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PURIFICACIN DE cc-AMILASA DE
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
MEMORIA
Que para optar al Grado de Doctor en Ciencias Qumicas PRESENTA
2
34 mi fFamifia
yafEva.
Tu este proceso afaptativo nadh es intiL lbs primeros groseros errores, as como l4sjakas rutas por orn/e la imaginacin se aventura, son necesarios, pues acaban por conucirnos al ziertailero camino, y entran, por tanto, en el xjto flng como entran en elacabao cuauro elartista lbsprimeros informes bocetos. la conquista e la nueva verd4constituye, sin d?sputa, 14 Ventura ms gratule a que puele aspirar elzombre. Los halagos e la vaniad las efrsiones el instinto, lbs caricias e la fortuna, paUteren ante elsoberanoplacer e sentir cmo brotan y recen las alas el espritu y cmo, alcomps el esfrerzo, superamos la ficultay ominamos y renufinws a la esquita naturaleza. Santiago L&amny Cajal, Los tnicos e la voluntadYlS9S).
El presente trabajo de investigacin se ha desarrollado en los laboratorios de Fisicoqumica de los Procesos Industriales del Departamento de Ingeniera Qumica de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la direccin de los Profesores Titulares J05 Aracil Mira y Mercedes Martnez Rodrguez.
AGRADECIMIENTOS El trabajo de investigacin que se expone en esta memoria se ha realizado a lo largo de los ltimos cuatro aos, aproximadamente. En el desarrollo de un trabajo de este tipo, muchas son las personas o instituciones que, de una forma u otra, se encuentran relacionadas con el mismo. Las aportaciones o influencias procedentes de cada una de ellas han servido para enriquecer y mejorar el resultado final del trabajo. Por ello, deseara expresar mi agradecimiento a las siguientes personas e instituciones:
-
A Pepe Aracil y a Mercedes Martnez porque desde que comenc a trabajar bajo su direccin, all por el curso 1989/90 (con un parntesis intermedio de tres aos), me han transmitido su experiencia y conocimientos en las materias en las que he trabajado. De ellos siempre he recibido ayuda y apoyo, tanto personal como profesional y confiaron en m para desarrollar el proyecto de investigacin que ahora concluye y que se ha convertido en la presente tesis doctoral.
A Roberto Soriano, por su ayuda y colaboracin en el trabajo diario del laboratorio y porque juntos empezamos a estudiar la adsorcin de wamilasa y juntos hemos comenzado a comprender y descubrir las peculiaridades experimentales y tericas que esconden los procesos cromatogrficos.
A Juanfran Escobedo. porque su punto de vista y consejos bioqumicos me han facilitado, en muchas ocasiones, el trabajo con las enzimas. Adems, su compaa y presencia en el laboratorio nos ha alegrado a todos muchas largas tardes de trabajo.
A Marimar Abad y M~ ngeles Fernndez, porque afrontaron problemas experimentales cuya resolucin he adoptado, habindome sido de gran utilidad en el desarrollo del presente trabajo.
A los compaeros y compaeras del laboratorio, Daniel Garca, Rafael Garca, Toms Garca y Almudena Cotern, con quien he compartido estos aos de tesis y a Geinma Vicente, Ana Renedo, Rocio Delgado, Joaqun Aguilar y Bea, que se unieron posteriormente al grupo, porque siempre han estado dispuestos a ayudar en lo que hiciera falta.
A mi hermano Jos Manuel, por compartir connigo parte de sus conocimientos acerca de las enzimas, permitindome comprenderlas un poco mejor, y por la ayuda prestada por l y su Mac para bucear por Internet y encontrar la informacin que buscaba.
A Flix, Mariajo y Amalia, del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular IV, por la ayuda prestada con la electroforesis de las muestras de a-amilasa.
Al Prof. Amador Haro por permitirme utilizar la cmara fra y algunos equipos del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular 1. Asimismo deseo expresar mi agradecimiento a Jos Luis, por su ayuda y consejos en el manejo de dichos equipos para la cristalizacin de la enzima.
A mi familia, que siempre ha estado presente y a quien debo mi educacin, que me ha apoyado para realizar los estudios que deseaba y seguir el camino que he ido trazando a lo largo de mi vida.
A mis amigos, que siempre lo han hecho, y a todos aquellos que en algdn momento me han animado y se han interesado por mi trabajo, porque aunque no se lo haya dicho, siempre lo he aaradecido y me ha servido de ayuda. A Eva Atanes, porque ha visto crecer este trabajo desde su inicio, lo ha vivido y compartido con casi tanta intensidad como yo mismo. Porque su presencia a mi lado ha sido el apoyo que nunca me ha faltado y que me ha permitido llegar hasta aqu.
Tambin quiero expresar mi sincero agradecimiento por la financiacin recibida de la Unin Europea (Proyecto BE-8 138, Programa Brite EuRam IT), DGICYT (Proyecto B1094-1508CE) y Comunidad Autnoma de Madrid (Proyecto AE00265/94), sin la que no hubiera sido posible la realizacin de este trabajo.
NDICE
1. INTRODUCCIN 1.1.- a-AMILASA 1.1.1.- Estructura y actividad cataltica 1.1.2.- Produccin 1.1.3.- Propiedades fisicoqumicas 1.1.4.-Aplicaciones
Procesado del almidn Produccin de etanol Produccin de cerveza Produccin de jarabes azucarados y edulcorantes Panificacin
4
5
10 14 18 19
21
21
22 22
ji Produccin de azcar Detergentes Industria textil Produccin de acetona y butanol Produccin de cido lctico Biomasa microbiana 1.1.5.- Mtodos de purificacin 1.2.- PURIFICACIN DE PROTENAS .2.1.- Etapas primarias 1.2.2.- Etapas de purificacin de alto valor aftadido Interaccin hidrofbica Intercambio lnico 1.3.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 1.4.- BIBLIOGRAFA 2. TRANSFERENCIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO QUMICO EN LOS PROCESOS DE ADSORCIN 2.1.- INTRODUCCIN 2.2.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIA 2.2.1.- Transferenciade materia en la capa limite externa 2.2.2.- Transferenciade materia en el interior de los poros Difusin molecular Djfiusividad de Knudsen Dusividad en macrnporos Dijhsividad superficial 2.2.3.- Acoplamiento de mecanismos difusionales 2.2.4.- Velocidad dc adsorcin 2.3.- EQUILIBRIO DE ADSORCIN. ISOTERMAS
INDICE
23 23 23 24 24 24 24 25 26 27
29
35 40 41
53 53 54 54 55 55 56 56 57 58 59
60
iii 60
62
2.3.1.- Introduccin
2.3.2.- Isoterma lineal 2.3.3.- Isoterma no lineal Isoterma de Lan gmuir Isoterma de Freundlich Otras isotermas
62 62
63 63
64 67
67 69
3.2.1.- Introduccin 3.2.2.- Modelo 3.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 33.1.-Introduccin 3.32.- Modelo
Establecimiento de hiptesis Balance de materia en tajase lquida Balance de materia en una seccin radial de la partcula Condiciones de contorno e iniciales
69 69 74 74 76
76
77
77
78 78 78 79
80 80 81
81 82
Iv
INDICE
3.5.- BIBLIOGRAFA 4. CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLISIS 4.1.- CARACTERIZACIN DEL ADSORBATO 4.1. 1.- Determinacin de la cantidad de protena total Mtodo de absorbancia en ultravioleta Mtodo de Bradford
82
89
89 90 91
91
92 92 94 94 95
96
96 97 97
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99 99 100 101 101 102 102 102
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105 106
Adsorcin en fase gaseosa Porosimetra de mercurio Absorcin de lquido Tamao de partcula por dispersin de luz 4.5.- BIBLIOGRAFIA 5. EXPERIMENTAL 5.1.- PREPARACIN DE LOS ADSORBENTES 5.2.- CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) 5.2.1. Materiales 5.2.2.- Equipo experimental 5.2.3.- Relleno y preparacin de las columnas de HPLC 5.2.4.- Desarrollo de un experimento 5.2.5.- Experimentos previos Adsorbentes
pH
106 107
109
109 110 113 113 114 115 115 116 117 117 118 118 118 119 119 120 120 120 120 121 122 123 123 123
Fuerza inica Coticen tracin de adsorbaro Tamao de partcula Caudal Temperatura Volumen de inyeccin Reversibilidad 5.2.6.- Condiciones de operacin 5.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 5.3.1.- Materiales 5.3.2.- Equipo experimental Sistema de adsorcin
vi
INDICE
Sistema termosttico Sistema de agitacin Sistema de recirculacin Espectrofotmerro ultravioleta Medidor de pH 5.3.3.- Desarrollo de un experimento 5.3.4.- Experimentos previos pHyfuerza inica Velocidad de agitacin Concentracin inicial Tamao de pan(cula Volumen de disolucin Masa de adsorbente
5.3.5.- Condiciones de operacin
123 123 124 124 124 125 125 126 126 126 127 127 127 127 28 129 129 129 130 130
30
54.- ADSORCIN EN LECHO RIO 5.4.1.- Materiales 5.4.1- Equipo experimental Mdulo de elucin Columna Mdulo de anlisis Mdulo de pH Colector de fracciones Mdulo de control 5.4.3.- Desarrollode un experimento 5.4.4.- Experimentos previos
Caudal
Concentracin inicial
vii
Tamao de partcula Dimensiones del lecho Temperatura 5.4.5.- Condiciones de operacin 5.5.- BIBLIOGRAFA 6. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN
133
133
133 134 134 137
6.1.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO 6.1.1.- Planificacin de experimentos 6.1.2.- Intluencia de las variables de operacin
Clculo de la porosidad de la columna Hidrofobicidad de la resma Duolite XAD-761 Carga caracter~sica de la a-amilasa en la resma Duolite A-S68 Influencia de las variables
143
144
6.3.1.-Planificacin de experimentos
6.3.2.- Resultados 6.4.- ADSORCIN EN LECHO FIJO 6.4.1< Planificacin de experimentos 6.4.2< Resultados experimentales Efcto del caudal Efecto de la concentracin
168
169 174 174 176 178 180
vn
INDICE
Efecto de la temperatura Efecto del tamao de partcula Efecto de la altura de lecho 6.4.3< Estabilidad y reutilizacin de la columna 6.5< HIBLIOGRAFIA
181
i 83
7. MODELADO MATEMTICO
7.1< ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 7.2< ADSORCION EN LECHO FIJO 7.3< BIBLIOGRAFA
ANEXO 13. AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLISIS ESTADSTICO ANEXO C. FIGURAS C. 1< EXPERIMENTOS DE ADSORCIN EN TANQUE AGITADO
C2< EXPERIMENTOS DE ADSORCIN EN LECHO FIJO C.3< MODELADO DE LA ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 227 237 237 242 246
ix
255
265
1. INTRODUCCIN
El espectacular avance que han experimentado la ingeniera gentica y la ingeniera bioqumica en las dos ltimas dcadas ha permitido el desarrollo y la aparicin de un gran nmero de productos y procesos biotecnolgicos de nueva creacin as como la sustitucin de otros, que se realizan en la actualidad por procesos convencionales. Esta situacin de rpido crecimiento contina en la actualidad gracias, en parte, al sinergismo producido por el acoplamiento de las diferentes disciplinas de la ciencia, bsica y aplicada, y la tcnica que se van sumando al desarrollo de la biotecnologa. Esta parte de la ciencia se est desarrollando en base a tres panes ltndamentales: la produccin, el control de bioprocesos y la recuperacin y purificacin del producto final. A cada una de ellas, que est en proceso de evolucin y ramificacin, se le estdn aadiendo nuevas disciplinas de la ciencia y la tcnica y otras ya establecidas que se han adaptado a las caractersticas particulares de
los procesos y los productos biotecnolgicos. La separacin y purificacin a escala industrial de una protena procedente de un caldo de
fermentacin es una etapa bsica en la biotecnologa de procesos actual, ya que, en general, representa el mayor coste de produccin. La viabilidad econmica y la competitividad de un proceso
INTRODUCCIN
biotecnolgico depende no solo de las innovaciones llevadas a cabo en la produccin gracias al avance de la biologa molecular, inmunologa. microbiologa, etc., sino tambin de la innovacin y optimacin de los procesos de purificacin (Wbeelwright, 1987). En algunos procesos
bioteenolgicos, las etapas de separacin y purificacin pueden llegar a suponer entre un 50 y un 80% de los costes de operacin. El diseo de bioprocesos, econmicamente rentables, a escala industrial para la purificacin de protenas supone la obtencin de rendimientos elevados, altos niveles de pureza y ininimizacin de costes, para lo cual es necesario realizar las siguientes acciones (Asenjo, 1990): (a) definicin de las especificaciones del producto final, (b) caracterizacin de las propiedades fisicoqumicas de la mezcla y (c) definicin de las etapas de purificacin y de las restricciones del sistema. La definicin del producto final supone el conocimiento previo de la aplicacin a la que se va a destinar. En esta etapa es necesario establecer la pureza y concentracin requerida de la protena que se va a obtener, as como los niveles permitidos para cada una de las impurezas que lo acompaan. Las especificaciones comerciales de pureza para las protenas utilizadas en medicina suelen ser mucho ms estrictas que las correspondientes a las protenas industriales. Esta situacin se hace especialmente crtica en el caso de la produccin de vacunas, de las que es imprescindible eliminar trazas de determinadas impurezas a fin de evitar posibles reacciones inmunognicas indeseadas. El conocimiento de las propiedades fisicoqumicas del caldo de fermentacin y de los componentes que lo integran es ttndamental para el diseo del proceso de purificacin. Es necesario determinar la cantidad y tipo de impurezas presentes, concentracin del producto, lugar de localizacin (citoplasmtica, periplsmica, extracelular, cuernos de inclusin), caractersticas tisicoquimicas (punto isoelctrico, masa molecular, carga, hidrofobicidad
Este ltimo aspecto puede influir y determinar el tipo de operacin unitaria adecuada para la purificacin o discriminar las que no son viables para el mantenimiento de la actividad cataltica propia de la protena que se persigue purificar. Una vez realizadas las dos primeras etapas (a) y (b), es necesario definir las operaciones de separacin que se incluirn en el proceso. Como primera aproximacin se pueden aplicar una serie de reglas heursticas para la seleccin de estas etapas (Wheelwright, 1987: Asenjo y Patrick, 1990): (1) Seleccionar etapas de separacin que se basen en diferentes propiedades fsicas. qumicas o bioqumicas. Un proceso de purificacin suele ser ms efectivo si cada una de las etapas que lo forman se basa en una propiedad diferente de los componentes que se desean separar Por ejemplo, una operacin de ultrafiltracin seguida de cromatografa de intercambio inico o de afinidad.
(u) Elegir procesos de purificacin que maximicen las diferencias entre las propiedades
del producto y las impurezas.
sustancias no deseadas que lo acompaan. (iii) Separar las principales impurezas lo antes posible.
Esto generaimente supone una reduccin de la cantidad total de material que se va a
procesar, elevando la concentracin del producto. Esta situacin implica varias ventajas de forma conjunta; en primer lugar la reduccin de la corriente que se alimente a las posteriores etapas disminuye el tiempo de procesado as como los costes de operacin asociados a las mismas; en segundo lugar, en el proceso de eliminacin de la impureza mayoritaria se suelen eliminar tambin otras con propiedades similares. (iv) Realizar la etapa ms cara o compleja al final. A lo largo de un proceso de purificacin, el volumen o la masa de material para procesar disminuye a medida que se desarrolla cada una de las etapas que lo componen. Los costes de produccin aumentan proporcionalmente a la cantidad procesada por lo que es aconsejable utilizar operaciones de alto coste, como la cromatografa de atiidad, cuando esta cantidad es lo menor posible. Desde el punto de vista tcnico, hay operaciones de separacin ms adecuadas para tratar los elevados volmenes que existen al inicio del proceso. (vi) Utilizar una etapa de alta resolucin lo antes posible.
Esta regla implica el diseo de procesos de purificacin con el menor nmero de etapas posible y, por tanto, una importante reduccin de costes. Por ejemplo, en un proceso constituido por diez etapas en serie, en la que cada una de ellas tenga un rendimiento del 90%, el rendimiento final en el producto de inters ser menor del 35% (como muestra la figura 1.1). Dentro de las etapas de alta resolucin destacan, por su versatilidad y facilidad de escalado, las tcnicas cromatogrficas. Existen diversos tipos diferentes de cromatografa dependiendo del mecanismo de interaccin y retencin del adsorbato por parte de la fase estacionaria (como se describe en el apartado 1.2), como son la cromatografa de interaccin hidrofbica y en fase reversa. de intercambio inico, de afinidad, fltracin en gel, etc.
