UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR TESIS DE DOCTOR EN BIOLOG IA

Aceites esenciales, una herramienta alternativa en el manejo integrado de plagas de grano almacenado

Lic. Natalia Stefanazzi

BAH IA BLANCA 2010

ARGENTINA

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Prefacio
Esta tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado acad emico de Doctor en Biolog a, de la Universidad Nacional del Sur y no ha sido presentada previamente para la obtenci on de otro t tulo en esta Universidad u otras. La misma contiene resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en el Laboratorio de Zoolog a de Invertebrados II, dependiente del Departamento de Biolog a; Bioqu mica y Farmacia, durante el per odo comprendido entre Abril de 2005 y Diciembre de 2009, bajo la direcci on de los Dres. Adriana A. Ferrero y Teodoro Stadler. La Dra. Ferrero es Profesora Adjunta de la asignatura Zoolog a de Invertebrados II, del Departamento de Biolog a, Bioqu mica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. El Dr. Stadler es Investigador Principal de CONICET y desempe na su funci on en el Instituto de Medicina y Biolog a Experimental de Cuyo (Mendoza), en el Laboratorio de Toxicolog a Ambiental. Lic. Stefanazzi Natalia

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR Secretar a General de Posgrado y Educaci on Cont nua

La presente tesis ha sido aprobada el .../.../..., mereciendo la calicaci on de .... (......................)

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Agradecimientos

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Resumen
Los aceites esenciales son reconocidos como una importante fuente de pesticidas naturales y se postulan hoy como posibles alternativas de reemplazo a los insecticidas de s ntesis quienes ocasionan severos da nos ecol ogicos y a la salud del hombre. En el presente trabajo se analiz o la actividad insecticida, repelente, las posibles alteraciones sobre la siolog a nutricional y el efecto fagodisuasivo de los aceites esenciales de Tagetes terniora (Asteraceae), Cymbopogon citratus y Elyonorus muticus (Poaceae) en larvas y adultos de Tribolium castaneum Herbst (Coleoptera:Tenebrionidae) y en adultos de Sitophilus oryzae L. (Coleoptera:Curculionidae). La actividad insecticida de los aceites esenciales se evalu o por contacto, fumigante e ingesta. Los tres aceites s olo produjeron toxicidad postingesta en larvas de T. castaneum. T. terniora gener o toxicidad fumigante y por contacto en adultos de ambas plagas. La toxicidad por contacto evaluada mediante la t ecnica de impregnaci on de papel demostr o que los adultos de T. castaneum resultaron m as tolerantes que los adultos S. oryzae (CL50 = 217,26 g /cm2 y CL50 = 146,58 g /cm2 respectivamente). Adem as en adultos de S. oryzae se observ o toxicidad postingesta. En esta especie tambi en resultaron t oxicos los aceites esenciales de C. citratus, a trav es de la cut cula y E. muticus por cut cula y por ingesta . El efecto repelente se determin o mediante la prueba de impregnaci on de dieta. T. terniora, C. citratus y E. muticus, produjeron actividad repelente en larvas y adultos de T. castaneum y en adultos de S. oryzae.

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Para registrar las posibles alteraciones en la siolog a nutricional y el efecto fagodisuasivo se utilizaron peque nos discos de harina con los que se alimentaron a los insectos. Los tres aceites modicaron los ndices nutricionales, indicando alteraciones en la siolog a nutricional en adultos de T. castaneum y S. oryzae. En larvas de T. castaneum, el aceite de C. citratus redujo la tasa de crecimiento y la eciencia de conversi on del alimento. El aceite de T. terniora produjo efecto fagoestimulante en adultos de T. castaneum. Los tres aceites produjeron efecto fagodisuasivo en adultos de S. oryzae.

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Abstract
Plan essential oils have been recognaized as an important natural source of pesticides and are considered to be an alternative to synthetic chemicals insecticides because essential oils reputedly pose little threat to the enviroment or to human health. The toxic, repellent and feeding deterrent activities of essential oils from Tagetes terniora (Asteraceae), Cymbopogon citratus and Elyonorus muticus (Poaceae) were evaluated against Tribolium castaneum Herbst (Coleoptera:Tenebrionidae) larvae and adults and Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae) adults. Contact, fumigant and post-ingestive toxicity were assayed. All essential oils produced post-ingestive toxicity on T. castaneum larvae. Fumigant and contact toxicity were observed with T. terniora on adults of both pests. Contac toxicity assayed by treated lter paper showed that T. castaneum adult were more tolerant than S. oryzae adults. Although, postingestive toxicity was observed on S. oryzae adults. Essential oils from C. citratus showed contact toxicity and E. muticus showed contact and post-ingestive toxicity on S. oryzae. Repellency was evaluated by treated diet. All essential oils produced repellent activity on T. castaneum larvae and adults and S. oryzae adults. A our disc bioassay demonstrated that all essential oils produced alteration on nutritional index on T. castaneum and S. oryzae adults. C. citratus reduced the relative growth rate and the eciency of conversion of ingested food T. castaneum larvae. Essential oils from T. terniora produced feeding stimulant efect on T. castaneum adults. ix

All essential oils produced feeding deterrent action S. oryzae adults

 Indice general

1. Introducci on 1.1. Insectos plaga en grano almacenado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. M etodos de control de insectos plaga de grano almacenado . . . . . . . . . 1.2.1. Insecticidas vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1.1. Aceites esenciales para el control de cole opteros plaga de

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grano almacenado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3. Insectos en estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.1. Tribolium castaneum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.1.1. Clasicaci on de Tribolium castaneum . . . . . . . . . . . . 16 1.3.1.2. Distribuci on geogr aca e importancia econ omica . . . . . 16

1.3.1.3. Descripci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.3.2. Sitophilus oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.3.2.1. Clasicaci on de Sitophilus oryzae . . . . . . . . . . . . . . 18 1.3.2.2. Distribuci on geogr aca e importancia econ omica . . . . . 18

1.3.2.3. Descripci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.4. Especies vegetales en estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.4.1. Tagetes terniora (Asteraceae) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.4.1.1. Consideraciones generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.4.1.2. Clasicaci on taxon omica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

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1.4.1.3. Origen y usos etnobot anicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.4.1.4. Bioactividad de Tagetes sp. en cole opteros plaga de grano almacenado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.4.2. Cymbopogon citratus y Elyonorus muticus (Poaceae) . . . . . . . . 22 1.4.2.1. Consideraciones generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.4.2.2. Clasicaci on taxon omica: C. citratus . . . . . . . . . . . . 23 1.4.2.3. Origen y usos etnobot anicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.4.2.4. Bioactividad de Cymbopogon. en cole opteros plaga de grano almacenado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.4.2.5. Clasicaci on taxon omica: E. muticus . . . . . . . . . . . . 24 1.4.2.6. Origen y usos etnobot anicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.4.3. Descripci on bot anica de las especies en estudio . . . . . . . . . . . . 25 1.4.3.1. Tagetes terniora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.4.3.2. Cymbopogon citrarus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.4.3.3. Elyonorus muticus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.5. Hip otesis general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.6. Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2. Actividad Insecticida de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae 29

2.1. Introducci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.2. Hip otesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.3. Objetivo espec co . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.4. Materiales y M etodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.4.1. Insectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.4.2. Material vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.4.2.1. Obtenci on de los Aceites Esenciales . . . . . . . . . . . . . 33

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2.4.3. Bioensayos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.4.3.1. Toxicidad fumigante de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . 33 2.4.3.2. Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . 35 2.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.5.1. Toxicidad fumigante de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.5.2. Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.6. Discusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.7. Resumen de la actividad insecticida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3. Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae 41

3.1. Introducci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.2. Hip otesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.3. Objetivo espec co . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.4. Materiales y M etodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.4.1. Bioensayos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.4.1.1. Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de 25 d as de T. castaneum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

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3.4.1.2. Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.5.1. Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de T. castaneum . . . . . . . . . . . 45 3.5.2. Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae . . . 47 3.6. Discusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 3.7. Resumen de la actividad repelente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 4. Efectos sobre la siolog a nutricional y actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae 53

4.1. Introducci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.2. Hip otesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.3. Objetivos espec cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.4. Materiales y M etodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.5.1. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de T. terniora en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.5.2. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de C. citratus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae 58 4.5.3. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de E. muticus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae 61 4.6. Discusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

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4.7. Resumen de la alteraciones de la siolog a nutricional y actividad fagodisuasiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 5. Conclusiones Finales 6. Perspectivas para la utilizaci on de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus 73 67

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 Indice de guras
1.1. Adulto de T. castaneum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2. Larva de T. castaneum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.3. Adulto de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.4. Larva de S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.5. Tagetes sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.6. C. citratus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.7. E. muticus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.8. Espartillar del noroeste Argentino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 5.1. Toxicidad de los aceites esenciales en estudio en T. castaneum y S. oryzae 5.2. Actividad repelente de los aceites esenciales en estudio en T. castaneum y S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 69

5.3. Alteraciones en la siolog a nutricional y efecto fagodisuasivo de los aceite esenciales en en T. castaneum y S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

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 Indice de Tablas
1.1. Propiedades de los insecticidas de origen vegetal utilizados actualmente en los EE.UU. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.1. Constituyentes de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.2. Toxicidad fumigante del aceite esencial de T. terniora en adultos de T. castaneum y S. oryzae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.3. Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae . . . . . . . . . . . . 37 3.1. Actividad repelente en larvas de 25 d as de T. castaneum causada por los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus a diferentes tiempos y concentraciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.2. Actividad repelente en adultos de T. castaneum y S. oryzae causada por los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus a las 24 hs y a diferentes concentraciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.1. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de T. terniora en larvas y adultos de T. castaneum y adultos S. oryzae. . . . . 59 4.2. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de C. citratus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae . . . . . . . 60

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4.3. Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de E. muticus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae . . . . . . . 61

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Cap tulo 1 Introducci on

1.1. Insectos plaga en grano almacenado

Los artr opodos son el grupo m as variado de organismos dentro del reino animal y al menos se han descripto 750.000 especies, m as de tres veces el n umero del resto de especies animales combinadas. En la actualidad, la mayor parte de los zo ologos est an de acuerdo en considerar posibles cuatro l neas principales en la evoluci on de los artr opodos. Dentro de estas l neas se encuentran los unirr ameos que contienen a los ciempi es, milpi es e insectos (Ruppert & Barnes, 1996). De los 15 millones de organismos vivientes (animales y vegetales) los insectos representan el 50 % de los mismos (Speight et al., 2008). El f osil m as antiguo claramente atribuible al grupo de los insectos tiene una dataci on aproximada de 400 millones de a nos y se puede armar sin duda, que cuando el hombre apareci o sobre la tierra, hace solo un breve lapso en la escala geol ogica, los insectos ya ocupaban de forma estable cualquier h abitat terrestre y su espectro tr oco inclu a todo tipo de plantas, animales y restos org anicos de variada procedencia (Scoureld, 1940). Hoy en d a, exito evolutivo de estos organismos se pone de maniesto por el n umero elevado de especies y por su gran radiaci on adaptativa (Ruppert & Barnes, 1996). 1

Las primeras interacciones del hombre con los insectos fueron tan ambiguas como las mantenidas en la actualidad. As , muchos de estos organismos resultan beneciosos, en tanto que otros son destructivos y causan enormes da nos, a la salud del hombre, a sus animales dom esticos, a los cultivos y a los productos que este almacena. En relaci on a esto u ltimo, existe una cuesti on obvia y es que el hombre y los insectos est an condenados a compartir h abitats y recursos; por este motivo la aparici on de fen omenos de competencia interespec ca es algo inevitable y a pesar de los notables avances tecnol ogicos, este enfrentamiento todav a continua vigente a juzgar por las graves p erdidas que los insectos ocasionan en relaci on a los alimentos almacenados (De los Mozos Pascual, 1997). De los 32 o rdenes de insectos, solamente tres, Coleoptera (gorgojos), Lepidoptera (mariposas y pollillas) y Psocoptera (piojos de los libros), contienen especies que se encuentran como plagas de granos almacenados. Los Hemiptera (chinches) e Hymenotera (avispas) tambi en se encuentran en estos productos actuando como predadores y parasitoides de las plagas antes mencionadas. Miembros de otros ordenes como Thysanura (pececitos de plata), Blattodea (cucarachas), Diptera (moscas) e Isoptera (temitas) pueden encontrarse accidentalmente contaminando los granos (Rees, 2004). Los insectos-plaga de grano almacenado comenzaron a ser importantes cuando el hombre, hace m as de 10.000 a nos aprendi o que pod a almacenar sus cosechas para utilizarlas posteriormente como alimento o semillas. De la antigua civilizaci on egipcia, ha llegado hasta nosotros un legado de pruebas escritas sobre el almacenamiento de granos y otros alimentos as como de las primeras medidas de control. El almacenamiento para periodos de escasez fue una pr actica com un que se hizo extensiva hace aproximadamente 4.500 a nos y desde esa epoca se tiene conocimiento de la utilizaci on de construcciones de gran capacidad para este prop osito (Levinson & Levinson, 1994). En la actualidad, es sabido que deben cumplirse tres requisitos b asicos para evitar la proliferaci on de los insectos en el almacenaje. El grano se debe guardar, seco, sano y limpio. Para esto, la consigna b asica y v alida para todo tipo de almacenamiento es la de 2

mantener los granos vivos con el menor da no posible. Cuando los granos se guardan sin alteraciones f sicas y siol ogicas mantienen todos los sistemas propios de autodefensa y se conservan mejor durante el almacenamiento (Casini & Santa Juliana, 2005). Si estas condiciones no se cumplen, se produce la infestaci on de los granos por los insectos. Esto genera un impacto negativo que se traduce en importantes da nos y p erdidas econ omicas. En relaci on a los da nos, estos pueden ser clasicados en dos categor as: da nos de tipo directo y da nos de tipo indirecto (De los Mozos Pascual, 1997). Los primeros son producidos por la alimentaci on de la plaga sobre el grano, en tanto que los segundos suelen ser mucho m as graves y a menudo ocasionan la total inviabilidad del producto tanto para consumo humano como animal. As , la presencia de exuvias, deyecciones y otros restos de las especies infestantes causan una notable p erdida del valor comercial. Por otra parte, algunos insectos coneren a los productos atacados, olor y sabor desagradables pudiendo causar afecciones digestivas a quienes los ingieren. Adem as, la propia actividad metab olica de la plaga crea un calentamiento en la zona atacada entonces el gradiente de temperatura provoca la condensaci on de la humedad lo cual favorece el desarrollo de hongos que contaminan el producto con micotoxinas y lo convierte en no apto para el consumo humano (Lacey et al., 1980). Las p erdidas debidas a estos da nos oscilan entre un 5 % y un 10 % en pa ses desarrollados y alrededor del 50 % en pa ses en v as de desarrollo (Adam et al., 2006). En particular, en Argentina, las p erdidas en poscosechas registradas para los principales cultivos oscilan alrededor del 8 % (INTA, 2008). Los porcentajes referidos anteriormente se traducen en p erdidas econ omicas que representan unos 300 millones de d olares en en pa ses desarrollados y en nuestro pa s ascienden a 1000 millones de d olares seg un datos de la u ltima campa na cerealera (Adam et al., 2006; INTA, 2008). Existen unas 1.000 especies de insectos que infestan los productos almacenados, siendo las de mayor importancia econ omica las que se encuentran dentro de los Ordenes Coleoptera y Lepidoptera (Vi nuela et al., 1993; Rees, 1996; De los Mozos Pascual, 1997; 3

Trematerra et al., 1999; Riudavets et al., 2002; Dal Bello & Pad n, 2006; Nerio et al., 2009). Tradicionalmente, a estas especies se las suele clasicar en plagas primarias o secundarias en base al da no producido sobre el grano (Dell Orto Trivelli & Arias Vel azquez, 1985). Si bien esta clasicaci on se mantiene, esto conlleva a un an alisis m as profundo, que permite agrupar a las especies en base a las diferentes estrategias de alimentaci on y en t erminos generales se habla de un u nico grupo denominado commodity feeders. Es importante tener en cuenta, que cada especie plaga requiere su propio nivel de da no, encontr andose en un extremo las que claramente cumplen el rol de plagas primarias y se alimentan de granos enteros, y en el otro, las secundarias que poseen un espectro de alimentaci on m as amplio. Es as que, algunas plagas secundarias se alimentan de granos parcialmente da nados, debido al ataque previo de las plagas primarias o debido a da nos mec anicos ocasionados durante la cosecha, transporte, limpieza y secado de los granos. Otras, tienen preferencia por las harinas, que podr a considerarse el caso m as extremo de da no en el grano. Finalmente existen algunas especies que atacan preferentemente subproductos tales como cereales, deos, chocolates o alimentos para mascotas (Rees, 2004). La plagas primarias estan representadas por insectos altamente especializados con la capacidad de perforar la testa de las semillas. Dentro de este grupo encontramos a cole opteros de las familias Curculionidae (Sitophilus granarius ; S. oryzae ; S. zeamais, y Prostephanus truncatus ) y Bostrichidae (Rhyzopertha dominica ) y lepid opteros de la familia Gelechidae (Sitotroga cerealella ). Las plagas secundarias en cambio, son insectos poco especializados que atacan un amplio rango de productos almacenados, procesados y manofacturados. Dentro de estas se encuentran cole opteros de las familias Cucujidae (Cryptolestes ferrugineus, C. pusillus y Oryzaephilus surinamensis ) y Tenebrionidae (Tribolium castaneum ).

