UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

HALINA BINDE DORIA

USO DE BIOMARCADORES HISTOLGICOS E BIOQUMICOS NA ANLISE DA TOXICIDADE DO CLORETO DE COBRE EM JUNDIS (Rhamdia quelen)

CURITIBA 2010

HALINA BINDE DORIA

USO DE BIOMARCADORES HISTOLGICOS E BIOQUMICOS NA ANLISE DA TOXICIDADE DO CLORETO DE COBRE EM JUNDIS (Rhamdia quelen)

Monografia apresentada disciplina de Estgio em Farmacologia como requisito parcial para a obteno do grau de Bacharel em Cincias Biolgicas, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran. Orientadora: Prof. Dr.Helena Cristina da Silva de Assis Co-orientadora: Guiloski MSc. Izonete Cristina

CURITIBA 2010

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Prof Dr Helena Cristina da Silva de Assis pela confiana no meu trabalho, pacincia, orientao e bom humor que sempre me recebeu.

A Cris que me ajudou tanto na parte de biomarcadores enzimticos e a Maritana que me ensinou a leitura das lminas histolgicas, muito obrigada pelo tempo e pacincia que tiveram comigo.

Aos meus pais que sempre me apoiaram em todas as minhas escolhas.

Aos meus colegas de laboratrio que sempre me proporcionaram boas conversas e risadas: Cris, Csar, Letcia e Jssica.

Aos meus amigos Janana, Francine, Alejandro, Andria, Anne, Andr, Joyce, Patrcia e Vanessa que tornam minha vida to divertida!

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

RESUMO O cloreto de cobre (CuCl2. 2H2O) uma substncia amplamente utilizada como desinfetante, desodorante e dessulfurizante em destilados de petrleo, na purificao de gua, como aditivo alimentar e principalmente, como biocida. O jundi Rhamdia quelen, organismo bioindicador do presente trabalho, um peixe de distribuio neotropical encontrado em rios paranaenses. O cultivo dessa espcie vem aumentando nos ltimos anos devido sua boa aceitao pelo mercado consumidor. O uso de biomarcadores possibilita avaliar o efeito causado por diferentes contaminantes, como o cobre, nos seres vivos. Eles podem ser definidos como respostas biolgicas adaptativas a estressores, evidenciadas como alteraes bioqumicas, celulares, histolgicas fisiolgicas ou comportamentais. Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do cloreto de cobre em jundis (Rhamdia quelen) utilizando biomarcadores histolgicos e bioqumicos por meio de um bioensaio esttico. Os peixes (n=80) foram distribudos em grupos controle e teste, sendo expostos por 96 horas s concentraes de 2 g/L, 10 g/L e 20 g/L de cloreto de cobre. Em fgado, os parmetros analisados foram a histopatologia e as atividades enzimticas: catalase (CAT), superxido dismutase (SOD), glutationa Stransferase (GST) e glutationa redutase (GR), alm da peroxidao de lipdica (LPO). A anlise da atividade da acetilcolinesterase (AChE) foi realizada em msculo e crebro. Os resultados obtidos permitiram concluir que o cloreto de cobre txico para a espcie principalmente, nas concentraes de 10 g/L e 20 g/L. A atividade da SOD e a anlise histopatolgica com a presena de centros de melanomacrfagos (CMM) podem ser utilizados como biomarcadores para a exposio ao cloreto de cobre, pois foram os que mais responderam. Palavras-chave: Cobre, jundi, estresse oxidativo, histopatologia.

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LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1: Distribuio e especiao do cobre em guas naturais............................ 10 Figura 2: Especiao do cobre em funo do pH.....................................................11 Figura 3: Exemplar de Rhamdia quelen ...................................................................19 Figura 4: Respostas dos organismos poluio ambiental .....................................21 Figura 5: Atividade da GST em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ......37 Figura 6: Atividade da SOD em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre......38 Figura 7: Atividade da CAT em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ......38 Figura 8: Atividade da GR em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ........39 Figura 9: Lipoperoxidao em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ........39 Figura 10: Atividade da AchE muscular em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ........................................................................................................................40 Figura 11: Atividade da AchE cerebral em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ........................................................................................................................40 Figura 12: ndice de leso histopatolgica de fgado de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre........................................................................................................41 Fgura 13: Contagem de centros de melanomacrfagos e melanomacrfagos livres em fgado de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre ..................................42 Figura 14: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen do grupo controle .....43 Figura 15: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen do grupo exposto a 2g/L ........................................................................................................................44 Figura 16: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen do grupo exposto a 10g/L ......................................................................................................................45 Figura 17: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen do grupo exposto a 20g/L ......................................................................................................................46 Tabela 1: Alteraes histopatolgicas e seus respectivos fatores de importncia... 36

SUMRIO RESUMO.................................................................................................................... iv LISTA DE FIGURAS E TABELAS............................................................................... v 1. INTRODUO ........................................................................................................1 1.1 Metais Pesados .................................................................................................2 1.2 Cobre: Fontes e Usos ........................................................................................4 1.3 Cobre: Propriedades qumicas e bioqumicas ...................................................8 1.4 Cloreto de cobre ..............................................................................................16 1.5 Bioindicador: Rhamdia quelen .........................................................................19 1.6 Biomarcadores.................................................................................................20 1.6.1 Biomarcadores de Biotransformao ........................................................21 1.6.2 Biomarcadores de Estresse Oxidativo ......................................................22 1.6.3 Biomarcador de Neurotoxicidade Acetilcolinesterase (AChE)................27 1.6.4 Histopatologia ...........................................................................................28 2. OBJETIVOS ..........................................................................................................30 2.1 Objetivo Geral..................................................................................................30 2.2 Objetivos especficos .......................................................................................30 3. MATERIAL E MTODOS ......................................................................................31 3.1 Desenho experimental .....................................................................................31 3.2 Biomarcadores bioqumicos.............................................................................31 3.2.1 Atividade da GST ......................................................................................32 3.2.2 Atividade da CAT ......................................................................................32 3.2.3 Atividade de SOD......................................................................................33 3.2.4 Atividade da GR ........................................................................................33 3.2.5 Lipoperoxidao ........................................................................................33 3.2.6 Atividade da AChE ....................................................................................34 3.2.7 Anlise da concentrao de protena ........................................................34 3.3 Biomarcador Histopatolgico ...........................................................................35 3.3.1 Microscopia de luz - Anlise histopatolgica de fgado .............................35 3.3.2 Avaliao histopatolgica..........................................................................35 3.3.3 Anlise quantitativa dos centros de melanomacrfagos e melanomacrfagos livres em fgado ..................................................................36 3.4 Anlises estatsticas ........................................................................................36 4. RESULTADOS ......................................................................................................37 4.1 Biomarcadores bioqumicos.............................................................................37 4.1.1 Atividade da Glutationa S-transferase.......................................................37 4.1.2 Atividade das enzimas antioxidantes e lipoperoxidao ...........................37 4.1.3 Atividade da AChE ....................................................................................39 4.2 Anlise histopatolgica ....................................................................................40 5. DISCUSSO .........................................................................................................47 6.CONCLUSO.........................................................................................................55 7. RERNCIAS BIBLIOGRFICAS...........................................................................56

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1. INTRODUO

Os chamados metais pesados esto presentes desde muito cedo na histria da humanidade. O cobre considerado como o primeiro metal j utilizado pela espcie humana, artefatos manufaturados com esse metal datam de 4.000 anos a.C.(NAVARRO, 2006). A intensa utilizao do cobre seja ele na forma metlica ou de compostos cpricos e a natural abundncia no meio, torna inevitvel a exposio dos seres vivos a este metal. Mesmo que seja essencial vida, em altas concentraes, ele pode causar dano aos organismos (EISLER, 1998). No ambiente aqutico o estado de oxidao mais importante do cobre o bivalente (Cu+2), ele o mais biodisponvel e txico das espcies inorgnicas. Porm, a concentrao de ons livres sensvel formao de complexos a ligantes orgnicos e inorgnicos, a adsoro e particulao e consequente, deposio no sedimento. O conhecimento da especiao do cobre tambm permite a avaliao da toxicidade que ele pode causar (TEMPLETON et al., 2000; PEDROZO & LIMA, 2001). O cloreto de cobre, composto utilizado no experimento em questo, muito utilizado como desinfetante, em destilados de petrleo, na purificao de gua e como aditivo alimentar, mas principalmente, como fungicida e bactericida mesmo com vrios relatos de fitotoxicidade (PEDROZO & LIMA, 2001). Como o ambiente aqutico um receptor de muitos poluentes, incluindo os metais como o cobre, provvel que haja algum perjrio aos animais aquticos que nele vivem. Assim, os estudos de toxicologia ambiental com organismos aquticos permitem a mensurao dos efeitos desses poluentes nos seres participantes do ecossistema aqutico complementando as anlises realizadas em outras reas de estudo. A espcie Rhamdia quelen foi escolhida como bioindicador no presente trabalho por ser um peixe nativo da regio e devido utilizao desta espcie como alimento estar crescendo, alm da fcil manuteno em condies laboratoriais (GOMES et al.,2000). Sabe-se que a pesquisa laboratorial de grande importncia quando essa apresenta resultados extrapolveis ao campo. Ento, o uso de biomarcadores faz-se de grande importncia para a avaliao da toxicidade de diversos compostos

potencialmente poluentes, pois ele apresenta respostas rpidas e permite a predio de efeitos adversos nos organismos (VAN DER OOST et al., 2003). Assim, o presente estudo pode contribuir com informaes que permitem a melhor compreenso e a resoluo dos problemas ambientais. 1.1 Metais Pesados O termo metal pesado usado principalmente para definir compostos qumicos com propriedades potencialmente txicas ou ecotxicas. A categorizao e classificao de substncias pode ser muito til, pois permite uma rpida e simples associao com outras que tem propriedades em comum. Porm, por definio, o termo considerado arbitrrio e muito impreciso. As limitaes so claras: a palavra metal convencionalmente, usada para se referir ao elemento puro ou ligas metlicas e pesado implica alta densidade. Dessa maneira, se levarmos em conta o sentido literal dessas palavras, o conhecimento da densidade contribui minimamente para a predio dos efeitos biolgicos dos metais, especialmente quando os metais ou as ligas em questo no so, na maioria dos casos, as espcies reativas que os organismos vivos esto em contato. Vrias explicaes para justificar esse nome foram propostas ao longo dos anos em termos de densidade, peso atmico, nmero atmico, propriedades qumicas e toxicidade, mas todas agrupam desiguais grupos de elementos, e ainda mais discrepantes grupos de compostos de elementos qumicos (DUFFUS, 2002). A poluio do ambiente por metais se deu a partir da domesticao do fogo. Com a deposio de pequenas quantidades e de resduos da queima durante atividades de metalurgia, os nveis dessas substncias j se alteravam nos ambientes de caverna que habitavam os primeiros homindeos (NRIAGU, 1996). Alm da metalurgia, eles tambm eram usados como purificadores de gua pelos egpcios h 3.000 a.C. e vrios eram empregados na fabricao de medicamentos (BERALDO, 2005). Partindo da antiga afirmao do assim chamado pai da toxicologia, Theophrastus Bombastus von Hohenheim (1493-1541), mais conhecido como Paracelso de que O que no txico? Todas as substncias so txicas. Apenas a dose correta que diferencia um veneno de um remdio. Pode-se afirmar que ela continua atual e correta. Dado que, todos os metais so considerados potencialmente txicos e capazes de gerarem efeitos adversos nos sistemas

biolgicos quando em concentraes acima do necessrio (DALLINGER & RAIMBOW, 1993). A frase aplica-se perfeitamente no caso dos metais essenciais, assim chamados por serem indispensveis para um completo ciclo de vida dos seres vivos (DUFFUS, 2002). Alguns exemplos so: Sdio, Potssio, Mangans, Ferro, Cobre, Zinco e Clcio. A alta concentrao desses metais, dissolvidos nas guas, por exemplo, faz com que eles se acumulem nos tecidos em uma concentrao muito maior do que a necessria, causando danos aos sistemas. A disponibilizao de metais no meio aqutico d-se por fontes naturais como lavagem geolgica de solos e rochas, diretamente expostos gua, e por fontes antrpicas como efluentes domsticos e industriais, pelo processo de minerao, pela aplicao de pesticidas na agricultura (EBRAHIMPOUR & MUSHRIFAH, 2008) e atravs de precipitao em reas com poluio atmosfrica (PEREIRA et al., 2006). Como metais so substncias persistentes no meio e prejudiciais a biota, uma vez que no podem ser degradados ou destrudos, a contaminao por metais dos ambientes aquticos considerada uma situao perniciosa. Estudos j mostraram que a toxicidade global anual dos metais mobilizados pela atividade antrpica excede a toxicidade resultante dos desperdcios orgnicos e radioativos (NRIAGU & PACYNA, 1988). Nos ecossistemas aquticos, a maioria dos poluentes, incluindo os metais, tendem a precipitar na superfcie dos sedimentos (AHMAD & SHUHAIMIOTHMAN, 2010). Assim sendo, os sedimentos so conhecidos como uma importante fonte de contaminantes e de maneira geral, as concentraes de metais neles so maiores do que na coluna dgua. Mas, as guas intersticiais podem influenciar as concentraes de metais nas guas superficiais por meio de processos como a difuso, consolidao e bioturvao (SALOMONS & FRSTNER, 1984) e dependendo das condies abiticas do ambiente que interferem diretamente na especiao dos metais como temperatura, pH, dureza da gua potencial de oxirreduo da gua, ligantes complexadores , partculas em suspenso e carbono, presena de ctions competidores (Ca+2, Mg+2, Fe+2) e nions de sais cpricos insolveis (OH-, S-2, PO4-3, CO3-2) (PEDROZO & LIMA, 2001), eles podem comear a ser liberados na coluna dgua tornando-se biodisponveis. Nestas condies podem afetar os organismos aquticos, sendo incorporados ao longo da cadeia alimentar e consequentemente podendo tambm causar danos sade humana (KHAN et al., 2005).

