Sunteți pe pagina 1din 11

CARACTERE BIOCHIMICE DE CULTUR ALE MICROORGANISMELOR

Examinarea caracterelor biochimice de cultur ale unui microorganism const din


evidenierea echipamentului su enzimatic i a particularitilor sale metabolice i reprezint una
din cele mai importante etape n identificarea i clasificarea unui microorganism.
Testele biochimice sunt standardizate i se efectueaz numai pe culturi pure, folosind culturi
microbiene martor care produc reacie pozitiv sau negativ i medii speciale, numite medii de
diagnostic difereniat.
Prezentm n tabelul urmator principiile care stau la baza unora dintre testele biochimice,
teste care sunt frecvent utilizate n practica microbiologic la caracterizarea i identificarea
speciilor microbiene.

Tabel 1.
Testul
biochimic
Principiul testului Evaluarea testului Microorganisme
martor/ Observatii
Evidenierea
producerii
de gaz la
fermentaia
glucidelor
Evidentiaza capacitatea
microorganismelor de a
fermenta glucidele cu
producere de dioxid de carbon,
care se acumuleaz n
tubuorul Durham.
Reacie pozitiv:
Gazul se acumuleaz
n tubuorul Durham
i determin ridicarea
lui la suprafaa
mediului de cultur;
Reacie negativ: nu
se observ acumularea
de gaz n tubuorul
Durham.
Unele bacterii i
majoritatea drojdiilor.
Testul
roului de
metil
(fermentaia
acid mixt)
Evidentiaza metabolizarea
glucozei cu producere de acid
(lactic, acetic, succinic,
formic), dioxid de carbon,
hidrogen i etanol. Acumularea
acestor acizi determin
scderea pH din mediu la
valori mai mici de 4.5 i poate
fi pus n eviden cu ajutorul
substanei indicatoare de pH
rou de metil.
Reacie pozitiv:
adugarea
indicatorului n
mediul de cultur
determin colorarea n
rou a mediului.
Reacie negativ:
adugarea substanei
indicator de pH
coloreaz mediul n
galben.
Escherichia sp.,
Salmonella sp.,
Proteus sp.
Testul
Voges-
Proskauer
Reacia Voges-Proskauer pune
n eviden capacitatea unui
microorganism de a produce
acetil-metil-carbinol, care n
mediu alcalin este oxidat la
Reacie pozitiv:
apariia n mediu a
culorii roii.
Reacie negativ:
culoarea mediului
E. aerogenes
diacetil. Diacetilul se combin
cu arginina, creatinina sau
creatina din mediu i determin
apariia unei coloraii roii.
rmne neschimbat.

Producerea
catalazei
Testul detecteaza producerea
de catalaza, care converteste
apa oxigenata (H
2
O
2
) in apa si
oxigen.
Reacie pozitiv: se
observa o reactie
efervescenta daca o
picatura de H
2
O
2
se
depunde pe colonie;
Reacie martor: o alta
picatura de H
2
O
2
se
depune pe mediu si se
compara reactiile
obtinute.
In cazul bacteriilor
crescute pe sange agar
pot aparea reactii fals
pozitive datorita
prezentei in mediu a
celulelor rosii ale
sangelui.

Testul
producerii
oxidazei
Testul detecteaza producerea
de oxidazei. In cazul metodei
cu hrtia de filtru, pe aceasta se
depun cateva picaturi de
dimetil-parafenildiamina-
hidroclorat 1% si o mica
portiune din colonie dezvoltata
pe mediu neselectiv.