Para utilizar de una forma eficaz los mtodos de purificacin a escala industrial es necesario un profundo conocimiento del comportamiento dinmico del proceso. Una forma adecuada de expresar dicho comportamiento es mediante el uso de modelos matemticos fenomenolgicos~. Estos
INTRODIJCCIN
expresan la evolucin temporal de las variables dependientes del proceso de purificacin (concentracin de salida, pureza,
...)
operacin del mismo. Los modelos matemticos se proponen a partir de una serie de hiptesis basadas en la observacin experimental del sistema objeto de estudio y encuentran su utilidad en el desan-ollo (le diseo del proceso de purificacin as como en la simulacin y optimacin de sus diferentes etapas. Esto ltimo es de gran importancia debido a la considerable contribucin de las etapas de separacin-purificacin en el coste global de produccin, pudiendo alcanzar hasta el 80 % del mismo para el caso de determinadas protenas teraputicas (Kenney, 1990). La optimacin de aquellas, de la forma ms rigurosa posible, es fundamental para la rentabilizacin y viabilidad de cualquier proceso biotecnolgico integrado. loo
SO
.0
a o,
o
60 40
E 5
4>
20
o
0 1 2 3 4 5 6 7 5 9 10 II 12 Nmero de Etapas
Figura
1.1.- ct-AMILASA
La a-amilasa (1,4-a-D-glican glicanohidrolasa; EC 3.2.1.1) es una enzima que cataliza la hidrlisis de los enlaces ~-.4-glicosidicos del almidn, quedando como productos de reaccin poli- y oligosacridos de diferente longitud, a-dextrinas y el disacrido maltosa. La a-amilasa es una enzima presente en prcticamente todos los organismos vivos (Raimbaud el al., 1989; Vihinen y Mantsla, 1989). Se han identificado y estudiado a-amilasas desde clulas procariotas de Los gneros <Bacillus, Streptomvces, Acromonas, Escherichia, Saccharomycopsvs, Strepococcus,
...)
hasta
ratas, humanos), posiblemente por ser un mecanismo qumico general para la obtencin de glucosa para el metabolismo energtico de estos organismos.
Alanina Arginina Asparragina cido Asprtico Cisteina Glutamina cido glutmico Glicina Histidina Isoleucina Leucina
Lisina
37
37
o
0
lo
26 44 lo 18
lo
26
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o
3
9
19 12
12
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.7
o
l
-2
27 34 20
9
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34 20 9 14
o o
o
o
21 37 40 9
34 29
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36 40 10 34 30
478
o
1
o
1
Total
478
Las diferencias encontradas entre las secuencias de aminocidos obtenidas por ambos mtodos (una adicin, una supresin y diez sustituciones) no afectan a ningn residuo perteneciente al centro activo, pudiendo deberse a variacin entre las cepas utilizadas para cada uno de los estudios
1989.
INTRODUCCIN
(Tada eta!., 1989). La estructura secundaria y terciaria de la a-amilasa de A. oryzae se ha estudiado en profundidad mediante difraccin de rayos X (Matsuura et al., 1979; Matsuura et al., 1980; Matsuura et al., 1984; Boel el al., 1990; Swift et al., 1991). La molcula es un elipsoide cuyas dimensiones se han calculado en 80 x 45 x 35
A.
terminal (residuos 1 al 380) y carboxilo terminal (residuos 384 al 478). El primero de ellos est constituido a su vez por dos subdominios, denominados A y B. El A (residuos 1 al 121 y 177 al 380) consta de una estructura supersecundaria de barril (a/(3)8 en la que existen ocho a-hlices rodeando a ocho lminas [3,en su mayora paralelas, que forman el barril. Este tipo de estructura se ha identificado en otros 16 tipos de protenas, todas ellas con funcin cataltica (Farber y Petsko, 1990). Asimismo, parece ser una estructura bsica en la mayora de las cz-antilasas de diferentes orgenes, incluso en aquellas con baja homologa en estructura primaria. De estudios indirectos (MacOregor y Svensson. 1989; Raimbaud et al., 1989) se desprende la conservacin de este dominio que es tambin observado en otras -amilasas cuya estructura tridimensional se ha determinado en especies tan alejadas como Aspergillus niger y cerdo (Brady et al., 1991; Qian et al., 1993).
Dominio A
Dominio
C
Dominio
Figura 1.2: Esquema de la disposicin de las estructuras de a-hlice (O) y lminas g (O) que forman los dominios A, 3 y C. Los extremos amino terminal y carboxilo terminal vienen sealados por N y C respectivamente (Fuente:
Matsuura el al., 1984). El pequeo subdomiio B (residuos 122 al 176) se localiza a partir del bucle siguiente a La tercera lmina ~ hasta la tercera a-hlice del subdominio A. Consta de tres hojas
I~
antipaxalelas, as
como de una regin de estructura ms irregular formada por bucles dc interconexin. El dominio carboxilo terminal, C, (residuos 384 al 478) pliega ocho estructuras de lmina j~
2TAA) y se han representado grficamente mediante el programa RasMac Molecular Graphics, Machintosh version 2.5 ( R. Sayle, 1994). La a-amilasa es una exoenzima que cataliza la escisin, al azar, de los enlaces a-D-1,4
internos de las largas cadenas de polisacridos de que se compone el almidn. El almidn, la forma principal de almacenamiento de hidratos de carbono en las plantas, es un polmero de a-D-glucosa
que existe como mezcla de dos formas: amilosa y amilopectina. La primera es un polmero prcticamente lineal en el que las subunidades de glucosa se encuentran unidas por enlace a-D-l,4, llegando a alcanzar tamaos cuya masa molecular se encuentra alrededor de 300000. La amilopectina es un poimero ramificado cuya masa molecular puede oscilar entre 1.5
3.0
lOt consistiendo en
cadenas lineales formadas por subunidades de glucosa unidas entre si por enlace a-D-l,4 y ramificaciones dc 20 a 30 subunidades unidas a la cadena lineal por enlaces a-D-1,6. El almidn procedente de los cereales consiste, aproximadamente, en un 20 - 30% de amilosa y un 80 amilopectina.
o GiuIBfi - 70%
de
Asp2fl\.< Hs 210
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340
lo
INTRODUCCIN
las subunidades de glucosa en posicia 4 y 5. La mayora, sino todas, las protenas secretadas por hongos filamentosos se encuentran
glicosiladas. En particular, la a-amiasa de A. o,zae contiene una sola cadena de oligosacrido unida a un residuo de asparragina (Asn-197). Se han propuesto diferentes estructuras (Yamagucl et al., 1971; Minobe et al., 1979) constando todas ellas de varias subunidades de manosa unidas a la
protena a travs de dos restos de N-acetil glucosamina.
Man ~Man Man Man~ Figura 1.6: Esquema de la estructura del oligosacrido de la a-amilasa de A. oryzae, donde Man y GIcNAc representan, respectivamente, subunidades de D-manosa y de N-acetilglucosamina (Minobe et al., 1979). Man
GlcNAc
GtcNAe
CD
1.1.2.- Produccin La a-amilasa procedente de A. oryzae fue la primera enzima microbiana producida a escala industrial y comercializada (Takamine, 1894). El producto obtenido se denomin Takadiastasa y su produccin se realizaba mediante cultivo en superficie (denominado semislido). Las ventajas de los cultivos sumergidos radican en la mayor facilidad de medir, controlar y modificar los factores y parmetros que influyen en el proceso (pH, temperatura, transferencia de oxgeno, composicin del substrato,
...)
que se produce a-amilasa, hay una casi total falta de informacin acerca de las condiciones de
crecimiento y produccin de los microorganismos desarrolladas por las compaas productoras. Sin
embargo existen bastantes estudios a escala de laboratorio y planta piloto sobre la influencia de las condiciones de operacin en las que se desarrolla la fermentacin de los diversos microorganismos
productores de a-amilasa. En la actualidad el A. oryzae es el microorganismo ms ampliamente utilizado como fuente productora de a-amilasa de origen fngico. En la literatura se encuentran numerosos estudios en los que se investiga la influencia de las condiciones experimentales en el crecimiento del microorganismo y en la produccin de a-amilasa, as como de los diferentes tipos de operacin en los que se
ADSORCIN
11
arroz (Meyrath y Bayer, 1980; Nakadai y Nasuno, 1988). Este ltimo tipo de fermentacin se ha usado tradicionalmente en Japn para producir el preparado enzimtico koji. Respecto a la influencia de la fuente de carbono, se ha encontrado que para cultivos de A. oryzae en operacin continua, la maltosa induce a la produccin de a-amilasa entre un 50 y un 70%
ms eficazmente que la glucosa (Carsen, 1994). Otros estudios sealan, tras la maltosa y en orden decreciente de eficacia, el a-metil-D-glicsido y el almidn como inductores de la sntesis de aamilasa (Yakubi et al., 1977). Sin embargo, el almidn produce mayores niveles de la enzima que la maltosa, dextrinas y otros azcares simples cuando se utiliza como fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo (Malik y Chaudhary, 1977). Experimentos llevados a cabo en sistemas continuos y semicontinuos (Carsen, 1994) indican que. en el caso del A. oryzae, el crecimiento celular est relacionado, casi linealmente, con la
otros relativos a otras a-ainilasas Iiingicas. Jarniewicz y Wlodarczyk (1978) seleccionaron una cepa de A. niger y desarrollaron un medio de cultivo basado en destilados procedentes de patata
suplementado con almidn, obteniendo niveles altos de produccin de a-amilasa durante la fermentacin. Tambin se han estudiado los parmetros de escalado en fermentadores agitados y aireados para este mismo microorganismo (Ghildyal et al., 1980). El hongo comestible Calvatia
12
INTRODUCCIN
postenormente, a la generalizacin del cultivo sumergido aireado de este y otros microorganismos productores de enzimas amilolticas. Las diferentes a-amilasas procedentes de distintas especies generan una amplia variedad de distribuciones de oligosac&idos como productos finales de la hidrlisis del almidn. La a-anilasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens produce maltohexosa como componente mayoritario mientras el Bacillus licheniformis da, principalmente, maltopentosa y maltosa. La glucosa es obtenida solamente como producto minoritario (Norman, 1981). Se ha observado que la fermentacin de 8. amyloliquefaciens en operacin semicontinua produce un 60% ms de actividad amiloltica que en operacin discontinua cuando se trabaja a altas concentraciones de substrato que actan como inhibidor del crecimiento o cuando se generan cepas mutantes menos eficaces durante el proceso fermentativo (Yoo et al., 1988). La seleccin de cepas mutantes de baja productividad de a-amilasa tambin se ha demostrado en fermentaciones en
continuo de 5 subtilis (Fenc y Pazarova, 1982). En el citado estudio se comprueba que el uso de
medios de cultivo en condiciones de limitacin de nutrientes se favorece la seleccin de mutantes de baja productividad. Sin embargo, cuando se cultiva en medios ms complejos y ricos en nutrientes, la produccin de enzimas extracelulares no es una desventaja y se promueve la seleccin de cepas superproductoras.
13
mediante la utilizacin de diversos monosacridos (Salto y Yamamoto, 1975). Gracias al avance de la ingeniera gentica, se han logrado desarrollar microorganismos mediante mutacin gentica y seleccin fenotpica aadido a procesos de transferencia de genes entre diferentes especies. De este modo se logran obtener altos niveles de expresin de protenas recombinantes. En general, la produccin de este tipo de protenas se encuentra promovida en condiciones de fermentacin que perjudican la velocidad de crecimiento del microorganismo, para
alcanzar relaciones ms favorables entre la protena de inters y el resto de protenas del organismo
productor. En la fermentacin del B. subtilis, al que se le ha introducido el gen que expresa dicha protena en la bacteria termfila Bacillus stearothermophilus, la sustitucin de glucosa por almidn como fuente de carbono hace disminuir la velocidad de crecimiento de las clulas recombinantes a la vez que favorece la produccin de cz-amilasa por unidad de masa celular y aumenta el perodo de tiempo en el que se est produciendo dicha enzima (Lee y Parulekar, 1993). Una estrategia adecuada para la obtencin de a-amilasa mediante este microorganismo es la de realizar una primera etapa de fermentacin en discontinuo, en la que se favorezca el crecimiento celular, seguida de una fermentacin en semicontinuo con las condiciones apropiadas para obtener mayor actividad enzimtica. De este modo, se obtienen aumentos de produccin enzimtica de hasta el 54% respecto al cultivo desarrollado en una sola etapa en discontinuo. En fermentaciones continuas llevadas a cabo con 8. suhtilis recombinante (Wei et al., 1989), se ha comprobado que la actividad especfica de aamilasa disminuye al aumentar la velocidad de dilucin as como la velocidad especfica de
fermentacin desde 1.0 mg/mI, en el caso de la cepa original deA. oyzae, hasta 12.0 mg/ml en el caso
de la cepa recombinante. En la actualidad, no slo se encuentran patentados procesos de produccin en los que se utiliza a-amilasa, recombinante o no, como catalizador de determinadas reacciones qumicas sino que tambin estn sujetos a patente los procedimientos de donacin as como los vectores de expresin
utilizados para producir enzimas recombinantes (Levin y Joyet, 1986). Ms recientemente, se ha estudiado la produccin de enzimas extracelulares mediante el uso
de clulas inmovilizadas. Se ha observado que el crecimiento de clulas a partir de esporas inmovilizada de A. niger, Penicilium funiculosum y Phanerochaete chrysosporium por atrapamiento en gel de alginato clcico produce distribuciones del microorganismo mis homogneas que la
14
INTRODUCCIN
obtenida por inmovilizacin del micelio ya crecido (Linko et al., 1988). Los valores de temperatura y pH ptimos para la produccin de a-amilasa por clulas de A. niger inmovilizadas son similares a las obtenidas para la fermentacin utilizando el micelio libre, pero la estabilidad trmica de la enzima obtenida es mayor. La fermentacin de 8. subtilis inmovilizado en gel de carrageenan en bioreactores
continuos aireados aumenta la produccin de a-amilasa en un 20% respecto al cultivo en iguales condiciones con las bacterias en suspensin (Guo et al., 1990).
Tambin se han inmovilizado diversas bacterias termfilas anaerobias en gel de alginato para la produccin de a-amilasa y pululanasa mediante fermentacin en rgimen semicontinuo a 60 0C utilizando almidn como substrato (Klingeberg et al., 1990). Los niveles de produccin de a-amilasa aumentan con la inmovilizacin, hasta doce veces, en el caso del Clostridium thermosaccharolyticum y alrededor de dos veces para una cepa de C. thermohydrosulfuricum y para Thermoanaerobacter jinnii. Las fermentaciones llevadas a cabo con otra cepa mutante de C. thermohydrosulfuricum y con Clostridium thermosulfurogenes no han mejorado los resultados obtenidos mediante el cultivo de esas especies en suspensin. Sin embargo, otros autores ponen en duda la eficacia y utilidad de las fermentaciones de microorganismos inmovilizados. Se han descrito una serie de problemas relacionados con la
1.1.3.- Propiedades fisicoqumicas Las propiedades fisicoqumicas de las diferentes a-amilasas varian en un amplio intervalo dependiendo del organismo productor, indicando una importante adaptacin evolutiva a las condiciones medioambientales.
El pH ptimo para la actividad de las distintas a-amilasas oscila entre, aproximadamente, 2 y 10.5. Para la mayora de las a-amilasas producidas por microorganismos de la especie Aspergillus, este intervalo se limita a 4.5
-
fuertemente acidlilos, pueden encontrar su pH ptimo a valores alrededor dc 2 y de otros alcaltilos a valores de pH iguales o superiores a 10, aunque para la mayor parte de las a-amilasas procedentes
15
80 60 40 20
.3;
O <u ~0
= o
pH Figura 1.7: Efecto del pH sobre la actividad de a-anilasa de A. oryzae a 37 c (Fuente: Ficha Tcnica de Fungamyl HO, Novo
Nordisk A/S,
Bagsv~rd, Dinamarca).
60 40 20
.5 o
.1<
o
0 10 20 30 T~2C) 40 50 60 70
Figura 1.8: Efecto de la temperatura sobre la actividad de aamilasa de A. oryzae a un pH de 4.7 (Fuente: Ficha Tcnica de Fungamyl HO, Novo Nordisk A/S, Bagswrrd, Dinamarca).
En general, la mayora de las a-amilasas son estables en los intervalos fisiolgicos habituales de temperatura y pH. La estabilidad de las enzimas no solo depende de las condiciones de pH y temperatura sino, tambin, de la composicin del medio en el que se encuentren. El intervalo de pH en el que las enzimas son estables, se modifica en funcin de la temperatura y el tiempo de incubacin
16
INTRODUCCIN
en unas condiciones determinadas. En general, puede hablarse de una mayor termoestabilidad de las a-amilasa procedentes de Bucillas. Algunas cepas de 8. stearothermophilus mantienen el 100% de la actividad tras una incubacin a 70 0C durante 24 horas (Manning y Campbell, 1961; Manning et al., 1961). La a-amilasa de A. oryzae es una enzima extremadamente estable en el intervalo de pH 5
- 8,
no detectndose desactivacin, de forma significativa, tras largos perodos de tiempo en estas condiciones (Carsen, 1994). En la figura 1.9 se muestra la estabilidad de la a-ainilasa en funcin del pH a dos diferentes tiempos de incubacin.
