GENETICA BACTERIANA

Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Gelbart W., Suzuki D., Miller J. (2005) Introduction to Genetic Analysis (8th ed). W.H. Freeman and Company, New York. QH430/I59/2005

Las bacterias poseen todos los componentes requeridos para reproducirse, cosechar y utilizar la energa del ambiente.

Se reproducen rpidamente, una clula da origen a dos idnticas en cada ciclo de divisin, produciendo un colonia de individuos idnticos.

Suspensin celular bacteriana

Suspensin plaqueada en caja con agar Incubacin 1 2 das

Caja Petri con agar

Clulas individuales invisibles a simple vista

Colonias visibles procedentes de una clula individual (mismo genotipo y fenotipo)

Mutantes bacterianas
Prototrficas : Son bacterias silvestres que pueden crecer en medios mnimos (sales inorgnicas, fuente de carbono glucosa y agua). A partir de estas sustancias mnimas las bacterias pueden construir todas las macromolculas necesarias para vivir. Auxotrficas : Las bacterias son generalmente mutantes y no pueden crecer a menos que se adicionen al medio nutrientes especficos (Adenina, biotina, metionina, etc.)

Resistencia o susceptibilidad a antibiticos

Marcadores Genticos

Requiere biotina como suplemento Requiere arginina como suplemento Requiere metionina como suplemento No puede utilizar lactosa como fuente de carbono No puede utilizar galactosa como fuente de carbono Resistente al antibitico estreptomicina Susceptible al antibitico estreptomicina
Medio mnimo: medio sintetico bsico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales

Transferencia gentica horizontal

Transferencia gentica vertical

Mecanismos de Transferencia Gentica Horizontal

La bacteria donadora es la que contribuye con una fraccin de material gentico a la bacteria receptora
El fragmento de DNA donado es llamado exogenota y el genoma receptor el endogenota Una bacteria que contiene ambos DNAs, el exogenota y el endogenota es merocigoto

a+

b+

Exogenota

Endogenota

Material Gentico Transferido

DNA bacteriano DNA plasmdico DNA viral

Conjugacin bacteriana E. coli F+ (Factor de fertilidad)

William Hayes, 1953

FPili
F+

Plsmido F
*Plsmido F codifica alrededor de 100 genes

GENOTIPO

FENOTIPO

Es el plsmido F el responsable de fenotipo WT despus de la Conjugacin?

F+

La frecuencia de transferencia de F es mayor a la frecuencia de recombinantes para los marcadores genticos que se estudiaron!

Estos marcadores genticos residen en el DNA del cromosoma bacteriano

Para la transferencia de DNA del cromosoma bacteriano mediante conjugacin, se necesita la INSERCIN del plsmido F al cromosoma generando una clula Hfr

High Frequency of Recombination

Integracin de F al cromosoma bacteriano

El bajo nivel de transferencia de marcadores genticos se debe a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la poblacin F+

La insercin de plsmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en diferentes lugares mediante recombinacin (sitios IS y Tn1000 )

Integracin del plsmido F al cromosoma

O Orientacin del origen O O

Dependiendo de la orientacin del Origen de replicacin de F durante la integracin, comenzarn a transferirse los marcadores genticos

Experimentos de conjugacin interrumpida

Wollman y Jacob, 1957
azis tons lac gal azir tonr lac+ gal+

F- strr Hfr strs

Str +

Despus de 2 h algunos exconjugantes se convierten en Hfr

F d c

b a O

Orden de Transferencia de Marcadores Genticos

Dos eventos de recombinacin

Generalmente la Conjugacin se interrumpe antes de que se transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es circular. Ocurren dos eventos de recombinacin.

Recombinacin entre exogenote y endogenote

No viable

Doble entrecruzamiento !
a+ a No viable

+
a+ Viable Recombinantes recprocos

Merocigoto

Conclusiones:
1. El cromosoma de E. coli es circular. 2. El plasmido F es circular. 3. La orientacin en la que se intergra F al cromosoma determina la polaridad del cromosma Hfr. 4. Un extremo de F integrado es el Origen donde comienza la transferencia y el otro extremo es el trmino que NO se transfiere a menos que antes se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.

Resumen de la Conjugacin bacteriana

PLSMIDOS
Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio de replicacin, sitios de reconocimiento para enzimas de restriccin, marcadores de seleccin (resistencia a antibiticos). Presentes en elevado nmero de copias en la clula.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Eco RI Sa/I tetracycline resistance origin of replication Pstl amplicillin resistance Pst I EcoRI SalI

CLASIFICACIN DE PLSMIDOS

Por su capacidad de transferencia: -Conjugativos (a travs de un pili a otra membrana) -No conjugativos

Por sus efectos fenotpicos: -Fertilidad (factores F) -Plsmidos bacteriocinognicos (codifican una protena txica para otras bacterias que no portan ese tipo de plsmido) -Plsmidos de resistencia (factores R)
Por el nmero de copias: -Relajados (>1000 copias/clula) -Restringidos (<100 copias/clula)

Episoma (F) : Plasmido F con genes bacterianos

Donadora

Exconjugante

Mapeo por frecuencia de recombinantes

Si seleccionamos leu como marcador: Podemos medir la distancia entre los genes porque todos tienen la misma oportunidad de incorporarse al cromosoma receptor

La frecuencia de recombinacin indicar la distancia entre los genes

Las posibilidades de recombinacin que existen:

4%

9%

87%

muy poco frecuente

0%

leu+ arg - met - 4%

leu+ arg+ met - 9% leu+ arg+ met+ 87%

leu -- arg 4 u.m. y

arg met 9 u.m.

En E. coli, cuatro cepas Hfr donaron los siguientes marcadores genticos en el orden:

Cepa Cepa Cepa Cepa

1: Q W D M T 2: A X P T M 3: B N C A X 4: B Q W D M

Todas las cepas Hfr strains derivan de la misma cepa F+. Cul es el orden de los marcadores en el cromosoma original?
(4) (3) (1)

N C
(2)

M A
X P T

Tarea: 1) Se realiz la conjugacin entre una cepa Hfr que es met+ thi+ pur+ con una cepa F que es met thi pur de manera interrumpida. Se encontr que met es el marcador que se transfiere ltimo, as que los exconjugantes se seleccionaron en un medio sin metionina. Para probar la presencia de los alelos thi+ y pur+ se hizo seleccin en medios sin estos compuestos, encontrando los siguientes datos:

met+ thi+ pur+ 280 met+ thi+ pur0 met+ thi pur+ 6 met+ thi- pur- 52
Determina el orden de estos marcadores en el cromosoma Calcula la distancia entre los marcadores en unidades de mapa

2) Se aisl una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato como fuente de carbono (ace-). Para determinar dnde mapea el gen responsable de la mutacin se utiliz la conjugacin con cuatro cepas diferentes donadoras StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posicin y orientacin de F en cada Hfr.

a) En qu medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto? b) Cmo vamos a excluir las clulas donadoras en este experimento? c) Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa (tomando en cuenta el tiempo en minutos).