Reacia pozitiv: dup
10-15 secunde
coloniile oxidaz-
pozitive i schimb
culoarea n roz, apoi
n rou nchis,
devenind n final
negre.
Reacia negativ:
coloniile oxidaz-
negative nu i
modific culoarea.
Este unul dintre cele
mai importante teste,
deoarece permite
diferenierea ntre
microorganismele din
familia oxidaz-
negative
(Enterobacteriacetae)
i alte specii oxidaz-
pozitive
(Pseudomonas sp.).
Reducerea
nitratului
Evidentiaza capacitatea
bacteriilor facultativ aerobe de
a produce nitraze care
converteste nitratul la nitrit.
Enzima se evidentiaza rapid, in
absenta oxigenului liber cu
reactivii: acid sulfanilic si
dimetil--naftilamina.
Reacia pozitiv:
adaugarea in mediu de
crestere cu nitrat a
catorva picaturi de
reactivi determina
apariia n mediu a
culorii roii.
Reacia negativ:
mediul nu i modific
culoarea.
E. coli
Testul
indolului
Evidentiaza capacitatea unor
bacterii de a degrada
triptofanul cu producere de
indol i acid piruvic. Indolul se
evideniaz rapid cu ajutorul
reactivului Kovacs.
Reacie pozitiv:
apariia unui inel
colorat n rou la
suprafaa mediului
lichid.
Reacie negativ:
apariia unui inel
galben la suprafaa
mediului lichid.
E. coli, Proteus
vulgaris
Hidroliza Evidentiaza capacitatea unor Reacie pozitiv: Permite diferentierea
ureei bacterii de a hidroliza urea cu
producere de amoniac, care
alcalinizeaza pH mediului.
Aceasta poate fi pus n
eviden cu ajutorul substanei
indicatoare de pH rou fenol,
care are o culoare galbena la
pH 6.8 si rosu la cresterea pH
peste valoarea 8.1.
adugarea
indicatorului n
mediul de cultur
determin colorarea n
rou a mediului.
Reacie negativ:
adugarea substanei
indicator de pH
coloreaz mediul n
galben.
intre grupul Proteus si
alte bacterii gram-
negative patogene
Producerea
de H
2
S
Testul evidentiaza producerea
de H
2
S prin dezaminarea
cisteinei. Producerea de H
2
S pe
mediu cu sulfat feros (mediul
Kligler) determina formarea
unui precipitat negru
Reacie pozitiv:
mediul formeaza un
precipitat negru.
Reacie negativ:
mediul nu i modific
culoarea rosie datorita
indicatorului rosu
fenol.
Proteus vulgaris
Testul
utilizrii
citratului
Evidentiaza bacteriile care au
capacitatea de a utiliza citratul
ca unic surs de carbon, ceea
ce determin alcalinizarea
mediului, evideniat cu
ajutorul unei substane
indicatoare de pH.
Reacie pozitiv:
culoarea mediului
Simmons vireaz de
la galben spre
albastru.
Reacie negativ:
mediul nu i modific
culoarea.
E. aerogenes,
Salmonella
typhimurium
Deaminarea
fenilalaninei
Evidentiaza dezaminarea
fenilalaninei cu producere de
acid fenilpiruvic care in
prezenta de FeCl
2
10%
formeaza un compus colorat in
verde.
Reacie pozitiv: In
prezenta de clorura
ferica mediul cu
fenilalanina se
coloreaza in verde.
Reacie negativ:
mediul nu i modific
culoarea.
Proteus sp.,
Morganella sp.,
Providencia sp.







