Sunteți pe pagina 1din 33

II.

ANALIZA CROMATOGRAFIC
Analiza chimica cromatografica include mai multe metode de separare si totodata
de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila - aflata n miscare, se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea se petrece n coloana cromatografica, piesa cheie a ntregii metode.
Faza mobila, denumita si eluent -scurgndu-se continuu (deci cu viteza constanta) prin
interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite,
a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus
separarii se introduce sub forma de solutie la nceputul coloanei, folosindu-se un
dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa), si se afla initial fixat ntr-
o zona ngusta de la nceputul coloanei. Spalati de eluent, o parte din componentii
probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza
interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (desigur, nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retentie si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza n
grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea componentilor, pe rnd, la parasirea coloanei, de catre un instrument, n
grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod
ideal la oricare) dintre componenti ce ies din coloana si care este plasat n eluent,
imediat dupa iesirea din coloana. Acest analizor, denumit detector este capabil sa dea
un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component n faza
mobila. n consecinta, dispozitivul, "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce
formeaza initial proba, similar cu o fotocelula care nregistreaza trecerea concurentilor la
sosire n atletism.
Fig. II.1. Elementele unei cromatograme
n orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu
concentratia, alteori cu masa componentului aflat n celula de masura, semnal ce poate
fi nregistrat n functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de
eluent se numeste cromatograma. Pe cromatograma distingem o serie de maxime,
numite picuri (peak =vrf n l. engleza), care se produc deasupra liniei de baza sau a
portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. Aceasta apare ori de cte ori n
detector nu apare nici un component, n afara eluentului evident.
Oricare pic are, n cazul ideal, forma distributiei normale Gauss. Sa consideram
cea mai simpla cromatograma posibila: cazul introducerii unui singur component, ntr-un
gaz, C, care contine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei
cromatograme este cel prezentat n figura II.1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul
(sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei,
iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului - n unitati arbitrare.
Distingem urmatoarele elemente de baza ale unei cromatograme:
1. Picurile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale
sau vrfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile n analiza
calitativa si cantitativa n toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic,
corespunde unui component inert (aerul de exemplu n CG) - care nu este retinut de loc
- iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic n cazul de fata) al
probei considerate si este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul migrarii
prin coloana ntre faza mobila si cea stationara si care, n consecinta, ies mai trziu din
coloana.
2. Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de
catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta
nu poate fi zero. n cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al
aerului: tM =tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la
injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de concentratie n
detector, pentru componentul neretinut.
3. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component
al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior
n fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la
verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau n amestec.
4. Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de
retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, F
e
):
V
R
=t
R
F
e
5. Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea
compara timpii masurati pe coloane diferite, n cazul aceluia si component - este dat de
diferenta:
t
R'
=t
R
- t
M
6. Corespunzator exista si un volum de retentie ajustat,
V
R'
=V
R
V
M
unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
V
M
=t
M
F
e
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.
II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE
S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de
altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge:
a. cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobila este un lichid in cadrul
careia se distinge:
-cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
-cromatografia de lichide pe coloana inchisa;
b. cromatografia de gaze (GC) cnd faza mobila este un gaz;
c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat
peste temperatura critica.
A. n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie
de mecanismele de separare:
1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor
organice cu molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina,
folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza
stationara solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni -
substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele mai
raspndite sunt rasinile schimbatoare de ioni.
3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare
poroase dar cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda dimensiunilor
moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele sunt
excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza mobila. Tehnica se mai
ntlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri n functie de
natura apoasa sau organica a fazei mobile.
4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza
lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici
suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai
raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide.
5. Cromatografia pe coloana deschisa sau cromatografia planara (PC) faza
mobila circula printr-un material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ
subtire, dar de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe
coloana. Se disting:
Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara este o hrtie poroasa
din celuloza (initial o hrtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare.
Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza stationara pulverulenta
este fixata de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un
strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta (HPTLC), n care faza
stationara are granulatie extrem de fina ridicndu-se astfel eficienta separarilor dar si
viteza acestora.
B. n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretentios
cromatografiei n faza gazoasa), denumita prescurtat GC se disting urmatoarele tehnici:
1. Cromatografia gaz-lichid n care faza stationara este un lichid nevolatil
imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o
coloana n asa-numita cromatografie de gaze conventionala sau chiar pe peretii
coloanei, confectionata de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloana capilara.
2. Cromatografia gaz-solid este analoga cu cromatografia de adsorbtie si la
cea de excluziune sterica cu deosebirea ca schimbarea gazului nu modifica
selectivitatea. Faza stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele
moleculare (niste silicati naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros.
Metoda este extrem de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2,
N2, gaze nobile etc.)
II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE
Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze
sau solide care pot fi trecute sau exist n stare gazoas i care nu se descompun la
nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care
amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas
prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este
la substan[ele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de
descompunere a substantelor de analizat rezultind al[i compui dect cei supui
analizei. In aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza
niste derivati (compusi noi), volatili, utiliznd anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode.
Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia,
industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica.
La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea n coloana
cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la
intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (elu[ia) are loc cu ajutorul unui gaz
purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interac[ioneaz cu faza
mobil , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din
amestec prin coloan. nceputurile Cromatografiei de gaze snt legate de coloane cu
umplutur n care se transfera amestecul de substan[e gazoase dup ce n prealabil
erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n
exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur la care se
deosebesc dou tipuri:
- cromatografia de gaze pe faze sta[ionare solide (cromatografie de absorb[ie)
- cromatografia de gaze pe faze sta[ionare lichide (cromatografie de reparti[ie)
La cromatografia de gaze pe faze sta[ionare solide reten[ia speciilor de
analizat din amestec este realizat pe baz de absorb[ie fizic pe peretele interior al
coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi
apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorb[ii ireversibile, care duc
la rndul lor reproductibilit[i slabe, aceast tehnic este folosit rar i numai la
substan[e cu pu[ine molecule n structur.
Cromatografia de gaze pe faze sta[ionare lichide se bazeaz pe reparti[ia
substan[ei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid imobilizat pe
peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este
folosit la ora actual aproape n exclusivitate. Rela[iile matematice care o descriu snt
valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri snt dictate
de faptul c gazele snt compresibile i ca atare propriet[ile i comportarea reologic
snt influen[ate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de
gaze este folosit n locul timpului de reten[ie t
r
volumul de reten[ie V
r
care [ine cont de
debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i
de temperatur :
V
r
=t
r
.
