UNIVERSITATEA LUCIAN BLAGA DIN ARAD FACULTATEA DE STIINTE AGRICOLE, INDUSTRIA ALIMENTARA SI PROTECTIA MEDIULUI SPECIALIZAREA: MANAGEMENTUL PROCESARII

MODERNA A ALIMENTELOR

-Amilaza

Coordonator: Prof. Univ. Dr. Ing. Neli Darie Masterand: Turcanu Radu Sibiu ~2013~

-Amilaza

Rezumat
-amilaza este o enzim EC 3.2.1.1 care hidrolizeaza legaturi de polizaharide mari cu legaturi , cum ar fi amidonul si glicogenul, obinndu-se glucoz i maltoz. Este forma majora a amilazei gsite n oameni i alte mamifere. Este de asemenea prezent n semine care conin amidon ca o rezerv de alimente, i este secretata de multe ciuperci. Dei gsita n multe esuturi, amilaz este cel mai proeminent n suc pancreatic i saliv, fiecare dintre care are propria izoforma de -amilaz umana. Acestea se comport diferit pe focalizare izoelectric, i de asemenea, pot fi separate n testari folosind anticorpi monoclonali specifici. La om, toate amilazele izoforme se leaga de cromozomul 1p21. Cuvinte cheie: Enzime, Amilaza, Biosinteza, Bacillus subtillis, Amidon

Abstract
-Amylase is an enzyme EC 3.2.1.1 that hydrolyses alpha bonds of large, alpha-linked polysaccharides, such as starch and glycogen, yielding glucose and maltose. It is the major form of amylase found in humans and other mammals. It is also present in seeds containing starch as a food reserve, and is secreted by many fungi. Although found in many tissues, amylase is most prominent in pancreatic juice and saliva, each of which has its own isoform of human -amylase. They behave differently on isoelectric focusing, and can also be separated in testing by using specific monoclonal antibodies. In humans, all amylase isoforms link to chromosome 1p21. Key words: Enzymes, Amylase, Biosynthesis, Bacillus subtillis, Starch

Cuprins
I. INTRODUCERE A. Prezentare generala a enzimei B. Clasificarea E.C. C. Rol catalitic si fiziologic II. RASPANDIRE III. MODURI SI TEHNOLOGII DE OBTINERE SI PURIFICARE A -AMILAZEI A. Microorganisme, plante si animale utilizate ca sursa de -amilaza: B. Biocinetica producerii -amilazei: a.Particularitati morfo-fiziologice corelate cu potentialul productiv tulpinilor de Bacillus subtilis b. Dinamica acumularii -amilazei in culturile submerse c. Influenta pH-ului d. Influenta temperaturii si duratei de incubare asupra biosintezei amilazei e. Influenta ratei de aerare si vitezei de agitare asupra biosintezei amilazei f. Influenta caracteristicilor fizico-chimice ale mediului nutritiv biosinteza C. Purificarea si caracterizarea -amilazei IV. REACTII SI MECANISME A. Proprietati generale ale -amilazei din Bacillus subtillis B. Substratul si mecanisme ale atacului enzimatic V. APLICATII INDUSTRIALE A. Utilizarea -amilazei in panificatie B. Utilizarea -amilazei in industria berii C. Utilizarea -amilazei in industria spirtului BIBLIOGRAFIE

al

de

1. Introducere
A. PREZENTARE GENERALA A ENZIMEI: Amilaza este o enzima ce activeaza hidroliza amidonului in maltoza si dextrine. Enzimele sunt componente de natura proteica produse de celulele vii care catalizeaza reactii de sinteza si degradare din organismele animale, vegetale si microorganisme. Enzimele, ca toti catalizatorii, nu catalizeaza decat reactii termodinamic posibile, decurgand in sensul stabilirii unui echilibru[2]. Enzimele actioneaza fie in celula vie in care iau nastere, constituind un factor cheie in asigurarea cineticii optime a reactiilor chimice necesare proceselor vitale, fie in afara mediului care le-a creat (cazul enzimelor constituite in secretii sau al celor care actioneaza in vitro). -Amilaza, alaturi de -amilaza, hidrolizeaza legaturile -1,4-glucozidice. -Amilaza, cunoscuta si sub denumirea de amilaza dextrinogenica, ptialina, -1,4-glucon 4glucanohidroxilaza (E.C. 3.2.1.1.), este o metalproteina care contine calciu in proportie de 1 atom gram/molecula, strans legata de enzima. Prin indepartarea calciului, enzima devine inactiva si instablila la caldura. Calciul nu participa la formarea complexului enzima-substrat, dar mentine molecula de enzima in configuratia optima pentru un maxim de activitate si stabilitate. Enzima are activitate la pH cuprins intre 4,5-7,0 , pH-ul optim depinzand de originea enzimei. B. CLASIFICAREA E.C.: O recenta clasificare si nomenclatura a enzimelor se bazeaza pe principiile si regulile stabilite in 1961 de catre Comisia de Enzime a Uniunii Internationale de Biochimie (C.E.-I.U.B) si a Uniunii Internationale de Chimie Pura si Aplicata (I.U.P.A.C.). Astfel, enzimele au fost clasificate in 6 clase (numeroase subclase si sub-subclase) [3]. Potrivit acestei clasificari, -amilaza este codificata cu E.C. 3.2.1.1. literele E.C. reprezinta o prescurtare de la Enzyme Commission; Prima cifra, 3 face referire la clasa din care face parte enzima, si anume, hidrolaze. Hidrolazele catalizeaza scindarea hidrolitica a substraturilor, determinand desfacerea legaturilor dintre atomii de carbon si alti atomi prin introducerea elementei apei. A doua cifra, 2, reprezinta subclasa din clasa hidrolazelor, unde se gaseste emzima de interes, si anume: glicozidaze. Glicozidazele scindeaza legaturile glicozidice. Cea de-a treia cifra, 1 face referire la sub-subclasa din care face parte enzima si anume: polizaharidaze, iar ultima cifra, 1, este numarul de ordine din sub-subclasa. Tabel 1. Clasificarea enzimelor I. Oxido-reductaze II. Transferaze III. Hidrolaze 1. Esteraze 2. Glicozidaze 1.Oligozaharidaze 2. Polizaharidaze 1. a-Amilaze 5. Reactii: hidrolize de esteri, amide, peptide Hidrolizeaza legaturi glicozidice