% Actividad residual
120
100 80 66 40 20
10
11
pH
Figura 1.9: Estabilidad de la a-amilasa de A. oryzae en
Funcin del pH del medio. Incubada a 30 0C durante 30 minutos (O) y durante 14 horas (A) (Fuente: Carsen ci al., 1996). En condiciones ms extremas, ~icidas y bsicas, la enzima se desactiva en gran medida en un intervalo muy estrecho de pH. Bajo incubacin a pH cido, la inactivacin de la a-amilasa de A. oryzae sigue una cintica de primer orden, cuya constante aumenta parablicamente con la disminucin de la concentracin de protones en el medio (Cansen el al., 1996). Estos mismos estudios indican que el proceso de reactivacin de a-amilasa desactivada por cido sigue tambin una cintica de primer orden, aunque la recuperacin de actividad no es, en ningn caso, total. En la figura 1.10 se muestra el proceso de reactivacin a diferentes valores de pH. Este mecanismo de inactivacin propuesto supone la existencia de dos formas inactivas de a-amilasa, una de las cuales est en equilibrio reversible con la forma original activa cuando se aumenta el pH hasta valores neutros. La otra forma corresponde a una a-amilasa irreversiblemente inactiva (Cansen. 1994).
% Actividad residual
17
i 00
80
60
40
20
50
100
iSO
200
250
tiempo (niln)
Figura 1.10: Reactivacin de a-amilasa de A. oryzae inactivada por cido a diferentes valores de pH. Tras incubacin a pH 3.5 durante 120 minutos (desactivacin), se aument a: pH 7.5 (+), pH 6.0 (0) y pH 5.0 (X), respectivamente (reactivacin) (Fuente: Cansen et al., 1996).
Respecto a la inactivacin trmica de la a-amilasa, cuando la temperatura aumenta por encima de un cierto nivel, las enzimas en disolucin acuosa sufren un desplegamiento parcial causado por la ruptura, inducida trmicamente, del equilibrio de interacciones no covalentes que mantienen la estructura nativa de la molcula (Tomazic y Klibanov, 198&b). Esta desactivacin, que supone la prdida estructural del centro activo, es completamente reversible si la temperatura se disminuye rpidamente hasta valores de estabilidad. Para tiempos de incubacin ms prolongados, el grado de recuperacin de la actividad enzimtica no es total, lo que pone de manifiesto la existencia de un
proceso irreversible de desactivacin. La causa de este proceso se debe, probablemente, a un proceso monomolecular conformacional de formacin de estructuras terciarias incorrectas acompaado, en funcin del pH, de oxidacin de los residuos de cisteina o de deandacin de los residuos que
contienen grupos amido. La termoinactivacin irreversible puede evitarse, parcialmente, por adicin de substrato (Tomazie y Klibanov, 1988b). Este proceso se ha estudiado en a-amilasa procedente de
encuentra inmovilizada sobre soportes de diferente naturaleza (Ulbrich et al., 1986). Para este caso, se propone un mecanismo cualitativamente similar al mencionado anteriormente de la desactivacin
cida de esta misma enzima. En l, la enzima activa se puede convertir a una forma inactiva final y en
18
INTRODUCCIN
un intermedio inactivo que, en funcin de la evolucin de la temperatura, puede revertir tanto a la forma inactiva fmal como a la molcula de enzima activa. Otros muchos factores pueden afectar a la estabilidad de la enzima, incluyendo la pureza del preparado (Hanzawa eta!., 1986), la presencia de calcio u otros iones (Vallee et al., 1959), la adicin
de substrato y otras sustancias estabilizantes (Janecek y Balaz, 1992; De Cordt et al., 1994), la
concentracin de la disolucin (Graber y Combes, 1990). La presencia de otras protenas, como la seroalbmina bovina, acta como molcula estabilizadora, probablemente debido a que el aumento de la concentracin de protenas es ventajoso cuando existen proteasas contaminantes de la preparacin
(Carsen, 1994).
1012
- i~
M1)
a-amilasas de otros orgenes se ve inhibida por la presencia de un agente quelante como el etiln diamino tetraacetato (EDTA). la procedente de A. oyzae mantiene prcticamente intacta la suya debido a que la unin es tan fuerte que no es capaz de eliminar el Ca2~ principal de la enzima. Por otro lado, se ha comprobado que la existencia del ion calcio protege a la a-amilasa de la accin de enzimas proteoliticas (Stein y Fiseher, 1958), indicando la formacin de una estructura ms compacta. La existencia de otros iones pueden tener tambin efecto sobre la estabilidad y actividad de la a-amilasa. As, la funcin del Ca2 puede sustituirse, aunque con menor efectividad, con otros cationes divalentes como Sr2~, Mg2~, Ha2 o Zn2~ e incluso algn cation monovalente, Na (Vihinen y Mntsla, 1989). La presencia de CF induce a un leve cambio conformacional en a-antilasa de
pncreas porcino que hace aumentar 30 veces la magnitud de la constante cintica y la constante de unin al Ca2 principal en 240 (Levitzki y Steer, 1974). Otros aniones monovalentes producen este
efecto aunque en menor medida segn aumentan sus radios inicos. El Zn2 parece jugar un papel de centro de unin en la dimerizacin de la a-amilasa procedente deS. subtilis (Valee et al.. 1959).
1.1.4.- Aplicaciones Se ha estimado que el mercado mundial de enzimas industriales, en el ao 1994, fue de unos
1.200 millones de dlares y se encuentra actualmente creciendo a un ritmo del 10% anual (Krauczyk.
1997). A nivel mundial la industria de los detergentes es la que mayor uso hace de las enzimas, con un 39% del total del mercado. A continuacin se encuentra la industria textil (14%) y la industria de procesado de almidn (12%) (Novo Nordisk, 1995).
21
Produccin de etanol En la bibliografa se han descrito numerosos materiales que contienen almidn como materia prima para la produccin de etanol, como son el maz (Wilke a al., 1981), patatas y trigo (Maiorella et al., 1981), raz de mandioca (Lindeman y Rocchiccioli, 1979), etc.
En general, los carbohidratos procedentes de las plantas que contienen almidn no son
directamente fermentables por la mayora de las levaduras, debiendo ser previamente hidrolizados a azcares ms simples. Por ello, en primer lugar, el almidn, es hidratado y gelificado mediante molienda y calentamiento para posteriormente degradarlo a azcares fermentables mediante el uso de
enzimas amiloliticas (a-amilasa, [3-amilasa,glucoamilasa, ...). Se han descrito procesos econmicamente rentables a escala industrial para la produccin de
junto con otras enzimas amilolticas, como sustituto parcial de la malta en la produccin de diferentes
bebidas alcohlicas (whisky, ron, bourbon, sak, etc.). Este mismo principio se ha venido utilizando desde 1945 para producir etanol como combustible.
Produccin de cerveza De manera anloga que en la produccin de licores, la industria cervecera hace uso de la aamilasa con el fin de aumentar la cantidad de azcares fermentables para producir alcohol, reduciendo
a su vez la cantidad de carbohidratos en la composicin final de la cerveza. Tambin se aade aamilasa en determinados momentos del proceso con el objeto de disminuir la alta viscosidad, debido a la existencia de almidn gelificado, a valores razonablemente bajos (Peppler y Reed, 1987). Los
procesos tradicionales utilizan malta como fuente de almidn y protenas, as como diferentes
enzimas, entre las que se encuentran las arniloliticas. La sustitucin de esta malta por cereales no malteados junto con enzimas amilolticas y proteolticas, reduce costes de produccin y facilita la uniformidad en la calidad del producto final. Una aplicacin ms reciente de la a-ainilasa en la industria cervecera es La produccin de
cervezas con bajo contenido calrico. En condiciones normales de elaboracin, las enzimas presentes en la malta no hidrolizan por completo el almidn a azcares fermentables, quedando
aproximadamente un tercio del almidn transformado en dextrmnas no fermentables pero que aportan energa al ser metabolizadas por el organismo. La adicin de amilasas suplementarias permite la
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INTRODUCCIN
en glucosa y fructosa procedentes del maz. Estos productos se utilizan como sustitutos de los jarabes de sacarosa en la industria de alimentacin y bebidas. En 1940 se patent el uso de enzimas comerciales y almidn hidrolizado en la fabricacin de jarabes de maz (Langois y Dale, 1940). La primera aplicacin industrial de una enzima inmovilizada fue la produccin en continuo de jarabes de alto contenido en fructosa mediante la accin combinada varias enzimas amiloliticas (Venkatasubramanian, 1978), dando paso al estudio de la inmovilizacin
de amilasas sobre numerosos soportes (Wykes
1989; Siso ci al., 1990) en procesos de transformacin del almidn (licuefaccin y sacarificacin). La utilizacin de enzimas inmovilizadas en los procesos de hidrlisis del almidn frente al uso de
enzimas en disolucin tiene una serie de ventajas econmicas y tcnicas. Por un lado reduce los costes
de operacin por la posibilidad de reutilizar la enzima y por otro se consigue un mayor control de la reaccin as como una mayor estabilidad de La enzima,
Panificacin
La produccin de pan requiere la utilizacin de sustancias emulsionantes que se aaden a la mezcla de harina, agua, levadura y otros componentes y cuya funcin es la de acondicionar la masa y
suavizar la textura del pan (miga) una vez cocido. Un adecuado acondicionamiento de la masa produce un incremento en la facilidad de mezcla y procesamiento de la misma, mayor capacidad de
retencin de gases, mayor volumen y mejor textura del producto acabado.
La ct-amilasa puede ser utilizada como sustituto de los emulsionantes habitualmente utilizados
por la industria panadera (steres del cido diacetil tartrico, estearoil lactilato sdico, inonoglicridos,
...).
acompaado por una disminucin en el efecto suavizador de la miga. El uso de u-ainilasa favorece el aumento del volumen del pan una vez cocido debido a la produccin de azcares susceptibles de servir de sustrato a la levadura, prolongando la fermentacin y produciendo mayor cantidad de
alcohol y dixido de carbono. Por otro lado, reduce la fuerza de la miga debido a la hidrlisis parcial
del almidn presente en la harina que gelifica durante el proceso de coccin por lo que tambin se logra un retardo en el endurecimiento del pan (Hille, 1990).
PURiFICACIN DE a-AMILXsA DE
23
Produccin de azcar El almidn es un componente natural de la caa de azcar que se encuentra en cantidades
variables en funcin de la variedad y condiciones de crecimiento de la planta. Su presencia en cantidades altas puede crear dificultades en el proceso de reno del azcar, causando bajas velocidades de filtracin, bajos ndices de cristalizacin as como turbidez en algunas disoluciones preparadas con los azcares producidos (Namer eta!., 1987). La adicin de wamilasa permite reducir el contenido de almidn en el proceso de produccin de azucar, aumentando el rendimiento y evitando
la aparicin de los problemas citados derivados de la presencia de almidn. Detergentes La a-amilasa (junto con otras enzimas amilolticas, proteasas, celuiasas, lipasas, etc.) se
encuentra presente en la composicin de muchos de los detergentes que se comercializan, con la funcin de actuar sobre las manchas procedentes de alimentos y sustancias ricas en almidn. En 1903, Otto Rhm patent el uso de una proteasa, la tripsina pancretica, aunque su efectividad se reduca debido a la inactivacin producida por la alcalinidad del detergente en disolucin. La introduccin generalizada de las amilasas en la formulacin de los detergentes para ropa se realiz a partir de 1980 (Krauczyk, 1997). Posteriormente, la composicin enzimtica de los detergentes se ha completado
con la adicin de lipasas y celulasas. Las industrias fabrican detergentes con diferente composicin en
enzimas para cada pas o rea geogrfica en funcin de la dieta habitual de sus habitantes e incluso de las costumbres y medios de lavado. En Hispanoamrica, las amilasas se han utilizado en grandes cantidades debido a que su dieta es rica en alimentos que contienen almidn.
Industria textil
Durante el proceso de tejedura a partir de algodn o de mezclas de algodn y fibras sintticas, los hilos se exponen a una considerable tensin mecnica. Con el fin de evitar su rotura, se recubren con una sustancia adhesiva y gelatinosa. Esta sustancia, denominada agente de encolado, suele estar compuesta de almidn o de derivados de este a los que se les pueden aadir otros
polmeros como el alcohol de polivinilo, cido poliacrlico, o carboximetil celulosa. Una vez tejido es necesario eliminar por completo el recubrimiento para lo que se pueden utilizar productos qumicos fuertes como cidos, bases o agentes oxidantes. Sin embargo, desde hace aos se ha preferido el uso
de amilasas que hidrolizan el almidn totalmente sin daar la tela evitando, paralelamente, el alto nivel de contaminacin de las aguas residuales del proceso (Novo Nordisk, 1992).
24
INTRODUCCIN
Produccin de acetona y butanol El proceso Weizmann produce acetona y butanol mediante la fermentacin de azcares por el Chlostridium acetobutylicuni. Dichos azcares se obtienen tras los procesos de licuefaccin y sacarificacin por va enzimtica del almidn procedente de maz, trigo, centeno u otros cereales generando glucosa y maltosa como productos finales (Beech, 1953).
Biomasa microbiana El almidn y los residuos de la industria del almidn sirve como fuente de materia prima
renovable para la produccin de biomasa microbiana. A pesar de que algunas bacterias son capaces de
utilizar almidn, en la mayora de los casos es necesaria una hidrlisis previa del mismo para permitir
su metabolizacin (Busta et al., 1977).
1.1.5.- Mtodos de purificacin Muchos de los trabajos publicados sobre purificacin de a-amilasa estn orientados a la
preparacin de pequeas cantidades de enzima para su posterior caracterizacin y estudio. Esta circunstancia hace que los procedimientos utilizados se centren en la obtencin de la mxima pureza a
expensas de conseguir muy bajos rendimientos y costes unitarios muy elevados. La cristalizacin de
a-amilasa procedentes de diferentes organismos para realizar estudios estructurales mediante difraccin de rayos X es un ejemplo significativo de esta situacin (Qian et al., 1993; Brady et al., 1991; Swift eral., 1991; Ramasubbu eral., 1991; Boel et al., 1990; Buisson et al., 1987; Matsuura er
al.,
1979; Campbell, 1954; Akabori eral., 1954). El almidn entrecruzado ha sido utilizado como soporte de afinidad ya que este polmero es el
sustrato natural de la a-amilasa (Somers et a!., 1995: Zhang eta!., 1994: Rozie eta!., 1991; Somers y Vant Riet, 1990).
La extraccin en sistemas de dos lases acuosas utilizando polietiln glicol/sulfato muestra buenos resultados para la purificacin de a-amilasa procedente del caldo de la fermentacin de B.
subrilis (Schmidt a al., 1994). Procedimientos basados en estos sistemas se encuentran patentados (Ananthapadmanabhan, 1988). En ellos se utilizan polietiln glicol, polipropiln glicol, alcohol
25
polivinlico, dextrano, politeres de silicona, etc. Relacionados con los ltimos se encuentran estudios realizados sobre la concentracin de cx-amilasa mediante la extraccin con micelas reversas (Dekker
et al., 1991).
1990; Yamamoto et al., 1992). Todos estos estudios estn encaminados a la investigacin del mecanismo de retencin implicado o al desarrollo de mtodos preparativos para la obtencin de la enzima purificada. La informacin sobre aspectos cinticos y termodinncos as como la aplicacin de modelos matemticos que describan el comportamiento de la operacin de adsorcin de cr-amilasa
en este tipo de sistemas es muy escasa y se encuentra muy dispersa.
una adecuada coordinacin y disposicin de las operaciones unitarias con el fin de disear procesos eficaces que permitan alcanzar los objetivos especficos planteados. De forma general, los objetivos
de un proceso son los de obtener productos de alto valor aadido a partir de materias primas
relativamente baratas.
