Pruebas Colilert y Colisure

Preparado por Terry C. Covert Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos

La prueba de autoanalysis Colilert fue desarrollada por el Dr. Stephen Edberg de la Universidad de Yale en 1988. La tcnica emplea una tecnologa desarrollada para identificar microbios de infecciones del tracto urinario pero posteriormente fue adoptado para anlisis de agua. La filtracin por membrana (FM), la prueba de fermentacin en tubos mltiples (MFM) y la prueba de presencia ausencia (PA) de coliformes se basan en la fermentacin de la lactosa obtenindose colonias con brillo metlico, gas o cido y gas. Estos mtodos requieren una verificacin o confirmacin de la presencia de coliformes, lo cual demanda un tiempo adicional de anlisis. La prueba de Colilert fue desarrollada en respuesta a estas limitaciones y de los problemas experimentados en un sistema de distribucin de agua de New Haven, Connecticut, debido a la reproduccin de coliformes en la capa biolgica. La prueba de Colisure fue desarrollada por la corporacin Millipore en 1993. Las pruebas Colilert y Colisure estn disponibles en los laboratorios Idexx Inc., Westbrook, Maine.

Las pruebas Colilert y Colisure se basan en la capacidad de los coliformes para producir la enzima galactosidasa que acta sobre sustratos especficos, en el caso de Colilert sobre el O nitrofenil - - D - galactopiransido (ONPG), producindose un color amarillo al actuar sobre el O nitrofenil. La prueba Colisure contiene el sustrato clorofenol rojo - D - galactopiransido (CPRG). Con la hidrlisis por - galactosidasa el CPRG libera un compuesto cromognico, rojo de clorofenol, 1

que cambia el color del medio de amarillo a rojo o magenta. Adems, la enzima - glucoronidasa producido por E. coli forma una sustancia fluorescente cuando hidroliza 4 - metilumbelliferil - - Dglucurnido (MUG). Tanto el Colilert como el Colisure contienen MUG. Esta combinacin de sustratos permite detectar tanto los coliformes totales como la E. coli en un plazo de 24 horas. Adems del ONPG y MUG, sustratos que son usados como fuentes de carbono, el Colilert contiene sulfato de amonio como fuente de nitrgeno, sales minerales y sulfito de sodio para ayudar a reparar los coliformes daados, y solanium como dispersivo. El Colisure tambin contiene una combinacin de nutrientes y sales inorgnicas. As mismo, inhibe selectivamente el crecimiento de los no - coliformes mediante la accin de detergentes y antibiticos.

El uso de Colilert como el de Colisure es simple, en el sentido de que lo nico que se debe hacer es aadir 10 ml de muestra a los tubos de Colilert, 20 ml de muestra a los tubos de Colisure o 100 ml a los frascos de presencia ausencia que contienen sustratos definidos (medios). Las pruebas se incuban de 24 a 28 horas. Se recomienda incubar hasta por 48 horas. Ambas pruebas estn diseadas de tal manera que no se requiera ninguna prueba adicional de confirmacin. La incorporacin de los dos sustratos permite la deteccin y enumeracin simultnea tanto de los coliformes totales como de E. coli. Como en ambas pruebas el medio de cultivo se encuentra en forma de polvo listo para su uso, no hay ningn medio para preparar ni esterilizar. Los tubos de Colilert o frascos de PA tienen un perodo mximo de almacenamiento sin refrigerar de 12 meses. La prueba Colisure tiene un perodo mximo de almacenamiento con refrigeracin de nueve meses. Por lo general, es muy fcil leer o interpretar las pruebas positivas. La prueba Colilert tiene un comparador de color muy tnue, en caso de que los tubos o frascos de PA sean difciles de leer o interpretar. Para los tubos Colilert o los 2

frascos de PA en donde el color es indefinido, se recomienda una incubacin adicional de cuatro horas. Recientemente, los laboratorios Idexx desarrollaron la prueba Colilert de 18 horas que se basa en la misma formulacin de la prueba de Colilert de 24 horas, con un tiempo menor de incubacin. Primero se incuba la muestra por 20 minutos en bao mara a 35 C despus de agregar el sustrato de Colilert18, luego se incuba durante 18 horas a 35 C. Otra innovacin reciente del Idexx es el Quanti-Tray. Se trata de un sistema de NMP de 51 tubos (celdas) que usa el Colilert - 24 horas, el Colilert - 18 o el Colisure como medio o sustrato. El medio (sustrato) se aade a la muestra, la muestra se vierte en el Quanti-Tray, la bandeja se sella con calor y se incuba a 35 C. Se enumeran las celdas positivas con coliforme totales o E. coli y se comparan con el cuadro de los NMP de las 51 celdas que proporcionan los laboratorios Idexx.

Aunque se ha informado que Colilert y Colisure equivalen a las pruebas estndares de coliformes en cuanto a la deteccin, recuperacin y especificidad, ambas pruebas tienen limitaciones. No todas la E. coli son MUG-positivo, como la E. coli O157 H: 7, lo que puede dar resultados negativos falsos. Los altos niveles de Aeromonas hydrophila y Flavobacterium spp. tambin pueden provocar reacciones positivas falsas de ONPG y reacciones MUG. En las instrucciones del fabricante y en el Manual para la Certificacin de laboratorios de anlisis de agua potable de la EPA de los Estados Unidos, se recomienda que en cada lote de producto recibido se controlen los cultivos positivos y negativos y que se registren los resultados. Tanto la prueba de Colilert como la de Colisure estn aprobadas por la EPA de los Estados Unidos para detectar coliformes totales y E. coli en el agua potable.