3. Amidaze 4. Proteaze

Poligalacturonidaze 2. b-Amilaze 6. Chitinaze 3. Cicloamilaze 7. Hialuronidaze 4. Celulaze Hidrolizeaza legatura C-N Hidrolizeaza legaturi peptidice

5. Purin-desaminaze Amino-purine hidroxi-purine + NH3 6. Nucleaze Hidrolizeaza acizi nucleici IV. Liaze V. Izomeraze VI. Ligaze C. ROL CATALITIC SI FIZIOLOGIC: a).Rol catalitic: -Amilaza actioneaza asupra amidonului, care reprezinta substratul ei natural. Amilaza scindeaza hidrolitic, la intamplare, orice legatura -1,4-glucozidica, preferandu-le totusi pe cele din interiorul macromoleculelor de amiloza si amilopectina, motiv pentru care li s-a si dat denumirea de endoamilaze. Sub actiunea lor, amiloza si amilopectina sunt fragmentate la polizaharide cu grad de polimerizare mai mic, numite dextrine. Ea realizeaza o lichefiere a amidonului si o hidroliza prelungita la maltoza si maltotrioze[3]. -Amilazele nu pot scinda legaturile -1,6-glucozidice din amilopectina. b).Rol fiziologic: S-a demonstrat faptul ca -amilaza este prezenta in cantitati mai mari in caz de pancreatite acute, oreion, colecistite, calculi biliari si obturatie intestinala[5]. -Amilaza joaca un rol important si in aparitia placii dentare si a cariilor. Se cunoaste faptul ca aceasta enzima formeaza legaturi cu un grad ridicat de afinitate cu un anumit grup de streptococci orali. Datorita faptului ca -amilaza este prezenta in smaltul dintilor, duce la formarea legaturilor -amilaza - bacterie. Acest contact intre legatura -amilaza bacterie si dinti poate avea implicatii importante in aparitia placii dentare si a cariilor. Datorita actiunii amilazei asupra carbohidratilor care ajung in gura, se realizeaza o hidroliza a acestora, formanduse acid lactic, care in final duce la demineralizare[10]. De asemenea, -amilaza reprezinta un agent antiinflamator[12]. Se cunoaste faptul ca -amilaza este secretata de glandele salivare si de pancreas, insa aceasta mai este eliberata si in limfa si urina atunci cand o persoana prezinta diferite forme de cancer, cum sunt: cel de plamani, ovarian. Majoritatea cancerelor de plamani care produc amilaza s-au dovedit a fi adenocarcinogene[11].

2. Raspandire
-Amilazele pot fi de origine animala (amilaza produsa de glanda salivara si pancreas), de origine vegetala (cereale incoltite, in special malt) cu importanta in industria berii, spirtului si panificatiei si de origine microbiana (bacterii, mucegaiuri si mai putin drojdii), cele de origine bacteriana fiind mai stabile la caldura decat cele de origine fungica. -Amilaza de origine bacteriana pot fi moderat termostabile (-amilaze normale)si termostabile. Astfel, -amilaza din Bacillus subtillis, var. amiloliquefaciens, este moderat termostabila (-amilaza normala), iar cea din B. Licheniformis este termostabila, suportand temperaturi cu 200C mai mari decat celelalte -amilaze bacteriene. Firma NOVO comercializeaza preparatul enzimatic termostabil TermamilR a carui stabilitate nu este strisct dependenta de Ca2+ si care se utilizeaza la lichefierea amidonului intr-o singura treapta, ce incepe cu temperatura de 1050C iar dupa cateva minute se scade la 951000C, valoare care se mentine cateva ore. Acest procedeu de lichefiere se aplica la obtinerea izosiropului, unde se cere un material de start cu puritate ridicata. -Amilaze termostabile se mai obtin si din Bacillus coagulans si Bacillus stearothermophilus. Preparatul enzimatic de -amilaza moderat termostabila (-amilaza normala) este comercializat de firma NOVO sub denumirea de BAN si se utilizeaza la lichefierea amidonului in 3 trepte, preparatul fiind utilizat in treptele 1 si 3 care se desfasoara la 85 0C. In etapa 2, amidonul este incalzit la 1400C, pentru o completa gelatinizare. -Amilazele de origine fungica (A. oryzae, A. niger) sunt termostabile, avand actiune maltogenica (sunt folosite la zaharificare pentru obtinerea siropului de maltoza). Astfel, preparatul FurgamilR (NOVO) are actiune mai buna decat -amilaza bacteriana (BAN), in sensul ca prin degradarea amidonului se obtine o cantitate mai mare de maltoza. Fungamilul se utilizeaza si impreuna cu amiloglucozidaza (AMG) pentru obtinerea de siropuri dulci fermentescibile.