Porm, a distribuio, o transporte e a biodisponibilidade dos metais em ambientes aquticos primeiramente controlados pelo sedimento e depois pela coluna de gua. Assim, os metais so concentrados pelo sedimento e partculas em suspenso na gua reagindo atravs de trocas inicas, adsoro e precipitao (YUAN, 2004). Existem trs importantes mecanismos no seqestro de metais. Adsoro fsico-qumica pela coluna de gua, absoro biolgica por algas e bactrias e abitica por sedimentao e em ltimo, aprisionamento fsico de partculas por matria enriquecida. A importncia relativa desses trs mecanismos ser diferente dependendo do sistema aqutico em questo (HART, 2004). A retirada dos metais em soluo na gua s acontece quando eles so devidamente imobilizados. A capacidade inerente a alguns organismos como bactrias, algas e fungos que podem funcionar como agentes imobilizadores alvo de vrios estudos na comunidade cientfica, pois se sabe que essa competncia pode ser usada em tratamentos para desintoxicao das guas. Porm, de acordo com a espcie utilizada, a origem da biomassa e seu processamento, eles consistem em vrios mecanismos que diferem quantitativa e qualitativamente entre si. Assim, o sequestro de metais segue mecanismos complexos, como: troca de ons, quelao, adsoro por foras fsicas e aprisionamento de ons em capilares inter e intrafibrilar e espaos da rede de polissacardeos estruturais como resultado do gradiente de concentrao e de difuso atravs de parede celular e membranas. Vrios grupos qumicos que atraem e sequestram metais na biomassa j foram identificados como: grupos acetamido da quitina, polissacardeos estruturais de fungos, os grupos amino e fosfato em cidos nuclicos, aminocidos, amido, sulfidrila, grupos carboxila em protenas, hidroxilas em polissacardeos, e principalmente, carboxilas e sulfatos em polissacardeos de algas marinhas de Phaeophyta, Rhodophyta e Chlorophyta (VOLESKY, 1995). 1.2 Cobre: Fontes e Usos O cobre o mais antigo metal usado pelo homem. Ele caracteriza uma poca que pode ser considerada como intermediria entre a idade da pedra e a do bronze. Artefatos feitos com ele datam de 4.500/4.000 a.C. (NAVARRO, 2006). Porm, onde atualmente o norte do Iraque foi encontrado um colar de cobre de 8.700 a.C, demonstrando que a descoberta acidental deste metal pode ter ocorrido

muito antes. Os antigos gregos da era pr-crist de Hipcrates (400 a.C) foram os primeiros a descobrir o poder de desinfeco do cobre. Eles receitavam cobre para doenas pulmonares e para purificar a gua potvel. Os celtas, naturais da Esccia, produziam usque em vasos de cobre por volta de 800 d.C, e esta prtica continua at os dias atuais. Os principais depsitos de cobre da Antiguidade estavam localizados no Sinai, na Sria, no Afeganisto, em Chipre, na Macednia, na Ibria e na Europa Central. As principais minas europias da Era do Bronze estavam localizadas na ustria, Alemanha, Frana, Espanha, Portugal, Grcia e Tirol (BORKOW & GABBAY, 2004). No imprio Romano, intensificou-se o uso do cobre. A minerao e a troca de recursos minerais tornaram-se importantes para o sustento da economia, alm, de que as diferentes tcnicas utilizadas no manejo dos metais significavam status tecnolgico (NRIAGU, 2005). A maior parte do cobre usado pelo Imprio Romano vinha da ilha de Chipre, da a origem do nome que vem do latim, cuprum, proveniente de Kypros, nome grego da ilha de Chipre, onde foram descobertas as primeiras jazidas deste metal (VON SPERLLING, 2005). Alm disso, o cobre foi representado com o mesmo signo que Vnus, pois Chipre estava consagrada a deusa da beleza e os espelhos eram fabricados com este metal. O smbolo, espelho de Vnus da mitologia e da alquimia, foi posteriormente adotado por Carl Linn para simbolizar o gnero feminino (). Apesar de sua antiguidade, o cobre manteve aliado aos outros metais, um papel constante e meritrio na evoluo da humanidade, sendo utilizado em todas as fases das revolues tecnolgicas j passadas pelo ser humano. Principalmente na revoluo eltrica quando Alexandre Volta construiu o dispositivo da pilha. O mecanismo consistia na utilizao de uma srie de discos de dois metais diferentes, como cobre e zinco, empilhados (da o nome pilha) alternativamente e entre cada disco havia um pedao de tecido ou papel embebido com algum cido (CHAGAS, 2000). Sendo o cobre um dos melhores condutores de eletricidade somente suplantado pela prata, a demanda aumentou exponencialmente, com o

desenvolvimento da indstria eltrica. As instalaes telefnicas e telegrficas, as centrais hidreltricas, os motores, os dnamos, os transformadores, os aparelhos de rdio, os cabos, os fios absorvem, hoje, uma quantidade enorme de cobre puro, que no pode ser substitudo na maior parte dos casos, por nenhum outro metal.

O cobre amplamente distribudo na natureza e ocorre naturalmente em muitos minerais, como cuprite (Cu2O), malaquita (Cu2CO3.Cu(OH)2), azurita (2CuCO3.Cu (OH)2), calcopirita (CuFeS2), calcocita (Cu2S), e bornita (Cu5FeS4). As formas malaquita, calcopirita e calcocita so as mais representativas fontes de cobre. Na crosta terrestre apresenta uma abundncia natural de aproximadamente 60 mg/kg (50 ppm) e 2,5.10-4 mg/L nos mares. O contedo de cobre nos depsitos minerais varia de 0,5% a 5% do peso. Rochas gneas contm 0,010% e as rochas cristalinas 0,0055% em peso (IPCS, 1998; PEDROZO & LIMA, 2001; HSDB, 2000). Os arenitos apresentam entre 10 a 40 ppm, os xistos entre 30 a 150 ppm e os xistos marinhos entre 20 a 300 ppm de cobre (PEDROZO & LIMA, 2001; HSDB, 2000). No Brasil, em 2005, o consumo de cobre, foi de 1,44 kg per capita, e cerca de 0,52 kg, por habitante, ficam "em uso" como estoque, principalmente em infra-estruturas, edifcios, equipamentos eltricos e eletrodomsticos. A gerao de resduos est perto da mdia europia de 1,865 kg por habitante, e menor do que na Amrica Latina que tem 3 kg per capita. O Brasil ainda importa cobre principalmente, do Chile e do Peru (TANIMOTO, 2009). Devido combinao nica de propriedades que compreendem condutividade eltrica e trmica, durabilidade e maleabilidade, 65% do cobre so principalmente, usados na indstria eltrica e eletrnica; 15% na construo civil e os 20% restantes em equipamentos de transporte, ar condicionado e refrigerao, bens de consumo como aparelhos domsticos, cunhagem, munies e produo de ligas como lato e bronze (IPCS, 1998). Os sais de cobre, dentre eles o sulfato e cloreto de cobre, so amplamente utilizados como biocidas no controle de algas e macrfitas, caracis de gua doce que podem ser vetores da esquistossomose e outras doenas, ectoparasitas de peixes e mamferos, organismos incrustantes marinhos, mofo e doenas de plantas cultivadas. Esses sais tambm so usados em fertilizantes agrcolas, produtos veterinrios e mdicos, na indstria de alimentos, como desinfetantes e como conservante de madeira e outros materiais. (EISLER, 1998). Sessenta e cinco por cento da produo desses compostos destinada a aplicaes na agropecuria, 28% na indstria como agente de flotao de minrios de sulfeto, refino de petrleo, mordente para corantes txteis, galvanoplastia, conservante de madeiras e tintas anti-incrustantes e 7% so intencionalmente, jogados em corpos dgua para tratamentos de purificao. Alguns outros usos interessantes incluem o DIU (dispositivo intra-uterino) que um artefato de

polietileno que pode ser adicionado a cobre ou hormnios e, quando inserido na cavidade uterina exerce funo contraceptiva (TREIMAN et al., 1995). Tais dispositivos contm cerca de 100 a 150 mg de cobre. A utilizao de ligas que usam cobre associado a outros metais como alumnio, cobalto, mangans, nquel e zinco na fabricao de pontes e coroas dentrias (PEDROZO & LIMA, 2001). A exposio ao cobre inevitvel uma vez que ele um metal abundante na crosta terrestre. Mesmo por fontes naturais, a eroso e lixiviao liberam quantidades significantes em forma de poeira que se depositam na superfcie terrestre e em guas superficiais, principalmente. As fontes naturais de exposio ao cobre incluem poeira levada pelo vento, vulces, vegetao em decomposio, incndios florestais e nvoas marinhas. Os ventos, por possibilitarem a movimentao do metal depositado no solo da superfcie terrestre, chegam a distribuir cerda de 65% do cobre emitido por fontes naturais. A atividade vulcnica tambm injeta partculas na atmosfera que podem se distribuir por terra ou em guas superficiais. Como qualquer outro metal tambm distribudo por precipitaes e fluxo de guas. Emisses antropognicas incluem usinas, fundio de ferro, fontes de combusto, como queima de carvo para incineradores e gerao de energia, mas principalmente, sobrecarga de minas de cobre e dejetos humanos e animais. Como exemplo, efluentes e esgotos tem concentraes de metais que variam enormemente. O lodo de esgoto, estritamente urbano, tem normalmente baixas quantidades de metais, mas quando esgotos industriais e gua da chuva entram no sistema de captao de esgoto, este pode ter as concentraes de metais aumentadas, representando um risco ao meio ambiente e sade pblica (OLIVEIRA & MATIAZZO, 2001). O acmulo de metais pesados em solos agrcolas, devido s aplicaes sucessivas de lodo de esgoto, causa preocupao com relao segurana ambiental necessria para a implementao desta prtica. Os metais expressam o potencial poluente diretamente nos organismos do solo, pela disponibilidade s plantas em nveis fitotxicos, alm da possibilidade de transferncia para a cadeia alimentar atravs das prprias plantas ou pela contaminao das guas de superfcie e subsuperfcie (CHANG et al., 1997). A utilizao agrcola (fertilizantes, biocidas e suplementos alimentares) de produtos de cobre responsvel por 2% do cobre lanado no solo (IPCS,1998). A utilizao de resduos slidos, como o lixo domstico e o procedente da agricultura em processos de compostagem so fontes relevantes de metais, sendo o lixiviado oriundo desses

processos ricos em metais como o cobre (GROSSI, 1993). Outras fontes de exposio ao cobre significativas e curiosas consistem no cobre oriundo de tubulaes o que pode elevar sua concentrao no sistema pblico de abastecimento de gua dependendo da acidez, dureza da gua, temperatura, contedo de CO2 dissolvido, durao do contato gua - tubulao, idade e extenso da tubulao de cobre ou peas hidrulicas feitas com ligas desse minrio (BARCELOUX, 1999). O uso de cobre na cobertura de telhados pode tambm favorecer a contaminao das guas atravs da lixiviao. Nesses casos o volume de precipitao, a maior exposio ao dos ventos e a menor inclinao em relao ao horizonte so fatores determinantes de uma maior ou menor lixiviao (WALLINDER et al., 2000). Apesar de ter sido estimado que 66% das emisses de cobre para o ambiente em 1983 foram provenientes de fontes antrpicas (IPCS, 1998) a quantidade anual que entra no ecossistema global desconhecida, entretanto as estimativas variam de 75.000 toneladas (MOORE et al., 1997) a 1,8 milhes de toneladas (NAS, 1977). Disso, 80,7% do cobre produzido depositado nos compartimentos terrestre, 15,7% na hidrosfera, e 3,6% para a atmosfera (NRIAGU, 1979). A entrada de cobre nos ecossistemas aquticos aumentou acentuadamente nas ltimas dcadas, pois os recursos hdricos tm sido utilizados como locais para o despejo dos resduos provenientes das atividades antropognicas e, pensava-se que esses ecossistemas tinham capacidade infinita de absorver poluentes. O problema que a diluio no de maneira alguma uma soluo para a poluio (MELA, 2004). 1.3 Cobre: Propriedades qumicas e bioqumicas Como classificao, o cobre um elemento qumico de smbolo Cu nmero atmico 29 (29 prtons e 29 eltrons) e de massa atmica 63,6. Dito um metal de transio, pertence ao grupo 11 (1B) da Classificao Peridica dos Elementos. temperatura ambiente, o cobre encontra-se no estado slido. Tem ponto de ebulio de 2595 C e fuso a 1083 C, apres enta densidade relativa de 8,9, em forma nativa no solvel em gua ou em solues salinas, porm solvel em solues cidas na presena de um agente oxidante como o cido ntrico. O cobre apresenta quatro estados de oxidao: metlico Cu0, on cuproso Cu+, on cprico Cu+2 e on trivalente Cu+3. Possui dois istopos estveis,
63 65

