Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer

PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES ET DES ANIMAUX TRANSGENIQUES
Pourquoi les cellules de mammifres ? - Elles permettent la production de protines complexes : anticorps et facteurs de coagulation. Fabrication de vaccins recombinants, facteurs sanguins. - Amlioration de lexpression des protines par rapport aux autres systmes : - glycosylation : la N-glycosylation est possible dans les lignes cellulaires de mammifres - repliement des protines. Nombre de protines recombinantes (biomdicaments) produites dans les diffrents systmes : 39% de cellules de mammifres, 29% de cellules dE. coli, 18% de Saccharomyces, 11% de cellules hybrides, trs peu de cellules dinsecte ou de cellules danimaux transgniques.

I. Production dans des cellules

1. Les lignes de cellules de mammifres utilises
Ligne BHK 21 NSO CHO HEK 293 Nature Cellules de rein de hamster syrien Mylome murin de souris Cellules dovaires de hamster chinois Cellules de rein dembryon humain Mode de croissance Adhrentes En suspension Adhrentes Adhrentes, certaines en suspension

Les lignes cellulaires de mammifres sont rpertories par lECACC (europen) et ATCC (amricain).

2. Autres types cellulaires

Cellules souches somatiques Cellules souche embryonnaires Culture de cellules primaires

3. Les vecteurs utiliss dans les cellules de mammifres

- Plasmides - Adnovirus - Rtrovirus : virus de la leucmine murine de Moloney, lentivirus - Baculovirus

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer a) Les plasmides Les plus courants : pcDNA, pIRES. b) Les adnovirus Virus non envelopp ADN db, linaire de 30-38 kb Htes naturels de lhomme pour certains, utilisation des srotypes 2 et 5 (non tumorignes, non oncognes) Large tropisme Gnome adnoviral code 11 protines diffrentes. Gne prcoce E, gne tardif L. Dltion de la rgion E1/E3 pour lutilisation comme vecteur. E1/E3 code pour la capside virale, qui est reconnue par les Ac. Si on enlve ces lments, le plasmide nest pas reconnu et on peut lutiliser comme plasmide. Ces vecteurs adnoviraux permettent dinsrer jusqu 8 kb dADN tranger. Ladnovirus recombin est utilis pour transfecter des cellules (HEK 293 modifies pour produire les protines E1, ventuellement E3). Dans ces cellules, lADN viral est rpliqu et les protines virales sont produites. Les virions forms sont rcolts et serviront transduire les cellules dans lesquelles on souhaite exprimer le transgne. Ladnovirus recombinant peut infecter de nombreux types cellulaires (en prolifration, mais aussi quiescents). Aprs transduction virale de la cellule hte, prsence de nombreuses copies du virus. Ceci permet une forte expression transitoire du transgne. Les gnes viraux ne sont pas exprims (absence des protines transactivatrices E1 et E3 parfois. Le transgne est exprim partir dun pCMV. Exemple dun vecteur adnoviral : systme Clontech : Adeno X Le gne dintrt va tre insr dans un plasmide. Rgions importantes pour le mettre sur ladnovirus. On obtient un gne recombin avec le gne dintrt. Le plasmide shuttle sera coup par des enzymes de restriction particulires : Pi-Sce I qui reconnait une squence relativement longue donc probabilit de coupure relativement faible. Quand on a multipli le vecteur pShuttle2, on met lenzyme de restriction et on va peut-tre retrouver une ou 2 coupures. On rcupre ainsi le morceau quon va rajouter sur ladnovirus par un systme de clonage classique. Les 2 lments sont mlangs, on fait une ligation in vitro et on rajoute lenzyme Swa I. Swa coupe le fragment de ladnovirus qui est suppos tre la place du fragment quon veut rajouter. Sans cette enzyme, il y a comptition entre les 2 fragments, en prsence de lenzyme ce nest plus le cas. Transformation E. coli et purification, puis Pac I qui va linariser.

