Cromatograf a de Lquida High Performance Liquid Chromatograp de Alta hy Eficiencia

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia? Tipos de Cromatografa Lquida Diagrama de un Sistema de HPLC Eleccin del Solvente Bombas Programacin del Solvente Sistemas de Inyeccin de muestra Columnas y Fase Estacionaria Deteccin Derivatizacin Anlisis Cualitativo y Cuantitativo Problemas ms comunes encontrados en HPLC Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC Referencias Bibliogrficas recomendadas

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia?

Tipos de Cromatografa Lquida

Cromatografa de Particin. Cromatografa de Adsorcin Cromatografa Inica Cromatografa de Exclusin

Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

Elecccin del Solvente

Caractersticas:

Disponible comercialmente Precio Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatogrfica. Bajo contenido de impuresas. Disolver la muestra Misible con otros solventes para formar mezclas tiles No degradar o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan detectores UV)

Filtracin y Desgasificacin de solventes

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laborario Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatografos lquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver. Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden acumular partculas en suspencin que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspencin pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a partculates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos. En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito

solvente y su almacenamiento en estos depsitos mseste fenmeno. El Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente. Mtodos de Filtracin de Solventes en HPLC Hay tres(3) mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de los Solventes en HPLC :

Filtro a la Entrada del Solvente Filtracin al Vaco Filtracin en Lnea

Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC Existen cuatro(4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:

Sonificacin Burbujear Helio Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo Desgasificacin al Vaco en Lnea

Bombas
Requisitos o aspectos ms importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. Mantener el flujo libre de pulsaciones Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) Control y reproducibilidad del flujo de solvente Componentes de la bomba resistentes a la corrosin

Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar segn su funcionamiento y diseo en:

Mecnicas

Recprocantes De desplazamiento contnuo Neumticas

o o

Programacin del Solvente

Existen dos mtodos de programacin de Solvente en HPLC:
o o

Isocrtico Gradiente de Elucin. Es un trmino que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composicin de la fase mvil. Pueden efectuarse de dos maneras: A baja presin A alta presin Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se debe tener presente dos objetivos:

Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible. Asegurar alta presicin y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir 5 pasos fundamentales:

Determinar la composicin inicial y final del solvente Ajustar el tiempo del gradiente Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusin Regresar a las condiciones iniciales la columna.

Sistemas de Inyeccin de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyeccin de la muestra con jeringas de alta presin cuales ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vvulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias Tipos de Columna:

Fuentes de dao de una columna de HPLC: * Obstruccin por partculas pequeas en los solventes o fases mviles * Obstruccin por materiales no eludos en las muestras * Variacin de las caractersticas de retencin por incremento de materiales no eludos

Deteccin
La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de lascaractersticas de las seal de transferida. Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:

Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta

Los detectores ms utillizados en HPLC son:

Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: o Detector de Longitud de Onda Fija o Detector de Longitud de Onda Variable o Detector de Arreglo de Diodos Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: o Tipo Deflexin o Tipo Fresnel Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o Segn la Fuente de Excitancin o Segn el sistema ptico Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: o Detector Amperomtrico o Detector Conductimtrico

Detector Potenciomtrico Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis reproducicbles:

Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador. Usar bombas reciprocantes de doble piston Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector. Operar con el voltaje adecuado Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos. Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana. Desconectar el detector electroqumico cuando este llimpiando las columnas. Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza.

Derivatizacin
Existen dos tendencias :

Pre-Columna PostColumna

Analisis Cualitativo y Cuantitativo

Ver Cromatografa de Gases

Problemas ms comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles

causas posibles, y cmo solucionarlos.

Presin Alta o Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partculas. o Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si sto no funciona reemplaze el fritado a la entrada de la columna. Si la presin sigue alta reemplaze la columna. o Solucin a largo plazo: Asegurese que todas las fases mviles se filtren apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . Tambin filtre todas las muestras antes de inyectarlas. Prdida de la Resolucin o Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna por partculas. o Solucin: vea la seccin de Presin Alta o Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC. Picos Hendidos o Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partculas. o Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna. o Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC. Variacin en los Tiempos de Retencin o Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase mvil. o Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente [degassed] o Solucin a larga plazo: Asegurese fase tan mvil est propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing] completo. Variaciones de la Lnea Base o Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil. o Solucin: Asegurese que todas las fases mviles estn debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de corriente del detector. Lnea Base con mucho Ruido o Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba. o Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase movil del sistema. Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia) o Posible causa: Oxgeno Disuelto

Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la concentracin de oxgeno disuelto. o Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea. Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto. Baja Ninguna Presin o Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho tiempo a partculas en suspencin en la fase mvil. o Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.

Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus necesidades:

Cuntas muestras y tipos de ensayos La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento) La exactitudad y presicin del sistema de bombas El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla Que tipo de servicio ofrecen puede ofrece la casa vendedora Suministro de software y compatibilidades Cunto puede PAGAR usted !

Referencias Bibliogrficas Recomendadas

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http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm#Qu es