Abstracto

Con el fin de estudiar el papel de la forma citoslica de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (GTP) (CE 4.1.1.32) (PEPCK-C) en el msculo esqueltico, la PEPCKC mus ratones fueron creados mediante la introduccin del ADNc de la enzima, vinculado a la humana promotor del gen de la actina -esqueltico, en su lnea germinal. Dos lneas fundadoras generados por este procedimiento fueron criados juntos, la creacin de una lnea de ratones que tienen 9,0 unidades / g de msculo esqueltico, en comparacin con 0.080 unidades / g en el msculo de los animales de control. Los ratones eran ms activos que los controles en sus jaulas y se podan ejecutar para hasta 5 km, a una velocidad de 20 m / min sin parar (ratones de control se ejecutan durante 0,2 km con la misma velocidad). Male PEPCK-Cmus ratones son extremadamente agresivos, as como hiperactivos. Durante el ejercicio vigoroso, se utilizan cidos grasos como combustible de manera ms eficiente que hacer controles y producen mucho menos lactato que hacen los animales de control, tal vez debido al nmero mucho mayor de mitocondrias en su msculo esqueltico. PEPCKC mus ratones tambin almacenar hasta cinco veces ms de triglicridos en su msculo esqueltico, pero tienen slo cantidades marginales de triglicridos en sus depsitos de tejido adiposo, a pesar de comer 60% ms que los controles. La concentracin de leptina e insulina en la sangre del 8 al 12 de mes de PEPCK-C mus ratones es mucho ms bajo que se seala en la sangre de los animales de control de la misma edad. Estos ratones viven ms que los controles y las hembras permanecen reproductivamente activa durante el tiempo de 35 meses. Las posibles razones de la profunda alteracin en la actividad y la longevidad causados se discutir la introduccin de una enzima metablica simple en el msculo esqueltico de los ratones. Tenemos que salir ya que estamos todava joven, Porque vagabundos como nosotros, nena, nacimos para correr. Bruce Springsteen Born to run Ir a:

Justificacin de la generacin de los PEPCK-C mus ratones

PEPCK-C es una enzima bien estudiado, cuyo papel en el metabolismo intermediario es aparentemente establecido, sino que est presente en el hgado, corteza renal y marrn y blanco tejido adiposo y est implicado en la gluconeognesis y / o glyceroneogenesis [ 1 ]. Sin embargo, una mirada ms cercana a la biologa de esta enzima indica anomalas que no se explican por nuestra comprensin actual de su funcin metablica. PEPCK-C est presente en una amplia variedad de tejidos de mamferos que no hacen glucosa o, en glyceroneogenesis an no se ha demostrado

[ 2 ]. A travs de los aos, se han realizado muy pocos estudios dirigidos a delinear la funcin de la enzima en estos tejidos. Hemos elegido para estudiar el papel de la PEPCK-C en el msculo esqueltico, un pauelo de papel de importancia en el metabolismo energtico total y en el que investigaciones anteriores haban sugerido un papel para la enzima, pero no lleg a ofrecer un resultado definitivo. Estos estudios se centraron principalmente en el papel potencial de la PEPCK-C en la generacin de alanina, que se produce durante el ayuno en el msculo esqueltico [ 3 ]. El fundamento de esta investigacin fue que PEPCK-C elimina aniones ciclo del cido ctrico por descarboxilacin de oxalacetato a PEP, lo que podra a su vez ser convertido en piruvato a travs de tipo muscular piruvato quinasa y luego transaminada a alanina. La otra posibilidad, para la que hay evidencia fisiolgica escasa, es que PEPCK-C est implicada en la gluconeognesis o la sntesis de glucgeno en el msculo esqueltico. Adems, la investigacin en el laboratorio de la extensin de glyceroneogenesis en varios tejidos de la rata, utilizando in vivo las tcnicas isotpicas, se ha demostrado que glyceroneogenesis, no gluclisis, fue la principal fuente de glicrido-glicerol, tanto en el sleo y gastrocnemio (Nye, Hanson y datos no publicados Kalhan). Esto apoya un papel alternativo de PEPCK-C en el msculo esqueltico, ya que la sntesis de triglicridos es una va metablica importante en este tejido. En este contexto general, decidimos producir lneas de ratones transgnicos que sobreexpresan el gen de la PEPCK-C en su msculo esqueltico y luego para determinar el resultado metablico.