Q
Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen[ mare
asupra l[irii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influen[a difuziei
longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine
de mrime la gaze fa[ de cel al lichidelor.
II.2.1. Aparate folosite n gazcromatografia de gaze
Un gazcromatograf respect schema bloc din figura avnd particularit[i specifice
pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arat ca n figura II.2.
Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purttor, 2-reductor de
presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator
de presiune i debit, 6- sering de injec[ie pentru substan[e de analizat n stare ini[ial
lichid, 7-dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nclzire, 9- coloan
cromatografic tubular, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de
achizi[ie prelucrare i afiare date, 13 calculator, 14- imprimant
II.2.1.1. Al i mentarea cu gaz purttor
Gazul purttor trebuie s fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de
vedere intr n discu[ie gazele inerte, hidrogenul, azotul i bioxidul de carbon. Natura
gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rndul lui de
mai mul[i factori dar n principal de clasa de substan[e analizate. Gazele purttoare de
nalt puritate snt preluate de regul din butelii speciale de nalt presiune prevzute cu
reductoare de presiune ce asigur presiuni de intrare cuprinse ntre 1,5 i 3 ata, dar pot
fi produse i pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purttor
se gsete un debitmetru electronic precum i o sit molecular pentru re[inerea
vaporilor de ap i a eventualelor impurit[i solide de dimensiuni mici.
II.2.1.2. Sistemul de injecie
Caracteristicile sistemului de injec[ie asigur n mare parte calitatea analizelor
cromatografice, fiind responsabile de l[irea de band a peak-urilor. Un sistem
Fig.II.3. Fazele de injec[ie ale amestecului lichid de analizat
performant de injec[ie trebuie s asigure injec[ia n timp scurt a unor cantit[i extrem de
mici de subsatan[ de analizat numai aa snt asigurate peak-uri nguste la baz.
Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticl aezat pe suportul
mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale ac[ionat automat.
Acul seringii perforeaz un dop de cauciuc siliconic sau i absoarbe o cantitate bine
definit de prob, figura II.3. , dup care se ridic automat , se deplaseaz i injecteaz
proba printr-un semptum prevzut cu un dop de cauciuc siliconic ntr-un dispozitiv de
evaporare rapid situat la intrarea n coloan. Este foarte important ca evaporarea s
se produc practic instantaneu astfel nct amestecul fazei purttoare cu substan[a de
analizat s se produc chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe
analizate pentru coloane analitice normale variaz de la c[iva l la cca 30 l, la
coloane capilare volumul probei este mult mai mic de ctiva nl fiind necesar folosirea
unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigur
preluarea pentru analiz numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat n mediu.
Aceste sisteme de splitare snt n principiu divizri de debit cu tuburi de tip T,
existente att pe traseul gazului purttor ct i pe cel al amestecului gazos, pe ale crori
ramuri se creaz rezisten[e hidraulice bine controlate astfel nct s poat fi purjat cea
mai mare parte din substan[a de analizat, pe coloan ajungnd numai o parte infim de
amestec i gaz purttor aa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantit[i
Fig. II.4. Dou procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze
2- tub de evaporare cu dop de vata de sticl sau de cuar[ , 4 corpul
dispozitivului de injec[ie , 5- ventil cu 3 ci, 6- ventil cu ace cu debit
reglabil
mici de prob, aa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori
importante motiv pentru care pentru dozare i injec[ie snt recomandate dispozitive de tip
autosampler.
II.2.1.3. Col oane cromatografice
Termenul de coloan cromatografic este oarecum impropriu pentru
cromatografia de gaze, el provine inc din timpul n care se foloseau coloane cu
umplutur de lungimi rezonabile care ncpeau n gazcromatograf sau care erau
montate n pozi[ie vertical lng aparat avnd o termostatare concentric. Diametrul
interior al coloanelor cu umplutur pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm
sau la aa numitele coloane micro <1mm. Acest tip de coloane este astzi extrem de
rar folosit din cauza faptului c au o capacitate de separare redus i o rezolu[ie slab.
Astzi snt folosite cu precdere coloane capilare care se prezint sub forma unor
tuburi metalice de cupru , o[el inoxidabil sau din sticl cele din urm fiind trase ntr-un
film de poliamid sau de aluminiu pentru a le mri rezisten[a mecanic la incovoiere.
Coloanele capilare snt goale, au diametre interioare submilimetrice i lungimi de zeci
de metrii putnd depi i o sut de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare
i rezolu[ie mare n schimb din cauza cantit[ilor extrem de mici de substan[ analizat
au au o limit de detec[ie sczut i un timp de analiz mai ridicat. Din cauza
volumului extrem de mic necesar ntr-o coloan capilar , de ordinul l, ale amestecului
gazos de analizat nainte de intrarea n coloana cromatografic se folosete splitarea
(divizarea) probei ,prin aceast opera[ie numai o mic parte a acesteia, la limita dozrii
volumice, este admis n colan cealalt parte fiind purjat n atmosfer. Aceast
cantitate emic de substan[ analizat este motivul limitei de detec[ie mai sczute. Att
coloanele cu umplutur ct i cele capilare pot func[iona n regim de cromatografie de
absorb[ie (gaz- solid) sau n regim de cromatografie de reparti[ie (gaz - lichid).
La folosirea coloanelor cu umplutur pentru cromatografia de absorb[ie umplutura
este format dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de reparti[ie
umplutura este format dintr-un material poros figura II.5, a crui suprafa[ este
impregnat cu o faz lichid sta[ionar.
Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate n gazcromatografie. a- coloane cu umplutur pentru
cromatografia de absorb[ie, 1-perete coloan, 2-umplutur poroas . b-coloane cu
umplutur pentru cromatografia de reparti[ie, 1-perete coloan, 2faz sta[ionar lichid
depus pe umplutur, 3-umplutur. c-coloan capilar cu film lichid sub[ire, 1-perete
coloan, 2-film lichid , d-coloan capilar cu strat sub[ire impregnat cu lichid, 1-perete
coloan, 2- film lichid, 3-strat granular sub[ire.
La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film i capilare cu strat.
La coloanele capilare cu film, figura, faza sta[ionar ader sub forma unui film sub[ire
de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura,
faza stationar este aplicat sub forma unui strat sub[ire de diatomee impregnat cu faza
lichid sta[ionar. n cadrul cromatografiei de gaze snt valabile tot rela[iile stabilite la
ceromatografia de lichide cu condi[ia ca influen[a temperaturii i a presiunii s fie
redus la maxim. n acest scop procesul de sparare n coloan trebuie s fie izoterm
iar trecerea amestecului n faz gazoas ct mai rapid posibil.
