%/ 9ilodaltones 19+a3! las protenas de bajo peso molecular 18sp de %0<,/ 9+a3 son abundantes en plantas superiores m(s 4ue en otros organismos # presentan baja 'omologa con otras 8sp de bajo peso molecular de animales # microorganismos$ >in embargo! algunas otras 8sp son mu# similares en plantas # animales! por ejemplo! los genes estructurales 4ue codi"ican para 8sp&/ en Maz! Drosophila # 'umanos muestran un &0B de 'omologa$ >i bien las 8sp de plantas "ueron identi"icadas por cambios r(pidos de )0 a ,/K7! 4ue raramente ocurren en la naturaleza! tambin son inducidas por cambios graduales de incremento de temperatura 4ue representan el ambiente natural # ocurren en plantas bajo condiciones de campo$ Algunas 8sp se encuentran en clulas normales 1constitutivamente3 sin estrs! # algunas protenas celulares esenciales son 'omlogas a las 8sp! pero no se incrementan en respuesta al estrs por temperatura$ Muc'as 8sp son codi"icadas por miembros de "amilias multignicas! de las cuales solo algunas son inducidas por calor$ +istintas 8sp son localizadas en el nHcleo! mitocondria! cloroplasto! retculo endopl(smico # citoplasma$ Las 8sp no slo son inducidas por calor! sino 4ue tambin por estrs ambiental como d"icit 'drico! tratamiento con (cido abcsico 1ABA3! da6o "sico! baja temperatura # salinidad 1Ruarrie! %22*. Dobertson et al$! %22*3$ El c'o4ue por calor se puede despertar bajo numerosas circunstancias con resultados 4ue se ubican entre crecimiento retardado! a da6o de rganos # la muerte de la planta$ En el campo! el c'o4ue calrico puede encenderse cuando la transpiracin es insu"iciente 1limitacin de agua o temperatura alta3 o cuando los

A6

estomas est(n parcial o totalmente cerrados # la irradiacin es alta. en la germinacin! cuando el suelo es calentado por el sol. en rganos con capacidad reducida para la transpiracin$ Las plantas pueden ser aclimatadas al estrs por calor! o ad4uirir termotolerancia si son sujetas a temperaturas altas no letales 1permisivas3 por unas pocas 'oras antes de encontrar las condiciones de c'o4ue calrico$ El proceso de aclimatacin se cre involucra nuevas protenas sintetizadas en respuesta a temperaturas altas permisivas! las cuales con"ieren termotolerancia al organismo$ Una planta aclimatada puede sobrevivir a temperaturas 4ue podran ser de otra "orma letales$ A pesar de esa capacidad 'a# por supuesto lmites de la cantidad de calor 4ue debe recibir la planta 1Bra# et al$! )///3$ La germinacin despus de la siembra a temperaturas entre )/ # )0K7 es de , a ; das 1con crecimiento de por lo menos 0 cm para poder emerger a la super"icie3! en tanto 4ue al incrementar el rango 'asta */K7! germinan de ) a , das 17olbr# et al$! %2;%. +u""us # >laugt'er! %2-/. Parson! %2-%3$ >i bien muc'as semillas germinan en un amplio rango de temperaturas! usualmente no germinan por arriba o por debajo de sus rangos espec"icos de especie$ La temperatura mnima de muc'as especies es de / a 0K7! la m(xima es de ,0 a ,-K7! # la ptima! es de )0 a */K7 1Daven et al$! %2223$ Los tejidos 'idratados con crecimiento activo di"cilmente sobreviven a ,0 K7 1Faiz # eiger! %22-3$ Las plantas expuestas a calor excesivo ex'iben un grupo de caractersticas de respuesta celular # metablica! de las cuales muc'as est(n conservadas en todos los organismos$ La caracterstica de la respuesta a calor es un decremento en la sntesis de protenas normales! acompa6ada por una transcripcin # traduccin acelerada de las protenas de c'o4ue calrico 1conocidas como 8sp3! esta respuesta se observa cuando las plantas son expuestas a por lo menos 0K7 por encima de las condiciones ptimas de crecimiento$ En adicin a la alteracin de los patrones de expresin gentica! el calor tambin a"ecta la estabilidad de las membranas! aumentando la "luidez de los lpidos de la membrana! lo cual se correlaciona con la prdida de la "unciones biolgicas cuando se presenta cierta AE

adaptacin "isiolgica al incremento de la temperatura$ +e igual manera se a"ecta la "uerza de las interacciones electrost(ticas de las protenas con otros componentes solubles # con los lpidos 1Daison et al$! %2-)3$ El incremento de la temperatura a"ecta la "otosntesis! por4ue se ven a"ectados los "otosistemas ? # ?? de las membranas de los cloroplastos$ Existen plantas 4ue se 'an adaptado a las condiciones ambientales de una radiacin solar intensa # 'an desarrollado algunas estructuras mor"olgicas # "uncionales 4ue les permiten proteccin contra un calor excesivo 1BSjorman et al$! %2-/3$

En ese contexto de adversidades es 4ue las protenas 8sp se expresan! precediendo las posibilidades de aclimatacin! proteccin # sobrevivencia$ +e a' la relevancia de estudiar el comportamiento de las mismas en uno de los eventos crticos de la agricultura= la germinacin! asunto Htil desde el punto de vista de la produccin # del cultivo del "rijol. # al mismo tiempo evento "isiolgico! celular # molecular! 4ue merece ser estudiado para la obtencin de conocimientos b(sicos! para su entendimiento # posterior manipulacin 1Bra# et al$! )///3$

La "uncin espec"ica de las di"erentes 8sp aun no se conoce! pero las 8sp # algunas otras protenas actuan como c'aperonas! involucrando estabilizacin # doblado de protenas dependientes de AFP # ensamble de protenas oligomricas 1Cigura 03$ Fambin! est(n involucradas en el transporte de polipptidos a travs de las membranas a compartimentos celulares 1Telc' # BroIn! %22;3$ Algunas de las principales 8sp est(n conservadas entre todos los organismos vivos= eucariotes # procariotes! muc'as de esas protenas "uncionan como c'aperonas # est(n involucradas en el re<doblamiento de protenas desnaturalizadas por el c'o4ue calrico$ Algunas de las 8sp son expresadas al inicio del desarrollo del organismo! por lo tanto! no son inducidas por calor! pero son de"inidas como 8sp debido a su 'omologa de secuencias # posible similitud en la "uncin$ La ma#ora de las "unciones de las 8sp de plantas no 'a sido demostrada in vivo 1Bra# et al$! )///3$ Es decir! la ma#or parte de la investigacin de las "unciones de las 8sp 'a sido completada en Drosophila! donde se 'an obtenido mutantes! por lo 4ue el papel de AF

8sp en plantas! 'a sido in"erido por estudios de complementacin en levaduras de Saccharomyces cerevisiae 1@over et al$! %22;3$

Cigura 0$ Cunciones de c'aperonas moleculares$ Cuente= Telc' # BroIn! %22;$ Los residuos 'idro"bicos de las cadenas de los polipptidos no doblados son protegidos por las 8sp del ambiente acuoso! de tal manera 4ue evitan interacciones 'idro"bicas # "ormaciones agregativas no nativas de los polipptidos$ Estudios in vitro de "racciones protecas enri4uecidas con 8sp%0 muestran 4ue se comportan como protenas estabilizadoras no espec"icas! 4ue estabilizan otros polipptidos 4ue se degradan "(cilmente con el incremento de calor$ In vivo la unin de 8sp a pptidos particulares dentro de compartimentos subcelulares se cre es muc'o m(s espec"ica! tales uniones de 8sp<polipptidos son crticas dado la tendencia de muc'as protenas a desnaturalizarse en altas temperaturas 18ig'toIer # 8enders'ot! %22&3$

AG

Las condiciones 4ue inducen la tolerancia trmica en plantas correlacionan estrec'amente con las 4ue inducen la acumulacin de 8sp! pero tal correlacin no prove evidencia de 4ue las 8sp jueguen un papel esencial en la aclimatacin al estrs calrico$ La expresin del "actor activador 18s"3 de la transcripcin de las 8sp! induce la sntesis constitutiva de las 8sp e incrementa la termotolerancia en Arabidopsis 1Lee et al$! %2203$ Estudios en plantas de Arabidopsis 4ue contenian secuencias antisentido de A+@! redujeron la sntesis de 8sp&/! mostrando 4ue las altas temperaturas extremas a las cuales las plantas podan sobrevivir! se redujeron en )K7 comparados con el control$ Mutantes crecieron a la temperatura ptima 1Lee # >c'oe""l! %22;3$

Las protenas de c'o4ue calrico 18sp3 se 'an denominado # agrupado en cinco distintas "amilias! con base a sus pesos moleculares 1Ellis! %22;3$ %3 F3?.4.3 ;, 43s Hsp900 =900)990 ED3>$ ?nclu#en protenas de bacterias! levaduras! tripanosomas! mam"eros # plantas! contienen dos dominios conservados de unin a AFP$ >e pueden distinguir * sub"amilias con base a la 'omologa de los dominios 4ue "lan4uean los dominios de unin a AFP$ Una de las sub"amilias es inducible por calor # estan involucradas en la termotolerancia$ Estas c'aperonas "uncionan en la desagregacin! m(s 4ue en prevenir la agregacin # doblados errneos durante la exposicin a altas temperaturas 1Easton et al$! )///3$ )3 F3?.4.3 ;, 43s Hsp%0 =F&)%0 ED3> $ Las 8sp2/ se asocian con receptores de 'ormonas en clulas animales # podran estar involucradas en su activacin! pero! no 'a# in"ormacin e4uivalente en plantas$ >e encuentran en bacterias! compartimentos citopl(smicos! nucleares # de retculo endopl(smico de eucariotes! donde "uncionan como c'aperonas moleculares de larga vida de interaccin$ En levaduras son esenciales para la sobrevivencia a las temperaturas altas 1Laevis et al$! %22;3$ *3 F3?.4.3 ;, 43s Hsp70 =BB)7F ED3> $ >on esenciales para la "uncin celular normal! algunos miembros de esta "amilia son expresados constitutivamente! otros