Los resultados sorprendentes de la sobre-expresin de PEPCK-C en el msculo esqueltico

Cuatro lneas fundadoras de ratones transgnicos, que contenan un gen quimrico compuesto por el promotor del gen de -actina esqueltica, que dirige la expresin del cDNA para PEPCK-C, ligado al extremo 3 'del gen de la hormona de crecimiento bovino (vase la referencia [ 4 ] para ms detalles de esta construccin), no tenan un fenotipo manifiestamente diferente que los controles de camada. Esto no era sorprendente, ya que esperbamos que el principal efecto de la sobre-expresin del gen sera sutil y requerira anlisis bioqumico detallado de las alteraciones en la tasa de flujo del ciclo del cido ctrico, debido a la PEPCK-C adicional en el msculo esqueltico, y / o de un aumento de la tasa de glyceroneogenesis en el tejido. Las cuatro lneas fundadoras expresadas de 1,5 a 3 unidades de PEPCK-C / g de msculo (en comparacin, un hgado de un ratn en ayunas tiene de 2 a 3 unidades de PEPCK-C / g). Despus decidimos criar dos de estas lneas juntos para aumentar la actividad total de la enzima en el msculo esqueltico, adems de estudiar las lneas fundadoras originales. El resultado de esto fue una lnea de cra de animales que nos referimos como PEPCK-C mus ratones . Desde el primer momento de la observacin (alrededor de 2 semanas de edad), se observ que estos animales tenan un notable grado de hiperactividad. De hecho, este fenotipo era tan evidente que nos permiti seleccionar

las PEPCK-Cmus ratones sin la necesidad de determinar el genotipo de ellos ampliamente (por ejemplo, hiperactividad siempre corresponda a un ratn que contena ambos transgenes). Los PEPCK-C musratones eran de 7 a 10 veces ms activo en sus jaulas y tena la habilidad de correr largas distancias (5 km a 20 m / min) en una cinta del ratn sin parar. Los animales no eran tan grandes como camada de control, pero coman mucho ms. Un anlisis de resonancia magntica de los PEPCKC mus ratones demostrado que slo tenan niveles marginales de tejido adiposo y un anlisis bioqumico del msculo esqueltico se indican altos niveles de triglicridos en que el tejido. De hecho, la concentracin de triglicridos en el msculo esqueltico de los PEPCK-C mus ratones era directamente proporcional a la actividad de la PEPCK-C en el msculo, lo que sugiere la importancia de glyceroneogenesis en el tejido.Triglicridos del msculo esqueltico es claramente el principal combustible de conducir la hiperactividad en los PEPCK-C mus ratones, tienen muchas ms mitocondrias en su msculo esqueltico que el encontrado en el msculo de los controles, el apoyo a las tasas mejoradas de metabolismo de cidos grasos observaron en los ratones.

Los PEPCK-C mus ratones han ampliado la longevidad y la capacidad reproductiva

Un segundo resultado sorprendente fue el extender la longevidad aparente de las PEPCK-C mus ratones, sino que vivi casi dos aos ms que los controles y tuvieron camadas normales de cras a los 30 a 35 meses de edad (la mayora de los ratones dejan de ser reproductivamente activa en 12 a 18 meses).Usamos la palabra "aparente", ya que hasta el momento no se ha llevado a cabo un estudio detallado de envejecimiento, que implica mltiples ratones, que se siguen a intervalos regulares durante su tiempo de vida, este tipo de estudio se encuentra actualmente en curso en nuestro laboratorio, as que espero que se poder afirmar inequvocamente que los PEPCK-C mus ratones hacen viven ms que los controles. Sin embargo, la evidencia disponible es suficientemente fuerte como para justificar una cierta especulacin de por qu estos ratones tienen una esperanza de vida tan largo. Esto es especialmente importante, ya que los ratones violan uno de los pilares de la investigacin sobre el envejecimiento, es decir, que la limitacin de la ingesta de alimentos aumenta la longevidad. Este principio general se apoya en estudios con especies de moscas a las ratas, y parece bien fundamentada en la literatura. Si es correcta, los resultados con los PEPCK-C mus ratones implican que no es el nmero de caloras que se consumen, pero qu pasa con estas caloras se consumen uno! Los ratones comen casi dos veces ms que los animales de control, pero debido a su hiperactividad, utilizan el exceso de caloras para satisfacer sus demandas de energa. Tal vez el nuevo paradigma en la investigacin sobre el envejecimiento debe ser la actividad sostenida aumenta la longevidad En este punto, tanto el tiempo de vida prolongado y la capacidad de

reproduccin prolongado de los PEPCK-C mus ratones necesitan un estudio detallado antes de conclusiones definitivas, en lugar de la especulacin, se enviar en breve.