Pentru alegerea corect a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie s se
[in cont de urmtoarele:
- propriet[ile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiz, absorb[ie
rezidual) snt propor[ionale cu lungimea crescnd deci cu creterea acesteia
- singura proprietate pozitiv a coloanei i anume capacitatea ei de separare
crete abia cu ptratul lungimii coloanei, acesta fiind i motivul folosirii unor
coloane de lungime medie de 20 -30 m n locul unor lungimi ce pot depi 100
m. Afar de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiz i absorb[ia
rezidual deoarece ea este propor[ional cu lungimea drumului parcurs de faza
mobil n mediul absorbant
- Atunci cnd se solicit o separare avansat se vor folosi coloane de lungime
mare cu recomandarea ca drept gaz purttor s se foloseasc hidrogenul
deoarece se reduc sensibil timpii de analiz. Trebuie avut n vedere c aici
crete timpul de analiz
- Reducerea timpului analiz prin mrirea presiunii ini[iale a gayului purttor
duce la reducerea capacit[ii de separare a coloanei capilare
II.2.1.4. Cuptoare de termostatare
Temperatura coloanei este un parametru esen[ial pentru gazcromatografie
deoarece ea provoac practic gradientul de presiune ce transport gazul prin coloan.
Creterea Temperaturii duce la creterea exponen[ial a presiunii amestecului gazos
care la rndul ei duce la creterea vitezei de migrare reducnd sensibil timpul de
reten[ie. n general se consider c o cretere atemperaturii cu cca 30
0
C duce la
reducerea la jumtate a timpului de reten[ie. n realitate nu intereseaz viteza absolut
de migrare ci viteza relativ de migrare v
r
ca fiind raportul dintre viteza medie v
ma
liniar a substan[ei analizate raportat la viteza medie v
mg
a gazului purttor:
mg
ma
v
v
v
r

valoarea vitezei relative de migrare se situeaz ntre 0 i 1, ceea ce nseamn vc la
valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mic, iar la valoarea 1
nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traverseaz coloana cu
aceei vitez cu gazul purttor nefiind re[inu[i diferen[iat n timp diferi[ii componen[i.
Care valoare intermediar ntre zero i 1 este optim depinde n mare parte de
dificultatea separrii. Temperatura optim a coloanei depinde de temperatura de
fierbere i de gradul de separare. Pentru amestecuri a cror temperatur de evaporare
se situeaz ntr-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ
bun c o temperatur egal sau ceva mai mare dect temperatura medie de
evaporare a probei duce la un timp de elu[ie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce
reprezint valori acceptabile. Dac se folosete acest ra[ionament se apeleaz la
regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constant). In cadrul lucrului n regim
izoterm valoarea temperaturii trebuie men[inut constant n limitele 0,1
0
C motiv pentru
care coloana se gsete ntr-un cuptor termostatat . n cazul unor probe cu un interval
mare de fierbere este de dorit s fie folosit un program de temperatur n cadrul
cruia temperatura este crescut fie n mod continuu fie n trepte . La injec[ie proba se
gsete la temperatura cea mai sczut optim pentru componentele volatile dar
necorespunztoare pentru componentele cu temperatur de vaporizare mare. n timpul
analizei temperatura este crescut progresiv pn cnd se ob[ine n final temperatura
corespunztoare componentelor volatile. n cadrul programelor de temperatur nu
trebuie depit ns temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative
de migrare v
r
II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie
II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor
La ieirea din coloana gascromatografice exist condi[ii optime de msurare pentru
multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rnd substan[e gazoase pure cu o dilu[ie
ideal realizat cu un gaz inert. Pentru identificri calitative este indicat folosirea de
spectrometre la ieirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combina[ii snt:
gazcromatograf- spectrometru de mas ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru n
infrarou cu transformat Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativ a probelor (
probe a cror compozi[ie calitativ este deja cunoscut) s-au impus cteva detectoare
utilizate la ora actual la scar mare acestea se clasific dup principiul lor fizic n:
- Detectoare sensibile la varia[ie de concentra[ie
- Detectoare sensibile la varia[ie de debit masic
La detectoarele sensibile la varia[ie de concentra[ie semnalul electric al
detectorului este propor[ional cu concentra[ia momentan a substan[ei (i) din volumul
din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la varia[ie de debit masic
semnalul electric al detectorului este propor[ional cu debitul masic (M
i
), adic cu masa
de substan[ ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile
la varia[ia de concentra[ie snt influen[ate de debitul de gaz purttor motiv pentru care
debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea men[inerii constante a valorii
lui. Influen[a debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la
varia[ie de debit masic.
Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii
fizice neelectrice ntr-o mrime electric propor[ional. La detectoarele sensibile la
Fig.II.6. Componente duntoare ale semnalului electric al detectoarelor
varia[ie de concentra[ie sensibilitatea detectorului este dat de raportul dintre
semnalul electric E
i
i concentra[ia substan[ei i din gazul purttor, iar la detectoare
sensibile la varia[ie de debit masic sensibilitatea este dat de raportul dintre semnalul
electric E
i
i debitul masic M
i
- mas n unitate de timp). Prin nregistrarea semnalului
electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric I-mA) n func[ie de
timp se ob[ine cromatograma. Un detector nu d numai un semnal electric util ci
con[ine i componente duntoare sau parazite precum: abateri, zgomot de fond ,
drift (plaj de variaie) , figura II.6., care pot duce la erori importante de msurare.
Abaterile periodice i au originea n reglrile periodice automate ale temperaturii i
debitului gazului pe cnd oscila[ii neperiodice trebuie puse mai ales pe seama coloanelor
de separare inclzite incomplet sau murdare. Zgomotul de fond are frecven[ ridicat
este specific fiecrui detector i electronicii sale aferente i se manifest mai ales atunci
cnd amplificarea electronic a semnalului este mare. Componentele parazite din
semnalul electric se determin n felul urmtor: din semnalul nregistrat al detectorului n
func[ie de timp se alege ntimpltor un interval de 15 minute si se traseaz pe ambele
pr[i ale liniei de baz a semnalului dou linii paralele n aa fel nct aceste linii s
ating tangen[ial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari.
Drift-ul , figura , este definit ca fiind nclina[ia celor dou linii paralele fa[ de abscis.
Abaterile snt definite ca distan[a ntre cele dou linii. Pentru stabilirea mrimii
zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezin cel mai mare zgomot.