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son iducibles por "ro o calor! se localizan en muc'os compartimentos celulares! son c'aperonas dependientes de AFP involucradas en el doblado! ensamble # desensamble$ La localizacin nuclear de las 8sp&/ es redistribuda al citoplasma durante la recuperacin por estrs$ La caracterstica m(s conservada entre organismos es el dominio amino terminal de unin a AFP! la expresin de 8sp&/ en plantas generalmente no es tan "uerte como en otros organismos$ +os miembros distintos pero mu# 'omlogos por su igualdad en composicin de amino(cidos son= la 8sp&/ # la 8sc&/! 4ue residen respectivamente en el citoplasma # nHcleo de las clulas de mam"eros 1Marimoto # Milas9i! %22/. 7raven et al$!%22&3$ ,3 F3?.4.3 ;, 43s HspB0 ='0$B0 ED3>$ Fambin se cre 4ue "uncionan como c'aperonas moleculares! se presentan en el citoplasma bacteriano! matriz mitocondrial # en el estroma de cloroplastos$ >on abundantes aun en temperaturas normales! su "uncin principal est( asociada al ensamble de protenas$ Presentan una estructura oligomrica! ) 'ept(meros en "orma de anillo 4ue re4uieren de AFP$ En plantas! la m(s estudiada es la c'aperonina ;/ de cloroplasto codi"icada en nHcleo! involucrada en el ensamble de la enzima Dubisco! pero! no se incrementa en respuesta al estrs por calor 1Lo9ota et al$! )///3$ 03 F3?.4.3 ;, 43s p,D6,G3s s?Hsp =9'$"0 ED3> $ Un aspecto Hnico de las plantas! es la presencia de sm8>Ps 1small 'eat s'oc9 proteins3 contienen por lo menos 0 clases de estas protenas! mientras otros organismos tienen slo una clase de sm8>P! las distintas clases se distribu#en dos en citoplasma! una en cloroplasto! una en retculo endopl(smico! una en mitocondria$ El extremo amino de ellas comparte 'omologa con las protenas <cristalinas! protenas del cristalino de los ojos de vertebrados$ Corman complejos de )//<-// 9+a. en plantas no se 'a demostrado su "uncin! pero en mam"ieros # Drosophila indican 4ue stas participan en el establecimiento de la termotolerancia! no 'a# evidencia de 4ue se re4uieran para la "uncin celular normal$ @o re4uieren de AFP$ En c'c'aro se 'a demostrado 4ue previenen la agregacin de protenas in vitro! en respuesta a temperaturas altas 1Bra# et al$! )///3$ Algunas 8sp se unen temporalmente a una 2A

enzima estabilizada en un estado particular del desarrollo celular! posteriormente! se liberan para dejar activa la enzima! por ejemplo la 8sp&/ de plastidios en el cromoplasto de las "lores de Narcissus pseudonarcissus! la cual protege la enzima "itoene desaturasa! 4ue se asocia con la biosntesis de los carotenoides$ Esta enzima se codi"ica en el nHcleo # es importada al cromoplasto temprano en el desarrollo! permanece unida # es estabilizada por la 8sp&/ 'asta 4ue es liberada m(s tarde para 4ue sea activa 1Bon9 et al$! %22;3$

!.7 O-2os p2o5,sos D6, .1/o465231 3 43 Hsp70 >e 'a reportado 4ue la protena del gene de c'o4ue calrico 18sp&/3 est( involucrada en la determinacin de susceptibilidad a desarrollar lupus eritematoso sistmico en la poblacin mestiza mexicana$ Esto est( soportado! a 4ue este gene se encuentra cercano a los alelos del complejo de 'istocompatibilidad! 4ue son reconocidos como "actores genticos para desarrollar lupus 1Pargas et al$! )///3$ Por otro lado! el "actor de necrosis tumoral al"a 1F@C< 3 est( en aumento en tejido adiposo! tanto en modelos de roedores como en 'umanos! por lo 4ue se 'a! considerado un gene candidato para la obesidad$ 8a# evidencia de 4ue el gene cercano de 8sp&/ est( involucrado tambin en la ganancia de peso 17'ouc'ane et al.! )//%3$

Por otra parte! se 'a estudiado la expresin de la "orma constitutiva # de la inducible por estrs de 8sp&/! respecto a la calidad del semen en c'ivos de carne al realizar an(lisis de Testern blot! # se observ 4ue la calidad disminu#e signi"icativamente en muestras con un bajo nivel de 8sp&/ durante la estacin de calor 18uang et al$! )///3$ >e 'a reportado 4ue la protena 8sp&/ participa en el proceso de muerte celular programado 1apoptosis3! unindose al "actor Apa"<% evitando 4ue se "orme el apoptosoma # se lleve a cabo este evento 1Davagnan et al$! )//%3$

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III. MATERIALES H MITODOS

&.9 Lo534.J35.71 ;,4 K2,3 ;, ,s-6;.o El presente trabajo se realiz en el +epartamento de Biologa Molecular de Plantas de la Unidad Acadmica de Biologa Experimental de la Universidad Autnoma de acatecas! ubicada en el 9ilmetro 0 de la 7alzada de la Devolucin Mexicana en la 7olonia Fierra # Libertad del municipio de Auadalupe< acatecas. con una temperatura promedio de %-K7 # una altura de ),2; metros sobre el nivel del mar$

&.! M3-,2.34 *.o470.5o En este estudio se utiliz la variedad de "rijol @egro acatecas 1Cigura ;3$ Los

anticuerpos 1anti<8sp&/ # anti<?gA asociado a peroxidasa3! "ueron de 7albioc'em$

Cigura ;$ >emillas # plantas de "rijol! variedad @egro acatecas &.& Ap4.535.71 ;, ,s-2@s 53472.5o 3 43s s,?.443s ,1 0,2?.135.71 >e pesaron )/ gramos de semillas de "rijol! en cajas Petri # se pusieron a germinar en papel absorbente 19im Iipe3 con 0 mL de agua destilada estril a una temperatura de )0K7! en una incubadora simple durante %) 'oras. previamente las semillas "ueron lavadas * veces en agitacin por ,0 segundos con el mismo

2B

volumen de agua destilada$ >e 'izo un lavado "inal con agua destilada estril$ Franscurridas las %) 'oras del proceso de germinacin en condiciones de 'umedad! oscuridad # de temperatura constante! las semillas se sometieron a un incremento de temperatura de 0K7 por una 'ora! de tal manera 4ue el primer tratamiento slo contaba con %) 'oras a )0K7$ El segundo tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a */K7$ El tercer tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a *0K7$ #! el Hltimo tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a ,/K7! es decir! 4ue el segundo tratamiento "u sometido 0 grados sobre los )0K7 iniciales por una 'ora! en tanto 4ue el Hltimo tratamiento "ue sometido %0 grados sobre los )0K7 durante una 'ora$ 7omo control! se utilizaron semillas de "rijol de la misma variedad en estado de dormancia! las cuales solo "ueron tratadas con agua # sin aplicar estrs calrico$ A todas las semillas se les extrajeron los embriones! )/ gramos rinden aproximadamente -// miligramos de embriones en seco$ +espus se les 'izo extraccin # cuanti"icacin de AD@ # protenas solubles 1Brad"ord! %2&;3. todo el ensa#o se realiz por triplicado! para veri"icar su reproducibilidad en el resultado$

&." EL-2355.71 ;, ARN -o-34 5o1 T2.Jo4 >e tomaron en un tubo eppendor" de %$0 mL 0/ miligramos de embriones de "rijol! # se les adicion % mL de reactivo de Frizol 1Aibco BDL3! se mezcl # se incub por %/ minutos$ Luego se puso la mitad del 'omogeneizado en otro tubo eppendor" estril$ +espus se le adicion a cada tubo )// L de cloro"ormo 1>igma3 "ro! se taparon bien # se agitaron vigorosamente con la mano por %0 segundos # se dejaron reposar durante * minutos para posteriormente centri"ugar a %*!/// rpm por %0 minutos$ La "ase acuosa e incolora 1parte de arriba3! se tom cuidadosamente # se trans"iri a otro tubo eppendor" estril # se le adicion a cada tubo 0// L de alco'ol isoproplico 1>igma3 "ro! se mezclaron ligeramente con la mano # se dejaron reposar por )/ minutos a ,K7 en el re"rigerador! para luego centri"ugar a %*!/// rpm por %/ minutos$ Posteriormente! se decant el sobrenadante # se lav el pellet de AD@ 1gel translHcido3! adicionando % mL 1por

2C

cada tubo3 de etanol al &0 B en agua<+EP7 1Apndice3$ >e mezcl un poco # nuevamente se centri"ug a %*!/// rpm por %/ minutos$ Por Hltimo! se decant el sobrenadante # el remanente acuoso se retir con papel absorbente! luego se dej el tubo abierto para secar un poco al aire durante 0 minutos # despus se resuspendi el AD@ de cada! tubo en 0/ L de agua tratada con +EP7 1Apndice3$ >e cuanti"ic el AD@ en el espectro"otmetro # despus se mantuvo a <)/K7 en el re"rigerador por tiempo inde"inido 'asta su uso$ Fodo el procedimiento se realiz a temperatura ambiente # usando guantes desec'ables! para evitar su degradacin por la contaminacin de D@Asas! empleando la tcnica suministrada con el reactivo de Frizol de la empresa ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %002;! %22&3$

&.' EL-2355.71 ;, p2o-,:13s so46*4,s ;, 4os ,?*2.o1,s ;, <2.+o4 Los embriones se sumergieron en nitrgeno l4uido # una vez congelados! se molieron con el pistilo en un mortero de porcelana 'asta obtener un polvo "ino$ +espus! al polvo se le adicion bu""er de extraccin @EF<) 1@ambara et al$! %22)3! poniendo )/ microlitros de bu""er por cada % miligramo de embrin molido$ Para este caso se emplearon aproximadamente , mL de bu""er @EF<) 1Apndice3! luego! el extracto de embriones se pas a un tubo estril # se disolvi bien en vortex! posteriormente! se puso a ebullicin por * minutos # despus se centri"ug a -/// rpm durante %/ minutos para recuperar la "raccin soluble 1sobrenadante3 # determinar as! la concentracin de protenas$

