Sunteți pe pagina 1din 4

Un biosenzor pentru detectarea directa a secvente de ADN pe baza mas uratorilor de capacitate Cererea mare pentru analiza ADN-ului

solicita pentru dezvoltarea de portabi le, low-cost, usor de a efectua teste. Ne-am dezvoltat ?i a efectuat evaluarile preliminare ale unui biosenzor integrabila pentru detectarea directa a secvente de ADN prin masuratori capacitatii. Dispozitivul se comporta n mod constant cu un model electric propus ?i detecteaza fiabil de hibridizare ADN-ul cu specificita te mare. Noi am verificat, de asemenea, reproductibilitatea rezultatelor experim entale ?i reutilizare a biosenzor ADN-ului. 1.Introducere Detectarea moleculara a demonstrat un poten?ial mare pentru identificarea rapi da a bolilor,pentru alimente ?i monitorizarea mediului. Dupa succesele recente d in secventierea genomului uman, detectarea de secvente de ADN specifice n probe b iologice a jucat un rol fundamental n genetica de diagnostic ?i n detectarea celul e patogene.[1] Cererea mare pentru low-cost teste genetice a condus la dezvoltarea unor bios enzori portabile ?i u?or de utilizat. Aceste sisteme ar trebui sa fie n masura sa efectueze analize ntr-un timp foarte scurt ?i cu o cantitate foarte limitat de p roba. Structuri micro-fabricate, bazate pe micro si nano-tehnologia poate satisf ace aceste cerin?e ?i pentru a permite,deasemenea un grad ridicat de paralelism si sensibilitate. Scopul final al acestor sisteme de micro-ar fi integrarea pe acela?i substrat site-ul de reac?ie, senzorul, precum ?i circuitul de condi?ionare ?i amplificar ea semnalelor de ie?ire. Doua dintre principalele caracteristici dorite ale unui senzor bio-sunt imediata apropiere a element de recunoastere biologice pentru a traductorului ?i utilizarea unei metode de etichete fara sa se evite ndelungate ?i complexe pre-tratamente ?i modificarile nedorite ale probelor [3]. Aplicatia noastra a acestor principii a fost axat pe detectarea directa a ADN -ului de la masurarea schimbarilor n parametrii electrici ai o structura care int erac?ioneaza cu moleculele de ADN n solu?ie. Posibilitatea de a detecta ADN-ului, la o interfata electrod / solutie prin masuratori de capacitate a fost demonstr ated.However, set-up utilizate n experimente raportate anterior nu permit integra rea usoara. Am implementat un senzor de prototip ale carui elemente ?i circuite sunt standard ?i u?or sa se integreze. Recunoa?terea are loc la interfe?ele de electrozi / solu?ie de o celula cu do ua electrod. Una sau ambele activita?i ultra-plate electrozi de aur sunt func?iu ni cu straturi reactive, care pot capta un singur-catenar oligonucleotide sau du blu-catenar molecule de ADN. Legare ADN-secventa-specifice electrod (recunoa?ter ea secven?a) a fost investigat cu monostraturilor auto asamblate (SAMS) de sonde oligonucleotide care au fost proiectate pentru a captura oligonucleotide cu mul ?umiri complementare secven?elor sa ?i ntemeieze-asociere. Prezen?a straturilor ?i a moleculelor pe suprafe?e de aur a fost verificate n mod independent prin micro scopie de for?a atomica (AFM), imagistica [4]. Capacita?i de celule au fost masu rate cu ajutorul capacitanceto-traductoare circulante derivate din circuitele de taxa pe baza de masurare capacitiv utilizate pentru masurarea on-chip capacitat ile electrice n adncime sub-micron ICs [5, 6]. Un impuls periodica se aplica celul a, n timp ce masurarea curentului medie necesara pentru a ncarca n mod repetat capa citate necunoscut. Noi am efectuat masuratori comparative recipiente cu celule echipate cu elect rozi de aur goale, electrozi func?iuni (cu oligonucleotide SAM) ?i electrozi de func?iuni, care a fost expus la ADN-ului. Aparatul a aratat specificitatea pentr u detectia maxima n hibridizare ADN-ului ?i reproductibilitate buna. Am verificat , de asemenea, posibilitatea de reutilizare a biosenzor ADN-ului.

