Citotoxina vacuolizante A (VacA), una toxina clave para Helicobacter

pylori patognesis
Ms de 50% de la poblacin mundial est infectada con Helicobacter pylori( H. pylori ). La infeccin crnica por este patgeno Gram-negativas se asocia con el desarrollo de las lceras ppticas y est asociada a un mayor riesgo de cncer gstrico. H. pylori segrega muchos factores proteicos que son importantes para la colonizacin inicial y posterior persistencia en el estmago de acogida. Una de las principales toxinas de protenas secretadas por H. pylori es la vacuolizante citotoxina A (VacA). Despus de la secrecin de las bacterias a travs de un sistema de secrecin de tipo V autotransport, la toxina de 88 kDa de VacA (compuesto de las subunidades p33 y p55) se une a las clulas husped y se internaliza, causando "vacuolizacin" grave caracterizada por la acumulacin de grandes vesculas que poseen caractersticas distintivas tanto de los endosomas tardos y tempranos lisosomas. El desarrollo de "vacuolas" se ha atribuido a la formacin de canales de aniones-selectiva VacA en las membranas. Adems de sus efectos vacuolizante, se ha convertido recientemente en claro que VacA tambin afecta directamente a la funcin mitocondrial. Algunos estudios han sugerido que la subunidad p33, pero no la subunidad p55 de VacA, podan entrar en las mitocondrias para modular la funcin de orgnulos. Esto plante la posibilidad de que un mecanismo independiente de formacin de poros puede ser responsable de los efectos de VacA en la mitocondria, como estudios de cristalografa y modelado estructural predicen que se requieren ambas subunidades para un poro fisiolgicamente estable. Tambin se ha sugerido que los efectos observados son mitocondriales debido a los efectos indirectos sobre las protenas pro-apoptticas y efectos directos sobre los procesos relacionados con la morfologa mitocondrial. Otros estudios han demostrado que tanto el p55 y p33 subunidades de hecho se pueden importar de manera eficiente en las mitocondrias derivadas de mamferos que plantea la posibilidad de que podran volver a montar para formar un poro. Nuestra revisin resume y consolida los avances recientes en la investigacin de la toxina VacA, con especial atencin en las controversias pendientes en el campo y el resto de preguntas clave que deben abordarse.

Introduccin
Helicobacter pylori ( H. pylori ) es una bacteria Gram-negativa que coloniza el estmago humano. Aproximadamente la mitad de la poblacin humana en todo el mundo est infectada con H. pylori . La infeccin se transmite por contacto humano principalmente por va gstrica por va oral y, a menudo se adquiere en la infancia temprana ( Marshall, 1991 ; Blaser et al, 2004. ; Amieva y El-Omar, 2008 ). Si no se trata, H. pylori infeccin a menudo persiste durante la vida, destacando la notable adaptacin de este patgeno en el estmago humano. Gastritis superficial crnica es una caracterstica de la persistente H. pylori infeccin y suele ser asintomtica en personas ms infectadas. Sin embargo, aproximadamente el 10-15% de la poblacin infectada se desarrolla trastornos digestivos graves como lceras ppticas, linfoma gstrico de tejido linfoide asociado con la mucosa (MALT) y adenocarcinoma gstrico ( Marshall y Warren, 1984 ; Marshall, 1991 ; . Blaser et al, 2004 ; Houghton y Wang, 2005 ). Adenocarcinoma gstrico es la segunda causa de muerte por cncer en todo el mundo, siguiendo slo el cncer de pulmn ( Ferlay et al., 2008 ). Curiosamente, los estudios aislados han sugerido que

la H. pylori tambin puede ser un agente causante de enfermedades no gstricos tales como la enfermedad vascular, enfermedad heptica crnica y la prpura trombocitopnica idioptica (Pellicano et al., 2009 ). Una de las toxinas ms ampliamente estudiado producidas por H. pylori es la vacuolizante citotoxina A (VacA). La infeccin con H. pylori cepas que contienen el allica toxignica S1 forma de VacA se asocia con un mayor riesgo de lcera pptica y cncer gstrico ( Atherton et al, 1995. ; Gerhard et al, 1999. ; Miehlke et al, 2000. , 2001 ; Louw et al. , 2001 ). VacA fue nombrado con referencia a la capacidad de causar "vacuola"-como vesculas de membrana en el citoplasma de las clulas gstricas ( de Bernard et al., 1997 ), pero su papel en H. pylori patognesis siguen sin estar claros.Adems de la induccin de vacuolizacin, VacA ejerce una variedad de otros efectos sobre clulas diana, incluyendo interrupcin de las funciones mitocondriales, la estimulacin de la apoptosis y el bloqueo de la proliferacin de clulas T ( de la cubierta y Blanke, 2005 ). VacA tambin es importante para la colonizacin de H. pylori in vivo ( Salama et al., 2001 ).Teniendo en cuenta la fascinante multifuncionalidad de Vaca y su asociacin con un riesgo de cncer gstrico aumentada, la comprensin de las propiedades bioqumicas de esta toxina verstil y cmo contribuye a la H.pylori patognesis son reas de investigacin activa e intensiva. En esta revisin se resumen los hallazgos recientes claves, controversias y preguntas sin respuesta relacionadas con la biologa de Vaca.

