Sunteți pe pagina 1din 9

1.

Etapele de obtinere ale preparatului microscopic permanent in microscopia optica Preparatul microscopic permanent este un model de examinare a unor celule, fragmente, tesuturi, organe, carora li s-au suprimat functiile vitale prin procese de fixare. Se obtine prin recoltare biologica sau necrologica. PMP permite examinarea principala a caracterelor celulei si a modului lor de organizare. Alcatuit din : obiect de examinat subtire si transparent, mediu de fixare transparent, lama si lamela. Etapele de obtinere: 1) recoltarea = obiectul de examinat e prelevat de la omul sau animalul viu (bioptica) sau dupa moarte (necroptica) Bioptica raclare, punctie bioptica, aspiratie, interventie chirurgicala Necroptica dupa sacrificarea animalului, recoltarea de la cadavre 2) fixarea etapa decisiva in obt unui preparat microscopic permanent. Este un proces fizic sau chimic, sunt oprite cat mai rapid procesele vitale celulare, pastrandu-se cu alterari minime volumul, forma, relieful si raporturile spatiale si molec. Tratamente postfixare: decalcifierea, disocierea pieselor, mordansarea. 3) Spalarea 4) Includerea realizarea cond optime care sa permita taierea pieselor in sectiuni subtiri de ordinul micrometrilor, transparente si cu fete plane. parafina 5) sectionarea piesa inclusa sau inghetata se taie felii subtiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat numit microtom. 6) colorarea cresterea contrastului intre elementele tisulare sau celulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor. 7) montarea intre lama si lamela in diferite medii de montare initial fluide. 8) etichetarea (tipul celular, sursa de recoltare, fixatorul, met de colorare, data efectuarii)

2. Etapele de obtinere ale preparatului microscopic permanent in microscopia electronica 1) recoltare 2) fixare 3) deshidratare 4) clarificare 5)impregnare 6) incluzie 7) sectionare 8) diferentierea structurilor prin contrastare

9) montare pe grila - inghetare fracturare, permite vizualizarea suprafetelor rez prin clivajul anumitor struct, se realiz un mulaj metalic sau de carbon

3. Principiul imunofluorescentei Aplicatie practica a microscopului cu fluorescenta = punerea in evidenta a dif. Img. Antigeni cu ajutorul unor anticorpi specifici, marcati cu compus fluorescent IZOTIOCIANAT DE FLUORESCEINA (FITC). Tipuri: directa (Ag + anticorp specific marcat); indirecta (Ag + ac specific + ac secundar marcat) Are o sensibilitate mai mare, se foloseste in cazul in care antigenele se gasesc in cantitate mica in tesut. 4. Principiul de functionare al microscopului cu contrast de faza Lumina trece prin medii cu indice de refractie dif si isi modifica directia si viteza. Microscopul transfera aceste diferente in diferente de intensitate luminoasa. 5. Colorarea : definitie, mecanism Etapa in obtinerea preparatului microscopic permanent, in care se urmareste cresterea contrastului intre elementele tisulare sau celulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor. Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului si de tesutul pe care se aplica. Mecanismul colorarii: proteinele substratul molecular la nivelul carora se fixeaza colorantii prin legaturi electrochimice de hidrogen. Colorarea poate fi directa (simplu contrast dintre colorant si substrat) si indirecta (necesita prezenta unui mediator=mordant, intre colorant si substrat. Aceasta fixeaza colorantul de componentele cel. Coloratia optima se obt prin 2 metode : progresive si regresive (actiune prelungita supracolorare, decolorant-diferentiator, ex. Coloratia Nissl) Rezultatul colorarii: ortocromazia substratul se coloreaza in aceeasi culoare ca zi a colorantului. Metacromazia alta culoare.

6. Coloratia hematoxilina-eozina Hematoxilina colorant natural vegetal Este metoda cea mai rspndit ca tehnic de rutin n majoritatea laboratoarelor de histologie normal i patologic. Coloraia reuete dup majoritatea fixrilor uzuale i poate fi realizat pe seciuni de parafin, celoidin, mase plastice, gelatin i congelare. Rezultate: nuclee albastru intens-negru. citoplasma, colagenul, eritrocitele: diverse nuane de roz fibrina: roz-ntunecat cartilagii, coloidul tiroidian: rou sau albastru bacterii gram-pozitive: albastru granule de secreie: rou sau albastru-violet muchii: roz ntunecat-rou.