Cu e

Cu, com

abundncia na natureza de 69,17% e 30,83% respectivamente, alm de ter nove radioativos, de massa, 58, 59, 60, 61, 62, 64, 66, 67 e 68. Cristaliza no sistema cbico e no possui formas alotrpicas. No atacado pelo ar seco, mas em ar mido que contenha dixido de carbono forma-se uma camada protetora esverdeada de hidroxicarbonetos e hidroixissulfatos protegendo-o contra posterior oxidao (PEDROZO & LIMA, 2001). A forma fsico-qumica do cobre determina seu comportamento no meio ambiente e disponibilidade na biota. O on cuproso (Cu+1) instvel em soluo aquosa na faixa de pH entre 6-8 dissociando-se rapidamente por auto- oxirreduo em on cprico e elementar (PEDROZO & LIMA, 2001). Existe apenas em gua, quando complexado, geralmente em uma forma tetradrica, com afinidade para ligantes de enxofre e de nitrognio (SCHROEDER et al., 1966 apud EISLER, 1998). Os poucos compostos cuprosos estveis em gua so aqueles extremamente insolveis como o cloreto de cobre. O estado de oxidao mais importante no meio ambiente aqutico ou in natura o bivalente (Cu+2). ons cpricos so coordenados com seis molculas de gua em soluo. Ele normalmente forma quelatos menos estveis com ligantes de nitrognio e oxignio planares. Na gua do mar e guas intersticiais, o on cprico livre o mais biodisponvel e txico das espcies inorgnicas, no entanto, a concentrao de ons livres sensvel a complexao e est menos disponvel para a biota aqutica na presena de quelantes naturais orgnicos e de salinidade elevada (BRYAN & LANGSTON, 1992). ons cpricos so responsveis por cerca de 1% do cobre total dissolvido em gua salgada e menos de 1% em gua doce (EISLER, 1998) O on cprico liga-se preferencialmente a ligantes inorgnicos como H2O, OH-, CO3-2, SO4-2 via oxignio e a compostos orgnicos atravs de grupos fenlicos e carboxlicos. Esta forma pode ainda adsorver-se a vrios xidos metlicos hidratados, incluindo os de ferro, mangans e alumnio. Os compostos cpricos so geralmente, solveis em gua e de colorao azul ou verde (IPCS, 1998; PEDROZO & LIMA, 2001). O cobre trivalente (Cu+3), provavelmente no ocorre naturalmente, apenas em alguns compostos. Ele um forte oxidante, mas nenhum composto considerado industrialmente importante ou ambientalmente significativo (EISLER, 1998; PEDROZO & LIMA, 2001). Como ilustrado na Figura 1, vrios processos influenciam o destino do cobre em meio aquoso. Estes incluem a formao de complexos a ligantes orgnicos e inorgnicos, a adsoro a xidos de metal hidratado, argilas e materiais

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orgnicos em suspenso, a bioacumulao e troca entre sedimentos e gua (IPCS, 1998; PEDROZO & LIMA, 2001). Grande parte do cobre descarregado na gua est na forma de partculas e tende a precipitar ou ser adsorvido por matria orgnica, ferro hidratado, xidos de mangans e argila no sedimento ou coluna de gua. Informaes sobre as formas fsico-qumicas da especiao de cobre so mais relevantes do que as concentraes de cobre total (IPCS, 1998).

Figura 1: Esquema da distribuio e especiao do cobre em guas naturais. Adaptado a partir de Sodr (2005).

Assim, nota-se que a especiao no se restringe apenas diferenciao entre estados de oxidao, mas tambm distribuio de um elemento entre compostos orgnicos e inorgnicos de forma que possa afetar seu transporte, biodisponibilidade e, conseqentemente, sua toxicidade (TEMPLETON et al., 2000). Desta maneira, o conhecimento da especiao de um metal representa o instrumento que mais subsidia a avaliao da toxicidade destas espcies. Devido importncia do conhecimento da especiao de metais em guas naturais, os padres de qualidade de gua nos Estados Unidos so baseados, h mais de quinze anos, na frao solvel do metal, e no em sua concentrao total (USEPA, 1992). Anteriormente, os padres de qualidade de gua para corpos receptores no nosso pas eram fundamentados apenas na concentrao total do metal (CONAMA, 1986). Atualmente, os padres esto estabelecidos com base tanto na concentrao total como na frao solvel do metal na coluna de gua (CONAMA, 2005). Essa mudana na lei foi considerada um avano, pois, atualmente considera-se a informao obtida atravs da determinao da concentrao total de um dado

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elemento

insuficiente

do

ponto

de

vista

ambiental,

por

no

traduzir

biodisponibilidade desse (SOARES, 1995). relevante ainda dizer que a forma qumica de cobre em gua doce importante no controle de processos geoqumicos e biolgicos (EISLER, 1998). Em gua doce, a solubilidade de sais de cobre diminuda em condies de reduo e ainda modificado pelo tamanho e densidade dos materiais em suspenso, temperatura, dureza e principalmente o pH da gua, como mostra a Figura 2. As principais espcies qumicas de cobre solvel encontradas na gua doce so Cu(CO3)2-2 e CuCO3 (EISLER, 1998). O on cprico e algumas espcies de hidroxila de cobre so correlacionados com alta toxicidade vida aqutica, no entanto, as espcies de carbonato (CuHCO3+, CuCO3, Cu(CO3)2-2) so muito menos txicas do que outros complexos de cobre (MEADOR, 1991).

Figura 2: Especiao do cobre em funo do pH. Retirado de (PEDROZO & LIMA, 2001).

A toxicidade do cobre geralmente decresce com o aumento da dureza da gua, provavelmente pela competio entre clcio e cobre pelos stios de adsoro em superfcies biolgicas. Assim, quanto maior a concentrao de clcio menor a adsoro de cobre (IPCS, 1998). O equilbrio alterado na presena de cidos hmicos, cidos flvicos, aminocidos, cianetos, certos polipeptdios e detergentes (USEPA, 1980). A maioria dos sais cpricos dissolvem-se facilmente em gua doce para produzir o on aquoso, Cu(H2O)6+2 (EISLER, 1998). Cloreto, nitrato e sulfato de cobre divalentes so altamente solveis em gua mas, carbonato de cobre, carbonato cprico, hidrxido de cobre, xido cprico e sulfeto cprico precipitam em

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soluo ou formam suspenses coloidais quando a concentrao de um nion em particular excede a solubilidade do sal. Os principais precipitados formados em guas naturais so a malaquita, o hidrxido de cobre e a azurita. Em guas com baixas concetraes de O2, forma-se calcocita (Cu2S), xido de cobre (Cu2O) e cobre metlico (PEDROZO & LIMA, 2001). As concentraes de cobre nos sedimentos correlacionam-se

positivamente com a concentrao de cobre dissolvido na coluna de gua sobrejacente e so usados para prever a toxicidade de sedimentos de gua doce (ANKLEY et al. 1993). Em sedimentos, o cobre liga-se primeiramente a matria orgnica na seguinte ordem: hidratos de xido de mangans, matria orgnica, xidos de ferro hidratado, aluminossilicatos e argila. A presena de sulfetos solveis em soluo cida fraca, comuns em guas doces e salgadas, denominados sulfetos cidos volteis (SAV) um fator importante no controle da toxicidade de vrios metais. A toxicidade dos metais no observada quando estes se ligam ao sedimento e a concentrao de SAV maior que a soma da concentrao molar dos metais presentes (IPCS, 1998). Um estudo de WINNER et al.(1990) demonstrou tambm que as comunidades aquticas se tornam mais sensveis toxicidade do cobre durante a exposio de cinco semanas na primavera e no no vero ou no outono, porque na primavera as concentraes de carbono orgnico dissolvido so reduzidas. O cobre exibe vrias interaes relevantes com outros metais. Nos animais, ele interage com metais essenciais, como ferro, zinco, molibdnio, mangans, nquel e selnio e tambm com elementos no essenciais incluindo a prata, cdmio, mercrio e chumbo. As interaes podem ser benficas ou prejudiciais ao organismo (KIRCHGESSNER, 1979). Os padres de acmulo de cobre, o metabolismo e a toxicidade dessas interaes frequentemente, diferem daquelas produzidas pelo cobre sozinho. O reconhecimento dessas interaes essencial para a compreenso da toxicocintica do cobre (EISLER, 1998). Como exemplo pode-se citar a interao de cobre e cdmio nos mamferos, onde o cdmio inibe a absoro de cobre atravs da mucosa intestinal (AASETH & NORSETH, 1986). No caso do ferro, a adio dele na dieta de porcos domsticos aumenta a resistncia toxicidade do cobre, mas esse caso considerado uma exceo entre os mamferos (USEPA, 1980). O antagonismo entre cobre e zinco amplamente conhecido, as concentraes sricas e hepticas de cobre decrescem linearmente

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conforme aumenta logaritmicamente as concentraes de zinco na dieta (PEDROZO & LIMA, 2001). Misturas de sais de cobre e zinco em peixes marinhos ou de gua doce so aditivos de toxicidade, produzindo mais mortes em 96 horas do que o esperado com base em componentes individuais (EISLER & GARDNER, 1973). Em peixes, a toxicidade com metais no essenciais aditiva, e ocorre com misturas de sais de cobre e mercrio, cobre-zinco-fenol e de cobre-nquel-zinco (BIRGE & BLACK, 1979). Compostos orgnicos que tambm causam aumento de toxicidade do metal em questo so as misturas de cobre com detergentes aninicos ou inseticidas organofosforados (EISLER, 1998). Metabolicamente, o cobre essencial na homeostase dos organismos e parte de vrias enzimas, incluindo a tirosinase envolvida na produo de melanina, a dopamina beta-hidroxilase relacionada sntese de catecolaminas. A superxidodismutase com funo de desintoxicao de radicais livres, ceruloplasmina, importante na regulao inica do ferro e outros metais possivelmente e citocromoc-oxidase, a ltima enzima da cadeia transportadora de eltrons, presente em todos os organismos aerbicos (AASETH & NORSETH, 1986; MOORE, 1997). Assim sabe-se, que a utilizao do cobre se deu cedo na evoluo dos organismos, e esperado certo grau de conservao das molculas envolvidas no transporte do cobre. Como todos os metais essenciais, o cobre apresenta uma curva em forma de U que vai da deficincia e consequente morte, at o excesso que toxico e tambm pode ser uma eventual causa de morte (MOORE, 1997). Em humanos, a anemia e neutropenia ocorrem na deficincia grave de cobre, e parte da explicao a necessidade de cobre na ceruloplasmina que oxida Fe+2 a Fe+3 para ligao da transferrina (MOORE, 1997). Outro fato importante na deficincia desse metal a doena de Menkes, de causa gentica recessiva ligada ao cromossomo X, pode ser causa morte em crianas por deficincia na absoro de cobre. Nesta alterao gentica, a transferncia placentria de cobre deficiente e a transferncia de cobre no pequeno intestino delgado muito ineficiente. Os efeitos fisiolgicos so agravados pelo fato de que necessrio o gene em questo para o transporte do cobre atravs das camadas celulares do epitlio e organelas celulares, na maioria das clulas e na barreira hematoenceflica (MOORE, 1997). J a doena de Wilson um exemplo da toxicidade crnica do cobre em humanos, quando esse excede as concentraes consideradas aceitveis no metabolismo. Assim, o cobre se acumula principalmente no fgado e no crebro, causando mau

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funcionamento desses rgos (HARRIS & GITLIN, 1996; MOORE, 1997). Como os nveis da absoro de cobre da dieta no so afetados, a acumulao no fgado de forma constante culmina na morte dos hepatcitos (MOORE, 1997). As manifestaes sistmicas da doena de Wilson so leses hepticas e renais e anemia hemoltica (USEPA 1980; AASETH & NORSETH 1986; EISLER, 1998; ATSDR, 2004). Os efeitos txicos do cobre de maneira geral so diversos, incluindo alteraes da permeabilidade das membranas celulares. O principal alvo dos ons cpricos nas membranas celulares so grupos tiol que reduzem o on cprico (Cu+2) para on cuproso (Cu+1), h ainda a oxidao simultnea de dissulfetos na membrana. ons cuprosos so reoxidados na presena de oxignio molecular e este convertido em radicais superxido txicos (O-2), os quais induzem a lipoperoxidao (AASETH & NORSETH, 1986; EISLER, 1998). Na biota aqutica o excesso de cobre manifesta-se em diferentes grupos de maneiras diversas. Em gastrpodes, o cobre pode induzir secreo de muco pelas clulas caliciformes. Ele foi localizado no epitlio celular do p (RYDER & BOWEN, 1977) e liga-se a regies hidroflicas das membranas externas das clulas epiteliais, alterando propriedades bioqumicas e biofsicas, perturbando o

funcionamento normal da peroxidase e ferretina (CHENG,1979). Nos caranguejos, as brnquias so um dos principais alvos da toxicidade do cobre. Ele causa a diminuio da afinidade do oxignio com a hemocianina (TRUCHOT & BOITEL, 1992). Em peixes o principal stio receptor de metais so as brnquias onde o Na+1 e o Ca+2 so transportados da gua para a circulao sangunea por meio de bombas. O canal ou protenas carreadoras associadas a essas bombas apresentam ligantes especficos carregados negativamente. Experimentos demonstraram relao entre a extenso das saturaes dos stios receptores nas brnquias e mortalidade (IPCS, 1998; PREDROZO & LIMA, 2001). Estudos mostram tambm que a superfcie externa do epitlio branquial tem uma afinidade relativamente baixa para o cobre, permitindo a penetrao dele pelos compartimentos intracelulares. O cobre prejudica a funo das brnquias, ao alterar trocas inicas transepiteliais, por exemplo, impede ou perturba o equilbrio eletroltico por captao ativa inibindo ou estimulando a perda passiva (REID & MCDONALD, 1991). Causas de morte so

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relacionadas com a hipxia do tecido, resultado de reduo da atividade de enzimas regulatrias da sntese de ATP (HANSEN et al., 1992). O cobre pode danificar ou destruir a capacidade de olfao de um peixe, levando-o morte. Salmes, por exemplo, usam o senso olfativo para identificar predadores, presas, parentes e companheiros, a mistura e eventual engano de qualquer um desses eventos prejudicial ou fatal (WOODY, 2007). Alm disso, eles podem ter a migrao afetada e consequentemente, a taxa reprodutiva pode decair. Esses peixes memorizam uma combinao complexa de odores qumicos quando da migrao da gua doce onde nasceram gua salgada. Quando voltam ao habitat para desovar, eles seguem esses odores usando a combinao memorizada (HASLER & SCHLOTZ, 1983). Se o salmo no puder cheirar, ou se a assinatura qumica do habitat dos peixes mudarem, o retorno em seguida para a desova ser inviabilizado, pois eles no reconhecero o lugar onde nasceram (WOODY, 2007). A dieta a via mais importante de acumulao de cobre em animais aquticos, e a escolha dos alimentos influencia a concentrao de cobre no organismo (EISLER, 1998). A concentrao de cobre em insetos aquticos coletados em rios contaminados maior em detritvoros (102 mg/kg de peso seco), seguida por predadores (54 mg /kg de peso seco) e onvoros (43 mg /kg de peso seco) (CAIN et al., 1992). Em ecossistemas onde esto inseridos salmondeos, o cobre afeta desde consumidores primrios at os predadores de topo. Isso acontece principalmente pela predileo dos salmes em alimentarem-se de zooplncton que so severamente afetados pela toxicidade desse metal (WOODY, 2007). Concentraes letais e subletais de cobre mostram efeitos txicos do cobre na biota aqutica em nveis menores que 9 g/L (EISLER, 2000). O cobre ou os compostos derivados do cobre em concentraes ambientalmente realistas parece no ser agentes causadores de carcinogenicidade ou teratogenicidade (USEPA 1980; AASETH & NORSETH, 1986; EISLER, 1998). No entanto, sob condies controladas de concentraes elevadas, estudos sugerem que o cobre um potencial carcinognico em roedores (USEPA 1980). Alm de que, dados levantados entre trabalhadores de minas de extrao de cobre constatam que o risco de cncer aumentou com o tempo de trabalho desde a primeira exposio (ATSDR, 2004). Pode ser mutagnico em roedores (AASETH & NORSETH, 1986) e teratognico em peixes (BIRGE & BLACK, 1979).