VacA-A Toxina Multifuncional

La investigacin en las ltimas dcadas ha revelado que VacA tiene una variedad de efectos sobre las clulas husped y se ha denominado una "toxina multi-funcional." Vacuolizacin es tal vez el efecto ms distinta de VacA. Esta acumulacin pronunciada de vesculas membranosas internos (Figura 1 ) se produce despus de VacA internalizacin por la clula husped. VacA es la hiptesis de crear canales de aniones-selectiva en las membranas de estas vesculas que poseen caractersticas de ambos endosomas tardos y principios de los lisosomas ( Papini et al., 1994 ). Un modelo actual para la vacuolizacin sugiere que estos canales de aniones-selectiva facilitan el transporte de iones cloruro, lo que resulta en un aumento en las concentraciones de cloruro intraluminal ( cubierta y Blanke, 2005 ). En ltima instancia, las bases dbiles-membrana permeable se difunden en estos compartimentos endoctica resultantes de la hinchazn osmtica y vacuolizacin ( cubierta y Blanke, 2005 ). Una regin hidrfoba en el dominio N-terminal de Vaca (aminocidos 6-27) se ha demostrado que se requiere para la "vacuolizacin" ( Vinion-Dubiel et al., 1999 ).Curiosamente, la eliminacin de esta regin hidrfoba de VacA no slo inhibe la vacuolizacin sino que tambin impide VacA de forma estable la integracin en la membrana mitocondrial interna ( Vinion-Dubiel et al, 1999. ; . Foo et al, 2010 ). La importancia fisiolgica de "vacuolizacin" durante H. pylori infeccin no es clara, aunque es posible que "vacuolizacin" podra perturbar vas de trfico de protenas desde y hacia la membrana plasmtica, por lo tanto, ejerciendo efectos de largo alcance sobre las funciones de la clula husped. FIGURA 1

Figura 1. VacA, un multi-funcional de la toxina VacA puede producir "vacuolas", que tienen rasgos de endosomas tardos y principios de los lisosomas; ser tomadas por la clula y localizar a las mitocondrias, lo que puede dar lugar a la apoptosis, se unen a una protena de la clula membrana e inducir inflamacin y; obstruir la activacin de clulas T y la proliferacin . Adems de su papel en la induccin de vacuolizacin, VacA se ha demostrado que localizar a las mitocondrias, donde sus efectos pueden ser responsables de desencadenar la cascada apopttica ( Kimura et al, 1999. ; . Galmiche et al, 2000 ; . Foo et al, 2010 ). Tpicamente, durante la apoptosis citocromo c se libera desde el espacio entre la membrana mitocondrial en el citoplasma mediante un mecanismo desconocido; caspasas ejecutoras aguas abajo son entonces activados, que en ltima instancia resulta en la muerte celular. En lnea con las capacidades de formacin de poros propuestas de VacA, se ha planteado la hiptesis de que VacA puede formar poros de la membrana-incrustado en la membrana mitocondrial interna-resultante en la disipacin del potencial de membrana mitocondrial electroqumica () (Willhite y Blanke, 2004 ) . Aunque la reduccin mediada por VacA en ha sugerido para acompaar a la liberacin de citocromo C ( Kimura et al, 1999. ; . Galmiche et al, 2000 , la funcin apopttica exacta de VacA sigue siendo poco clara, como una gota en solo la ) No se espera que cause apoptosis ( Yamasaki et al., 2006 ). A pesar de esta observacin, los estudios anteriores han demostrado que la inhibicin de la formacin de canal de membrana de VacA inhibe la liberacin de citocromo c , lo que sugiere que la formacin de canales es crucial para el potencial apopttico de Vaca ( Willhite et al, 2003. ; Willhite y Blanke, 2004 ).