7. Coloratia citologica : definitie, exemple, rezultate Utilizata pentru evidentierea anumitor organite celulare. 1)Metoda Cajal da Fano evid. Complexului Golgi Rezultate : nucleii necolorati, aparatul Golgi e o retea perinucleara neagra, citoplasma aurie. 2)Metoda Hematoxilina ferica Regaud evid. Mitocondrii Rezultate: nucleu necolorat, nucleol negru, mitocondrii puncte negre

8. Coloratia topografica: definitie, exemple, rezultate 1) HEMALAUN-EOZINA : 2 coloranti, hemalaun (bazic), eozina (acid) Rez: nuclei albastru-violet, citoplasma roz/rosu 2)HEMALAUN-EOZINA CU ALBASTRU DE METIL tes adipoase albe si brune. Coloratie tricroma : hemalaun, eozina, albastru de metil. Rez: nuclei violet, citoplasma albastru-cenusiu, fibre de colagen albastru intens. 3)VAN GIESON tricroma : hematoxilina ferica, acidul picric, fuxina acida Rez: nuclei negri, citoplasma galben, fibre de colagen rosu intens 4)MASSON tricroma : hematoxilina ferica, solutia coloranta A ce contine fuxina acida, B contine albastru de anilina, Rez: nuclei negru, citoplasma rosu-violet deschis, f de colagen albastru intens. 5)MALLORY fuxina acida, albastru Mallory (anilina+orange G) Rez: nuclei rosu intens, citoplasma rosu, f de colagen si reticulina albastru, tesut muscular neted violet, striat rosu portocaliu. 6)AZAN asocarmin, albastru Heidenhein cu anilina si orange G Rez: nuclei rosu-viu, citoplasma rosu, f de colagen si reticulina albastru deschis si tes musculat striat rosu/orange/galben.

9) Coloratia May-Grunwald-Giemsa Obtinuta prin intinderea celulelor in monostrat pe o lamela dee sticla. Metoda panoptica Pappenheim pentru colorarea frotiului sangvin: Sol. May-Grunwald contine eozinat de albastru de metilen solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra. Sol. Giemsa eozinat de azur de metilen solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina netura.

Rez: nuclei violet, citoplasme agranulocite albastru, citoplasme granulocite roz. Granulatii : neutrofile rosu-violet, bazofile albastru inchis spre negru, eozinofile rosu-portocaliu.

10) Evidentierea la microscopul optic a limitelor intercelulare Impregnarea argentica ranvier - folosita pt evidentierea elem din tes epitelial conjunctiv si in cercetarea sist nervos. Rezultate: structurile vizate colorate in negru.

11) Metode de evidentiere la microscopul optic a fibrelor conjunctive 1)fibrele de reticulina se examineaza folosind impregnarea argentica, negru. Niciodata HE 2)fibrele elastice : rezorcin-fuxina (albastre) sau orceina (cafeniu-roscate) 3)f de colagen

12) Metode de evidentiere la microscopul optic a celulelor conjunctive: exemple COLORAIA CU ALBASTRU DE TOLUIDIN - granulaiile din mastocite prin coloraie metacromatic n rou violet

13) Metode speciale de evidentiere la MO a tesutului muscular in microscopia optica Met. Heidenhen (cu hematoxilina ferica) evidentiaza structura periodica a miofibrilelor. Se remarca alternanta de zone clare si intunecare, nucleii palid colorati.

14) Impregnarea argentica : principiu, rezultate PRINCIPIU: precipitat de metal care se depune pe diferitele elemente de tesuturi evideniind structuri care n mod obisnuit nu se coloreaz cu colorani. Impregnarea argentica este folosit pentru evidenierea elementelor din esutul epitelial, conjunctiv i n cercetarea sistemului nervos. Rezultate: structurile vizate sunt colorate n negru.

15) Tehnici de evidentiere la MO a tesutului nervos Metoda Nissl, impregnarea argentica, evidentierea tecii de mielina prin fixare cu tetraoxid de osmiu negru.

16) Tehnici de evidentiere la MO pentru glicoproteine Metoda PAS evidentierea glicogenului, GAG, glicoprot, glicolip. Principiu: grupari glicol ->oxidare cu acid periodic -> grupari aldehidice + r. Schiff -> pp rosu violaceu vizibil la MO

17) Metacromazia definitie, principiu Capacitatea unui substrat de a se colora intr-o alta culoare decat cea a colorantului. Principiu: existenta unor grupari anionice aflate la o diferenta f mica una de alta, formand agregate cu proprietati de absorbtie a luminii vizibil diferite de a moleculelor neagregate.

