Escuela Politcnica del Ejrcito Ingeniera en Biotecnologa Enzimologa Nombres: David Dvila Ma.

Eugenia Quintana Daniel Vizuete 1. Demustrese que la ecuacin general MWC de cuatro sitios solamente produce Cooperatividad positiva y nunca Cooperatividad negativa. Fecha: 2012-01-03 Curso: Quinto Competencias

n-1

n-1

L c (1+ c )
n

+ (1 + )
n

Y=

L (1+ c ) + (1 + )

Existe cooperatividad positiva porque la unin de una molcula de ligando a una subunidad de protena, ya sea en estado R o T, desplaza el equilibrio a las otras subunidades con mayor afinidad que la subunidad inicial, lo cual genera un aumento de L.

2. Prubese que para n>1, la ecuacin de Hill describe una actividad enzimtica de unin con cooperatividad positiva. Para n = 2

Rs =
Rs =

[ S]0,9 [ S]0,1
2

81 Rs = 81
Rs = 9

nh

Con un ndice mayor a 1 siempre se obtendr una raz positiva

3. Con un ejemplo realizar el esquema de una reaccin bimolecular que siga un mecanismo con formacin de complejo ternario: al azar y Bi-Bi ordenado. Reaccin Bi-Bi al azar Representacin bimolecular convencional:

Notacin de Cleland:

Ejemplo:

Reaccin Bi-Bi ordenada Representacin bimolecular convencional:

Notacin de Cleland:

Ejemplo: Reaccin de la alcohol deshidrogenasa (ADH) dependiente de NAD+.

4. Un enzima con cintica hiperblica y con ndice de Hill igual a uno para un mismo cambio de saturacin, en cuantas veces necesita aumentar la concentracin del sustrato? Demostrar. n= coeficiente de Hill n=1 No existe cooperatividad

Rs

S 0,9Vmx S 0,1Vmx

Rs=(81)1/n Rs=(81)1/1=81 Con un Rs= 81 quiere decir que se requiere 81 veces ms sustrato para pasar de una saturacin del 10% al 90%. 5. Citar al menos cuatro propiedades que presenta una protena alostrica. Suelen ser protenas multimricas Actividad est regulada por la unin no covalente y reversible de moduladores Se unen a sitios distintos al sustrato La representacin cintica de v frente a [S] suele ser una sigmoide. 6. Cul es el proceso de activacin para el quimiotripsingeno? El quimiotripsingeno se activa por el corte trptico especfico de su enlace peptdico Arg 15Ile 16 para formar -quimotripsina. sta sufre luego la autodigestin para escindir en forma especfica dos dipptidos, Ser 14-Arg 15 y Thr 147-Asn 148, que rinden la enzima igualmente activa -quimotripsina.

7. Qu diferencia a una cintica alostrica homotrpica de una heterotrpica? Cintica de una enzima alostrica homotrpica

Cintica de un enzima alostrico Heterotrpico

8. Comentar brevemente la utilidad de las enzimas en la terapia La terapia enzimtica acta mejorando la funcin digestiva y asegurando una buena digestin y asimilacin de los nutrientes. Las digestiones insuficientes establecen unas condiciones propensas a la enfermedad; por ejemplo, los alimentos no digeridos apropiadamente favorecen una flora intestinal daina, las protenas se pudren, los carbohidratos fermentan y las grasas se vuelven rancias. Esto favorece la formacin de compuestos txicos como las nitrosaminas y el amoniaco, conocidos carcingenos. Las enzimas digestivas ingeridas fuera de las comidas actan contra la enfermedad de forma ms directa, atacando, por ejemplo, la cubierta proteica de las clulas cancergenas, los tumores o virus; destruyendo los complejos inmunolgicos dainos, disolviendo cogulos sanguneos o disminuyendo la inflamacin. Las enzimas pancreticas se han utilizado para detectar antgenos en la superficie de las clulas cancerosas, permitiendo que el sistema inmunitario los identifique y los destruya, y tambin para estimular la funcin inmunitaria.