3. Moduri si tehnologii de obtinere si purificare a -Amilazei

A. MICROORGANISME, PLANTE SI ANIMALE UTILIZATE CA SURSA DE -AMILAZA: In prezent, microorganismele cele mai folosite pentru obtinerea preparatelor enzimatice de -amilaza sunt specii ale genului Bacillus (B.subtilis; B.licheniformis) si Aspergillus (A.oryzae, A.niger). Preparatele amilolotice obtinute din tulpini de Bacillus subtilis, datorita termostabilitatii ridicate si puterii mari de fluidificare a gelului de amidon au o larga aplicabilitate in industria hidrolizatelor de amidon, textila, detergentilor. Amilazele de natura fungica se preteaza utilizarii in industria panificatiei, unde se cer temperaturi optime de lucru scazute si capacitate zaharogenica pronuntata. In continuare, vom pune accentul doar pe dinamica biosintezei -amilazei, utilizand tulpini de Bacillus subtilis, dupa procedeul submers, discontinuu si continuu. B. BIOCINETICA PRODUCERII -AMILAZEI:

Obtinerea cu regularitate a sarjelor de culturi cu un continut ridicat in -amilaza depinde de starea fiziologica a microorganismului utilizat ca inocul si de parametrii de biosinteza: temperatura, pH, agitare, rata de aerare, durata cultivarii, caracteristicile fizico-chimice ale mediului nutritiv. a) Particularitati morfo-fiziologice corelate cu potentialul productiv al tulpinilor de Bacillus subtilis: Bacillus subtilis este un germen GRAM+, sporogen, strict aerob, saprofit, posedand un pronuntat pleomorfism. Sporul este termorezistent (rezista 40 de minute la 0,5 atm sau cateva ore la 1200C caldura uscata). Temperaturile optime de dezvoltare sunt cuprinse intre 28-400C, iar pHul optim este 6,0-8,0. Este sensibil la bacteriofagi 2-DNA, F,AL, GAI, SP50, PBSI. Tulpinile de Bacillus subtilis prezinta fenomenul de disociere RS,P,M, in anumite conditii. Forma R tipica este activa cu potential enzimatic ridicat, in timp ce formele S,P,M sunt slab active sau inactive (Fig.1.). Formele S,P,M se pot deosebi intre ele si dupa viteza si intensitatea sporularii, fiind posibila si formarea variantelor asporogene. Deoarece disocierea RS,P,M este insotita de pierderea capacitatii productive, s-au elaborat procedee de limitare a variabilitatii tulinilor de Bacillus subtilis. Modalitatile de limitare a variabilitatii si de stabilizare genetica sunt: selectia coloniilor de tip R inalt productive, supunerea celulelor provenite din acestea unui soc termic, liofilizarea si conservarea culturilor stoc la 4 0C, utilizarea la fiecare sarja a unui inocul preparat dintr-o fiola liofilizata, evitarea replicarilor repetate. Folosirea unui inocul de calitate asigura obtinerea cu regularitate a productiilor ridicate de -amilaza[4].

Fig.1. Biosinteza -amilazei de catre diferite forme ale producatorului B.subtillis: 1-forma R; 2-forma R in amestec cu forma M.

b) Dinamica acumularii -amilazei in culturile submerse: Biosinteza substantelor biologic active este corelata cu starea fiziologica in care se afla microorganismul in timpul fazelor ciclului sau biologic. Trofofaza in care caile amfibolice functioneaza preponderent energetic (respiratie) si plastic (acumulare de biomasa) corespunde metabolismului primar. Idiofaza este starea fiziologica in care caile metabolismului primar sunt comutate la biosinteza produsilor secundari metabolici, enzime, antibiotice, etc. La bacteriile aerobe, sporogene, biosinteza enzimelor extracelulare este cuplate cu procesul maturarii sporilor. Biosinteza -amilazei in culturi submerse de Bacillus subtilis pe medii naturale continand amidon, incepe in timpul fazei log, inregistreaza o crestere brusca in faza de post-log, moment in care apar sporii in stadiul 0-1 si atinge palierul in cursul fazei

stationare. Aproape simultan cu biosinteza -amilazei are loc biosinteza -glucanazei care se declanseaza la sfarsitul fazei log, creste constant in prima parte a fazei stationare si inceteaza spre sfarsitul acesteia. c) Influenta pH-ului: Deoarece enzimele sunt proteine functionale, proprietatile si biosinteza lor sunt puternic influentate de valorile de pH. Valorile pH-ului care au ca efect limitarea fenomenului de disociere sunt cuprinse intre 6,5-7,5 reflectandu-se prin acumularea cantitatilor maxime de -amilaza in mediile de cultura. In timpul biosintezei -amilazei, utilizand medii de cultiura in formula carora se folosesc subproduse si produse din industria alimentara (srot de floarea-soarelui, tarate de grau, malai), pH-ul natural 6,2-6,5 are in primele faze o usoara tendinta de scadere, dupa care se inregistreaza o crestere progresiva pana la valori cuprinse intre 7,5-8. Valorile pH-ului mediului de cultura inainte si dupa procesul de biosinteza conditioneaza biosinteza si acumularea -amilazei. Rezulta ca exista un pH optim de biosinteza a enzimei si un pH de stabilitate maxima a enzimei. d) Influenta temperaturii si duratei de incubare asupra biosintezei -amilazei: Temperatura la care se efectueaza biosinteza este un factor esential pentru formarea si acumularea in cantitate maxima a enzimei. Ea influenteaza viteza de dezvoltare a microorganismului, rata disocierii, viteza de formare a enzimei si viteza de inactivare a enzimei. Ca si in cazul pH-ului, exista o temperatura optima de crestere a microorganismului la care rata de disociere este minima, cuprinsa intre valorile 32-37 0C care coincide si cu temperatura optima de biosinteza a enzimei, iar temperatura de inactivare rapida a enzimei este mult superioara, mai mare de 80 0C. Durata incubarii trebuie stabilita in asa fel incat procesul de biosinteza sa fie intrerupt in momentul atingerii palierului sau a unei activitati rezonabile pentru evitarea consumului nejustificat de energie si timp (fig.2). Procesul de dezvoltare a microorganismului este puternic exogenic. Temperatura se mentine in limitele optime prin insuflare de aer rece sterilizat si prin termostatarea bioreactorului cu o manta de apa.