Polimorfismo Biognesis, y estructura de VacA

Todos identificado H. pylori cepas poseen el gen VacA. Sin embargo, no es significativa la diversidad de secuencia en vacA genes a travs de los muchos H. pylori aislar cepas ( Atherton et al, 1995. ; . Van Doorn et al, 1999 ; . Rhead et al, 2007 ). El polimorfismo en el vacA secuencia del gen ha sido identificado en tres regiones: la regin de la seal de secuencia ( s -region), la regin media ( m -regin) y la regin intermedia recientemente identificado ( i -regin) (Figura 2A ) ( Atherton et al, 1995. ; . Rhead et al, 2007 ). FIGURA 2

Figura 2. VacA diversidad allica y la estructura-(A) existe la diversidad allica significativa en tres regiones del gen VacA: la regin de la seal ( S1 y S2 ), la regin intermedia ( i1 , i2 , y i3 ) y la regin media (m1 y m2 ), (B) la secuencia de seal permite el paso de la pro-toxina travs de la membrana interna bacteriana-. El dominio de toxina de pasajeros consiste en el fragmento N-

terminal de Vaca (p33) y el fragmento de VacA C-terminal (p55). El dominio de autotransportador permite que la toxina se translocan a travs de la membrana externa bacteriana mediante la formacin de un -barril. El p33 y p55 fragmentos pueden ser escindidos desde el dominio de -barril en algn momento durante el trnsito a, o en, el medio extracelular para formar las subunidades maduras virulentas. Las flechas indican los sitios de escisin . Los dos tipos de variaciones allicas en la s -regin y m -regin se clasifican como S1 o S2 y m1 o m2 , respectivamente ( Atherton et al., 1995 ). El S2tipo codifica una protena VacA con un segmento de aminocido hidrfilo N-terminal adicional, que la S1 carece de tipo. La presencia de este segmento adicional impide que el S2 toxina de tipo de induccin de vacuolizacin (McClain et al., 2001 ). El m1 y m2 genotipos difieren con respecto a un tramo codificada de 148 aminocidos, que en ltima instancia afecta la especificidad para diversos receptores celulares sobre la base de las diferencias observadas en la actividad de Vaca ( Ji et al., 2000 ). Se ha mostrado que H. pylori con s1/m1 y s1/m2 VacA causan inflamacin crnica ms grave en comparacin con los otros genotipos. El nivel ms alto de la virulencia se asocia con la s1/m1 combinacin de alelos, que tambin se asocia con el mayor aumento en el riesgo de cncer gstrico ( Atherton et al, 1995. ; . Gerhard et al, 1999 ; . Miehlke et al, 2000 , 2001 ; Louw et al, 2001. ). Los estudios recientes que investigan el i -regin han revelado que el I1 alelo se correlaciona fuertemente con la produccin de CagA (un factor de virulencia codificados por el gen asociado a la citotoxina A) y la presencia de la S1 alelo de tipo en varios H. pylori cepas aisladas de varios pases (Chung et al., 2010 ). Esta asociacin podra sugerir que la regin intermedia juega un papel en los resultados ms graves de crnica H. pylori infeccin (Chung et al., 2010 ). El gen de VacA codifica un kDa Pro-toxina 140. El Pro-toxina consiste de una secuencia seal, un dominio pasajero y un dominio de auto-transportador; el ltimo de los cuales funciona como un sistema de secrecin de tipo V. El dominio de pasajeros, que contiene las subunidades p33 y p55, se procesa ms tarde y se escinde del dominio de auto-transportador en algn momento durante el trnsito a, o en, el medio extracelular para formar el virulenta madura de 88 kDa VacA toxina (Telford et al., 1994 ; Lupetti et al, 1996. ; . Isomoto et al, 2010 ). Los sitios Pro-toxina y de escisin se ilustran en la Figura 2B . El fragmento N-terminal con un peso molecular de aproximadamente 33 kDa se denomina "P33" (tambin conocido como p34 y p35) ( cubierta y Blanke, 2005 ). El fragmento C-terminal con un peso molecular aproximado de 55 kDa se denomina "P55" (tambin conocido como p58) ( cubierta y Blanke, 2005 ; . Isomoto et al, 2010 ). El papel celular de cada subunidad VacA todava no se entiende completamente. La actividad de formacin de poros de VacA se considera que es dependiente de p33, mientras que la unin celular se sugiri inicialmente a ser dependiente en el dominio de p55 ( Reyrat et al, 1999. ;McClain et al, 2003. ). Desde entonces se ha demostrado que p33 tambin est implicada en la unin celular, y recientemente se demostr que p55 es de hecho esencial para la vacuolizacin y la despolarizacin de la membrana, lo que sugiere p55 est implicado en la formacin de canales de la membrana aninicos ( Torres et al, 2005. ; Ivie et al, 2008. ; . GonzlezRivera et al, 2010 ). Adems, la estructura cristalina de p55 ha sido resuelto, que consiste en una serie de -hilos paralelos con un dominio globular carboxi-terminal ( Gangwer et al., 2007 ). Modelado de la estructura predicha de p33 con la estructura cristalina resuelta de p55, da lugar a un modelo de la arquitectura molecular del poro montado, que estipula que un canal de