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer Ensuite mthode de transfection pour faire rentrer le plasmide dans le vecteur HEK. Ce sont les cellules HEK qui permettront de donner les adnovirus recombins. Purification des Adnovirus recombinants : Recueil des plages de lyse : caractrisation du vecteur, amplification dans les cellules 293 et clatement des cellules. Purification sur gradient de CsCl et dialyse. Caractrisation finale : - vrification de la structure de ladnovirus recombinant - titration des particules virales - vrification de labsence de particules adnovirales rplicatives. c) Les rtrovirus Famille de virus envelopps ARN trouve chez tous les vertbrs. Sintgrent dans lADN de la cellule hte. Outils puissants pour infecter tout type de cellules de mammifres en division ou en quiescence. Les diffrents types de rtrovirus -rtrovirus : virus simple Voir schma Lentivirus et spumavirus : organisation plus complexe avec gag pol env plus dautres gnes codant des protines virales. Vecteurs drivs des rtrovirus Rtrovirus MoMLV (virus de la leucmie murine de Moloney) Remplacement des gnes gag pol env par le transgne. On peut infecter des virus en prolifration mais pas en quiescence. Encapsidation du gne thrapeutique dans la capside et lenveloppe virale ADN plasmidique sur lequel on a mis la construction avec le site dencapsidation, le LTR et le gne dintrt. On transfecte : par lectrophoration ou par un autre moyen on amne lADN dans la cellule, pour former des virus recombins. LADN porte va sintgrer dans la cellule dencapsidation. Permet 2 choses : la transcription du gnome et lexpression des diffrentes protines qui sont celles de la capside, synthtises dans le cytoplasme. On reforme lencapsidation cd lADN va tre entour de la capside viral, qui sort par bourgeonnement. Rtrovirus infectieux rplication-incomptent qui servira juste vhiculer le morceau de gne. Voir schma

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer Transduction de cellules cibles et expression du gne thrapeutique Rtrovirus recombinant : aprs infection, on retrouve la capside lintrieur de la cellule cible, ainsi que lARN qui va tre rtrotranscrit grce la transcriptase inverse en ADN db, pour sintgrer dans la cellule cible. Voir schma Les vecteurs rtroviraux : - si le vecteur rtroviral driv de MoMLV : transfection des cellules en mitose uniquement. - Pour la transfection de cellules quiescentes : utilisation de vecteurs drivs des lentivirus qui prsentent des squences permettant le transport du gnome viral travers la membrane nuclaire (cPPT = central polyurine tract). Les vecteurs rtroviraux permettent : - La transduction de nombreux types cellulaires (cultures primaires, cellules souches) - Lobtention dune expression stable par intgration du transgne dans le gnome de la cellule hte, taux dexpression dpend du lieu dinsertion.

4. Rgulation de lexpresson dans les cellules de mammifres

a) Le systme TetOn / TetOff (Clontech) Le systme TetOff En amont du promoteur, TREMOD va reconnaitre une molcule tTa qui est une protine transactivatrice hybride form du domaine de liaison lADN de tetR associ 3 units du domaine transactivateur de la protine VP16 de HSV. Se lie en absence de ttracycline. Fonctionne pour activer la transcription. La transcription du gne se fait en absence de ttracycline : il y a un site de fixation sur tTa, si la tetracycline se fixe, TRE inhibe la transcription. Voir schma Dans TetOff : transcription du transgne en absence de ttracycline. Le systme TetOn La construction de dpart est la mme, llment TRE est modifi. Cest surtout le rpresseur qui est modifi de ne manire se fixer la TRE uniquement quand il y a de la ttracycline ou de la doxycycline.

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer rtTa : protine transactivatrice forme du domaine de liaison lADN de tetR associ 3 units du domaine transactivateur de la protine VP16 de HSV. Voir schma Dans TetOn : La transcription du gne ne se fait quen prsence de ttracycline. Il faut que rtTa soit prsent. Remarque : dans ce systme inductible, ncessit dutiliser des cellules exprimant la protine transactivatrice. HEK (ou autres cellules modifies).