SISTEME MULTITEST DE IDENTIFICARE A MICROORGANISMELOR

Identificarea i clasificarea microorganismelor este un proces complex, care se poate realiza
prin dou categorii de metode:
7 metode clasice, care presupun utilizarea cheilor taxonomice de identificare a germenilor,
se gsesc prezentate n manuale de specialitate cum sunt Bergey`s Manual of Determinative
Bacteriology, pentru bacterii, i determinatoarele lui Lodder, 1974, Kreger van Rij, 1984 sau
Barnett, 1990, pentru fungi;
7 metode moderne, care utilizeaz sisteme multitest de identificare a diferitelor grupe de
microorganisme, metode care au la baz cheile biochimice de identificare. Cele mai utilizate
sisteme multitest de identificare rapid sunt: sistemul Enterotube II pentru enterobacterii,
sistemul Oxi/Ferm Tube pentru bacteriile Gram-negative i oxidazo-pozitive, sistemul API
pentru bacterii, fungi i stafilococi - API 20E, API 20C, API Staph-Ident System.
Comparativ cu metodele clasice, utilizarea sistemelor multitest de identificare prezint o
serie de avantaje, dintre care amintim:
- obinerea rezultatelor ntr-un timp foarte scurt, n unele cazuri chiar ntr-un interval de 5
ore;
- uniformitatea rezultatelor;
- precizia/sigurana rezultatelor;
- simplitatea tehnicilor de lucru;
- un consum minim de materiale i medii de cultur.
Pentru a exemplifica, prezentm n continuare tehnica de lucru pentru identificarea cu
sistemul API 20E, produs de firma Analytab Products, Plainview, New York i folosit la
identificarea microorganismelor din familia Enterobacteriaceae i a altor bacterii Gram-negative
oxidazo-negative (Fig. 8.23.).





























Fig. 8.23. Tehnica de lucru pentru identificarea microorganismelor cu ajutorul
sistemului API 20E (prelucrare dup H. Benson, 1990)
1 -Selectarea unui izolat colonial din tulpina de testat, care este inoculat n ser fiziologic i
omogenizarea suspensiei cu un agitator tip Vortex; 2 -Dup notarea datelor la captul plcii
(numrul coloniei i numele executantului) se disperseaz n tav, cu ajutorul pisetei, 5 ml de ap
distilat steril; 3 - Galeria API 20E se plaseaz cu grij n tav, pentru a preveni contaminarea; 4
- Se disperseaz suspensie de microorganisme n cele 20 de compartimente ale galeriei API,
folosind o pipet Pasteur steril (se vor umple parial compartimentele notate: ADH, LDC, ODC,
H
2
S i URE i se vor umple complet compartimentele CIT, VP i GEL); 5 - n
compartimentele ADH, LDC, ODC, H
2
S i URE se adaug cu o alt pipet Pasteur i ulei
mineral steril, pentru a asigura condiii de anaerobioz; 6- Dup incubare i adugarea reactivilor
se citesc rezultatele, se stabilete numrul caracteristic i se consult Indexul furnizat de firm; 7
- Exemplu de citire a rezultatelor pentru E. coli.

C C
C

Exemplu: 5 144 572 = E. coli
C
C C

Sistemul API 20E este fabricat din plastic i este alctuit din dou componente:
- o tav din plastic, care permite asigurarea unui mediu umed n timpul efecturii testului;
- o galerie pe care se gsesc 20 de compartimente separate, fiecare compartiment fiind
reprezentat de o alveol i un tub n care se afl mediu nutritiv deshidratat specific.
Sistemul permite realizarea simultan a 23 de teste biochimice diferite.

Tehni ca de l ucru:
Etapa I Inocularea
izolarea n cultur pur a microorganismului de testat;
se realizeaz coloraia Gram i testul oxidazei pentru a confirma faptul c
microorganismul testat este Gram-negativ i oxidaz-negativ;
se noteaz pe testul API numrul microorganismului de testat i numele lucrtorului care
efectueaz identificarea;
toate operaiile ulterioare se efectueaz respectndu-se condiiile de manipulare aseptic,
pentru a preveni contaminarea cu germeni din aer sau de pe masa de lucru;
se selecteaz o colonie microbian, care este transferat ntr-o soluie de 0,85% NaCl
(ser fiziologic);
soluia de ser fiziologic inoculat este bine omogenizat cu ajutorul unui agitator tip
Vortex;
n tava sistemului API se disperseaz cu ajutorul pisetei 5 ml de ap distilat steril;
galeria API se introduce cu grij n tav, n aa fel nct s se previn contaminarea
testului cu germeni de pe masa de lucru;
dispersarea soluiei de ser fiziologic inoculate n cele 20 de alveole ale galeriei API,
folosind o pipet Pasteur steril;
se vor umple parial compartimentele notate: ADH, LDC, ODC, H
2
S i URE (aceste
compartimente sunt subliniate);
se vor umple complet compartimentele CIT, VP i GEL (aceste compartimente
fiind marcate);
se adaug cu o alt pipet Pasteur ulei mineral steril la suprafaa lichidului din
compartimentele ADH, LDC, ODC, H
2
S i URE, pentru a asigura condiii de anaerobioz.
se acoper cu un capac din plastic testul API 20E i se incubeaz la termostat, la 37C,
pentru 18-24 de ore.

