Manipulao Molecular e Biotecnologia

NOME: ____CURSO:

Na experincia esquematizada na figura, bacterifagos com elevada frequncia de infeco (e.o.p. =1) na estirpe original X, foram usados para reinfectar quer a estirpe Xnovamente,queraestirpeY. Em cada crculo representando uma placa de Petri,indiqueafrequnciadeinfeco(e.o.p. efficiencyofplating)esperada: 1parae.o.pelevada. 2X104parae.o.p.baixa Porque razo, para o mesmo bacterifago, a eficincia de infeco no sempre igual paraasmesmaestirpes?

Se um DNA for propagado numa estirpe de E. coli com fentipo (r, m+) poder, uma vez clonado nesta estirpe e aps extrado e purificado, ser propagado numa outra estirpe semmutaesnos3geneshsd?Justifique.

5RelativamenteSau3A1(GATC)diga,dasseguintesenzimasqualouquaisa)soisoesquizmeros;b)tm extremidadescompatveis: Symbol 1. XhoIIRGATCY Description Basesrepresented [1] 2. PsuIRGATCY 3. FbaITAGATCA W weak A T 4. NdeIIGATC S strong C G 5. BamHIGGATCC M amino A C 6. DpnIGATC K keto G T R purine A G Y pyrimidine C T B notA C G T D notC A G T H not G A C T V notT A C G anybase(nota N gap) A C G T 2FoiobtidoumfragmentoderestriopordigestodegDNAdeArabidopsiscomaenzimaBglII,eclonadonolocal BamHIdoplasmdeopUC57.PararecuperaresteimportantefragmentodeDNA,porquequenofoipossvelusar nemaBamHInemaBglII?Expliqueasuaresposta(sepreferir,recorrendoaumesquema). Locaisdereconhecimentodasenzimas BamHI:G/GATCCeBglII:A/GATCT. Naimagemabaixoestrepresentadooresultadodaseparao,porelectroforeseemgeldeagarose de:1plasmdiopUCextraidodeE.colienocortado;2plasmdiopUCdigeridocomenzimaHindIII; 3MarcadorDNAdelambdadigeridocomHindIII.AenzimaHindIIIpossuiapenasumlocalde reconhecimentonoplasmdiopUC.(AoladoencontramseosfragmentosobtidosporrestriodeDNA delambdacomHindIIIerespectivostamanhos) a)Aqueconfiguraocorrespondeabandamaisfortedo plasmdiopUCnapista1? bPorquerazoabandadapista2,quecorrespondeaomesmoplasmdio,se encontranumaposiocorrespondenteaumtamanhomolecularmais elevado? 3Porcomparaocomomarcadormolecularnapista3(Lambda/HindIII) qualotamanhoaproximadodoplasmdio?Justifique

6Messingecolaboradoresdesenvolveramumaclassedevectores(pUC)quepermitemaidentificaohistoqumica dosclonesrecombinantes.Paraisso a)incorporaramnovectorogenequecodificaabetalactamase b)incorporaramnovectorogenecompletodabetagalactosidase c)introduziramumlocaldeclonagemmltiplanogeneparcialdabetagalactosidase d)introduziramumlocaldeclonagemmltiplanogeneresistnciaampicilina e)introduziramnovectoramutaolacZM15(correspondeaumadeleconaporoquecodificaaregioN terminaldabetagalactosidase) 7Orastreiodecolniasazuis/brancasbaseiasenumfenmenochamadodealfacomplementao.Parasepoder usarestesistemaderastreionecessriodispordeumaestirpeespecialdeE.colique(assinalaropocorrecta): a)ExpresseofragmentoCterminaldabgalactosidase b)ExpresseofragmentoNterminaldabgalactosidase c)PossuaogenelacZnumplasmdeoF d)DegradeosubstratoXGaldemodoespontneo e)PossuaogeneCcdBfuncional NasntesedecDNAapartirdemRNAutilizase(assinalaraopocorrecta) a)terminaltransferase b)DNApolimeraseIdeE.coli c)T4DNAligase d)RNApolimerase e)transcriptasereversa NasntesedemRNAapartirdecDNAutilizase(assinalaraopocorrecta) a)terminaltransferase b)DNApolimeraseIdeE.coli c)T4DNAligase d)RNApolimerase e)transcriptasereversa Um cDNA possui uma extremidade NotI a 5' e uma extremidade EcoRI a 3' (poliA) e est inserido no vector pBluescript SK II (ver mapa em anexo). A partir do referido cDNA clonado pretendese obter uma SONDA de RNA por transcrio in vitro para detectar os respectivos mRNAs em tcnicas de "Northern blotting". Para isso, aps linearizaodoplasmdiocomenzimaderestrioadequadaadicionase a)ribonucleotdeoseaRNApolimeraseespecficaparaopromotorT3 b)ribonucleotdeoseaRNApolimeraseespecficaparaopromotorT7 c)desoxirobonucletdeoseumatranscriptasereversa d)uminiciador(polidT)queemparelhassecomasequnciapoliAdocDNAetranscriptasereversa e)uminiciadorqueemparelhassecomasequnciadopromotorT7earespectivaRNApolimerase
Justifiquearespostaanterior