5. Protines dintrt thrapeutiques produites dans des cellules de

mammifres
a) Production de lactivateur tissulaire du plasminogne = tPa = protase srine Dissolution des caillots sanguins par action sur la fibrine. t-Pa est un agent fibrinolytique puissant administr lors dinfarctus du myocarde, embolie pulmonaire, AVC dorigine ischmique. Un dficit en t-Pa mne un risque accru de thromboses. Son mode daction : Transformation du plasminogne en plasmine par le t-Pa. La plasmine active la dgradation de la fibrine en produits de dgradation de la fibrine. Voir schma La spcialit : lAltplase, obtenu par gnie gntique, est une glycoprotine de 527 acides amins, 335 cystines, 14 ponts disulfures et de nombreux sites de glycosylation. Identique lactivateur tissulaire du plasminogne ou t-Pa. Premier mdicament produit commercialement partir de culture de cellules de mammifres en 1987 par Genentech. Rserv lusage hospitalier, administr par voie IV, cot denviron 2200 $/100 mg. La production dans les CHO (hamsters chinois) cote environ 10 000 $/g.

II. Production de protines recombinantes partir danimaux transgniques

Animal transgnique : animal dont le patrimoine gntique a t modifi par lhomme. Notamment la souris, le lapin, le porc, le mouton.

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1. Principe gnral
On utilise le gne naturel chez lanimal qui code la bta casine : en vert le promoteur de la bta casine. On rajoute le gne tranger. On fabrique une structure hybride pour mettre le nouveau gne sous contrle du promoteur de la bta casine. Production de protines recombinantes grce diverses techniques de transgnse. Voir schma

2. Les diffrentes techniques de transgnse

a) Microinjection dADN dans un pronuclus But : intgrer ce nouvel ADN dans le chromosome. Exemple de la souris - Traitement hormonal de la souris femelle - Accouplement des souris mle et femelle - Prlvement et slection des ovules fconds : pronuclus mle et femelle - Micro-injection directe de la solution dADN dans le pronuclus mle - Rimplantation de lembryon micro-inject dans loviducte de la souris Tous les souriceaux nauront pas intgr le transgne mais si la recombinaison homologue se fait : intgration du matriel apport dans le matriel gntique. - Gnotypage de la descendance : prsence du transgne rvle par les fragments obtenus par PCR - Extraction de la protine recombinante (dans le lait gnralement) Voir schma Daprs le schma de la PCR : les souris 1 et 2 sont qualifies danimaux fondateurs (gnration F0). Le pourcentage de russite varie de 0 20%. La ligne germinale est stable. b) Technique ICSI LICSI (intracytoplasmic sperm injection) est largement utilise en clinique comme mthode de reproduction mdicalement assiste dans le cas de strilit humaine dans les laboratoires pour des recherches sur la reproduction. But : introduction dun spermatozode (aprs mise en contact avec lADN tranger) dans le cytoplasme dun ovocyte. Principal avantage de lICSI : possibilit dobtenir de longs fragments dADN avec une efficacit relativement bonne en comparaison avec linjection dans les pronucli.

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer - Prlvement des spermatozodes : une fois prlevs, ils seront mis en contact avec lADN tranger dans un milieu de culture. - Recueil des ovocytes : injection dhCG pour permettre lovulation et ainsi avoir un ovocyte mature. Prlvement de lovocyte au stade mtaphase II (prsence dun globule polaire). - ICSI : un spermatozode sera directement inject dans le cytoplasme de lovocyte laide de pipettes en verre trs fines. Un microscope quip dune excellente optique et une paire de micromanipulateurs seront ncessaires. Ensuite le processus de la fcondation se poursuit come une fcondation naturelle (in vitro). Si la fcondation (la fusion de noyaux des 2 gamtes) a eu lieu normalement, on peut observer aprs linjection, la prsence des deux pronucli au centre du cytoplasme et la prsence du deuxime globule polaire dans lespace privitellin. Introduction des embryons chez des femelles receveuses. La descendance porte dans son gnome le gne tranger (taux de russite : 20%). c) Linfection virale Rcupration des cellules de la morula, infection virale par lments rtroviraux. d) Transgnse via le transfert de noyau Le clonage par transfert de noyau a donn naissance la brebis Dolly. Transfert dun noyau dune cellule diffrente dans une cellule nucle. On obtient le noyau dune cellule diffrencie dans un environnement diffrent : reprogrammation gntique. Principe : cellules gntiquement modifies, puis slectionnes comme donneuses de noyau pour raliser des clonages. Polly : premier mammifre clon transgnique. Facteur IX de la coagulation humain. Protocole : - Isolement des cellules somatiques ou pluripotentes, mise en culture - Des cellules sont transfectes avec un vecteur permettant laddition ou le remplacement de gne. - Slection des clones porteurs du gne tranger par une double slection positive et ngative. - Introduction du noyau ou de la cellule slectionne dans le cytoplasme dun ovocyte nucl Formation dun embryon complet. - Introduction de lembryon dans une mre adoptive e) Utilisation des cellules souches embryonnaires Cellules du stade blastocyste : cellules pluripotentes puisquelles peuvent donner les 3 feuillets embryonnaires. Cellules non diffrencies. Elles sont caractrises par 2 proprits majeures : - lauto-renouvellement : population pure de cellules indiffrencies pendant de longues priodes de culture - la pluripotence : capacit de gnrer tous les types cellulaires de lorganisme.