Nivelul zgomotului de fond se determin prin mrimea distan[ei ntre cele dou linii
paralele ce unesc vrfurile semnalului de zgomot.
Limita de detectare L
d
reprezint o msur a concentra[iei mg/l sau a debitului
masic g/s celor mai mici a substan[elor analizate nc detectabile de un senzor
cromatografic: Pentru descrierea capacit[ii unui senzor folosit n cromatografie se
folosete exclusiv limita de detectabilitate i nu sensibilitatea lui. Limita de detectabilitate
se determin din raportul dintre nivelul tuturor semnalelor parazite praportat la
sensibilitate S:
L
d
=p/S
Numai atunci cnd diferen[a E ntre valoarea mrimii msurate i valoarea medie a
unei analize oarbe este de trei ori mai mare dect abaterea standard (s) a tuturor
semnalelor parazite p se poate sus[ine cu o siguran[ de 99% c c un punct de
msurare oarecare P de pe cromatogram reprezint un punct a semnalului util i nu a
componentelor parazite ale semnalului. La acest ra[ionament se iau n calcul numai
abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumtatea semnalului de
eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este modificat n practica
cromatografic n sensul c se iau n considerare att abaterile pozitive ct i cele
negative , msurtorea fcndu-se vrf vrf. Din aceste msurtori ar rezulta prin
mpr[ire un factor f , (f =1,5 (n loc de 3) pentru distan[a punctului de msurare P de
la valoarea median a semnalului de abatere . de regul pentru calculul limitei de
detectabilitate L
d
se fololosete un factor f =1,2 2:
L
d
=(1,5...2) semnal de abatere /S
i
L
d
=(5...10) semnal de abatere /S
i
n conformitate cu alte standarde snt folosite i alte valori pentru factorul f, de ex
IUPAC recomand f =3.
Limita de determinare real L
det
reclam valori mai mari pentru (f) dect n
cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie s fie cuprins ntre 5-10
corespunztor cu siguran[a statistic cerut pentru rezultatul msurtorilor.
Constanta de timp () , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a
electronicii aferente, reprezint timpul care trece din momentul ini[ierii msurtorii
pn n momentul n care este indicat 63,2% a ntregului semnal. Dup (5) se ob[in
99,3 % a ntregului semnal
Fig.II.7. Influen[a consatantei de timp asupra timpul de rspuns t
Selectivitatea unui detector S
i,j
descrie sensibilit[ile diferite pentru dou
materiale diferite i i j. Selectivitatea S
i,j
este indicat ca fiind raportul sensibilit[ii
detectorului pentru cele dou substan[e:
S
ij
=S
i
/S
j
Dac sensibilitatea pentru substan[a j se apropie de valoarea unu detectorul este
specific pentru substan[a i, (S
i
= )
Domeniul liniar al unui detector, figuraII.8, reprezint domeniul unde
sensibilitatea S
i
este constant . n partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita
Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie
de detectabilitate L
d
. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal
de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n
coordonate dublu logaritmice suprafa[a peak-ului A
i
sau a semnalului detectorului E
i
n
func[ie de cantitatea m
i
a probei, concentra[ia C
i
, respectiv fa[ de debitul masic Q
mi
i,
figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint sensibilitatea S
i
n
func[ie de cantitatea de prob folosit m
i
, n func[ie de concentra[ia C
i
sau n func[ie de
debitul masic Q
mi
i, figura II.8.b. Valoric domeniul liniar se exprim prin raportul dintre
limita superioar a domeniului liniar i limita de detectabilitate, este obligatorie i
indicarea naturii substan[ei analizate i. Domeniul dinamic al detectorului este plasat n
continuarea domeniului liniar i reprezint domeniul n care o modificare a concentra[iei
sau a debitului masic mai provoac o modificare sensibil i posibil de calibrat a
semnalului detectorului, figura II.8.a,b.
II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flac ( FID)
Detectorul de ionizare cu flacr, figura II.9, este un detector folosit pentru
substan[e organice ( hidra[i de carbon) ce are aplica[ia de baz la cromatografele de
gaze deoarece mbin o sensibilitate ridicat cu robuste[ea. Un detector de ionizare
cu flacr este de cca 1000 ori mai sensibil dect un detector de conductivitate termic.
Alte domenii de aplicare ale acestui detector snt la supravegherea apelor privind
prezen[a de hidrocarburi volatile precum i la supravegherea polurii atmosferei i a
aerului din spa[ii interioare cu hidrocarburi gazoase. Principiul detectorului se bazeaz
pe msurarea conductivit[ii electrice unei flcri de hidrogen plasat ntre doi
electrozi. Substan[ele de analizat snt transportate n flacr cu un gaz purttor unde
snt ionizate termic datorit aportului de cldur din flacr. n felul acesta n cmpul
electric dintre cei doi electrozi apare un curent ionic msurabil care este nregistrat n
func[ie de timp de ctre nregistrator sub form unor vrfuri (Peak-uri) cu aplica[ii n
analiza chimic calitativ. Intensitatea semnalului electric al detectorului (nl[imea
maxim al Peak-ului) este liniar i propor[ional cu con[inutul de hidrocarbur ntr-un
domeniu foarte larg de concentra[ie , cu aplica[ii n analiz cantitativ. Din acest motiv
concentra[ia unei hidrocarburi poate fi determinat direct din semnal fr a se folosi
curbe de etalonare. Unele substan[e organice ( de ex. acidul formic, acetaldehida) au
detectabilitate slab . Alte substan[e precum: gazele nobile, H
2
, N
2,
NO
2
, CO, CO
2
,
H
2
O , CS
2
, NH
3
, 0
2
, CCl
4
sau alte legturi de halogen , halogenuri de siliciu
Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-areztor, 2-flacr de
hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare i afiare
Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea
concomitent a compozi[iei calitative i cantitative moleculare precum i a celei
calitative i cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. n acest scop este
folosit un gazcromatograf echipat cu detector FID dispozitivat cu o structur
spectrometric modular format dintr-o sond, compus la rndul ei dintr-o lentil
colimatoare, o fibr optic, un spectrometru miniatural compact echipat cu re[ea de
difrac[ie fix , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informa[ii spectrale de emisie
atomic precum i un sistem de procesare, afiare i tiprire spectre. Sonda se
monteaz perpendicular pe direc[ia de ardere a flcrii de hidrogen i valorific emisia
spectral a atomilor elementelor chimice excitate n flacra de hidrogen la cca 3.000
0
C. Informa[ia spectral ajunge prin lentila colimatoare i fibra optic pe re[eaua de
difrac[ie a unui spectrometru miniatural, iar dup difrac[ie, pe un detector Diode-Array
care mpreun cu microprocesorul spectrometrului furnizeaz spectrograma de
emisie atomic a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in
amestecul de gaze analizat.
Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3-
sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din
sticl de cuar[, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu re[ea de difrac[ie i
detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre
II.2.1.5.3. Detectorul pentru compui de azot i fosfor (NPD)
Detectorul pentru azot i fosfor este un detector modificat de tip FID care con[ine o
surs alcalin de silicat sub forma unei perle din sticl sau ceramic dopat cu
elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce elibereaz uor electroni. Perla alcalin este
fixat pe o srm de platin ntre flacra de hidrogen i electrozii colectori de electroni
ai detectorului, figura fiind nclzit att pe cale electric prin srma de platin pus sub
tensiune ct i prin flacra de hidrogen, n jurul ei formndu-se un nor termic plasmatic
care prin norul de electroni emii are totdeauna sarcina negativ fa[ de sarcina
pozitiv a electrozilor colectori .
Detectorul NPD poate fi folosit n dou moduri:
- ca detector de fosfor (P)
- ca detector de azot (NP)
n cazul utilizrii lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacra de hidrogen arde ca la
detectorul FID deasupra arztorului cu deosebirea c arztorul este legat la pmnt,
figura, deoarece electronii rezulta[i din arderea unor componente ce con[in atomi de
carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , snt respini n
acest caz de poten[ialul negativ al perlei scurgndu-se la mas, n schimb electronii
ce iau natere pe suprafa[a perlei alcaline , al cror numr este propor[ional cu
concentra[ia de fosfor, ajung nestingheri[i la electrozii colectori formnd semnalul
electric al detectorului. n ce privete mecanismul propriuzis de reac[ie trebuie artat c
la nceput se formeaz n flacr oxizi de fosfor cu un numr impar de electroni , prin
fixarea a electronului impar se formeaz n prima faz anionii diferi[ilor acizi fosforici
care n flacr snt oxida[i n flacr cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,
a)
b)
Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P).
1-arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin,
6-plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare
ocazie cu care electronul fixat este eliberat i se constituie n semnalul electric al
detectorului. La folosirea detectorului pentru compui de azot mecanismul este
asemntor ca la fosfor deoarece i i azotul are un numr impar de electroni care
duce la formarea de oxizi numai c acetia se descompun prea repede i nu
reac[ioneaz cu perla alcalin . Dac n schimb se scade regimul termic de nclzire al
perlei se formeaz radicali cian care dau reac[ie alcalin specific . Pentru a reduce
regimul termic se micoreaz debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 l/min i cel de
aer la cca 100 l/min, condi[ii n care flacra de hidrogen se stinge iar aportul slab de
hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui n
jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian forma[i prin piroliz
termic fixeaz un electron iar anionii CN
-
forma[i reac[ioneaz cu hidrogenul
respectiv cu radicali OH
o
cu formare de compui neutrii de tip CO
2
, H
2
O, N
2
cu
eliberarea unui electron ce se constituie , aa cum s-a mai artat, n semnalul
detectorului .
Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putnd fi folosit n principiu
pentru toate elementele care au un numr impar de electroni , inclusiv pentru compui
volatili de bor i arsen , utilizarea lui de baz este totui cea pentru compui fosfor i
azot n regimul de lucru N-P, figura II.11 b. n regimul de lucru numai pentru fosfor
(regimul P) detectorul este selectiv pentru compui de fosfor dar are sensibilitatea mai
redus ca n regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru
de tip N) nu este posibil fiind indicate alturi de compui de azot totdeauna i compui
de fosfor , binen[eles dac acetia snt prezen[i n amestecul de subsatan[e analizate
II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termic
Detectorul de conductivitate termic este unul din cele mai vechi detectoare
folosite n cromatografie. El se bazeaz pe msurarea continu a conductivit[ii termice
a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purttor i amestecul gazos de analizat,
figura. Conductivitatea termic este o mrime fizic specific naturii i concentra[iei
substan[elor. Amestecuri de gaze de compozi[ii i concentra[ii diferite ce scald cei patru
rezistori nclzi[i ai pun[ii Wheatstone modific propor[ional cu natura i cu
concentra[iilor substan[elor rezisten[a acestor rezistori ducnd la apari[ia unei tensiuni
de dezechilibru a pun[ii.
Fig.II.12. Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul pun[ii
Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achizi[ie , prelucrare i
afiare, R
1
,R
2
, R
3
, R
4
- rezistori din platin nclzi[i electric
Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute cu
filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o punte
de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de compensa[ie.
n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale bra[elor pun[ii, trece
gazul purttor pur, iar prin celelalte dou bra[e ale pun[ii trece gazul purttor n amestec
cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt parcurse de un curent electric care
provoac nclzirea acestora prin efect J oule-Lenz. Temperatura srmelor i prin aceasta
i rezisten[a lor electric depinde de conductivitatea termic a gazelor ce trec prin
celule. Modificri ale compozi[iei gazelor provoac prin conductivit[ile lor termice
specifice modificri corespunztoare de temperatur i prin aceast modificri ale
rezisten[ei electrice a filamentelor de srm. Diferen[ele de temperatur a filamentelor
n celulele de msurare i n celulele de referin[ duc la un dezechilibru electric
msurabil al pun[ii Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este
propor[ional cu natura substan[ei care traverseaz la acel moment dou bra[e opuse
ale pun[ii , iar valoarea dezechilibrului este propor[ional cu concentra[ia acelei
substan[e din amestecul de gaze. Detectorul de conductivitate termic este un detector
universal, utilizabil la aproape toate substan[ele, singurele ngrdiri snt la substan[e
puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de sczut.
II.2.1.5.5. Detectorul cu capcan de electroni (ECD)
Detectorul cu capcan de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este
un detector specific pentru gazcromatografie folosit n analiza substan[elor sulfuroase,
substan[elor cu azot i a substan[elor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplica[iile de
baz snt n analiza urmelor i n chimia mediului. Detectorul este format dintr-o camer
de ionizare ce con[ine un catod i un anod i un flux continuu de gaz. Pentru ionizare
snt folosite radia[ii () emise de o surs radioactiv sub forma unei folii foarte sub[iri al
izotopului Ni
63
, sursa de radia[ii constituie totodat i catodul, figura II.13.