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1.4 Cloreto de cobre O cloreto de cobre um composto qumico inorgnico de forma molecular CuCl2. Existe em diferentes formas dependendo da sua hidratao. Como anidro ele conhecido por eriocalcita. O nome tem origem do grego, erion que significa l e kalcos cobre, uma aluso a forma de agregao do material coletado na rea do vulco Vesvio, Itlia. Na forma dihidratada (CuCl2. 2H2O), a qual foi usada neste trabalho, ele classificado como sal inorgnico de aparncia slida em grnulos, cristais, microcristais ou p. A cor varia do azul ao verde, quando em presena de umidade e ocorrem variaes at a colorao marrom escuro quando exposto luz e inodoro. Segundo dados da ficha de informaes de segurana do produto qumico, tem como propriedades fsicoqumicas peso molecular de 170,48, o pH em soluo aquosa a 25% estimado em 3,6, o pontos de fuso 110 C e de ebulio 150 C, tem densidade relativa de 2,51. solvel em gua e em metanol e no inflamvel. Pode ser encontrado na natureza, porm raro. A sua formao depende de condies do ambiente e geoqumicas muito particulares como alta evaporao, pequena umidade relativa do ar e continuo suplemento de Cl e Cu dos lenis freticos (BEA, et al., 2010). Sendo assim no um mineral muito explorado na indstria, devido s poucas jazidas existentes. Os principais lugares de ocorrncia so como incrustaes em torno de fumarolas no Vesvio, Itlia, na Rssia a partir da fissura do vulco Kamchatka e como produto de intemperismo em clima rido num depsito de sulfato de cobre em Quetena, Chile. Neste ltimo lugar ele ocorre como implantaes na superfcie de rochas em forma de liquens (PALACHE & FOSHAG, 1938). Outras localidades tambm so importantes como, na mina de explorao de cobre Mt. Gunson, Stuart Shelf e Moonta no sul da Austrlia e Hawthorne no estado de Nevada, Estados Unidos. Ele apresenta associaes com outros minerais dependendo da localidade. No Vesvio, por exemplo, encontra-se com melanotalita, calcocianita, euclorina e dolerofanita (ANTHONY et al., 2005). Este sal muito usado como desinfetante, na preservao de madeiras, desodorante e dessulfurizante em destilados de petrleo, em fotografia, na purificao de gua, como aditivo alimentar e tambm biocida (PEDROZO & LIMA, 2001).

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Os fungicidas cpricos esto entre os primeiros biocidas utilizados no mundo e ainda hoje so amplamente aproveitados na agricultura (MENKISSOGLU & LINDOW,1991). O oxicloreto de cobre em particular, muito usado em pulverizaes e encontrado no mercado com diversas formulaes como, por exemplo, o conhecido fungicida- bactericida Agrinose, o Reconil, o Fungitol Verde, Iperion WG, entre outros. Existem inmeros relatos de fitotoxicidade causada pela sua administrao. PEREIRA et al. (2008) estudou o desempenho do composto em questo e constatou que, mesmo ele sendo o mais indicado para o tratamento de doenas de natureza fngica em ma, maracuj, caqui e goiaba ele causa fitoxicidade e no tem resultados relevantes no controle do C. gloeosporioides, fungo por ele estudado. Extrema fitotoxicidade foi constatada no estudo com cultivo de milho e controle da doena foliar, mancha branca do milho, causada pela bactria Pantoea ananatis (PINTO & FERNENDES, 1993). Alm de que, h vrias descries na literatura sobre a pouca eficcia desse tipo de tratamento, principalmente pela ocorrncia frequente de estirpes patgenas a vegetais resistentes aos compostos cpricos (PERNEZNY, 2007). Em REIS & TEODORO (2000), constatou-se que os resduos de oxicloreto de cobre em cafeeiros tm efeito positivo sobre a reproduo do caro Oligonychus ilicis, ocorrendo um aumento na postura de ovos com o aumento da dosagem, concluindo-se que esse efeito uma das causas de surtos do caro em cafezais. O mecanismo de ao tem por fator crtico o alto potencial de oxidao cataltica e de reduo que permite aos ons de cobre alterem as formas das protenas fazendo com que elas j no possam realizar suas funes normais (INTERNATIONAL COPPER ASSOCIATION, 2010). Assim, ele tambm influncia a atividade da peroxidase e da catalase, a qual reduzida sob alto teor de cobre, fato que resulta no acmulo de perxidos (ZAMBOLIN & VENTURA, 1996 apud TOMAZELA et al. 2006). O cloreto de cobre tambm interfere na importao de protenas para o cloroplasto, ele oxida reversivelmente grupos tiol e inibe quase completamente a ligao da protena e o subsequente transporte para o interior da organela (SEEDORF & SOLL, 1995). Como purificador de gua, os sais de cobre so usados no controle de florao de algas. Eles eram usados no Brasil em concentraes que variavam de estao para estao e no raramente ultrapassavam as quantidades estipuladas por lei, sendo ele um responsvel em potencial pela morte e consequente, liberao

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de toxinas pelas cianobactrias (SCHUBERT et al., 2003). Tal prtica acabou sendo proibida por lei e atualmente, a portaria n 518, de 25 de maro de 2004, emitida pelo Ministrio da Sade estipula a norma de Controle e Vigilncia da Qualidade da gua para Consumo Humano e seu padro de Potabilidade. No segundo pargrafo consta: vedado o uso de algicidas para o controle do crescimento de cianobactrias ou qualquer interveno no manancial que provoque a lise das clulas desses microrganismos, quando a densidade das cianobactrias exceder 20.000 clulas/ml (ou 2mm3/L de biovolume), sob pena de comprometimento da avaliao de riscos sade associados as cianotoxinas. Em algas, o cobre inibe a fotossntese, fixao biolgica de nitrognio, e absoro de fsforo (EISLER, 1998). Outro uso do CuCl2 devido suas propriedades biocidas como poderoso desinfetante. As solues de cloreto de cobre tm eficcias antimicrobianas similares aos desinfetantes e aos produtos qumicos esterilizantes que se utilizam na indstria dos equipamentos mdicos. Para os consumidores, o cobre um ingrediente ativo em enxgues bucais, creme dental e medicamentos

(INTERNATIONAL COPPER ASSOCIATION, 2010) Como aditivo alimentar ele usado em doses bastante altas nas dietas de frango de corte (MORAIS et al., 2001), mas principalmente em leites recm desmamados (LIMA & MIYADA, 2003). As concentraes na dieta podem conter at 250 mg/kg de cobre (USEPA 1980). A ao antimicrobiana e modificadora da flora do trato gastrintestinal amplamente discutida (ZHOU et al., 1994; APGAR et al., 1995) e sugeriram que o Cu pode ter uma ao metablica ou sistmica na promoo do crescimento de leites recm desmamados. O uso do cobre como promotor do crescimento pode se justificar em funo do baixo custo em relao aos demais agentes antimicrobianos. Porm, vrios pases, sofrem restries quanto ao uso de nveis subteraputicos de aditivos antimicrobianos em dietas de sunos, devido possibilidade do desenvolvimento de resistncia bacteriana aos antibiticos e quimioterpicos (LIMA & MIYADA, 2003).

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1.5 Bioindicador: Rhamdia quelen

Figura 3: Exemplar de Rhamdia quelen

O Rhamdia quelen (QUOY & GAIMARD, 1824) ilustrado na Figura 3, conhecido, popularmente, como jundi pertence Classe Osteichthyes, Srie Teleostei, Ordem Siluriformes e Famlia Pimelodidae. SILFVERGRIP (1996) revisou a sistemtica do gnero Rhamdia, pois era confusa desde que foi primeiramente descrita, sendo este gnero formado por apenas 11 espcies e no pelas 100, anteriormente consideradas. Ele tem distribuio neotropical, do sudeste do Mxico ao norte, at o centro da Argentina ao sul, ocorrendo em todo o Brasil (SILFVERGRIP, 1996). Morfologicamente, o jundi possui boca sem dentes, maxila superior pouco mais longa que inferior e corpo sem escamas, possui barbilhes de forma cilndrica com comprimento variado. A cor varia do marrom escuro, dourado at uma colorao preta, apresenta algumas manchas mais escuras espalhadas pelo corpo e ventralmente tem colorao clara. Podem atingir 50 cm de comprimento e 3 kg de peso. Vive em lagos e poos fundos dos rios, preferindo os ambientes de guas mais calmas com fundo de areia e lama, junto s margens e vegetao. Escondem-se entre pedras e troncos apodrecidos. So esteno-hialinos e euritrmicos (GOMES et al., 2000). Possuem maior atividade alimentar no perodo noturno (PIAIA et al., 1999). Onvoros, com uma clara preferncia por peixes, crustceos, insetos, restos vegetais, e detritos orgnicos, os organismos encontrados no contedo gastrintestinal de R. quelen no so restritos ao habitat bentnico indicando que essa espcie generalista com relao alimentao (GUEDES, 1980). A maturidade sexual atingida por volta de um ano de idade nos

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dois sexos e possui dois picos reprodutivos por ano (no vero e na primavera); a espcie no possui cuidado parental (GOMES et al., 2000). As caractersticas particulares desse peixe de resistncia ao manejo pela facilidade de reproduo e larvicultura, crescimento acelerado, inclusive nos meses mais frios, boa eficincia alimentar levaram ao aumento de sua criao (CARNEIRO et al., 2002). Alm de apresentar grande aceitao pelo mercado consumidor devido carne saborosa e ausncia de espinhos intramusculares (CARNEIRO & MIKOS, 2005). O uso de peixes como organismos sentinelas muito importante tanto pela posio desses organismos na cadeia trfica e o alto valor comercial agregado quanto, pela logstica (custo, manuteno, acondicionamento, transporte e espao). 1.6 Biomarcadores Avaliar a toxicidade e o impacto de potenciais poluentes ao meio ambiente com estudos macroecolgicos de populaes e comunidades complexo, sendo que os efeitos observveis tendem a se manifestar aps longos perodos de exposio. Alm disso, as situaes identificadas so distrbios ecolgicos muito graves e praticamente irreversveis como perda de biodiversidade, destruio do hbitat e declnio populacional (MOORE et al., 2004). Assim o uso de biomarcadores como mostra a Figura 4 o meio mais efetivo para predizer efeitos adversos de poluentes em geral. Biomarcadores so definidos pela Academia Nacional de Cincias (National Academy of Sciences) dos Estados Unidos como variaes em compostos celulares ou bioqumicos ou processo, estruturas ou funes induzidos por um xenobitico que so mensurveis num sistema biolgico. Muitas definies para esse termo foram propostas e so muitas tambm as discusses sobre a melhor definio. O uso de biomarcadores d informaes sobre os efeitos biolgicos dos poluentes em vez de apenas quantificar seus nveis no meio ambiente (VAN DER OOST et al., 2003). Existem duas categorias para classificao de biomarcadores, os de efeito e os de exposio. Biomarcadores de exposio indicam apenas se ocorreu ou est ocorrendo exposio nociva poluentes sobre o indivduo analisado, sem permitir qualquer inferncia a respeito do grau de efeitos adversos causados. As

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metalotionenas podem ser citadas como exemplo. No entanto, biomarcadores de efeito demonstram a ocorrncia de toxicidade no organismo em questo. Geralmente, as alteraes bioqumicas podem ser consideradas marcadores tanto de exposio como de efeito (GUILOSKI, 2009).