&.B M,;.5.71 ;, 43 5o15,1-235.71 ;, K5.;os 1654,.5os ( p2o-,:13s Para la determinacin de (cidos nucleicos! se tomaron 0 L de la muestra # se le adicionaron 220 L de agua destilada! luego se mezclaron # se trans"irieron a una cubeta de cuarzo$ Para ajustar el espectro"otmetro a ceros! se trans"irieron %/// L de agua destilada a la cubeta$ >e le# la absorbancia a una densidad ptica de );/ nanmetros en la regin ultravioleta$ La concentracin de AD@ total se calcul

2D

a partir de 4ue una densidad ptica de %$/ es igual a ,/ g de AD@ por mililitro 1/$%% mM3$ Por ejemplo! si la densidad ptica "ue de /$)0! 'aciendo una regla de tres dara igual a %/ g por los 0 L 4ue se aplicaron de AD@! 'abiendo as una concentracin "inal de ) g de AD@ por % microlitro de muestra$ 7ada determinacin se 'izo por triplicado$ Para la concentracin de A+@c # oligos! sta se calcul a partir de 4ue una densidad ptica de %$/ es igual a 0/ g de A+@ por mililitro 1/$%0 mM3 # de ** g de oligos por mililitro 1/$%/ mM3 respectivamente 1+avis et al$! %2-;3$

Por otra parte! la cantidad de protenas se midi de manera colorimtrica en el espectro 1Brad"ord! %2&;3! donde se adicionaron en varios tubos eppendor" cantidades de % a 0 microlitros de muestra ajustando a un volumen de -// L con solucin de @a7l %0/ mM 1Apndice3! despus se a6adieron )// L de solucin de trabajo Brad"ord 1Apndice3$ >e mezclaron los tubos en el vortex # se dejaron reposar por * minutos a temperatura ambiente$ +espus se trans"iri a una cubeta de pl(stico # se le# la absorbancia a una densidad ptica de 020 nanmetros en la regin visible$ El blanco para ajustar el espectro"otmetro a cero! contena -// L de @a7l %0/ mM U )// L de solucin de trabajo Brad"ord$ La cantidad de protena se calcula! interpolando la densidad ptica obtenida en una curva patrn de protena o sacando la regresin lineal # sustitu#endo el valor en la ecuacin de una recta 1Apndice3$ 7ada determinacin se 'izo por triplicado$

&.7 E4,5-2o<o2,s.s ;, ARN -o-34 ,1 0,4,s ;, 3032os3 <o2?34;,C:;o >e pusieron /$&0 gramos de agarosa 1%$0 B3 en un matraz erlenme#er de %)0 mL # se disolvieron en ,0 mL de agua destilada m(s 0 mL de bu""er MEP> %/ V 1Apndice3$ >e puso la solucin a calentar en el 'orno de microondas # se dej a'! 'asta 4ue desaparecieron los grumos "ormados. de vez en cuando se sac el matraz # se agit para luego observar si #a se 'aba disuelto completamente la agarosa$ +espus! se dej en"riar # cuando lleg a una temperatura de ;/K7! se le

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adicion 1en una campana de extraccin3 )$& mL de "ormalde'ido al *& B # 0 l de bromuro de etidio %/ mgJmL 1apndice3$ >e mezcl # se vaci el contenido a una c(mara de electro"oresis sumergida previamente armada con su peine! # se dej geli"icar la solucin de agarosa$ 7ada muestra se prepar con ) microgramos de la muestra! e4uivalentes a 0 l de AD@ total diludo! m(s %0 l de bu""er de muestra para AD@ 1Apndice3! se calentaron a 20K7 por * minutos$ +espus de 4ue se retir el peine del gel! se carg cada pozo con la muestra # se puso bu""er de corrida MEP> %V para la electro"oresis! luego se le aplic una corriente constante de %// Polts por */ minutos$ Una vez terminada la electro"oresis! se puso el gel en el transiluminador # se encendi la l(mpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas 1+avis et al$! %2-;3$ &.F RT)PCR =R,/,2s, T231s52.p-3s,$Po4(?,23s, CC3.1 R,35-.o1> 7on el AD@ obtenido! se realiz DF<P7D segHn lo descrito en el protocolo proporcionado por el producto >uper>criptFM Ene<>tep DF<P7D Iit' PlatinumD Fa4 de ?nvitrogen 17at$ @o$= %/2)-</,)! )//)3 con oligonucletidos espec"icos para el AD@m de 8sp&/ caprino 1secuencia no mostrada3$ Esta reaccin 17uadro )3! consisti en usar una mezcla de las enzimas reverso transcriptasa 1DF3 # Fa4 A+@ polimerasa 1Fa4 platinum3! donde primero se llev a cabo la sntesis de A+@ complementario a partir del AD@m! # luego se ampli"ic el "ragmento resultante por P7D en un termociclador Fec'ne marca Aenius aplicando di"erentes ciclos de temperatura # tiempo 17uadro *3= 7uadro )$ 7antidades de la mezcla de reaccin para la DF<P7D
C!"#!nen$e% M%/cla (% r%acc )n 2H T%-'la(" (% ARN 4r -%r !%n. ("=A0 M3 4r -%r an. I!%n. (" =A0 M3 M%/cla (% RTKTa+ 'la. n,A1,aIDE4C %!.3r l V!&'"en ( )0 l 2D L H L A L A L A L A:"rar a D0 L C!n*en$r+*,-n .,n+& I A0 '1 J A 1 0.2 M 0.2 M I I

?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/2)-</,)! )//)3$

2E

7uadro *$ 7iclos de temperatura # tiempo para la DF<P7D

/. S0n$e%,% 1e ADN* 2 #re3 1e%n+$'r+&,4+*,-n ;ac%r A c cl" (%9 CDLC '"r AD - n. GCLC '"r 2 - n. 5. A"#&,.,*+*,-n PCR ;ac%r C0 c cl"! (%9 D%!na.,ral /ar, GCLC '"r D ! Al n%ar, DDLC '"r B0 ! E8.%n(%r, 6FLC '"r A - nK<&
?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/2)-</,)! )//)3$

6. E7$en%,-n F,n+& ;ac%r A c cl" (%9 E2LC '"r A0 - n.

&.% E4,5-2o<o2,s.s ;, ADN 5o?p4,?,1-32.o ,1 0,4,s ;, 3032os3 >e pusieron /$0 gramos de agarosa 1% B3 en un matraz Erlenme#er de %)0 mL # se disolvieron en 0/ ml de bu""er FAE %V 1Apndice3$ >e calent la solucin en el 'orno de microondas con el propsito de 4ue desaparecieron los grumos "ormados. de vez en cuando se sac el matraz # se agit para luego observar si #a se 'aba disuelto la agarosa$ +espus! se dej en"riar # cuando lleg a una temperatura cercana a los ;/K7! se le adicion 0 l de bromuro de etidio %/ mgJmL 1Apndice3$ >e mezcl bien # se vaci el contenido a una c(mara de electro"oresis sumergida previamente armada con su peine! # se dej geli"icar la solucin de agarosa$ 7ada muestra se prepar con ) microgramos de la muestra! e4uivalente a %/ L del A+@c diluido! m(s %<) l de bu""er de muestra para (cidos nucleicos 1apndice3$ +espus se retir el peine del gel # se carg cada pozo con la muestra$ >e puso con cuidado! el bu""er FAE %V 1o el FBE %V3 para el corrimiento! # se le aplic una corriente constante de %// Polts por */ minutos 1+avis et al$! %2-;3$ Fambin se aplicaron ) L de marcadores 1/$& gJL3 #a preparados de peso molecular para A+@ % Ob plus 1de %// pb a %) Ob3 marca ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/&-&</%-! )//)3$ Una vez terminada la electro"oresis! se puso el gel en el transiluminador # se encendi la l(mpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas te6idas con el bromuro de etidio$ Posteriormente! se captur la imagen # el an(lisis densitomtrico de las bandas se 'izo empleando un "otodocumentador modelo 7'emi<+oc marca Bio<Dad$

2F

&.90 E4,5-2o<o2,s.s ;, p2o-,:13s ,1 0,4,s ;, po4.352.43?.;3 >e 'icieron electro"oresis para la separacin de protenas bas(ndose en su peso molecular! en condiciones desnaturalizantes # reductoras 1Laemmli! %2&/3$ >e utiliz una minic(mara de electro"oresis dual Mini protean ?? de Bio<Dad$ Para ello! primero se arm la minic(mara # se prepar el gel separador 17uadro , # Apndice3! luego se coloc la mezcla poco a poco en la c(mara! dejando espacio para poner el gel concentrador e inmediatamente se adicion isopropanol %=% en agua 1vJv3! para linealizar el gel # para 4ue geli"i4ue m(s r(pido al estar en un ambiente de anaerobiosis$ >e dej polimerizar por aproximadamente )/ minutos # luego se decant el isopropanol! posteriormente se sec con papel absorbente$ +espus se prepar # adicion el gel concentrador 17uadro ,3 colocando previamente el peine con el nHmero de pozos deseado en la c(mara de electro"oresis$ Una vez geli"icado! se removi el peine despacio # con cuidado se a6adi bu""er de corrida %V 1Apndice3 # despus se secaron los pozos con tiras cortadas de papel "iltro$ >e cargaron los pozos con la muestra de inters! preparada en bu""er de muestra para protena 1Apndice3 # luego se a6adi lentamente bu""er de corrida %V sobre los pozos cargados con la muestra! # se corri el gel a %// Polts constantes por aproximadamente ) 'oras usando una "uente de poder PoIer Pac de Bio<Dad$ Al "inal de la electro"oresis! se ti6 el gel para visualizar las bandas de protena! o se trans"irieron a membranas de nitrocelulosa para realizar ensa#os de Testern blot$ El gel se carg con ;/ microgramos de protena por carril 1%0 microlitros de muestra3! sta se prepar calculando la cantidad de muestra necesaria para %/ corrimientos # se dilu#eron en un volumen de %0/ microlitros de bu""er de muestra para protenas 17uadro 03! luego se puso a 'ervir la muestra contenida en un tubo eppendor" por 0 minutos en un ba6o con agua$ +espus se centri"ugaron a m(xima velocidad 1%)!/// a %,!/// rpm3 por %/ segundos$ >e pusieron tambin! %/ L por carril de marcadores de peso molecular prete6idos de amplio rango! 4ue contena las protenas de= )/1miosina3! %%; 1<galactosidasa3! -, 1albHmina srica bovina3 # ,& 1ovoalbHmina3 9ilodaltones 1Bio<Dad 7at$ @o$= %;%</*/23$