Originalmente muchas de estas especies plaga tenian una distribuci on restringida pero la comercializaci on de granos entre distintos pa ses ha dado como resultado que la mayor a sean cosmopolitas constituyendo en la actualidad un grave problema en todas las latitudes. En todo el mundo se cita a los cole opteros como las plagas m as frecuentes, con m as de 600 especies que atacan los granos (De los Mozos Pascual, 1997; Kalinov c et al., 2002; Rees, 2004; Pascual-Villalobos, 2006; Sahaf et al., 2008). En Argentina, estudios realizados en la zona de inuencia del Puerto de Ingeniero White, Bah a Blanca, determinaron que las m as relevantes fueron S. oryzae y T. castaneum (Descamps, 2002). La presencia de insectos en los granos constituye un serio problema al momento de su comercializaci on, es as que, los gobiernos sancionan leyes que regulan su importaci on. En los EEUU, la Federal Grain Inspection Service (FGIS) estableci o el t ermino infestado para todos aquellos trigos que contengan dos o m as insectos vivos da ninos por 100 gramos de trigo (FGIS., 2003). Otros pa ses industrializados como Canad a y Australia tiene tolerancia cero para insectos vivos en granos almacenados (Rajendran, 2008). En Argentina, la legislaci on establece el rechazo de toda mercader a con un solo insecto y/o a caro vivo en cualquier etapa de la comercializaci on (Resoluci on N 1975/94, Secretar a de Agricultura, Ganader a, Pesca y Alimentos, 2007).

1.2.

M etodos de control de insectos plaga de grano almacenado

Los primeros indicios documentados en relaci on con la protecci on de los productos almacenados datan de 3.500 a nos y provienen de los egipcios. Se trata de un escrito que se considera una compilaci on de la medicina terap eutica donde se sugieren una serie de medidas para paliar el efecto de las plagas sobre los granos almacenados.Entre las medidas citadas se encuentran la utilizaci on de carbonato s odico, grasas y cenizas de

excrementos animales para aplicar sobre las paredes de los graneros y la fumigaci on con inciensos preparados a base de resinas, gomas y especias para controlar las plagas en casas y almacenes. En la actualidad, las medidas de control se basan en la aplicaci on de productos qu micos, debido a su ecacia y bajo costo (Dal Bello & Pad n, 2006; Sahaf et al., 2008). En nuestro pa s y en el resto del mundo, los m as utilizados son los insecticidas qu micos convencionales como los organofosforados (diclorv os, malati on, metil-clorpirifos, metilpirimifos), piretroides (deltametrina) y piretrinas naturales obtenidas a partir de extractos de Tanacetum sp. (Asteraceae) (Perez Mendoza, 1999; CASAFE, 2005; Alleoni & Ferreira, 2006; Fields, 2006; dos Santos Veloso et al., 2008) y los fumigantes que incluyen el bromuro de metilo, la fosna y el uoruro de suldrilo (Ducom et al., 2002; Navarro, 2006). El uso indiscriminado de dodos ellos gener o distintas problem aticas que se mencionan a continuaci on: 1. La presi on que se ha ejercido con estos productos ha generado fen omenos de resistencia en las poblaciones de insectos (Pacheco et al., 1990; Correa et al., 2006; Ar aujo et al., 2006; dos Santos Veloso et al., 2008; Soares Corr ea et al., 2008; Braga Rodrigues et al., 2008; Sousa et al., 2009). En los a nos noventa ya se hab an registrado 550 especies de insectos resistentes a insecticidas sint eticos (Metcalf, 1994). En Australia, se estima que la resistencia a los piretroides podr a aproximarse a un 100 % para el 2010 (Collins, 2006). En Argentina, el primer caso de resistencia fue detectado en poblaciones de T. castaneum y S. oryzae en 1985 (Picollo de Villar et al., 1985). A posteriori, se informaron nuevos casos de resistencia a insecticidas en insectos plaga de grano almacenado (Ferrero, 1988; Picollo de Villar et al., 1992; Descamps, 2002; Stadler et al., 2003).

2. Muchos fumigantes han tenido que ser discontinuados o retirados del mercado debido a efectos adversos en el medio ambiente, en la salud del hombre o por sus elevados costos (Rodr guez Hernandez & Vedramim, 1998; Rejendran, 2001). 3. Restricciones severas regulan el uso de insecticidas y el patentamiento de nuevos productos para la aplicaci on de los mismos en granos destinados a la alimentaci on, es por ello que, los gobiernos de EE.UU y Europa han creado pol ticas tendientes a reemplazar los productos qu micos de uso corriente por productos menos agresivos para la salud del hombre y el medioambiente (Arthur & Rogers, 2002; Isman, 2006; Navarro, 2006). La problem atica planteada, reeja claramente la necesidad de un manejo integrado y racional de las plagas, donde el control no este dado por una u nica alternativa sino por el uso combinado de diferentes m etodos (Sosa & Tonn, 2006). Estos deben cumplimentar tres requisitos b asicos, el mantenimiento de la rentabilidad, la protecci on del medioambiente y la menor utilizaci on de insecticidas de s ntesis que es una de las mayores demandas generadas por los consumidores. Dentro de este marco, el manejo integrado de plagas (MIP) se impone como una excelente estrategia de control, teniendo como premisa el mantenimiento de las poblaciones de insectos por debajo de los niveles de da no econ omico dentro de un marco de protecci on del medioambiente (Dent, 2000). El MIP, propone el uso combinado de m etodos preventivos, biol ogicos, f sicos y qu micos. Los m etodos preventivos son la pieza clave de cualquier programa de lucha y deben cumplirse de manera rigurosa para garantizar una adecuada conservaci on del producto. Es de vital importancia el uso de las Buenas Pr acticas Agr colas para producir alimentos sanos e inocuos y el cumplimiento de los est andares ISO, particularmente las nomas ISO 9.000 y 14.000 las cuales sugieren la necesidad actual de incorporar nuevos conceptos de calidad en el manejo de granos almacenados. Adem as es fundamental el cuidado de las

instalaciones, la higiene y el aislamiento para evitar el ingreso de plagas a los sitios de almacenaje (Campos, 2006; Cosenzo, 2009). Los m etodos biol ogicos consisten en la utilizaci on de enemigos naturales para reducir el efecto de organismos indeseables (plagas) y favorecer a organismos u tiles (cultivos) (Garc a et al., 1988). Los enemigos naturales utilizados en el control de plagas de grano almacenado incluyen parasitoides pertenecientes al orden Hymenoptera y depredadores de los ordenes Hemiptera y Acari (Collatz et al., 2007; Meierhofer et al., 2007). Otro grupo interesante de enemigos naturales est a constituido por los hongos entomopat ogenos que producen la muerte del insecto por destrucci on de tejido y producci on de toxinas (de Conte Carvalho de Alencar et al., 2008; Coelho Batista et al., 2008). Dentro de los m etodos de control f sico, las atm osferas modicadas (AM) forman parte de las nuevas tecnolog as utilizadas para el control de plagas en productos almacenados. Si bi en este m etodo ha sido utilizado durante siglos, actualmente el empleo de AM combinadas con altas temperaturas, forman parte de las nuevas t ecnicas de aplicaci on gaseosa que han permitido reemplazar con gran exito a los fumigantes convencionales (Soderstrom et al., 1992; Bell & Conyers, 2002; Navarro, 2006; Navarro & donahye, 2007; Vroom, 2007). Otros m etodos de control f sico consisten en, la utilizaci on de polvos inertes, tierra de diatomeas, radiaciones ionizantes y almacenamiento herm etico entre otros (Mansour & Al-Blacheer, 1995; Subramanyam & Roesli, 2000; Alder et al., 2000; Fields, 2006; Korunic & Fields, 2006; Lorini & Beckel, 2006; Ignatowicz & Olejarski, 2007). Los m etodos qu micos incluyen a los insecticidas sint eticos convencionales, fumigantes, reguladores de crecimiento y los insecticidas de origen vegetal (Daglish et al., 1995; Broussalis et al., 1999; Procopio et al., 2003; Kljaji c & Peri c, 2006b; Lorini & Beckel, 2006; Kljaji c & Peri c, 2007; Nukenine et al., 2007; Gutierrez et al., 2008; de Lima et al., 2008; Ogendo et al., 2008).

1.2.1.

Insecticidas vegetales

En los u ltimos a nos con el surgimiento de la agricultura ecol ogica en los pa ses industrializados, los estrictos requerimientos para el registro de nuevas sustancias insecticidas, la problem atica de la resistencia y los efectos no deseados producidos por los insecticidas qu micos de s ntesis en el medioambiente y en organismos no blanco, despert o nuevamente el inter es en la b usqueda de plantas con nuevas actividades insecticidas. Esto ha quedado reejado en el aumento considerable de la comercializaci on de insecticidas de origen bot anico (Caballero Garc a, 2004). El surgimiento de la utilizaci on de las plantas como fuente de insecticidas naturales tiene su origen en simples observaciones emp ricas realizadas por el hombre que determinaban que ciertos vegetales se proteg an mejor que otros frente al ataque de insectos. Es as que, los insecticidas vegetales poseen una larga historia frente a la mayor a de los dem as pesticidas. Desde la antig uedad, los griegos, romanos y chinos utilizaban extractos de plantas para combatir las plagas de sus cultivos (Isman, 2006). En muchas comunidades ind genas, esta pr actica se ha mantenido a trav es de generaciones y representa un recurso renovable, m as accesible y econ omico que los insecticidas qu micos sint eticos. Sin embargo, es dif cil saber exactamente d onde y en que momento comienzan a ser utilizadas las plantas en forma sistem atica para la protecci on de los vegetales y en la agricultura. Publicaciones del 1700, documentan la utilizaci on de formulaciones a base de vegetales para combatir los gorgojos de los graneros y chinches hemat ofagas. Estos documentos son considerados como las primeras observaciones de car acter cient co sobre la bioactividad de extractos de plantas (Regnault-Roger & Vincent, 2004). La capacidad que poseen las plantas para defenderse frente a insectos perjudiciales es el resultado de a nos de evoluci on a trav es de los cuales desarrollaron la capacidad de producir una diversidad de compuestos con funciones diferentes. Se tratan de aleloqu micos que seg un su modo de acci on pueden clasicarse como sustancias defensivas, t oxicas,

repelentes, disuasorias o atrayentes (Cox, 2002). Se puede armar entonces, que las plantas act uan como laboratorios naturales donde se sintetizan una innidad de productos, constituyendo una fuente inagotable de sustancias qu micas que podrian ser la base del surgimiento de nuevas mol eculas insecticidas altamente selectivas, de baja persistencia en el ambiente y con menor posibilidad de generar fen omenos de resistencia. Esto u ltimo, se debe a que las mol eculas de origen vegetal presentan una enorme diversidad estructural lo cual les conere nuevos sitios de acci on diferentes a los de los insecticidas sint eticos (Caballero Garc a, 2004; ?). Hoy en d a, los productos de origen bot anico m as utilizados para el control de insectos son el piretro, la rotenona, el neem y los aceites esenciales (Isman, 2006). En la Tabla1.1 se detallan las propiedades de estos cuatro productos. El piretro, es una oleorresina extra da de las ores secas de Tanacetum sp y Chrysanthemum sp. (Asteraceae), donde se encuentran los principios activos de la planta que dieron origen a los piretroides sint eticos, quienes dominan actualmente el mercado acaparando el 80 % de las ventas, debido a que poseen amplio espectro de actividad, r apido efecto y excelente degradabilidad (Casida & Quistad, 1995). La rotenona es un isiavonoide presente en las ra ces de Lonchocarpus sp. y Derris sp. (Favaceae) que ha sido utilizada como insecticida desde hace m as de 150 a nos. El neem obtenido de las semillas de Azadirachta indica (Meliaceae) es un compuesto utilizado en la India desde hace m as de 4.000 a nos para combatir insectos plaga de grano almacenado. El extracto obtenido de dichas semillas contiene triterpenos, de los cuales el m as importante es la azadiractina (Jones et al., 1989). Sin embargo, recientemente se han documentado fen omenos de resistencia a los piretroides y el nim, ve limitada su utilizaci on debido a su elevado costo (Tabla1.1) y su baja efectividad frente a insectos (Caballero Garc a, 2004; Correa et al., 2006; Isman, 2006; Soares Corr ea et al., 2008; dos Santos Veloso et al., 2008). Es por ello que la b usqueda de nuevos compuestos vegetales para controlar insectos plaga es incesante. Seg un Daglish 10

Tabla 1.1: Propiedades de los insecticidas de origen vegetal utilizados actualmente en los EE.UU. Propiedad Piretro Rotenona Nim Aceites esenciales Pa s de origen Kenia, Australia Sudeste asi atico, Venezuela Materias activas Precio aprox. (d olares/kilo) Formulaciones Numerosas Polvo, polvo mojable Situaci on reglamentaria Acci on frente a las plagas Contacto Knock-down T oxico por ingesti on T oxico (ingest.), RCI antialimentario Persistencia Toxicidad para mam feros Muy limitada Limitada M nima Moderada. Muy t oxico para el hombre
Modicada de Regnault-Roger et al. 2004.

India

Todo el mundo

Piretrinas ( esteres) 45 60

Rotenoides (isoavonoides) 35

Azadiractina (limonoides) 125 200

Monoterpenos

10 25

Concentrados emulsionables Homologado

Numerosas

Homologado

Homologado

Exento

T oxico, antialimentario, repelente Muy limitada No t oxico

Muy limitada No t oxico

11

(2006), desde 1990 hasta 2005 se publicaron en el Journal of Stored Products Research m as de 150 trabajos referidos al control qu mico de estos organismos, un 37 % de estos son sobre insecticidas de origen vegetal . En este contexto, los extractos y aceites esenciales se presentan hoy en todo el mundo, como una excelente alternativa ofreciendo, biodisponibilidad, biodegradabilidad y selectividad. Numerosos trabajos documentan la bioactividad de estos compuestos frente a diferentes insectos plaga (Rice & Coats, 1994.; Ramos Rodr guez, 2001; Garcia Correia Tavares, 2002; Seyoum et al., 2002; Choi et al., 2003; Kim et al.; Rahman et al., 2003; Rivera Amita et al., 2003; Dharmagadda et al., 2004; Roy et al., 2005; Barbosa de Azevedo et al., 2008; Picollo et al., 2008; Ko Ko et al., 2009). En Argentina se desarrollan proyectos de investigaci on relacionados con la utilizaci on de especies vegetales arom aticas, medicinales o de inter es local y regional para el control de insectos plaga (Novo & Nassetta, 1997; Valladares et al., 2003; Viglianco et al., 2008; Folcia et al., 2009; Bertoni & Palacios, 2009; Gamarra et al., 2009; Viturro et al., 2009; Sosa et al., 2009). En la Universidad Nacional del Sur, desde hace varios a nos, se eval ua la bioactividad de extractos y aceites esenciales en insectos de importancia en la sanidad vegetal y humana (Werdin Gonzalez et al., 2005; Ferrero et al., 77; Stefanazzi et al., 2006b; Descamps, 2007; S anchez Chopa et al.; Gutierrez et al., 2008, 2009).