Los cambios en las hormonas y citoquinas en la sangre de PEPCKC mus ratones y las posibles consecuencias metablicas
Hemos llevado a cabo un anlisis detallado de los niveles de hormonas y citoquinas en la sangre de los PEPCK-C mus ratones y tom nota de niveles muy bajos de insulina, leptina y MCP-1 en comparacin con los animales control (Hakimi, Berger, Tracy y Hanson , datos no publicados). Todos estos factores suprimen el apetito al influir directamente en el hipotlamo, de modo que una concentracin circulante marcadamente reducida de estas protenas podra explicar el mayor nivel de la ingesta de alimentos en los PEPCK-C mus ratones, en comparacin con los controles. La hiperactividad observado en los ratones aumenta el consumo de combustible, especialmente en el msculo esqueltico, lo que resulta en dramticamente menos tejido adiposo y por tanto menos leptina. El alto nivel de actividad tambin se traduce en una mayor sensibilidad a la insulina y el reclutamiento de GLUT-4 a la superficie celular [ 5] [ 6 ]. Por lo tanto Suponemos que la concentracin muy baja de insulina en la sangre de los PEPCK-Cmus ratones refleja una mayor sensibilidad a la insulina del msculo esqueltico, lo que a su vez se traduce en la disminucin de la secrecin de insulina.

Un modelo para explicar las alteraciones metablicas observadas en los PEPCK-Cmus ratones
A partir de la informacin disponible sobre los PEPCK-C mus ratones, es posible especular sobre un posible mecanismo para explicar este fenotipo complejo (ver la Figura 1 ). Esto requiere varios supuestos que requieren validacin, pero no hay suficiente evidencia en la mano para hacer de este mecanismo propuesto plausible. La primera suposicin es que la sobre-expresin de PEPCK-C se produce slo en el msculo esqueltico y que funciona como una enzima y no como un factor de transcripcin, lo que limita el efecto directamente a una perturbacin metablica y no a una alteracin global en la transcripcin de genes tal como ocurre cuando PPARd [ 7 ] o PGC-1 [ 8 ] se sobre-expresado en el msculo esqueltico. A continuacin, el gran aumento de la actividad de la PEPCK-C en los resultados del msculo esqueltico en una elevacin de glyceroneogenesis y luego en la concentracin de triglicridos en el tejido. Esto es razonable basada tanto en el papel conocido de la PEPCK-C en glyceroneogenesis [ 9 ] y en nuestra observacin de una relacin directa entre la actividad de la PEPCK y la cantidad de triglicridos en el msculo de varias lneas de ratones transgnicos [ 4 ]. Este triglicrido proporcionara la principal fuente del cido graso utilizado para apoyar la contraccin muscular durante el ejercicio intenso en los ratones.

Figura 1 Posible mecanismo para explicar el fenotipo de la PEPCK-Cmus ratones Otro supuesto importante, para los que no tenemos evidencia directa, es que la hiperactividad se seala en los PEPCK-C mus ratones est directamente relacionado con el aumento del nmero de mitocondrias en el msculo esqueltico. Sabemos que los PEPCK-C mus ratones son hiperactivos a los 10 das despus del nacimiento, lo que sugiere que el mecanismo que es responsable, es probable que haya sido modelada por la sobreexpresin de PEPCK-C en el msculo esqueltico durante el desarrollo en el tero .En este sentido, el gen para el gen de actina -esqueltico se transcribe primero en alrededor de 14 das de vida fetal en el ratn [ 10 ], cuando se reemplaza la actina cardiaca como la principal forma de actina en este tejido. Existe, pues, una gran oportunidad para la actividad PEPCK-C elevado para alterar la biognesis mitocondrial, ya sea directamente por el aumento de flujo del ciclo del cido ctrico o estimulando glyceroneogenesis y sntesis de triglicridos, alterando el metabolismo de los cidos grasos en recin nacidos PEPCK-C mus ratones. Los cidos grasos necesarios para apoyar la hiperactividad observada se derivan del nivel muy alto de grasa presente en la leche de roedores, que se utiliza en la sntesis de triglicridos a travs de glyceroneogenesis y como una fuente directa de acetil CoA para la oxidacin de las mitocondrias. No sabemos si la PEPCK-C mus ratones comen ms mientras mama, pero el inicio temprano de la hiperactividad observada en las cras lactantes apoyaramos esta posibilidad. Despus del destete, los PEPCK-C mus ratones comen 60% ms de compaeros de camada de control, pero pesan casi la mitad como mucho. Ellos tambin tienen una