Fig.2. 1-influenta duratei incubarii; 2- influenta temperaturii asupra -amilazei

e) Influenta ratei de aerare si vitezei de agitare asupra biosintezei -amilazei: Biosinteza -amilazei este un proces intens aerob, microorganismul utilizat ca agent producator al enzimelor avand necesitati fiziologice deosebite pentru oxigen. Oxigenul insuflat odata cu aerul sterilizat nu poate fi utilizat direct in faza gazoasa, ci numai ca oxigen solvit. Necesarul de oxigen solvit depinde de microorganism si mai ales de faza de dezvoltare in care se afla, intensitatea maxima de respiratie situandu-se in timpul fazei logaritmice. Cantitatea de oxigen solvit necesara este cu atat mai mare cu cat durata de generatie este mai mica, aerarea 8

trebuind sa asigure instantaneu saturarea cu oxigen a mediului. In acest scop, bioreactoarele sunt echipate cu sisteme de agitare eficiente pentru asigurarea unui transfer de masa al oxigenului cat mai bun. Aerul sterilizat in prealabil se insufla sub o usoara suprapresiune pentru prevenirea contaminarilor. Cerintele totale de oxigen in timpul biosintezei -amilazei au fost determinate pentru Bacillus subtilis NRRL-B3411 si estimate la 120mMO2/l/h, iar pentru Bacillus subtilis NCIB 8646 la 18mMO2/l/h, demonstrand mari variatii ale necesarului de oxigen pentru tulpini diferite ale aceluiasi gen. f) Influenta caracteristicilor fizico-chimice ale mediului nutritiv de biosinteza: Mediile de cultura utilizate pentru biosinteza enzimelor trebuie sa contina in diferite raporturi optime sursa de carbon si sursa de azot, care pot juca rol de indulcitori ai enzimelor, precursori, cofactori si microelemente. Productia de enzime a unei tulpini variaza mult in functie de mediul utilizat. Bacillus subtilis NRRL-B3411 produce considerabil mai multa proteaza neutra decat proteaza alcalina sau -amilaza, dar cand este cultivat pe un mediu de faina de peste, productia de proteaza neutra este redusa in timp ce productia de proteaza alcalina este ridicata. Mecanismele de inductie ale biosintezei -amilazei pe medii sintetice par a fi identice si pentru mediile naturale, totusi activitatea amilolitica maxima se obtine pe medii naturale continand amidon si extract de porumb. Biosinteza -amilazei este puternic indusa in prezenta amidonului in mediile de cultura, el fiind substratul natural al enzimei. Maltoza, lactoza si galactoza favorizeaza de asemenea acumularea -amilazei. Prezenta glucozei in mediul de cultura are un efect puternic represor, inhiband partial sau total biosinteza -amilazei. Biosinteza este inhibata de anaerobioza si de substantele care decupleaza procesul de fosforilare oxidativa (2,4 dinitrofenol). Pe langa sursa de carbon care este si inductor specific pentru -amilaza, sursa de azot are o importanta deosebita sub raport cantitativ si calitativ. Se pot utiliza ca surse de azot ingrediente naturale ca: srot de floarea-soarelui, srot de soia, extract de porumb. Bacillus subtilis este capabil sa utilizeze proteinele, aminoacizii si chiar azotul amoniacal. Utilizarea sarurilor acidului azotos si azotic depinde de capacitatea fiecarei tulpini de a reduce nitratii si nitritii pana la NH4+. S-a observat ca mediile care contin ca ingrediente majore de amidon si fosfati de amoniu induc cel mai puternic biosinteza enzimelor amilolotice si proteolitice. Caracterul puternic inductor al ionilor amoniu si calciu s-ar datora rolului important pe care il joaca in biosinteza acidului dipicolinici. Acidul dipicolinic (prezent sub forma de sare de calciu in spori), induce la randul sau formarea presporului, moment in care are loc excretia maxima de -amilaza, proteaza, -glucanaza. Ionii de Mn++ si Ca++ in concentratii oligodinamice limiteaza disocierea, stimuleaza sporularea si stabilizeaza activitatea enzimei. Proprietatile fizico-mecanice ale mediului de cultura, care prezinta interes sunt: vascozitatea, tendinta de spumare, capacitatea tampon, viteza de filtrare, usurinta recuperarii, randamentul si calitatea enzimelor recuperate.