Etapa II Evaluarea testului
nainte de nceperea acestei etape se va studia Anexa 6, care explic simbolurile utilizate i
prezint modul de interpretare a reaciilor pentru fiecare test.
se citete rezultatul din compartimentul GLU:
dac rezultatul este negativ (dup incubare 18-24 de ore), atunci microorganismul
testat nu aparine familiei Enterobacteriaceae i pentru identificarea lui este
necesar o perioad suplimentar de incubare;
dac rezultatul n compartimentul GLU este negativ, dar pe plac apar mai puin de
trei rezultate pozitive, rezultatele obinute nu sunt relevante;
dac testul GLU este pozitiv (galben) i apar mai mult de trei reacii pozitive pe
plac atunci testul se va continua;
se adaug urmtorii reactivi:
n tubul TDA se adaug o pictur de clorur feric 10% i se noteaz apariia
reaciei pozitive (rou-cafeniu) sau negative (galben);
n tubul VP se adaug o pictur de soluie Barritt A sau B i se citete rezultatul
dup 10 minute (culoarea roz aprut imediat dup adugarea reactivului nu se ia n
considerare); reacia pozitiv (roz nchis sau rou) sau negativ (incolor);
n tubul IND se adaug o pictur de reactiv Kovacs i se citete rezultatul dup
dou minute: reacie pozitiv (apare un inel rou) sau negativ (apare un inel galben
spre cafeniu);
se examineaz tubul GLU pentru a observa prezena bulelor de gaz, care indic
reducerea azotitului (NO
2
-
) i formarea azotului gazos (N
2
);
Ulterior se adaug la testul GLU dou picturi de reactiv pentru azotit, iar reacia se citete
dup 2-3 minute: reacia pozitiv, care confirm reducerea nitratului (rou). Pentru a confirma
testul negativ se adaug praf de zinc, iar rezultatele se citesc dup 10 minute: reacia este
pozitiv dac apare culoarea roz-portocaliu, care confirm faptul c nu s-a realizat reducerea
azotitului sau reacia este negativ, dac apare culoarea galben, care confirm prezena N
2
.
n compartimentele MAN, INO i SOR se adaug cte o pictur de peroxid de hidrogen
(ap oxigenat) i se citete rezultatul dup 2 minute: reacie pozitiv, care confirm producerea
de catalaz (apar bule) sau reacie negativ. Cele mai bune rezultate vor fi obinute n cazul n
care nu s-a produs gaz prin fermentaie.
evaluarea final a testului presupune nregistrarea tuturor rezultatelor i stabilirea unui
numr caracteristic format din 7 cifre:
pe foaia de observaie testele sunt grupate cte trei, rezultnd astfel 7 grupe (Fig.
8.24.);
fiecare dintre teste este evaluat cu un numr de puncte 1, 2 sau 4;
pe baza consultri Anexei 6 se noteaz pe foaia de observaie n dreptul fiecrui test
rezultatul testului (+ sau -);
dac testul este pozitiv i se va acorda punctajul corespunztor, iar dac este negativ
testul va fi evaluat cu 0;
la nivelul fiecrui grup se numr punctajul rezultat, obinndu-se astfel cifrele
numrului caracteristic;
la numrul caracteristic format din 7 cifre se pot aduga 2 cifre ce reprezint numrul
suplimentar i care apreciaz reaciile: NO
2
reducerea azotatului la azotit, N
2

reducerea complet a azotatului la azot sau amine, MOT observarea motilitii,
MAC creterea pe mediu Mac Corkey, OF/O utilizarea oxidativ a glucozei i
OF-F fermentaia glucozei.
identificarea speciei se realizeaz consultnd Indexul furnizat de firm;
la finalul experimentului toate componentele sistemului API 20E se introduc ntr-un
recipient cu amestec dezinfectant (nu se arunc la gunoi).