Producto
Servicios (aire)
Calor
Residuos
Residuos
La operacin central de un proceso biotecnolgico es la ocupada por el biorreactor, lugar donde se transforman las materia primas en productos mediante biocattisis, fennentacin o cultivo
celular (ver figura 1.14). Sin embargo, esta etapa no tendra utilidad prctica si se encontrase alsada. Es necesario realizar una preparacin y un pretratamiento adecuado a las
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INTRODUCCIN Las operaciones unitarias de separacin basan su eficacia de trabajo en la explotacin de una
propiedad caracterstica diferenciadora entre el producto de inters y el resto de los componentes de la mezcla. Los efluentes de los biorreactores suelen ser complejos, formados por un gran nmero de sustancias con caractersticas similares. Esto hace necesario utilizar diferentes procedimientos en serie para lograr la purificacin final del producto de inters. En la tabla 1.2 se muestran las operaciones unitarias de separacin habituales en procesos biotecnolgicos, indicando la propiedad
Propiedad fisicoqumica
Velocidad de sedimentacin Tamao de partcula Naturaleza intracelular Coeficiente de reparto Solubilidad hidrofbica) (interaccin electrosttica e
Centrifugacin Filtracin, Microfiltracin Homogeneizacin Extraccin en 2 fases Precipitacin Adsorcin fsica Intercambio inico Afinidad Interaccin hidrofbica Ultrafiltracin Filtracin en gel Fase reversa Electroforsis
Fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrgeno, momento dipolar. Carga elctrica Afinidad biolgica, ffincin 1-lidrofobicidad superficial Tamao molecular Tamao molecular Interacciones hidroflicas e hidrofbicas Punto isoelctrico, carga elctrica, tamao molecular, conformacin
27
puede realizarse mediante centrifugacin o filtracin. Esta ltima pese a la mayor sencillez del equipo
utilizado, presenta la desventaja de que la compresibilidad de las clulas o del micelio depositado
sobre el filtro disminuye la permeabilidad, dificultando la operacin (Belter, 1985). La aplicacin de la filtracin tangencial aumenta el caudal de filtrado, respecto a la filtracin tradicional en condiciones equivalentes, en un factor de 100 a 1000 (Gabler, 1985). Otra alternativa atractiva la
constituye la separacin mediante el uso de membranas de fibras huecas (Tutunjian, 1985).
mecnicos, lisis qumica o enzimtica, cboque osmtico, calentamiento, congelacin-descongelacin, uso de clulas mutantes con pared celular deficiente, etc. (Engler, 1985).
Una vez clariticado el medio a purificar, pueden aplicarse gran nmero de procesos que sirven para concentrar el producto de inters, generalmente bastante diluido, e ir eliminando contaminantes
principales. Entre estas etapas pueden destacarse las correspondientes a los procesos de membrana:
ultrafiltracin, smosis inversa, microfiltracin de flujo cruzado y dilisis (Fane y Radovich, 1990), que permiten la separacin en base a la diferencia en el tamao molecular de los componentes. Las separaciones llevadas a cabo en sistemas de dos fases inmiscibles permite una elevada afinidad en condiciones suaves no desnaturalizantes para las protenas (Albertsson er al., 1990). Su aplicacin a la recuperacin de protenas y cidos nucleicos es relativamente reciente, pese a ser esta una tcnica conocida y aplicada a otras sustancias desde hace tiempo. La razn es que hay pocas protenas solubles en disolventes orgnicos comunmente utilizados en la industria qumica y la
mayora de ellos produce un elevado grado de desnaturalizacin en las protenas. La sustitucin de la extraccin tradicional en dos fases, acuosa/orgnica, por dos fases acuosas inmiscibles realizadas a
partir de polmeros solubles (polipropiln glicol
-
permite la formacin de un entorno favorable para las molculas biolgicamente activas evitando, as, su desnaturalizacin (Kula, 1985).
La precipitacin suele utilizarse en las etapas iniciales del diagrama de flujo, produciendo tanto purificacin como concentracin, aunque es esta ltima accin la que realiza de forma ms efectiva. Es una operacin tcnicamente sencilla y econmica, ya que es posible el uso de gran
nmero de agentes precipitantes, muchos de ellos de muy bajo coste y que no producen la desnaturalizacin de los productos biolgicos (Glatz, 1990).
1.2.2.- Etapas de purificacin de alto valor aadido En los casos en los que sea necesario cumplir con las exigentes especificaciones impuestas
28
INTRODUCCIN
grado de pureza del producto, a los niveles mximos de determinados contaminantes o a ambos. Pese a la alta efectividad de separacin y purificacin que tienen los mtodos electroforticos,
su aplicacin a nivel industrial no se halla generalizada, aunque se han descrito algunos trabajos sobre el escalado de la purificacin de a-amilasa de 8. subrilis mediante autoenfoque (Dobrnsky et al., 1987). La cromatografa, es. posiblemente, la tcnica ms ampliamente difundida como etapa de alta eticacia en los procesos de purificacin utilizados en biotecnologa. La denominacin de cromatografa es muy general y engloba a todos los sistemas basados en la interaccin entre molculas disueltas en un liquido (o en un gas) con la superficie de un slido o con ligandos unidos a un slido inerte. Dentro de ella, dependiendo del mecanismo responsable de la interaccin, pueden diferenciarse numerosas tcnicas:
-
Los sistemas cromatogrficos de filtracin en gel se basan en la diferente diflisividad que sufren las molculas de distinto tamao al atravesar una columna rellena de una matriz de porosidad determinadi En operacin normal, las molculas de mayor tamao, al no entrar en el interior de los poros del polnero de la fase estacionaria, atraviesan la columna ms rpidamente que las molculas pequeas. Esto se debe a que el paso de estas ltimas por la columna se retarda al introducirse y diliindirse por el interior de la matriz porosa de la fase estacionaria. Esta caracterstica hace que esta operacin sea adecuada y muy utilizada como procedimiento para desalar disoluciones de biopolmeros. Las fases estacionaria habituales estn basadas en polimeros como son dextrano entrecruzado, poliacrilamida o agarosa. La porosidad se produce al gelificar estas sustancias en contacto con el agua. La naturaleza de estos polimeros. hace que no sean excesivamente rgidos por lo que no permiten la utilizacin de elevados caudales de funcionamiento. Actualmente estn apareciendo nuevos soportes que palan en cierta medida este efecto negativo. Estos soportes rgidos son de vidrio modificado, slice flincionalizada o polmeros como el poli(2-hidroxi-etil metacrilato) (Yarmusli ca al.. 1985). Su utilizacin de tbrma ms generalizada a nivel industrial est condicionada por el limitado desarrollo que presenta en operacin en rgimen continuo. El trmino cromatografa de afinidad (Cuatrecasas ca al, 1968) se refiere a la interaccin bloespecfica entre dos sustancias, una en solucin y otra unida a un soporte slido. Es una herramienta muy valiosa en la purificacin de sustancias biolgicamente activas. La biomolcula se
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une, generalmente de forma covalente, a un ligando unido a un soporte slido inerte. Debido a la alta bioespecificidad, mediante la cromatografa de afinidad se pueden obtener rendimientos elevados por
el ahorro de etapas previas que supone. Los soportes de afinidad suelen ser caros debido a que no son
muy verstiles en cuanto a nmero de diferentes aplicaciones posibles. Deben disearse para cada adsorbato que se quiera purificar ya que una mayor versatilidad llevar acompaada una menor bioespecificidad. Las matrices debern ser fcilmente derivatizables con el fin de poder unir el ligando adecuado para la aplicacin deseada, Las matrices utilizadas son geles de agarosa, vidrio poroso, slice. poliacrilamida, celulosa y diversos hidroxialquil metacrilatos (Yannush y Colton, 1985). Los ltimos desarrollos en cromatografa de afinidad estn enfocados al desarrollo de procesos de inmunoadsorcin. Esto suponen la unin de un antgeno a un anticuerpo inmovilizado a la matriz o viceversa, logrando as una especificidad en la adsorcin no conseguida por ningn otro procedimiento. La tcnica se hace todava ms efectiva si se utilizan anticuerpos monoclonales (l-Iorstmann, 1989). En el presente trabajo se realizar el estudio de la adsorcin de a-amilasa mediante interaccin hidrofbica e intercambio jnico. A continuacin se revisarn con mayor detalle los
aspectos tericos y experimentales correspondientes a ambos mecanismos.
Interaccin hidrofbica A principios de los aos 70 se comenzaron a utilizar fases estacionarias compuestas por ligandos ligeramente hidrofbicos, alquilaminas de diferente longitud de cadena, unidos
covalentemente a matrices inertes de gel de agarosa (Er-EI eral., 1972; Shaltiel y Er-El, 1973) con el
fin de separar y purificar protenas. El trmino Cromatografa de Interaccin Hidrofbica, HIC, fue
introducido por Hjertn (1973) para referirse a la separacin de protenas mediante las interacciones nediadas por sales que se producen entre las zonas hidrofbicas de la superficie de las mismas con
[os ligandos hidrofbicos de la fase estacionaria. Las primeras fases estacionarias diseadas especialmente para su aplicacin en HJC se desarrollaron para paliar la relativa baja eficacia de las anteriores debido a su poca resistencia tsica que no las hacan adecuadas para su uso en columnas de alta presin. Consistan en matrices siliceas con un recubrimiento polimrico de carcter hidroflico y ligandos n-butilo y fenilo (Kato el al., 1983). Ms recientemente se han desarrollado fases
estacionarias con matrices polimricas hidroflicas proporcionando, junto con una elevada resistencia
fsica, una gran estabilidad qumica que permite su utilizacin a valores extremos de pH (Cooke er al., 1990). Esta circunstancia es. sobre todo, adecuada para la regeneracin del soporte ya que la separacin o purificacin de protenas a pH altamente cido o alcalino produce, generalmente, La
desnamrafizacin de Las mismas.
30
INTRODUCCIN
comprobado tambin para aminocidos funcionalizados (Gehas y Wetlaufer, 1990). Entre los ligandos habitualmente utilizados, los de tipo alquilico son los que producen adsorbentes ms hidrofbicos.
seguidos de los de tipo fenlico, politeres y glicoles, siendo necesarias fases mviles de mayor concentracin salina para quedar adsorbidos en estos ltimos. La cromatografa en fase reversa es una tcnica, fundamentalmente analtica, que comparte con la HIC el uso de la diferente hidrofobicidad de las molculas como propiedad que proporciona diferente selectividad y afinidad por un determinado soporte. La diferencia entre ambos tipos de adsorcin reside en el grado de interaccin protena-ligando. En el caso de cromatografa en fase reversa, la densidad superficial de los ligandos unidos a la matriz es muy elevada, por lo que la interaccin con el adsorbato es tan fuerte que es necesario aadir disolventes orgnicos a la fase mvil para disminuir la tensin superficial de la misma y permitir, as, la elucin de las biomolculas retenidas. En estas condiciones se produce la prdida de la estructura nativa de las protenas, quedando expuestos los residuos hidrofbicos del interior de la molcula, lo cual conduce a un incremento adicional en la intensidad de la interaccin. La interaccin que producen los ligandos en
HIC es ms suave debido a la mayor dispersin de los mismos, pudindose variar la fortaleza de la
interaccin hidrofbica modificando la densidad superficial de los ligandos en el soporte (Fausnaugh
eral., 1984). Debido a la menor hidrofobicidad de la fase estacionaria en HIC, en la etapa de elucin
se pueden utilizar fases mviles que no desnaturalizan apreciablemente las protenas. Tambin se ha estudiado el uso de tensioactivos de carga neta nula que, por su naturaleza, no producen efectos desnaturalizantes en la estructura de las protenas a la vez que disminuyen su retencin en columnas con adsorbentes hidrofbicos debido a un efecto competitivo entre la protena y el agente tensioactivo por los Jigandos correspondientes (Bucldey y Wetlaufer, 1989; Bucldey y Wetlaufer, 1990). Por ello, estas substancias pueden ser utilizadas como agentes moduladores de la elucin en HIC. Los fenmenos fisicoqumicos subyacentes en el mecanismo de la HIC de protenas son anlogos a los correspondientes al efecto salino por el cual la solubilidad de las protenas se reduce en
presencia de concentraciones crecientes de sales neutras. Sin embargo, a pesar de dicha analoga, este
efecto es consecuencia de las interacciones hidrofbicas protena-protena a diferencia del mecanismo de retencin en el proceso de HIC que es el resultado de las interacciones inducidas por sales entre las protenas y los centros de unin, ligeramente hidrofbicos, de la fase estacionaria.
PURIFICCIN DE ~-AMILA5A
DhAspergillus oryzae
POR ADSORCIN
31
9
4 ~< a jiaa a A -x .5 -5 A 7
44
<~7-~~
Protena
..----<5-5-9<
a44aa4-a-455
1,q
5~5
7 7 -7 7
~s
> <
-
it
AAAAAAS:ta-4 Ci AL> 7..
~7> <5-
~x-~ Va->-~
<+4
V
~
1<
[3gando hidrofobia-o
,> < 7.
>5 7..
(1)
Zona hidroflsia, de a supercir dc la prolcina
7
(II)
(apa dc anauicculas de agua equncnra das en la s ipcrbcic dc la prota-ina vdd ligando.
Molcula dc agua
Figura 1.15.: Esquema del mecanismo de interaccin hidrofbica. Las molculas de agua sc estructuran alrededor de la protena en disolucin y de cada ligando (1). Las molculas de aguase eliminan de las zonas de interaccin (II). La fuerza impulsora que dirige la adsorcin mediante interacciones hidrofbicas es la ganancia de entropa del sistema (Hjertn, 1973; Fausnaugil er al., 1984). Una molcula de protena en disolucin mantiene una o varias capas de molculas de agua estructuradas alrededor de su superficie. Esta situacin es termodinmicamente inestable ya que supone una disminucin
importante de la entropa en comparacin con la de la protena sin solvatar ms la correspondiente a las molculas libres de agua (Scopes, 1987). Para que se produzca la interaccin entre las zonas no
inicas de la superficie externa de la protena y de un ligando hidrofbico del adsorbente, esta capa deber eliminarse (figura 1.15). En el proceso de interaccin, debido al aumento del desorden de la fase mvil, aumentar la entropa del sistema (AS0> 0). En estos procesos el cambio entlpico suele ser pequeo por lo que la variacin de energa libre, dada por la expresin [1.1] es negativa, ocurriendo el proceso de tbrma espontnea. AGa- =AH0 -TAS0
[1.1]
efecto del disolvente en la agregacin de las zonas no inicas entre diferentes molculas de biopolimeros a partir de los cambios termodinmicos correspondientes al equilibrio de asociacin de
macromolculas en disolucin. La solubilizacin de cada molcula de biopolimero supone la creacin de una cavidad entre las molculas de disolvente. En base a ello, se ha desarrollado un modelo terico que trata de explicar y predecir la retencin de los adsorbatos en HIC (Melander y Horvth, 1977; Horvtli er al., 1977). En l se propone que la magnitud de la interaccin hidrofbica y, por tanto, de
32
INTRODUCCIN
la retencin de las molculas de adsorbato, viene determinada por un balance de energas de Van der Waals, electrostticas e hidrofbicas implicadas en la unin del adsorbato sobre los grupos funcionales de la fase estacionaria. En cromatografa, una forma adecuada de expresar la retencin de un soluto es mediante el factor de capacidad, k, que viene definido de la forma siguiente:
k= tR te ~10 [1.2] donde tR y t0 son, respectivamente, los tiempos de retencin correspondientes al adsorbato y a un soluto que no se adsorba, en iguales condiciones de operacin.
lnk=
--
0 + AG0 ~ 1+ lni(RT 1 ~ RT~ red.~ PV) IAG~ +AG% +AG7.,~~ +AG aaoc.
[13]
Los tres primeros trminos, AGtv, A00ee y AC0vdw, representan la variacin de energa libre neta entre la fase mvil y la estacionaria asociada con la formacin de cavidades, con los efectos electrostticos y las interacciones de Van der Waals respectivamente. Acta,, corresponde al cambio de energa libre para la asociacin ligando-adsorbato en ausencia de disolvente que lo rodee (es decir, el que correspondera a una fase gaseosa) y
AGt 1.
interacciones disolvente-ligando y disolvente-adsorbato no tenidas en cuenta en los tres primeros trminos. Los valores y y P son, respectivamente, el volumen molar medio del disolvente y la presin de operacin. El parmetro ~ es constante para cada columna y est relacionado con la concentracin de ligandos accesibles de la misma. nicamente los tres primeros trminos son dependientes de la concentracin de sal en la fase mvil (Melander er al., 1984) por lo que la ecuacin anterior, para un sistema cromatogrfico determinado, puede simplificarse de la siguiente forma:
+AG~~ +AOvdw)
[1.4]
donde y es un valor constante que engloba a los trminos no dependientes de la concentracin salina.
De acuerdo con la teora solvofbica, AG0cav depende linealmente de la concentracin salina en el disolvente
A00
cay,
=AAjTm+y
[1.5]
siendo AA~ la diferencia en el rea superficial del ligando y la molcula de adsorbato expuestos a la fase mvil entre los estados adsorbido y en solucin, correspondiendo al rea molecular de contacto
33
en la unin ligando-adsorbato. El parmetro e es el incremento molal de tensin superficial de la sal, m es la concentracin molal de sal en el disolvente y y un parmetro constante. La contribucin energtica debida a interacciones electrostticas se determina a partir de la aplicacin de la teora de Debye-Hckel mediante la siguiente expresin:
B
donde ja es el momento dipolar de la protena y A, 8, C y D son valores constantes para cada adsorbato, siendo A y 8 proporcionales a la carga neta de la protena y C y D estn relacionados con el tamao molecular de la misma.
La contribucin de las fuerzas de Van der Waals, aunque de menor magnitud que las
[1.7]
B (mi) lnk=
______
1 +c
DI.tm+
(m!)