AenzimaTaqDNApolimerase(assinalarcomVouF,respectivamenteparaverdadeiroefalso) ____apresentaactividadedeexonucleasede5para3 ____apresentaactividadedeexonucleasede3para5 ____apresentaactividadedeproofreading

7Faaalegendadafigura. 8Caracterize,justificando,os3paresdeprimersrelativamentea
20ComoobjectivodeexpressaraprotenaemE.colieapsserconhecidaasequnciadecDNAdecardosinaAforam desenhadosdoisprimerscomadaptadoresNheI.Pretendiaamplificarseazonade76a1515dasequnciaabaixo.Asequncia dereconhecimentodaNheIG^CTAGC AssinalenasequnciadafichaabaixoazonadeemparelhamentodosprimersPrimerFProNheIeePrimerRNheI(Reverse). Indiqueabaixo,asequncianucleotdicadoPrimerRNheI(Reverse) PrimerFProNheI,GCTAGCTCCGATGACGGATTGATTCGAe PrimerRNheI,_________________________________ QualotamanhodoamplificadocomosprimersreferidoscontendoolocalNheI?_____________________ PorquerazesforamacrescentadasaosprimerssequnciasdereconhecimentoparaaenzimaNheI?

a)eficincia b)especificidade

FICHA DO GENEBANK: LOCUS CCA132884 1515 bp mRNA PLN DEFINITION Cynara cardunculus mRNA for preprocardosin A. ACCESSION AJ132884 VERSION AJ132884.1 GI:4581208 KEYWORDS cardA gene; cardosin A; preprocardosin A.

