UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS REPORTE: Prctica No.

2 Deshidrogenacion del cido Succnico LABORATORIO DE BIOQUMICA METABOLICA QUMICO FARMACUTICO BILOGO 502 EQUIPO: 6

INTEGRANTES: CABAAS RODRGUEZ JOSELINE LAGUNES VIRGEN ZULEIMA RAMOS AHUMADA EDITH RODRGUEZ RAMREZ JUAN IVN VAZQUEZ PEREZ MAYDELITH

CATEDRATICO: Q.F.B. MARGARITA MURILLO FIGUEIRAS

AGOSTO NOVIEMBRE 2013

ORIZABA, VER.

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Prctica No. 2 Deshidrogenacion del cido Succnico. Objetivo. El alumno comprender y demostrar mediante un ensayo colorimtrico la conversin de Succinato a Fumarato, por la accin de la enzima Succinato Deshidrogenasa utilizando azul de metileno como aceptor de electrones e identificara esta reaccin como parte del ciclo de Krebs. Fundamento. El ciclo de Krebs (de los cidos tricarboxlicos o del cido ctrico) es una va metablica presente en todas las clulas aerobias, es decir, las que utilizan oxgeno como aceptor final de electrones en la respiracin celular; el ciclo de Krebs ocurre en las mitocondrias de las clulas eucariotas y en el citoplasma de las clulas procariotas. En los organismos aerobios las rutas metablicas responsables de la degradacin de los glcidos, cidos grasos y aminocidos convergen en el ciclo de Krebs, que a su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO2. La enzima Succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del cido succnico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidacin del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado Redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.

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Las reacciones restantes del ciclo oxidan al succinato a oxalacetato, ste al regenerarse, permite otra vuelta del ciclo. Para que eso sea posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un carbonilo. Es la nica reaccin en el ciclo asociada a un grupo prosttico flavnico (FAD) mediante el cual los equivalentes de reduccin del succinato son transferidos a la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En general la funcin bioqumica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida alcoholes a aldehdos o cetonas. El malonato es un fuerte inhibidor competitivo de la enzima. Un inhibidor competitivo es una sustancia cuyas molculas son semejantes en composicin y morfologa a las de ciertas sustancias activas. stas son capaces de unirse a ciertos receptores de las clulas y provocar un efecto. Aqullas (No competitivas) se unen a los receptores sin provocar efecto alguno, as que 'compiten' con las molculas activas e indirectamente actan disminuyendo las oportunidades de stas. Es importante mencionar que en los inhibidores competitivos, se aumenta el sustrato mientras se elimina el competidor; mientras que en las no competitivas, se forma el complejo pero no tan fuerte, lo cual da lugar a que no se elimine y permanezca dentro del complejo.

No

accio a

Materiales y reactivos. 4 tubos de ensayo Pipeta graduada de 5ml Gradilla Bao mara Termmetro Parrilla elctrica Azul de metileno 0.1% cido Succnico cido Malnico Glucosa Levadura Aceite Mineral o de inmersin.

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Tcnica. 1. Se etiquetan 4 tubos de ensayo A, B, C y D. 2. Aadir 2 gotas de azul de metileno 0.1% a cada tubo. Sostener con los dedos cada tubo y mezclar. Contine agregando la tintura de azul de metileno gota a gota mezclando al agregar hasta que la solucin se torne de un azul ligero. 3. Sostenga cada tubo haciendo in ligero ngulo. Verter 1ml (aproximadamente) de aceite de inmersin haciendo bajar desde el borde, formando una pelcula. 4. Colocar los tubos a bao mara a 37C durante 40minutos. 5. Observar cambio de color.

Observaciones. Tabla 1.- Modo de preparacin de los tubos para la prctica B C A Levadura Levadura Glucosa Glucosa ADM ADM ADM H2O Ac. Succnico Ac. Malnico Aceite Aceite Aceite

D Levadura Glucosa ADM Suc/Mal Aceite

NOTA: La levadura se aadi al final para que las reacciones se llevaran a cabo al mismo tiempo y no hubiera variacin en los resultados. Se rotularon 4 tubos de ensayo y a cada tubo se aadi lo indicado en la Tabla 1. Cabe mencionar que se aade Azul de Metileno para hacer una deteccin cuantitativa del estado de oxidacin-reduccin. Este colorante es un aceptor electrnico artificial coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Es importante tener en cuenta que se utiliza este colorante debido a que su valor estndar de Redox es de mientras que el de la reaccin de Succinato a Fumarato es de lo cual indica que el azul de metileno es ms positivo, lo que indica que es un mayor atractor de electrones.

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Los tubos se homogenizaron una vez que se aadi la levadura; posteriormente se aadi aceite a modo de formar una pelcula ya que cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxgeno del aire se reoxida tomando la coloracin azul y formando perxido de hidrogeno, por esta razn el sistema se asla mediante la capa de aceite aadido. Se llev a bao mara durante 40minutos controlando la temperatura a 37C; durante este proceso se pudo visualizar el proceso de fermentacin, por medio del desprendimiento de CO2, excepto en el tubo A. Pasado los 40 minutos se pudieron observar los resultados finales.

Esquema.

Fig. 1 Tubos despus de agregarse los reactivos y previo al calentamiento.

Fig.2 Decoloracin despus de iniciado el calentamiento.

Fig.3 Resultados finales

Resultados. Tabla 2.- Resultados esperados segn la bibliografa. CONTENIDO COLOR INICIAL Control Azul A c. Succnico Celeste B c. Malnico Celeste C c. Celeste D Suc/Malnico

COLOR FINAL Azul Azul cielo Azul Anillo azul cielo

CODIGO DE CRUCES ++++ + +++ ++

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Tabla 3.- Resultados finales obtenidos por tubo. CONTENIDO COLOR INICIAL Control Azul A c. Succnico Celeste B c. Malnico Celeste C c. Suc / Celeste D Malnico

COLOR FINAL Azul Azul cielo Anillo azul Anillo azul cielo

CODIGO DE CRUCES ++++ + + +

TUBO A: No existi ninguna reaccin debido a que solo era un patrn de referencia. TUBO B: Se pudo comprobar que se efectu la Deshidrogenacion del cido succnico debido a la decoloracin del complejo Succinato-SDH; se sabe que se efectu esta reaccin ya que se aument el sustrato. TUBO C: Tericamente no debi de existir decoloracin en el complejo, puesto que la enzima SDH es especfica para el cido Succnico pero no para el c. Malnico. TUBO D: Segn la bibliografa se esperaba obtener una reaccin no competitiva ya que se debi formar un complejo que es tan fuerte la unin enzima-sustrato que no se puede eliminar el competidor (c. Malnico), sin embargo, se obtuvo una reaccin competitiva ya que se produjo una decoloracin lo que indica que se elimin el competidor.

Conclusin. Con la realizacin de esta prctica se pudo demostrar la Deshidrogenacion del cido succnico por accin de la enzima Succinato Deshidrogenasa puesto que el azul de metileno actu como el receptor de hidrgenos sobre el FAD al haber ocurrido la reduccin del indicador Redox.

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