1.2.1.1.

Aceites esenciales para el control de cole opteros plaga de grano almacenado

Los aceites esenciales (AE) consisten en mezclas complejas que se originan del metabolismo secundario de las plantas. Pueden estar localizados en pelos, sistema vascular, hojas, tallos, ores o en otros sitios dependiendo de la especie vegetal. Son de naturaleza vol atil y entre los principales m etodos de extracci on se encuentran la hidrodestilaci on,

12

destilaci on por arrastre de vapor, hidrofusi on, extracci on con di oxido de carbono y microondas (Tripathi et al., 2009). Los monoterpenos son las mol eculas m as representativas de los AE (Koul & Dhaliwal, 2001), constituyen alrededor del 90 % de todos los componentes de la mezcla y poseen gran diversidad estructural y funcional. Adem as de los monoterpenos y formando parte de los componentes mayoritarios suelen encontrarse sesqui y diterpenos y m as raramente hemiterpenos, triterpenos y tetraterpenos. Dentro de los componentes minoritarios se encuentran alcoholes, fenoles y aldeh dos que junto a los mayoritarios son responsables de otorgarle al aceite, el aroma y la bioactividad caracter sticos. La composici on qu mica de un determinado aceite esencial puede variar en diferentes ejemplares de la misma especie vegetal, e incluso en los diferentes o rganos de la misma planta como resultado de su propia siolog a, o debido al clima y a las condiciones del suelo (Shaaya & Rafaeli, 2007). Se conocen aproximadamente unos 3.000 AE de los cuales 300 son de importancia comercial para las industrias farmac euticas, de cosm etica y perfumer a (Tripathi et al., 2009). En lo que respecta a su utilizaci on como insecticidas, es importante tener en cuenta que, todos aquellos productos que est en hechos a base de aceites esenciales, no necesitan ser homologados (Tabla1.1), lo que ha contribuido a su desarrollo comercial en EE.UU, Australia, India, Dinamarca, Brasil, Canad a y M exico (Regnault-Roger & Vincent, 2004; Isman, 2006). No es mucha la informaci on disponible de los AE respecto de su modo de acci on en los insectos. Sin embargo algunos aceites o sus constituyentes producen s ntomas espec cos que sugieren que estar an actuando como neurot oxicos (Kostyukovsky et al., 2002; Isman, 2006). Investigaciones recientes indican que algunos AE y en particular los monoterpenos act uan sobre los receptores de la octopamina, lo cual los convierte en productos altamente selectivos dado que este tipo de receptores no est a presente en los vertebrados (Enan, 2001, 2005; Price & Berry, 2006). De esta manera el sistema octopamin ergico presente en los insectos se convierte en un blanco biorracional para su control. 13

El modo de acci on de los aceites esta ntimamente relacionado con las estructuras de las mol eculas que lo componen. As , la actividad biol ogica depende del tipo de grupo funcional y de su posici on en la mol ecula m as que de su volatilidad y su peso molecular (Tripathi et al., 2009). Es por ello que los estudios realizados sobre la relaci on estructura-actividad en diferentes insectos son de gran importancia debido a que proporcionan informaci on respecto del exacto modo de acci on de una mol ecula (Ngoh et al., 1998; Giordano et al., 2000; K.K. et al., 2001). Algunos aceites esenciales y sus componentes mayoritarios resultan t oxicos a trav es del contacto directo o mediante la penetraci on al organismo por v a respiratoria (Shaaya et al., 1997; Pascual-Villalobos, 2002; Negahban et al., 2006; Kordali et al., 2006; L opez et al., 2008). Otros afectan la siolog a nutricional de los insectos ya sea por modicar su comportamiento (actuando como antialimetarios) o produciendo efectos t oxicos a trav es de la ingesti on (Rodr guez Hernandez & Vedramim, 1998; Huang et al., 2000; Pungitore et al., 2005; Benzi & Ferrero, 2009). Adem as, muchos aceites han demostrado ser altamente efectivos por su acci on repelente (Ogendo et al., 2008; Nerio et al., 2009; Ukeh et al., 2009). Algunos autores postulan a los AE como potenciales alternativas de reemplazo para el bromuro de metilo y la fosna, dos de los fumigantes m as ampliamente utilizados en la actualidad en el control de plagas de almac en (Shaaya & Rafaeli, 2007). Adem as son numerosos los trabajos publicados que informan respecto a su bioactividad frente a estos insectos. Pascual Villalobos (2002), registr o efecto fumigante del aceite esencial de Coriandrum sativum (Apiaceae) sobre adultos de C. maculatus y S. granarius, causando 100 % y 60 % de mortalidad respectivamente . Lee et al. en 2004, registraron la toxicidad fumigante de aceites esenciales de varias especies vegetales de la familia Myrtaceae en S. oryzae y T. castaneum. De los 42 aceites evaluados los de Eucalyptus nicholii, E. codonocarpa, E. blakelyi, Callistemon sieberi, Melaleuca fulgens, y M. armillaris fueron los m as efectivos en ambos insectos .

14

En 2005, Tapondjou et al. analizaron la toxicidad por contacto e ingesta y el efecto repelente en S. zeamais y T. confusum de los aceites esenciales de Eucalyptus saligna (Myrataceae), Cupressus sempervirens (Cupressaceae) y del cymol, uno de los componentes mayoritarios de ambos aceites. El eucalyptus result o ser el m as t oxico para ambos insectos por contacto, sin embargo, solo se observ o toxicidad por ingesti on en S. zeamais. Los aceites produjeron una repelencia superior al 70 % en ambas plagas, en tanto que el cymol solo produjo un 55 % de repelencia. En 2006, se registr o actividad repelente del aceite de Aloysia polistachia (Verbenaceae) en larvas de T. castaneum mediante el m etodo de impregnaci on de dieta obteni endose valores de repelencia cercanos al 67 % (Gutierrez et al., 2006). Ahmadi y su equipo (2007), compararon la toxicidad fumigante de los aceites de Artemisia sieberi (Asteraceae) y Rosmarinus ocinalis (Lamiaceae) en T. castaneum. Los autores informaron que el insecto fue m as susceptible al aceite de R. ocinalis . La toxicidad fumigante y la actividad repelente del aceite esencial de Ocimum gratissimum (Lamiaceae) y su componente mayoritario eugenol se evaluaron en S. oryzae, T. castaneum, R. dominica, O. surinamensis y C. chinensis. En estos u ltimos tres insectos se inform o un importante efecto t oxico con porcentajes de mortalidad que oscilaron entre 98 % y 100 % para el aceite y 79 % y 100 % para el eugenol. Con respecto a la repelencia se registraron porcentajes que variaron entre 37,5 % y 100 % para el aceite y entre 45 % y 100 % para el eugenol en todos los insectos (Ogendo et al., 2008). La toxicidad fumigante de Vitex pseudo-negundo (Verbenaceae) fue evaluada en adultos de T. castaneum y S. oryzae. El an alisis de las CL50 , demostr o que esta u ltima fue la especie m as susceptible (Sahaf et al., 2008). En el a no 2009 Benzi et al., registraron alteraciones en la siolog a nutricional de S. oryzae con el aceite esencial de hojas y frutos de S. molle var. areira. Adem as, el aceite de frutos produjo efecto inhibitorio de la alimentaci on con un ndice fagodisuasivo de 62 % .

15

1.3.
1.3.1.

Insectos en estudio
Tribolium castaneum

El g enero Tribolium comprende 30 especies, cinco de ellas se encuentran en asociasci on con los productos almacenados, siendo T. castaneum (L amina 1.1) la plaga m as importantes a nivel mundial (Rees, 2004) .

1.3.1.1.

Clasicaci on de Tribolium castaneum

Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Cole optera Suborden Polyphaga Serie Cucujiformia Superfamilia Cucujoidea Familia Tenebrionidae G enero Tribolium Especie Tribolium castaneum Herbst

1.3.1.2.

Distribuci on geogr aca e importancia econ omica

Es una especie cosmopolita, se desarrolla en climas templados y mediterr aneos aunque es dominante en climas c alidos, siendo los fr os los menos favorables. Se trata de una de las especies que se encuentran con mayor frecuencia en los productos almacenados. Ataca virtualmente cualquier tipo de producto seco de origen animal o vegetal, siendo especialmente importante como plaga de cereales y granos. Es considerada una plaga secundaria ya que tanto las larvas como los adultos se alimentan de grano partido. La infestaci on puede dejar un olor persistente y desagradable en el grano debido a la secreci on de benzoquinonas liberadas desde gl andulas abdominales (Rees, 2004). 16

L amina 1.1 Caracter sticas morfol ogicas de T. Castaneum 1.3.1.3. Descripci on llo y antes de emerger el adulto se torna de coloraci on casta no rojiza (Metcalf & Flint, 1974) Ciclo de vida: La hembra puede depositar m as de 1.000 huevos durante su vida adulta. Las larvas se alimentan del producto almacenado e incluso de otros insectos peque nos. El canibalismo es muy com un tanto en larvas como en adultos. La larva completa su desarrollo en unos 25 d as aproximadamente. Los estados de huevo y pupa son cortos, pasando m as del 60 % del ciclo en estado larval. El adulto, puede vivir por dos o tres a nos si se dan las condiciones adecuadas. Se multiplica en un rango de temperaturas que va de 22 C a 40 C y una HR inferior al 1 %. En condiciones o ptimas de temperatura y humedad (35 C a 37 Cy 70 % HR) el ciclo se completa en 20 d as, esta es la tasa de reproducci on m as r apida alcanzada por una plaga de grano almacenado.

Adultos: presentan una coloraci on marr on rojiza y mide entre 2.6 y 4.4 mm (Fig 1.1). Posee los u ltimos tres segmentos antenales de mayor tama no que los anteriores. En una vista lateral de la regi on cef alica, se puede observar claramente una carena que divide el ojo en dos facetas. Ventralmente la distancia entre ambos ojos es relativamente estrecha y puede observarse un proceso en forma de hacha entre el primer par de patas.Dorsalmene, el t orax presenta peque nos hoyos en la regi on central del pronoto (Rees, 2004). Huevos: peque nos y alargados, de color blanquecino, reci en ovipuestos est an cubiertos de una capa viscosa que les sirve para adherirse a las supercies facilitando la infestaci on (Dell Orto Trivelli, 1985) Larva: peque na, delgada, cil ndrica mide entre 5 y 10 mm de longitud, de color blanco amarillo p alido y cabeza rojiza (Fig 1.2). Pupa: de color blanco al comienzo de la fase, gradualmente se torna color amari-

Figura 1.1: Adulto de T. castaneum.

Figura 1.2: Larva de T. castaneum.

17

1.3.2.

Sitophilus oryzae

Los curculi onidos se encuentran en un amplio rango de h abitats y muchas especies son importantes plagas de la agricultura, horticultura y forestales. Los miembros del g enero Sitophilus son las plagas m as importantes de grano almacenado (L amina 1.2) (Rees, 2004).

1.3.2.1.

Clasicaci on de Sitophilus oryzae

Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Cole optera Suborden Polyphaga Serie Cucujiformia Superfamilia Curculionoidea Familia Curculionidae G enero Sitopilus Especie Sitophilus oryzae L.

1.3.2.2.

Distribuci on geogr aca e importancia econ omica

Es un insecto cosmopolita aunque su desarrollo se restringe a regiones de temperaturas muy bajas donde es reemplazado por S. zeamais. Es la principal plaga del arroz pudiendo atacar otros productos almacenados. La infestaci on, si no es controlada a tiempo provoca da nos devastadores en los productos almacenados. Es considerada una plaga de infestaci on primaria. La infestaci on produce un aumento de la temperatura y genera humedad, con la p erdida consecuente de la calidad del grano y desarrollo de hongos y de otras especies de insectos primaria. La alimentaci on de las larvas ocasiona grandes cavidades dentro del grano y la emergencia de los adultos deja hoyos de salida produciendo a un un mayor da no (Rees, 2004).

18

L amina 1.2 Caracter sticas morfol ogicas de Sitophilus oryzae 1.3.2.3. Descripci on. Extra do de (Rees, 2004) Pupa: es de color blanco y se desarrolla dentro del grano en el hueco realizado por la larva. Ciclo de vida: Los huevos son depositados dentro del grano, la hembra selecciona un punto en la supercie del mismo donde realiza un agujero por el cual introduce el huevo. El agujero es luego cerrado mediante una secreci on serosa. Las hembras depositan mas de 150 huevos durante su etapa adulta. Las larvas se desarrollan en el interior del grano y al nalizar su desarrollo, antes de empupar, realizan un hoyo por donde emerger a el insecto adulto. Una vez emergido el adulto puede pasar varios d as en el interior del grano. Los adultos contin uan aliment andose del grano y viven entre 3 y 6 meses, pudiendo reproducirse en rangos de temperatura que var an desde los 11 C hasta los 34 C y una humedad relativa por encima del 40 %. El ciclo puede acortarse a 25 d as en condiciones o ptimas de temperatura y humedad (30 C , 70 % HR).

Adultos: poseen una prolongaci on frontal que los hace inconfundibles frente a otras plagas de almac en (Fig 1.3). Es de color marr on oscuro, mide entre 2,5 y 4 mm, dependiendo del tama no de la semilla de la cual emerja. Posee un par de manchas anaranjadas en cada elitro y hoyos redondeados en el pronoto. La determinaci on del sexo se realiza f acilmente mediante caracter sticas externas. Las hembras poseen una prolongaci on frontal relativamente corta con hoyos marcados e irregulares, en tanto que en los machos es m as alargada y los hoyos son m as suaves y de distribuci on regular. Huevos: son de color blanco, ovales y depositados en el interior del grano a trav es de un peque no agujero realizado por la hembra. Larvas: son a podas, rechonchas y de coloraci on blanquecina. Se desarrollan en el interior del grano. En este estado es muy frecuente el canivalismo (Fig.1.4).

Figura 1.3: Adulto de S. oryzae

Figura 1.4: Larva de S. oryzae

19

1.4.
1.4.1.
1.4.1.1.

Especies vegetales en estudio

Tagetes terniora (Asteraceae)
Consideraciones generales

El orden Asterales con cerca de 1.000 g eneros y 19.000 especies se encuentra distribuido por todas las latitudes y representa uno de los grupos m as rico en formas de las Angiospermas. En el orden se distinguen dos subfamilias, Asteraceae y Cichoriaceae. Las Asteraceae son de gran importancia desde el punto de vista econ omico incluyendo plantas comestibles como la alcachofa Cynara scolymus y el girasol Helianthus annuus y ornamentales entre las que podemos citar a Senecio, Aster, Dahlia, Ageratum, Chrysanthemum, Tagetes, Calendula entre otras. Otas especies de aster aceas como Achillea millefolium, Artemisia vulgaris, Matricaria chamomilla, Centaurea cyanus son utilizadas en la medicina tradicional. Durante los u ltimos 30 a nos aument o la informaci on sobre el g enero Tagetes y recientemente el inter es se ha centrado en los extractos, su actividad insecticida debido a su biodegradabilidad, como compuestos farmac euticos y por su actividad nematicida (Vasudevan et al., 1997). Las especies m as comunes del g enero son T.minuta, T. erecta, T. patula y T. terniora. En Kenia, las ramas de T.minuta se colocan en el interior de las viviendas actuando como repelente para el vector de la malaria Anopheles gambiae s.s. (Diptera) (Seyoum et al., 2002); T. erecta es una fuente natural de xant olas. Sus extractos saponicados son utilizados como aditivos para una gran variedad de comidas y en la industria farmac eutica (Navarrete-Bola nos et al., 2005). Tereschuk et al. en 2003, informaron el uso de extractos metan olicos de hojas de T. terniora como bactericida contra organismos Gram negativos en general. . Dharmagadda, (2004) demostr o que T. patula posee un

20

enorme potencial larvicida en d pteros de Aedes aegypti, Anopheles stephensis y Culex quinquefaciatus .