Figura 4: Resposta dos organismos poluio ambiental. Agentes biolgicos mais simples possuem rpida resposta perturbao (biomarcadores), com capacidade de previsibilidade, fundamental para estudos ecotoxicolgicos. Adaptado de Trevisan (2005)

Neste estudo analisaremos as atividades de enzimas relacionadas biotransformao, ao estresse oxidativo e danos de membrana no tecido heptico e neurotoxicidade no tecido muscular e cerebral. Tambm sero considerados anlises morfolgicas e danos histopatologicos do tecido heptico devido sua grande importncia na biotransformao de txicos e excreo de alguns metais pesados. 1.6.1 Biomarcadores de Biotransformao A biotransformao uma etapa importante na desintoxicao e eliminao de substncias nocivas. Este processo normalmente d origem a metablitos finais mais hidrossolveis. O fgado o rgo principal onde ocorre a biotransformao de xenobiticos na maioria dos animais, mas as enzimas existem em quase todos os rgos, como nos tecidos situados nas principais vias de entrada, como trato gastrointestinal, pele, pulmo e mucosa nasal (ROCHA, 2004).

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Alteraes nos nveis de atividade das enzimas de biotransformao so consideradas muito sensveis e por isso, empregadas como biomarcadores de biotransformao (PAMPLONA, 2009). As fases da biotransformao so separadas em I e II. Na fase I podem ocorrer oxidao, reduo e hidrlise. A primeira fase fornece os grupos funcionais que possibilitam as reaes da prxima fase. As reaes de fase II podem ser precedidas ou no pelas de fase I, e incluem glicuronidao, sulfatao, acetilao, metilao, conjugao com glutationa, aminocidos e cidos graxos (PARKINSON, 2001; ROCHA, 2004). 1.6.1.1 Glutationa S-transferase (GST) A glutationa S-transferase (GST) representa uma importante famlia de isoenzimas pertencentes fase II. So multifuncionais, dimricas e esto presentes no citosol de clulas e tem papel como catalisadoras da conjugao do tripeptdeo glutationa reduzida (GSH) com vrios compostos eletroflicos oriundos da fase I (CLEMENTE, 2009). Alm da importncia no transporte intracelular e biossntese de leucotrienos e prostaglandinas, a funo importante das GSTs a defesa do DNA e lipdios contra o dano oxidativo (VAN DER OOST et al., 2003) ligando-se covalentemente a compostos eletroflicos, as GSTs reduzem a probabilidade desses compostos se ligarem a outras molculas celulares, como o DNA (HUGGETT et al.,1992). Assim, a toxicidade de muitos compostos exgenos pode ser modulada pela induo da atividade da GST (VAN DER OOST et al., 2003). Algumas isoformas de GST podem tambm combater o dano por estresse oxidativo pela atividade peroxidase dependente de GSH, enquanto outras isoformas conjugam aldedos - insaturados reativos produzidos durante peroxidao da membrana lipdica (LIEBLER & REED, 1997; TRUTE et al., 2007). 1.6.2 Biomarcadores de Estresse Oxidativo O oxignio fundamental para os organismos aerbios, porque utilizado na produo de energia atravs da cadeia transportadora de eltrons na mitocndria dos eucariotos, ou na membrana celular de muitas bactrias, alm da essencialidade em vrias vias metablicas. Porm, seu consumo gera substncias

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txicas intra e extracelulares. Pode-se ento afirmar que existe certo paradoxo nessa questo do oxignio, pelo balano existente entre suas vantagens e desvantagens e a inerncia dessa molcula a vida aerbica (TREVISAN, 2008). Assim, a maioria do oxignio molecular consumido pelos animais reduzida gua, acoplada oxidao de alimento e produo de energia como, por exemplo, durante o transporte de eltrons, reaes enzimticas, reaes de autooxidao, ou ainda, pelo grupo heme de protenas. A reduo parcial resulta na formao de espcies reativas de oxignio (EROs) ou oxiradicais e compreendem espcies radicais ou no radicais, como exemplo, o perxido de hidrognio. Os radicais livres so definidos como molculas que possuem um ou mais eltrons desemparelhados. As formas de EROs incluem radical nion superxido (O-2), radical hidroxil (OH-), radical peroxil (RO2), radical alcoxil (RO) e radical hidroperoxil (HO2), perxido de hidrognio (H2O2), peroxinitrito (ONOO-, espcie reativa de nitrognio) (NORDBERG & ARNR, 2001; LIVINGSTONE, 2001; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). As EROs so continuamente produzidas, e podem reagir com grande gama das biomolculas e danificar lipdios, protenas e cidos nuclicos (CLEMENTE, 2009). Entretanto, papis fisiolgicos benficos das EROs foram j descritos, como na sinalizao intracelular e regulao do estado redox (NORDBERG; ARNR, 2001) controle da ventilao respiratria, apoptose, diferenciao e desenvolvimento celular, aderncia de leuccitos a clulas endoteliais ou mesmo na ativao da resposta imunolgica especfica contra patgenos no processo inflamatrio (DRGE, 2002). A taxa de produo de EROs pode elevar-se na presena de diversos xenobiticos, como contaminantes ambientais (LIVINGSTONE, 2001), tornando-os importantes em estudos de toxicologia. Vrios mecanismos de defesa celular existem para prevenir danos causados por EROs. Eles podem ser desintoxificados dos organismos por defesas antioxidantes como a vitamina C e glutationa reduzida ou enzimas antioxidantes especficas como superxido-dismutase, catalase e glutationa-peroxidase. Entretanto, quando h desequilbrio na produo dessas molculas EROs e os sistemas antioxidantes pode acontecer uma situao denominada estresse oxidativo (LIVINGSTONE, 2001). O estresse definido como uma condio em que o equilbrio dinmico do organismo, chamado de homeostase, ameaado ou perturbado como resultado das aes de estmulos intrnsecos ou

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extrnsecos, comumente definidos como estressores (WENDELAAR BONGA, 1997) Este pode ocorrer devido ao de poluentes, na alterao da regulao redox celular, pelo metabolismo do citocromo P450, ou ainda, pela presena de ons metlicos livres, gerando ciclos de reaes oxidativas (REGOLI et al., 2002). 1.6.2.1 Superxido Dismutase (SOD) A SOD uma metaloenzima que desempenham papel antioxidante central, tem grande importncia, pois observada em todos os organismos aerbicos. Age sobre o radical O-2. dismutando-o a H2O2 e protegendo em at 97% os alvos do ataque do nion superxido (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). 2O2.- + 2H+

O2 + H2O2

Existem diferentes formas de SOD que podem variar quanto a sua estrutura e localizao. Em eucariotos so encontradas duas principais isoformas, no citosol principalmente, mas tambm pode estar presente nos lisossomos, peroxissomos, ncleo e espao intermembranoso das mitocndrias na forma SODCuZn (possui cobre e zinco em seu stio ativo), enquanto que na mitocndria a forma SOD-Mn, com mangans em seu stio ativo (HERMES- LIMA, 2004; TREVISAN, 2008). Essa enzima demonstra grandes diferenas quanto atividade entre tecidos e espcies de peixes, tendo maior atividade nos marinhos, em comparao com peixes de gua doce (WILHELM FILHO, 1996). Os peixes herbvoros tambm apresentam maior atividade dessa enzima (LACKNER, 1998). Em relao presena de contaminantes, vrios trabalhos mostram que a atividade da SOD tende a ser maior em peixes expostos a poluentes, assim a atividade dessa enzima pode ser usada para mensurao de efeitos adversos resultantes da exposio. Ela induzida muito rapidamente, dentro de poucas horas, especialmente se a produo de EROs no for muito alta (VAN DER OOST et al., 2003). 1.6.2.2 Catalases (CAT) As catalases (CAT) so enzimas que tem um grupamento heme, localizadas principalmente nos peroxissomos de clulas eucariticas. Catalisam a

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eliminao de perxido de hidrognio (H2O2), liberando como produtos gua e oxignio molecular (VAN DER OOST et al, 2003). A reao predominante depende da concentrao de doadores de H e da concentrao ou taxa de produo de H2O2 no sistema. Entretanto, enquanto a reao peroxidativa relativamente lenta, a decomposio do H2O2 ocorre rapidamente (AEBI, 1984; VENTURA 2004) 2 H2O2 2H2O + O2

CATALASE

As catalases tambm atuam na desintoxicao de diferentes substratos na oxidao de doadores de H como, como fenis e alcois, via reduo acoplada de perxido de hidrognio:

H2O2 + R H2

R + 2H2O

Uma das funes antioxidantes da catalase reduzir o risco da formao do radical hidroxil a partir da H2O2 via reao de Fenton, catalizada por ons de cobre e ferro (NORDBERG & ARNR, 2001). Vrios poluentes, incluindo drogas hipolipidemicas, herbicidas,

inseticidas, lubrificantes, so conhecidos como indutores da proliferao de peroxissomos no fgado de mamferos. Entretanto, a proliferao de peroxissomos pode mostrar diferentes efeitos sobre cada enzima encontrada nessa organela, podendo suas atividades estar ou no elevadas (FASHIMI & CAJARAVILLE, 1995). 1.6.2.3 Glutationa Redutase (GR) Para entender a atividade da GR necessrio saber que durante o processo catalisado pela glutationa peroxidase (GPx), enzima responsvel tambm pela eliminao de perxidos, ocorre a oxidao da glutationa. A GPx catalisa a reduo de H2O2 em H2O, utilizando glutationa, na sua forma reduzida (GSH), como substrato:
GPx

H2O2 + 2GSH

GSSG + 2H2O

Assim, a relao da concentrao entre GSH/GSSG precisa ser elevada para a manuteno do poder redutor intracelular (KAPPUS, 1987). Nas clulas

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normais isto ocorre pela presena de enzimas acessrias como a glicose-6 fosfato desidrogenase (G6PDH) e GR, as quais fornecem os co-substratos NADPH e GSH, respectivamente, necessrios para o funcionamento do sistema de defesa celular contra o estresse oxidativo (VENTURA, 2004).
GR

GSSH + NADPH

GSH + NADP+ NADP+

NADPH

G6PDH

Para evitar a depleo da GSH e aumento da GSSG, a glutationa redutase reduz a GSSG custa de NADPH, regenerando a GSH e mantendo desta forma o estado redox intracelular. A enzima G6PDH no deixa de estar envolvida com as defesas antioxidantes, pois fornece os equivalentes redutores NADPH para regenerao de GSSG (TREVISAN, 2008). Aumentos nos nveis de atividade dessa enzima indicam aumento da formao de radicais. Sendo a GR um biomarcador sensvel a variao na homeostase do indivduo. 1.6.2.4 Lipoperoxidao (LPO) O processo de lipoperoxidao (LPO), ou oxidao de lipdios tem grande potencial como biomarcador de estresse oxidativo. Porque a oxidao de cidos graxos polinsaturados uma importante consequncia do estresse oxidativo. Ele ocorre por uma cadeia de reaes envolvendo trs etapas distintas: iniciao, propagao e terminao. Iniciada pela abstrao de um tomo de hidrognio de um grupo metil (- CH2) de um cido graxo polinsaturado atravs do ataque de uma molcula reativa, como ERO, metais, ou outros radicais livres, formando um radical de carbono. Oxiradicais, particularmente OH, podem realizar essa abstrao (VAN DER OOST, 2003).

Incio da peroxidao lipdica: LH + R- ou HO- L- + RH ou HOH (1) LH = lipdeo polinsaturado

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Propagao da lipoperoxidao: L- + O2 LOO- (radical lipidico peroxil) (2) LH + LOO- L- + LOOH (hidroperxido lipdico) (3)

O trmino da peroxidao lipdica o resultado da interao de radicais lipdicos e/ou formao de espcies no radicais por radicais lipdicos peroxil. Entre os produtos finais formados durante o processo de lipoperoxidao, destacam-se gases de hidrocarbonetos e os aldedos, como o malondialdedo (MDA) e o 4hidroxinonenal (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O LOOH resultante pode facilmente se decompor em espcies reativas, sendo muitos desses agentes txicos e mutagnicos. As membranas lipdicas peroxidadas tornam-se rgidas e perdem sua permeabilidade e integridade (SEVANIAN & MCLEOD, 1997; VALAVANIDIS et al., 2006). 1.6.3 Biomarcador de Neurotoxicidade Acetilcolinesterase (AChE) As enzimas usadas como biomarcadores de neurotoxicidade so as colinesterases. Dois tipos so identificados nos vertebrados, a acetilcolinesterase (AChE), e a butirilcolinesterase (BChE), conhecida como esterase no especfica ou pseudocolinesterase. O crebro de peixes tem AChE, mas no BChE, mas em msculos encontram-se ambas, AChE e BChE (VAN DER OOST et al., 2003) porm, assume-se que a AChE seja a mais representativa nesses tecidos. A AChE essencial para a neurotransmisso colinrgica. Essa enzima a responsvel pela degradao da acetilcolina, um neurotransmissor, o produto gerado colina e cido actico com liberao de um prton. Assim, enquanto diminui a quantidade de neurotransmissor, diminui tambm o potencial ps-sinptico (SHIMIDT-NIELSEN, 1996), esse mecanismo previne a passagem contnua de impulsos nervosos, vital para o normal funcionamento do sistema nervoso. No ocorrendo degradao de acetilcolina, j foram observados efeitos comportamentais como hiperatividade, asfixia e morte (ROEX, et al., 2003). A hidrlise ocorre logo aps a ligao acetilcolina-receptor, sendo o receptor nicotnico da membrana ps-sinptica seu alvo. Isso desencadeia a abertura de