Vascozitatea mediului de cultura influenteaza consumul de energie necesar agitarii mecanice, tendinta de spumare, consumul de antispumant, capacitatea tampon. Substantele proteice confera mediului de cultura o capacitate tampon ridicata, excluzand necesitatea corectarii pH-ului la valoarea optima in timpul biosintezei. Cresterea vascozitatii mediului de cultura are ca efect o scadere accentuata a ratei transferului de oxigen, producand perturbari importante ale procesului de biosinteza in conditiile utilizarii germenilor aerobi. Viteza de filtrare a mediilor de cultura dupa biosinteza enzimelor este un factor important in fazele de prelucrare pentru obtinerea preparatelor enzimatice purificate. Insasi calitatea enzimelor recuperate este conditionata de compozitia mediului de biosinteza. Enzimele precipitate din medii continand faina de peste-cereloza au activitati specifice inalte, fiind de consistenta solida, gumoase, brun inchise, in timp ce enzimele obtinute din medii continand faina de soia-amidon sunt solide, pufoase, de culoare deschisa, cu activitati specifice mai mici. In ultimul timp s-a studiat dinamica biosintezei -amilazei cu tulpini de Bacillus subtilis in culturi submerse continui, in conditii chemostatice. In conditii chemostatice, la viteze ale fluxului de dilutie cuprinse intre 0,05-0,015 h-1, activitatea amilazei se mentine un timp oarecare la nivel ridicat, apoi scade pana la disparitie pe parcursul experientei. Scaderea activitatii -amilazei si proteazei in conditiile cultivarii continui comparativ cu dezvoltarea in sistem discontinuu a fost semnalata de o serie de cercetatori. Culturile continui sau realizat pe medii sintetice si naturale. Dupa 72 de ore, activitatea -amilazei scade pana la 10 U/ml si se mentine la acest nivel inca 50 de ore.Cel mai stabil nivel al sintezei -amilazei s-a observat la o viteza scazuta a ratei de dilutie, egala cu 0,05 h-1. La o astfel de viteza a fluxului, activitatea -amilazei scade de la 22,5 pana la 15,75 U/ml in 5 zile de la initierea procesului. Cu cat viteza fluxului de dilutie este mai mare, cu atat activitatea -amilazei descreste mai repede, scaderea fiind mai lenta in culturile continui pe medii naturale si brusca in culturile pe medii sintetice. Fenel coreleaza aparitia instabilitatii producerii -amilazei pe mediu sintetic in procesul continuu, cu cinetica neuniforma de sinteza a ARNm care specifica formarea -amilazei si sinteza insasi a -amilazei la una si aceeasi viteza de crestere. O alta cauza consta in neomogenitatea populatiei bacteriene care conduce la aparitia mutantelor neproductive in conditiile cultivarii continui. C. PURIFICAREA SI CARACTERIZAREA -AMILAZEI: Denumirea sistematica a -amilazei este -1,4-glucan 4-glucano-hidrolaza si catalizeaza hidroliza legaturii -1,4-glucan din polizaharidele care contin mai mult de trei unitati de Dglucoza -1,4 legate (amidon, glicogen, oligo si polizaharide inrudite). -Amilaza bacteriana a fost descrisa pentru prima data in anul 1946. In literatura exista mai multe procedeea de purificare pentru -amilaze din B.subtillis, dar cele mai multe dintre aceste procedee au fost considerate prea lungi si prea complicate pentru scopuri industriale. 10

In continuare se descriu metode de purificare si caracterizarea -amilazei obtinuta dintrun amestec brut de exoenzime produse de B. Subtillis NRRL-B 3411. Cele trei enzime predominante sunt: o proteaza neutra, o proteaza alcalina si o -amilaza. Amilaza din B.subtillis a fost clasificata drept o -amilaza de lichefiere, dar unele tulpini de B.subtillis produc un tip diferit de -amilaza, o amilaza de zaharificare care hidrolizeaza amidonul producand considerabil mai multa glucoza decat amilaza de lichefiere. Cele doua tipuri de B.subtillis sunt denumite B.subtillis var. amylolichefaciens si B.subtillis var. Amylosacchariticus, desi exista unele dubii in clasificarea anumitor organisme producatoare de amilaza ca B.subtillis. amilaza din B.subtillis NRRL-B 3411 prezinta interes intrucat s-a aratat ca proteaza alcalina produsa de microorganism este aceeasi cu Subtilizina Novo si Nagarse, iar acelasi germen produce de asemenea o proteaza neutra activa. Izolarea -amilazei din B.subtillis NRRL-B 3411 s-a efectuat conform procesului descris in continuare. Amestecul enzimatic brut (100g) a fost suspendat in 1000 ml apa distilata rece sub agitare la 50C. S-a adaugat lent 950 ml acetona rece (50C) sub agitare, iar dupa continuarea agitarii inca 10 minute, s-a colectat prin filtrare precipitatul. Precipitatul a fost dizolvat in 500 ml acetat de calciu 0,1% si 0,2%clorura de sodiu. Solutia a fost incalzita la 750C timp de 30 minute si apoi racita rapid pe baie de gheata. pH-ul a fost ajustat la 6,4 cu acid acetic diluat si s-a adaugat DEAE celuloza (in forma acetat pH=6,4 greutate uscata 50g). Suspensia a fost agitata 10 minute si celuloza indepartata prin filtrare. Filtratul s-a dializat contra solutiei de acetat de calciu 0,1% la 50C peste noapte si clarificat prin centrifugare (volum 560 ml). O parte din aceasta solutie (350 ml) a fost precolata pe o coloana 3,5x10 cm de hidroxiapatita in acetat de calciu 0,1% la 50C. Coloana a fost spalata cu acetat de calciu 0,1% si amilaza eluata apoi cu fosfat de potasiu 0,1M, pH=7. Solutia de amilaza a fost dializata contra solutiei de acetat de calciu, peste noapte la 50C; centrifugata pentru indepartarea solidelor si apoi liofilizata, obtinandu-se 1,56 g de solid alb. Intrucat proteaza neutra se adsoarbe pe hidroxiapatita odata cu -amilaza si cele doua enzime sunt eluate simultan din coloana, este deci necesar sa se indeparteze proteaza neutra. Cea mai potrivita metoda de purificare a amilazei a fost fractionarea cu un solvent in prezenta acetatului de calciu. Amilaza precipita atunci cand concentratia solventului creste la 45-50%, in timp ce proteazele nu precipita decat in momentul cand concentratia solventului ajunge la 67%. Proteazele reziduale neutra si alcalina au fost inactivate prin incalzirea solutiei de enzima la 750C timp de 30 minute, -amilaza fiind suficient de termostabila la acest tratament. Cea mai mare parte a pigmentului contaminant, care pare a fi de natura polizaharidica sau proteica cu greutate moleculara mare, a fost indepartata prin tratare cu DEAE celuloza la pH=6,4..7,0 iar rasina indepartata prin filtrare. Activitatea specifica a enzimei a fost cuprinsa intre 3 105 - 6 106 U/g cu o recuperare de 60%. Tratamentul termic inactiveaza proteaza neutra in proportie de 100% si numai 98% din proteaza alcalina. Proteaza alcalina reziduala este inactivata prin adaus de diizopropilfluorofosfat [4] (D.F.P) .