1.4.1.2.

Clasicaci on taxon omica

Divisi on Angiosperma Clase Dicotiledonea Subclase Metaclamideas Familia Asteraceae Tribu Helenieae Genero Tagetes Especie Tagetes terniora Kunth

1.4.1.3.

Origen y usos etnobot anicos

Es nativa del noroeste argentino (NOA) conocida vulgarmente con el nombre quichia. Habita en terrenos de cultivo, bordes de barrancos y acequias y presenta resistencia a la salinidad (Loja Herrera, 2002). Se cultiva con distintos prop ositos: ornamentales, sociales, religiosos, como colorante para comidas y cultivo de borde con otras plantas como tomate con efectos ben ecos para estas. Sus hojas son utilizadas como condimento para sopas y guisos.

1.4.1.4.

Bioactividad de Tagetes sp. en cole opteros plaga de grano almacenado

Algunos trabajos documentan la bioactividad de diferentes especies del g enero frente a plagas de grano almacenado (Sarin, 2004). Broussalis et al.(1999) observaron porcentajes de mortalidad superiores al 50 % en S. oryzae al utilizar extractos obtenidos de partes a ereas de T.erecta. En el a no 2000, se inform o actividad fumigante y ovicida del aceite esencial de T.minuta en Callosobruchus maculatus (Keita et al., 2000). En este mismo 21

a no, Pad n et al., encontraron importante actividad insecticida del aceite esencial de T. minuta en Acanthoscelides obtectus y S. oryzae. En el a no 2009 Nerio et al., informaron efectos repelentes del aceite esencial de T. lucida en S. zeamais. En 2009, Paul et al. registraron efectos t oxicos y reducci on en la oviposici on y producci on de progenie en A. obtectus utilizando polvos de T. minuta.

1.4.2.
1.4.2.1.

Cymbopogon citratus y Elyonorus muticus (Poaceae)

Consideraciones generales

Ambas especies pertenecen al Orden Cyperales y a la gran familia de las gram neas o po aceas que representan los vegetales m as u tiles para el hombre, cont andose entre ellas las que nos proporcionan alimentos imprescindibles, como el trigo, ma z, arroz, ca na de az ucar y las forrajeras m as importantes para la ganader a. Su inter es cient co, sus m ultiples aplicaciones y su extraordinaria riqueza espec ca (m as de 10.000 en todo el mundo y unas 1.000 en Argentina) convierte a las gram neas en un interesante grupo de estudio (Parodi, 1958). El g enero Cymbopogon comprende unas 180 especies, subespecies, variedades y subvariedades de pastos que crecen en regiones tropicales y subtropicales en todo el mundo, muchas de ellas producen aceites esenciales de aromas agradables que poseen un perl industrial; se utilizan en bebidas, alimentos, fragancias, productos farmac euticos y en el tabaco. Varias especies del g enero producen aceites esenciales. De C. martinii se extrae aceite de palmarrosa que se incorpora a nos perfumes y velas arom aticas; de C. nardus y C. winterianus se obtiene citronela utilizada en muchos productos cosm eticos y como repelente de mosquitos (Anand, 2010). Varios extractos y aceites esenciales obtenidos de diferentes especies de Cymbopogon han demostrado bioactividad en artr opodos (Nerio et al., 2010).

22

El g enero Elyonorus, comprende unas 25 especies tropicales y subtropicales de dif cil diferenciaci on. Habitan suelos pobres y arenosos de Am erica, Africa y Asia. En las extensas sabanas de Elyonorus del Chaco, las personas las queman para que los brotes tiernos sirvan de alimento al ganado. Son pastos arom aticos y en nuestro pa s se ha extra do de alguna de las especies, una esencia vol atil con olor a citronela que se ha propuesto como suced aneo de este producto (Cabrera, 1970).

1.4.2.2.

Clasicaci on taxon omica: C. citratus

Divisi on Magnoliophyta Clase Liliopsida Subclase Commelinidae Familia Poaceae Tribu Andropogoneae Genero Cymbopogon Especie Cymbopogon citratus (DC) Stapf, Sin.: Andropogon citratus

1.4.2.3.

Origen y usos etnobot anicos

Es nativa de a reas tropicales y subtropicales de Asia, y se cultiva en Am erica Central, Am erica del Sur y Africa (Lewinsohn et al., 1998). Vulgarmente se la conoce con el nombre de lemon grass o pasto lim on de donde se extrae el lemongras utilizado como ingrediente para t es, sopas y en inumerables recetas de la cocina del Sudeste de Asia, Camboya y Vietnam. En Europa, es utilizado en vinos y cervezas especiadas y en la jungla Boliviana tradicionalmente se la utiliza como repelente de mosquitos (Nerio et al., 2010).

23

1.4.2.4.

Bioactividad de Cymbopogon. en cole opteros plaga de grano almacenado

Distintos autores informan la bioactividad de distintas especies del g enero frente a plagas de grano almacenado. En 1994, Rice y Coats reportaron actividad insecticida del citral, componente mayoritario de Cymbopogon sp., frente a T. castaneum . Pad n et al. (2000), reportaron importante actividad insecticida del aceite esencial de C. citratus frente a A. obtectus, T. castaneum y S. oryzae . En el a no 2005, Ketoh et al. informaron actividad insecticida e inhibici on del desarrollo en C. maculatus utilizando aceite esencial de C. schoenanthus . El mismo autor, un a no m as tarde compar o la bioactividad del mismo aceite y de su componente mayoritario (piperitone) en la misma especie plaga. Los resultados indicaron que el piperitone, result o ser m as t oxico, adem as de producir mayor inhibici on del desarrollo tanto en huevos como en larvas neonatas (?).

1.4.2.5.

Clasicaci on taxon omica: E. muticus

Divisi on Magnoliophyta Clase Apogonia Subclase Commelinidae Familia Poaceae Tribu Andropogoneae Genero Elyonorus Especie Elyonorus muticus (Spreg)

1.4.2.6.

Origen y usos etnobot anicos

Planta ind gena de Argentina, en la provincia de Buenos Aires es frecuente en los suelos arenosos del oeste y del sur y tambi en en las sierras de Tand l, Balcarce y Ventana (Cabrera, 1970). Se la conoce con los nombres vulgares de espartillo, colita peluda, pasto amargo,

24

paja (Burkart, 1968). No da pasto apetecible para el ganado y adem as otorga un sabor amargo y olor desagradable a la leche de las vacas que lo ingieren (Burkart, 1968). En cambio, en la medicina popular las ra ces se usan por su sabor para mezclar con el mate y como remedio para la ebre. Tambi en es utilizado como fragancia de sahumerios (Bandoni, 2002). Junto a otras especies del mismo g enero constituyen un valioso grupo de arom aticas cuya resina contiene m as de 90 % de citral, de f acil cocecha y extracci on. Si bien se la cita como fuente de sustancias arom aticas (Burkart, 1968), no se ha encontrado en la bibliograf a consultada trabajos sobre su actividad insecticida.

1.4.3.

Descripci on bot anica de las especies en estudio

En las l aminas 1.3 y 1.4 se detallan las caracter sticas morfol ogicas de T. terniora, C. citratus y E. muticus.

25

L amina 1.3 Descripci on de las especies vegetales en estudio 1.4.3.1. Tagetes terniora liguladas, femeninas, l gula blanca. Flores del disco hermafroditas, 3-4 corola tubulosa, amarillo lim on, pentadentada; anteras a pice apendiculado, base obtusa, lamento lacriforme. Pappus esta formado por una pajita aristiforme y 2-3 pajitas peque nas escamiformes y de diferente tama no. Aquenio siforme, longitudinalmete estriado. 1.4.3.2. Cymbopogon citrarus

Posee un sufr utice 60-80 cm. de alto, tallo cil ndrico, estriado, ramoso de color gris aceo, glabrescente, gl andulas ole feras. Hojas alternas, pec olo 0.5-2 cm de largo; limbo pinnatisecto, generalmente 2-3 pares de segmentos, raramente con 4-5 pares de segmentos en las hojas basales, segmentos el pticos-lanceolados, margen aserrado en las hojas basales y dentado en las superiores, caquis 3-5 cm de largo, 7 cm de largo en las hojas basales. Cap tulos en discos terminales, existen dos tipos de cap tulos, femeninos y heter ogamos. Cap tulo en forma de media luna con 1 a 2 ores; involucro 7-8 mm de alto por 1-2 mm de di ametro, br acteas involucrales uniseriadas, soldadas casi hasta el apice, dorso con algunas gl andulas ol feras, or ligulada, l gula blanca, el ptica, con el apice ligeramente lobulado. Cap tulos heter ogamos cil ndricos, involucro 1-1.1 cm de alto por 0.5-0.66 cm de di metro, br acteas uniseriadas soldadas casi hasta el apice con gl andulas ol feras en el dorso. Flores marginales de 2-3

Perenne, cepitosa, hasta de 1,50 m de altura, con multiles macollos que provienen de un corto rizoma ramicado, semisubterr aneo. Hojas planas, anchas y tiernas de 50 a 80 cm de largo por 1 a 1,5 cm de ancho, con intenso aroma a cedr on al estrujarlas. Ordinariamente no orece, pero en climas tropicales suele producir ca nas or feras hasta de 1,80 m de altura. Se lo conoce u nicamente en cultivo. Se multiplica por divisi on de matas que pueden plantarse a nes de invierno y en primavera. De sus hojas se extrae un aceite esencial con olor a cedr on que se emplea en perfumer a. Cultivos en Misiones, Corrientes, Entre R os y Tucum an (Parodi, 1958).

Figura 1.5: Tagetes sp.

Figura 1.6: C. citratus

26

L amina 1.4 Descripci on de las especies vegetales en estudio 1.4.3.3. Elyonorus muticus de longitud, bicarenada, con las carenas y el dorso pilosos,pelos blancos de 3-4 mm; bordes inexos abrazando a la gluma superior, con estr a bals amica a lo largo de su nervadura; gluma superior menos, lanceolada, aguda, 3-nervada, con pelos sedosos cortos en su dorso y con margen hialino ciliado; lemma est eril hialina, de 5-6 mm de longitud, con margen ciliado plegado hacia adentro, lemma f ertil, hialina de 4 mm aproximadamente, p alea hialina, tenue de 2,5 mm. Estambres con 3 anteras liniares de 3-3,5 mm de longitud; estigmas plumosos, rojizos, que emergen de los costados de las glumas durante la antesis. Espiguilla superior masculina, con 3 anteras lineares de 3 mm de longitud; gluma inferior de 5-6 mm, con a pice ntegro o brevemente bidentado y quillas pilosas, gluma superior carenada, poco menor que la inferior, con pelos cortos en su dorso y nervadura central escabrosa; lemma est eril hialina de 3 mm y p alea una peque n sima escama hialina de 1 mm, m as o menos, de longitud (Cabrera, 1970).

Perenne, de 50-70 cm de altura, con ca nas glabras a menudo canaliculadas, plurinoides, nudos glabros; vainas glabras, estriadas; l gula membranosa de bordes ciliados, de 1,5 mm de longitud; l aminas estrechas, liformes, de 20-50 cm de longitud y 2 mm de anchura en la base, terminadas en punta na, glabras exteriormente, densamente pubescentes en la cara adaxial y con pelos largos, de hasta 7 mm, en sus bordes. Inorescencia espiciforme de 8-10 cm de longitud, emergente o semiincluida en la u ltima vaina foliar, solitaria, densamente pilosa, desarticul andose a la madurez. Espiguilla inferior hermafrodita brevemente pedicelada, pedicelo de 1,5 mm de longitud, la superior masculina, con pedicelo de 3,5-4 mm, ambos al igual que los artejos del raquis, engrosados y vestidos de pelos largos; espiguilla hermafrodita con glumas cori aceas, la inferior de 8-9 mm de longitud, ntegra, apenas bidentada o rostrada y b da, con dientes apicales de 2-4 mm

Figura 1.7: E. muticus

Figura 1.8: Espartillar del noroeste Argentino

27

Dado que no existen antecedentes de la actividad biol ogica de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y en adultos de S. oryzae y teniendo en cuenta hoy en d a, el uso de productos vegetales en el control de insectos plaga se plantea la siguiente hip otesis general:

1.5.

Hip otesis general

Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus tienen actividad insecticida, repelente, fagodisuasiva y modican la siolog a nutricional en larvas y adultos de T. castaneum y en adultos de S. oryzae. En base a esta hip otesis se plantea el siguiente objetivo general:

1.6.

Objetivo general

Evaluar la actividad insecticida, repelente, fagodisuasiva y alteraciones en la siolog a nutricional producida por los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y en adultos de S. oryzae.

28

Cap tulo 2 Actividad Insecticida de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae
2.1. Introducci on

Desde el inicio de la agricultura proteger los cultivos y conservar las cosechas se convirti o en una de las mayores preocupaciones. Los hallazgos arqueol ogicos demuestran que, desde el neol tico, el hombre de las cavernas ide o nuevos m etodos de almacenamiento de los v veres para dejarlos fuera del alcance de los insectos t ofagos y durante la edad media se cita la utilizaci on de azufre como fumigante y ars enico como insecticida (Regnault-Roger & Vincent, 2004). Actualmente, la protecci on de los productos almacenados frente al ataque de insectos plaga se realiza casi exclusivamente a trav es de la utilizaci on de fumigantes. La fumigaci on de las estructuras de almacenaje permite controlar un amplio espectro de plagas debido 29

a la capacidad de los gases de penetrar a trav es de los empaques, paredes y otras areas donde por otro tipo de t ecnicas de control no se pueden acceder (Ducom et al., 2002). Sin embargo, la mayor a de los productos utilizados para tal n han tenido que ser retirados del mercado debido a serios inconvenientes tales como contaminaci on del medio ambiente, presencia de residuos en los alimentos, costos elevados y efectos carcinog enicos entre otros (Navarro, 2006). Tal es as que de los 16 fumigantes listados por Bond en 1984, solo tres, el bromuro de metilo (BM), el uoruro de suldrilo (FS) y la fosna quedaban vigentes a principios de 2005 (Ducom, 2006). Actualmente tambi en estos productos ven limitada su utilizaci on por distintas razones. El BM es un producto muy deseado comercialmete debido a su r apida acci on, su bajo costo y la capacidad de controlar un amplio espectro de insectos plaga (Ducom, 2006). Sin embargo ha comenzado su fase de eliminaci on debido a sus efectos delet ereos en el ambiente. Es as que el Protocolo de Montreal, un tratado internacional que procura proteger el planeta contra los efectos perjudiciales del agotamiento de la capa de ozono, ha puesto en marcha un plan de eliminaci on de varios productos incluyendo el BM. En los pa ses desarrollados se comenz o a limitar su uso a partir de enero de 2005 y se pretende conseguir lo mismo en los pa ses en v as de desarrollo a partir de 2015 (UNEP, 2002). El FS por su parte, es utilizado para la desinfecci on de molinos harineros como producto alternativo al BM aunque su costo es mucho m as elevado. Por otra parte se ha informado que los huevos de muchos insectos plaga, particularmente los de T. castaneum se han vuelto tolerantes a este producto (Ducom, 2006). La fosna es actualmente el u nico fumigante registrado en todo el mundo para la desinfecci on de los sitios donde se realiza el almacenaje, adem as la progresiva eliminaci on del BM ha incrementado notablemente su utilizaci on en cuanto a la cantidad de productos a los cuales se aplica (especias, cacao y frutos secos) (Horn et al., 2005; Ducom, 2006). La utilizaci on ecaz y continua de la fosna se ve amenazada por la generaci on de resistencia y tolerancia en las poblaciones de insectos y si bien los protocolos de su utilizaci on se 30

han revisado en diversos pa ses existen trabajos que documentan la aparici on de estos fen omenos (Hasan & Reichmuth, 2002; Cao et al., 2003; Savvidou et al., 2003; Ahmedani et al., 2007; Pimentel et al., 2007; Braga Rodrigues et al., 2008; Pimentel et al., 2009). Los insecticidas organofosforados, carbamatos y piretrodes han sido utilizados ampliamente desde 1960 para el control de plagas de grano almacenado (Perez Mendoza, 1999); generalmente son aplicados durante el secado de los granos, en forma l quida o m as raramente como polvos y dependiendo del tipo de aplicaci on pueden asegurar una protecci on a largo plazo. La aparici on del fen omeno de resistencia en plagas de productos almacenados, los costos elevados, los da nos ecol ogicos y efectos adversos sobre la salud humana limitan el uso de insecticidas sint eticos (Subramanyam & Hagstrum, 1995; Perez Mendoza, 1999; Kljaji c & Peri c, 2006a; G oes Cordeiro et al., 2008; Guedes & Pereira, 2008; Soares Corr ea et al., 2008). En funci on de las condiciones actuales expuestas se debe reexionar acerca de una defensa integrada en la cual los insecticidas de origen vegetal cumplan un rol relevante. Si bien su aplicaci on para la protecci on de productos almacenados est a solo en sus comienzos, son muchos los compuestos vegetales que han sido evaluados y demostraron toxicidad frente a insectos plaga de grano almacenado (Schmidt & Streloke, 1994; Shaaya et al., 1997; Tun & Daly, 2000; Tripathi et al., 2003; Cox, 2004; Navarro, 2006; Wang et al., 2006; Barbosa de Azevedo et al., 2008; Sahaf et al., 2008). Los aceites esenciales y sus constituyentes, particularmente los monoterpenos, produjeron efectos t oxicos comparables a los del bromuro de metilo frente a algunos insectos del almacenaje (Isman, 2000; Tunc et al., 2000; Weaver & Subramanyam, 2000; Shaaya et al., 2003).