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canais de ons Na+, e a posterior despolarizao da membrana, o que causa um potencial de ao, e permite a propagao do impulso. Se ocorrer a inibio da enzima que degrada a acetilcolinesterase acontece o bloqueio na transmisso de impulsos nervosos, isso porque ocorre a sobreposio dos impulsos causados pela permanncia dos canais de Na+ abertos. Resultando na paralisao dessa funo vital inerente dos organismos (STENESH, 1998). Essa importante informao sobre a inibio das colinesterases foi proposta como biomarcador especfico para organofosforados e carbamatos durante a dcada de 50 (WEISS, 1958), pois eles so inibidores especficos do stio de ligao da AChE. Porm, nas ltimas dcadas tem sido relatada a inibio das colinesterases em vrias espcies por outros contaminantes ambientais que no os supracitados (GUILHERMINO et al., 2000; MONTSERRAT et al., 2007). Os metais foram provavelmente primeira classe de poluentes ambientais includa como agentes anticolinestersicos. 1.6.4 Histopatologia Alteraes histopatolgicas resultam de mudanas bioqumicas e fisiolgicas no organismo. Essas mudanas podem levar a formao de leses nas clulas, nos tecidos ou rgos, assim, elas representam uma integrao dos efeitos cumulativos dos estressores (HINTON et al., 1992; MYERS & FOURNIE, 2002). A histopatologia considerada uma ferramenta til e interessante que pode indicar e quantificar os efeitos resultantes da exposio a estressores nos indivduos, representando um nvel intermedirio de organizao biolgica. Como o fgado o principal rgo e a maior glndula de metabolismo de xenobiticos nos vertebrados, e tem a capacidade de acumular diversas substncias ele um rgo de grande relevncia como biomarcador e, consequentemente no estudo da toxicologia. Alm de atuar na biotransformao de xenobiticos, responsvel pela excreo de alguns metais pesados, tem como funes tambm a estocagem de glicognio e, especialmente em ciclostomados e peixes, acumula lipdeos. Produz a maioria do vitelo transferido aos vulos e pode ter funo hematopoitica, libera substncias envolvidas na coagulao sangunea, processa ou estoca vitaminas, est envolvido com o metabolismo de hormnios esterides e

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produz a bile (HEATH, 1995; POUGH et al., 1999; MELA, 2004). As principais clulas do fgado, os hepatcitos, so clulas polidricas com um ou dois ncleos grandes, esfricos e centralmente localizados, com nuclolo evidente. Ele um rgo altamente recomendvel como indicador para contaminao com metais pesados. EVANS et al. (1993) e AL-YOUSOUF et al. (2000) descreveram que este rgo tem papel importante na estocagem, redistribuio, desintoxicao e transformao de metais traos como o cobre, zinco e mangans, alm de ser um stio importante de alteraes patolgicas causadas por esses contaminantes.

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2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Analisar o efeito txico do cloreto de cobre sobre peixes da espcie Rhamdia quelen com o uso de biomarcadores histopatolgicos e bioqumicos.

2.2 Objetivos especficos Avaliar o uso de biomarcadores bioqumicos para deteco de efeitos txicos nos peixes expostos ao contaminante.

Avaliar, atravs de anlises histopatolgicas, o efeito do cloreto de cobre no fgado do jundi, utilizando microscopia de luz.

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3. MATERIAL E MTODOS 3.1 Desenho experimental Os peixes da espcie Rhamdia quelen foram adquiridos da Epagri psicicultura em Santa Catarina e transportados para o Laboratrio de Toxicologia Ambiental do Departamento de Farmacologia da UFPR. Os exemplares foram acondicionados em aqurios contendo gua filtrada e desclorada mantida a aerao e temperatura constante de 27 C. Um sistema de timer manteve um fotoperodo de 12 horas claro e 12 horas escuro. Aps um perodo de 30 dias de aclimatao, os peixes foram distribudos em grupos controle e teste, sendo expostos s concentraes de 2 g/L (concentrao referncia do CONAMA), 10 g/L e 20 g/L. O bioensaio foi esttico com durao de 96 horas. Aps o perodo de exposio os peixes foram anestesiados com benzocana diluda em gua a 2% e eutanaziados por seco medular. O fgado foi retirado para histopatologia e anlise bioqumica dos biomarcadores GST, CAT, SOD, GR e LPO e o msculo e o crebro para anlise da AChE As amostras para anlises bioqumicas foram acondicionadas em gelo durante a coleta e posteriormente, armazenadas em freezer -80 C. Para histopatologia, um fragmento de fgado de cada exemplar foi coletado e fixado em Alfac, soluo de cido actico glacial, formaldedo 40% e etanol 80%, por 16 horas. 3.2 Biomarcadores bioqumicos Uma amostra de crebro e msculo axial de cada peixe foi obtida, pesada e homogeneizada em tampo fosfato 0,1M, pH 7,5 na proporo de 1:10, utilizando um microhomogeneizador. Os homogeneizados foram centrifugados por 20 min a 4 C a 10000 x g. Alquotas dos sobrenadantes (fra o S9) foram armazenadas a 20 C para posterior anlise da atividade de AChE e concentrao protica. As amostras de fgado (pools de dois fgados) foram descongeladas em gelo modo e pesadas. Uma parte homogeneizada na proporo 1:10 em tampo fosfato 0,1 M pH 7,2 com auxlio de microhomogeneizador. O homogeneizado foi centrifugado por 30 minutos a 12.000 x g a 4 C, obt endo-se assim o sobrenadante,

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do qual foram retiradas duas alquotas para medir a atividade da GST, CAT, SOD, GR e LPO. A outra parte foi homogeneizada na proporo 1:10 em metanol 30% e centrifugada por 30 minutos a 12.000 x g a 4 C obte ndo-se o sobrenadante para medir a lipoperoxidao. 3.2.1 Atividade da GST A anlise da atividade da GST foi baseada no mtodo de Keen et al. (1976). As GSTs catalisam a reao de conjugao do substrato CDNB (1-cloro- 2,4dinitrobenzeno) com a glutationa reduzida (GSH), formando um tioter que pode ser medido pelo aumento de absorbncia atravs da leitura em microplacas. As amostras foram diludas (1:10 v/v) em tampo fosfato 0,1M, pH 6,5 e pipetadas em quatro rplicas de 20 l na microplaca de leitura em

espectrofotmetro, seguido de 180 l de soluo reao. A soluo reao foi composta por CDNB a 3mM e GSH 3mM, em soluo tampo fosfato 0,1M, pH 6,5. A leitura foi realizada em espectrofotmetro TECAN SUNSHINE com comprimento de onda de 340nm, durante 3 min e a atividade enzimtica foi expressa em mol de CDNB conjugado/min/mg protena. 3.2.2 Atividade da CAT A anlise da atividade da catalase foi baseada no mtodo descrito por Aebi (1984) que consiste em mensurar a atividade da catalase atravs do consumo de perxido de hidrognio exgeno, gerando oxignio e gua, atravs de espectrofotometria. As amostras foram diludas (1:5 v/v) em tampo fosfato 0,1M, pH 7,2 e pipetadas em 3 rplicas de 10 l em cubetas de quartzo seguido de 990 l de soluo reao. A soluo reao foi composta por perxido de hidrognio 20 mM, em soluo tampo (TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8).A leitura foi realizada em espectrofotmetro com comprimento de onda de 240nm, por 1 min e 30 seg e a atividade enzimtica foi expressa em mol H2O2 consumido/min/mg protena.

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3.2.3 Atividade de SOD A anlise da atividade da SOD foi realizada pelo mtodo proposto por CROUCH et al. (1981), que se baseia na capacidade da SOD em inibir a reduo do NBT para azul pelo O2- gerado pela hidroxilamina em soluo alcalina, sendo que a reduo do NBT medida espectrofotometricamente a 560 nm. s amostras foi adicionado etanol de modo que ficassem com 25% desse, foram centrifugadas durante vinte minutos a 12 000 x g. Na microplaca foi pipetado o branco com 20 l de etanol e 20 l das amostras do sobrenadante centrifugado. Aps foi pipetado 70 l da mistura de NBT A 285 mM e EDTA 0,05 mM, por ltimo adicionou-se 110 l de tampo carbonato de sdio (182 mM, pH 10,2) e hidroxilamina 67 mM para iniciar a reao. A leitura foi feita a 560 nm em espectofotmetro TECAN SUNSHINE durante uma hora em intervalos de cinco minutos. A atividade enzimtica foi expressa em ml/min/mg protena. 3.2.4 Atividade da GR A anlise da atividade da GR foi realizada pelo mtodo de Sies et al. (1979), em que a enzima GR catalisa a reduo da glutationa oxidada (GSSG) atravs da oxidao do NADPH, cujo decrscimo de absorbncia 340 nm medido espectrofotometricamente. Em microplaca foi pipetada 50 l da amostra e em seguida 100 l do meio de reao que consiste em tampo fosfato de potssio 0,1 M, EDTA 5,0 mM, pH 7,6 adicionado a GSSH a 5,0 mM e NADPH a 0,5 mM. A leitura foi feita a cada vinte segundos por dois minutos a 340 nm em espectofotmetro TECAN SUNSHINE. A atividade enzimtica foi expressa em nmol/min/mg protena. 3.2.5 LPO A produo de hidroperxidos lipdicos foi verificada pelo mtodo de FOX (Ferrous Oxidation / Xylenol Orange Method). Esse mtodo tem por princpio a rpida oxidao do Fe+2 mediada por perxidos sob condies cidas e posterior formao do complexo Fe+3 laranja de xilenol (fonte de absoro de luz) na presena do estabilizador hidroxitolueno butilado (JIANG et al., 1992).

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O sobrenadante foi diludo na proporo 1:5 em metanol 30%, centrifugado por 10 minutos a 10.000 x g a 4 C obtendo-se a amos tra. As amostras foram pipetadas (30 l), em microplaca e em seguida foi adicionado 270 l de soluo reao [(laranja de xilenol a 100 M, H2SO4 a 25 mM, BHT (hidroxitolueno butilado) a 4 mM, FeSO4.NH4 (sulfato ferroso amoniacal) a 250 M (acrescentados na seqncia descrita a metanol 90%)], e incubadas por 30 min antes da leitura. Foram feitas trs rplicas. A leitura foi feita em espectrofotmetro de microplaca TECAN SUNSHINE ( = 570 nm). Os resultados foram expressos em concentrao de hidroperxidos (nmol.min-1.mgproteina-1). 3.2.6 Atividade da AChE As amostras de crebro e msculo, foram descongeladas em gelo e diludas na proporo 1:10 (ou 10% V/V) em tampo fosfato 0,1M, pH 7,5. Aps a diluio cada amostra foi pipetada (50 l) na microplaca em quatro rplicas, seguido de 200 l de 5,5-Ditio-bis-2nitro-benzoato (DTNB) preparado a 0,75 mM e 50l de iodeto de acetiltiocolina (ATC) 12mM em gua destilada. O principio o desenvolvimento da reao colorida que ocorre entre a colina formada pela quebra da acetilcolina e o DTNB. A leitura foi realizada em espectrofotmetro de microplaca TECAN SUNSHINE com comprimento de onda de 405 nm, seguindo mtodo de Ellman et al.(1961) modificado para microplaca por Silva de Assis (1998). A atividade enzimtica foi expressa em nmol/min/mg protena. 3.2.7 Anlise da concentrao de protena Para anlise da concentrao de protena dos tecidos (crebro, msculo e fgado) foi utilizado o mtodo de Bradford (1976) utilizando soro albumina bovina como padro. As amostras foram diludas na proporo 1:20 em tampo fosfato de potssio 0,1M e a leitura foi realizada em espectrofotmetro com comprimento de onda de 620 nm.

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3.3 Biomarcador Histopatolgico 3.3.1 Microscopia de luz - Anlise histopatolgica de fgado Aps a remoo do fgado, ele foi imerso em fixador Alfac durante um perodo de 16 horas. Aps esta fase, as peas passaram pelo processo da desidratao em srie alcolica crescente, diafanizao em xilol, impregnao e incluso em Paraplast Plus (Sigma) (56 C). Os blocos obtidos foram trimados p ara a obteno dos cortes histolgicos com espessura de cinco micrmetros, que foram distendidos sobre lmina histolgica e corados com Hematoxilina e Eosina (H.E.) segundo protocolo anexo. As mesmas foram analisadas e fotografadas digitalmente no fotomicroscpio Leica DME. 3.3.2 Avaliao histopatolgica As alteraes histopatolgicas observadas no fgado de todos os exemplares utilizados neste trabalho foram avaliadas de acordo com o mtodo descrito por BERNET et al. (1999). Estas foram consideradas de acordo com os seus respectivos fatores de importncia (Tabela 1), onde: (1) importncia patolgica mnima, a leso facilmente reversvel; (2) importncia moderada, reversvel em muitos casos e (3) importncia marcante, geralmente irreversvel, levando a diminuio das funes do rgo. De acordo com o grau de ocorrncia, foram atribudos valores para as alteraes observadas em cada tratamento, sendo: (0) Inalterado, (2) Ocorrncia Ocasional, (4) Ocorrncia Moderada e (6) Ocorrncia severa (leso difusa). O ndice de leso (IL) foi calculado de acordo com a seguinte equao: IL= pr alt (a x w) Onde: pr = padro de reao, alt = alterao, a = valor atribudo alterao e w = fator de importncia.

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Tabela 1: Alteraes histopatolgicas analisadas em fgado de Rhamdia quelen com seus respectivos fatores de importncia (modificado a partir de Bernet et al., 1999).