18) Histochimia glucidelor, principiu, exemple Monozaharidele, oligozaharidele solubile. Polizaharide libere, combinate cu proteine. 1.Metoda PAS: evidentierea glicogenului, GAG, glicoprot, glicolip. Principiu: grupari glicol ->oxidare cu acid periodic -> grupari aldehidice + r. Schiff -> pp rosu violaceu vizibil la MO Glicogen; specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice, de tipul amilazei salivare. Se considera ca struct colorate cu PAS care dispar in urma pretratamentului cu amilaza contin glicogen.

2.Met. Carmin amoniacal test : evidentiaza glicogenul polimer cu solubilitate redusa in apa. Daca fixarea lui nu este prompta, enzimele hidrolitice il descompun in glucoza, care e f sol in apa si difuzeaza. Rez: granule rosii in citoplasma. 3.Bazofilia: propr subst glucidice de a se colora cu coloranti bazici de tipul albastru de metil si albastru alcian. Poate fi utiliz pt evidentierea lipidelor si proteinelor cu caracter acid. 4.Metacromazia.

19) Histochimia lipidelor Principiu: colorantul trb sa fie mai solubil in lipide decat in solventul propriu. Sudanofilia: coloranti Sudan, III rosu-portocaliu, IV rosu, B negru, BB albastru.

20) Studiul proceselor celulare in vitro: cultura de celule, etape de obtinere si evolutie. Digestia enzimatica a tes cu obtinerea unei suspensii de celule. Izolarea unei populatii celulare pure. Insamantarea in flacoane de cultura sau placi Petri, obt astfel o cultura primara. Pasarea resuspendarea celulelor idn cultura primara urmata de reinsamantarea in flacoane de cultura sau placi Petri obt culturi secundare. Evolutie: 1)faza de lag sau de inductie cel isi refac suprafata si se acomodeaza cu mediul de cultura. 2)faza exponentiala cel se divid rapid, exponential

3)faza stationara nr de cel ramane constant, in aceasta faza se efectueaza pasarea 4)faza de declin scaderea nr cel, imbatranire + moarte

21) Studiul proceselor celulare in vitro: baia de organ Permite mentinerea viabilitatii unor fragmente de organ sau tes. Variate in fct de organul expus la experimente, asigura o temperatura constanta, oxigenarea materialului biologic, posibilitatea controlarii compozitiei mediului din baie si culegerea de date fct si esantioane.

22) Morfometria Studiu cantitativ al formelor. Utilizeaza un analizator de img, se stabileste criteriul dupa care se va efectua analiza, precum si limitele max si min. Rez: diferite populatii celulare, rez analizei cantitative e afisat sub forma unei histograme.

23) Principiul citometriei in flux Permite analiza si separarea cel pe baza unor caractere morfologice si biochimice. Ofera informatii asupra: marimii relative a celulelor, granularitatii interne relativa (neomogenitatea interna a citoplasmei), intensitatea relativa a fluorescentei. Utilitate: masurarea caracterelor fizice a cel, identificarea si separarea populatiilor de celule sanguine, masurarea cant de ADN, Ca, masurarea pH intracelular.

24) Specializari membranare de pol apical: cili (prelungiri permanente celulare structur nalt organizat; la organite nedelimitate - microtubuli) si microvili.

25) Specializari membranare de pol latero-bazal: jonctiunile celulare si labirintul bazal.

26) Nucleul : ultrastructura nucleul are 3 componente: invelis nuclear: prezent doar n interfaz alctuit din: membranele nucleare intern i extern si cisterna perinuclear. nucleoplasma: Cromatina ( 2 tipuri, n funcie de aspectul n ME: eucromatina- electronoclar, funcional activ; heterocromatina electronodens, inactiv funcional) si nucleolul.