membrana aninica estable slo se puede formar cuando las dos subunidades estn presentes ( Gangwer et al. , 2007 ).

Entrada VacA en clulas hospedadoras

La unin de VacA a una clula diana es un evento crtico en su toxicidad.Como VacA afecta a mltiples tipos de clulas incluyendo las clulas epiteliales y las clulas T, es probable que un rango de receptores de clulas husped o incluso otros factores de superficie estn implicados en la unin celular ( Yahiro et al, 1999. , 2003 ; . Sewald y col, 2008 ). Como era de esperar, los receptores utilizados por VacA al enlazar con los linfocitos T se diferencian de aquellas en las que la unin a las clulas epiteliales gstricas.Recientemente se revel que la subunidad de la integrina 2 de linfocitos asociado a la funcin de antgeno-1 (LFA-1), CD18, es, de hecho, un receptor especfico de VacA en las clulas T ( Sewald y col., 2008 ). En contraste, los receptores implicados en la unin de VacA a las clulas epiteliales gstricas incluyen el factor de crecimiento epidrmico (EGF), sulfato de heparina, glicoesfingolpidos, protena del receptor tirosina fosfatasa alfa (RPTP), protena del receptor beta de la tirosina fosfatasa (RPTP) y esfingomielina entre los otros ( Seto et al, 1998. ; Yahiro et al, 1999. , 2003 ; . Utt et al, 2001 ; . Roche et al, 2007 ; . Gupta et al, 2008 ). RPTP fue descubierto como un posible receptor para VacA cuando la presencia de vacuolas intracelulares estaba vinculada a la mayor unin de la toxina a una glicoprotena de 250 kDa que se encuentra en la superficie de AZ-521 (clulas de una lnea celular gstrica tumor maligno). La glicoprotena se identific ms tarde como RPTP ( Yahiro et al., 1999 ).Varios aos ms tarde, VacA se demostr que causaba vacuolizacin en clulas G401 (una lnea de clulas tumorales de rin) ( Yahiro et al., 2003). Vacuolizacin ocurri en estas clulas a pesar de la falta de RPTP en la superficie celular. Para investigar ms a esto, VacA fue co-immunoprecipitated despus de la incubacin con las clulas G401. Una glicoprotena de 140 kDa (p140) se identific como un receptor para VacA y se encontr que era RPTP ( Yahiro et al., 1999 , 2003 ). Aunque RPTP sigue siendo un posible receptor celular VacA, un estudio reciente ha puesto en duda la clasificacin de RPTP como un receptor epitelial esencial para VacA, ya que se descubri que la vacuolizacin se produjo en clulas HeLa que carecen RPTP ( Skibinski et al., 2006 ). Curiosamente, la unin especfica a tipos de clulas individuales se ha atribuido a la m1 y m2 alelos del gen de la Vaca. VacA de la S1 / M1 escriba enlazado correctamente a dirigirse a las clulas HeLa y vacuolizacin inducida, mientras que la S1 / m2 VacA afectada conejo-de rin (clulas RK13) y clulas epiteliales primarias pero no las clulas HeLa ( Pagliaccia et al, 1998. ; Ji et al ., 2000 ). RPTP y RPTP son reconocidas por S1 / m2VacA ( Guzman et al., 2005 ). Debido a que los m alelos-regin se encuentran en el dominio de p55, estos resultados apoyan la hiptesis de que p55 est implicada en la unin celular. FOCALIZACIN DE vacA A LAS MITOCONDRIAS Y LAS VAS APOPTTICASii Las mitocondrias son el sitio de la respiracin aerbica y son esenciales para todas las clulas humanas. Tienen muchas funciones, incluyendo la produccin de trifosfato de adenosina (ATP), la sntesis de cidos grasos y de hierro de azufre clster de la biognesis. Las mitocondrias son tambin cruciales para la va intrnseca de apoptosis a travs de la cual se instruy a una celda. Al