AA,
am+vm+y
[1.8]
En el limite, para valores de la fuerza inica suficientemente elevados, el logaritmo del factor de capacidad depende linealmente de la molalidad de la sal, por lo que, definiendo el parmerro de
interaccin hidrofbica,
definido por X
= AA,c + y
Dji.
Como puede observarse, el parmetro de interaccin hidrofbica est en relacin directa con
el rea de contacto entre protena y ligando. Se ha estudiado y confirmado esta relacin para una serie de protenas (Katti el al., 1987), observndose tambin que dicho rea de contacto es directamente proporcional al rea superficial correspondiente a las zonas hidrofbicas accesibles de la superficie exterior de la molcula de protena, considerando propiedades superficiales y cargas netas constantes para cada una de ellas. De acuerdo con el desarrollo termodinmico anterior, la retencin del adsorbato aumentar
34
INTRODUCCIN
con la temperatura. Sin embargo, su influencia no ha sido completamente generalizada. Se han descrito sistemas en los que la temperatura no tiene un claro y determinante efecto positivo sobre la intensidad de la adsorcin (Hjertn, 1973). En otros casos, la dependencia de la retencin con la temperatura, aunque globalmente aumenta en un amplio margen (0-50 0C), existen intervalos en los que la iniluencia sobre la retencin es prcticamente nula (Lu er al., 1986; Wu er al., 1986), debido, posiblemente, a cambios conformacionales de la protena a diferentes temperaturas.
intensidad de La adsorcin de las molculas de protena sobre los ligandos hidrofbicos. La capacidad
de un ion para estructurar las molculas de agua en torno a l (efecto anticaotrpico) est en relacin directa con la fortaleza de la interaccin. Al solvatarse, los iones hacen disminuir el nmero de
molculas de disolvente (agua) disponibles en el medio, por lo cual disminuye la solubilidad de la protena y aumenta la tensin superficial de la disolucin aumentando, por tanto, la retencin del
adsorbato. El efecto de los iones descrito sigue el orden propuesto por Hofmeister (figura 1.16) para el efecto de diferentes iones en la solubilidad de las protenas (Roe, 1989) Esta propiedad se ha utilizado para optimar la separacin de mezclas de protenas con diferente comportamiento cido-base, amplio intervalo de masas moleculares y carcter hidrofbico (El Rassi er al., 1990). La inclusin de varias sales con diferente efecto sobre la interaccin hidrofbica en la elucin de la mezcla de protenas permite modular, con mayor eficacia, la retencin de cada una de ellas en sistemas de HJC.
<
so., CH
PURIFIcACIN DE cx-AMwAsADBAspergillus
35
preferenciales entre los iones salinos y la protena en disolucin (Arakawa, 1986), aunque tambin podra estar relacionado con un cambio estructural de dichaprotena (Fausnaugh y Regnier, 1986). Otro factor que puede tener importancia en la 1-lIC, por su efecto sobre las cargas elctricas de la protena y el adsorbente, es el pH. La hidrofobicidad de una protena es mxima cuando su carga neta es nula, es decir, cuando el pH del medio coincide con su punto isoelctrico. En general, la disminucin del pH hace aumentar la interaccin entre la molcula de protena y los grupos no inicos de los Ligandos hidrofbicos, especialmente los aromticos y otras estructuras con orbitales
electrnicos
it.
En este caso se ha propuesto (Scopes, 1987) que la nube de electrones se asocia a las
protenas en reas cargadas positivamente que se encuentran adyacentes a las cadenas laterales de los
residuos hidrofbicos de la cadena polipeptdica. Como al disminuir el pH aumentan las cargas
un enlace que cree una carga positiva como en el caso del bromuro de ciangeno, el efecto de la disminucin del pH sobre la retencin puede darse en sentido opuesto debido a mecanismos paralelos
de intercambio inico. En el marco de la teora solvofbica, se ha descrito que, para un determinado
sistema cromatogrfico, la variacin del pH no afecta significativamente al parmetro de interaccin hidrofbica (pendiente en la ecuacin 1.9) aunque si lo hace sobre el valor de k0 (Fausnaugh y Regnier, 1986). Esto indica que la ionizacin, a pesar de que no altera la superficie hidrofbica de contacto, s modifica la intensidad de la adsorcin. Las caractersticas fisicoqumicas del adsorbente tambin son de gran importancia en el
comportamiento de la adsorcin por interaccin hidrofbica. La longitud del ligando es un factor que
de diferente hidrofobicidad, los de mayor longitud mostraban una mayor retencin, a igualdad del
resto de las condiciones de operacin (Fausnaugh eral., 1984; Gooding eral., 1986). Sin embargo, la
Intercambio jnico La purificacin mediante adsorcin por intercambio jnico se basa en la retencin selectiva,
por parte del slido intercambiador de iones, de las especies qumicas implicadas debida a la diferente distribucin de carga elctrica expuesta en la superficie externa las mismas. Los aminocidos que componen las protenas contienen grupos ionizables que, en funcin de las condiciones del medio, pueden encontrarse cargados o no. Las cargas positivas se deben a los
36
INTRODUCCIN
grupos funcionales pertenecientes a las cadenas laterales de los residuos de arginina, usina e bisfidina y, en menor medida, a los grupos amino terminales. Por otro lado, las cargas negativas que portan las cadenas polipeptdicas son debidas a los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico, a los
grupos carboxilo terminales y, ms dbilmente, a los gmpos tiol de tos residuos de cisteina. En la
tabla 1.3 se muestran los valores de pK correspondientes a los grupos susceptibles de ionizacin que se encuentran en los aminocidos que componenuna protena.
Tabla .3: Valores intrnsecos de pK de los diferentes
grupos ionizables de las protenas (Creighton, 1993). Grupo lonizable a-Amino a-Carboxilo 3-Carboxilo (Asp) y-Carboxilo (Glu) 6-Guanidino (Arg) e-Amino (Lys) Imidazol (1-lis) Tiol (Cys) Fenoxi (Tyr) pK 6.8 - 8.0 3.5 - 4.3 3.9 4.0
-
11.1
Las interacciones electrostticas producidas entre los grupos con carga opuesta juegan un papel importante en la estructura terciaria y cuaternaria de las protenas. Dependiendo de la cantidad
relativa de aminocidos bsicos y cidos y en ncin, principalmente, de las condiciones de pH as
como de la temperatura, fuerza inica o presencia de otros compuestos, las protenas muestran una
carga neta que puede variar desde valores positivos hasta negativos. El pH al cual la carga neta es nula se denomina punto isoelctrico, pI. Debido a que la variacin del pH del medio modifica la carga neta de la protena, la capacidad del intercambiador de iones se ve tambin afectada. Las protenas tienen estructuras tridimensionales y distribuciones superficiales de carga que son caractersticas, por lo que su purificacin o separacin del medio en que se encuentran mediante adsorcin por intercambio inico puede ser una operacin muy selectiva y eficaz. Como ilustracin de la alta sensibilidad y selectividad que presenta este mecanismo, se han realizado estudios en los que se comprueba que la sustitucin de 2 residuos de aminocidos cargados en una ~-lactoglobulina hace cambiar sustancialmente su tiempo de retencin en sistemas de cromatografa lquida (Yamamoto a
al., 1987). Junto a la alta selectividad comentada. Ja cromatografa de intercambio inico presenta la
38
INTRODUCCIN
superficial de carga y la orientacin con que interaccionan adsorbato y adsorbente. Debido a estos
efectos, la capacidad de adsorcin de una resma de intercambio inico disminuye, de una forma casi lineal, al aumentar el logaritmo de la masa molecular de la protena (Seopes, 1981).
Las resinas de intercambio anidco o catinico consisten en una matriz inerte, generalmente
porosa, a la que se encuentran unidos ligandos que contienen grupos iotizables con carga positiva o negativa, respectivamente. Estos grupos funcionales se encuentran neutralizados por el
correspondiente in de signo opuesto, denominado contrajn. Mediante el mecanismo de intercambio inico, una protena con carga neta de igual signo que el contrain desplaza a uno o varios de estos, quedando unida al ligando. Las protenas en disolucin tambin tienen sus cargas neutralizadas por sus correspondientes contraiones. En la figura 1.17 se muestra, esquemticamente, el mecanismo descrito. Existe un conocimiento rdativamente escaso del mecanismo de intercambio inico en su aplicacin a pptidos y protenas (Wang, 1990) debido a una serie de factores caractersticos de este tipo de sistemas que a continuacin se sealan:
-
EJ
condiciones de pH. concentracin salina, temperatura o por la presencia de determinadas sustancias en el medio.
-
total de retencin puede modificarse por cambios de pH, afectando dc esta forma al
equilibrio de adsorcin.
-
mecanismo mixto de intercambio inico y de interaccin hidrofbica (Heinitz el al., 1988) por lo que la afinidad adsorbene-adsorbato tiene una dependencia compleja con la concentracin salina.
-
tesina de intercambio inico u otras superficies. En estos casos las isotermas pueden variar con el tiempo de contacto, mostrando una dependencia con la historia de la concentracin en la fase adsorbida. Los tratamientos termodinmicos ms simples tienen en cuenta la carga neta de la protena como faclor principal por el cual se produce el intercambio. Sin embargo, se ha comprobado experimentalmente que, en determinados sistemas, no hay una buena correlacin entre dicha carga
PURIFICACIN DE
39
neta y la retencin del adsorbato (Kopaciewicz el al., 1983). As, se ha observado que existe retencin de protenas que se encuentran en su punto isoelctrico o incluso a valores de pH inferiores en columnas de intercambio aninico. Esta adsorcin no est causada por fuerzas hidrofbicas, sino por la existencia de asimetra en la distribucin superficial de cargas que presentan las protenas a cualquier valor de pH (Drager y Regnier, 1986). De esta forma, las protenas, aunque la carga neta que soporten sea nula, pueden presentar en algunas zonas de su superficie una concentracin de grupos cargados que le comieren una densidad de carga local no nula que le permiten unirse a intercambiadores de iones adoptando la orientacin adecuada. La biomolcula, a medida que fluye a travs del adsorbente y debido al movimiento trmico, tiende a situarse en una o varias orientaciones que minimicen la energa libre en el estado adsorbido. Con objeto de comprender y describir de una forma ms completa el mecanismo de intercambio inico de macromolculas poliinicas, se introdujo el concepto de carga caractersrica (Velayudhan y Horvth, 1986). Este designa al ndmero de cargas o residuos de aminocidos (para cadenas polipeptdicas) cargados de la biomolcula que intervienen en la unin, por interaccin
electrosttica, a la superficie del adsorbente. Este valor depende de las condiciones del medio (pH,
ifierza inica, temperatura, etc.) as como de las caractersticas del adsorbente (Velayudhan y
Horvth, 1994). Existen diferentes mtodos para determinar el valor de la carga caracterstica. En primer lugar
se pueden destacar los clculos a priori basados en la mecnica estadstica. Estos requieren un
tratamiento matemtico muy complejo a la vez que un conocimiento muy completo del sistema que se
est estudiando. Esta situacin no es con la se cuenta habitualmente debido a la dificultad de describir adecuadamente el comportamiento y caractersticas de las estructuras proteicas. Por ello, se han
desarrollado procedimientos basados en datos obtenidos experimentalmente en sistemas relativamente
sencillos. Entre ellos se encuentran los basados en datos obtenidos a partir de experimentos en impulso en equipos de HPLC por elucin isocrtica (Drager y Regnier, 1986; Velayudhan y Horvth, 1986) y los que hacen uso de los valores obtenidos a partir de la isoterma de Langmuir del sistema
(Velayudhan y Horvth, 1986).
De los tratamientos experimentales anteriores, podemos generalizar una relacin lineal entre el logaritmo del factor de capacidad y el logaritmo de la concentracin salina (o fuerza inica) de la
fase mvil de la siguiente manera: log(k) = logA
.~-
4;
log[S]
[1.10]
40
INTRODUCCIN
z5 p+z 1 Y*z
<
11.111
donde Zs y
Zp
respectivamente.P y 5 hacen referencia a la protena y al contrain salino. La barra sobre alguno de ellos representa que la especie correspondiente se encuentra unida al ligando de la fase estacionaria.
1.3.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO La implantacin de un proceso biotecnolgico a escala industrial requiere un profundo conocimiento de sus mecanismos y de los factores que en l influyen. Adems, para disear y optimar procesos de purificacin de forma no emprica, es necesaria la utilizacin de modelos matemticos generales que permitan describir y predecir el comportamiento del sistema. Por ello y por todo lo
anteriormente expuesto, los objetivos del presente trabajo de investigacin son los siguientes:
-
Desarrollar una metodologa que permita el diseo de procesos de purificacin de bioproductos mediante adsorcin.
Determinar y cuantificar los factores que influyen en la adsorcin de ct-amilasa de Aspergillus oryzae sobre soportes de intercambio inico e interaccin hidrofbica.
Determinar los parmetros cinticos y termodinmicos que caracterizan al modelo terico desarrollado para utilizar este en la operacin de diseo, simulacin y escalado del proceso de adsorcin de a-amilasa.
Eleccin de los adsorbentes ms adecuados y de las condiciones de operacin en las que se va a desarrollar el estudio posterior de la adsorcin de a-amilasa.
Caracterizacin fisico-quimica del adsorbato y de los adsorbentes utilizados. Estudio experimental, en forma secuencial, de la adsorcin de a-amilasa sobre los adsorbentes seleccionados mediante los siguientes procesos: (1) cromatografa de impulso en columnas de HPLC. (2) adsorcin en tanque agitado discontinuo y (3) adsorcin en lecho fijo.
41
adsorcin de ct-amilasa mediante el ajuste de los resultados experimentales al modelo matemtico desarrollado.
1.4.- BIBLIOGRAFA
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PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE
53
2.1.- INTRODUCCIN La cantidad de protena o cualquier otro adsorbato que un adsorbente puede retener, viene determinada por el equilibrio qumico existente entre ambos. Este ltimo tambin establece la
separacin entre los diferentes componentes de una mezcla que una columna cromatogrfica es capaz de resolver. Aun siendo un factor de gran importancia en la eleccin de un adsorbente, la capacidad del mismo no es el nico a tener en cuenta. Para el diseo de procesos de adsorcin es fundamental el conocimiento de la velocidad con la que se alcanza el equilibrio entre las fases as como la velocidad de transporte de las molculas de adsorbato desde el seno del finido, en el que se encuentra, hasta los sitios de adsorcin en la superficie del adsorbente.
54
disolucin hasta la superficie externa de la partcula de adsorbente a travs de la capa lmite externa que la rodea.
-
travs del interior de los poros hasta los puntos de adsorcin mediante uno o varios mecanismos difusionales que se describirn a continuacin.
-
y los sitios de adsorcin de la superficie interna de la partcula de adsorbente. Junto a todo ello, en el caso de trabajar en sistemas en los que el adsorbente se encuentre dispuesto como fase estacionaria en el interior de una columna, habr que tener en cuenta los posibles efectos que la dispersin axial y radial tienen sobre la velocidad de transferencia de materia.
2.2.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIA En este apartado se revisan los mecanismos de transporte que se presentan en los procesos de
adsorcin en slidos porosos. Cada uno de ellos viene determinado por las caractersticas fisicoqumicas del adsorbato y del adsorbente as como por las condiciones del medio en el que se encuentran. La fuerza impulsora de cada uno de los mecanismos define la expresin de la velocidad con la que dicho transporte se realiza. El anlisis cintico de un sistema concreto permitir conocer la
2.2.t.- Transferencia de materia en la capa lmite externa El flujo de un soluto a travs de la capa lmite externa que rodea a una partcula slida se
considera linealmente dependiente de la diferencia entre la concentracin de dicho soluto en el seno de la disolucin y en la superficie exterior de la partcula, lo cual puede expresarse mediante la relacin matemtica descrita por la ecuacin 2.1.
-h
=kf(CCKR)
[2.lj
La resistencia a dicho flujo viene caracterizada por el denominado coeficiente de transferencia de materia externo,
~.
PURIFICACIN DE
U-AMILA5A DE Aspergil/us
55
kf =
2 DAB d
+0.31
hP DAR )t
(A;i~}
[mis]
[2.2]
donde d~ es el dimetro de partcula en m, g es la viscosidad de la solucin en Pas, p es la densidad de la disolucin en kg/mt Ap es la diferencia de densidad entre las partculas y la fase fluida en
3, g 9.81 m/s2 es la constante de aceleracin de la gravedad y D,~ la difusividad molecular del kg/m
2.2.2.- Transferencia de
El transporte de materia a travs del interior de los poros de una partcula de adsorbente puede deberse a varios mecanismos difusionales, que pueden darse de forma individual o conjunta.
