DIVISIN DE BIOTECNOLOGA. ANLISIS INSTRUMENTAL. PRCTICA No.

3 MTODOS CROMATOGRFICOS

INTRODUCCIN. La cromatografa es un conjunto de tcnicas que se utilizan para la separacin de los componentes presentes en una muestra, en funcin de la afinidad que presenten estos por la fase estacionaria y la fase mvil. Los principios cromatogrficos en los que se fundamenta son: Cromatografa de adsorcin. se lleva a ca!o por la interaccin de tipo d!il que presentan las sustancias con una fase estacionaria como puentes de "idrgeno, fuerzas de #an der $aals o interacciones electrostticas. Cromatografa de intercam!io inico. donde los componentes de la muestra interaccionan por atraccin de cargas elctricas opuestas en una resina que contiene a un in intercam!ia!le. %e divide en resinas aninicas y catinicas Cromatografa de e&clusin. la separacin ocurre por el tama'o de las molculas en una matriz o fase estacionaria de tama'o de poro especfico. (&iste la filtracin en gel y la e&clusin molecular Cromatografa de particin. la separacin ocurre por la afinidad que tengan los componentes de la muestra entre la fase estacionaria y la fase mvil en funcin de la polaridad Cromatografa de afinidad. la separacin ocurre en funcin de afinidad que tengan las diferentes sustancias de una muestra con respecto a la fase estacionaria. Laminar. la fase estacionaria se encuentra en una lmina delgada constituida por un soporte inerte al cual se ad"iere una pelcula delgada de la fase estacionaria. %e divide en cromatografa en papel y en capa fina *+"in Layer C"ormatograp"y, (n columna. la fase estacionaria se encuentra empaquetada en una tu!o o columna "ec"o de material inerte. -nstrumental. son equipos que incluyen accesorios o aditamentos acoplados a una columna as como un equipo que identifica y mide concentraciones de los componentes de la muestra que "as sido separados. %e divide en Cromotografia de liquidos de alta resolucin *.ig" )erformance Liquid C"romatograp"y, .)LC, y cromatografa de gases */as C"romatograp"y,

)or el tipo y estructura de la fase estacionaria, la cromatografa se divide en:

)ara determinar la eficiencia de separacin que tiene una columna o una lmina con respecto a los componentes de una muestra se denota con un trmino llamado Coeficiente de 0istri!ucin 123 y se define como la relacin que descri!e la cantidad de soluto retenido por la fase estacionaria entre el acarreado por la fase mvil. 2 4 Cfe 5Cfm %i se realiza una cromatografia de particin el coeficiente se denomina Coeficiente de )articin 2p 4 Cs5Cm o concentracin del soluto en la fase estacionaria *stationary, entre la concentracin del soluto en la fase mvil *movil, 6l efectuar una cromatografa de intercam!io inico el coeficiente se denomina Coeficiente de 0istri!ucin 12d3 y se define como cantidad del ion en la resina5g resina seca 1Crs3 entre la cantidad del ion en la disolucin *o fase mvil, por mL de disolucin. 1Cfm3 2d 4 Crs5Cfm (n una cromatografa laminar es de suma importancia los factores de retencin 17f3 que determinan la afinidad que tiene cada componente de una muestra entre la fase mvil y la fase estacionaria. %e calcula por: 7f 4 d6 5 d8 o distancia recorrida del componente 1d63 entre la distancia recorrida por la fase movil 1d83 )or 9ltimo, el desarrollo de una cromatografa laminar se conoce como 1corrimiento o desarrollo3 cromatogrfico y el producto final es un cromatogrma revelado. (n cam!io cuando la alcuota de una muestra recorre la columna, efectundose la separacin de sus componentes se conoce como (L:C-;<, o!tenindose al final de la misma un (L:=0> OBJETIVOS. 7ealizar la una cromatografa laminar por medio de cromatografa en papel. (fectuar una cromatografa de intercam!io inico por medio de la remosin de la dureza total en una muestra de agua por medio de una resina de intercam!io catinico. 7ealizar una cromatografa de adsocin mediante la eliminacin de colorantes de una muestra en una columna de car!n activado Calcular el 7f de cada componente de la muestra de colorantes por cromatografa laminar. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS . )apel filtro <o. ? Capilar 8ec"ero o lmpara de alco"ol +ren de tincin de /ram #idrio de reloj Cmara de corrimiento 6cetona 6lco"ol al CDE Fureta de ?A mL %oporte universal .idr&ido de %odio G.A< )ro!eta de @GG mL Conductmetro 8atraz erlenmeyer de @?A mL Bi!ra de vidrio )izeta con agua destilada Car!n activado 7esina de intercam!io catinico <egro de (riocromo + Fuffer de amonio para dureza de p. @G #aso de precipitados de @GG mL Hcido clor"drico G.A< )ipeta de A o @G mL )otencimetro para p. )inzas para !ureta