3.3.3 Anlise quantitativa dos centros de melanomacrfagos e melanomacrfagos livres em fgado A ocorrncia de melanomacrfagos foi avaliada de acordo com Rabitto et al. (2005), de acordo com esta metodologia centros de melanomacrfagos e melanomacrfagos livres so contados em 15 campos de cada lmina. Os centros de melanomacrfagos e melanomacrfagos livres foram contados atravs de um sistema-teste quadriculado acoplado a uma das oculares do microscpio, cuja rea era de 1mm2 onde cada quadrado media 0,01 mm2. Foram analisados 15 campos escolhidos aleatoriamente em lminas de fgado de todos os indivduos utilizados no estudo, coradas em H.E. atravs de microscopia de luz. O nmero de melanomacrfagos livres foi considerado como sendo aqueles que continham de 1 a 4 clulas pigmentadas e os centros de melanomacrfagos os que continham um nmero igual ou superior a 5 clulas pigmentadas. Os resultados da contagem dos melanomacrfagos foram apresentados por mm2. 3.4 Anlises estatsticas Para os biomarcadores bioqumicos os dados obtidos foram analisados estatisticamente atravs do Programa GraphPad Prism 3 atravs de ANOVA de uma via seguida de Prova de Bonferroni com limite de significncia em 0,05. Os resultados foram expressos em mdia erro padro da mdia. Para histopatologia utilizou-se o programa estatstico GraphPad Instat V.3.0. A normalidade dos dados foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Em seguida, foi aplicado o teste no paramtrico de Mann Whitney para fgado. O nmero de melanomacrfagos foi analisado estatisticamente pelo teste t de Student no Programa GraphPad InStat. A normalidade dos dados foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.

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4. RESULTADOS

No houve mortalidade de jundis durante o bioensaio de exposio, e os indivduos testados permaneceram aparentemente saudveis at o final do experimento. 4.1 Biomarcadores bioqumicos 4.1.1 Atividade da Glutationa S-transferase A atividade da GST (Figura 5) do grupo exposto concentrao de 10 g/L de cloreto de cobre mostrou-se significativamente induzida em comparao ao grupo controle. *

GST (mol.min .mgprotena-1)

-1

30

20

10

0 Controle 2ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 5: Atividade da GST de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da GST erro padro. * = difere significantemente do controle (p<0,05) quando testados por ANOVA de uma via seguida de Teste de Bonferroni

4.1.2 Atividade das enzimas antioxidantes e lipoperoxidao A atividade da SOD dos grupos expostos s concentraes de 10 g/L e 20 g/L de cloreto de cobre mostrou-se aumentada em comparao ao grupo controle (Figura 6). No foi observada diferena entre os grupos para a atividade da catalase (Figura 7). A enzima glutationa redutase (GR) (Figura 8) mostrou-se significativamente inibida na maior concentrao em relao ao controle. Finalmente, a lipoperoxidao (Figura 9) analisada mostrou-se maior na

concentrao de 10 g/L de cloreto de cobre em comparao ao controle.

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SOD (mL.mgprotein-1.min-1)

0.04

*
0.03

0.02

0.01

0.00 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 6: Atividade da SOD de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da SOD erro padro. * = difere significantemente do controle (p<0,05) quando testados por ANOVA de uma via seguida de Teste de Bonferroni

CAT -1 (mol.min .mgprotena-1)

500 400 300 200 100 0 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 7: Atividade da CAT de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da CAT erro padro.

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GR (nmol mgprotein-1min-1)

0 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 8: Atividade da Glutationa Redutase de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da GR erro padro. * = difere significantemente do controle (p<0,05) quando testados por ANOVA de uma via seguida de Teste de Bonferroni

1.00

Hidroperxidos (mol.mgproteina-1)

*
0.75

0.50

0.25

0.00 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 9: Lipoperoxidao expressa por concentrao de hidroperxidos em Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da concentrao de hidroperxidos erro padro. * = difere significantemente do controle (p<0,05) quando testados por ANOVA de uma via seguida de Teste de Bonferroni

4.1.3 Atividade da AChE A atividade enzimtica da acetilcolinesterase muscular (Figura 10) apresentou diferena significativa apenas na dose de 20 g/L, na qual a atividade se mostrou um pouco maior em relao ao controle. Entretanto, na atividade de acetilcolinesterase cerebral (Figura 11) no foi observada diferena significativa entre os grupos-teste e controle.

40

AChE muscular (nmol.mgprotein-1.min-1)

300

*
200

100

0 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 10: Atividade da acetilcolinesterase muscular de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da acetilcolinesterase muscular erro padro. * = difere significantemente do controle (p<0,05) quando testados por ANOVA de uma via seguida de Teste de Bonferroni

AChE cerebral (nmol.mgprotein-1.min-1)

750

500

250

0 Controle 2 ug/L 10 ug/L 20 ug/L

Figura 11: Atividade da acetilcolinesterase cerebral de Rhamdia quelen expostos ao cloreto de cobre por 96 horas. As barras expressam a mdia da atividade da acetilcolinesterase muscular erro padro.

4.2 Anlise histopatolgica De acordo com as observaes feitas na anlise histopatolgica as alteraes mais comumente observadas foram infiltraes leucocitrias,

vacuolizao dos hepatcitos e necroses alm de aumento da incidncia de centros de melanomacrfagos nas doses mais altas. Todos esses fatores contriburam para um notvel ndice de leso histopatolgica nos grupos expostos as concentraes de 10 g/L e 20 g/L (Figura 12).

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A anlise tambm evidenciou que tanto os indivduos do grupo controle (Figura 14) quanto os expostos s trs concentraes do contaminante mantiveram a estrutura padro dos hepatcitos e morfologia estrutural normal espcie analisada. O grupo exposto menor concentrao de cloreto de cobre (Figura 15) apresentou pequena incidncia de infiltraes leucocitrias e formao tanto de centros de melanomacrfagos, como presena de melanos livres, alm de certa vacuolizao em reas do tecido e pequenas necroses. J os indivduos expostos s concentraes de 10 g/L (Figura 16) e 20 g/L (Figura 17) apresentaram alm de maior incidncia de infiltraes leucocitrias e formao de centros de melanomacrfagos em relao ao grupo controle, necroses que variavam de pequenas a grandes em tamanho e localizavam-se pontualmente ou em mais de um lugar no tecido observado. A presena de melanos livres nos tecidos de todos os grupos expostos ao cloreto de cobre e o controle no foi significativa (Figura 14).

Figura 12: ndice de leso de acordo com o mtodo de avaliao de BERNET et al. (1999) em fgado de Rhamdia quelen. As barras expressam a mdia de leses erro padro da mdia. * = difere significantemente do controle (p<0,05).

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Figura 13: Anlise quantitativa dos centros de melanomacrfagos (CMM/mm ) e melanomacrfagos 2 livres (ML/mm ) em fgado de Rhamdia quelen. As barras expressam a mdia de leses erro padro da mdia. * = difere significantemente do controle (p<0,05).

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Figura 14: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen, grupo controle. Colorao hematoxilinaeosina. A) Viso panormica do tecido. Na imagem est indicado o parnquima heptico ( ), B) veias centrolobulares indicadas (*). b) detalhes das veias centrolobulares.

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Figura 15: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen, grupo 2g/L. Colorao hematoxilinaeosina. A) Vacuolizao dos hepatcitos ( ) e necrose ( ). B) Inflitrao leucocitria ( ) C) Melanos livres ( ).

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Figura 16: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen, grupo 10g/L. Colorao hematoxilinaeosina. A) Vacuolizao dos hepatcitos ( ). B) Inflitrao leucocitria ( ), C) Necrose ( ). D) Centros de melanomacrfagos ( ).

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Figura 17: Cortes histolgicos de fgado de Rhamdia quelen, grupo 20g/L. Colorao hematoxilinaeosina. A) Vacuolizao dos hepatcitos ( ). B) Necrose ( ). C) Infiltrao leucocitria ( ) D) Centros de melanomacrfagos ( ).

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5. DISCUSSO A glutationa-S-transferase enzima pertencente fase II de

biotransformao de grande importncia no processo de detoxificao celular e tambm est envolvida com o processo de estresse oxidativo. No experimento em questo a atividade da GST do grupo contaminado com a concentrao intermediria de cloreto de cobre (10 g/L) foi a nica que se mostrou significativamente maior em relao ao controle. Usualmente, aumentos na atividade da GST so relatados em diversos estudos quando da exposio a diversos poluentes ambientais como

hidrocarbonetos policclicos aromticos, polifenilas bicloradas e produtos derivados da atividade petroqumica. Porm, sobre o efeito de metais os registros so confusos e diferentes mecanismos de ao e efeitos tem sido descritos (CUNHA et al., 2007). J foram encontradas desde repostas inibitrias da GST quando peixes so expostos a compostos de cobre (DAUTREMEPUTIS et al., 2002) at a no alterao da atividade desta enzima (SANCHEZ et al., 2005). No entanto, a maioria dos trabalhos relata aumento na atividade enzimtica da GST quando exposta ao cobre. Em LOPES et al. (2001) peixes coletados de reas de minerao de cobre apresentaram aumento na atividade da enzima. GSTs de brnquias de Pomatoschistus microps tambm expostos ao cobre apresentaram igualmente induo de atividade (VIEIRA et al., 2009). Respostas de aumento da atividade de GSTs em diferentes tecidos no so novidade, haja vista que o cobre um conhecido promotor de estresse oxidativo. A toxicidade heptica resultante da exposio ao cobre hipotetizada pela reao na qual ons de cobre reagiriam com H2O2 formando ainda mais reativas espcies de oxignio (AWASTHI et al., 1996; POURAHMAD & OBRIEN, 2000; DROGE, 2002). A ligao da GST ao cobre seria uma barreira ligao desse metal a compostos celulares, evitando assim o perjrio s funes celulares normais (VIEIRA et al., 2009). Peixes da espcie Carassius auratus expostos ao sulfato de cobre apresentaram resultados de aumento da atividade da GST do tecido heptico nas concentraes de 2,50 g/L e 5 g/L e nas concentraes maiores de 50 g/L e 250 g/L a atividade enzimtica da GST no foi alterada em relao ao grupo controle

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(LIU et al., 2006). Danio rerio expostos a concentraes de 40 g/L e 140 g/L de cobre apresentaram em ambas as concentraes aumento da atividade de GST (PARIS-PALACIOS et al., 2000). Considerando esses dados possvel a inferncia de uma no responsividade das GSTs frente a uma exposio a concentraes muito elevadas de cobre, sendo os mecanismos desse bloqueio enzimtico ainda no bem elucidados. Porm uma explicao satisfatria para o aumento da atividade da GST na concentrao de 10 g/L e a no responsividade na concentrao mais alta de 20 g/L difcil e provavelmente esse resultado seja consequncia de problemas amostrais e/ou metodolgicos ou diferenas de respostas ao

contaminante que variam de espcie a espcie. A SOD respondeu ao cobre com induo de atividade nas concentraes de 10 g/L e 20 g/L, resultado esperado quando do aumento do estresse oxidativo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007), a formao de radicais superxidos induzem o aumento atividade da enzima. Alm de que, sendo o Cu+2 um cofator necessrio para a estrutura e funo cataltica da isoforma Cu-Zn SOD, que a mais representativa no citosol, peroxissomos e ncleo, concentraes subletais de cobre podem induzir a gerao e aumento cataltico da SOD (PEDRAJAS et al., 1995; LIU et al., 2005). PEDRAJAS et al. (2005) tambm observou a formao de novas isoformas da Cu-Zn SOD como conseqncia do estresse oxidativo. Mudanas na estrutura da enzima envolvem a oxidao da histidina-118, um dos ligantes do cobre (USHIDA & KAWAKISHI, 1994). Observaes onde tambm foi constatado aumento da atividade da SOD so bem descritas na literatura. Como exemplo pode-se citar PEDRAJAS et al. (1995) que injetou intraperitonialmente Cu+2 em Sparus auratus, VIEIRA et al. (2009) observou os efeitos do cobre e mercrio em peixes de esturio Pomatoschistus microps e FAROMBI et al. (2007) analisou bagres da espcie larias Gariepinus provenientes do Rio Ogun na Nigria, o qual est localizado perto das seis maiores industrias do pas e apresenta altos nveis de metais pesados como Cu, Zn, Cd nas guas. J VARANKA et al. (2001), diferentemente de alguns estudos, constataram aumento da SOD em exposies ao sulfato de cobre na espcie Cyprinus carpio em vinte e quatro horas, porm aps quarenta e oito horas ocorreu decrscimo da atividade. SANCHEZ et al. (2005) tambm em exposio ao sulfato de cobre da espcie Gasterosteus aculeatus percebeu que depois de quatro dias de experimento aps uma sbita alta na atividade da SOD, ela comeava a diminuir sua ao. LIU et

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al. (2005) observaram que a SOD se mantinha em alta atividade apenas em baixas concentraes de cobre. Esses resultados mostram alguma diferena na resposta enzimtica da SOD em relao ao tempo de durao das observaes, sendo bastante especfico dependendo da espcie em estudo. Porm, a catalase, outra enzima importante na neutralizao de espcies reativas de oxignio e prxima atuante na cadeia de enzimas antioxidantes depois da SOD, pela razo que ela age na quebra da molcula de H2O2 transformando-a em gua e oxignio, no apresentou diferenas significas em nenhum grupo exposto em relao ao controle. Aumentos de atividade do sistema SOD-CAT so usualmente observados frente a exposies a inmeros poluentes e entre esses tambm os metais (LIVINGSTONE et al., 1993; BURGEOT et al., 1996; STEPHENSEN et al., 2000; DAUTERMEPUITS et al., 2004; VENTURA, 2004; TREVISAN, 2008; VIEIRA et al., 2009). Mais especificamente sobre exposies feitas com cobre PARIS-PALACIOS et al. (2000) observaram aumento de CAT nas concentraes de 40 g/L e 140 g/L de sulfato de cobre, em SANCHEZ et al. (2005) a espcie Gasterosteus aculeatus depois da exposio durante vinte e um dias a uma concentrao de 200 g/L de Cu continuava a responder com indues da atividade enzimtica, ATLI et al. (2006) analisaram a atividade de CAT em Oreochromis niloticus usando cloreto de cobre dihidratado em concentraes de 100 g/L, 500 g/L, 1000 g/L e 1500 g/L durante 96 horas e houve aumento da atividade no tecido heptico. FIRAT & KARGIN (2010) concluram o mesmo em Cyprinus carpio expostos a 100 g/L e 1000 g/L de Cu+2 durante dez e vinte dias. O aumento da atividade da CAT em peixes pode estar relacionado ainda proliferao peroxissomal como um mecanismo de defesa contra a produo de oxiradicais gerados pela biotransformao destes compostos (MATHER-MIHAICH & DIGIULIO, 1991). Porm, vrios estudos da literatura afirmam um decrscimo na atividade de CAT quando h presena de cobre (VARANKA et al., 2001; VUTUKURU et al., 2005; FAROMBI et al., 2007; LIU et al., 2005). Isso atribudo a uma a ligao direta de ons metlicos a grupos SH- na enzima (ATLI et al., 2006), inativao causada pelo excesso na produo de radicais superxido e diminuio da taxa de reao como resultado de um excesso de produo de H2O2 (FAROMBI et al., 2007; VUTUKURU et al., 2005; ATLI et al., 2006). Foi indicado que a rpida inativao da CAT em altas concentraes de perxido de hidrognio foi devido a converso do