Adems las enzimas proteolticas degradan la cubierta de clulas cancerosas, que estn compuestas de protenas y as consiguen que la quimioterapia sea ms efectiva y funcione en dosis menores. 9. Qu caractersticas comunes presentan la activacin de un cimgeno pancretico en general y la activacin de la cascada de coagulacin sangunea? Para que se activen debe haber un estmulo previo. Sobre el zimgeno acta una proteasa activante y as la enzima pasa de forma inactiva a su forma activa, mediante cortes proteolticos realizados por la proteasa activante en cuestin. 10. Importancia Fisiolgica en Cooperatividad Positiva Pueden ser reguladas por compuestos no anlogos del sustrato (retroinhibicin y retroactivacin). Permiten amplificar cambios pequeos en la concentracin de sus ligandos, tanto del sustrato como de los inhibidores o activadores, respondiendo con cambios grandes en la velocidad de la reaccin catalizada. Ejemplo: la accin de la hemoglobina al momento de captar oxgeno para el torrente sanguneo 11. Importancia Fisiolgica en Cooperatividad Negativa Permiten amortiguar cambios grandes en la concentracin de ligandos, respondiendo con cambios pequeos en la velocidad de la reaccin catalizada. Ejemplo: relacin entre el gliceraldehdo-3-fosfato y la enzima gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa. 12. Se determin la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima reguladora, con la siguiente gama de [So]: [So] mmol/L 0,1 0,3 0,5 1,0 3,0 5,0 10,0 100,0 500,0 1000,0 Vo mmol/L.min 1,6 x 10-4 1,4 x 10-3 4 x 10-3 1,6 x 10-2 0,14 0,39 1,45 14,6 15,9 16

Determinar el coeficiente de Hill y el Km aparente los[S] -1 -0,52287875 X=Vo/(Vmax-Vo) 1,00E-05 8,75E-05 LOG X -4,99999566 -4,05795394

-0,30103 0 0,47712125 0,69897 1 2 2,69897 3

2,50E-04 1,00E-03 8,83E-03 2,50E-02 9,97E-02 1,04E+01 1,59E+02

-3,6019514 -2,99956549 -2,05417515 -1,6023383 -1,00149499 1,01822482 2,20139712

4 3 2 X=Vo/(Vmax-Vo) 1 0 -1 -1 0 -2 -3 -4 -5 -6 Log [S] 1 2 3 y = 1,967x - 3,0037 R = 0,9995

-2

y = 1,967x - 3,0037 m=n n= 2 Rs= Rs= 9

b log

1 Km 1 Km

KmAp log

log

1 2,996 Km

Km 0,001

13. Pueden existir inhibidores competitivos en el caso de un enzima alostrica que obedece al modelo V de MWC? Qu caractersticas deben presentar? S, debe presentar una accin sobre la velocidad mxima sin cambiar la constante de afinidad por el sustrato (KR=KT)). 14. La velocidad de hidrlisis de un sustrato por una enzima alostrica se ha estudiado en presencia de un activador a concentracin saturante (experimento A), de un inhibidor a concentracin saturante (experiencia B) y en ausencia de un activador y de un inhibidor (experiencia C). las velocidades de la reaccin, expresadas en unidades arbitrarias son las siguientes: S (10-5) M 1 2 3,5 5 7,5 10 20 35 50 A 0,62 1,1 1,67 2,1 2,6 2,95 3,7 4,2 4,4 B 0,1 0,18 0,27 0,33 0,41 0,47 0,59 0,67 0,7 C 0,375 0,65 1 1,25 1,55 1,75 2,2 2,5 2,6

a) Parmetros cinticos de A, B, C Sustrato 1/[So] 100000 50000 28571,4286 20000 13333,3333 10000 5000 2857,14286 2000 1/[A] 1,61290323 0,90909091 0,5988024 0,47619048 0,38461538 0,33898305 0,27027027 0,23809524 0,22727273 Velocidades 1/[B] 10 5,55555556 3,7037037 3,03030303 2,43902439 2,12765957 1,69491525 1,49253731 1,42857143 1/[C] 2,66666667 1,53846154 1 0,8 0,64516129 0,57142857 0,45454545 0,4 0,38461538