Difusin molecular A pesar de que el mecanismo de difusin molecular es, fundamentalmente, similar en fase gaseosa y en fase lquida, la teora que soporta esta ltima est mucho menos desarrollada. Dicho mecanismo se caracteriza porque la resistencia al flujo se produce debido a las colisiones entre las molculas de soluto que se difunden. Para la determinacin del coeficiente de difusin molecular en fase lquida existen un gran nmero de correlaciones empricas y semiempricas basadas en las ecuaciones de Nernst-Einstein y Stokes-Einstein GMvarez eta,!., 1982). Para adsorbatos no electrolitos cuya masa molecular sea inferior, aproximadamente, a 1000, la ecuacin de Wilke y Chang (1955) es una de las ms habitualmente utilizadas: 1.17 1016 (VB M D AB
=
5)
6 ~AB v4
r, [m / sj
[2.3]
donde VB es el parmetro de asociacin del disolvente (para el agua tiene un valor de 2.6, aunque otros autores recomiendan un valor de 2.26 (lvarez e al., 1982)), MB es la masa niolecular del
56
disolvente, T es la temperatura en kelvin; I1B es la viscosidad del lquido en as y VA es el volumen molar del soluto a su temperatura normal de ebullicin en m3 /molkg.
D AB =9A1W15
(MV3
[m~ , s]
[2.4]
Difusividad de Knudsen En sistemas gaseosos, cuando el dimetro de poro es pequeo o la presin es suficientemente
baja, puede ocurrir que las colisiones entre molculas de adsorbato y las paredes internas de los poros sean ms frecuentes que ias colisiones entre dos molculas de adsorbato. En este caso, una vez que la molcula de adsorbato ha chocado con la pared interna del poro, se adsorbe y es reemitida inmediatamente en una direccin aleatoria. Este mecanismo de transferencia de materia en el interior del poro se denomina difusin de Knudsen y el coeficiente de difusin que lo caracteriza puede ser
1)
[m2
/s]
[2.5]
Debido a que en fase lquida el recorrido libre medio de las molculas de soluto es muy pequeo, se considera que este mecanismo no es significativo y, por tanto, no controla la velocidad de
transporte de materia.
Dfusividad en macroporos
Dependiendo del sistema adsorbato-adsorbente as como de las condiciones de operacin. pueden darse situaciones de transicin entre los diferentes mecanismos difusionales. En el caso de
gases, en la regin en la que tanto la difusin molecular como la difusin de Knudsen son
significativas, la difusividad en la fase lquida puede definirse mediante la siguiente expresin (Ruthven, 1984): 1
D
1
D
DK
12.6]
PURIFICAClN DE tX-AMILA5A
57
se debe a que junto a los mecanismos difusionales que se dan en el interior del poro, el flujo de materia se reduce debido a la propia estmctura y geometra porosa. Esta situacin hace que la estimacin terica del coeficiente de difusin en los poros no sea una tarea siempre posible por lo que se suele recurrir a la experimentacin para una determinacin exacta. El factor de tortuosidad, r, es el parnetro que relaciona los coeficientes de difusin en los poros y molecular de la siguiente manera: ~ D
t
[2.7]
El flujo a travs del lquido que llena los marroporos de una partcula esfrica se puede expresar, considerando constante la diflisividad, de acuerdo con una expresin de similar forma a la
ley de Fick:
1 aF 2 Dcl =D r2dr Ir [ dr J
[2.8]
DiJisividad superficial El flujo de adsorbato a travs de la capa de molculas adsorbidas a la superficie del adsorbente se conoce como difusividad superficial. La determinacin del valor de la difusividad superficial no puede hacerse por medidas directas ya que al ser un proceso en paralelo al flujo de adsorbato a travs del poro en la fase fluida, sera necesario eliminar la contribucin correspondiente a este ltimo (Schneider y Smith, 1968).
Estudios realizados en fase gaseosa indican que la difusividad superficial es significativa
de difusin de K.nudsen. Para la difusin superficial, la expresin del flujo msico debido a dicho mecanismo tiene una forma similar. En este caso la fuerza impulsora es el gradiente radial de concentracin superficial adsorbida en el interior de la partcula (ecuacin 2.9):
..
60
desorcin respectivamente. Tanto la velocidad de adsorcin como la de desorcin suelen considerarse muy elevadas en
comparacin con las etapas de difusin que se dan en los procesos de adsorcin, por lo que puede considerarse que, en todo momento, la concentracin de adsorbato en el liquido del interior del poro
se encontrar en equilibrio local con la concentracin adsorbida en la superficie interna del adsorbente. De esta forma la velocidad global del proceso de adsorcin en slidos porosos viene determinada por las etapas difusionales en el interior de las partculas.
2.3.1.- Introduccin
Las isotermas correspondientes al equilibrio de adsorcin, como su nombre indica, describen la distribucin del adsorbato entre la fase estacionaria y la fase fluida a temperatura constante. Esta ltima condicin se corresponde con la suposicin de que, en la mayora de los procesos de adsorcin en fase lquida, ni la transicin de fases ni la impulsin de la fase mvil genera efectos significativos
de transferencia de calor que invaliden la hiptesis planteada. La prctica totalidad de los desarrollos tericos relacionados con la adsorcin se han llevado a cabo en fase gaseosa por la posibilidad de conocer con mayor detalle y profundidad las interacciones y caractersticas de las dos fases presentes. La adsorcin en fase lquida ha aplicado, adaptado y, en su caso, discriminado los modelos ya existentes para poder explicar y predecir el comportamiento observado en dichos sistemas.
La forma grfica de la isoterma de adsorcin difiere en funcin del mecanismo de interaccin entre el adsorbato y el adsorbente, de las caractersticas fisicoqumicas de ambos y de las propiedades porosas del adsorbente. Una clasificacin clsica de los diferentes tipos de isotermas, atendiendo a su
forma, fue dada por Brunauer
(Brunauer
La isoterma tipo 1, identificada previamente (Langmuir, 1916; Langmuir, 1918), presenta una tbrma hiperblica y supone un mecanismo restringido a la adsorcin de una monocapa de molculas
sobre la superficie del slido. Adems, no considera inpedimentos ni interacciones entre molculas adyacentes adsorbidas. El tipo II tiene un similar comportamiento que el tipo a concentraciones de
adsorbato bajas, pero al aumentar esta se produce la adsorcin en multicapas, produciendo una forma
convexa a altas concentraciones. El tipo 111 adopta esta ltima configuracin debido a una distribucin
61
de tamaos de poro muy amplia, lo que provoca un continuo llenado de los poros segn aumenta la
concentracin. Las isotermas tipo IV, semejantes a las tipo II, presentan un valor asinttico debido al
mecanismo de condensacin capilar. El tipo y se relaciona con las isotermas tipo III, presentando un lmite superior como en el caso de la isoterma tipo IV por similares razones. No todos estos tipos de isoterma, observados en adsorcin gas-slido, se han descrito en sistemas liquido-slido.
Otra clasificacin que agrupa los tipos anteriores en tres categoras (figura 2.3) es la siguiente:
-
Isotermas cncavas: adsorcin favorable. Isotermas convexas: adsorcin desfavorable. Isotermas que presentan punto de inflexin.
o z o
1
Concentracin en la fase fluida Figura 2.3: Clasificacin de las isotermas de adsorcin atendiendo a la forma de la curvatura. Aunque la forma de las isotermas nos da informacin sobre el proceso de adsorcin, es conveniente, a efectos prcticos, disponer de datos de equilibrio o, mejor aun, de una expresin matemtica que nos relacione la concentracin de adsorbato a cada temperatura en ambas fases. Existen en la literatura numerosas ecuaciones para tal fin, pudindose clasificar en dos grupos principales: las isotermas lineales y las no lineales. A continuacin se describen las condiciones en las que se presentan ambas, junto con las expresiones matemticas que las describen.
62
[2.12]
Isoterma de Langmuir
El modelo terico en que se basa (Langmuir, 916: Langmuir, 1918) fue desarroiJado a partir de argumentos cinticos simples correspondientes a la adsorcin de gases. Las suposiciones sobre las que se asienta son las siguientes:
-
posiciones fijas.
-
monocapa.
-
Todos los sitios son energticamente equivalentes No existen interacciones laterales entre molculas adsorbidas.
La velocidad de adsorcin es proporcional a la concentracin libre y a la fraccin desocupada de los sitios de adsorcin. La velocidad de desorcin es proporcional a la fraccin ocupada de dichos sitios. Ambas velocidades, en el equilibrio, son iguales. A partir de lo anterior, se puede expresar la relacin de equilibrio como:
63 [2.13]
bC eq
q~1
siendo
1+bC~
por molculas de adsorbato, q~ la mxima cantidad de
adsorbato sobre la superficie del adsorbente y b representa la constante de equilibrio a baja concentracin (pendiente de la isoterma cuando Ceq 4 0).
Isoterma de Freundlich La desviacin observada del comportamiento predicho por la isoterma de Langmuir en diversos casos, puede ser debido a la heterogeneidad energtica de la superficie del adsorbente (Ruthven, 1984), no cumplindose una de las suposiciones de la teora de Langmuir.
K~
~ eq
[2.14]
donde Kf y 3 (3 < 1) son parmetros constantes para cada temperatura. Este modelo presenta la desventaja de que no predice la saturacin, de forma asinttica, del adsorbente a alta concentracin de soluto ni se reduce al comportamiento lineal a baja concentracin del mismo. Por esta razn, la utilizacin de la isoterma de Freundlich se encuentra limitada a superficies heterogneas y a un intervalo determinado de concentracin.
Otras isotermas Para poder describir adecuadamente el comportamiento de sistemas que se apartan del predicho por las isotermas descritas anteriormente, se han propuesto numerosas expresiones, algunas de las cuales se indican a continuacin. La suposicin de una heterogeneidad superficial debida a dos tipos de sitios de adsorcin
a1C,, l+b1C
+ l+b2Q
[2.15]
64
aC11
1 + b
U
[2.16]
q = 1 + b U
[2.17]
La eleccin de cualquiera de las isotermas expuestas, o de otras muchas descritas en la bibliografa depender, principalmente, del sistema estudiado y de la profundidad con que se conozca, de los datos experimentales de que se disponga y del grado de exactitud que se quiera alcanzar.
2.4.- BIBLIOGRAFA
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67
3.1.- INTRODUCCIN
Los procesos de separacin basados en la cromatografa lquida o, de forma ms general, en el
equilibrio lquido/slido son muy utilizadas como etapas finales de la purificacin de productos
obtenidos mediante biotecnologa. Hasta hace pocas dcadas, los procesos biotecnolgicos, salvo determinados procesos clsicos de fermentacin (por ejemplo, produccin de cerveza y de otras bebidas), estaban reducidos a la obtencin de productos de muy alto valor aadido con producciones muy bajas. En la actualidad, estn apareciendo nuevos procesos bioteenolgicos a la vez que otros ya establecidos, que se realizan mediante procedimientos dsicos de la qumica, pasan a realizarse utilizando la biotecnologa. En este campo, actualmente, gran parte del trabajo desarrollado para pasar de la investigacin en el laboratorio a la produccin industrial se realiza mediante escalado intermedio en planta piloto con procedimientos empricos o semiempricos. El asentamiento de los principios generales de los procesos biotecnolgicos, acompaado de
68
la consolidacin de la tcmca necesaria para su desarrollo, hace necesario el establecimiento de modelos matemticos que permitan el diseo y simulacin de cada una de las operaciones que lo
componen. De esta forma, el desarrollo de procesos biotecnolgicos se situara en una posicin similar a la que tienen los procesos qumicos convenciona,!es, cuyos representantes ms destacados
son los pertenecientes a la industria petroqumica. La proposicin de modelos matemticos que describan el comportamiento del sistema a partir de parmetros conocidos o de fcil obtencin requiere un profundo conocimiento del proceso,
determinando las variables que influyen en el mismo as como la cuantificacin de la mencionada influencia. En el caso de la adsorcin, adems de la extensin del equilibrio entre el adsorbato y el adsorbente, es necesario conocer la velocidad de transporte del atisorbato hasta los sitios de adsorcin sobre la superficie del slido. Esto ltimo viene determinado por los mecanismos de transferencia de materia que se encuentran presentes en el proceso.
KA
KA
np
Fado! de Capacidad
KA
KA
np
DL
np DL Factor de Capacidad kr
Factor de Capacidad
Entalpia de Adsorcion Entropia de Adaercion
Figura 3.1: Parmetros cinticos y termodinmicos que se obtienen a partir de los tratamientos matemticos aplicados a cada uno de los sistemas experimentales estudiados.
En el presente trabajo se estudiar la adsorcin de wamilasa sobre adsorbentes con mecanismos de adsorcin diferentes, interaccin hidrofbica e intercambio irco. El estudio se realizar utilizando una metodologa secuencial desarrollada en anteriores trabajos por nuestro grupo de investigacin (Aracil y Martnez, 1993) mediante los siguientes sistemas experimentales:
cromatografa de impulso en HPLC, adsorcin en tanque agitado discontinuo y adsorcin en lecho fijo
(Aracil et al., 1992). Los modelos matemticos propuestos, de complejidad creciente, permitirn caracterizar el proceso de adsorcin mediante los parmetros cinticos y termodinmicos del sistema.
69
3.2.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO. ANLISIS DE MOMENTOS La aplicacin ms conocida, difundida y establecida de la cromatografa lquida de alta
eficacia, HPLC, es como tcnica analtica, encontrndose muy desarrollada y bien establecida para
una gran diversidad de sustancias qumicas. Sin embargo, otra aplicacin de importancia creciente, es
como mtodo de purificacin para determinados productos de alto valor aadido en la industria
farmacutica o de alimentacin, debido a la facilidad de escalar el proceso y a los altos grados de pureza que se alcanzan.
3.2.1.- Introduccin El estudio del proceso de adsorcin mediante HPLC permite obtener una valiosa informacin del sistema de una forma rpida, repetitiva, con equipos comerciales relativamente sencillos y a partir de muy pequeas cantidades de adsorbente y, sobre todo, de atisorbatos (Aracil y Martnez, 1993). Estas circunstancias hacen que sea una tcnica especialmente adecuada para productos de gran valor
aadido como son antibiticos, pptidos, protenas, hormonas, anticuemos monoclonales, etc.
Tras la aplicacin del impulso de adsorbato en la fase mvil a la entrada de la columna, la informacin de que se dispondr ser la de la curva de respuesta a la salida de la misma, es decir, la concentracin de adsorbao a la salida en funcin del tiempo. Estos datos, junto con los correspondientes a las condiciones de operacin y caractersticas del sistema (caudal, temperatura,
tamao y porosidad de las partculas y de la columna) permitirn la aplicacin del mtodo de los
momentos, como se describe en el siguiente apaado, con el fin de obtener los parmetros cinticos y de equilibrio que caracterizan al sistema.