2G

7uadro ,$ 7antidades para preparar ) minigeles de poliacrilamida S!&'*,!ne% Ge& %e#+r+1!r +& /5 8 Acr la- (aI& !acr la- (a =B090.F M> Tr !ICl A.D M, '; F.F Tr !ICl 0.D M, '; 6.F ;2O & (%!.. " .r (%!. la(a SDS al A0 M 4SA al A0 M T%-%(
Laemmli U$ O$ %2&/$

Ge& *!n*en$r+1!r +& 9.) 8 0.60 -L 0 -L A.00 -L 2.B2 -L F0 L 2D L D L

C.00 -L 2.D0 -L 0 -L B.D0 -L 200 L E0 L A0 L

&.99 T.15.71 ;, *31;3s ;, p2o-,:13s 5o1 5o4o231-, 3J64 ;, Coo?3ss., Esta tcnica se utiliz para visualizar las protenas separadas despus de la electro"oresis! donde el azul de 7oomassie se une a las protenas de manera no espec"ica # el lmite de deteccin es de /$* g a % g por banda de protena$ Para realizar esta tincin! primero se coloc el gel de poliacrilamida en un recipiente de pl(stico! al cual se le adicion solucin "ijadora para tincin de 7oomassie 1Apndice3 'asta cubrir totalmente el gel # se agit suavemente por %0 minutos en un orbital s'a9er$ Luego se decant la solucin "ijadora # se cubri el gel con solucin de tincin r(pida de 7oomassie 1Apndice3 # se agit suavemente por ) 'oras o 'asta observar las bandas te6idas en el s'a9er$ +espus se tir la solucin de tincin # se cubri el gel con solucin deste6idora de (cido actico al %/ B 1Apndice3$ >e Agit suavemente! 'asta 4ue dio un "ondo claro$ +espus se analiz el gel en un "otodocumentador! para realizar densitometra o c(lculo de pesos moleculares de las bandas de inters o simplemente escanear el gel puesto entre dos acetatos para obtener la imagen # as analizarla con un so"tIare apropiado$ Para almacenar el gel! ste se sec en papel celo"(n a temperatura ambiente 1Bollag # Edelstein! %22%3$

B0

&.9! S,53;o ;, 0,4,s ;, po4.352.43?.;3 Para secar los geles para su conservacin prolongada! se llevaron a cabo los siguientes pasos= primero! el gel # el papel de celo"(n dulce se embebieron por */ minutos! en un recipiente de vidrio 4ue contena solucin de secado para geles 1Apndice3$ Luego se coloc el gel en medio de dos trozos de papel celo"(n "ormando un emparedado$ Posteriormente! sto se puso sobre una placa de vidrio! # se estir. luego se coloc encima un marco de pl(stico # se sujet ste con pinzas de clip! evitando la "ormacin de burbujas$ El gel se dej secar a temperatura ambiente por * das 1Bollag # Edelstein! %22%3$

&.9& E4,5-2o-231s<,2,15.3 ;, p2o-,:13s 3 p3p,4 ;, 1.-2o5,464os3 Una vez 4ue se realiz la electro"oresis! se realiz la electrotrans"erencia 1FoIbin et al$! %2&23! 4ue consisti en trans"erir las bandas de protena separadas en el gel de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa 18#bond<7 de Amers'an3$ Estas membranas se marcaron con un corte diagonal con tijeras en un extremo! para saber cual era el inicio del corrimiento # se les puso tambin con l(piz un nHmero para identi"icar las membranas$ En un recipiente de vidrio! el gel # el papel de nitrocelulosa se cubrieron con solucin de FoIbin 1Apndice3 de %0 a */ minutos! despus se coloc papel extra grueso 1F'ic9 Paper Bio<Dad , mm semidr#3 en la misma solucin para 'umedecerlo$ >e utiliz un aparato trans blot para realizar la trans"erencia en semiseco 1modelo Frans Blot >em# +r# marca Bio<Dad3$ Posteriormente! se 'izo un emparedado sobre la placa positiva 1parte in"erior3 del trans blot! colocando primero el papel extra grueso! luego la membrana de nitrocelulosa! despus el gel de poliacrilamida # por Hltimo! otro papel extra grueso$ >e a6adi m(s solucin de FoIbin por encima del emparedado # se pas rodando un tubo de ensa#o por encima del s(ndIic'! para evitar 4ue se "ormaran burbujas de aire$ Luego se coloc la placa negativa 1parte superior3 # la tapa del trans blot! # se conect a una "uente de poder modelo poIer pac)// marca Bio<Dad! aplicando una corriente de %0 Polts por )/ minutos$ Una vez terminada la trans"erencia de las protenas del gel al papel de nitrocelulosa! se ti6 en solucin de verde r(pido BA

1Apndice3 todo el papel o una sola tira 4ue correspondi a un solo carril$ Para ello! se aplica en un recipiente de pl(stico un poco de esta solucin al papel # se agita con la mano 'asta visualizar las bandas de protena$ Para remover el colorante! slo 'a# 4ue adicionar agua destilada # poner en agitacin$ +espus se determin la presencia de la protena 8sp&/ mediante la reactividad del anticuerpo monoclonal anti<8sp&/ isotipo ?gA% de 7albioc'em 1Alan W F'orpe! %2--3! revelando con un segundo anticuerpo anti<?gA de ratn conjugado con peroxidasa 15o'nson et al$ %2&23. cu#o sustrato "ue un reactivo 4uimioluminiscente 1Doc'e3! en el cual se visualizaron # analizaron las bandas en un "otodocumentador 7'emi<+oc marca Bio<Dad$

&.9" M,s-,21 *4o+espus de la electrotrans"erencia de las protenas del gel a la membrana de nitrocelulosa! se le puso a blo4uear por toda la noc'e a ,K7 en solucin de PB> % V : lec'e * B 1Apndice3$ +espus! se decant la solucin # se lav la membrana cuatro veces por 0 minutos en el siguiente orden= a3 lavado con PB><FIeen 1apndice3! b3 lavado con PB> %V 1Apndice3! c3 lavado con PB><FIeen # d3 lavado con PB> %V$ +espus de terminar los lavados! la membrana se incub con el primer anticuerpo anti<8sp&/ de bovino 1dilucin %=%/// en PB> % V : lec'e * B3 durante ) 'oras o toda la noc'e a ,K7! para una mejor reactividad del anticuerpo$ Luego se volvieron 'acer los , lavados # despus se incub % 'ora la trans"erencia con el segundo anticuerpo asociado a la enzima peroxidasa de r(bano 1dilucin %=%/// en PB><lec'e3$ >e volvi a lavar , veces siguiendo la secuencia anterior # luego se dej secar el papel de nitrocelulosa sobre una 'oja de papel en blanco # se revel con un 9it de 4uimioluminiscencia E7LUPlus de la marca Amers'an! 4ue permite localizar la enzima peroxidasa por la emisin de luz$ Para ello! se ba6 la membrana con % mL de la solucin del 9it! # luego se puso a secar a temperatura ambiente # posteriormente se visualiz la aparicin de bandas reactivas en el "otodocumentador 7'emi<+oc marca Bio<Dad$ Fodos los pasos de lavado e incubacin con los anticuerpos # el sustrato! se 'icieron a temperatura

B2

ambiente # en agitacin constante # suave! en un orbital roc9et o s'a9er 1Bollag # Edelstein! %22%3$

&.9' D,1s.-o?,-2:3 Las im(genes de las bandas de protena! Testern blot # A+@c! "ueron capturadas con un "otodocumentador 7'emi+oc marca Bio<Dad$ Luego se sometieron a un an(lisis densitomtrico semi<cuantitativo! con el so"tIare Ruantit# Ene de marca Bio<Dad! con el "in de calcular el tama6o en base a est(ndares de peso. as como tambin cuanti"icar la cantidad de AD@ mensajero # de la protena 8sp&/ expresada en embriones de "rijol sometidos a di"erentes temperaturas$

BB

IV. RESULTADOS

Una vez extradas las protenas de los embriones en dormancia # de los sometidos a estrs calrico 1cuadro 03! se separaron por electro"oresis las bandas de protena 1"igura &3 se les determin el peso molecular 1"igura -3. # se analizaron por densitometra para su cuanti"icacin 1"igura 23$ Feniendo el antecedente de 'aber identi"icado a la protena 8sp;/ en embriones de "rijol sometidos a varias temperaturas 1"igura %/3$ Las bandas resueltas por electro"oresis! se electrotrans"irieron a membranas de nitrocelulosa 1"igura %%3! para identi"icar la banda de protena 8sp&/ por Testern blot 1"igura %)3! a la cual se le 'izo an(lisis densitomtrico 1"igura %*3$ Fambin se extrajo # veri"ic por electro"oresis! la integridad del AD@ total de los embriones en dormancia # de los germinados sometidos a estrs calrico 1"igura %,3$ 7on el AD@ obtenido se realiz DF<P7D con primerGs espec"icos para el gene de la protena U%&/! la cual participa en el procesamiento del AD@m en eucariotes # el cual sirvi de re"erencia para ver si 'aba o no ampli"icado 1"igura %03$ Fodos los AD@ mensajeros de los embriones en dormancia # de los germinados a varias temperaturas! se ampli"icaron con oligoprimerGs espec"icos para 8sp&/ 1"igura %;3 # se les 'izo densitometra para comparar con un gene conservado AA+P8 # cuanti"icar su expresin 1imagen no mostrada3$ As mismo! se determin su tama6o en pares de bases empleando marcadores de peso nucleotdico conocido 1"igura %-3$ Por otro lado! se observ la relacin de la temperatura con la expresin del AD@m # de la protena 8sp&/ 1"iguras %)! %*! %; # %&3$

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C,a(r" D. C"nc%n.rac )n (% 'r".%2na! .".al%!, 'ara r%!"l$%r '"r %l%c.r":"r%! !