10 8 6 4

y = 9E-05x + 1,2513

1/[So] Vs 1/[A] 1/[So] Vs 1/[B] 1/[So] Vs 1/[C] y = 2E-05x + 0,3372

2 0 0 20000 40000

y = 1E-05x + 0,1972

60000

80000

100000 120000

1) Con Activador

Y= 1x10-5 X + 0,1972
b= 1 Vmax A

b=0,1972
Km A 1 10 5, 071
5

Vmax A 5, 071

M min

Km A m V max A
2) Con Inhibidor

Km A 7,1805M

Y= 9x10-5 X + 1,2513
b= 1 Vmax B

b=1,2513
Km B 9 10 0, 799
5

Vmax B 0, 799

M min

Km B m V max B

Km B 7,191105 M

3) Sin inhibidor y sin activador

Y= 2E-05X + 0,3372
b= 1 Vmax C

b=0,3372
KmC 2 10 2,9656
5

Vmax C 2,9656

M min

KmC m V max C

KmC 5,9312 105

b) Qu modelo permite interpretar estos resultados? Modelo V

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,00E+00 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 4,00E-04 5,00E-04 Activador Inhibidor Sin A ni I

c) Cul es la constante de Transformacin?

L=0 ; hay mucha mayor afinidad por el Inhibidor, por lo que la enzima est en forma tensa; R es
muy pequea para T

15. Un enzima posee cuatro subunidades y se comporta de modo Michaeliano, respecto a su substrato. Puede tratase de un enzima alostrico que presente por otra parte, fenmenos cooperativos? S Cul ser el aspecto de la curva de saturacin de este enzima por un activador alostrico?

Y por un inhibidor alostrico?

Cul ser el aspecto de la curva de saturacin por el sustrato en presencia de un activador o de un inhibidor?

16. La fijacin del NAD+ sobre la deshidrogenasa del 3-P-gliceraldehdo de levadura origina un quenching de la fluorescencia de los triptfanos de la protena (lo que corresponde a una extincin de esta fluorescencia). Conociendo la extincin de fluorescencia que acompaa a la fijacin de un mol de NAD sobre el enzima, se puede calcular para cada experiencia la concentracin de NAD fijado. ste trabajo se efectu a pH 7.34, en presencia de enzima 10 6 M. Los triptfanos estaban excitados a 300nm y la fluorescencia se midi a 350 nm. [NAD] total (uM) 20 15 10 8 6 5 4 3 2 [NAD] unido (uM) 3,7 3,5 3,3 3,05 2,7 2,5 2,15 1,8 1,3

Calcular el nmero de centros de fijacin del NAD por mol de enzima y la constante de asociacin de cada uno de ellos. Fijado/Libre 0,226993865 0,304347826 0,492537313 0,616161616 0,818181818 1 1,162162162 1,5 1,857142857 Fijado 3,7 3,5 3,3 3,05 2,7 2,5 2,15 1,8 1,3

Tratamiento de Scatchard
2

Fijado/Libre

1,5 1 0,5 0 1 1,5 2

y = -0,6778x + 2,6939 R = 0,9944 2,5 Fijado 3 3,5 4

y = -0,6778x + 2,6939 R = 0,99436 y = -0,6778x + 2,6939 m=-0,6778 k = 0,6778 Centros de fijacin: Cuando y = 0; X = 3,974476247 Nmero de centros de unin = 4 17. Se ha estudiado una enzima alostrica que obedece al modelo K de MWC, la constante de transformacin de protena es 1 a 25C y 0,01 a 15C. la constante de disociacin intrnseca para el sustrato es de 10-5 M. La forma T no fija el sustrato, pero se asocia con un inhibidor (I), cuya constante intrnseca es de 10-6 M a 25C. La enzima es dimrica. a) Calcular el valor de L para I= 10-5 M a 15C y a 25C.

b) Cul sera el aspecto de la curva de saturacin de la enzima por el sustrato a 25C y 15C, en ausencia de inhibidor y con inhibidor.