11

4. Reactii si mecanisme
A. PROPRIETATI GENERALE ALE -AMILAZEI DIN BACILLUS SUBTILLIS -Amilaza din B.subtillis are o stabilitate termica remarcabila in prezenta Ca2+ 0,01M si NaCl 0,1 M, fiind o metaloenzima (fig.3.). dupa 45 de minute la 700C, -amilaza retine 81% din activitatea initiala, proteaza alcalina 1% si proteaza neutra 0%. Atunci cand s-a lucrat cu enzima bruta s-a constatat ca aceasta se comporta similar cu enzimele mai purificate. -Amilaza de B.subtillis are un domeniu larg de stabilitate la pH in prezenta Ca2+0,01M si NaCl 0,1 M. Enzima retine practic intreaga activitate de la pH 5,5 la pH 9,5 indiferent de tamponul utilizat. pH-ul optim de activitate este 6,0 iar temperatura optima de activitate este 600C (fig.4.).

Fig.3. Efectul ionilor de Ca2+asupra stabilitatii (700C) activitatii -amilazei

Fig.4. Efectul pH-ului si temp. asupra -amilazei

Pentru a stabili caracterul dextiniogen sau zaharogen al -amilazei din B.subtillis NRRL-B 3411 s-a studiat efectul enzimei asupra puterii de complexare a iodului de catre amidon, randamentul in zaharuri reducatoare si glucoza la hidroliza amidonului, hidroliza ciclodextrinelor si reactia imunologica cu antiserurile pentru amilazele de lichefiere si zaharificare. Amilaza de lichefiere din B.subtillis NRRL-B 3411 nu are actiune asupra ciclodextrinelor, in timp ce amilaza de zaharificare este activa pentru substratul ciclic, deschizand ciclul si punand in libertate moleculele de glucoza. -Amilaza din B.subtillis NRRL-B 3411 este practic lipsita de zinc, in timp ce -amilaza din B.subtillis var. Amylolichefaciens contine zinc. Aceste doua tipuri de amilaze difera dupa capacitatea de retinere a zincului in dializa contra tampoanelor nechelatizante, desi enzima nu difera din alte puncte de vedere. Zincul se poate indeparta usor cu agenti chelanti: EDTA, 8-hidroxi-chinolina, citrati. Prin indepartarea zincului,

12

macromolecula enzimei se scindeaza in doua parti egale, omogene electroforetic, ceea ce a sugerat faptul ca -amilaza produsa de B.subtillis este un dimer, la care cele 2 componente sunt unite printr-un atom de zinc. In prezenta Ca2+ -amilaza este total rezistenta la atacul proteazelor, insa in lipsa acestuia devine susceptibila la proteoliza. B. SUBSTRATUL SI MECANISME ALE ATACULUI ENZIMATIC Amidonul este un substrat natural al -amilazei. Amidonul nu este o substanta unitara, ci un amestec de doua tipuri de polizaharide : amiloza si amilopectina. Amiloza este formata din polizaharide ce contin resturi de glucoza unite numai prin legaturi 1,4- -glucozidice. Gradul de polimerizare al acestora variaza intre 100 si 2000. Macromoleculele de amiloza, datorita legaturilor 1,4- -glucozidice, au o structura helicala cu spire formate din 6 molecule de glucoza. Spirele formeaza un tub consolidat prin legaturi de hidrogen, avand un diametru de 5. In lumenul tubului pot patrunde molecule si atomi straini care daca au dimensiuni potrivite dau cu amiloza combinatii de incluziune. Iodul poate patrunde in lumenul tubului de amiloza unde vine in contact numai cu atomii de hidrogen, rezultand o combinatie de culoare albastra. Macromoleculele de amiloza cu grad inalt de polimerizare prezinta locuri de ramificare, reduse insa la numar, ramificari date de legaturi 1,3- -glucozidice. Macromoleculele de amilopectina sunt ramificate fiind formate din lanturi amilozice scurte (18-26 resturi de glucoza), unite prin legaturi 1,6--glucozidice, numite si legaturi izomaltozice. Gradul de polimerizare al macromoleculelor de amilopectina este cuprins intre 6000-36000. Amidonul este principalul hidrat de carbon de rezerva din regnul vegetal, biosinteza lui are loc in celula vie din derivati ai glucozei cu legatura -glucozidica preexistenta prin reactii anergonice de transglucozilare catalizate de enzime specifice. a). Actiunea -amilazei pure asupra amilozei si amilopectinei: -Amilaza catalizeaza hidroliza, la intamplare, a legaturii -1,4-glucozidice din macromoleculele de amiloza si amilopectina. Afinitatea enzimei este insa mai mare pentru legaturile din interiorul macromoleculelor decat pentru legaturile de la periferie, motiv pentru care se mai numeste endoamilaza. In figura 5 se indica legaturile hidrolizate preferential si legaturile rezistente la atacul amilazei din B.subtillis asupra amilozei. Cercetari recente au indicat diferite tipuri posibile de atac cu -amilaza in cazul substratului linear: atac monocatenar, atac multiplu sau atac multicatenar (fig.6.). Succesiunea evenimentelor in cazul atacului multiplu decurge astfel: a- un segment intern al amilozei se leaga de zona activa a enzimei, producandu-se scindarea hidrolitica in punctul S; b- dupa scindare, fragmentul care contine capatul nereducator nou expus difuzeaza in afara, iar fragmentul ramas este mai puternic legat de portiunea A a enzimei, ramanand mai mult timp pe aceasta suprafata; c- substratul se aranjeaza in zona activa si se produce un nou eveniment hidrolitic (fig.7.); 13