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Gnie gntique 8 Mme Kilhoffer Un outil idal pour la thrapie cellulaire et la production danimaux transgniques. Le gnome de ces cellules peut tre modifi en culture. On peut : - supprimer un gne (knock-out = invalidation gnique), - remplacer un gne (knock-in), - apporter un nouveau gne (transgnse additive). Les souriceaux dintrt sont ceux qui ont intgr la nouvelle squence dans les cellules germinales (ovules ou spermatozodes). La couleur agoutie est dominante sur la couleur noire. +/- = htrozygote. Voir schma Inconvnients : - mthode longue - applicable uniquement des animaux prolifiques - trs utilise pour la souris - pas de succs chez les grands animaux.

III. Exemples de protines produites dans lanimal

1. Lantithrombine
Lantithrombine AT : inhibiteur de la protase qui clive la prothrombine en thrombine, une substance qui joue un rle essentiel dans le processus de la coagulation sanguine. Chvres transgniques possdant le gne humain de lAT, produit de lAT recombinante dans le lait. ATryn : premire molcule commerciale obtenue partir de chvres transgniques. AMM le 26 juillet 2006 en Europe, accord FDA en 2009 (USA). Prvention des accidents thromboemboliques chez les patients atteints de dficience hrditaire de production dT (pathologie touchant 1/5000). On peut produire des quantits trs importantes par cette technique.

2. Le facteur IX
Le facteur de coagulation IX est une protine dont le rle est essentiel dans la rgulation de la coagulation du sang. Sa dficience entraine une hmophilie. 1997 : naissance de la brebis Polly, la premire brebis transgnique clone produite par la technique de transfert nuclaire -> protine facteur de coagulation IX dans le lait.

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3. Les anticorps recombinants

Les chaines lgres L sont formes de 2 domaines : - un domaine variable VL - un domaine constant CL. Les chaines lourdes H comportent : - un domaine N-terminal variable (VH) - 3 ou 4 domaines constants (CH). Evolution structurale des anticorps monoclonaux usage thrapeutique. Murin chimrique (partie variable de murin) humanis humain. On peut produire des chaines dIg totalement humaines chez les animaux. Principe de la production danticorps humain par la Xenomouse : voir schma Cellules ES murines : - inactivation des gnes murins codant la chaine lourde IgH et inactivation des gnes murins codant la chaine lgre Igk souche de souris immunodficiente incapable de produire des anticorps murins - introduction du locus humain IgL et introduction du locus humain IgH souche de souris produisant des anticorps humains et murins. On croise les deux souris obtenues souche de souris produisant des anticorps humains = Xenomouse. Plusieurs techniques appliques pour le transfert des gnes dans un animal : Elles se diffrencient par leur plus ou moins bonne adaptation aux diffrentes catgories danimaux et par lefficacit de la transgnse. Avantages : Ces techniques permettent lintgration dun gne tranger dans une cellule. Les sources naturelles de protines mdicamenteuses sont limites, ncessit de produire par dautres moyens certaines protines vise thrapeutique. Cette technique permet de produire des protines modifies afin daugmenter par exemple lefficacit de la molcule mdicamenteuse (en modifiant par exemple quelques AA). Animaux transgniques Souris Lapin Chvres Vache Quantit de protines recombinantes produites dans le lait 1g 1 kg/an 1 kg 1 tonne/ an Plusieurs tonnes/an

Inconvnients : Faibles taux de production, de fcondation et de dveloppement de ces animaux. Parmi les premiers individus transgniques dune igne, bon nombre sont des animaux mosaques = ils sont porteurs dans certaines cellules seulement du transgne en question.

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