Descompunerea radia[iei () duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu
moleculele (N
2
) ale gazului purttor i ca urmare iau natere ioni N
2
ncrca[i pozitiv i
electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni ntre cei doi electrozi apare un
cmp electric prin care electronii secundari liberi se deplaseaz spre anod unde produc
un curent electric de c[iva nanoamperi numit curent de ionizare de baz. Dac n
amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare fa[ de electroni atunci aceast
substan[ colecteaz o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micorarea
curentului de ionizare de baz. Aceast micorare afecteaz propor[ional curentul de
baz i reprezint semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcan de electroni
reac[ioneaz la substan[e cu afinitate de electroni cum snt de exemplu substan[e
halogenate precum i anumite pesticide. Sistemul clasic cu msurarea curentului de
ionizare de baz, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv
pentru care n aparate moderne se folosete alt sistem de lucru. Astfel se aplic un
impuls de tensiune cu frecven[ variabil . n momentul n care exist semnalul de
tensiune (0,5 pn la 1s), electronii care nu au reac[ionat cu substan[ele amestecului
de gaze din gazul purttor snt colecta[i de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric
se aleg aa de scur[i pentru ca ionii grei, rezulta[i ca urmare a absorb[iei de electroni,
s nu poat ajunge la anod. Frecven[a semnalelor electrice aplicate nu este constant ci
modificat continuu n sensul asigurrii unei intensit[i de curent constante. Dac n
detector intr prin amestecul de gaze un numr mare de molecule electrofile pentru
compensarea scderii sub limit a curentului (ca urmare a scderii numrului de
electroni) se mrete frecven[a curentului. La acest mod de lucru semnalul util al
detectorului nu-l mai reprezint micorarea curentului de ionizare de baz ci modificarea
frecven[ei tensiunii aplicate n scopul men[inerii constante a intensit[ii curentului ,
frecven[a semnalului fiind propor[ional cu concentra[ia moleculelor captoare de
electroni. Prin timpul de pauz ntre semnale se asigur n limite largi un numr de
electroni liberi constant , ceea ce nsemn c i la concentra[ii mari ale substan[ei de
analizat snt suficien[i electroni la dispozi[ie pentru ionizare. Numrul de electoni se
adapteaz concentra[iei substan[ei de analizat prin acesta extinzndu-se sensibil i
domeniul liniar.
Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1
Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni
63
, 3- amplificator electronic, 4-
sistem electronic de prelucrare i afiare
Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativ pentru diferite clase de compui organici
Gruparea chimic Sensibilitatea relativ
Hidrocarburi 1
eteri, esteri 10
Alcoli alifatici, cetone, amine 100
Legturi mono-Cl- i mono-F-, mono-Br-, legturi di-Cl i di-F 1000
Aldehide i legturi tri-Cl 10
4
Legturi mono-J -, di-Br- i legturi nitro 10
5
Legturi di-J -, tri-Br-, legturi poly-Cl i poly-F 10
6
Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al
ierarhizrii. Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri
chimice deoarece ea depinde de structura legturilor .
II.2.1.5.6. Detectorul de emisi e atomica
Detectorul de emisie atomic (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14,
reprezint o realizare relativ recent fiind legat n principal de evolu[ia detectorului de
tip Diode- Array. Eluatul ce prsete colana cromatografic este introdus ntr-o
plasm termic de heliu generat ntr-un cuptor cu microunde . Energia nalt a
plasmei atomizeaz toate elementele din prob provocnd emisie atomic specific a
acestora . Prin decompunerea radia[iei rezultate cu o re[ea de difrac[ie rezult
spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode Array. Marele
avantaj al acestui tip de detector este analiza multipl fiind posibil detectarea mai
multor elemente n acelai timp. Profitnd de prezen[a unei plasme de nalt energie
deja existent la spectrometrele clasice cu plasm cuplat inductiv (ICP-MS), la ora
actual se realizeaz combina[ii deosebit de performante ntre cromatografe HPLC i
spectrometrele cu plasm cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) i gazcromatografe i
spectrometre cu plasm cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combina[ii snt
avantajoase ca pre[ de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiaz de o plasm
termic deosebit de performant generat de un alt aparat , respectic un spectroscop
cu plasm cuplat inductiv (ICP) prezent poate chiar n acelai laborator.
Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomic. 1-camer cu plasm termic
dat de microunde, 2- plasm termic, 3-oglind plan de reflexie, 4- retea de difrac[ie, 5-
detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem electronic de achizi[ie , prelucrare
i afiare
II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare
Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, n cromatografia de gaze se
datoreaz att selectivit[ii ct i sensibilit[ii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor
Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-camer de ionizare cu radia[ii
ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lamp de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare i afiare
aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizez
ionizarea cu radia[ii ultraviolete a compuilor ce prsesc coloana cromatografic
dup urmtorul model:
e R
R


Doi electrozi colecteaz electronii rezulta[i ca urmare a ionizrii, electroni ce formeaz
de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este propor[ional cu
gradul de ionizare , iar acesta la rndul lui este propor[ional cu concentra[ia specieiei
anlizate ce se gsete n acel moment n camera de ionizare.
II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA
(HPLC)
Cromatografia de lichide de nalt performan[ ( engl. HPLC - High
Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea
de cromatografie de nalt presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografic cea performant i este folosit n separarea i
identificarea calitativ i cantitativ a substan[elor din amestecuri lichide.
Separri i analize de substan[e imposibul de realizat prin alte metode pot fi
realizate uor prin HPLC. Pe de alt parte la aceast tehnic pot fi fcute i
multe greeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experien[
practic bogat dar i de cunostiin[e stiin[ifice fundamentale. Avnd n vedere c
att n cromatografia de gaze (GC) ct i in cromatografia de lichide HPLC starea
de agregare ini[ial a probelor este cea lichid trebuie luat decizia asupra
metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute
n vedere urmtoarele:
- la cromatografia de gaze proba trebuie adus n stare gazoas prin
nclzire fr ca aceast opera[ie s duc la distrugere integrit[ii
moleculare a speciei anlizate , in practic numai cca 20 % din speciile
moleculare ndeplinesc aceast condi[ie [LINDSAY
- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite
de detec[ie mai bune dect la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie fcut in cromatografie lichid
- n cromatografia de gaze exist numai o singur faz sta[ionar care
poate interac[iona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid, cu
aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport
- n HPLC att faza sta[ionar ct i cea mobil pot interac[iona mai selectiv cu
proba . Multitudinea acestor interac[iuni selective face cromatografia HPLC
multilateral fa[ de cromatografia de gaze cu ea putnt fi rezolvate
probleme de separare avansat deosebit de complexe.
- n situa[iile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru
gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai
rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de
compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
dect un cromatograf pentru HPLC.