30-SEP-1999

SOURCE ORGANISM REFERENCE AUTHORS

Cynara cardunculus. Cynara cardunculus

1 (bases 1 to 1515) Faro,C., Ramalho-Santos,M., Vieira,M., Mendes,A., Simoes,I., Andrade,R., Verissimo,P., Lin,X., Tang,J. and Pires,E. TITLE Cloning and characterization of cDNA encoding cardosin A, an RGD-containing plant aspartic proteinase JOURNAL J. Biol. Chem. 274 (40), 28724-28729 (1999) MEDLINE 99428553 REFERENCE 2 (bases 1 to 1515) AUTHORS Faro,C.J. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-MAR-1999) Faro C.J., Biologia Molecular e Biotecnologia, Centro de Neurociencias de Coimbra, Universidade de Coimbra, Edificio IBILI, Azinhaga de Sta Comba, 3000 Coimbra, PORTUGAL FEATURES Location/Qualifiers source 1..1515 /organism="Cynara cardunculus" /db_xref="taxon:4265" /dev_stage="young flower buds" /country="Portugal:Centro" gene 1..1515 /gene="cardA" CDS 1..1515 /gene="cardA" /note="During maturation of the protein a propeptide (from nucleotide 76 to 204) and an internal peptide (from nucleotide 931 to 1242) known as PSI are removed." /codon_start=1 /product="preprocardosin A" /protein_id="CAB40134.1" /db_xref="GI:4581209" /translation="MGTSIKANVLALFLFYLLSPTVFSVSDDGLIRIGLKKRKVDRID QLRGRRALMEGNARKDFGFRGTVRDSGSAVVALTNDRDTSYFGEIGIGTPPQKFTVIF DTGSSVLWVPSSKCINSKACRAHSMYESSDSSTYKENGTFGAIIYGTGSITGFFSQDS VTIGDLVVKEQDFIEATDEADNVFLHRLFDGILGLSFQTISVPVWYNMLNQGLVKERR FSFWLNRNVDEEEGGELVFGGLDPNHFRGDHTYVPVTYQYYWQFGIGDVLIGDKSTGF CAPGCQAFADSGTSLLSGPTAIVTQINHAIGANGVMNQQCKTVVSRYGRDIIEMLRSK IQPDKICSHMKLCTFDGARDVSSIIESVVDKNNDKSSGGIHDEMCTFCEMAVVWMQNE IKQSETEDNIINYANELCEHLSTSSEELQVDCNTLSSMPNVSFTIGGKKFGLTPEQYI LKVGKGEATQCISGFTAMDATLLGPLWILGDVFMRPYHTVFDYGNLLVGFAEAA" BASE COUNT 400 a 298 c ORIGIN 1 atgggtacct caatcaaagc 61 actgtatttt cggtctccga 121 gaccgaatcg accaacttcg 181 ttcggcttcc gtggtacagt 241 agggatactt cgtattttgg 301 attttcgata ccggaagttc 361 gcttgtcgtg cgcactcaat 421 acatttggcg ctattatata 481 gtcacgatcg gtgatcttgt 541 gacaatgttt tcttgcatag 601 tccgttcctg tctggtacaa 661 ttttggttga atcgcaatgt 721 gaccctaatc attttagggg 781 cagtttggaa tcggtgacgt 841 tgtcaagcat ttgccgactc 901 caaatcaatc atgcaattgg 961 agtcgttatg gaagggatat 1021 tgttcgcaca tgaagttatg 1081 agcgtggttg acaagaataa 1141 ttctgtgaga tggcggtcgt 1201 aacataatca actatgccaa 1261 caagtagatt gcaacactct 1321 aaatttgggc tcaccccaga 1381 tgcatcagtg gattcactgc 1441 gatgttttca tgcgtccata 1501 gcagaagcag cttga 368 g aaacgtgctt tgacggattg tggacgtcgt tagggactcg tgagattggt tgttctatgg gtatgagtcg tggaaccgga tgttaaagag gttgtttgac catgcttaat tgatgaggaa tgaccacact tcttattgga tggaacctct cgctaacggg aattgagatg cacttttgac cgacaagtct ttggatgcaa c gagttgtgt ttcctccatg gcagtacatc gatggatgcg tcacacagtg 449 t gccttgttct attcgaattg gcgttaatgg ggtagtgccg atcggaactc gtgccttctt agcgattcaa tcaatcacgg caggatttta ggtatactcg caaggtcttg gaaggtggcg tatgtccctg gataaaagta ttgttgtcag gtcatgaacc ctccgatcta ggtgctcgcg tctggtggca aacgaaatca gaacacttat cccaatgttt ttgaaagtcg actcttcttg tttgattatg tgttttatct gacttaaaaa aaggaaatgc ttgttgcact cacctcagaa caaagtgcat gtacctacaa gtttttttag tagaggcaac gcctttcatt ttaaagaacg aactcgtgtt tgacttatca ccggattttg gtccaacggc agcaatgcaa agatacaacc atgttagttc tacatgatga aacaaagcga cca cttcatc cctttacaat gtaagggaga gacctctgtg gcaatttact tctatcacct gaggaaggtg tcgaaaagat aacgaacgat gttcacagtg caattcaaaa ggaaaatggg ccaagactct cgatgaggcc tcaaacgatc gaggttttcc tggtgggctt gtactattgg cgcccctggt tattgttact gacagtggtt tgataaaatc aatcattgag gatgtgcacc gactgaagat tgaagaatta tggtggcaaa agcaacacaa gatcctcgga agttggattt

 ParaoptimizarumareacodeqPCRparadetecodeRNAespecfico,foiobtidaumarectapadroapartirdeuma sriedediluiesdomolde.C=concentraoinicial,CX101;CX102etc.
log(1)=0 log(0,1)=1 log(0,01)=2

etc.