Fig.5. Modul de actiune al -amilazei din B.subtillis asupra amilozei

Prin utilizarea concentratiilor mari de -amilaza, amiloza este hidrolizata complet la un amestec de 13% glucoza si 87% maltoza. Amilopectina, in aceleasi conditii este hidrolizata complet la un amestec format din 19% glucoza, 72% maltoza si 8-9% izomaltoza. Toate legaturile -1,6-glucozidice din ramificatii se regasesc in izomaltoza. Datorita atacului preferential al legaturilor 1,4- -glucozidice din interiorul macromoleculelor de amiloza si amilopectina, ca urmare a afinitatii mai mari a enzimei pentru amiloza si amilopectina decat pentru fractiunile mici ale acestora, in prima etapa a hidrolizei are loc o fragmentare rapida a macromoleculelor de amiloza si amilopectina la fractiuni cu greutati moleculare mult mai mici care constituie dextrinele. In etapele urmatoare dextrinele sunt hidrolizate complet numai la concentratii mari de -amilaza, aparand pe parcurs oligozaharide diferite de maltoza si izomaltoza ca: 63--glucozilmaltotrioza, 62--glucozil maltoza, 62--maltozil maltotrioza (fig.8). Cand concentratia enzimei este mica (ca in preparatele brute comerciale) hidroliza dextrinelor continua foarte lent si chiar prin adaugare de enzima nu se produce intensificarea procesului. Stoparea hidrolizei nu se datoreste afinitatii scazute a enzimei pentru substrat, ci datorita faptului ca dupa dizolvare in apa, macromoleculele de amiloza si amilopectina se asociaza formand agregate submicroscopice rezistente la atacul enzimatic, iar pe de alta parte, maltoza care apare in mediul de reactie actioneaza ca inhibitor necompetitiv al -amilazei[4].

14

Fig.7. Mecanismul atacului multiplu

Fig. 6. Tipuri de atac cu -amilaza a substratului linear

Fig.8. Dextrine obtinute prin -amiloliza amilopectinei cu: 1- amilaza din saliva umana, pancreas de porc si A.oryzae; 2- amilaza din malt; 3- -amilaza din B.subtillis

b). Actiunea -amilazei asupra amidonului: Amidonul nativ de diferite proveniente se prezinta sub forma de granule de marimi si forme diferite. Studiile efectuate in lumina polarizata si spectrele de interferenta cu raze X au demonstrat ca granula de amidon se comporta ca un cristal. Ea este formata din cristale aciculare, dispuse radiar in sferite . Cristalul este format din lanturile de amiloza pura si lanturile scurte de amiloza din amilopectina, care se intrepatrund. Granulele de amidon nativ, in vitro sunt atacate foarte lent de amilaze datorita structurii lor foarte dezordonate, iar atacul se produce numai in zonele necristaline. Prin incalzirea in apa a granulelor de amidon, structura cristalina este partial distrusa, o mare parte din lanturile de amiloza devin libere, cristalul transformandu-se intr-o particula uriasa care capteaza in reteaua sa de lanturi amilozice o cantitate importanta de apa. In acest moment se produce gelificarea suspensiei de amidon, vascozitatea crescand foarte mult chiar la concentratii mici de amidon. Sub actiunea -amilazei vascozitatea gelului de amidon scade brusc, iar capacitatea de complexare a iodului dispare repede, culoarea albastra trece la violet, rosu, incolor corespunzatoare amilodextrinei, eritrodextrinei si acrodextrinei. Zaharurile reducatoare apar lent, in schimb se produc la inceput dextrine in cantitate mare. Aceste amilaze se numesc dextrinogene sau de lichefiere, iar hidroxilul glicozidic este eliberat prin hidroliza in pozitia .