suicidio Una serie de eventos Celular culmina en la liberacin de citocromo c de la mitocondria en el citosol, lo que a su vez activa una serie de pro-caspasas que resulta en la muerte celular (Scheffler,2001).La va de la orientacin que participan en el trfico de Vaca a Mitocondria no se entiende completamente. VacA debe primero alcanzar el citosol despus de haber atravesado la membrana plasmtica. Despus de que esto ha ocurrido, VacA es objeto de trfico a las mitocondrias y, a continuacin transloca a travs de la membrana mitocondrial externa (Willhite and Blanke, 2004; Caloreetal, 2010).. A fin de que las protenas de atravesar la membrana mitocondrial externa, que deben pasar a travs de la translocasa de la membrana externa mitocondrial (TOM) (Chacinskaetal., 2009). Este canal de conduccin de protena tiene un dimetro que es insuficiente para la translocacin de protenas plegadas lo que significa que VacA debe desplegarse antes o durante la translocacin de enhebrar a travs del canal y entrar en las mitocondrias (SchwartzandMatouschek, 1999; GabrielandPfanner, 2007). Aparte de eso, los estudios recientes han descrito la importancia del dominio N-terminal de VacA en el trfico de mitocondrial . Se demostr que VacA de tipo salvaje Cultura H. pylori sobrenadante acumula en tanto endosomal y fracciones subcelulares de las clulas mitocondriales (MEF ) ( Caloreetal. , 2010 ) fibroblastos embrionarios de ratn . En contraste, las clulas MEF incubadas con sobrenadante de cultivo mutante de H. pylori, que contena Asingle - amino sustitucin de cido en la regin N -terminal de VacA , impidieron la toxina de alcanzar la mitocondria , y en su lugar se mantuvieron dentro de las fracciones subcelularesendosomal . Curiosamente , esta regin N - terminal es tambin esencial para la formacin de canales de membrana VacA ( Caloreetal. , 2010 ) , lo que sugiere que la formacin de canales puede ser importante para la liberacin de VacA de los compartimientos endosomal al citosol desde donde puede dirigirse a las mitocondrias . Esta hiptesis es se resume en la Figura 3 . Aunque hay muchas incertidumbres en torno a la forma en VacA se entrega a la Citosol y posteriormente dirigidas a las mitocondrias , es evidente que VacA puede de hecho en ltima instancia translocate para el orgnulo .

Modelos actuales sobre la apoptosis mediada por VacA

El mecanismo responsable de la apoptosis inducida por VacA es otra rea de gran controversia. Se ha sugerido que la subunidad p33 de VacA se dirige a las mitocondrias y capaz de iniciar la apoptosis por s sola, independiente de p55 ( Galmiche et al, 2000. ; Domanska et al, 2010. ). Protena fluorescente verde mejorada (EGFP) se expres como una fusin con el extremo N-o C-terminal de p33 o p55. Estas protenas quimricas se expresaron intracelularmente dentro de clulas HEp-2 y podran ser rastreados para la localizacin usando microscopa de inmunofluorescencia. Todas las formas etiquetadas de p33 fueron localizados a las mitocondrias, mientras que p55 marcado con GFP (N-o C-terminal etiquetado) no era ( Galmiche et al., 2000 ). Es posible que el resto de GFP interrumpido el trfico de protenas de la subunidad p55 como se ha informado GFP para afectar a la localizacin de algunas protenas, en particular aquellos localizado en el espacio entre la membrana ( Gabriel et al., 2007 ). Una alternativa al uso de grandes etiquetas de eptopo sera para generar anticuerpos contra VacA, p33 y p55 que podra ser utilizado para los experimentos de inmunofluorescencia con protenas sin etiquetar. Esto sera eludir cualquier cambio en las vas de trfico de protenas producidas por las grandes etiquetas de eptopo y bajo tales condiciones p55 tambin puede ser encontrado para localizar a las mitocondrias. Es importante sealar que en todos los estudios de cultivo de clulas anteriores en el que el expresa endgenamente VacA se utiliz para los ensayos de apoptosis, muerte celular no se midi durante al menos 24 h desde el momento de la exposicin, dejando abierta la posibilidad de otros efectos secundarios. Esto se ha complicado an ms por el uso del promotor de citomegalovirus (CMV) para la expresin, que mejora fuertemente la transcripcin del gen de inters ( Ramanathan et al., 2005 ). Bajo estas condiciones de expresin habra un nivel anormalmente alto de VacA en las clulas, miles de veces ms de lo que cabra esperar durante la infeccin.Adems, la alta expresin de las protenas del espacio de acumulacin entre la membrana de hecho matar a las clulas a travs de efectos indirectos (Kozjak-Pavlovic et al., 2010 ). Esto plantea la posibilidad de que los p33 y p88 (p33 fundido y p55) GFP fusiones de toxinas utilizadas en los estudios, como el estudio Galmiche en 2000, no pueden ser directamente responsable de la apoptosis per se ( Galmiche et al., 2000 ). Ms recientemente, se sugiri de nuevo que slo la subunidad p33 de VacA est dirigida a la mitocondria y es esencial para la toxicidad ( Domanska et al., 2010 ). Se plante la hiptesis de que una secuencia seal de 32 residuos de aminocidos no cargados que se encuentra en el extremo N-terminal de la subunidad p33, se dirige a las mitocondrias ( Domanska et al., 2010 ).Esta observacin interesante, sin embargo, an no se ha reconciliado con los hallazgos previos de que p33 etiquetados con las buenas prcticas agrarias en su extremo N-terminal, se sigue apuntado a las mitocondrias ( Galmiche et al., 2000 ), como la fusin de GFP a la N-terminal de p33 ordinariamente enmascarar una seal N-terminal. Adems, tambin se inform de que la subunidad p33 forma un poro sin p55, pero slo en presencia de bioqumicos reticulantes ( Domanska et al., 2010 ). En contraste, otras publicaciones sugieren que tanto p33 y p55 son necesarios para la formacin de poros y vacuolizacin ( Torres et al, 2005. ; . Calore et al, 2010 ; . Foo et al, 2010 ), y que ambas subunidades podran localizar a la mitocondrial espacio entre la membrana. Este ltimo es en la parte posterior de la evidencia que tanto p33 y p55 pueden ser importados de manera eficiente en las mitocondrias mediante un in vitro sistema de importacin