cantidad marginal de tejido adiposo blanco, lo que sugiere que los canales de hiperactividad las caloras normalmente depositan en forma de triglicridos en el tejido adiposo para apoyar la contraccin muscular. El tejido adiposo disminuida dara lugar a una muy baja concentracin de leptina en la sangre. Esto, junto con el bajo nivel de insulina, explica el aumento del apetito observado en los ratones. Las bajas concentraciones de insulina en la sangre de los PEPCK-C mus ratones podran ser debido a la hiperactividad de los ratones, lo que sera de esperar para un mximo de regular GLUT-4 [ 6 ], facilitando de este modo el transporte de glucosa en ausencia de insulina secretada . Nosotros sospechamos que el factor principal responsable de la longevidad de los PEPCK-C mus ratones es la muy baja concentracin de insulina en la sangre de los ratones que se mantiene durante toda su vida de hiperactividad. Los factores responsables de la sorprendente prolongacin de la capacidad reproductiva observaron en PEPCK-C hembra mus ratones es ms probable en relacin a su actividad fsica, pero el mecanismo de este efecto an no se ha estudiado.

PEPCK-C y el metabolismo energtico

El esquema general descrito anterior no responder a una pregunta fundamental acerca de los PEPCK-Cmus ratones, cmo una sola enzima, expresada en altos niveles excesivamente en el msculo esqueltico, inicie una alteracin global de este tipo en el metabolismo de la energa? Lo que est iniciando evento? Nuestro pensamiento actual sobre este tema se centra en el papel clave de la PEPCK-C en la dinmica del ciclo del cido ctrico. Hans Krebs describi por primera vez el ciclo del cido ctrico en 1937, sin embargo, el papel metablico del ciclo contina bioqumicos intriga. De especial inters es el concepto de anaplerosis y cataplerosis , que define esencialmente el papel metablico de la PEPCK (Nota: dependiendo de la especie, tanto PEPCK-C y / o PEPCK-M pueden estar implicados en estos procesos). anaplerosis , la recarga de los el ciclo del cido ctrico, se requiere cada vez que un ciclo intermedio sale de la mitocondria durante los eventos biosintticas. La piruvato carboxilasa es la enzima anaplertico arquetpico. cataplerosis sirve la funcin opuesta mediante la eliminacin de aniones ciclo del cido ctrico que pueden acumularse. PEPCK-C es la principal enzima cataplerotic, ya que elimina estos productos intermedios mediante la conversin de oxalacetato (derivado de malato) a PEP. Este es un proceso celular suele pasar por alto, pero crtica, ya que los esqueletos de carbono de los aminocidos, prcticamente todos los cuales entrar en el ciclo del cido ctrico en el hgado y otros tejidos, no se oxidan completamente a dixido de carbono en la mitocondria y se acumular a menos que se se eliminan. El metabolismo de la glutamina por la corteza renal es un excelente ejemplo de ambos anaplerosis y cataplerosis ( Figura 2 ). Glutamina de carbono entra en el ciclo del cido ctrico como -cetoglutarato (anaplerosis) y sale como malato, que se oxida a continuacin a OAA y descarboxila a PEP por PEPCK-C (cataplerosis). El PEP o bien se puede convertir en glucosa o en

piruvato mediante la piruvato quinasa y luego se oxida a dixido de carbono en el ciclo del cido ctrico. En los animales en los que PEPCK-M est presente en una actividad sustancial (especies ms de mamferos), OAA del ciclo del cido ctrico se puede descarboxila directamente a PEP y transportado desde la mitocondria [ 11 ].