15

5. Aplicatii industriale
Amilaza (diastaza), a fost obtinuta pentru prima data din bobul de orez sub forma unui extract apos de catre Kirchoff in 1811 [7]. Datorita proprietatilor sale in ceea ce priveste rezistenta la temperaturi inalte, activitatea intr-un domeniu larg de pH, marii capacitati de lichefiere a gelurilor de amidon, -amilaza bacteriana obtinuta din tulpini de Bacillus are o larga aplicabilitate in practica, in industria hidrolizatelor de amidon, berii, spirtului, textila, detergentilor, chimica, zootehnie, etc. Unele tari au organizat o puternica industrie producatoare de enzime. Astfel Japonia produce anual cca 11.000 t de -amilaza utilizand urmatoarele microorganisme: B.subtillis; B.amylolichefaciens; A.oryzae; A.niger. In practica sunt utilizate si -amilaze de natura fungica produse de specii ale genului Aspergillus (A.oryzae; A.niger). Aceste amilaze fungice sunt utilizate in practica la obtinerea siropurilor bogate in maltoza, in panificatie, industria berii, sucurilor de fructe. A. UTILIZAREA -AMILAZEI IN PANIFICATIE: Suplimentarea fainii cu -amilaza are ca efect intensificarea amilolazei si cresterea cantitatii de zaharuri fermentescibile in aluat, capabile sa sustina procesul de fermentare si deci formarea de gaze pe toata durata procesului tehnologic, la un nivel care sa asigure paine de calitate. Actiunea de zaharificare cea mai puternica o are -amilaza bacteriana, urmata de cea din malt si cea de origine fungica. Adaosul de -amilaza influenteaza: - proprietatile fizice ale aluatului, - activitatea microflorei. S-a stabilit ca adaosul de preparate amilolitice stimuleaza activitatea drojdiilor si bacteriilor din aluat, si anume creste numarul de celule de drojdie si se intensifica activitatea fermentativa a drojdiei si a microflorei bacteriene. Ca urmare, aluatul se maturizeaza mai repede si se creeaza posibilitatea reducerii duratei de fermentare a acestuia. - calitatea painii. Asupra calitatii paini, adaosul de -amilaza are influente multiple. El determina: o cresterea volumului datorita formarii unor cantitati mai mari de dextrine; o inchiderea culorii cojii datorita zaharurilor prezente in straturile exterioare ale aluatului care participa la procesul de caramelizare, sau la reactii Maillard ducand la formarea de melanoidine; o intensificarea aromei, o prelungirea prospetimii datorita cresterii cantitatii de amidon hidrolizat, respectiv a scaderii cantitatii de amidon care gelifica. Acesta sufera la coacere o gelificare mai completa decat in lipsa -amilazei, ca urmare a unei cantitati mai mari de apa disponibila, si la depozitarea painii este retrogdradat mai lent.

16

o marirea elasticitatii miezului - Dozele mari determina insa reducerea elasticitatii miezului si cresterea lipiciozitatii lui [3],[6],[7]. Valoarea acestor modificari este legata de provenienta enzimei si de cantitatea de enzima adaugata. B. UTILIZAREA -AMILAZEI IN INDUSTRIA BERII: Utilizarea preparatelor enzimatice pe baza de -amilaza se poate realiza in diferite etape ale procesului de fabricare a berii pentru obtinerea unor efecte dorite, ca de exemplu: - Utilizarea -amilazelor bacteriene pentru fluidificarea plamezii de cereale nemaltificate evita aparitia unui gust pronuntat de coji; - Utilizarea la brasaj a -amilazei bacteriene realizeaza o lichefiere a amidonului cu obtinerea de zaharuri fermentescibile, iar prin utilizarea -amilazei fungice se realizeaza o zaharificare a dextrinelor, ducand la cresterea fermentescibilitatii[3],[8]; C. UTILIZAREA -AMILAZEI IN INDUSTRIA SPIRTULUI: Principalele obiective tehnologice care se pot realiza cu ajutorul enzimelor amilolitice (care contin si -amilaza) de origine microbiana in etapa de zaharificare a materiilor prime pe baza de amidon din cadrul procesului de fabricare a etanolului sunt: - Imbunatatirea parametrilor de fierbere Adaugarea, inainte de fierbere, a unor preparate amilazice termostabile cu actiune termofluidificanta, care raman active pana la temperaturi de 90950C, face posibila gelificarea si fierberea amidonului la temperaturi si presiuni mai scazute, reducandu-se de asemenea durata fierberii si crescand randamentul in alcool; - Inlocuirea partiala a maltului in vederea reducerii consumului de malt. Enzima poate fi folosita in scopul lichefierii, a zaharificarii amidonului, sau pentru amandoua. - Inlocuirea totala a maltului care necesita pe langa prezenta -amilazei care se adauga in plamada pentru a favoriza fluidificarea si dextrinizarea amidonului, si prezenta amiloglucozidazei fungice pentru zaharificare[9].

17

Bibliografie
[1].http://ro.wikipedia.org/wiki/Enzim%C4%83 [2].Banu, C. si altii, 2000, Biotehnologii n industria alimentara, Ed.Tehnica, Bucuresti, [3].BIA [4].BPEM [5]. http://www.pcfarm.ro/dictionar.php?id=Amilaza [6].http://www.anamob.ro/anamobnews/news99.pdf [7].http://ciprianpopa.blogspot.com/2007/04/amilaze.html [8].http://www.gramatrading.ro/opencms/export/gramatrading/partners/novozymes/indu stria_berii/index.html_2063068895.html [9]. C., Boeriu, Biotehnologii in industria alimentara, Note de curs, 2007 [10]. http://crobm.iadrjournals.org/cgi/content/abstract/4/3/301 [11]. http://www.erj.ersjournals.com/cgi/reprint/7/5/941.pdf [12]. http://www.medicineword.com/alpha-amylase.shtml

18