31

2.2.

Hip otesis

1. Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus presentan actividad insecticida en larvas de 25 d as y en adultos de 3 a 4 d as de edad de T. castaneum y S. oryzae. 2. La susceptibilidad frente a los aceites var a seg un la especie y el estado de desarrollo del insecto.

2.3.

Objetivo espec co

Evaluar la actividad insecticida de los aceites esenciales de hojas de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de 25 d as y en adultos de 3 a 4 d as de edad de T. castaneum y S. oryzae mediante toxicidad fumigante y toxicidad por contacto en papeles de ltro.

2.4.
2.4.1.

Materiales y M etodos
Insectos

Lo ejemplares de T. castaneum provinieron de una colonia susceptible del Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CIPEINCITEDEF/CONICET) que se criaron en recipientes de vidrio de 8 cm de di ametro y 13 cm de alto, cerrados con tela de malla na y se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura y humedad relativa (25 C, 60-70 % HR) y un fotoper odo 12:12 (L:O) utilizando como alimento una mezcla de levadura, trigo y leche en polvo en una proporci on 1:13:1 (F.A.O, 1974). Los ejemplares de S.oryzae provinieron de una colonia susceptible mantenida en la C atedra de Zoolog a Agr cola de la Universidad Nacional de Buenos Aires (UBA). Los insectos se criaron en recipientes de vidrio de 8 cm de di ametro, 13 cm de alto, cubiertos 32

con una tela de malla na y mantenidos a 28 C, 60-70 % HR, con un fotoper odo de 12:12 (L:O) utilizando granos de trigo entero para su alimentaci on.

2.4.2.
2.4.2.1.

Material vegetal
Obtenci on de los Aceites Esenciales

Las hojas de T. terniora, C. citratus y E. muticus se colectaron durante la epoca estival en la Provincia de Salta, Argentina Todos los aceites esenciales fueron facilitados por el Ing. N.A. Bonini Prof Asoc. Qca. Org. I. Fac. de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de Salta. Los mismos se obtuvieron por hidrodestilaci on en un aparato tipo Clevenger durante 3 a 4 hs; se analizaron por Cromatograf a Gaseosa acoplada a Espectrometr a de Masas (CGSM HP5972A) en una columna HP5 (30 m x 0,25 nm) con un programa de temperaturas de 50 C/2//5 C/min//200/15. 50 2 30 En la Tabla 2.1 se detallan los compuestos mayoritarios y el % de correlaci on de los aceites esenciales de de T. terniora, C. citratus y E. muticus.

2.4.3.
2.4.3.1.

Bioensayos
Toxicidad fumigante de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae

La toxicidad fumigante se evalu o utilizando frascos de vidrio de 40 ml con tapa a rosca. En el interior de los mismos se coloc o una campanita de vidrio tipo Durham de 0,8 cm de di ametro y 2,8 cm de alto, dentro de la misma se coloc o un papel de ltro de 5cm2 tratado con soluciones hex anicas de los aceites a diferentes concentraciones y se cubri o con una tela na para evitar el contacto entre los insectos y la soluci on. Como control se utiliz o papel de ltro rociado con 50 l de hexano. En los frascos de vidrio se liberaron 10 insectos 33

Tabla 2.1: Constituyentes de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus Aceite esencial Compuesto cis-ocimeno dihidrotagetona T. terniora cis+trans tagetona cis+trans ocimenona otros componentes neral geranial C. citratus acetato de nerilo oxido de carioleno neral E. muticus geranial acetato de nerilo carioleno oxido de carioleno % de Correlaci on 27,3 16,8 26 17,5 23 31,3 45,4 13,6 9,7 29 41,83 7,6 10,6 11.03

34

(larvas o adultos seg un correspondiera) (Pascual-Villalobos et al., 2004). Estos frascos se mantuvieron de acuerdo a las condiciones de cr a descriptas en el punto 2.4.1. A las 72 hs se registr o la mortalidad estim andose las CL50 mediante el programa Micro Probit 3.0. Cada experimento se repiti o tres veces en forma independiente.

2.4.3.2.

Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae

La actividad por contacto se evalu o mediante el m etodo de impregnaci on de papel. Al cuotas de 0,7 ml de soluciones hex anicas de los aceites esenciales se aplicaron a papeles de ltro (Whatman N 1). Como control se rociaron papeles de ltro con hexano solo. El solvente se dej o evaporar durante 10 min. Cada papel de ltro se coloc o dentro de una caja de Petri de vidrio de 9 cm de d ametro en cuyo interior se liberaron 10 insectos (larvas o adultos seg un correspondiera). Una tapa pl astica con agujeros se coloc o sobre los insectos para prevenir su escape. Los insectos se mantuvieron de acuerdo a las condiciones de cr a descriptas en el punto 2.4.1. A las 72 hs se registr o la mortalidad y se estimaron las CL50 mediante el programa Micro Probit 3.0. Cada experimento se repiti o tres veces de forma independiente (F.A.O, 1974).

2.5.
2.5.1.

Resultados
Toxicidad fumigante de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae

No se observ o toxicidad fumigante en larvas de 25 d as de T. castaneum con los aceites esenciales T. terniora, C. citratus y E. muticus. 35

Tabla 2.2: Toxicidad fumigante del aceite esencial de T. terniora en adultos de T. castaneum y S. oryzae Insectos T. castaneum S. oryzae CL50 362,82a 322,61a 95 % IC (302,00-426,18) (264,9-387,44) CL95 817,42 844,09 95 % IC (642,06-1310,20) (636,23-1445,12) Pendiente ES 4,661 3,931 X2 1,68 0,48

N umeros en la misma columna seguidos de la misma letra no presentan diferencias signicativas (p>0,05). LD50 : Concentraci on Letal 50 (g /cm2 ); LD95 : Concentraci on Letal 95 (g /cm2 ); IC 95 %: Intervalo de Conanza 95 %; ES: Error estandar.

No se observ o mortalidad en adultos de T. castaneum y S. oryzae con los aceites de hojas de C. citratus y E. muticus. El aceite esencial de T. terniora result o t oxico para adultos de T. castaneum y S. oryzae con una CL50 = 362,82 g /cm2 y 322,61 g /cm2 respectivamente. El an alisis estad stico de los datos revela que no se hallaron diferencias signicativas en este par ametro para ambas plagas (p>0,05) (Tabla 2.2).

2.5.2.

Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae

No se observ o toxicidad por contacto en larvas de 25 d as de T. castaneum con los aceites esenciales T. terniora, C. citratus y E. muticus. Los aceites de C. citratus y E. muticus no produjeron toxocidad por contacto en adultos de T. castaneum El aceite de hojas de T. terniora produjo mortalidad por contacto en los adultos de ambas plagas, resultando S. oryzae m as susceptible que T. castaneum (Tabla 2.3).

36

Tabla 2.3: Toxicidad por contacto de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae CL50 Aceite Insecto (95 % IC) 217,26a T. castaneum (185,4-254,32) T. terniora 146,58b S. orizae (120,4-176,7) 435,41b C. citrarus S. orizae (332,01-523,5) 99,63a E. muticus S. orizae (74,1-136,45) (335,2-1127,38) (913,4-1783,8) 533,15 2,251 0,63 (330,25-671,07) 1158,29 3,871 2,91 434,31 3,48 0,912 (380,8-695,43) (95 % IC) 476,60 4,821 0,626 CL95 Slope ES X2

N umeros en la misma columna seguidos de la misma letra no presentan diferencias signicativas. LD50 : Concentraci on Letal 50 (g /cm2 ); LD95 : Concentraci on Letal 95 (g /cm2 ); IC 95 %: Intervalo de Conanza 95 %; ES: Error estandar.

El aceite esencial de E. muticus result o m as t oxico que C. citratus en S. oryzae con una CL50 = 99,63 g /cm2 y 435,41g /cm2 respectivamente. Adem as no se observaron diferencias signicativas (p>0,05) entre la CL50 de E. muticus y T. terniora (Tabla 2.3).

2.6.

Discusi on

Es sabido que los compuestos m as activos sobre un insecto no lo son para otros, incluso para la misma especie la actividad puede variar en los diferentes estados de desarrollo (Hamraoui & Regnault-Roger, 1997). Este fen omeno se observa con frecuencia en plagas de grano almacenado (Stadler et al., 1990; Rejendran & Sriranjini, 2008; Nyamador et al., 2009). Nuestros resultados son comparables con los de los autores antes 37

mencionados puesto que los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus no produjeron efecto t oxico en larvas de a trav es de los m etodos evaluados. La ausencia de toxicidad en larvas frente a los aceites esenciales podr a ser atribuida a diferentes factores, algunos de ellos realacionados con la propia siolog a del insecto. En referencia a esto u ltimo, dos mecanismos estar an implicados en la detoxicaci on de estos productos por parte de las larvas. Uno de ellos se relaciona con la capacidad de estos organismos para acumular gran cantidad de grasa, especialmente durante los u ltimos estad os; as antes de mudar a pupa m as del 30 % del peso corporal de la larva corresponde a tejido adiposo, en donde la mayor a de los insecticidas se acumulan volvi endose inactivos (Gillott, 2005). El otro mecanismo es la muda o ecdisis que se observa a menudo durante el trascurso de los ensayos y que permitir a a la larva remover los t oxicos a trav es de la exuvia (Ho et al., 1995). Otro factor implicado es la concentraci on utililzada en los bioensayos. Algunos autores sugieren que mayores concentraciones de los productos ser an necesarias para lograr efecto t oxico en las larvas (Ho et al., 1996; Huang et al., 1997; Liu & Ho, 1999; Mondal & Khalequzzaman, 2006). La toxicidad de los aceites esenciales en plagas del almacenaje es inuenciada por la composici on qu mica que estos presentan (Rajendran & Sriranjini, 2008). Adem as, aquellos constituyentes que se encuentran en bajas proporciones pueden actuar como sinergistas aumentando el efecto de los componentes mayoritarios a trav es de mecanismos muy variados (Berenbaum, 1985; Tripathi et al., 2009). Varios autores, al realizar bioensayos de toxicidad en insectos observaron efectos sin ergicos de los componentes individuales de los aceites, principalmente monoterpenos que resultan en un marcado aumento de la mortalidad (Krishnarajah et al., 1985; Don-Pedro, 1996; Hummelbrunner & Isman, 2001). El importante efecto t oxico por contacto del aceite esencial de E. muticus en S. oryzae podr a deberse a un efecto individual y/o sin ergico de alguno de sus constituyentes. Si se comparan los aceites esenciales de C. citratus y E. muticus (Tabla 2.1), en este u ltimo el carioleno aparece como el u nico compuesto diferencial entre ambos aceites, pudiendo ser 38

el responsable de efecto t oxico observado. Se ha observado actividad adulticida en S. oryzae al evaluar diferentes aceites esenciales y sus componentes mayoritarios (Pad n et al., 2000; Tripathi et al., 2003; Pascual-Villalobos et al., 2004; L opez et al., 2008; Ogendo et al., 2008). Independientemente de la variabilidad toqu mica de los aceites esenciales, su efecto t oxico depende tambi en del punto de entrada al organismo. Los aceites esenciales pueden ser ingeridos con la dieta, inhalados por v a respiratoria y absorbidos a trav es de la cut cula (Tripathi et al., 2009). El aceite esencial de T. terniora gener o toxicidad a trav es de la cuticula y por v a respiratoria en adultos de ambas plagas de grano almacenado. En el caso particular de la toxicidad por contacto T. castaneum result o m as tolerante que S. oryzae. Similares resultados han sido informado por otros autores (Shaaya et al., 1997; Negahban et al., 2006; Sahaf et al., 2008; Ko Ko et al., 2009). La tolerancia observada en T. castaneum podr a deberse a la capacidad de la cut cula de este insecto para solubilizar y retener la sustancia t oxica evitando que ingrese al organismo (Gillott, 2005). Es sabido que la composici on de los l pidos y otros componentes cuticulares var a entre las especies de insectos constituyendo un car acter de diferenciaci on interespec ca (Hackman, 1964; Neville, 1975). Algunos autores han atribu do variaciones en la susceptibilidad a diferentes productos debidas a cambios en los componentes presentes en la cut cula de cole opteros plaga de grano almacenado (Korunic, 1997; Mewisa & Ulrichs, 2001; Korunic & Fields, 2006). En concecuencia, alg un componente diferencial presente en T. castaneum podr a ser la explicaci on a la tolerancia observada en nuestro estudio.

2.7.

Resumen de la actividad insecticida

En larvas de 25 d as de T. castaneum

39

Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus no produjeron efecto t oxico fumigante ni mortalidad por contacto. En adultos de 3 a 4 d as de edad de T. castaneum El aceite esencial de T. terniora produjo efecto t oxico fumigante y mortalidad por contacto. Los aceites esenciales de C. citratus y E. muticus no produjeron efecto t oxico fumigante ni mortalidad por contacto. En adultos de 3 a 4 d as de edad de S. oryzae El aceite esencial de T. terniora produjo efecto t oxico fumigante. Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus produjereron mortalidad por contacto. La actividad insecticida de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus se evalu o en larvas de 25 d as y adultos de 3 a 4 d as de edad de T. castaneum y adultos de S. oryzae mediante toxicidad fumigante y por contacto. En base a los resultados obtenidos y a las hip otesis planteadas en el punto 2.1.1 podemos inferir que: La primera hip otesis se acepta parcialmente dado que los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus no generaron toxicidad fumigante y por contacto en larvas de T. castaneum. En tanto que los aceites esenciales de C. citratus y E. muticus no generaron toxicidad fumigante y por contacto en adultos de T. castaneum ni toxicidad fumigante en adutos de S. oryzae. La segunda hip otesis se acepta parcialmente dado que frente al aceite esencial de T. terniora no existieron variaciones en la susceptibilidad entre los adultos de ambas especies cuando se evalu o el efecto fumigante.