2. Lucrari anterioare Potrivit modelului electrostatice, o plate?te suprafa?a / interfa?a electrolit solu?ie poate fi modelata ca o serie de condensatori (a se vedea schema din fig ura 1). Taxa de suprafata este echilibrata de un ion reg de ioni incarcati opus (counterions), cunoscut sub numele de strat electric dublu difuze. Stratul cel m ai apropiat de suprafa?a, alcatuit din counterions legate de dipoli de suprafa?a ?i de apa, se nume?te Stern sau Helmholtz strat; al doilea strat de o atmosfera difuza a counterions hidrata?i, a carui caracteristica lungime corespunde cu lu ngimea Debye ?i este cunoscut sub numele de Gouy-Chapman strat [7]. Daca o supra fata de electrod de metal este func?iuni, orice molecula ncarcat capturat la inte rfata cu electrolitul produce o schimbare att n ??structura capacita?ii ?i a compo rtamentului sau electric. Prin urmare, prezen?a de molecule obliga?i sa suprafata transduces ntr-o schim bare capacitate. Operelor recente a prezentat mai multe metode pentru analiza pa rametrilor electrici ale interfe?elor compozite. Cele mai relevante sunt chronoa mperometry [3] ?i spectroscopie de impedanta [8]. Ambele dintre ele necesita o c elula trei electrod ?i un poten?iostat. Chronoamperometry consta n aplicarea o si ngura etapa la celula de masurare ?i relaxare constanta a structurii. Spectrosco pie de impedanta se bazeaza pe masurarea frecventei impedanta ?i parametrii de m ontare a unui model electric empiric. Acestea sunt electrochimice de analiza, au nevoie de un electrod de referin?a ?i un set-up experimental, care nu este u?or sa se integreze. Din fericire, pentru unicul scop de a detecta molecule lega?i de suprafa?a, n plina floare tehnici electrochimice de caracterizare de interfa?a nu sunt strict necesare. Am implementat un sistem care masoara schimbarile n taxa totala stocate pe o p ereche de electrozi func?iuni, dupa un pas de tensiune. Perkins et al. [9] a apl icat o justificare similara transducing schimbari de ncarcare printr-un tranzisto r efect de cmp. Configurarea nostru este pe deplin integrabila ?i alcatuita din c omponente standard. 3. Metoda experimentala 3.1 functionalizarea suprafetei Electrozii de aur au fost ob?inute prin tehnica de ?ablon dezbracat [10]: un strat gros de aur 200 nm a fost evaporat la proaspat-despicat Ruby mica n vid rid icat, supuse la ncalzire mai ndelungata n vid ?i lipite pe buca?i capacul de sticla (aproximativ 1 cm n diametru ), cu nalta performan?a epoxi-glue.At momentul utili zarii, banda mica este cojit off ?i proaspat expus ultra-plat suprafa?a de aur f unctionalizate chimic este (sau folosite ca referin?a). 30-baza tiol-modificate sonde oligonucleotidice 5\'-pGATCATCTAGCCGGACCCGGGCATCGTGG-3\'-(SH) au fost imob ilizati pe suprafata datorita aur la aur de sulf obliga?iuni (o picatura de 4 ol igonucleotidului uM n tampon a fost lasat pe suprafata de joc pentru 72 de ore ?i apoi clatite cu apa ultrapura). Doua tipuri de obiective de ADN au fost alese pentru a hibridizarea cu SAM: oligonucleotide scurte sau molecule mai doublestranded ADN-ului. Doua oligonucl eotide au fost testate: prima este de 26-baza lung ?i complementare pentru a oli gonucleotidului sonda de suprafa?a legat (5\'-GATGCCCGGGTCCGGCTAGATGATC-3 \'), i ar al doilea este de 27 - baza de lunga (5\'-AATTGTTGAAGACGAAAGGAGCTCGTG-3\') ?i nu este complementara cu secven?a sonda. Ca un obiectiv de lunga de ADN dublu c atenar, am folosit pBR322, o pereche de baza ADN-ului 4361-lung, care are un tra ct 15-baza