( Foo et al., 2010 ). Residuos 6-27 en p33 y seales de orientacin internos en las regiones cercanas a la N-terminal y C-terminal de p55 fueron demostrado ser importante para la integracin estable de las subunidades en la membrana mitocondrial interna-( Foo et al., 2010 ) . Por otra parte, la importacin de p55 por s solo no result en asociacin integral de p55 con las membranas mitocondriales ( Foo et al., 2010 ). Por tanto, es plausible de las dos subunidades que interactan con la membrana mitocondrial interna y se insertan, formando la caracterstica del poro "en forma de estrella" que se describe en estudios anteriores ( El-Bez et al, 2005. ; Gangwer et al, 2007. ; Foo et . al, 2010 ). Se ha propuesto que este poro "en forma de estrella" consta de seis monmeros Vaca (hexmero) y funciona como un canal de aniones-selectiva ( El-Bez et al, 2005. ), facilitando la disipacin de la ; una caracterstica ligada a la induccin de la apoptosis ( Willhite y Blanke, 2004 ). La interrupcin de la se produce antes de la permeabilizacin de membrana externa mitocondrial (MOMP) (Willhite y Blanke, 2004 ), el ltimo de los cuales podran servir para que funcione como un mecanismo para el citocromo c de la mitocondria liberacin. De hecho, la capacidad de VacA para formar canales de la membrana se ha demostrado ser esencial para la apoptosis inducida por-vaca. Las formas mutantes de VacA que carecen de la capacidad para formar canales membranosos fallan para inducir la apoptosis en las clulas CcGFPHeLa (una lnea celular que expresa un citocromo c y la protena de fusin GFP).Este resultado se reprodujo cuando la misma lnea celular intoxicado cons1/m1 VacA se incub con un inhibidor de canal (NPPB) ( Willhite et al, 2003. ; Willhite y Blanke, 2004 ). El hallazgo fue confirmado varios aos ms tarde, cuando dos isognicas mutantes H. pylori cepas, que contienen mutaciones puntuales individuales en la regin N-terminal de VacA que la abolicin de la capacidad de la toxina para formar poros membranosos, no inducir la apoptosis en clulas MEF ( Calore et al., 2010 ). A partir de estos datos parece que la formacin de poros es de hecho esencial para la apoptosis inducida por-vaca a travs de la va mitocondrial dependiente. Recientemente, la historia ha tomado un nuevo giro, ya que se ha sugerido que VacA acta externamente a la mitocondria para inducir la apoptosis a travs de mecanismos indirectos. Vaca (ms especficamente p55) se muestra a un mximo de regular la expresin de Bax (una protena pro-apopttica multi-dominio) y VDAC1 (un canal de membrana externa mitocondrial-endgena) que resulta en la MOMP inducida-VacA y posterior liberacin de citocromo c ( Lan et al., 2010 ). Por otra parte, tambin se observ la baja regulacin de la protena anti-apopttica Bcl-2, fortaleciendo el caso de la apoptosis inducida por VacA a travs de un mecanismo que no se inicia en las mitocondrias, aunque las mitocondrias estn implicadas en las fases posteriores ( Lan et al., 2010 ). En un estudio llevado a cabo en el mismo ao, Bax y Bak (una protena pro-apopttica multidominio unido a la membrana) se encontr que eran esenciales para el Helicobacter apoptosis inducida. Doble knockout clulas MEF deficientes tanto para Bax y Bak eran resistentes a la apoptosis cuando son expuestos a H. pylorisobrenadante del cultivo, mientras que las clulas MEF tipo salvaje sufri la apoptosis como se esperaba ( Calore et al., 2010 ). Un estudio reciente ha revelado que VacA puede acoplarse a la maquinaria de fisin mitocondrial, causando cambios en la morfologa mitocondrial que estn implicados en la muerte celular inducida por VacA ( Jain et al., 2011 ).Se demostr que VacA recluta y activa la protena relacionada con dynamin-1 (Drp1), un regulador de la fisin mitocondrial dentro de las clulas. En AZ-521, AGS y clulas MDCK polarizado infectados con H. pylori, redes mitocondriales transicin de las redes filamentosas de fibras interconectadas a orgnulos puntiformes ms cortos dentro de