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F 1,ra AA. T nc )n (% 'r".%2na! c"n c"l"ran.% $%r(% r6' (" M%-&rana +,% -,%!.ra la %l%c.r".ran!:%r%nc a (% 'r".%2na!

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F 1,ra AF. D%.%r- nac )n (%l '%!" -"l%c,lar %n 'ar%! (% &a!%! (%l ADNc (% ;!'E0 Marca("r%! (% '%!" n,cl%".2( c" 'ara ADN =carr l A>, ADNc (% ;!'E0 (%9 ca&ra =carr l 2>, c%&a(a =carr l B>, n"'al =carr l C> * :r 0"l =carr l D>.

V. DISCUSIN

CE

El objetivo de este trabajo "ue determinar la expresin del AD@ mensajero # de la protena 8sp&/ en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrs calrico! as como generar datos de las protenas 8sp&/ # del AD@ mensajero de "rijol bajo condiciones de semillas en latencia # germinacin! para conocer sus caractersticas moleculares # poder asociar sus "unciones b(sicas en las clulas vegetales u otros modelos biolgicos$ El en"o4ue se centr en las etapas iniciales de la germinacin en "rijol! en esta "ase del ciclo biolgico no se encontraron reportes de estudios de protenas de estrs calrico! en tanto 4ue en otros modelos! sobre todo de microorganismos # animales s abundan 1Lu"t # +ix! %2223$ Al momento de comenzar la germinacin se inicio el "enmeno de 'idratacin # vacuolizacin celular! lo cual "ue in"luido por accin de la temperatura! #a 4ue se observ 4ue 'ubo una disminucin de la concentracin de protenas a los )0 K7! en tanto 4ue a los */ K7 se presento el valor m(s alto en condiciones de germinacin! a partir de esa temperatura disminu# el rendimiento en cuanto a concentracin de proteinas a los *0 K7 # aumento nuevamente a los ,/ K7 1cuadro 03$ Las concentraciones de los extractos de proteinas de embriones permitieron comparar los rendimientos # de"inir el e"ecto del estrs calrico de cada una de las temperaturas aplicadas$ Los resultados permitieron comprobar 4ue la sntesis de protenas totales se incrementa por el estrs de acuerdo con lo propuesto por Lind4uist # 7raig %2--! sin embargo un dato importante es el rendimiento de protenas totales en los embriones en dormancia! 4ue se 'a reportando como el valor m(s alto! ello es importante en trminos de 4ue en latencia se tiene toda la ma4uinaria protica para iniciar el proceso de germinacin # generacin de la nueva planta 1Beltr(n et al$! %2203$ La importancia de la concentracin de los extractos de protenas explican la sntesis de las mismas en los tratamientos del presente trabajo$ Es importante comentar 4ue el rendimiento de protenas es alto! si se considera el rendimiento 4ue produce un cultivo de clulas animales! por ejemplo= 8eLa$ La cantidad de

CF

protenas permiti estandarizar las cantidades aplicadas para separar por electro"oresis # monitorear 8sp&/ por Testern blot$ Al separar las protenas por electro"oresis se observ un correspondencia con los rendimientos de los extractos! es decir! 4ue se corri la misma cantidad de protena para cada muestra en cada carril 1"igura &3! sin embargo se observ un incremento en la concentracin de alguna bandas! indicando el incremento a los */ K7! con un descenso a los *0 K7 # nuevamente se incrementaron a los ,/ K7! sobre todo las protenas entre los pesos de 0/ # 2/ 9+a! 4ue se pueden apreciar de manera visible en el gel te6ido con azul de 7oomassie$ +atos 4ue corresponden con lo propuesto en >o#a por! >ac's # 8o! %2-;$ +espus de te6ido el gel con las protenas separadas por peso molecular se calcul el peso molecular aproximado de las mismas! los datos permitieron concluir 4ue la concentracin de poliacrilamida al %)B "ue su"iciente para separar protenas entre los )/ # %// 9+a sin perder resolucin! # 4ue los marcadores estandarizados de peso molecular sirvieron adecuadamente para calcular el peso de las protenas de peso desconocido! mediante una regresion lineal 4ue procesa autom(ticamente el so"Iare Ruantit# Ene empleado 1"igura -3$ El an(lisis densitomtrico de las bandas de protena observados en la "igura 2! demuestraron 4ue al incrementar la temperatura de las muestras 1carriles * a ;. "igura 23! se increment la densidad de las bandas de protena # por tanto de su concentracin individual en el gel 4ue las separ! demostrando de manera clara el e"ecto del estrs en los embriones germinados sobre la expresin de protenas asociadas a la germinacin! #a 4ue 'a# ma#or sntesis de algunas protenas con respecto al control 1carril ). "igura 23$ Por ejemplo! en la banda de peso aproximado a los &/ 9+a! se observ una densidad promedio en embriones en dormancia de %%$)% unidades! alcanzando un valor de ),$&& unidades a los ,/ K7! es decir! un incremento de m(s del doble! en donde evidentemente! se demuestr el impacto del "actor calor sobre la sntesis de protenas # por tanto sirvio para validar el modelo biolgico de embriones$ Al nivel de protenas cercanas a los 2/ 9+a en

CG

embriones en dormancia la densidad "ue de %0$%& unidades contra )2$%) de embriones a ,/ K7 1carril ;. "igura -3$ As mismo bandas cercanas a los ;/ 9+a$ presentaron valores de %;$;& unidades 1carril ). "igura -3 en embriones en dormancia! contra *%$** a los ,/ K7 1carril ;. "igura -3$ Por otro lado! en bandas cercanas a los ,/ 9+a$ el valor "ue de %;$2/ unidades de densidad en los embriones en dormancia 1carril ). "igura 23 4ue aumentaron 'asta ,;$,, 1carril ;. "igura 23 a los ,/ K7$ Esto es interesante! #a 4ue todas estas bandas coinciden con las principales "amilias de protenas de c'o4ue calrico 1Los'ida et al$! %2223. siendo probable 4ue tambin sean las mismas$ Por otro lado! se observ un incremento de embriones en dormancia a )0 # */ K7! con un decremento a los *0 K7 # una recuperacin del incremento de las densidades a ,/ K7! lo cual conserva el mismo nivel de comportamiento para todas las protenas asociadas con las "amilias de 8sp 1Los'ida et al$! %2223$ El an(lisis de los geles de poliacrilamida a nivel de bandas te6idas! peso molecular # densitometra permiti realizar la siguiente etapa! en la cual se se explor la expresin de la protena 8sp&/ por Testern blot con el antecedente de 4ue previamente se realizaron experimentos para monitorear la protena 8sp;/ 1"igura %/3$ La e"iciencia del procedimiento de electrotrans"erencia de las protenas del gel a la membrana de nitrocelulosa! "ue evidente al ser te6ido con verde r(pido el papel 1"igura %%3$ La deteccin de 8sp&/ como muestra la "igura %) de"ini la expresin de la 8sp&/ 1Telc'! %22)3 # otra protena 4ue puede ser una iso"orma de 8sp&/ o la "orma constitutiva de sta! as como tambin una protena no relacionada con 8sp&/. la cual dio reactividad cruzada con el anticuerpo empleado$ Fal reconocimiento de ambas protenas se present en los embriones en dormancia! como en todos los tratamientos. lo cual probablemente indica 4ue el anticuerpo reconoce estructuras o epitopes conservados de 8sp&/ 18uang et al$! )///3$ 7abe mencionar 4ue no existen anticuerpos monoclonales espec"icos para esta protena en plantas de manera comercial # muc'o menos para "rijol! por ello el antecedente m(s directo es 4ue la protena 8sp&/ es una de las m(s conservada entre los organismos 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ >in embargo! es interesante el

D0

'ec'o de 4ue no 'ubo reactividad cruzada con otros antgenos de la muestra! #a 4ue "ueron las Hnicas bandas detectadas$ Un aspecto importante es 4ue la deteccin de las bandas de 8sp&/ en el Testern blot re4uiri de tiempos largos de exposicin del extracto proteco con el anticuerpo anti<8sp&/! con tiempos de %0 'oras a , K7! ello probablemente debido a la naturaleza de la "uente antignica de la cual derivaron el monoclonal utilizado # la concentracin a la cual se expuso la electrotrans"erencia$ El an(lisis densitomtrico del Testern blot 1"igura %*3! detect 4ue 'ubo una ma#or densidad de 8sp&/ inducible a los */ # *0 K7 1carriles * # ,. "igura %*3 con respecto a )0 K7 1carril ). "igura %*3 # en embriones en dormancia 1carril %. "igura %*3$ Mientras 4ue para la "orma 4ue probablemente sea una protena de las 8sp! la ma#or expresin "ue en los embriones en dormancia! lo cual indica la posibilidad de 4ue dic'a protena est disponible para ser utilizada como c'aperona en los eventos tempranos del proceso de germinacin! particularmente despus de la imbibicin! en tanto 4ue tiende a disminuir con"orme aumenta la "orma inducible de 8sp&/ 1"igura %&3. aun4ue conviene 'acer m(s estudios sobre esta "orma para corroborar 4ue pertenece a la "amilia de las 8sp$ Posteriormente! al asociar estos resultados con los resultados del an(lisis de los AD@ mensajeros de la protena! se observ una coincidencia en cuanto a 4ue la ma#or induccin del mismo! "ue a la misma temperatura de */ K7 1"igura %;3$ 7on el propsito de analizar la expresin de los genes de 8sp&/! se extrajo AD@ de los embriones! obteniendo AD@ total de buena integridad 1"igura %,3$ Es necesario mencionar 4ue el patrn de bandeo en clulas de mam"eros es di"erente al de plantas$ >in embargo! no se detect el AD@ de trans"erencia ni los AD@ ribosomales! posiblemente por4ue est(n en mu# baja cantidad en el embrin o 4uiz(s por4ue stos se degradaron 1carril *. "igura %,3$ Fambin se corri AD@ total de clulas eucariotes como control 1carriles % # ). "igura %,3! donde s se observaron todas las clases de AD@$ >e realiz DF<P7D con oligoprimerXs espec"icos de 8sp&/! a partir de los AD@ mensajeros 1Tang et al$! %2223! las reacciones de control positivo se 'icieron con