complementara pentru a sonda oligonucleotidului. Hibridizarea a fost pus n aplicare prin ncalzirea disc de aur functionalizate pna la 90 C, acoperind su prafa?a cu solu?ie de oligonucleotidului fierbinte ?i ncet-l racire la temperatur a camerei. AFM imagistica a fost efectuat pentru a verifica prezen?a unui monost rat auto-asamblate (SAM) din oligonucleotide imobilizate pe suprafa?a aurului: a ?a cum se arata n figura 3, prezen?a unui strat plat, a fost evidentiata prin apl icarea unei for?e verticale de mare locale scanare sonda, care a nlaturat o parte

patrulatera a stratului, expunnd astfel suprafata de baza de aur. 3.2. Masurare capacitate Pentru a n?elege pe deplin tehnica de masurare, vom descrie un model simplifi cat electrica a structurii. Capacitatea paralela ntre cele doua electrozi de aur este neglijabil. Comportamentul capacitiv de structura este determinata de capac ita?ile de interfa?a doua, care constau element de recunoastere biologice ?i str atul electric dublu. Noi masuram varia?ia capacitatea de strat dublu electric la interfa?a electrod / solutie. Potrivit circuitul echivalent din figura 4, atunc i cnd electrozii A ?i B sunt pastrate la acela?i nivel de tensiune nu exista nici un curent care curge pasiv n ntreaga celula ?i nici caderea de tensiune pe conden satori. Pe de alta parte, atunci cnd V (A) = V (B) + DV-un calm curent IDC = DV / (2Rp + R), pare ca da na?tere la o cadere de tensiune ?V1 = RpIDC pe fiecare co ndensator. n cazul n care un impuls DV este periodic aplicat la electrodul A, iar perioada este suficient de lunga pentru a permite condensatoarelor sa fie comple t ncarcat / descarcat la fiecare ciclu, apoi curentul mediu absorbit de celule n t impul pulsul este suma a doua contribu?ii: pasiv IDC curent ?i curentul de ncarca re care ofera cantitatea necesara de ncarcare de catre cele doua (necunoscute) co ndensatori pentru a sus?ine caderea de tensiune. 3.3. Biosenzor Figura 4 arhitectura ofera o reprezentare schematica a traductorului capacit atea la curent utilizat pentru masuratori noastre. Acesta consta ntr-un simplu ps eudoinverter CMOS al carui pull-up ?i trage n jos tranzistori sunt conduse de non -suprapunere periodice impulsuri, n scopul de a evita curen?ilor de scurtcircuit. De ie?ire a invertorului prevede impuls periodic care trebuie aplicate pentru a electrodului B. actual de aprovizionare mediu ntocmit de pseudo-invertor este ex primata prin ecua?ia 1. Celula cu doua electrod a fost pusa n aplicare dupa cum u rmeaza: discuri de aur electrozii au fost lipite pe lamele de sticla. O celula p lexiglas de 8 pna la 3 de 2,5 cm3, a fost construit cu ghidaje pentru a men?ine d iapozitivele la o distan?a fixa ??(2 mm) ?i con?in solu?ia. Electrolitul a fost NaCl 100 mm. Sistemul folosit un generator de impulsuri HP8011A, o. Agilent34401 A multi-metru pentru a masura curentul mediu ?i un osciloscop TektronixTDS3032 p entru a monitoriza frecven?a pulsului. 4. Rezultatele experimentale ?i modificarii Capacitatile pot fi monitorizate prin masurarea curentului care curge prin media de celule n timpul de descarcare de gestiune, la frecven?a diferita. Masura torile actuale au fost efectuate cu o secventa de impulsuri cu amplitudine 500 m V pas. n nostru de set-up, unul dintre cei doi electrozi este ntotdeauna gol de au r, n timp ce celalalt este cel supus unor modificari de suprafa?a. Capacitatea to tala ntre electrozi de aur doi este propor?ionala cu panta de regresie curent-fre cven?a liniar (ecua?ia 2). 