las 8 h de la infeccin. En clulas infectadas con un H. pylori VacA knockout cepa, hay fragmentacin mitocondrial era visible. Crticamente, se ha demostrado que la inhibicin de la fisin mitocondrial inducida por Drp1 impidi la activacin de Bax, MOMP, y por lo tanto la muerte celular ( Jain et al., 2011 ). Mientras que el complejo equilibrio entre la apoptosis, la fisin, la fusin y la autofagia es un tema de intenso estudio, VacA se ha encontrado recientemente para activar la autofagia en las clulas AGS (una lnea gstrico adenocarcinoma de clulas) ( Terebiznik et al., 2009 ). La autofagia induccin por VacA parece requerir la actividad de formacin de poros toxina, como sobrenadante de cultivo de H. pylori cepas incapaces de formacin de poros no inducir la autofagia ( Terebiznik et al., 2009 ). Sera interesante examinar con ms detalle la relacin de causalidad entre la formacin de poros, la induccin de la autofagia, y la induccin de apoptosis por Vaca. Est claro que todava hay muchas preguntas sin respuesta que rodean el mecanismo por el cual VacA es capaz de inducir apoptosis en clulas epiteliales gstricas, y tambin hay un gran debate en cuanto a cul de las dos subunidades (p33 y / o p55) es responsable. La mejora de los ensayos utilizados para medir los efectos VacA en clulas husped se requiere. Esto puede ser en la forma de introduccin de un conjunto de vectores que permitan una expresin ms estrechamente regulado y controlable de VacA y la expresin de versiones sin etiquetar de las subunidades de la toxina.

VacA y CagA: El Yin y el Yang de H. Pyloricitotoxicidad inducida

Otra de las claves H. pylori factor de virulencia es el producto del gen de la CagA. Curiosamente, los ltimos hallazgos sugieren que los efectos provocados por CagA en la clula husped pueden contrarrestar los provocados por VacA, y viceversa , que apunta a otro nivel de complejidad en el modo de accin de Vaca. CagA se entrega en la clula husped por H.pylori a travs de un sistema de secrecin de tipo IV ( Segal et al, 1999. ;Asahi et al, 2000. ; Backert et al, 2000. ; Odenbreit et al, 2000. ; Stein et al, 2000. ). Una vez dentro de la clula husped, CagA es fosforilada por la quinasa Src tirosina anfitrin ( Selbach et al., 2002 ). Fosforilada CagA dysregulates actina del citoesqueleto reordenacin en la clula husped, lo que provoc el llamado fenotipo colibr, que se caracteriza por una morfologa alargada de la clula husped que se asemeja a la largo pico delgada de un Hummingbird ( Segal et al., 1999 ). El antagonismo funcional entre VacA y CagA se hizo evidente cuando se examinaron los efectos de estas dos protenas sobre la actividad del factor de transcripcin nuclear factor de acogida de clulas activadas-T (NFAT) (Yokoyama et al., 2005 ). VacA purificada (a 2,5 g / ml) contrarresta el efecto estimulador de CagA en la actividad transcripcional de NFAT en clulas epiteliales gstricas cultivadas ( Yokoyama et al., 2005 ).Translocacin nuclear de NFAT tambin fue abolido por el tratamiento VacA ( Yokoyama et al., 2005 ). Ms tarde, Argent y colaboradores estudiaron el H. pylori cepas 60190 y 84-183 y encontr que la vacuolizacin mediada VacA atenuada fenotipo colibr inducida CagA-, yviceversa ( Argent et al., 2008 ). Tegtmeyer y sus colaboradores confirmaron estos efectos usando el H. pylori cepas P310 y P277, y dieron un paso ms para demostrar que no slo VacA fenotipo colibr inhibido, sino tambin el aumento de la internalizacin del receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) y se inhibe la actividad de EGFR y la activada por mitgenos protena quinasa ERK1 / 2 ( Tegtmeyer et al., 2009). Curiosamente, bafilomicina A1, un inhibidor de la vacuolizacin mediada-vaca V-ATPasa y,