La cromatografia HPLC faza mobil purttoare denumit "Eluent"
mpreun cu substan[ele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei
pompe printr-o coloan cromatografic de separare ce con[ine faza sta[ionar.
n mod obinuit naintea coloanei de separare propriu zise se cupleaz o pre -
coloan de separare pentru re[inerea impurit[ilor, coloan care este sensibil
mai ieftin dect coloana de baz. O coloan de separare ntr-un cromatograf
HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm iar debitul de faz mobil este
cuprins ntre 1-5 ml/min.
La ora actual exist urmtoarele metode de cromatografie de lichide :
- cromatografie prin absorb[ie
- cromatografie prin reparti[ie
- cromatografie prin schimb ionic
- cromatografie de excludere cromatografie prin gel
La cromatografia schimbtoare de ioni faza stationar este este o rin
schimbtoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea
interac[iunilor intre ionii probei i grupele schimbtoare de ioni din rin . In
cromatografia de excludere ca faz sta[ionar este folosit un gel cu pori mari
care poate separa moleculele dup mrime i form , la acest tip de
cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai rapid sistemul cromatografic.
Cromatografia cu lichide supracritice
Dac n timpul separarii cromatografice compozi[ia substan[ei de analizat
rmne constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic.
Dac compozi[ia fazei analizate este schimbat n timpul procesului de
separare dup o modalitate prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de
gradient .Cea din urm tehnic este folosit atunci cnd domeniul timpilor de
reten[ie a moleculelor din prob este att de mare nct acetes nu pot fi eluate
ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solven[i.
Detectorii folosi[i n HPLC lnt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei
nu rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite
molecule sau clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un
detector universal i de inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul
de ionizare cu flacr FID din cadrul cromatografiei de lichide, n schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoper un numr mult mai mare de
substan[e dect cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe snt
greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup prsirea coloanei
cromatografice ntr-o form detectabil tehnic denumit derivatizare dup
coloan. Ca i la alte cromatografii n condi[ii tehnice date pentru analiza
calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a
traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de
retenie. Dat fiind numrul extrem de mare de substan[e organice unele
substan[e au timpi de reten[ie identici situa[ie n care peak-urile se suprapun
putnd da natere la erori importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui
neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC snt spectrometrele. Tot
mai des ieirile din coloanele cromatografice se cupleaz la spectrometre
clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de mas (MS) situa[ia clasic fiind
cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combina[ii de aparate au sisteme de
performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automat prin
compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare, n momentul
sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu spectrele etalon din
bibliotec electronic de spectre.
II.3.1. Aparatura folosit n cromatografia HPLC
Cromatografele de lichide de nalt performan[ snt formate dint-un
sistem de vase cu solven[i, o pomp de nalt presiune , o coloan
cromatografic , unul sau mai mul[i detectori , i un sistem de prelucrare a
datelor , ele mai snt completate cu elemente de reglare automat a debitului , a
presiunii i a temperaturii. In figura II.16 este reprezentat schema de principiu a
unui cromatograf de lichide.
Fig. II.16. Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt
presiune, 3-manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas
presiune, 6- sistem distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- distribuitor,
10,11-filtru, 12-sistem de injec[ie prob, 13-purj, 14-pomp de nalt presiune , 15-
precoloan, 16-filtru, 17-distribuitor, 18-coloana cromatografic, 19-incint de
termostatare coloan, 20-detector, 21- amplificator electronic, 22-sistem de achizi[ie i
prelucrare date, 23-sistem de calcul, 24-imprimant
Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solven[i organici puternici
sau soluii tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n
traseul lor de la recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate
materialele folosite pe acest traseu trebuie s prezinte o rezisten[ chimic
corespunztoare. O alt recomandare este aceea ca volumul mort , denumit i
volum extracolumnar, ntre introducerea probei i traversarea detectorului s fie
men[inut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o l[ire de band (vezi i
cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin msuri
constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC
Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n
esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai
prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se
poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de
eluent pompa.
Solvent Pompa Injector Coloana Detector nregistrator
Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC
II. 3.1.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de nalta performanta
(HPLC)
Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii n
cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o
coloana si care pot nregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum
decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar
semnalul lor.
ntruct coloanele de separare performante au capacitati de ncarcare mici,
sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca n LC volumul
de proba este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum
apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic.
n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de
analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de
instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinatia dintre un detector
refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza
polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar
posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica n urma adaugarii, cu
un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate
practica chiar nainte de introducerea probei n coloana, dar si dupa iesirea din coloana
a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pna n prezent n special legata de
metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza
unor amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu
aminoacizi).
Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente
analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.
II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici n UV-VIS
Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC,
ct si n HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie
colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe
de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-
Beer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita
de detectie sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS
(prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la
ntreaga scala, l. engl.). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de
0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele
substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au
grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este
vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor
hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH
2
). ntre
acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici
etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de
debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct propor[ionala cu coeficientul
de extinc[ie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui
mrita lungimea celulei dar aceasta este restric[ionata. Sensibilitatea este de ordinul
5x10
-8
g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza
doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa
luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un
domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui
astfel de detector este prezentata n figura II.18.
Sursa Monocromator Celula nregistrator
Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric
2. Detectorii policromatici mai frecvent utiliza[i n cromatografele HPLC moderne permit
si selectarea lungimii de unda la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic
absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai
mare siguran[a analizei, n sensul ca permite stabilirea purit[ii, adic daca picul
constituie un semnal dat de o singura substan[a sau de un amestec (ceea ce se
cunoate sub numele de stabilirea purit[ii picului).
Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentat n figura II.19.
Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1l-10l care este
intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treac prin
celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la
fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta mrete intensitatea semnalului) si apoi la
sistemul de achizi[ie, prelucrare si afiare a datelor ob[inute (8); rezultatul este o
cromatograma (9) ale crui picuri va oferi informa[ii calitativa si cantitative despre
substan[ele din solu[ia analizata.
Fig. II.19. Principiul de func[ionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substan[a ce vine de
la coloana cromatografica,3- substan[a ce pleac, 4- geam de cuar[, 5- tub capilar
prin care circula substan[a de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7-
amplificator,8- sistem de achizi[ie, prelucrare si afiare a datelor, 9-
cromatograma,10- cuva detectorului
II. 2.1.2. Detectori refractometrici
Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.
Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de
transmitere a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refractie dat. Astfel, un
fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente
unul continnd doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura
II.20
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
I
t
Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2-
amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6-
fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10-
cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in func[ie de
unghiul sub care cad razele
Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul primete un semnal de corec[ie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel
are loc compensarea modificrii indicilor de refrac[ie. In urma deplasarii urubului 8 ,
sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic
nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea
relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia
eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.
II. 2.1.3. Detectorii electrochimici
Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si
cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv
reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat
detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante
momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda
analiza si identificare a substantelor.
M 1
2
3
4
5 6
6
9
7
10
8
C
I
t
Exista doua tipuri de detectori electrochimici:
- Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti
- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la
substantele organice;
II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici
Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde
substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n
cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici
inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-
1ng). Detectorii conductometrici msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din
doi electrozi situa[i in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta
este msurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata.
Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat n figura
II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati
din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula
conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica
conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub
forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A
doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce
la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in
cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de
ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu
5kH.
Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta
frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat
ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica,
6- amplificator, 7- sistem de achizi[ie, prelucrare si afiare a datelor, 8-
cromatograma in coordonate conductivitate si timp
8
1 2
3
4
6
7
H 5
II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici
Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din
trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar
alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de
referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba
cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt
negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa.
Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul.
Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta
inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.
Fig.II.22. Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele
ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4-
celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substan[a de analizat, 6-
electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem
de achizi[ie, prelucrare si afiare a datelor,10- cromatograma in coordonate
intensitatea cinetica si timp
Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta
10
1
2
3 4
5
6
7
8
9
t
i
E3 E4 E5 E6
0
E0 E1 E2 E(mv)
-i
+i
t
I
Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama
potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se
duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se
duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).
II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta
Detectorii de fluorescenta se bazeaz pe msurarea intensit[ii fluorescentei
pentru substan[ele ce prezint acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care
apare la unele substan[e cnd sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substan[e emit radia[ii
pe o lungime de unda mai mare dect a radiatei incidente. Daca emisia de radia[ii are
loc in acelai timp cu emisia de radia[ie ultravioleta incidenta fenomenul se numete
fluorescenta. Putini compui prezint fluorescenta iar cei ce nu prezint pot fi
transforma[i in deriva[i ai lor ce au aceasta proprietate.
Fluorescenta s-a artat a fi foarte folositoare ca proces de detec[ie iar cu detectorii
baza[i pe fluorescenta s-au ob[inut unele dintre cele mai nalte sensibilitati din
cromatografie de lichide. Tehnicile de detec[ie bazate pe fluorescenta confer o buna
sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci cnd se folosesc
instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina
de fluorescenta este msurata pe un fundal ntunecat( sau la zgomot de fond redus).
Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poat fi msurata instrumental, raportul
dintre cantitatea de radia[ie remisa si cantitatea de radia[ie UV incidenta trebuie sa aib
valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este
aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90), figura
II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar
interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal
aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru).
Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce
monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi
foarte sensibil si relativ ieftin).
Fig.II.24. Principiul de func[ionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radia[ie, 2- fanta,
3- filtru, 4- lentila, 5- substan[a ce vine de la coloana. 6- substan[a de analizat, 7-
cuva cu pere[i de cuar[, 8- unghi de 90 grade,9- substan[a ce iese din cuva, 10-
lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem
de preluare, prelucrare si afiare a datelor, 16- cromatograma.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
13
14
15
t
I 16
Principiul de func[ionare: Radia[ia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radia[ia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele ob[inute sunt afiate
sub forma unei cromatograme (16).
II. 2.1.5.Detectoare Diode Array
Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu
determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.
Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care
emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar
lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7).
Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda
acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este
preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare,
prelucrare si afiare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele
pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o
cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si
timpii lor de retentie (analiza calitativa).
Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10
-7
g/ml iar domeniu dinamic
liniar de 5x10
3
.
Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25
Fig.II.25. Principiul de func[ionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radia[ii ultraviolete, 2-
substan[a ce vine de la coloana cromatografica,3- substan[a ce pleac la tratament
chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substan[a de analizat, 6-
re[ea de difrac[ie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achizi[ie si
afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de
unda)
1
2 3
4 5
6
7
8
9
10
I
t
II. 2.1.6. Alti detectori
In practica analitica se mai ntlnesc si alti detectori prezentati schematic n tabelul
2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria
de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin
alte variante de detectie n lipsa etaloanelor cunoscute.
Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre
cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate
substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti n proba.
Tab. II.2. Alti detectori utilizati n LC
Detectori LC Limita de
detectie
Caracteristici Disponibilitateco
merciala
Fluorimetrici 1-10pg Este necesara uneori derivatizarea
Sensibilitate 10-10M
Da
Electrochimici
(Amperometrici)
10pg =1ng Sensibilitate 10-10M
Compusi oxidabili sau reductibili
Da
Bazati pe
Spectrometria
de Masa (MS)
100pg -
1ng
Necesare coloane capilare
Necesara pulverizarea
Pret de cost ridicat
Da
FT-IR 1g Pret de cost ridicat Da
Difuzia luminii 10g Adecvati pentru macromolecule Da
Activitate optica 1ng Pentru substante optic active Nu
Electrozi ion
selectivi
10ng Doar pentru ioni sau compusi
ionizabili
Nu
Fotoionizare 1pg- 1ng - Nu
II. 3.2. El ectroforeza capilara
Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea
componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu.
Electroforeza poate fi:
fara medii stabilizante;
cu medii stabilizante.
Mediile stabilizante pot fi:
hartia electroforetica;
geluri speciale pe placi de sticla;
structuri de pulberi depuse in tuburi.
Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza
fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a
montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand
sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de
gradientul lor de potential, fig. II.26.b.
Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante
Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita
incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC
doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe
cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre
electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de
detectare al eletroforezei capilare).
Fig.II.27. Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica,
4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie,
8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achizi[ie si afiare a datelor, 11-
cromatograma electoforetica
Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii
electrice U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in
functie de potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din
amestecul de analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la
dreapta la stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei
+ +
-
_
Solutie
tampon
C
B+C
A+B+C
A
A+B
A
C
B+C B
a
b
electrozi
I
t
+
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
_
vor fi detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un
amplificator. Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achizi[ie si
afiare a datelor care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din
amestecul analizat sub forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este
caracterizata de timpul propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului
corespunzator ofera informatii despre cantitatea de substanta existenta.
Avantaje ale electroforezei capilare sint:
- separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC i creste cu
cit tensiune electrica aplicata este mai mare
- pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC;
- fiabilitate mai buna decit la HPLC