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composto ativo da enzima em inativo (WONG & WHITAKER, 2000). Ainda, REGOLI & PRINCIPIATO (1995) prope que a diminuio da atividade de CAT seja uma resposta transitria frente poluio aguda. Nenhuma alterao na resposta dessa enzima foi encontrada em ATLI & CANLI (2007), MENEZES (2005) e no presente trabalho. Como a estimulao da atividade da CAT pode ser associada com a eficcia do sistema de defesa antioxidante e/ou compensao da diminuio na atividade de outras enzimas antioxidantes, tais como SOD e GPx, nenhuma mudana significativa na atividade da CAT pode ser atribuda ao aumento da atividade das outras enzimas antioxidantes, como GPx e falha no sistema antioxidante do organismo (ATLI & CANLI, 2007). Ainda importante ressaltar que a atividade da catalase, como mostrada anteriormente, pode ser inibida ou aumentada sob estresse qumico, e tanto uma resposta como a outra depende de variveis inmeras como intensidade e tempo de exposio e suscetibilidade do organismo avaliado (MENEZES, 2005). J a glutationa redutase foi inibida em relao ao controle. Ela uma enzima chave no metabolismo da glutationa por reduzir a glutationa oxidada (GSSH) em glutationa reduzida (GSH), que um substrato necessrio para a GPx. Essa ultima enzima, juntamente com a catalase, catalisa tambm a quebra da molcula de perxido de hidrognio em gua. Ademais, o GSH considerado como um mecanismo de defesa contra o cobre, j que o grupo tiol da cistena rapidamente reduz o metal formando complexos estveis de GS-Cu+1 (SANCHEZ et al., 2005; GRAVATO et al., 2006). Normalmente, quando h estresse oxidativo num tecido a GR induzida como relatam vrios estudos (WINSTON & DIGIULIO, 1991; FILHO, 1996; VIEIRA et al., 2009; PEREIRA et al., 2010). O uso excessivo da GSH pelas clulas na tentativa de conter o dano causado pelas ROS estimularia a GR, e sua atividade manteria o balano GSSH/GSH dentro dos padres normais evitando a depleo da GSH. Porm respostas inibitrias so relatadas na literatura com certa freqncia. Como por exemplo, OZDEMIR & CIFTCI (2008) aps caracterizarem a GR de trutas arco-ris e constatarem que os produtos gerados por essa enzima agem como feedback negativo sobre sua atividade, pois a inibem competitivamente, tambm realizaram experimentos para determinar inibio da GR causada por ons metlicos e puderam mostrar que o cobre apresenta o segundo maior poder inibitrio da GR depois apenas dos ons de Cd+2. GRAVATO et al. (2006) estudou a

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exposio de enguias europias

Anguilla anguilla L.

ao cloreto de cobre nas

concentraes de 1 M e 2,5 e atribuiu a reduo da atividade da GR a falhas no sistema antioxidativo do animal, pois houve danos as membranas celulares, MORALES et al. (2004) tambm atribuiu falha do sistema antioxodante, frente a inibio da enzima. Ainda importante ressaltar que a GR catalisa uma reao dependente de NADPH e esse ltimo composto gerado por vrias reaes do metabolismo intermedirio que tambm podem ter podem ter sido prejudicadas pelos efeitos do cobre no metabolismo, ento a falta de NADPH seria um limitante na atividade enzimtica. A lipoperoxidao foi maior na dose intermediria de 10 g/L de cloreto de cobre em comparao ao controle. Quando as defesas antioxidantes do indivduo no conseguem deter a produo de ROS, isso acaba sendo um preldio para danos ao DNA, oxidao de protenas e peroxidao lipdica. Assim, a LPO um biomarcador de efeito muito utilizado, pois o estresse oxidativo pode causar a peroxidao dos cidos graxos polinsaturados existentes nos fosfolipdios das membranas celulares com formao de novos radicais livres. Vrios trabalhos relatam a falha do sistema antioxidante e consequente lipoperoxidao de membranas lipdicas quando h exposio ao cobre (VARO et al., 2007; BOUSKILL et al., 2006; HOYLE et al., 2007; VIEIRA et al., 2010). No presente estudo o maior nvel de LPO na concentrao de 10 g/L concorda com a maior atividade de GST nessa mesma concentrao, porm a maior atividade dessa enzima no foi o bastante para deter a lipoperoxidao. Finalizando, a avaliao da atividade da acetilcolinesterase no se mostrou alterada no tecido cerebral e foi pouco aumentada no muscular. Na literatura h uma grande variao da resposta da AChE aos metais. Normalmente, so relatados quadros de inibio da enzima em questo, comparando a capacidade de inibio dos metais pesados, incluindo o cobre, com organofosforados e carbamatos que so compostos conhecidamente inibidores de AChE (SURESH et al.,1992; BOCQUEN et al., 1995; GARCIA et al., 2000; FRASCO et al., 2005,ROMO et al., 2006; CUNHA et al., 2007). Provavelmente a concentrao testada no presente estudo no seja to alta para provocar alteraes considerveis na atividade cataltica da AChE. Estudos tambm j relataram que no houve alterao na atividade da enzima quando peixes foram expostos ao cobre ou compostos de cobre (VARO et al., 2007). Ainda, alguns casos de aumento da

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atividade da acetilcolinesterase tambm foram relatados em DETHLOFF et al. (1999) e ROMANI et al. (2003). ROMANI et al. (2003), constataram a existncia de duas isoformas enzimticas da acetilcolinesterase a globular (G) e a assimtrica (A) que parecem ter importncia quando da exposio subletal ao cobre. A forma globular, mais representativa nos tecidos cerebral e muscular, aparentemente afetada pelo cobre enquanto a isoforma A permanece inalterada em sua atividade. Estudos cinticos in vitro e in vivo demonstraram que o cobre melhora a atividade cataltica da enzima em questo nos tecidos cerebrais e musculares de S. auratus, e isso acontece aparentemente pelo aumento da afinidade enzima-substrato. Entretanto, como a maior parte da literatura relata que os ons metlicos de mercrio, cdmio, cobre e zinco inibem a atividade da acetilcolinesterase, mesmo que ainda no sejam to clara essas vias (VARO et al., 2007), os resultados encontrados na literatura sobre os efeitos dos metais sobre a AChE podem ser atribudos a diferenas de resposta entre as espcies, condies de estudo diversas, tempo de durao da exposio e tecido exposto ao xenobitico e ainda a problemas metodolgicos (DETHLOFF et al., 1999; VARO et al., 2007). Essa ltima varivel relacionada com a interferncia de ons metlicos com os grupos tiol da tiocolina, um produto da hidrlise do substrato acetilcolina, e com certas solues como o tampo fosfato (FRASCO et al., 2005). Os resultados da histologia mostraram que o cobre causou danos ao tecido heptico, sendo que medida que as doses aumentavam os danos tornavamse mais severos. Evidncias mostram que o fgado primeiro tecido a acumular cobre e como consequncia desse acmulo pode apresentar danos histopatolgicos causados pelo metal (TTH et al., 1996; SANTOS, 2003). Entretanto, no foi observada alterao na estrutura do parnquima heptico depois de 96 horas de exposio em nenhuma das concentraes, isso corrobora os resultados de PARISPALACIOS et al. (2000), que aps sete dias de exposio concentrao de 40 g/L tambm no observaram mudanas na estrutura celular do parnquima no lesado, SANTOS (2003) tambm observou a organizao do parnquima heptico dos grupos expostos por cobre na rao muito parecidos com o controle negativo. Em relao s patologias observadas, a menor dose apresentou alteraes como vacuolizao de algumas reas do tecido heptico, assim, o mesmo foi observado em SANTOS (2003) nos exemplares de tilpia Oreochromis niloticus

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expostos as concentraes de 4 mg e 40 mg de cobre por via trfica. O aspecto vacuolizado ocorre quando da preparao histolgica, pela eliminao das vesculas contendo lipdios, durante a preparao das amostras para a anlise. O acmulo de lipdio heptico pode estar vinculado caracterstica da espcie, ao perodo reprodutivo, dietas ricas em gorduras ou intoxicao (WOLF & WOLFE, 2005). Acredita-se que a vacuolizao encontrada nos animais deste experimento pode estar relacionada com a presena do cloreto de cobre, pois o acmulo de lipdios permite a imobilizao de certos compostos nocivos. Necroses tambm foram dectadas no experimento como mostram as Figuras 15, 16 e 17, evidenciando provavelmente, a alta sensibilidade do organismo teste ao cloreto de cobre.Assim, as necroses que foram encontradas em menor e maior graus em todas as concentraes a que foram expostos os peixes um dado importante, porque essa alterao tem sido foco de ateno na toxicologia, pois tende representar danos estruturais e funcionais que propiciam a perda da integridade e falncia do rgo, interferindo na sade dos indivduos e no equilbrio populacional (RABITTO et al., 2005). Assim, em paralelo ao descrito na literatura que identifica o cobre como um agente causador de alteraes histolgicas, desde SULTAN & KHAN (1983) que analisaram os efeitos do sulfato de cobre em Carassius auratus passando por PARIS-PALACIOS et al. (2000), VARANKA et al. (2001) e SANTOS (2003) que relataram a incidncia de necroses nos fgados de peixes em exposies ao cobre. Essa alterao pode ocorrer por meio de vrios mecanismos como ruptura lisossomal, hipxia tecidual, distrbio na sntese protica e metabolismo de carboidratos (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2002; ROSA et al., 2005; HINTON et al. 2008). Considerando que o fgado o principal rgo de desintoxicao nos vertebrados, e como j anteriormente ressaltado que essas alteraes comprometem o funcionamento metablico do rgo e

conseqentemente as enzimas de combate ao estresse oxidativo e desintoxicao tambm, isso explica em parte os resultados encontrados nesse trabalho que culminaram em estresse oxidativo. A maior incidncia de infiltraes leucocitrias nas concentraes de 10 g/L e 20 g/L indicam alm de processos inflamatrios no tecido (BERNET et al., 1999) uma possvel relao ao elevado nvel de necroses encontrados no tecido. Porque sabe-se que a ocorrncia de necroses est diretamente ligada ao comprometimento

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das membranas celulares,ento, a leso destas estruturas pode implicar no aumento da presena de clulas de defesa como o recrutamento de leuccitos (SILVA, 2010). Dessa maneira, em casos de leses celulares, diferentes tipos de leuccitos so atrados para o local. Porm, de uma forma geral, suas funes so neutralizar e destruir a fonte agressora, retirando o agente agressor e clulas mortas, alm de induzir a recuperao do tecido lesado (BOEGER, 2004). Diferenas significativas na incidncia de centros de melanomacrfagos (CMM) nas concentraes mais altas foram observadas. Esses centros so caracterizados como clulas pigmentadas encontradas em tecidos de animais heterotrmicos, nos quais melanina, lipofuscina ou hemosiderina so os pigmentos mais comuns. O papel dos CMM no fgado ainda incerto, porm a literatura afirma que a anlise histopatolgica de CMM pode ser um indicador sensvel quando os organismos esto expostos a condies adversas e sugere que esses centros estejam relacionados desintoxicao e reciclagem de compostos endgenos e exgenos (AGIUS & ROBERTS, 2003; CAMARGO & MARTINEZ, 2007; LEKNES, 2007; HINTON et al., 2008). Uma das hipteses que a melanina dos macrfagos neutraliza os radicais livres liberados como resultado do catabolismo de cidos graxos derivados da fagocitose de membranas celulares a baixas temperaturas (CLEMENTE, 2009). Ento a resposta positiva no aumento dos CMM, pode ser traduzida como um provvel sinal da toxicidade do cloreto de cobre ao Rhamdia quelen.

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6.CONCLUSO

O presente trabalho pode concluir que a exposio ao cloreto de cobre em concentraes subletais no organismo teste, o Rhamdia quelen, causa efeitos deletrios ao peixe. O desenho experimental se mostrou satisfatrio para os objetivos propostos e a espcie Rhamdia quelen pode ser considerada um bom modelo biolgico, pois adapta-se as condies laboratoriais e a manipulao durante o experimento. Os biomarcadores que se mostraram efetivos na avaliao da toxicidade do cobre foram nas anlises bioqumicas, a atividade da enzima SOD. A histopatologia e a contagem de centros de melanomacrfagos nas anlises histolgicas. A menor concentrao avaliada que permitida por lei nos corpos dgua brasileiros no mostrou significativas diferenas em relao ao controle na avaliao dos biomarcadores bioqumicos, porm algumas alteraes histolgicas foram encontradas nessa concentrao.

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7. RERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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