27) Nucleolul : ultrastructura Implicat n sinteza ribozomilor, nedelimitat de endomembran, ME: zon electronodens, neregulat, cu structur fibrilogranular 3 componente distincte: centrul fibrilar conine gene pt ARNr zona dens fibrilar zona de transcripie genic zona granular- conine ARN ribozomal

28) Ciclul celular Ciclul celular reprezinta secventa de faze diferite prin care trece o celula intre o diviziune celulara si urmatoarea. Ciclul celular poate fi impartit in patru perioade principale : 1. perioada M in cursul careia are loc mitoza (diviziunea nucleului) si citokineza (diviziunea citoplasmei); 2. perioada G1 in care au loc procese intense de biosinteza (producerea de molecule de catre celula) si crestere celulara; 3. perioada S in care se dubleaza cantitatea de ADN din celula si are loc replicarea (inmultirea) cromozomilor; 4. perioada G2 in timpul careia au loc ultimele pregatiri inainte de diviziunea celulara. Perioadele G1, S si G2 alcatuiesc impreuna interfaza (etapa care urmeaza dupa incheierea diviziunii celulare. In aceasta etapa nucleul nu se mai divide; au loc modificari atat in nucleu, cat si in citoplasma, care duc la dezvoltarea deplina a celulelor fiice).

29) RE: aspect si evidentiere la MO, aspect electrono-microscopic Reticulul endoplasmatic la microscopul optic se evidentiaza prin fluorescenta cu enzima marker glucozo-6fosfataza, apare colorat in verde in jurul nucleului, RER ca o retea fuarte concentrata, si mai dispersat REN pre exterior. La microscopul electronic, se pot evidentia cele 2 tipuri de RE. Reticulul Endoplasmatic Rugos apare ca o retea se tubi rugoasi cu ribozomi atasati pe membrana, RE Neted apare in cisterne in continuitatea RER.

30) Mitocondria: aspect si evidentiere la MO, aspect electrono-microscopic Mitocondia la microscopul optic se evidentiaza cu Hematoxilina Ferica Regaud, apar ca niste puncte negre in jurul nucleului care apare necolorat si cu nucleolul colorat in negru. La microscopul electronic, mitocondiile apar de obicei ca niste figuri rotund/ovalare cu membrana dubla si cu criste in interiorul lor.

31) Lizozomul : aspect electrono-microscopic Sunt vezicule delimitate de membrane , continand o mare varietate de enzime hidrolitice, sunt sintetizati de RE si transportati de Ap Golgi. Funcii: digestie enzimatic Lizozomul La ME este mai mic decat mitocondria contine membrana si are in interior o culoratie electrono densa granulara aproape uniforma.

32) Peroxizomul : aspect electrono-microscopic Perozixomii sunt structuri rotunde si apar cu o portiune electrono densa, intunecat ce se numeste cristaloid. Nu i se cunosc functii.

33) Aparatul Golgi un sistem de 3 10 saci turtiti cu diametrul intre 0,5 1 , usor curbati se evidentiaza prin coloratia cajal da fano la MO, unde apare colorat in negru si nucleii necolorati si citoplasma aurie. La ME se descriu 2 fee: Faa convex , orientat spre RER - faa cis sau imatur. In vecinatatea ei se gsesc numeroase vezicule mici cu rol n transport . Faa concav trans sau matur este orientat cel mai frecvent spre membrana celular. In vecinatatea ei se gasesc cteva vacuole mari rolurile sunt: modificrile posttranslaionale, mpachetare i fixarea destinaiei finale a proteinelor.

34) Ciclul secretor celular Circuit urmat de substanele sintetizate intracelular pn la destinaia lor final realizat prin intermediul sistemului de endomembrane. 2 destinaii finale: intracelular ( ex: lizozomii) si extracelular (ex: proteinele de export) ETAPE: sintez proteic la nivelul RE transport prin microvezicule ctre ap. Golgi mpachetare, sortare i etichetare n ap. Golgi expediere ctre destinaiile finale.

35) Ribozomii Ribozomii sunt organite celulare nedelimitate de endomembrana, sunt implicati in sinteza proteica, se gasesc liberi in plasma sau atasati pe RER. Pot fi studiati la ME si prin centrifugare diferentiala. Sunt alcatuiti din 2 unitati: 60S si 40S.

36) Proteazomul si apoptozomul Proteazomul este un organit nedelimitar de endomembrana, este un complex proteic implicat in digestia proteica, apare ca formatiuni cilindrice cu 3 discuri suprapuse dintre care discul central cu 20 de subunitati este activ si componenta majora ai proteolizei, si cele 2 discuri exterioare sunt cu 19 subunitati cu rol adjuvant. Apoptozomul este o proteina mare implicata in apoptoza celulara.

37) Citoscheletul si centrul celular citoscheletul este alcatuit din: microfilamente actina 8 um, filamente intermediare, microtubuli CENTRUL CELULAR: zona de organizare a reelei de microtubuli din citoplasm alctuit din 2 centrioli perpendiculari unul pe cellalt. Fiecare centriol este alctuit din 9 triplete de microtubuli.