4.1. Func?ionalizarea de suprafa?a cu o SAM de oligonucleotidului Cum este descris n sec?iunea metode, am pregatit un electrod de aur, care poar ta o SAM de oligonucleotide thiolmodified. Prezen?a SAM determina o scadere repr oductibila a capacitatii de structura. O verificare independenta a prezen?ei SAM a fost de asemenea ob?inute prin "nanoshaving" cu AFM (a se vedea figura 3). n t abelul 1 sunt raportate rezultatele masuratorilor privind circulante lungul expe rimentelor. Ultimul rnd raporteaza valorile calculate ale pantei de regresii lini are. Acest comportament este n conformitate cu modelul propus de o cre?tere a dis tan?a dintre tarifele n doublelayer electric indus de filmul oligonucleotidului, ajungndu-se astfel la o reducere a capacita?ii [3]. 4.2. Detectarea hibridizare ADN-ului ?i dehibridizari Oligonucleotide de SAM pe suprafa?a electrodului au fost hibridizat cu oligon ucleotide 26-baza complementare, cu scopul de a verifica daca hibridizare ar put

ea fi detectate printr-o varia?ie capacitate. O reducere suplimentara a capacita ?ii de masurat a fost gasit. Acest rezultat experimental este n conformitate cu c onstatarile anterioare [3] ?i ar putea fi explicate cu aceea?i logica a unei spa ?iere mai mare ntre straturi practicate n condensator. Pentru a verifica reversibi litatea tehnicii de masurare, am eliminat oligonucleotides ca obligate sa datori ta sonda-oligonucleotide unui tratament termic (temperatura de topire de mai sus ncalzire oligonucleotidului ?i clatire, n acelea?i condi?ii pentru a elimina olig onucleotide deta?ate). Cum de-hibridizarea metoda nu este de a?teptat sa perturb e datorita SAM pentru stabilitatea obliga?iunilor sulf-aur. Masura (a se vedea t abelul 1) prezinta o buna reversibilitate (o cre?tere a capacita?ii dupa dehybri dization). Un ciclu suplimentar de hibridare confirma faptul ca diispozitivul de resetare poate fi reutilizat. 4.3.O demonstra?ie de secventa-selectivitatea biosenzor Un oligonucleotidului diferit (cu un non-baza de secven?a complementara la s onde) a fost angajat pentru a testa pentru o schimbare de capacitate ca urmare a obiectivului aspecific obligatoriu la suprafata SAM. Masuratorile au demonstrat ca aparatul nu este sensibil la oligonucleotide necomplementara confirma adecva rea lui ca un detector de hibridizare. 4.4. Detectarea hibridare a unui lung dublu-catenar ADN-ulu 4361 de baza perechi ADN pBR322 mult timp a fost utilizat pentru testele pr eliminare de detectare a unei secven?e specifice de ADN scurt ntr-o molecula lung a n solu?ie. O concentrare nanomolar de pBR322 a fost pus pe suprafa?a ?i supus u nei similara de ncalzire-racire ciclu ca oligonucleotide din experimentele anteri oare. Rezultatele experimentale sunt n concordan?a cu masuratorile de oligonucleo tide. 5. Concluzii Am proiectat si testat un prototip al unui biosenzor integrat pentru detec tarea directa a secvente de ADN. Senzorul sa dovedit a func?iona reproductibile, sa fie insensibil la secven?e aspecific, ?i sa fie reutilizabil dupa desorb?ie a ADN-ului analitului. 6.Referinte [1] C.H. Mastrangelo et al., Microfabrizated devices for genetic diagnostics , Pro c. IEEE, 1998 [2] J. Wang, From DNA biosensors to gene chips. Nucleic Acids Res., vol. 28: pp. 30 11-6, 2000. [3] C. Berggren et al., A Feasibility Study of a Capacitive Biosensor for Direct Detection of DNA hybridisation , Electroanalysis, vol. 3, 11, 1999. [4]. G. Binnig et al., Atomic Force Microscope. Physical Review Letters vol. 56, p p. 930-3, 1986.