CROMATOGRAFA Es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos:

Retencin: Es el efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un soporte slido. Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas.

ELUCIN Es el fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o

cuantitativamente. TIPOS DE CROMATOGRAFA. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa

a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido. b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido anclado a un soporte slido. c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas. d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil un gas. Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre. a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar. b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas. c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN La adsorcin es la propiedad que tienen ciertos slidos de aumentar la concentracin en su superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las diferencias de adsorcin de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un slido polar de gran superficie (adsorbente). La fase mvil puede ser un gas o un lquido dando lugar a la cromatografa gas-slido (CGS) o lquido-slido (CLS).

El grado de adsorcin vara segn la naturaleza y superficie especfica de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre molculas adsorbidas y el adsorbente han de ser dbiles para que su fijacin sea reversible, las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrgeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas. Cromatografa lquido-slido (CLS). La fase estacionaria est constituida por un slido polar poroso y que esta finamente granulado. La superficie especfica contiene centros polares aptos para la adsorcin de las molculas polares presentes en la fase mvil. Al disminuir el tamao de las partculas, el nmero de centros activos por unida es mayor, y la capacidad de adsorcin se incrementa. El adsorbente ms utilizado es gel de slice aunque tambin se emplea almina activada. En el caso del gel de slice la interaccin se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales polares de los compuestos orgnicos. La fase mvil est constituida por un disolvente en el que los componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase mvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporcin del disolvente ms polar. Los disolventes ms comunes: hexano, tolueno, benceno, ter etlico, cloroformo, acetato de etilo, acetona, etanol, metanol, isopropanol(IPA), agua, etc. La retencin se realiza en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar (S) y las molculas de la fase mvil (M) por adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. As las molculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados por las molculas polares presentes en la fase mvil. Los tiempos de retencin y la selectividad en la separacin dependern de la polaridad de los compuestos a

separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y la naturaleza de los disolventes que componen la fase mvil (M). Cromatografa en capa fina. La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. La relacin entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor). Rf= La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo. La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografa preparativa en placa. La cromatografa preparativa se lleva a cabo en placas de gel de slice de 12 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separacin y aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas entre 100-200 mg. En la superficie del adsorbente (gel de slice), mediante una pipeta Pasteur, se traza una lnea continua con la muestra disuelta y se introduce la placa en posicin vertical en una cubeta. Durante la elucin debe permanecer tapada para evitar la evaporacin del disolvente. Una vez se han separado los productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del compuesto a aislar y con ayuda de una esptula se desprende del soporte de vidrio el gel de slice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un erlenmeyer se aade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el gel de slice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro. Cromatografa en columna. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retencin. El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las

partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm, slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida. Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las siguientes; a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura del adsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a separar. b) Eleccin del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena separacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de etilo. Cromatografa en papel. Es la ms sencilla de las tcnicas, pero slo nos dar resultados cualitativos. Est casi en desuso. El mtodo se basa en un mecanismo de reparto, y consiste en depositar una pequea cantidad de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el disolvente, de manera que ste fluya por la tira por capilaridad. CROMATOGRAFA DE PARTICIN. La cromatografa lquido-lquido, tambin llamada de particin se

caracteriza por emplear una fase estacionaria lquida, anclada a un soporte slido, y una fase mvil tambin lquida. El soporte slido por lo general es gel de slice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase lquida con la incorporacin de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformacin de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de slice en grupos siloxano (Si-O-Si-R), lo que proporciona una

fase lquida estacionaria trmicamente estable y difcil de hidrolizar en condiciones normales. La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en funcin de la naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de slice, lo que permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separacin en la cromatografa lquido-lquido se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de la mezcla entre las dos fases lquida o en las diferentes interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales presentes en la cadena enlazada al gel de slice. En funcin de la polaridad de la fase lquida estacionaria, se distingue entre: a) Cromatografa en fase normal. La fase estacionaria est constituida por un lquido de carcter polar. Como fase mvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo, diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado retenidos en una cromatografa slidolquido. En este tipo de cromatografa el orden de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos ms polares quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin b) Cromatografa en fase reversa. La fase estacionaria est constituida por un lquido de carcter apolar. Como fase mvil se emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fase mvil ms polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separacin de mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una cromatografa slido-lquido, y para la separacin de compuestos de una misma serie homloga. La retencin se explica en base a una adsorcin preferencial del disolvente menos polar de la fase mvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se establece un mecanismo complejo que supone una combinacin de equilibrios de solubilidad (particin) de la mezcla que se cromatografa entre la fase lquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase mvil.

La separacin ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares sern ms solubles en la fase estacionaria que los ms polares. Por tanto, al contrario que en la fase normal, los compuestos ms polares estarn menos retenidos que los menos polares. Los tiempos de retencin disminuyen cuando menor sea la proporcin de agua, cuando menos polar sea el disolvente empleado. Cromatografa de intercambio inico. La cromatografa de intercambio inico (cromatografa inica) es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basado en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que se inyecta es usualmente llamada muestra y loscomponentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad. La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie grupos funcionales inicos que interactan con iones de carga opuesta. Este tipo de cromatografa se subdivide a su vez en la cromatografa de intercambio catinico y cromatografa de intercambio aninico: La cromatografa de intercambio catinico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente (SO3-, CO2-). Las resinas cuyo grupo funcional activo es un sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras cidas fuertes, mientras que aqullas cuyo grupo funcional activo es un in carboxilato (CO2-) se consideran resinas cidas dbiles. R-A-H+ + M+ + B- <--> R-A-M+ + H+ + BLa cromatografa de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente, como un catin de amonio cuaternario (R4N+). R4-N+L- + M+ + B- <--> R4-N+B- + L- + M+

Este tipo de cromatografa se basa en el equilibrio de intercambio inico entre una fase slida que contiene grupos sulfnicos o carboxlicos (para la separacin de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la separacin de aniones) y los iones presentes en la fase mvil. Por ejemplo, para la separacin de cationes se puede utilizar una resina de cido dbil donde se producir el siguiente equilibrio: R-CO2H + M+ R-CO2M + H+ En este caso, el catin M+ puede ser eluido de la columna por un cido fuerte en una concentracin capaz de desplazar el equilibrio representado en la ecuacin anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta tcnica al estado de cromatografa de alta resolucin, llamada cromatografa inica, fue posible a partir de la dcada del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen los materiales tpicos para el intercambio (grupos sulfnicos para cromatografa catinica y grupos aminos cuaternario para cromatografa aninica). Estos recubrimientos se depositan sobre pequeas esferas de slice, vidrio o de algn polmero que son capaces de soportar las altas presiones comnmente utilizadas en cromatografa lquida de alta resolucin.