40

Cap tulo 3 Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae
3.1. Introducci on

La quimiorrecepci on a distancia (olfato) y la de contacto (gusto) constituyen procesos extremadamente importantes en los insectos debido a que generan algunos de los patrones de comportamiento m as relevantes, como la b usqueda de alimento, selecci on de sitios adecuados para la ovoposici on, localizaci on de parejas u hospedadores, formaci on de castas en los insectos sociales y respuestas a sustancias atractantes y/o repelentes (Gillott, 2005). Es as que el comportamiento de los insectos, a diferencia del de los vertebrados, es mucho m as dependiente de se nales qu micas que de cualquier otro tipo de est mulo (visual, t actil o auditivo). Los receptores moleculares del olfato y del gusto se localizan principalmente en antenas, palpos bucales, tarsos y ovopositor y la decisi on de alimentarse o no est a de41

terminada por est mulos positivos o negativos sobre dichos receptores (Dahanukar et al., 2005). En la relaci on planta-insecto, es el sentido del olfato el encargado de la recepci on a distancia de los est mulos qu micos que provocaran la primera respuesta del insecto o bien atray endolo hacia la fuente emisora o bien repeliendolo de la misma (Koul & Dhaliwal, 2005). Estas sustancias qu micas emitidas por las plantas capaces de modicar el comportamiento se denominan aleloqu micos y se agrupan en dos grandes categorias: las kairomonas son sustancias qu micas que al ser liberadas benecian solamente al agente receptor permitiendo por ejemplo, que el insecto reconozca una planta hospedera. Las alomonas, por su parte, son sustancias que favorecen u nicamente al emisor actuando como repelentes y disuasivos de alimentaci on u oviposici on. (Gillott, 2005). Los repelentes han sido denidos como sustancias qu micas que act uan localmente o a distancia provocando el alejamiento de un insecto de la fuente emisora y previniendo as su alimentaci on (Dethier et al., 1960; Choochote et al., 2007). En la agricultura tradicional de Africa, India y Europa una pr actica com un consist a en mezclar material de plantas locales con granos almacenados destinados a la alimentaci on para reducir la presencia de plagas. As , hojas de neem o de menta, eran utilizadas en los sitios de almacenamiento para repeler insectos (Van Puyvelde, 1976; Ignatowicz et al., 1994). Los peque nos productores del sudoeste de Francia, ten an la costumbre de colocar plantas olorosas como menta, ajo o laurel en el interior de los sacos de granos para protegerlos de la infestaci on (Regnault-Roger & Vincent, 2004) Durante la Segunda Guerra se inviertieron esfuerzos y dinero en la investigaci on y s ntesis de nuevos qu micos repelentes as , entre 1952 y 1962 se testearon m as de 11.000 compuestos de los cuales s olo unos pocos fueron efectivos contra un amplio rango de insectos (Ryan, 2002). Entre ellos podemos mencionar al DEET, (N,N-dietil-meta -toluamida, que permanece actualmente como el m as efectivo y a pesar de sus efectos adversos sobre

42

la salud del hombre no se ha encontrado a un un sustituto que otorgue el mismo grado de protecci on y la efectividad repelente frente a artr opodos hemat ofagos (Nerio et al., 2009). El consumo de repelentes utilizados en los sitios donde se almacenan los granos ha aumentado notablemente en los u ltimos a nos. Estos productos se emplean como protectores evitando que el insecto se acerque al grano, adem as de prevenir la alimentaci on y la oviposici on (Fields et al., 2001). Generalmente son colocados alrededor de los silos, en los empaques o como preventivos tratando las estructuras de almacenaje antes de guardar el grano fresco (Cox, 2004). El uso intensivo y extensivo de repelentes ha generado serios inconvenientes relacionados con la salud del hombre y del planeta (Nerio et al., 2009). As , la necesidad de encontrar productos efectivos, persistentes y pr acticos de utilizar ha incrementado el inter es por las sustancias repelentes de origen vegetal. En esa b usqueda incesante se han encontrado aceites esenciales que presentan efecto repelente en plagas del almacenaje. El aceite esencial de Ocimum kilimandscharicum (Lamiaceae) fue repelente en adultos de Sitophilus granarius, S. zeamais y T. castaneum (Obeng-Ofori et al., 1998). En este u ltimo insecto tambi en se registr o actividad repelente con los aceites de Chrysanthemum coronarium (Asteraceae), Evodia rutaecarpa (Rutaceae) y Ocimum gratissimum (Lamiaceae) (Perez & Pascual-Villalobos, 1999; Liu & Ho, 1999; Ogendo et al., 2008). Descamps (2007), encontr o efecto repelente en larvas de T. castaneum con aceite esencial de hojas de Schinus molle var. areira (Anacardiaceae). El aceite de O. gratissimum, tambi en gener o repelencia en S. oryzae,O. surinamensis, R. dominica y Callosobruchus chinensis (Ogendo et al., 2008). Los aceites esenciales de Foeniculum vulgare (Apiaceae) y Citrus bergamia (Rutacaea) fueron repelentes para S. zeamais y C. ferrugineus, en tanto que Laurus nobilis (Lauraceae) fue efectivo en larvas de T. molitor (Cosimi et al., 2009) citas de repelencia en larvas.

43

3.2.

Hip otesis

Los aceites esenciales de hojas de T.terniora, C.citratus y E. miticus producen efectos repelentes en larvas de 25 d as y en adultos de 3 a 4 d as de edad de T. castaneum y S. oryzae.

3.3.

Objetivo espec co

Evaluar la actividad repelente de los aceites esenciales de hojas de T.terniora, C.citratus y E. miticus en larvas y en adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae a trav es del m etodo de impregnaci on de dieta.

3.4.
3.4.1.
3.4.1.1.

Materiales y M etodos
Bioensayos
Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de 25 d as de T. castaneum

Para evaluar el efecto repelente se realiz o la prueba de impregnaci on de dieta. Cajas de Petri de 9 cm de di ametro se dividieron en tres zonas. En una zona, se colocaron 2 gramos de dieta tratada con 2 ml de hexano como control. La zona central se dej o libre. En la zona restante se colocaron 2 gramos de dieta tratada con 2 ml de las soluciones hex anicas de los aceites a las concentraciones de 0,04, 1, y 4 % (p/v). El solvente se dej o evaporar por 48 horas. En la zona central se liberaron 10 larvas de 25 d as. A las 2 y 24 h se registr o el n umero de larvas distribu das en cada mont on de dieta ofrecida. El bioensayo se repiti o en forma independiente al menos 3 veces. Se calcul o el Indice de Repelencia como IR = (C T )/(C + T )x100 siendo C= n de larvas en la zona no tratada o dieta control y T= n de larvas en la zona tratada o en dieta tratada. Valores positivos de IR indican 44

repelencia y valores negativos atractancia (Pascual Villalobos, 1998). Los datos obtenidos fueron analizados mediante an alisis de la varianza (ANOVA) y prueba de comparaci on de medias (DMS: Diferencias M nimas Signicativa) (Zar, 1999).

3.4.1.2.

Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae

Para evaluar el efecto repelente se utiliz o una arena experimental de vidrio formada por una caja central conectada por cilindros a cuatro cajas distribuidas sim etricamente alrededor de la primera. En dos de las cajas se colocaron 2 gramos de dieta tratada con soluciones hex anicas de los aceites a las concentraciones de 0,04 % y 2 % y en las dos restantes, se colocaron 2 gramos de dieta impregnada con 2 ml de hexano (control). En la central se liberaron 40 adultos, no sexados, de T. castaneum o S. oryzae. La evaluaci on del ensayo se realiz o a las 24 h. Se calcul o el Indice de Preferencia como IP = ( % de insectos en la dieta tratada) - ( % de insectos en dieta no tratada) / ( % de insectos en dieta tratada) + ( % de insectos en dieta no tratada) donde IP= -1,00 a -0,10 indica planta repelente; IP= -0,10 a + 0,10 planta neutra e IP= +0,10 a +1,00 planta atractante (Procopio et al., 2003). Se realizaron al menos tres r eplicas.

3.5.
3.5.1.

Resultados
Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de T. castaneum

En la Tabla 3.1 se resumen los efectos repelentes de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en larvas de T. castaneum. Los aceites esenciales de T. terniora y E. muticus, a las 2 hs, presentaron efecto repelente que fue concentraci on-dependiente. Al 4 % los valores de IR fueron superiores

45

Tabla 3.1: Actividad repelente en larvas de 25 d as de T. castaneum causada por los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus a diferentes tiempos y concentraciones. Concentraci on Aceite % (p/v ) 2h 0, 04 1 T. terniora 4 0, 04 1 C. citratus 4 0, 04 1 E. muticus 4
a

Indice de Repelencia ( % ESa ) 24 h 6, 66 0, 06a 73, 33 0, 06b 93, 33 0, 06b 6, 66 0, 06a 86, 66 0,06b 66, 66 0,06b 0 0a 60 0, 2a 46, 66 0, 24a

26, 66 0, 24a 60 0, 23a 93, 33 0, 06a 6, 66 0, 17a 46, 66 0, 17b 66, 66 0, 06b 33, 33 0,13a 60 0, 11a 100 0b

Los valores son las medias sin transformar ES. Valores seguidos por la misma letra no dieren signicativamente (DMS, p > 0,05).

46

al 90 %. EL aceite esencial de C. citratus produjo efecto repelente a las concentraciones de 1 % y 4 %, en tanto que al 0,04 % se registr o atractancia (Tabla 3.1). A las 24 hs los IR uctuaron en relaci on a las concentraciones para cada aceite. As , a la concentraci on de 0,04 % los aceites esenciales de T. terniora y E. muticus registraron una disminuci on del efecto repelente, en tanto que C. citratus mantuvo el efecto atractante. A las concentraciones de 1 % y 4 %, la repelencia de los tres aceites vari o entre 45 % y 90 % , siendo T. terniora el m as efectivo con un porcentaje de repelencia de 93,33 % a la mayor concentraci on (Tabla 3.1). Cuando se realiz o el an alisis estad stico de los datos de la actividad repelente se comprob o que no existen diferencias signicativas (p > 0,0)) entre los tratamientos efectuado a las 2 hs con el aceite esencial de T. terniora ; en tanto que existen diferencias signicativas (p > 0,05) entre los tratamientos con los aceites esenciales C. citratus y E. muticus y adem as existen diferencias signicativas entre las concentraciones de 1 % y 4 % con la de 0,04 % para el aceite de C. citratus y entre 0,04 % y 1 % con la de 4 % para el aceite de E. muticus (DMS,(p > 0,05)) (Tabla 3.1). A las 24 hs se cmprob o que no existen diferencias signicativas ((p > 0,05)) entre los tratamientos con el aceite esencial de E. muticus ; para T. terniora y C. citratus se encontraron diferencias signicativas entre los tratamientos (p > 0,05) y adem as existen diferencias signicativas entre las concentraciones de 1 % y 4 % con la de 0,04 % para ambos aceites (DMS,(p > 0,05)) (Tabla 3.1).

3.5.2.

Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en adultos de T. castaneum y S. oryzae

En adultos de T. castaneum y S. orizae los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus produjeron efecto repelente para ambas concentraciones. El porcentaje m as bajo 47

de repelencia fue de 66,22 % con C. citratus al 0,04 % en T. castaneum. El resto de los valores oscil o entre 73 y 96 % correspondiendo este u ltimo valor al obtenido con el aceite de E. muticus a la concentracion de 2 % en T. castaneum (Tabla 3.2).

3.6.

Discusi on

Aunque el grano que se retira del silo se encuentre libre de infestaci on, los insectos pueden entrar en los empaques de madera, en los sitios de almacenaje temporario e incluso infestar productos manofacturados que se encuentran al nal de la cadena de comercializaci on como deos, arroz, cereales y chocolates. Durante el empaque de los granos se utilizan repelentes para prevenir el ataque de insectos, la piretrinas sinergizadas con bot oxido de piperonilo, el metil salicilato y el DEET son los m as utilizadas en los sitios de empaque (Hou et al., 2004). El aumento de las restricciones en la utilizaci on de insecticidads sint eticos increment o en los ultimos a nos, la b usqueda de compuestos alternativos para la protecci on de granos. Los aceites esenciales constituyen una excelente opci on ya que se ha demostrado su actividad repelente frente a plagas de grano almacenado (Pascual-Villalobos et al., 2004; Wang et al., 2006; Liu et al., 2006; Stefanazzi et al., 2006a; Benzi & Ferrero, 2009; Ukeh et al., 2009; Nerio et al., 2009). Los resultados obtenidos en nuestro trabajo indican que los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus producen efecto repelente en T. castaneum y S. oryzae (Tablas 3.1 y 3.2) . En larvas de T. castaneum a las 2 hs, los tres aceites produjeron efecto repelente a las mayores concentraciones, sin embargo, al 0,04 % los aceites de T. terniora y E. muticus regitraron porcentajes de repelencia bajos con IR menores al 35 % en tanto que, para C. citratus se observ o atractancia (Tabla 3.1). Los valores de IR registrados para los tres aceites podr an estar relacionados con la baja concentraci on utilizada. Es sabido que el efecto 48

Tabla 3.2: Actividad repelente en adultos de T. castaneum y S. oryzae causada por los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus a las 24 hs y a diferentes concentraciones. Concentraci on Insecto Aceite ( %)(p/v ) 0,04 T. terniora 2 T. castaneum 0,04 C. citratus 2 0,04 E. muticus 2 0,04 T. terniora 2 S. oryzae 0,04 C. citratus 2 0,04 E. muticus 2 81,52 0,62
PI: Preference index: 1,0 to 0,1 repellent plant; 0,1 to +0,1 neutral plant, and +0,1 to +1,0 attractant plant.

Repelencia ( %) 80,1 90,93 66,22 84,52 75,61 96,53 80,69 73,19 73,41 89,26 75,61

PI ( %) 0,6 0,84 0.32 0.69 0,5 0,93 0.61 0.46 0,46 0,78 0.5

49

de un producto qu mico depende de muchas variables, entre ellas de la concentraci on, y es por ello que una misma sustancia puede comportarse como repelente o atractante dependiendo de las condiciones dadas en el bioensayo (Giordano et al., 2000). Por otra parte, la mezcla de la dieta tratada con la dieta control debida a la propia actividad del insecto, tamb en podr a estar favoreciendo el efecto atractante observado para C. citratus. Similares resultados se registraron en larvas de T. cataneum al utilizar diferentes compuestos a bajas concentraciones (Pascual Villalobos, 1998; Pascual-Villalobos & Robledo, 1999; Descamps, 2007) Transcurridas las 24 hs se registraron diferentes resultados que variaron seg un el aceite y la concentraci on (Tabla 3.1). As los aceites de T. terniora y C. citratus mantuvieron el efecto repelente en larvas de T. castaneum a la mayor concentraci on, siendo estos resultados concordantes con datos encontrados en la bibliograf a consultada (PascualVillalobos & Robledo, 1999; Gutierrez et al., 2006; Stefanazzi et al., 2006b; Descamps, 2007; Gutierrez et al., 2008). Adem as, para estos mismos aceites se registr o un aumento del efecto repelente al 1 % (Tabla). El aumento de la repelencia en funci on del tiempo podr a ser atribu da al comportamiento sico-qu mico de los compuestos presentes en el aceite. Estudios de repelencia realizados en larvas de T. molitor indican que algunos componentes requieren que transcurra un tiempo determinado para activar los receptores localizados en el cuerpo del insecto, ese tiempo adem as se modica seg un la concentraci on utilizada en el bioensayo (Garcia et al., 2003). En consecuencia y en base a los resultados obtenidos, se podr a inferir que los aceites de T. terniora y C. citratus al 1 %, tienen este tipo de comportamiento. Continuando con el an alisis de la repelencia observada a las 24 hs, los aceite esenciales de T. terniora al 0,04 % y E. muticus al 0,04 y 4 % registraron una disminuci on del efecto repelente (Tabla 3.1). Esto podr a deberse a que en general, los efectos protectores de los aceites esenciales se disipan relativamente r apido debido a que poseen componentes de bajo peso molecular que se volatilizan muy f acilmente (Trongtokit et al., 2005; Shaaya 50

& Rafaeli, 2007). Es por ello que el tipo de formulaci on de productos basados en aceites esenciales es de vital importancia para permitir la liberaci on controlada del compuesto, reducir las p erdidas de los principios activos y prolongar as el efecto repelente (Tripathi et al., 2009; Nerio et al., 2010). Precisamente la p erdida de componentes debida a la volatilizaci on podr a explicar la disminuc on de la repelencia observada en nuestro estudio. El mismo efecto fue registrado por Jilani y Saxena (1990) y Liu y Ho (1999) al evaluar diferentes aceites esenciales en plagas del almacenaje . En adultos de T. castaneum y S. oryzae los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus produjeron efecto repelente a las diferentes concentraciones con valores de IR que oscilaron entre 66 % y 96 % (Tabla 3.2). El mismo efecto para estas mismas especies plaga ha sido informado con los aceites esenciales de Ocium kilimandscharicum (Lamiaceae), Carum copticum (Apiaceae), Vitex pseudo-negundo (Verbenaceae), Artemisia vulgaris, A. princeps y A. absinthium (Asteraceae) y Schinus molle var. areira (Anacardiaceae) entre otros (Obeng-Ofori et al., 1998; Liu et al., 2006; Wang et al., 2006; Sahaf & Moharramipour, 2007; Stefanazzi et al., 2007; Benzi & Ferrero, 2009)

3.7.