perturbacin en impulso o en escaln ha sido ampliamente utilizada y estudiada con el fin de extraer
informacin acerca de los factores que afectan al proceso de adsorcin as como para conocer y
70
el coeficiente de transferencia de materia externo (Van Deemter el a,!., 1956), permiti una explicacin y una prediccin ms exacta del comportamiento cromatogrfico. Levenspiel y Smith (1957) determinaron el coeficiente de dispersin axial a partir de la caracterizacin de la curva normalizada de respuesta a un impulso mediante el uso del nmero adimensionaj de Peclet. Para la resolucin de las ecuaciones correspondientes al balance de materia en la columna se han utilizado, entre otras tcnicas, la transformacin al dominio de Laplace. La inversin de la solucin para obtener una expresin analtica en el dominio del tiempo es complicada o, en la mayora de Los casos, inviable. Es factible, sin embargo, la obtencin de expresiones para los momentos cromatogrficos a partir de la solucin en el dominio de Laplace. Estas expresiones relacionan los parmetros cinticos y termodinmicos propuestos en el modelo resuelto (Van der Laan, 1957) con la definicin estadstica de los momentos de una curva de distribucin. A continuacin se muestran las expresiones a partir de las cuales se calculan el primer momento (pi) y el segundo momento central (&):
J
II
tC(t) dt 13.1]
JC(t) dt
a-
J
=
(t
gV
C(t) dt 3.2]
C(t) dt
donde C(t) es la concentracin a la salida de la columna. A partir de la metodologa anterior y en base al establecimiento de los balances de materia en la columna y en una partcula. Kubin (1695a; 1965b) y Kucera (1965) desarrollaron el ntodo de los momentos para un modelo en el que las resistencias a la transferencia de materia son la dispersin axial a lo largo del eje de la columna, la difusin a travs de la capa limite que rodea a las partculas de adsorbente y la difusin de las molculas de adsorbato en el interior de las mismas hasta unirse a los sitios de adsorcin. Los parmetros cinticos que caracterizan los citados mecanismos de transporte son, respectivamente, los coeficientes de dispersin axial, DL, de transferencia de materia externa. k1, y de difusin en los poros, D~. Un modelo ms general, que incluye la difusin del adsorbato a travs de slidos con estructuras porosas bidispersas, fue desarrollado por Haynes y Sarma (1973). De esta forma se obtienen expresiones para los momentos de las curvas de respuesta que explican adecuadamente la mayora de los sistemas cromatogrficos. -Previamente se habfan propuesto modelos que incluan difusin en macro- y microporos aunque slo consideraban que la
71
Shah y Ruthven (1977) modificaron ligeramente el modelo de Haynes y Sarma refiriendo las
difusividades en micro- y macroporos en base al volumen del cristal y al rea superficial libre respectivamente. De esta forma, el anlisis de momentos se realiza a partir de las siguientes expresiones:
[3.3]
donde L es la longitud de la columna, y la velocidad intersticial de la fase mvil y k es una constante de equilibrio aparente que puede expresarse a partir de la constante del equilibrio de adsorcin, KA, como se indica a continuacin:
s~ + (1
E~, ) KA
[3.4]
La porosidad externa del lecho (referida al espacio interparticular) y la interna de las partculas (referida al volumen total ocupado por los poros) vienen representadas por E y respectivamente. La relacin entre el segundo momento y los parmetros cinticos que caracterizan el sistema puede expresarse mediante la ecuacin 3.5:
~,
d+9C.~i[+CY~
KAI
+Clfl(
~M~iiC j[ i R )(
1E
E
cP)KAI2
+
[3.5]
+
ED PP
+ (
~ KAj
5p
15
L y
~j(1)K
siendo R el radio de las partculas, r, el radio de los cristales que forman cada partcula y 0. el coetkiente de difusin intracrisualino. Relacionando las expresiones correspondientes al primer y segundo momento central, se obtiene:
112
O vL
Etc
1E
R
3kf 15 kD 0
15s~D~
jC
(1s)k
13.6]
-
72
cristal adquiere importancia en el caso de adsorbentes o catalizadores formados por agregados o compactacin de cristales, situacin habitual cuando se trabaja, por ejemplo, con zeolitas. Sin embargo, puede eliminarse cuando el slido utilizado carece de microporos. Por otra parte, los otros
dos trminos, correspondientes al transporte de materia a travs de la capa limite externa que rodea a
las partculas y el producido en el interior de los macroporosttienen rdenes de magnitud diferentes (Wakao y Funazkri, 1978). Mientras que el coeficiente de difusin externa tiene valores de, aproximadamente, 106 m/s, el de difusin en los poros se encuentra alrededor de 10 m2/s, de lo cual se deduce:
R
15% D~ 3k~
[3.7]
Con estas consideraciones, la ecuacin 3.6 puede simplificarse para dar la siguiente expresin:
&
2112
2+L~)LiEj15~2Dpj1t1iEkj
[3.8]
Por otro lado, a partir de la teora de platos (Martin y Synge, 1941) se puede obtener una relacin entre la altura equivalente de un plato terico, AEPT, y el resultado del desarrollo del anlisis de momentos, basado en las teoras de velocidad a partir de las ecuaciones de balances de materia:
AETP =
&
11
7L
[3.91
por lo que comparando con la ecuacin 3.8, se tiene: 2DL +2v~ AEPT= A partir de esta ltima expresin se deduce que para especies que no se adsorban (k -4 0) o que se difundan hacia los sitios de adsorcin muy rpidamente (D~ -4 ~), la AEPT viene dada, simplemente. por (2Djv), siendo un valor constante para cada sistema, esencialmente independiente de la temperatura o de la velocidad del fluido, especialmente a bajos valores del nmero de Reynolds (Bischoft 1960). La posible existencia de asimetra en los picos y la presencia de colas en los mismos as como EjI5EDj IiEkj [3.10]
En este caso, el trmino maeroporo engloba tambin a los mesoporos que, segn la recomendacin de
la IUPAC (Sing el
cd., 1985). comprenden los poros cuyo tamao se encuentra en el intervalo 2 50 nm.
-
73
de mido presente en la seal, hace inviable la utilizacin de momentos de orden mayor a dos. Incluso
en estos ltimos, los problemas descritos pueden afectar significativamente a su determinacin. Se
han descrito algunas modificaciones y correcciones al mtodo de los momentos para poder disminuir
el efecto mencionado. Sin duda, el ms utilizado de ellos es el mtodo de los momentos con peso
(Ostergaard y Michelsen, 1969; Anderssen y White, 1971; Ramachandran y Smith, 1978; Wolf et al., 1979). Este mtodo hace uso de la relacin entre los momentos ordinarios y la transformada de Laplace. El primer y segundo momento central con peso, g~ y o%, se definen como:
r=O
Je~ C(t) dt
t=0
J(t
&(s) =
p
t~O
&sL
C@) dt [3.12]
Jest C(t) dt
r=O
siendo s un parmetro arbitrario de la transformacin con unidades de inversa del tiempo. Para s = 0, los momentos con peso coinciden con los ordinarios. Para s > 0 el trmino (est) acta como un factor de peso que hace disminuir la contribucin al valor de i o & de los datos de concentracin a tiempos elevados, esto es, situados en la zona de cada del pico donde la asimetra es grande. El valor de s se determina como aqul que minimiza la varianza de la curva de distribucin (Anderssen y White, 1971).
Tambin se han descrito procedimientos para aplicar el mtodo de los momentos ordinarios a
picos con asimetra mediante el truncamiento de los datos, es decir, la eleccin de un punto de la curva a partir del cual no se integra la curva de respuesta (Skopp, 1984). Este mtodo ha dado resultados aceptables solo en determinadas ocasiones ya que para picos muy asimtricos el error obtenido es elevado y, adems, la frecuencia de recogida de datos y el espaciado, regular o no, entre ellos influye en la determinacin del punto de truncaniento.
El mtodo de los momentos permite un anlisis matemtico sencillo y rpido de las respuestas
obtenidas experimentalmente a partir de una perturbacin en impulso introducida a un sistema cromatogrfico. Este anlisis permite estimar la constante del equilibrio de adsorcin correspondiente a la ley de Henry, es decir, suponiendo la isoterma de tipo lineal, lo cual, debido a las bajas concentraciones que implican los impulsos de adsorbato, suele ser una aproximacin inicial oportuna.
74
Una vez se hayan determinado los valores de la constante de equilibrio para cada temperatura ensayada, mediante la aplicacin de la ecuacin de Vant Hoff puede obtenerse la variacin de
0 y AH RT K0exp(
[3.13]
AS0 =RInKA
AH0 T
[3.141
Adems, a partir del segundo momento central puede obtenerse el valor del coeficiente de difusin en los poros. Es necesario estudiar los resultados que se obtengan mediante esta tcnica con visin especialmente crtica, analizando hasta que punto las simplificaciones llevadas a cabo tienen un fundamento razonable. En cualquier caso, los parmetros cinticos y termodinmicos, as calculados, servirn de punto de partida para los anlisis ms rigurosos desarrollados para los procesos de adsorcin en tanque agitado y lecho fijo que se describirn en los apartados siguientes.
3.3.1.- Introduccin
Los modelos matemticos desarrollados para representar el comportamiento de los sistemas de adsorcin en tanque agitado. buscan la obtencin, numrica o analtica, de la disminucin de la concentracin del adsorbato o adsorbatos con el tiempo en funcin de una serie de parmetros empricos o no empricos. Los modelos ms sencillos suelen considerar isoterma de tipo lineal y una sla resistencia a la
75
transferencia de materia, bien sea la difusin interna (Huang y Li, 1973) o la externa (Crank, 1975).
Komiyama y Smith (1974a) y Furusawa y Smith (1974) dan cuenta de una difusividad interna efectiva mucho mayor de la esperada para disoluciones de benzaldehdo, atribuyndola a la existencia de una difusin superticial en paralelo a la difusividad molecular en el interior de los poros. La determinacin de la difusividad superficial se pudo hacer en trminos del calor de adsorcin y la aplicacin de la isoterma de Freundlich (Komiyama y Smith, 1974b). Este ltimo mecanismo es
significativo si la interaccin entre adsorbato y adsorbente es muy fuerte (Krishna y Wesselingh, 1997) o existe control a la transferencia de materia en los microporos (Ruthven, 1984), siendo la
contribucin al flujo del mismo orden de magnitud que la debida al mecanismo de Knudsen (Doong y Yang, 1986). Tambin se han descrito modelos en los que se diferencia la difusin en microporos y en
macroporos correspondiente a slidos con distribucin bimodal de tamaos de poro (Ruckenstein et al., 1971). Otros acercamientos al problema, pese a incluir la isoterma no lineal, no contemplaban la
acumulacin de adsorbato en la fase lquida en el interior del poro (Suzuki y Kawazoe. 1974; Hasbimoto c a,!., 1975). Neretnieks (1976) incluye la utilizacin de isoterma no lineal y la resistencia
a la transferencia de materia externa e interna, diferenciando la difusin superficial y la difusin molecular efectiva. La resolucin numrica se hace en base a diferentes casos lmite en los que se pueden realizar determinadas simplificaciones, por lo que es necesario conocer, a priori, si las condiciones experimentales las cumplen o no. Con el fin de abordar de forma ms sencilla el problema matemtico se han propuesto ecuaciones empricas que describen, en determinadas condiciones, el perfil de concentracin de adsorbato en la fase lquida del interior de los poros. La aproximacin ms sencilla corresponde a la consideracin de la fuerza impulsora lineal (Glueckauf y Coates, 1947), por la que el transporte de materia a travs del interior de la partcula es proporcional a la diferencia entre la concentracin en el borde exterior y la concentracin media en toda la partcula. Otros tratamientos posteriores consideran
un perfil parablico (ifice, 1982), existiendo otras expresiones como polinomios de cuarto grado (Do
y Rice, 1986) o funciones exponenciales (Do y Mayfield, 1987) que describen la distribucin del
76
restringiendo su uso a la zona de la isoterma donde el comportamiento es lineal (Membrez et a,!., 1996), resolviendo por transformadas de Laplace las ecuaciones del balance de materia. Modelos completos, que cuenten con la difusin externa e interna y un comportamiento no lineal de la isoterma, se han aplicado a aminocidos y penicilina O (Grzegorcyk y Carta, 1996) o a la adsorcin de cefalosporina C (Casillas eta,!., 1993).
3.3.2.- Modelo
Establecimiento de hiptesis
Para el planteamiento y posterior resolucin del modelo matemtico que describe el proceso de adsorcin en tanque agitado discontinuo se han establecido las siguientes hiptesis: i) Las partculas de adsorbente son esfricas, de igual dimetro y densidad. Los sitios
-
de adsorcin son iguales y se encuentran homogneamente distribuidos por la superficie de la partcula. it) La velocidad de transporte de materia viene determinada por la existencia de dos procesos en serie. Una etapa de difusin externa en la que las molculas de adsorbato atraviesan la capa lmite que rodea a las partculas y otra de difusin interna que corresponde a la difusin del adsorbato por el interior de los poros. La velocidad de cada uno de estos procesos viene caracterizada por el coeticiente de transferencia de materia externo, k1. y el coeficiente de difusin en los poros, D0, respectivamente. iii) El proceso es isotermo.
77
iv) La adsorcin del adsorbato sobre los sitios de adsorcin es instantnea y reversible y la velocidad con que se realiza es mucho mayor que la correspondiente a las etapas de difusin previas. y) El equilibrio de adsorcin se establece entre la concentracin de adsorbato en la fase
lquida del interior de los poros, e, y la concentracin de arisorbato adsorbida en la superficie interna, q. Dicho equilibrio viene descrito mediante la isoterma de
adsorcin: q= f(c)
vi) El coeficiente de difusin en los poros es independiente de la concentracin.
La disminucin de la concentracin de adsorbato en la fase lquida viene dada por el flujo que se difunde a travs de la capa limite que rodea a las partculas esfricas de adsorbente, pudiendo
expresarse como: dC
dt
H~2iEP kC
cl~
[3.15]
donde y es el volumen de disolucin en el tanque, v~ el volumen de poros por unidad de masa de adsorbente, C la concentracin de adsorbato en el seno del liquido del tanque y c la concentracin en
la fase lquida del interior de los poros..
Balance de materia en una seccin radial de la partcula Suponiendo que el mecanismo de transporte en el interior del poro es mediante difusin en la
fase lquida y que el coeficiente de difusin efectivo no vara con la concentracin, para una partcula
[3.16]
Dq
Dt
dq Dc
dcDt
[3.17]
78
Condiciones de contorno e iniciales El flujo de adsorbato que atraviesa la superficie exterior de la partcula deber ser igual al
flujo de adsorbato transportado por difusin a travs del interior de los poros:
En
= k~
(c cl)
[3.18]
3.4.- ADSORCIN EN LECHO FIJO Los procesos de purificacin a escala industrial operan, en la prctica totalidad de los casos,
en lecho fijo. Por ello, es fundamental contar con un modelo matemtico que describa dicha operacin para poder disear y posteriormente optimar el funcionamiento del proceso. Tras el modelado matemtico de la adsorcin en tanque agitado discontinuo, el modelo de lecho incluye el flujo de fase fluida en la direccin axial de la columna. Esto hace que, a los modelos planteados para la transferencia de materia en las partculas de adsorbente, sea necesario acoplar modelos para el flujo
mencionado. A continuacin se revisarn los avances ms significativos que se han llevado a cabo el desarrollo de modelos para la adsorcin en lecho fijo.
3.4.1.- Introduccin El desarrollo y planteamiento de los modelos matemticos que se encuentran descritos en la bibliografa ha estado condicionado, fundamentalmente, por las resistencias a la transferencia de materia que, se consideren, controlan la velocidad del proceso. el tipo de isoterma de equilibrio y el modelo de flujo postulado a lo largo de la columna. Otro factor importante son las simplificaciones realizadas o las condiciones dc contorno e iniciales que se planteen para su resolucin. La aparicin de una ecuacin correspondiente al balance de materia en la columna, junto con
79
la procedente del balance de materia en la partcula, complica el tratamiento matemtico del problema
en relacin al modelo de tanque agitado. Desde los pioneros trabajos de Wilson (1940), posteriormente desarrollados por DeVault (1947) y Glueckauf (1949) en los que no se consideraba resistencia a la transferencia de materia, se han planteado numerosos modelos y soluciones en base a
diferentes hiptesis para los sistemas de adsorcin en lecho fijo. Los ms sencillos consideran una sla resistencia y no contemplan la dispersin axial del flujo (Rosen, 1952; Rosen, 1954; Tien y Todos, 1960; Masamune y Smith, 1964), en ellos, la aplicacin de una isoterma de tipo lineal permite la resolucin analtica del sistema de ecuaciones. La inclusin del coeficiente de dispersin axial hace
ms realista el modelo a la vez que hace ms complejo el tratamiento matemtico necesario para su
resolucin (Deisler y Wilhem, 1953; Vermeulen, 1953; Rasmuson y Neretnieks, 1980; Rasmuson, 1981). Las aproximaciones de perfil parablico (Liau eta,!., 1979; Rice, 1982) o de fuerza impulsora lineal (Cooney, 1983; Carta, 1983; Sheng y Costa, 1997) comentadas en el apartado 3.3.1 tambin se han aplicado a la resolucin de sistemas en lecho fijo. A ellas se une la de considerar el perfil de
concentracin en la partcula como una distribucin pseudo logartmico-normal (Xiu et a,!., 1997).
so
3.4.2.- Modelo
Establecimiento de hiptesis
El planteamiento y formulacin del modelo matemtico de adsorcin en un lecho fijo se realiza en base a las siguientes hiptesis: i) El sistema opera en condiciones isotermas.
u)
El equilibrio de adsorcin se establece entre la concentracin de atisorbato en la fase lquida del interior de los poros, c, y la concentracin de adsorbato adsorbida en la superficie interna, q. Dicho equilibrio viene descrito mediante la isoterma de adsorcin: q = f(c)
iii) Se consideran dos resistencias en serie al transporte de materia. Una etapa de difusin externa en la que las molculas de adsorbato atraviesan la capa lmite que rodea a las partculas y otra de difusin interna que corresponde a la difusin del adsorbato por el interior de los poros. La velocidad de cada uno de estos procesos viene caracterizada por el coeficiente de transferencia de materia externo, kf, y el
-
coeficiente de difusin en los poros, D0, respectivamente. iv) La velocidad de la fase lquida en la columna y los parmetros de transferencia de materia son independientes de la concentracin en la fase lquida.