ParasegarantirorigorquantitativodeqPCR,deveserdemonstradoqueovalordeCttemumarelaode proporcionalidadecomologdaquantidadedemoldeinicialpresentenareaco.Habitualmenteissoconseguese a)AnalizandoogrficodeCtvs.diluiessucessivasdequantidadeinicialdemolde b)Testandopreviamenteaqualidadedosfluorocromos c)Averiguandoseasconcentraesdecadacomponenteindividualdareacoseencontraoptimizado d)Testarotermocicladoreverificarqueseencontraemmodooptimizadodefuncionamento Apartirdogrficopodemosafirmarque a)aoCtdeaprox.35correspondeaconcentraomaiselevada b)aoCtdeaprox.10correspondeumadiluiode104 c)aoCtdeaprox.35correspondeumadiluiode104 d)aoCtdeaprox.35correspondeoDNAnodiludo AvantagemmaisnotveldeqPCRsobrePCRconvencional: a)Nohaverprodutosdeamplificaoinespecficos b)PermitiramplificarRNAsemnecessidadedareacoprviacomatranscriptasereversa c)Sermuitomaisrpidanaobtenoderesultados d)Poderserusadaparadeterminarcomrigoraquantidadeinicialdemoldenareaco e)Poderserusadaemgrandeescalacomreagentesmaisbaratos A rectapadro anterior permite estimar a gama de diluies em que o Ct tem uma relao de proporcionalidade comologdaquantidadedemoldeinicialpresentenareaco.Podemosafirmarque a)existeproporcionalidadeemtodaagamadediluiesutilizadas b)noseconseguiudeterminaroCtparaasduasamostrasmaisdiludas c)noseobservaumarelaolinearparaasduasamostrasmaisconcentradas d)nosedevediluiraamostra NautilizaodatecnologiaGeneChipmicroarrayparaestudaraexpressogenticadelevedurasemmeiomnimo quandocomparadacomaexpressogenticaemmeiorico(V/F) ___ esta tecnologia permite quantificar os nveis de expresso (volume de RNA) de determinados genes em cada situao ___assondascorrespondemaosRNAsextradosdasclulas ___assondaspoderocorresponderaporesdeDNAimobilizadosnumsuporteslido ___osuportedivideseemposies(features)ecadaumatemapenasumanicamolculadeDNA

___nestetipodeexperinciaocorreemparelhamentodecadeiascomplementaresdecidosnucleicosformandose molculasdecadeiadupla ___cadasondadeverconterumasequncianicarepresentativadeumgeneespecfico 21Ordeneospassosnecessriospararealizaraexperinciaacimareferida ____OcDNAemparelhaapenascomsondascomplementaresnochip ____sousadoslasersparadetectarapresenadefluorescncianochip ____apresenadefluorescnciaindicaumacorrespondnciadocDNAcomasonda ____oRNAtotalextradodeclulasnasdiferentescondiesexperimentais ____ochipcomamisturadecDNAsvaiaincubaraumatemperaturaadequadahibridaoalvosonda ____oscDNAsmarcadossomisturadoseamisturapipetadasobreochip ____oRNAsofretranscrioreversaparacDNA ____ochipsubmetidoalavagemdemodoaremoverasmolculasnoemparelhadascomasonda ____ocDNAmarcadocomfluorocromosdiferentesconsoanteascondiesexperimentaisdasclulas 22Nadetecodemutaesoupolimorfismos,nomeadamenteSNPspormicroarrays (escolheropocorrecta) a)assondasimobilizadassoconstitudasporRNAmensageiro b)assondasimobilizadassoconstitudasporcDNAmarcadoscomfluorocromos c)aamostraconstitudaporRNAmensageiro d)aamostraconstitudaporcDNAmarcadocomfluorocromos e)aamostraconstitudaporDNAgenmico OesquemarepresentaoresultadodeumareacodesequenciaomanualrealizadapelomtododeSanger. Qualasequncianucleotdicalidaapartirdogel? ______________________________________________________________ Nesteesquemacadabanda: a)Representaumnucleotdiodiferente(G,A,TouC) b)Representaumdidesoxinucleotdiodiferente(ddGTP,ddATP,ddTTPouddCTP) c)RepresentaumfragmentodeDNAdecadeiasimplesqueterminanumabaseconhecida d)RepresentaumfragmentodeDNAdecadeiaduplaqueterminanumabaseconhecida 22 A sequenciao pelo mtodo de Sanger classicamente executada em 4 tubos separados de reaco. Contudo, possvel realizar quatro reaces simultaneamente no mesmo tubo desde que (assinalaropocorrecta) a)seuseumnucleotdeoradioactivoincorporadonoiniciador b)osddNTPssejammarcadosradioactivamente c)osoligonucleotdeosiniciadoressejammarcadoscomfluorocromosemitindodiferentescores d)cadaddNTPsejamarcadocomumfluorocromodiferente e) cada um dos 4 dNTPs normais deve ser marcado com um fluorocromo de cor diferente dos outros AssinalecomV/Fasseguintesafirmaesrelativaspirosequenciao: __esteprocessoenvolveasenzimasDNApolimerase,sulfurilaseeluciferase

__nonecessriousaroligonucleotdeosiniciadores __necessrioutilizardidesoxinucleotdeos __necessriousarprimesmarcadoscomumfluorocromo __umstipodedNTPadicionadodecadavezreaco __cadavezqueumnucleotdeoincorporado,hlibertaode __humarelaoentreoPPilibertadoduranteaincorporaodeumnucleotdeoealuzdetectadanofinalda reaco