Resumen de la actividad repelente

En larvas de 25 d as de T. castaneum Todos los aceites esenciales fueron repelentes a las concentraciones de 1 y 4 % tanto a las 2 como a las 24 hs. El aceite de C. citratus result o atractante a la menor concentraci on utilizada tanto a las 2 como a las 24 hs. En adultos de T. castaneum y S. oryzae Todos los aceites esenciales resultaron repelentes. 51

La actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus se evalu o en larvas de 25 d as y adultos de T. castaneum y de S. oryzae a trav es del m etodo de impregnaci on de dieta. En base a los resultados obtenidos se acepta parcialmente la hip otesis planteada en el punto 3.1.1. dado que: En larvas de 25 d as de T. astaneum el aceite esencial de C. citratus result o atractante a la menor concentraci on.

52

Cap tulo 4 Efectos sobre la siolog a nutricional y actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae
4.1. Introducci on

Una combinaci on compleja de se nales visuales, mec anicas y qu micas le permiten al insecto localizar, seleccionar y nalmente poder ingerir el alimento. Para ello debe ser atra do hacia la fuente donde realiza un reconocimiento mediante sus receptores gustativos, seguidamente prueba y nalmente determina si continuar a aliment andose. La decisi on de continuar o no con la ingesta generalmente esta determinada por el est mulo captado por quimiosensilas presentes en la cavidad bucal, palpos o antenas (Nation, 2002; Gillott, 2005). Estas quimiosensilas poseen receptores gustativos selectivos para sustancias 53

inductoras (fagoestimulantes) o inhibidoras de la alimentaci on (fagodisuasivas) que al ser activados env an la se nal al sistema nervioso central y generan as la respuesta en el insecto (Isman, 2002). La categor a de fagoestimulante o fagodisuasivo se le asigna a productos que inuencian el comportamiento alimentario afectando las variables siol ogicas. Al momento de categorizar un producto qu mico como por ejemplo un aceite esencial o alguno de sus componentes, es importante tener en cuenta que sus efectos dependeran de muchas variables. El tipo de metodolog a utilizada para la extracci on del aceite, las concentraciones, las condiciones del bioensayo y la especie seleccionada para probar dicho efecto entre otras. Es as que, dependiendo de todas estas variables un mismo producto puede presentarse como fagodisuasivo, fagoestimulante o no poseer ning un efecto (Giordano et al., 2000). Muchas sustancias de origen vegetal (aleloqu micos) previenen o reducen la alimentaci on en insectos como resultado de efectos pre-ingestivos (disuasorios de la alimentaci on) o pos-ingestivos (t oxicos) (Liu & Ho, 1999). La estrategia m as ecaz para encontrar estas sustancias es la de aislar metabolitos secundarios de las plantas y ensayar estos compuestos frente a los insectos mediante bioensayos que simulen las condiciones de campo, referidas a los h abitos de alimentaci on del insecto. En un sistema agr cola, por ejemplo, el caso m as com un es la situaci on de no preferencia, es decir sin posibilidad de elecci on (Caballero Garc a, 2004). En el laboratorio los bioensayos de no preferencia, constituyen una prueba r apida y econ omica que permiten establecer la actividad fagodisuasiva de una sustancia de origen vegetal mediante el calculo de un Indice Fagodisuasivo (IF) cuyos valores determinan si la sustancia vegetal en estudio posee efecto estimulante o inhibitorio de la alimentaci on (Isman, 2002). Liu y Ho (1999) a trav es de un ensayo de no elecci on realizado con peque nos discos de harina, registraron efectos antialimentarios en larvas de T.castaneum y adultos de S. zeamais utilizando aceite esencial de Evodia rutaecarpa (Rutacea) . 54

En el a no 2000, Giordano et al. evaluaron la bioactividad de metabolitos secundarios de plantas en T. molitor determinando relaciones entre las estructuras de las mol eculas y la actividad antialimentaria. Los autores informaron que ciertos grupos funcionales y rasgos estructurales de la mol ecula son fundamentales para elicitar el mecanismo antialimentario. La misma relaci on estructura-actividad fue encontrada por Caballero Garc a en 2004. En este caso fue registrada la actividad antialimentaria de tres grupos de terpenoides (diterpenos neo-clerod anicos, sesquiterpenos y limonoides) frente al escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera) y Spodoptera exigua (Lepidoptera). Los resultados manifestaron que, m nimos cambios en la estructura de las mol eculas son responsables de cambios, tanto en el tipo de actividad como en la especicidad por alguna de las dos especies. Por otra parte resulta importante estudiar los efectos de compuestos aleloqu micos sobre la siolog a nutricional de insectos (Beck & Reese, 1975) . En estos organismos, como en cualquier otro, resulta importante el balance de nutrientes para un buen crecimiento. Se ha demostrado que algunos insectos tienen la capacidad de seleccionar determinados componentes tanto de alimeto natural como de dietas articiales suministradas en laboratorio mediante cambios en la sensibilidad en los quimiorreceptores del gusto (Nation, 2002) As , a trav es de bioensayos se pueden evaluar los efectos sobre la siolog a nutricional de un insecto a trav es del uso de Indices Nutricionales. La tasa de crecimiento relativo (TCR) es uno de los m as utilizados ya que permite determinar la calidad de la dieta suministrada (Nation, 2002). Otros par ametros como la tasa de crecimiento relativo (TCR) , la tasa relativa de consumo (TRC) y la eciencia de conversi on del alimento ingerido (ECAI) permiten completar el an alisis. Adem as, la comparaci on de los ndices permite determinar si la actividad antialimentaria se debe el efecto disuasorio del compuesto evaluado o es consecuencia de un modo de acci on t oxico (Gols et al., 1996).

55

Varios autores han informado alteraciones siol ogicas en insectos plaga al evaluar diferentes compuestos de origen vegetal (Rodr guez Hernandez & Vedramim, 1998; Stefanazzi et al., 2006a; Descamps, 2007; Benzi & Ferrero, 2009; Stefanazzi et al., 2009)

4.2.

Hip otesis

1. Los aceites esenciales de hojas de T.terniora, C.citratus y E.miticus producen efectos fagodisuasivos y alteraciones en la siolog a nutricional, medida a trav es de alteraciones en los ndices nutricionales, en larvas y en adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae. 2. Los aceites esenciales de hojas de T.terniora, C.citratus y E.miticus producen toxicidad post-ingesta en larvas y en adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae.

4.3.

Objetivos espec cos

1. Evaluar el Indice fagodisuasivo (IF) de los aceites esenciales de hojas de T.terniora, C.citratus, y E.miticus en larvas y en adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae a trav es de ensayos de no preferencia (sin posibilidad de elecci on). 2. Evaluar posibles efectos sobre la siolog aa nutricional a trav es de la medici on de los Indices Nutricionales como Tasa Relativa de Consumo (TRC), Tasa de Crecimiento Relativo(TCR) y Eciencia de Conversi on del Alimento Ingerido (ECAI). 3. Evaluar si la mortalidad de los insectos se debe a una toxocidad post-intgesta o a alteraciones en el comportamiento.

56

4.4.

Materiales y M etodos

Para evaluar el efecto fagodisuasivo y las alteraciones en la siolog a nutricional en larvas y en adultos de T. castaneum y en adultos de S. oryzae se prepararon discos de harina (Huang et al., 2000). Al cuotas de 200 l de una suspensi on de harina en agua (10 g/50 ml) se colocaron en placas de pl astico para formar los discos que se dejaron secar en una c amara a 25 C y 60/70 % de humedad relativa durante toda la noche. Los discos se pesaron registr andose valores entre 70 y 78 mg se topicaron con 10 l de soluciones hex anicas de los aceites a las concentraciones de 0, 1 y 4 mg/disco, se pesaron y se colocaron en recipientes separados. Se prepar o un grupo control con discos tratados con hexano. En cada recipiente se colocaron 10 insectos previamente pesados en una balanza marca OHAU SAP210S (210 g. x 0,1mg.). Luego de mantenerlos durante 72 horas en condiciones controladas, se registr o el peso de los discos y la mortalidad y el peso de los insectos vivos. Se realizaron cinco r eplicas. Se calcularon los Indices Nutricionales: Tasa de Crecimiento Relativa TCR= (A-B)/(Bxd a) donde A= peso de los insectos vivos al tercer d a/n umero de insectos vivos al tercer d a; B= peso original de los insectos/n umero total de insectos; la Tasa Relativa de Consumo (TRC) que indica el consumo de las larvas en relaci on a su peso inicial y al tiempo de duraci on del ensayo TRC= D/(Bxd a), donde D= biomasa ingerida (mg)/n umero de insectos vivos al tercer d a; la Eciencia de Conversi on del Alimento Ingerido (ECAI) ( %) que indica cantidad de alimento utilizado para el crecimiento en peso de la larva o de los adultos ECAI= (TCR/TRC)x100. Para obtener el Indice Fagodisuasivo (IF) se consider o IF( %)= [(C-T)/C]x100, donde C= consumo de los discos en el control (mg) y T= consumo de los discos tratados (mg). Los datos se analizaron mediante la prueba de la varianza ANOVA y las medias fueron separadas utilizando el test de diferencias m nimas (DMS, p=0.05 ).

57

4.5.
4.5.1.

Resultados
Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de T. terniora en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae

El aceite esencial de T. terniora no modic o ninguno de los ndices en larvas de T. castaneum. Sin embargo en adultos, a la concentraci on de 1 mg/disco se produjo un aumento de la tasa relativa de consumo (TRC) y se registr o un valor IF de -55,66 % (Tabla 4.1). En adultos de S. oryzae se modic o la TCR a las concentraciones de 1 y 4 mg/disco y el IF fue de 38,44 % y 53,22 % respectivamente. Adem as a la mayor concentraci on se registr o un porcentaje de mortalidad del 38 % (Tabla 4.1).

4.5.2.

Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de C. citratus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae

El aceite esencial de C. citratus produjo una disminuci on en la TCR y alteraciones ECAI en larvas de T. castaneum para ambas concentraciones. Los porcentajes de mortalidad fueron de 42 % y 46 % para 1 y 4 mg/disco respectivamente. En adultos de esta misma especie, se redujo la TCR y la ECAI a la concentraci on de 4 mg/disco y la TRC para ambas concentraciones. El IF registrado fue de 47,17 % (Tabla 4.2). El aceite esencial de C. citratus redujo la TCR y la TRC en adultos de S. oryzae a la mayor concentraci on, obteni endose adem as un IF de 68,33 % y un porcentaje de mortalidad de 52 % (Tabla 4.2).

58

Tabla 4.1: Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de T. terniora en larvas y adultos de T. castaneum y adultos S. oryzae. Concentraci on Insectos (mg/disco) 0 T. castaneum 1 Larvas 4 0 T. castaneum 1 Adultos 4 0 S. oryzae 1 4 0,261a 0,395b 0,242a 0,166a 0,188a 0,249a 0,163a 0,135a 296,666a 166,333a 202,333a 150,75a 0 6 20 38 38,44 53,22 9,33 0,279a 0,194b 150a 2 -55,66 0,355a 0,273a 0,276a 0,128a 114,266a 217,166a 18 2 16,55 0,453a 0,437a 106,251a 14 -23,94 TCR TRC ECAI ( %) 124,111a Mortalidad ( %) 2 IF ( %)

(mgmg1 d1 ) 0,392a 0,331a

TCR: Tasa de Crecimiento Relativa. TRC: Tasa Relativa de Consumo. ECAI: Eciencia de Conversi on del alimento ingerido. IF: Indice Fagodisuasivo. Valores seguidos por la misma letra para cada insecto y dentro de cada columna no dieren signicativamente (DMS,p> 0, 05).

59

Tabla 4.2: Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de C. citratus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae Concentraci on Insectos (mg/disco) 0 T. castaneum 1 Larvas 4 0 T. castaneum 1 Adultos 4 0 S. oryzae 1 4 0,265a 0,437b 0,388b 0,249a 0,187a 0,562b 0,487ab 0,380a 144,57b 77a 80,11a 73,904a 2 2 2 52 16,94 68,33 47,17 0,313b 0,293b 107,222a 0 16,94 0,092a 0,347b 0,481a 0,357c 35,83a 97,969a 46 0 20 0,102a 0,212a 59a 42 13,33 TCR TRC ECAI ( %) 258b Mortalidad ( %) 18 IF ( %)

(mgmg1 d1 ) 0,553b 0,237a

TCR: Tasa de Crecimiento Relativa. TRC: Tasa Relativa de Consumo. ECAI: Eciencia de Conversi on del alimento ingerido. IF: Indice Fagodisuasivo. Valores seguidos por la misma letra para cada insecto y dentro de cada columna no dieren signicativamente (DMS,p> 0, 05).

60

Tabla 4.3: Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de E. muticus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae Concentraci on Insectos (mg/disco) 0 T. castaneum 1 Larvas 4 0 T. castaneum 1 Adultos 4 0 S. oryzae 1 4 0,256a 0,393b 0,185a 0,063a 0,261a 0,2228a 0,088a 0,3179a 97,873a 215,916a 276,5a 85a 2 10 34 50 71,66 56,66 13,11 0,348b 0,359b 98,48a 8 -11,16 0,092a 0,341b 0,481a 0,289a 35,83a 118,138a 46 4 20 0,677a 0,390a 244,614a 42 1,94 TCR TRC ECAI ( %) 101,777a Mortalidad ( %) 24 IF ( %)

(mgmg1 d1 ) 0,384a 0,456a

TCR: Tasa de Crecimiento Relativa. TRC: Tasa Relativa de Consumo. ECAI: Eciencia de Conversi on del alimento ingerido. IF: Indice Fagodisuasivo. Valores seguidos por la misma letra para cada insecto y dentro de cada columna no dieren signicativamente (DMS,p> 0, 05).

4.5.3.

Indices Nutricionales y actividad fagodisuasiva del aceite esencial de E. muticus en larvas y en adultos de T. castaneum y de S. oryzae

El aceite esencial de E. muticus no modic o ninguno de los ndices en larvas de T. castaneum, aunque en los adultos se produjo una disminuci on de la TCR a la mayor concentraci on y un aumento de la TRC a la concentrciones de 1 (mg/disco)e (Tabla 4.3). En adultos de S. oryzae el aceite produjo un descenso de la TCR para las dos concentraciones en tanto que fueron registrados tambi en altos porcentajes de IF y de mortalidad (Tabla 4.3).

61

4.6.