Bibliografa

Covert, T. C., L. C. Shadix, E. W. Rice, J. R. Haines, and R. W. Freyberg. 1989. Evaluation of the autoanalysis Colilert test for detection and enumeration of total coliforms. Appl. Environ. Microbiol. 55:2443.

Covert, T. C., E. W. Rice, S. A. Johnson, D. Berman, C. H. Johnson, and P. M. Mason. 1992. Comparing defined-substrate coliform tests for the detection of Escherichia coli in water. J. Amer. Water Works Assoc. 84(5):98.

Edberg, S. C., M. J. Allen, D. B. Smith, and The National Collaborative Study. 1988. National field evaluation of a defined substrate method for the simultaneous enumeration of total coliforms and Escherichia coli from drinking water: Comparison with the standard multiple tube fermentation method. Appl. Environ. Microbiol. 54:1595.

Edberg, S. C., M. J. Allen, D. B. Smith, and The National Collaborative Study. 1989. National field evaluation of a defined substrate method for the simultaneous detection of total coliforms and Escherichia coli from drinking water: Comparison with presence-absence techniques. Appl. Environ. Microbiol. 55:1003.

McCarty, S. C., J. H. Standridge and M. C. Stasiak. 1992. Evaluating a commercially available defined-substrate test for recovery of chlorine-treated Escherichia coli. J. Amer. Water Works Assoc. 84(5):91.

McFeters, G. A., S. C. Broadway, B. H. Pyle, M. Pickett and Y. Egozy. 1996. Comparative performance of Colisure and accepted methods in the detection of chlorine-injured total coliforms and E. coli. Water Sci. Technol. 31:259.

Pruebas Colilert y Colisure Esquema

Desarrollo * Colilert fue desarrollado por el Dr. Stephen Edberg de la Universidad de Yale en 1988.

* Todos los mtodos para coliformes basados en la fermentacin de la lactosa requieren una verificacin adicional y pruebas de confirmacin. Colilert se desarroll en respuesta a estas limitaciones.

* Colisure fue desarrollado por la Corporacin Millipore en 1993 y los laboratorios Idexx la 5

comercializa.

Principios de las pruebas * Se basan en la capacidad de los coliformes para producir la enzima - galactosidasa y E. coli para producir la enzima - glucuronidasa.

* El sustrato para - galactosidasa con Colilert es O - nitrofenil - - D -galactopiransido (ONPG) y con Colisure es clorofenol rojo - D - galactopiransido (CPRG).

* El sustrato para - glucuronidasa tanto en Colilert como en Colisure es 4 - metilumbelliferil - - D - glucornido (MUG).

* Cuando ONPG (Colilert) es hidrolizado por - galactosidasa se produce un color amarillo (O nitrofenil). Cuando el CPRG (Colisure) es hidrolizado por - galactosidasa, se produce un color rojo o magenta (clorofenol rojo). El desarrollo del color amarillo con Colilert y rojo o magenta con Colisure, indica la presencia de coliformes totales.

* Cuando el MUG es hidrolizado por E. coli ( - glucoronidasa) para formar 4 - metilumbelliferil, la fluorescencia se puede detectar con una luz ultravioleta de onda larga de 366 nm. Una prueba MUG positiva indica la presencia de E. coli.

Resumen del mtodo * Se aade 10 ml de muestra a diez (10) tubos Colilert, 20 ml de muestra a cinco (5) tubos Colisure o 100 ml de muestra a frascos de PA Colilert o Colisure o Quanti-Trays.

* Los tubos, frascos de PA o Quanti-Trays se incuban a 35 C 0,5

* Los tubos, frascos de PA o Quanti-Trays se examinan para verificar la presencia de color amarillo o magenta y se exponen a la luz ultravioleta de onda larga para detectar la presencia de E. coli. 7

Ventajas/Desventajas de los mtodos * No todas las E. coli son MUG - positivo. Actualmente se piensa que 93 95% son MUG positivo.

Los mtodos basados en MUG o los que usan una incubacin a temperatura elevada (44,5 C) no detectarn E. coli O157 H:7.

* No se requiere para preparar o esterilizar el medio de cultivo.

* No se necesita ninguna prueba adicional de confirmacin.

* Los niveles altos de hetertrofos no interfieren con la deteccin de los coliformes totales o E. coli.

* El Colilert se puede almacenar a temperatura ambiente.

* Por lo general, es fcil interpretar las pruebas positivas. 8

* Los altos niveles de Aeromonas hydrophila y Flavobacterium spp. pueden dar origen a pruebas positivas falsas de ONPG o MUG.

Pruebas Colilert y Colisure

Notas del instructor

Este bloque de instruccin es una combinacin de la ponencia y demostracin. Por lo general no se usan diapositivas ni transparencias (acetatos). El participante recibe un esquema y material didctico. Los tubos Colilert y Colisure y los frascos de PA se inoculan antes del curso con coliformes totales y E. coli junto con cultivos de control negativos de coliformes totales. La ponencia se desarrolla conforme al material didctico. Las prcticas de AC/CC descritas en el Manual para la certificacin de laboratorios de anlisis de agua potable de la EPA de los Estados Unidos tambin estn incluidas en la ponencia, es decir, el uso de cultivos de control positivos y negativos, comparador de color, etc.