Nr. referin ________________________________________
Data ______________________________________________
Locul recoltrii ______________________________________
Persoana care a realizat recoltarea/analiza _________________


ON
PG
A
D
H
L
D
C
O
D
C
CI
T
H
2
S
U
R
E
T
D
A
IN
D
V
P

G
E
L
G
L
U
M
A
N
IN
O
S
O
R
R
H
A
S
A
C
M
E
L
A
M
Y
A
R
A
O
XI
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4
5h
24
h

48
h


Numr
caracter
istic




NO
2
N
2
M
O
M
A
OF
-O
OF
-F




Informaii suplimentare
Microorganismul identificat
T C
1 2 4 1 2 4
5h
24
h

48
h


Numr
suplime
ntar



Fig. 8.24. Foaia de observaie pentru testul API 20E

Test 8. 4 .

1. Explicai importana examinrii caracterelor biochimice pentru procesul de identificare a
microorganismelor.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
2. Completai spaiile libere din frazele urmtoare:
a) testele biochimice sunt _____________ i se efectueaz numai pe culturi pure, folosind
__________________________ care produc reacie pozitiv sau negativ i medii
speciale, numite _________________________________________________________
b) testul Voges-Proskauer reprezint _____________________________________
______________________________________________________________________
c) testul catalazei este utilizat la ______________________________________________
3. Explicati principiul testului de producere a H
2
S.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
4. Explicai principiul metodei de evideniere a producerii de gaz la fermentaia glucidelor.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
5. Metoda de evideniere a proprietilor zaharolitice presupune:
a) evidenierea producerii de CO
2
cu ajutorul unei substane indicatoare de pH;
b) identificarea speciilor de bacterii care au capacitatea de a metaboliza zaharurile cu
producere de acid;
c) modificarea pH-ului n mediu datorit activitii microorganismelor care utilizeaz
acizi.
6. Precizai principalul scop al testului de hidroliza a ureei in cazul testarii bacteriilor patogene
Gram-negative din intestine.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
7. Explicai principiul testului de utilizarea a citratului si scopul sau.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
8. Completai spaiile libere din frazele urmtoare:
a) tulpinile _______________________________ produc reacie pozitiv la testul
indolului;
b) la testul Voges-Proskauer tulpina martor-pozitiv este _______ _______________ iar
tulpina martor-negativ ___________________;
c) la testul utilizrii citratului se utilizeaz mediul ___________;
9. Microorganismele care utilizeaz citratul fac parte din categoria:
a) bacteriilor;
b) drojdiilor;
c) fungilor imperfeci.
10. Explicati principiul testului de dezaminare a fenilalaninei si precizati care
Enterobacteriaceae sunt diferentiate prin acest test.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

Test 8. 5 .

1. Prezentai avantajele utilizrii sistemelor multitest de identificare a microorganismelor.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
2. Completai spaiile libere din frazele urmtoare:
a) principalul dezavantaj al identificari patogenilor prin metode clasice este
_________________________________________________________________________
b) sistemul API 20E este folosit la identificarea __________________________________
c) pentru identificarea enterobacteriilor se
folosesc__________________________________________________________________
d) sistemul API 20E este format din____________________________________________
________________________________________________________________________
e) sistemul API 20E permite realizarea a_________________ teste biochimice diferite;
3. Prezentai etapa I (Inocularea) de identificare a germenilor cu ajutorul sistemului API 20E.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
4. Explicai ce informaii ne ofer reacia din testul GLU.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
5. Precizai care sunt reactivii necesari la evaluarea rezultatelor n etapa a II de identificare cu
sistemul API 20E i n care compartimente se adaug.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________