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un control de embriones! en el cual se ampli"ic con primerGs espec"icos! el AD@m de una de las protenas >m 4ue participan en el procesamiento del AD@ 1U% &/ 9+a$3 4ue es conservado entre los genomas eucariotes 1"igura %0 iz4uierda3$ En el cual se obtuvo el A+@ complementario a partir de AD@ resuspendido en agua tratada con dietil pirocarbonato 1carriles ) # ;. "igura %03 # en "ormamida 1carril 0. "igura %03$ >e observo 4ue se obtuvo mejor A+@c a partir de AD@ en agua<+EP7 al correr ste en una electro"oresis en gel de agarosa$ Fambin para el an(lisis densitomtrico de la imagen obtenida directamente con luz del transiluminador 1iz4uierda3! se invirti con el so"tIare del "otodocumentador 1derec'a3$ Esto para "ines de 'acer un mejor an(lisis densitomtrico # para visualizar las bandas con una ma#or resolucin! en las siguientes electro"oresis 1"igura %0 derec'a3$ La ampli"icacin de los AD@ mensajeros de 8sp&/! producto de los genes expresados se someti a electro"oresis en gel de agarosa # a un an(lisis densitomtrico invertido de las bandas obtenidas de A+@c 1"igura %;3. en el cual adem(s! se compar con un gene control 1'ouse<9eeping3 de la enzima gliceralde'ido "os"ato des'idrogenesa AA+P8 para su cuanti"icacin 1dato no mostrado3$ >e observa 4ue en el control 1carril %. "igura %;3 # en las dem(s temperaturas 1carriles ) a 03! se obtuvo una sola banda de A+@c de 8sp&/. lo 4ue indica la pureza del sistema! #a 4ue no se observa otra banda! ni degradacin alguna del ampli"icado. #a 4ue esta reportado 4ue 'a# polimor"ismo del gene de 8sp&/ en otras especies 1Cavatier et al$! %22&3$ Adem(s 'ubo di"erencias visibles en sus concentraciones #a 4ue tambin se observ 4ue a temperaturas de */ # *0 K7 1carriles * # ,. "igura %;3 se obtuvo la ma#or densidad! lo cual corresponde con los resultados obtenidos en el Testern blot! correlacionando las temperaturas tanto en la expresin del gene como del producto 1"igura %*3$ Se realiz una electro"oresis para calcular el tama6o del "ragmento ampli"icado 1"igura %-3$ >e calcul el peso molecular del "ragmento obtenido en base a marcadores moleculares de peso nucleotdico conocido 1carril %. "igura %-3 # se observ 4ue en todos los A+@c de 8sp&/ de "rijol! tenia un peso aproximado de **/ pb 1carril 0. "igura %-3$ >e tuvo como control! un producto ampli"icado con los

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mismos primerGs utilizados de 8sp&/! de A+@c proveniente de clulas de ovario de cabra. # el cual present un tama6o aproximado de %&*/ pb 1carril ). "igura %-3$ Fambin se puso un ampli"icado de 8sp&/ de cebada 1carril *. "igura %-3 # nopal 1carril ,. "igura %-3$ Esto es interesante! #a 4ue los primerGs ampli"icaron AD@ mensajeros para 8sp&/ de varias "uentes! lo cual indica 4ue es un gene mu# conservado en la escala "ilogentica$ Aun4ue en revisiones e"ectuadas 'asta la "ec'a! no se 'a reportado estudios similares! autores mencionan la expresin de protenas 8sp 4ue se expusieron a di"erentes tipos de estrs 1Milioni et al. )//%3. donde se encontr 4ue en lneas celulares de zana'oria la 8sp2/ se expresaba constitutivamente a )0 Y7 # 4ue a *- Y7 la induccin aumentaba con"orme se acrecentaba el tiempo de exposicin en una! dos # tres 'oras! cesando cuando se elevaba la temperatura a ,/ Y7$ Fambin 'a# datos en la literatura! de 4ue en los blot de protenas en tejidos de 'ojas de espinaca mostraban niveles de protenas 8sp&/ relativamente constantes con respecto a la actividad metablica durante el da 1Li et al. )///3$ Por otro lado! se encontr 4ue una lnea de maz resistente! PBL %*/,! puede

estar involucrada en el desarrollo de resistencia bajo condiciones de campo a la se4ua # al calor observadas en 8sp de ,0 9+a$ 1B'adula et al$! %22&3$ 8a# antecedentes 4ue para para inducir embriognesis en polen de !rassica napus es necesario aplicar estrs calrico severo # corto para iniciar la sntesis de +@A en clulas vegetales para complementar su ciclo celular # posterior divisin 1Binarova et al$! %22&3$ L se 'a demostrado previamente 4ue en 'ojas de "rijol con di"erentes grados de maduracin! la 8sp&/ localizada en la matriz mitocondrial declinaba sus niveles de 8sp! sugiriendo 4ue esta reduccin de niveles de 8sp&/ limitaba la importacin de protenas mitocondriales en tejidos vegetales maduros 1Moore et al$!%22&3$ +e estas revisiones e"ectuadas # de otras mencionadas anteriormente! se puede decir 4ue es necesario analizar # pro"undizar en los estudios de 8spXs para un mejor entendimiento de cmo las protenas de c'o4ue calrico actuaran no

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solamente por la exposicin de estrs calrico aplicado! sino tambin cmo a"ectara la exposicin prolongada de calor en di"erentes etapas del desarrollo vegetativo en el cultivo de "rijol$ Estos datos son el comienzo de una serie de estudios! para determinar si la expresin del AD@m # de la protena 8sp&/! es una medida con"iable para estimar el nivel de adaptacin del "rijol al estrs trmico$ L para explorar si existe 'omologa a nivel de "uncin entre las 8sp&/ expresadas en mam"eros # las de "rijol$

VI. CONCLUSIONES

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9. La temperatura a"ecta la expresin di"erencial de protenas 8sp&/ # de otras protenas de pesos moleculares similares al de las "amilias de 8sp! en embriones germinados sometidos a di"erentes temperaturas$ !. Por Testern blot se detect di"erencialmente la protena 8sp&/ en los embriones sometidos a estrs calrico # en los embriones en dormancia$ &. >e ampli"ic di"erencialmente el AD@ mensajero de 8sp&/! en los embriones sometidos a estrs calrico # en los embriones en dormancia$

LITERATURA CITADA

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DG

+e'#dratation +uring Enviromental >tress! Fimot# 5$ 7lose and Elizabet' A$ Bra#! eds! A>PP$ Mar#land! U>A! pp$ )),<),0$ R3/30131 L.# G62*6L31. S.# S6s.1s. S.# M3.ss, C.# D3603s ,.# 3?J3?. N.# M32E T.# JUU--,4U M.# P,11.10,2 J.# G322.;o C. 31; P2o,?,2 G. =!009>. 8eat< s'oc9 protein &/ antagonizes apoptosis<inducing "actor$ @ature 7ell Biolog#$ *123= -*2<-,*$ R3.so1 J.# P.E, C. 31; B,22( J. =9%F!>. AroIt' temperature<induced alterations in t'e t'ermotropic properties o" @erium olenader membrane lipids$ Plant P'isiolog#$! vol$ &/= )%0<)%-$ R3/,1 P.# E/,2- R. 31; E.5CCo21 S. =9%%%>. Earl# +evelopment o" t'e plant bod# in= Biolog# o" plants$ ;t' Ed$ T8 Creman W 7ompan# Tort' Publis'ers$ @eI Lor9 U>A! 7'$ )*= 000<0;2$ Ro*,2-so1 A.# IsC.E3Q3 M.# M35E,1J., S. 31; G6s-3 L. =9%%&>. +roug't<induced protein s#nt'esis in potato$ ?n Plant Desponses to 7elluar +e'#dratation +uring Enviromental >tress! Fimot# 5$ 7lose and Elizabet' A$ Bra#! eds! A>PP$ Mar#land! U>A! pp$ )-;$ SAGAR =9%%B>. Anuario Estadstico de la Produccin Agrcola de los Estados Unidos Mexicanos$ Mxico! +$C$ pp$ ,0<,-$ SAS I1s-.-6-, =9%%!> >A>J>FAF UserGs guide= >tatitics! release ;$/- edition$ >A> ?nstitute ?nc$! 7ar#! @7! U>A$ SEFOA =9%%B>. Estadsticas Agrcolas$ Mxico! +$C$ pp$ -<%/$ S35Cs M. O Ho D. =9%FB>. Alternation gene expression during enviromental stress in plants$ Annu$ Dev$ Plant P'#siol$! vol$ *&= *;*<*&;$ S31;o/34 J.# H631 H.# G322,- C. C30, D.# 31; CC3p?31# P. =9%%'>. @< Ac#p'op'atid#let'anolamine in dr# and imbibing cotton seeds$ Amounts! molecular species! and enz#matic s#nt'esis$ Plant P'#siolog#$! vol$ %/2= );2<)&0$ SC32?3 P. =9%%9>. Tater resources <An overvieI o" t'e Iorld deserts$ Ann$ Arid one$! vol$ */= )-*$ SC,32,2 J.# B,,;, D.# B6E4.1 R. 31; B23( D. =9%%9>. Enviromental modi"ications to reduce 'eat stress in dair# cattle$ Agri<Practice$! vol$ ,= %%<))$ S.,0,4 S. =9%%9>. Estadstica no Paramtrica! aplicada a las ciencias de la conducta$ Editorial Frillas! Mxico$ S.431.Eo/, N$ =9%F7>. ?mpact o" s'elter in 'ot mediterranean climate on "eed inta9e! "eed utilization and bod# "luid distribution in s'eep$ Appetite$! vol$ 2= )/&$ T3.J L. O ,.0,2 E. =9%%F>. >tress P'#siolg#$ ?n= Plant P'#siolg# ) nd$ Ed$ >inauer Associates! ?nc$ Publis'ers$ >underland! Massac'usetts$ U>A$ 7'$ )0= &)0<&0&$ ToQ*.1 H.# S-3C,4.1 T 31; Go2;o1 J. =9%7%>. Electrop'oretic trans"er o" proteins "rom pol#acrilamide gel to nitrocelulose s'eets= Procedure and some Aplications$ Proccedings @ational Academ# >cience$ U>A$ Pol$ -/= ,*0/<,*0,$