METODOLOGA y RESULTADOS. A C!o"#$o%!#&'# L#"()#!. C!o"#$o%!#&'# *) +#+*,. 6@. Calentar a la flama un capilar "asta que adquiera un color anaranjado. 6?. Ialar por am!os e&tremos el capilar para la formacin de una micropipeta. 6J. 8ezclar en relacin @:@ cristal violeta y safranina en un vidrio de reloj 6K. Colocar a la altura de @ cm so!re una lmina de papel filtro una muestra de la mezcla de colorantes, dejar secar y repetir A veces para concentrar la muestra. 6A, Colocar en una cmara de corrimiento previamente adicionada con la fase mvil, los soportes de acero ino&ida!le para la colocacin de la muestra 6D. Colocar las lminas en forma inclinada y efectuar el corrimiento "asta que la fase mvil "aya cu!ierto la totalidad de la fase estacionaria 6L. Calcular el factor de retencin de la safranina y el cristal violeta B C!o"#$o%!#&'# *) -o,.")#. E"+#/.*$#"(*)$o. F@. 6rmar el soporte universal y las pinzas para !ureta F?. Colocar una malla de fi!ra de vidrio previamente "umedecida en el fondo de cada columna colocndola en el fondo de la misma con la ayuda de una varilla de vidrio. cromatogrfica *!ureta,,

FJ. 0isolver la fase estacionaria correspondiente en la fase mvil y verterla poco a poco en la columna previamente colocada en el soporte correspondiente, (#-+67 que se seque la misma para no generar agrietamiento, FK. 0ejar una altura li!re de M cm y una altura de solvente de @ cm como mnimo. C C!o"#$o%!#&'# 0* A01o!-(2). C@. 6 @G ml de agua destilada adicionar una gota de cristal violeta C?. 6dicionar A mL de la solucin colorida y posteriormente @A mL de agua destilada. CJ. Colectar el eludo en un vaso de pp y o!servar la coloracin del mismo. CK. 7egenerar el car!n activado con un c"oque de p., primero adicionando ?A mL de <a>. o.A < e inmediatamente despus adicionar ?A mL de .Cl G.A < y un enjuague final con @GG mL de agua destilada. D C!o"#$o%!#&'# 0* I)$*!-#"3(o C#$(2)(-o. 0@. 6 una muestra de agua de la llave llevar a ca!o la prue!a cualitativa de la dureza, adicionando a ?A mL de muestra G.A mL de !uffer para dureza p. @G y una pizca de <egro de (ricromo +, verificando coloracin violeta. 0?. 6dicionar a la columna de intercam!io catinico ?A mL de muestra de agua de la llave y posteriormente @G mL de agua destilada, colectando al final un volumen de ?A mL de eludo. 0J. 7epetir el paso de (@ pero a"ora verificando la nulidad de la dureza, al o!tener una coloracin azul marino en el eludo 0K. 7egenerar la resina con ?A mL de .Cl G.A< y dejar reposar A min. (njuagar con @GG mL de agua destilada y verificar un p. de D a la salida de la columna CUESTIONARIO. @. (&plique la diferencia de separacin de los componentes de una muestra en una cromatografa de intercam!io inico, e&clusin molecular, adsorcin y particin. ?. NCmo se lleva a ca!o la adicin de la muestra en una cromatografa de frente mvil *anlisis frontal,, elusin y desplazamientoO J. (n la cromatografa laminar NPu significado se le da al factor de 7etencin 7fO K. NCul es la funcin de la saturacin de la fase estacionaria en una cromatografa laminarO A. 0efina los siguientes trminos: fase estacionaria, soporte, fase mvil y eludo. REFERENCIA BIBLIOGRFICA )ietrzyQ 0.I., BranQ C.$. *@CMJ, 1Pumica 6naltica3 (d. -nteramericana, 8&ico, 0.B. CrocQford ..0., 2nig"t %.F. *@CCL, 1Bundamentos de fisicoqumica3 (d. Continental, 8&ico 0.B.