Discusi on

Los insectos poseen diferentes estrategias para detoxicar una gran variedad de sustancias que ingresan a su organismo a trav es de la ingesta de alimento. Una de estas estrategias consiste en la presencia de una barrera f sica en el intestino medio formada por m ultiples capas secretadas por las c elulas del epitelio intestinal. Se trata de la membrana peritr oca que se encuentra presente en la mayor a de los insectos y los protege de da nos mec anicos y de sustancias t oxicas como los aleloqu micos vegetales (Chown & Nicholson, 2004). Adem as de esta barrera f sica, el intestino proporciona al insecto una protecci on de tipo qu mica. Parte de esta protecci on esta dad a por enzimas como las monooxigenasas, la glutati on-S -transferasas y las esterasas, que le permite metabolizar una gran variedad de compuestos ex ogenos entre los que se encuentran los metabolitos secundarios de las plan tas (Caballero Garc a, 2004). Estas y otras enzimas conforman un paquete caracter stico para cada especie de insecto y se ha podido constatar que la producci on de las mismas se induce ante la presencia de un xenobi otico (Chown & Nicholson, 2004). Una segunda estrategia de defensa qu mica se basa en el potencial redox del intestino de los insectos. As mediante cambios controlados en el Ph, el intestino puede oxidar o reducir sustancias, alterando su efecto t oxico (Nation, 2002). Al igual que las enzimas, el Ph del intestino tambi en es caracter stico de cada especie (Gillott, 2005) La defensa de tipo f sica o las qu micas o una combinaci on de todas ellas podr an explicar la ausencia de toxicidad observada con algunos de los aceites utilizados en nuestro estudio. As , para los aceites esenciales de T. terniora y de E. muticus no se registr o mortalidad en adultos de T. castaneum para ninguna de las concentraciones y adem as no se observ o disminuci on en la tasa de consumo (Tablas 4.1 y 4.3). Esto mismo ocurri o con el aceite de C. citratus a la concentraci on de 1 mg/disco en S. oryzae (Tabla 4.2), lo que estar a indicando que estos aceites no producen toxicidad en estas plagas a pesar de ser

62

ingeridos con el alimento. Otros autores tambi en informaron estos efectos en plagas de grano almacenado (Liu & Ho, 1999; Descamps, 2007; Gutierrez et al., 2008) Contrariamente a lo ocurido en adultos de T. castaneum, los tres aceites produjeron toxicidad post-ingesta en larvas a juzgar por los valores de mortalidad, en algunos casos pr oximos al 50 %, sumado a que no se registraron cambios en las tasas de consumo (Tabla 4.1, 4.2 y 4.3). El mismo efecto fue observado en adultos de S. oryzae con los aceites de T. terniora y E. muticus en ambas concentraciones (Tabla 4.1 y 4.3). Una explicaci on posible para los resultados obtenidos, trae nuevamente a escena a las enzimas y a el potencial redox, aunque en este caso los compuestos presentes en los aceites parecen haber vencido estas defensas. En referencia al potencia redox del intestino, es sabido que valores de Ph muy altos favorecen la oxidac on de las sustancias aleloqu micas convirti endolos en metabolitos t oxicos (Chown & Nicholson, 2004). Por otra parte, se encontraron aleloqu micos vegetales capaces de inhibir la actividad de la -amilasa y de otras enzimas digestivas. Estudios citol ogicos realizados en larvas de T. castaneum muestran una clara toxicidad y una marcada desorganizaci on de las c elulas del epitelio intestinal luego de la ingesti on de extractos de Peganum harmala (Nitrariaceae) (Jbilou et al., 2008). En consecuencia, la toxicidad post-ingeta observada en larvas de T. castaneum y en adultos de S. oryzae podr a deberse a un aumento en Ph intestinal luego de la ingesta y/o a posibles inhibiciones sobre las enzimas digestivas que podr an ser atribu das a efectos citot oxicos sobre el epitelio intestinal. Descamps (2007) inform o efecto t oxico a trav es de la ingesta al evaluar el aceite esencial de hojas de S. molle var. areira en larvas de T. castaneum. El descubrimiento del poder antialimentario de los compuestos naturales ha sido un incuentionable suceso, sin embargo existen algunos inconvenientes con la aplicaci on de estas sustancias que limitan severamente su aplicaci on en los sistemas agr colas (Isman, 2002). En primer lugar, la plasticidad de los insectos para adaptarse r apidamente a una sustancia fagodisuasiva hace que esta se vuelva inefectiva en pocas horas. El segundo punto se reere a la variedad de respuestas interespec cas encontradas para una misma sustancia, inclu63

so en aquellas especies que se encuentran muy relacionadas logeneticamente, una misma sustancia puede comportarse como inhibidora o estimulante de la alimentaci on (Isman, 2006). Esto u ltimo fue registrado con los aceites utilizados en nuestro estudio. As , el an alisis del Indice Fagodisuasivo en larvas de T. castaneum indica que ninguno de los aceites produce un efecto inhibitorio de la alimentaci on. Esto adem as se correlaciona claramente con la TRC ya que en ninguno de los casos se encontr o diferencias con el control (Tabla 4.1, 4.2 y 4.3). En adultos en tanto, los IF variaron para cada plaga y con cada aceite. En general, los tres aceites produjeron efecto fagodisuasivo leve en T. castaneum a excepci on de T. terniora, que a la concentraci on de 1 mg/disco produjo un efecto fagoestimulante (Tabla 4.1). Muchas sustancias de origen vegetal estimulan la alimentaci on en los insectos mediante la activaci on de los receptores gustativos (Nation, 2002). Es muy posible que en el aceite de T. terniora exista alg un fagoestimulante natural que provoque este efecto. Hernandez y Vedramin (1998), observaron este fen omeno al evaluar extractos de varias plantas de la fam lia Meliaceae en Spodoptera frugiperda . Pungitore et al. (2005) hallaron importantes valores de atractancia alimentaria en S. oryzae al evaluar el aceite de Junellia aspera (Verbenaceae) . En S. oryzae los tres aceites produjeron efecto fagodisuasivo registr ando valores de IF superiores al 53 % a la mayor concentraci on (Tablas 4.1, 4.2 y 4.3), en tanto que el valor m as alto (71 %) se obtuvo con el aceite de E. muticus a la concentraci on de 1 mg/disco (Tabla 4.3). Varios autores han reportado componentes vegetales capaces de inhibir la alimentaci on en insectos (Talukder & Howese, 1995; Rahman et al., 2003; Valladares et al., 2003).

64

4.7.

Resumen de la alteraciones de la siolog a nutricional y actividad fagodisuasiva

En larvas de 25 d as de T. castaneum Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus produjeron toxicidad post-ingesta. El aceite esencial de C. citratus redujo la TCR y la ECAI en ambas concentraciones. Ninguno de los aceites produjo efecto fagodisuasivo. En adultos de T. castaneum El aceite esencial de T. terniora aument o la TRC; C. citratus aument o la ECAI y disminuy o la TCR y la TRC; E. muticus produjo un descenso en la TCR y un aumento en la TRC. El aceite de T. terniora a la concentraci on de 1 mg/disco registr o efecto fagoestimulante. En adultos de S. oryzae Los aceites esenciales de T. terniora y E. muticus produjeron toxicidad postingesta Los tres aceites provocaron un descenso de la TCR y C. citratus adem as, redujo la TRC. Los aceites esenciales de T. terniora y C. citratus a la concentraci on de 4 mg/disco y el de E. muticus a ambas concentraciones produjeron efecto fagodisuasivo.

65

Efectos sobre la siolog a nutricional y actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus se evalu o en larvas de 25 d as y adultos de T. castaneum y de S. oryzae. En base a los resultados obtenidos y a las hip otesis planteadas en el punto 4.1.1 podemos inferir que:: La primera hip otesis se acepta parcialmente dado que los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus no produjeron efectos fagodisuasivos en larvas y adultos de T. castaneum. Adem as, los aceites de T. terniora y E. muticus no produjeron modicaciones en los ndices nutricionales de larvas de T. castaneum. La segunda hip otesis se acepta parcialmente dado que los aceites esenciales de T. terniora y E. muticus en T. castanum y el de C. citratus en S. oryzae no produjeron toxicidad postingesta.

66

Cap tulo 5 Conclusiones Finales

La actividad insecticida y repelente, el efecto fagodisuasivo y las posibles alteraciones en la siolog a nutricional producida por los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus se evaluaron en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae. El aceite esencial de T. terniora gener o toxicidad fumigante y por contacto en adultos de ambas plagas. Adem as en S. oryzae y en larvas de T. castaneum result o t oxico por ingesti on. (Figura 5.1). C. citratus registr o actividad insecticida via cuticular en adultos de S. oryzae y a trav es de la ingesta en larvas de T. castaneum (Figura 5.1). El aceite de E. muticus en tanto, gener o efecto t oxico por contacto en S. oryzae. Para esta misma especie y en larvas de T. castaneum se observ o adem as acci on t oxica mediante la ingesta (Figura 5.1). Los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus generaron efecto repelente a las 24 hs y a la mayor concentraci on en larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae. A excepci on de E. muticus en larvas, todos los aceites registraron porcentajes de repelencia superiores al 73 % (Figura 5.2).

67

Con respecto al an alisis de la siolog a nutricional y efecto fagodisuasivo, T. terniora alter o los ndices nutricionales en adultos de las dos especies y en S. oryzae registr o un IF de 53,22 % (Figura 5.3). C. citratus alter o la siolog a nutricional de larvas y adultos de T. castaneum y adultos de S. oryzae, en esta u ltima plaga adem as el aceite produjo efecto fagodisuasivo con un IF de 68,33 % (Figura 5.3). El aceite de E. muticus modic o los ndices nutricionales en adultos de T. castaneum y S. oryzae y produjo efecto inhibitorio de la alimentaci on en S. oryzae (Figura 5.3).

68

Toxicidad de los aceites en estudio en T. castaneum y S. oryzae

C. citratus
TF CL50(g/cm2) Adultos T. castaneum 362,82 Adultos S. oryzae 435,41 TI (%Mortalidad) TI (%Mortalidad) Larvas T. castaneum 48% Adultos S. oryzae 5!% Adultos S. oryzae 322,61 Larvas T. castaneum 46% Adultos T. castaneum 217,26 Adultos S. oryzae 146,58 Adultos S. oryzae ,64 TC CL50(g/cm2) TC CL50(g/cm2)

T. terniflora

E. muticus

TC CL50(g/cm2)

69
Larvas T. castaneum 18% Adultos S. oryzae 38%

TI (%Mortalidad)

Figura 5.1: Toxicidad de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae. TF:Toxicidad Fumigante; TC:Toxicidad por Contacto; TI:Toxicidad por Ingesta

Actividad repelente a las 24 hs de los aceites esenciales en estudio a la mayor concentracin en T. castaneum y S. oryzae

T. castaneum

C. citratus

E. muticus

Larvas T. castaneum 93,33% Adultos

Adultos

Larvas T. castaneum 86,66%

Larvas T. castaneum 46,66%

Adultos

70
T. castaneum 90,93% T. castaneum 84,52% S. oryzae 73,19% S. oryzae 89,26%

T. castaneum 96,53%

S. oryzae 81,52%

Figura 5.2: Actividad repelente de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae. Los resultados corresponden a los datos obtenidos a las 24 hs y a la mayor concentraci on.

Alteraciones en la fisiolga nutricional y actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales en estudio en T. castaneum y S. oryzae

T. terniflora

C. citratus

E. muticus

IN

IF(%)

IN

IF(%)

IN

IF(%)

71
Adultos S. oryzae 53,22% Adultos S. oryzae 68,33% Larvas T. castaneum TCR ECAI Adultos T. castaneum TCR TRC ECAI Adultos S. oryzae TCR TRC

Adultos T. castaneum TRC

Adultos T. castaneum TCR TRC

Adultos S. oryzae 56,66%

Adultos S. oryzae TCR

Adultos S. oryzae TCR

Figura 5.3: Alteraciones en la siolog a nutricional y efecto fagodisuasivo de los aceite esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae. IN: Indices Nutricionales; IF: Indice Fagodisuasivo.

72

Cap tulo 6 Perspectivas para la utilizaci on de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus
Los aceites esenciales constituyen una importante fuente de pesticidas naturales y actualmente representan en el mercado mundial unos 700.000 millones de d olares con un total de 45.000 toneladas producidas al a no (Tripathi et al., 2009). Se los considera una alternativas de control frente a muchos insectos perjudiciales ofreciendo selectividad, que favorece a organismos ben ecos, y bajo impacto ambiental. Sin embargo desafortunadamente la mayor a de los productos naturales utilizados para el control de plagas a menudo carecen de los rigurosos controles necesarios para ser empleados a escala comercial. Es sabido que cualquier sustancia de origen vegetal que pretenda salir al mercado deber a satisfacer determinados criterios como: asegurar que el recurso natural (materia prima) est e disponible continuamente; que la identicaci on y puricaci on del material vegetal pueda establecerse a un costo razonable y que el producto pueda ser patentado y homologado.

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De estos criterios, quiz as la homologaci on sea el obst aculo m as importante para la comercializaci on de los productos de origen vegetal. Es f acil imaginar las dicultades que se presentan al evaluar la inocuidad para la salud humana de productos que contienen m ultiples materias activas como los aceites esenciales. Los insecticidas bot anicos parecen entonces estar en desventaja en la competencia frente a los insecticidas de s ntesis. Sin embargo, la creciente preocupaci on por parte de los consumidores en relaci on a los efectos adversos de los pesticidas convencionales favorecer a la adopci on de los productos de origen vegetal y aunque parece claro que estos no llegar an a reemplazar a los insecticidas de s ntesis, podr an ocupar nichos importantes en el mercado sobre todo en la agricultura org anica y en los pa ses desarrollados en los que existe una tendencia clara de consumo de estos productos. El uso de los aceites esenciales en el control de plagas es prometedor y su comercializaci on reci en comienza. Esto se deduce del an alisis de las ventas anuales de insecticidas de origen vegetal que aumentan entre un 10 % y un 15 % cada a no. En este estudio, en particular, se evalu o la bioactividad de los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus en T. castaneum y S. oryzae, especies plagas relevantes en la zona de inuencia del Puerto de Ingeniero White, Bah a Blanca, siendo este uno de los puertos de ultramar m as importantes del pa s y desde donde en el a no 2008 se exportaron 6.387.936 toneladas de granos. Adem as, la ciudad de Bah a Blanca se localiza en la subregi on triguera V sur, una de las de mayor producci on de trigo y cantidad de hect areas sembradas durante la campa na 07/08. En concecuencia este trabajo, representa un importante aporte tanto a nivel local, regional y por que no mundial ya que T. castaneum y S. oryzae son plagas cosmopolitas. El an alisis de la actividad insecticida, demuestra que los aceites de T. terniora, C. citratus y E. muticus generaron efecto larvicida y adulticida. Esto constituye una importante cualidad de los aceites en estudio, ya que en un sistema de almacenaje de granos, lo m as frecuente es encontrar diferentes estados de desarrollo de una misma especie as co74

mo tambi en, distintas especies con diferentes estrategias de alimentaci on. Estos aceites podr an ser una alternativa ecol ogica a la fosna y el bromuro de metilo, dos de los fumigantes m as ampliamente utilizados en la actualidad y ambos, con sobrados antecedentes en la generaci on de resistencia en insectos y en la poluci on medioambiental. Como parte de una defensa integrada los aceites tambi en podr an ser utilizados combinando estrategias de control, utilizando por ejemplo cebos atractantes que permitan reunir a los insectos en un a rea determinada donde puedan ser tratados con alguna sustancia insecticida. Este m etodo permitir a restringir el uso de insecticidas qu micos a una peque na zona de tratamiento reduciendo as los costos y los riesgos ecol ogicos. El comprobado efecto repelente y fagodisuasivo de los aceites utilizados en nuestro trabajo los postula como buenos protectores pudiendo actuar como bandas de seguridad alrededor de la maza de granos o en el interior de la misma evitando que los insectos se alimenten; adem as, podr an ser aplicados a las estructuras de empaque o utilizarlos como preventivos realizando la desinfecci on del silo antes de la llegada del grano. Lo m as importante al momento de utilizar cualquiera de estos aceites es tener en cuenta que se trata de sustancias muy vol atiles y si no se utiliza un sistema de liberaci on apropiado cuando se los administra, se perder a r apidamente el efecto repelente o fagodisuasivo. Otra a rea interesante de estudio ser a la de establecer qu e tipo de formulaci on (microc apsulas, mezcla de polimeros,cremas, etc.) es la m as eciente para producir una liberaci on controlada y aumentar la duraci on del efecto del aceite esencial. En base a lo ante dicho, los aceites esenciales de T. terniora, C. citratus y E. muticus resultan una alternativa viable para ser utilizados como herramientas de control de T. castaneum y S. oryzae en programas de manejo integrado de plagas del almacenaje.

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 Indice alfab etico

Tagetes terniora, 20 Sitophilus, 18 Clasicaci on, 18 Distribuci on geogr aca e importancia econ omica, 18 Identicaci on, 18 Tribolium, 16 Clasicaci on, 16 Descripci on, 17 Distribuci on geogr aca e importancia econ omica, 16

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