60

83203s A.# G2313;os J.# M32-:1,J L.# G7?,J C.# 6G.03 J.# S3403;o N.# H,21K1;,J# P.# H,s.D6.o R.# Ro;2:06,J R.# G3?*o3 R.# A45o5,2 8. 31; A213:J 8. =!000>. Lac9 o" association betIeen t'e pol#morp'ism at t'e 'eat<s'oc9 protein 18>P&/<)3 gene and s#stemic lupus er#t'ematosus 1>LE3 in t'e Mexican Mestizo population$ Aenes and ?mmunit#$ %1;3= *;&<*&/$ 8o1 E. =9%%'>. @euroendocrine integration o" stress and signi"icance o" stress "or t'e per"ormance o" "arm animals$ Applied Animal Be'avior >cience$! vol$ ,,= )%2$ M310 S.# PC31;,E32 J.# P364 P.# M.15C,s-,2 D. 31; Mo2.?o-o R. =9%%%>. A met'od "or t'e 4uantitative anal#sis o" 'uman 'eat s'oc9 gene expression using a multiplex DF<P7D assa#$ 7ell >tress W 7'aperons$ ,1*3= %0* < %;%$ M,45C M. F9%%!>. Mammalian stress response= cell p'isiolog#! structureJ"unction o" stresss proteins and implications "or medicine and disease$ P'isiolog# DevieI$ Pol$ &)= %/;*<%/-%$ M,45C M. O B2oQ1 R. =9%%B>. ?n"luence o" molecular and c'emical c'aperones on protein "olding$ 7ell >tress W 7'aperons$ %1)3= %/2 < %%0$ HoEo-3 S.# H.23-3 D.# M.1o-3 S.# H.03sC.(3?3 T.# P62.?o-o M.# H3130. H.# H623 T. 31; P6*o-3 H. =!000>. Autoantibodies against c'aperonin 77F in 'uman sera Iit' r'eumatic autoimmune diseases= comparison Iit' antibodies against ot'er 8sp;/ "amil# proteins$ 7ell >tress W 7'aperons$ 01,3= **& < *,;$ HosC.;3 M.# E1;o T# I-o P.# HosoE3Q3 N. 31; N303-3 P. =9%%%>. +#namics and regulation o" t'e stress response= meeting report on t'e stress response and molecular c'aperones "rom O#oto$ 7ell >tress W 7'aperons$ ,1%3= ;; < &,$

6A

APINDICE

So465.71 ;, T2.s)C4 '00 ?M# pH 7." Pesar ;$/0 g de Fris base 1/$0 M3 # disolver en 0/ mL de agua! luego ajustar a p8 de &$, con (cido clor'drico concentrado # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a ,K7$ B6<<,2 ;, EL-2355.71 NET)! Mezclar /$-& g de cloruro de sodio 1%0/ mM3! %/ ml de Fris<7l 0// mM p8 &$, 10/ mM3 # 0// L de @onidet @P<,/ ?gepal 1/$0 B3$ A"orar a %// mL con agua destilada # esterilizar en autoclave a %)%K7 por %0 minutos$ Almacenar a ,K7$ A063 D.,-.4p.2o532*o13-o =DEPC> 4.*2, ;, RNAs3s Adicionar en % litro de agua destilada %// L de dietilpirocarbonato 1/$/% B3 # dejar en agitacin toda la noc'e! despus esterilizar en autoclave a %)%K7 por %0 minutos # luego almacenar a ,K7$ So465.71 ;, ,-31o4 34 7' V ,1 3063 DEPC Mezclar en un tubo estril &$0 mL de etanol 1&0 B3 # )$0 mL de agua +EP7$ Fapar # almacenar a ,K7$ So465.71 ;, 54o262o ;, so;.o 9'0 ?M +isolver /$-& g de cloruro de sodio 1/$%0 M3 en %// mL de agua destilada$ Almacenar a ,K7$ So465.71 s-o5E B23;<o2; Mezclar %/ mL de etanol al 20 B! )/ mL de (cido "os"rico al -- B # *0 mg 1$/*0 g3 de azul brillante de 7oomassie A<)0/$ Almacenar en "rasco (mbar$ Esta solucin es estable inde"inidamente a temperatura ambiente$ 62

So465.71 ;, -23*3+o B23;<o2; Mezclar ,)$0 mL de agua destilada! %$0 mL de etanol al 20 B! *$/ mL de (cido "os"rico al -- B # *$/ mL de la solucin stoc9 Brad"ord$ +espus "iltrar en papel "iltro 1T'atman @o$%3 # almacenar a ,K7 en un "rasco (mbar$ Estable por un par de meses! luego debe se "iltrada nuevamente! para su uso$

C62/3 p3-271 ;, p2o-,:13 P2o5,;.?.,1-oA %3 Preparar una solucin est(ndar de albHmina srica bovina a una concentracin de % mg por mililitro! pesar $/% g 1%/ mg3 de sta protena # disolver en %/ mL de @a7l %0/ mM. 'acer alicuotas de % mL # almacenar a <)/ K7! para su posterior uso$ )3 7olocar en una serie de tubos eppendor"! di"erentes concentraciones de la solucin est(ndar de protena! adicionando el @a7l %0/ mM 1/$%0 M3 necesario para tener un volumen de -// L! como se muestra en la tabla 1'acer por triplicado3$ D,-344, ;, /34o2,s p323 2,34.J32 43 562/3 p3-271 ;, p2o-,:13s. N!. 1e $'A! 0 =&lanc"> A 2 B C D 6 E F G A0 C&!r'r! 1e %!1,! 0./) M S$!*> 1e +&AG",n+ H/"=("LI C!n*en$r+*,-n .,n+& 1e #r!$e0n+

F00 L EGG L EGD L EG0 L EFD L EF0 L EED L EE0 L E6D L E60 L EDD L

0 L A L D L A0 L AD L 20 L 2D L B0 L BD L C0 L CD L

0 1 A 1 D 1 A0 1 AD 1 20 1 2D 1 B0 1 BD 1 C0 1 CD 1 6B

C7RVA 4ATRON DE ALB7MINA SERICA BOVINA

/ 0/ %// %0/ )// )0/

/$,

Den%,1+1 O#$,*+ H)D)n"I

/$*

LZAUB[V Param Palor sd A /$%;2) /$//0*) B /$/%,&, /$//-% D Z /$222) \///% )$))-%)E<,

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Pr!$e0n+ HJ= "& 3/I

*3 Adicionar a cada tubo )// L de la solucin de trabajo Brad"ord para tener un volumen "inal de % mL! luego vortexear$ ,3 +ejar reposar durante * minutos$ 03 +espus ajustar a cero con el blanco # leer la absorbancia en luz visible a una longitud de onda de 020 nm$ Ara"icar la densidad ptica versus la concentracin de protena$ +espus interpolar la densidad ptica obtenida de la muestra problema en la gr("ica 'acer los siguientes c(lculos utilizando la ecuacin de una recta$ Por ejemplo! si la densidad ptica "ue de /$)/2! este valor 'a# 4ue sustituirlo en la sig$ "ormula= LZ aUbx. despejando nos 4uedara 4ue xZ #<aJb. luego sustitu#endo los valores obtenidos a partir de una regresin lineal de los valores de la curva patrn por el mtodo de mnimos cuadrados! tendramos /$)/2</$%;2)J/$/%,&, Z )$&! luego dividir este resultado entre la dilucin si es 4ue la 'a#$ Ej= )$&J0 4ue son los microlitros de la muestra problema! nos dara /$0, g de protena por microlitro! #

6C

por Hltimo se calcula la concentracin total de protena por mililitro de muestra! la cual para este caso sera de 0,/ gJmL Z /$0, mgJmL$ B6<<,2 MOPS =&)WN)?o2pCo4.1oX)p2op31,s64<o1.5 35.;> 90 X +isolver en %// mL de agua destilada ,$%- g de MEP> 1/$) M3! /$;- g de acetato de sodio 1/$//0M3 # /$*& g de E+FA 1/$/% M3$ Almacenar a temperatura ambiente o a ,K7 protegido de la luz$ B6<<,2 ;, 5o22.;3 o ,4,5-2o<o2@s.s MOPS 9 X Mezclar %/ mL de bu""er MEP> %/ V U 2/ mL de agua dietilpirocarbonato 1+EP73$ Auardar a ,K7$ B6<<,2 ;, ?6,s-23 p323 ARN =;,s13-6234.J3;o> Mezclar en un tubo estril &$0 mL de "ormamida! %$; mL de bu""er MEP> %/ V! )$; de "ormalde'do 1*& B3! %$- mL de agua +EP7! /$- mL de glicerol # /$- mL de azul de bromo"enol al % B$ 8acer alcuotas de 0// L # almacenar a <)/K7$ B6<<,2 TAE '0 X +isolver ),) g de Fris base 1,/ mM3 # *&$) g de E+FA<@a ))8)E 1)mM3 en 2// mL de agua destilada$ Adicionar 0&$% mL de (cido actico glacial # ajustar el volumen "inal con agua a % litro$ Fomar ) mL de este bu""er 0/ V # a"orar en %// mL de agua destilada para 'acer FAE %V$ Almacenar a temperatura ambiente o a ,K7$ B6<<,2 TBE 90 X +isolver %/- g de Fris base # 00 g de (cido brico en 2// ml de agua destilada$ Adicionar ,/ ml de E+FA<@a )8 )E /$0M! p8 -$/ 1+isolver %-$;% g de E+FA en -/ mL de agua! ajustar p8 -$/ con @aE8 # a"orar a %// mL3$ Ajustar el volumen "inal a % litro con agua$ Mezclar %/ mL de esta solucin! m(s 2/ mL de agua destilada para 'acer FBE %V$ Almacenar a temperatura ambiente o a ,K7$

6D

So465.71 ;, *2o?62o ;, ,-.;.o 90 ?0/?4 Adicionar /$% g de bromuro de etidio 1cancergeno3 a %/ mL de agua destilada! mezclar bien # 'acer alicuotas de % mL en tubos ependor"" 1cubiertos con papel aluminio3$ Almacenar una alicuota 1en uso3 a ,K7 # el resto a <)/K7$ Usar guantes # evitar in'alacin$ So465.71 ;, 3J64 ;, *2o?o<,1o4 34 9 V +isolver /$% g 1%// mg3 de azul de bromo"enol en %/ mL de agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$ So465.71 ;, L(4,1o 5.31o4 34 90 V +isolver % g de xileno cianol en %/ mL de agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$