La figura 2 El metabolismo de la glutamina en el rin: el papel de anaplerosis y cataplerosis en el ciclo del cido ctrico flujo Est bien establecido que varios aniones ciclo del cido ctrico se acumulan durante el ejercicio extenuante [ 12 ], por lo que un aumento de la actividad de la PEPCK-C podra ser un factor importante en asegurar que las altas tasas de flujo necesarias para apoyar el ejercicio contina mediante la eliminacin de estos productos intermedios antes que se acumulan en un nivel demasiado alto y actan como inhibidores de flujo de carbono en el ciclo. La importancia de la PEPCK-C para el flujo del ciclo del cido ctrico ha sido bien demostrado en los estudios que utilizaron ratones en los que se ha suprimido el gen de PEPCK-C, ya sea en todo el animal [ 13 ] [ 14 ] o en el hgado [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]. Por supuesto, la eliminacin de productos intermedios del ciclo del cido ctrico como PEP (a travs de PEPCK-C) implica que la propia PEP se metaboliza ms. En este sentido, tanto la gluconeognesis y glyceroneogenesis son vas cataplerotic, ya que convierten aniones ciclo del cido ctrico a PEP, que luego se utiliza para hacer ya sea glucosa o fosfato de 3-glicerol (vase la referencia [ 18 ] para una revisin de este concepto). En base a la discusin anterior, podemos predecir que un aumento de 100 veces en la actividad PEPCK-C en el msculo esqueltico alterara drsticamente la

dinmica del ciclo de cido ctrico, lo que permite un mayor flujo de productos intermedios. Esto puede reflejarse en un flujo elevado de carbono al glicrido-glicerol a travs de glyceroneogenesis o un aumento de la tasa de reciclaje de los esqueletos de carbono de los aminocidos a travs del ciclo del cido ctrico en el msculo. La bioqumica de los PEPCK-C mus ratones espera anlisis detallado.

Palabras finales
A menudo nos preguntamos si la notable actividad fsica de los PEPCK-C mus ratones, la longevidad y el vigor reproductivo tiene aplicacin directa con el comportamiento humano. Podemos introducir el gen de la PEPCK-C en el msculo esqueltico humano y ver una alteracin similar en el metabolismo y el comportamiento? Deportes de rendimiento, tales como andar en bicicleta, claramente se beneficiaran con el tipo de actividad observado en nuestros PEPCK-C mus ratones. Para ser capaz de utilizar los cidos grasos como combustible durante largos perodos de ejercicio vigoroso, mientras que la generacin de poco lactato, es el metabolismo que gana el Tour de Francia [ 19 ]! Sin embargo, hay un inconveniente de todo esto. Los PEPCKC mus ratones son muy agresivos, nuestro mundo necesita demenos , y no ms agresin. Lo ms importante, actualmente no hay manera de sobreexpresan PEPCK-C en todos los msculos esquelticos sin introducir el gen en la lnea germinal de los seres humanos, como hacemos con los ratones transgnicos, lo que es tico ni posible. Alternativamente, las tcnicas actuales para la terapia gnica no aseguran la expresin muy alta y prolongada de la PEPCK-C en cada msculo esqueltico, que se requiere para este fenotipo. Una cosa es segura, si la madre naturalezaquiso 9 unidades / g de PEPCK-C en el msculo esqueltico, en lugar de 0,08 unidades / g, tendra que ponerlo all! Tambin se nos pide "si la aplicacin directa para mejorar la fisiologa humana no es posible, de qu valor son los PEPCK-C mus ratones? "Varias respuestas vienen a la mente y otros son probables. La hiperactividad, pero robusta salud de los ratones, proporciona un modelo excelente para estudiar el efecto de la actividad en la etiologa de las enfermedades, tales como el desarrollo de cncer en lneas susceptibles de ratones que han sido cruzados con los PEPCK-C mus ratones. El aparente aumento de la longevidad tambin proporciona un modelo para determinar los factores bioqumicos y metablicos que contribuyen al envejecimiento. Si hiperactividad conduce a una vida ms larga, cules son los mecanismos subyacentes implicados? Por ltimo, la base biolgica para la capacidad de reproduccin prolongado de los ratones proporciona un modelo nico para estudiar este proceso. Todo esto recuerda a uno de [de Shakespeare 20 ] admonicin que "Certezas ..... son soluciones del pasado ".