no restaur fenotipo colibr en clulas infectadas por el P310, lo que sugiere que es poco probable que sea debido a la vacuolizacin el efecto inhibidor de VacA per se ( Tegtmeyer et al., 2009 ). Estos hallazgos sugieren que VacA contrarresta fenotipo colibr mediada CagA al interferir con vas de sealizacin de EGFR y Erk1/2-mediated. En apoyo adicional de un antagonismo funcional entre VacA y CagA, una fusin de GFP del dominio C-terminal de 38 kDa de CagA ha demostrado inhibir los efectos apoptticos y vacuolizante de VacA, posiblemente a travs de la inhibicin de la actividad de quinasa de la familia Src ( Oldani et . al, 2009 ).Este dominio construccin C-terminal de CagA tambin bloquea la co-localizacin de VacA con LAMP1, posiblemente inhibiendo el trfico de Vaca a endosomas (finales Oldani et al., 2009 ). A pesar de la falta de un vnculo gentico entre el cagA y vacA genes, la mayora H. pylori cepas que albergan el cagA gen llevan el ms toxignicoS1 forma de vacA alelo mientras que cagA cepasnegativos generalmente poseen la no txico S2 forma de vacA ( Atherton et al., 1995 ). La razn de esta relacin haba sido enigmtica. Estos hallazgos recientes han ofrecido explicaciones plausibles de una unin funcional entre CagA y VacA en el nivel de seal de la clula husped transduccin. Tal antagonismo entre CagA y VacA podra permitir a H. pylori a tomar el mando de las respuestas de clulas husped sin causar dao celular bruto. Sin embargo, el hecho de que algunos H. pylori aislamientos son totalmente capaces de ambas respuestas celulares mediadas por CagA y vacuolizacin inducida-vaca sugiere que el efecto neto de VacA y CagA podra variar entre cepas y posiblemente podra ser influenciado por la cantidad de VacA producida o por factores an no identificados. Adems comprensin de la base molecular de la sealizacin de VacA y CagA mediada en la clula husped es probable que proporcione datos esenciales sobre la importancia fisiolgica de la diafona entre estos dos importante e intrigante H. pylori citotoxinas.

Observaciones finales
VacA se ha implicado como una tecla H. pylori factor de virulencia y se ha demostrado que ejercen muchos efectos celulares. Aunque esta toxina multifuncional se ha investigado ampliamente, una considerable controversia acerca de los aspectos fundamentales de la accin VacA y la biologa. La subunidad y receptor celular responsable de la unin de VacA y posterior internalizacin siendo difcil de alcanzar y hay conjetura en cuanto a si un cierto receptor identificado (RPTP) es esencial. Adems, se sabe poco acerca de la trata de Vaca a la mitocondria, donde se dice que VacA para inducir la apoptosis a travs de un mecanismo desconocido, la zona ms altamente disputada de investigacin Vaca. Aunque muchos creen que tanto p33 y p55 se requieren para formar un canal de aniones-selectiva dentro de la membrana mitocondrial interna-, otros postulan que p33 por s sola es suficiente y capaz de formar canales de la membrana estables independientes de p55. Adicin de ms incertidumbre, la evidencia reciente ha revelado que p55 puede inducir la apoptosis indirectamente por indirectamente hasta la regulacin de factores proapoptticos. Delinear la subunidad / s responsable proporcionar informacin crucial sobre los mecanismos en el trabajo, y podra servir como base para futuros estudios.