B6<<,2 ;, ?6,s-23 p323 K5.;os 1654,:5os =ADN ( ARN> Para preparar %/ mL de bu""er adicionar % ml de azul de bromo"enol al % B 1/$% B3! % mL de xileno cianol al %/ B 1% B3! 0 mL de glicerol 10/ B3! )// l de bu""er FAE 0/ V 1% V3 # )$&0 mL de agua destilada$ Mezclar bien # dividir en alicuotas de % mL # almacenar a <)/K7$ Usar ) L de este bu""er por cada %/ L de la muestra$ Para AD@ adicionar %mM de E+FA U ) mL de >+> al %/B # a"orar en agua +EP7$ So465.71 ;, 352.43?.;3 =&0A0.F V> +isolver */ g de acrilamida! m(s /$- g de bis<acrilamida # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a ,K7 en "rasco (mbar$ Usar guantes # cubrebocas! #a 4ue la acrilamida es neurotxica en polvo solucin$ So465.71 ;, T2.s)C4 9.' M# pH F.F

66

Pesar %-$) g de Fris base # disolver en ;/ mL de agua$ Ajustar a p8 -$- con 87l concentrado$ A"orar a %// mL con agua destilada # almacenar a ,K7$ So465.71 ;, T2.s)C4 0.' M# pH B.F Pesar ;$/0 g de Fris base # disolver en ,/ mL de agua$ Ajustar a p8 ;$- con (cido clor'drico concentrado$ A"orar a %// mL con agua # almacenar a ,K7$ SDS 34 90 V +isolver %/ g del detergente duodecil sul"ato de sodio en 2/ mL de agua destilada$ 7alentar a ;-K7 para disolver bien # ajustar el p8 a &$) con 87l$ A"orar a %// mL con agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$ PSA 34 90 V Pesar /$0 g de persul"ato de amonio # disolver en 0 mL de agua$ Almacenar alicuotas de 0// microlitros en tubos eppendor" cubiertos con papel aluminio para proteger de la luz # almacenar a <)/K7$ +ejar un vial a ,K7 para su uso$ 7uadro 4ue muestra las cantidades necesarias! para realizar un gel separador a di"erentes concentraciones de poliacrilamida$
P!r*,en$! 1e& =e& A*r,&+",1+ =HKBQ-L> Tr,%3C& /.) M #E C.C A='+ =E.DI8KBQ -L> SDS +& /0 8 PSA +& /0 8 Te"e1

9.) 8
A.D0 -L 2.D0 -L D.F0 -L 200 L D0 L 6 L

<8
2.00 -L 2.D0 -L D.D0 -L 200 L D0 L E L

B8
2.BD -L 2.D0 -L D.AD -L 200 L 60 L F L

C8
2.E0 -L 2.D0 -L C.F0 -L 200 L 60 L F L

D8
B.00 -L 2.D0 -L C.D0 -L 200 L 6D L G L

/0 8
B.BD -L 2.D0 -L C.AD -L 200 L 6D L G L

// 8
B.E0 -L 2.D0 -L B.F0 -L 200 L E0 L A0 L

/5 8
C.00 -L 2.D0 -L B.D0 -L 200 L E0 L A0 L

La%--l 7. R., AGE0.

B6<<,2 ;, 5o22.;3 7 ,4,5-2o<o2@s.s 9 X Mezclar %// mL de bu""er de corrida %/ V! m(s 2// mL de agua destilada # m(s % g de >+>$ Almacenar a temperatura ambiente$ Este se puede reusar 'asta 0 veces$ B6<<,2 ;, 5o22.;3 7 ,4,5-2o<o2@s.s 90 X

6E

+isolver */ g de tris base! m(s %,, g de glicina en una cantidad de agua destilada$ A"orar a % litro # almacenar a temperatura ambiente$ B6<<,2 ;, ?6,s-23 p323 p2o-,:13s Para preparar )/ mL de bu""er= adicionar )$0 mL de solucin de Fris<7l /$0 M! p8 ;$- 1/$/;)0 M3! ,$/ mL de >+> al %/ B 1) B3! %$/ mL de Bis<mercaptoetanol 10 B3! -$/ mL de glicerol 1%/ B3! )/ L de azul de bromo"enol al % B 1/$//% B3 # ,$0 mL de agua destilada$ Mezclar bien # 'acer alicuotas de % mL $ Almacenar a <)/K7$

So465.71 <.+3;o23 p323 -.15.71 ;, Coo?3ss., Mezclar %)0 mL de metanol isopropanol 1)0 B3! con 0/ mL de (cido actico glacial 1%/ B3 # a"orar a 0// mL con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$

So465.71 ;, -.15.71 2Kp.;3 ;, 3J64 ;, Coo?3ss., Mezclar /$/; g de azul brillante de 7oomassie A A<)0/ 1/$//; B3 con %// mL de (cido actico glacial 1%/ B3 # a"orar a % litro con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente en "rasco (mbar$

So465.71 ;,s-,G.;o23 ;, K5.;o 35@-.5o 34 90 V Mezclar 0/ mL de (cido actico 1%/ B3 con ,0/ mL de agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$

So465.71 ;, s,53;o p323 0,4,s ;, po4.352.43?.;3 Mezclar 0/ mL de (cido actico 1%/ B3 con %0 mL de glicerol 1* B3 # a"orar a 0// mL con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$

So465.71 ;, ToQ*.1

6F

Mezclar *$/* g de tris base 1)0 mM3! %,$, g de glicina 1%2) mM3! )// mL de metanol 1)/ B3 # a"orar a % litro con agua destilada$ +ebe dar aproximadamente un p8 de -$*$ Almacenar a temperatura ambiente$ So465.71 ;, /,2;, 2Kp.;o =F3s- G2,,1> Mezclar /$% g de colorante "ast green 1/$% B3! 0 mL de (cido actico 10 B3! %/ mL de metanol 1%/ B3 # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a temperatura ambiente en "rasco (mbar$ So465.71 ;, P!HPO" 9 M =7 ;, N3!HPO"> 22$*& g de "os"ato de potasio dib(sico 1P$M$Z %,%$2;3 se disolvieron poco a poco en agua destilada # se a"or a &// mL$ 7alentar la solucin un poco para disolver los grumos$ So465.71 ;, PH!PO" 9 M =7 ;, N3H!PO"> )&$)) g de "os"ato de potasio monob(sico 1P$M$Z %*;$%3 se disolvieron poco a poco en agua destilada # se a"or a )// mL$ 7alentar la solucin un poco para disolver los grumos$ So465.71 5o15,1-23;3 ;, PBS '0 X A &// mL de solucin de O )8PE, % M! ajustar el p8 a &$, con aproximadamente %0/ mL de solucin de O8 )PE, % M$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.71 ;, PBS 9 X Mezclar )/ mL de la solucin concentrada de PB> 0/ V! m(s &$02 g de cloruro de sodio # a"orar a % litro con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.71 ;, PBS)4,5C, Mezclar * g de lec'e descremada 1* B3 con calcio 1marca >velt# de @estle3 en %// mL de solucin de PB> % V$ Preparar en "resco$

6G

So465.71 ;, PBS)TQ,,1 Mezclar % mL de FIeen<)/ 1/$% B3 en % litro de PB> % V$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ GLOSARIO
An.%! (% Cr !." Sc (" (%!"8 rr &"n,cl3 c" Sc (" (%!"8 rr &"n,cl3 c" c"-'l%-%n.ar " (% ("&l% ca(%na ='r"(,c." (%l 4CR> Sc (" r &"n,cl3 c" -%n!a0%r" B"$ n% !%r,- al&,- n% =al&T- na !3r ca &"$ na> Ca.6l"1" D%n! (a( )'. ca D (%"8 n,cl3". ("! D %. l ' r"car&"na." Gra("! c%n.21ra("! Gra-"! Gra$%(a(%! ;%a. !5"c< c"1na.%! ='r".%2na (% c5"+,% cal)r c" c"n!. .,. $a> ;%a. !5"c< 'r".% n! ='r".%2na! (% c5"+,% cal)r c" ) .3r- c"> ;%a. !5"c< :ac."r =:ac."r ac. $a("r (% la .ran!cr 'c )n (% la! ;!'> ;*(r"c5l"r (% ac ( =Sc (" cl"r52(r c"> R l"&a!%! R l"(al."n%! R l"1ra-"! R l)-%.r"! L .r"! M%.r"! M cr"1ra-"! M cr"l .r"! M cr"-"lar M l 1ra-"! M l l .r"! M l2-%.r"! M l -"lar M n,."! M"lar M"r'5"l n"I'r"'an%!,l:"n c ac ( =6c (" 'r"'an"!,l:)n c"I-"r:"l n"> Nan)-%.r"! N"r-al NT-%r" 4ar%! (% &a!%! 4%r!,l:a." (% a-"n " 4%!" -"l%c,lar 4"l*-%ra!% c5a n r%ac. "n =r%acc )n %n ca(%na (% la '"l -%ra!a> 4"rc %n." R%$%r!% .ran!cr '.a!%J4"l*-%ra!% c5a n r%ac. "n =R%$%r!a .ran!cr '.a!aI4CR> R%$"l,c "n%! '"r - n,." R &"n,cl%"'r".%2na! -%n!a0%ra! 3. C. ADN ADN5 ARN? BSA C3-. D. O. ;NTP DEPC NC 0 g Hs5 Hsp Hs< HC4 P* ED3 E0 E? L ? 0 L M ?0 ?L ?? ?M ?.1 M MOPS 1? N No. p* PSA P. M. PCR V RT)PCR 2p? RNP?

E0

S%1,n("! S-all 5%a. !5"c< 'r".% n! ='r".%2na! (% c5"+,% cal)r c" '%+,%?a!> S"( ,- (,"(%c l !,l:a.% =(,"(%c l !,l:a." (% !"( "> 7l.ra$ "l%.a V%r!,! =c"n.ra> V"l,-%n

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