Balance de materia en una pancula En base a La suposicin de la forma esfrica de las partculas y de la existencia de un proceso
de difusin interna, el balance diferencial en una seccin radial de la partculas, puede escribirse
PURIFICACIN DE
81
como:
dc
______
dt
E~
dq
dt
[3.21]
Se obtiene una ecuacin diferencial en derivadas parciales de tipo parablica. Asumiendo que
se produce un equilibrio instantneo entre el soluto de la fase lquida y el que se encuentra adsorbido,
se puede escribir la siguiente relacin:
dq dc
dc dq dt dc
[3.221
1+
1
1E
13.231 ~l dq ~
E0
dc
Balance de materia la columna Suponiendo un flujo no ideal, con dispersin axial, el balance de adsorbato en una seccin
diferencial del lecho se expresa de la siguiente manera:
DC DC (1E
3k
--DL
dz
dt
dq =0 dt
[3.24]
f(q,c)
[3.25]
d2C di
Condiciones de contorno
dc
dz
Ej
3 kf
(C
r=R)
[3.26]
dr
0
r=0
[3.27]
82
MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN En la superficie de la partcula, el flujo de adsorbato que se difunde a travs de los poros es
Ddr =k dc
IC
r=R)
[3.28]
dz
__
cl)
[3.29]
dC dz
=0
z=L
[3.30]
Condiciones iniciales C =O C =
c=O
o= z= L
o=
0=z=L 0= z= L
q = (1
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PURIFICACIN DE
89
4.1.- CARACTERIZACIN DEL ADSORBATO En este apartado se describen los mtodos utilizados para caracterizar las diferentes fuentes de cx-amilasa utilizadas as como los resultados obtenidos con las mismas. Debido a que la <x-amilasa es una enzima industrial de gran consumo, se procedi a la
comparacin entre las fabricadas por las compaas productoras ms importantes. A partir de todos los
datos de que se dispona previamente (bibliogrficos y de los fabricantes) y de los obtenidos a partir de
los ensayos de caracterizacin llevados a cabo, se seleccionar la enzima comercial con la que se va a desaaollar el estudio en el presente trabajo de investigacin. En la tabla 4.1 se muestran las diferentes a-amilasas de Aspergillus oryzae comerciales
analizadas en el presente trabajo y donadas directamente por cada una de las compaas que las
producen.
90
La ct-amilasa de A. oiyzae seleccionada para el estudio de su comportamiento cromatogrfico ha sido la procedente de Fungamyl 1600 HG type WF (Novo Nordisk PUS, Bagsv~erd, Dinamarca).
Denominacin
Brewers Fermex Rapidase [EF Rapidase PS Amylase [500 Grindamyt ASOGO Grindamyl 5100 Qrindamyl S250 Fungarnyl 1600 cx-Amylase type X-A Sanzyme SF6300 Swzynie SP 3500 Sanzyme A 7000
Fabricantet
Gist-brocades
Actividad~
50 000 SKBU/g 2000 SKBU/g 500 SKBU/g 1 600 FAU/g 27 000 BU/g 93 600 SKHU/g 51500 SKBU/g 8 543 SKBU/g
4.1.1.-
enzima (sales. nutrientes y otros productos del caldo de fermentacin, estabilizantes, otras protenas, etc.). La informacin sobre la composicin de estos productos, habitualmente, no est disponible por parte de las empresas productoras. Los ensayos generales para la determinacin de la concentracin de
La referencia completa
-
Novo Nordisk A/S. Bagsvard, Dinamarca. Sigma Chemical Co. St. Louis. MO, EEUU Sankyo Co.. Lid. Tokyo, Japn.
FAU (unidad de amilasa fngica>: 1 FAU corresponde a la cantidad de enzima que descompone 526 g de almidn por hora a 37 0C y pH 4.7 (Novo Nordisk. Analytical Method AF 216). -SKBU: I0SKBU~tFAU
-
BU: 1 BU libera It) mg de maltosa a partir de almidn en 3 minutos a pH 6.9 y 20 oc (Bemfeld. 1955).
PuRIFICACIN DE a-AMILASADE
91
protena en una disolucin suelen estar interferidos, en mayor o menor grado, por las diferentes sustancias que acompaen a las protenas. Por esta razn y con objeto de conocer la concentracin de protena en cada uno de los preparados comerciales de ct-ainilasa con los que se ha trabajado, se ha medido a travs de dos procedimientos basados en principios diferentes para poder realizar comparaciones y obtener mejores conclusiones.
de Warburg y Christian (1941) requiere la medicin de la absorbancia a 260 y a 280 mu. La concentracin total de protena en el medio analizado puede determinarse mediante la siguiente
frmula:
A 280 -
0.76 . A260
Esta correlacin ha sido estimada en base a la absorbancia de una protena utilizada como patrn de calibracin (enolasa de levadura cristalizada). Sin embargo, aunque la mayora de las protenas
tienen una absorbancia a 280 nm en el intervalo 0.5
- 2.0
Mtodo de Bradford
Este mtodo (Bradford, 1976) se basa en el cambio diferencial de color de un colorante en presencia de concentraciones variables de protena. El reactivo de tincin, Coomassie Brilliant Blue
G-250, es capaz de unirse a las protenas formando un complejo de coordinacin. El ensayo se basa en que dicho reactivo, en disolucin cida, desplaza su mximo de absorbancia desde 465 mn hasta 595
mn cuando pasa a encontrarse unido a una protena (por desplazamiento de su pKa). Se ha observado (Spector, 1978) que el coeficiente de extincin molar del complejo colorante-albmina es constante sobre un amplio intervalo de concentracin, por lo que se puede aplicar la ley de Beer para la determinacin de la concentracin total de protena en una disolucin. La concentracin se determina por comparacin con el resultado obtenido para una protena de concentracin conocida mediante una
92
CARACrEPszACIN y MTODos DE
ANLIsIs
En el presente trabajo, el procedimiento operativo utilizado para la realizacin de este ensayo est basado en el descrito por Bradford (1976). El calibrado del presente ensayo se ha realizado con seroalbmina bovina cristalizada y liofilizada. La disolucin del reactivo de tincin y la protena patrn, Bio-Rad Protein Assay Kit II, eron suministradas por Bio-Rad Laboratories (Munich,
Alemania).
4.1.2.-
Cristalizacin de a-arnilasa Los resultados obtenidos a partir de los anlisis de cantidad de protena y electroforesis
realizados sobre la (1-amilasa comercial hicieron necesaria la obtencin de muestra con alta pureza a
fin de eliminar las posibles influencias que las impurezas pudiesen provocar durante el proceso de adsorcin de ct-amilasa. Con objeto de obtener las cantidades necesarias de ct-antilasa con la pureza requerida para el desarrollo del presente trabajo de investigacin, se decidi llevar a cabo la purificacin del preparado comercial Eungamyl 1600 BO type WF. El procedimiento seguido (Akabori et al.. 1954) comprende
sdico, acetato clcico y rivanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), hidrxido sdico (Merck. Darmstadt, Alemania) cido actico (Panreac Qumica. Barcelona. Espaa), caoln, acetona y
sulfato amnico (Fluka Chemie. Neu-U]m, Alemania). Las bolsas de dilisis, Dialysis Tubing
-
Visking n0 5 (Medicel International Ltd. Londres, Gran Bretaa), tienen un corte de masa molecular entre 12000 y 14000. Se ha usado una centrfuga refrigerada Sorval Superspeed RC2-B con rotor SS34
polipptidos. Esta tcnica permite la separacin de las protenas de una mezcla en funcin de su masa
molecular. Las molculas del detergente dodecil sulfato sdico se unen fuertemente a las de protena de tal forma que slo un 0.1% de aquel es suticiente para saturar la cadena polipeptdica, quedando
93
aproximadamente una molcula de detergente por cada 2 residuos de aminocido (1.4 gramos de SOS
por gramo de protena). Cada molcula de SOS tiene una carga negativa por lo que una protena saturada por ellas soportar un gran exceso de carga neta negativa. En la prctica, debido a dicho exceso, se puede considerar que todas las protenas adquieren una relacin carga/tamao virtualmente
idntica, independientemente de la carga neta que tuviese en condiciones nativas, muy pequea en
comparacin con las procedentes de su unin al dodecil sulfato sdico. Por otro lado la placa de gel presenta un gradiente de concentracin de poliacrilamida, siendo
mayor en la parte inferior (cercana al nodo) y menor en la superior (cercana al ctodo). Bajo la accin
del campo elctrico, las protenas cargadas negativamente se mueven hacia el nodo. Las molculas de
menor tamao y mayor movilidad avanzarn a travs del gel, alcanzando las zonas de mayor
-
cercana al ctodo, habiendo avanzado ms las de menor tamao molecular. En estas condiciones existe
una relacin lineal entre el factor de retencin y el logaritmo de la masa molecular de la protena. Esta se determina por comparacin con una recta de calibrado realizada con una mezcla de protenas de masa molecular conocida. El procedimiento operativo (Pharmacia Biotech [a]) consiste en la adicin de un tampn (15 ~l) con SDS y ~-mercaptoetanol a la disolucin de protenas (5 pl) que se desea analizar. Posteriormente se hierve la mezcla para desnaturalizar la protena y que el SDS se una a la cadena polipeptdica. A continuacin se aplican 10 pi de la muestra en un extremo del gel de poliacrilanida, se aade el tampn y se aplica el campo elctrico durante un tiempo determinado. Para detectar las bandas correspondientes a cada protena separada, es necesario realizar la tincin de las mismas mediante un procedimiento (Phannacia Biotech lib]) en el que se utiliza Coomassie.
tincin y lavado. Las placas de gel, PhastGel Gradient 8-25 (Phannacia Biotech, Uppsala, Suecia)
conteman un gradiente de poliacrilamida del 8 al 25%. Se utiliz un sistema de tampn discontinuo
PhastGel SDS Buffer Strips a pH 8.1 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las protenas utilizadas
como marcadores para el calibrado del sistema y su masa molecular han sido: fosforilasa E (94000),
seroalbmina bovina (67000). ovoalbnina (43000), anlxidrasa carbnica (30000), inhibidor de la tripsina de soja (20100) y lactoalbmina (14400), todas ellas suministradas por Pharmacia Biotech
(Uppsala, Suecia). Coomassie Brilliant Blue R-250, fi-mercaptoetanol, glicerol, cido actico y dodecil sulfato sdico fueron suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).
94
mximo de absorbancia en funcin del medio en que se encuentren. El resto de aminocidos con absorcin en esta regin del espectro no presentan una sensibilidad tan acusada. Debido al alto nmero
de residuos, los aminocidos aromticos de una protena se encuentran rodeados de una multitud de microentornos diferentes, por ello, el valor obtenido para la absorbancia en ultravioleta de una cadena
polipeptdica refleja un valor medio del comportamiento espectral de cada uno de dichos grupos
aromticos.
(nm)
Adems este mtodo puede ser de gran utilidad para el seguimiento y determinacin de la
concentracin de protena en los diferentes procesos de adsorcin que se van a llevar a cabo ya que, realizando el calibrado adecuado, la concentracin de protena en disolucin est relacionada proporcionalmente con la absorbancia a determinada longitud de onda.
1
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un
4.2.- CARACTERIZACIN DE LOS ADSORBENTES El conocimiento de las caractersticas tisicoquimicas de los slidos porosos utilizados como adsorbentes es fundamental para conprender y. en su caso, explicar la interaccin de este con el adsorbato en los diferentes procesos de adsorcin. Por otro lado, los modelos fenomenolgicos desarrollados incluyen algunos parmetros fsicos de las resinas, como son la porosidad y la densidad de las mismas, por lo que es necesaria su caracterizacin. En la tabla 4.3 se muestra la informacin, suministrada por el fabricante, sobre las propiedades tisicoquimicas de ambos adsorbentes. Debido a que esos datos no son suficientes o no estn
PURIFICACIN DE
95
Duolite XAD-761
(HIC)
Matriz Grupo funcional
Hidroxilo fenlico (principal) Metilo Densidad aparente [mg/m] 1.11 Retencin de humedad [%] Radio de poro [nm] Hinchamiento reversible [%] Capacidad de intercambio 60 65
-
20 30
-
15-25
7
1.2 eq/l (base hmeda)
En el presente trabajo de investigacin se ha estudiado la adsorcin de una protena, la aamilasa de A. orvzae, mediante dos mecanismos diferentes: interaccin hidrofbica (HIC) e intercambio inico (IEC). Los adsorbentes utilizados han sido, respectivamente para cada uno de ellos, Duolite XAD-761 y Duolite A-568 (Rohm and Haas Co., Filadelfia, PA, EE.UU.). Los dos
adsorbentes seleccionados tienen la misma matriz, diferencindose fundamentalmente en los ligandos
de que estn recubiertos, confirindoles un carcter hidrofbico o de intercambiador de aniones. As, se podrn estudiar de forma ms independiente el comportamiento en el proceso de adsorcin debido a
cada uno de los mecanismos mencionados.
La adsorcin de gases es una tcnica ampliamente empleada para la caracterizacin de una gran variedad de tipos de slidos porosos. En particular, la aplicacin de estudios de fisisorcin (adsorcin fsica) es adecuada para determinar el rea superficial, el volumen de poro y la distribucin de tamaos
de poro de catalizadores, adsorbentes, pigmentos, ridos y otros materiales. Para el presente trabajo se ha utilizado la adsorcin de nitrgeno como tcnica de caracterizacin de los adsorbentes porosos. El equipo empleado para la caracterizacin de las resinas porosas por adsorcin de nitrgeno ha sido un ASAP 2000 (Micromeritics Instrument Corp., Nortcross, GA, EE.UU.).
96
cantidad de gas necesario para formar una monocapa completa de molculas del mismo adsorbidas a la
superficie del slido. A continuacin se expone, de forma resumida, el procedimiento experimental: Una cantidad conocida del slido poroso que se desea analizar se desgasitica sometindola a
calentamiento y vaco en una bureta de gases. La isoterma de adsorcin se construye punto a punto registrando la presin de equilibrio que se alcanza tras la introduccin en la bureta de cantidades
conocidas de nitrgeno. Paralelamente, se debe realizar un ensayo en blanco para corregir la cantidad de gas que se adsorbe a las paredes del sistema.
La determinacin del rea superficial se lleva a cabo mediante el mtodo estndar de BrunauerEmmett-Teller (BET) a partir de los datos de la isoterma de fisisorcin (Sing eta,!., 1985): p
na (~o
~) n~ C
Clp
_
nl, C
PO
[4.1]
donde na es la cantidad de gas adsorbida a la presin relativa p/p0, nam representa la capacidad de la monocapa y C es una constante que depende exponencialmente de las entalpias de adsorcin y licuefaccin. De la pendiente de la representacin lineal de pI(na.(po~p)) frente a p/p0 (representacin
EET) se obtiene el valor de n
0,. El intervalo de linealidad est restringido a una zona limitada de la isoterma, normalmente para valores de presin relativa inferiores a 0.3. As, el rea superficial (rea BET) puede calcularse a partir de la siguiente ecuacin:
ABEr
na,1. L am
[4.2]
siendo a,,1 el rea media ocupada por cada molcula adsorbida en la monocapa completa (su valor para
N2 a 77 K es 0.162
nm
2) y L es la constante de Avogadro.
Distribucin de tamao de poro A valores altos de presin relativa (p/p0), la forma de la isoterma de adsorcin se curva hacia
arriba debido al progresivo llenado los mesoporos del slido mediante el proceso de condensacin
capilar. Cuando los nesoporos se llenan por completo, la isoterma se estabiliza alcanzando una lnea
horizontal. El volumen total de mesoporos puede derivarse de la cantidad de vapor adsorbido cuando la isoterma se encuentra en la zona estabilizada mencionada (es decir, cuando pip0 tiende a la unidad) y, por tanto, los poros se han llenado con el adsorbato condensado en estado liquido.
En base a la ecuacin de Kelvin para la variacin de la presin de vapor con la curvatura superticial del menisco de un liquido en un cilindro capilar cerrado por un extremo (Rouqurol et a,!.,
1994) y con los datos de fisisorcin de nitrgeno en el adsorbente poroso se puede determinar el
97
volumen de poro asociado a cada valor del radio del mismo, rp:
2
=
a V~1
cos6
RT n(p ~,o)
[4.3]
donde a y y11, son la tensin superficial y el volumen molar del lquido condensado respectivamente
3/mol y e = 0~). El parmetro t es (para el nitrgeno liquido a 77.4K, a 8.7210~ N/m, Vm= 34.68 cm un factor de correccin que representa el espesor de la capa ya adsorbida en las paredes del poro
(espesor de la multicapa).
El tamao de los poros de mayor tamao que pueden medirse mediante este mtodo esta limitado por la gran variacin del radio del menisco del lquido con la presin cuando la presin reducida se acerca a la unidad (Satterfield, 1980). Por lo tanto, el mtodo puede aplicarse a poros de hasta 60 nm de dimetro, produciendo errores significativos del volumen de poro en la zona de la distribucin cercana a ese lmite superior. Para determinar la distribucin de tamaos correspondiente a poros del orden de 60 nm y mayores, se deber recurrir a la porosimetra de mercuno.
distribucin del tamao de poro as como de la porosidad y densidad de slidos porosos. En el presente trabajo se han caracterizado ambos adsorbentes porosos mediante esta tcnica utilizando un equipo Micromeritics Pore Sizer 9310 (Micromeritics Instrument Corp., Norcross, GA,
EE.UU.).
de lquidos que no mojan. Cuando el ngulo de contacto, O, entre el lquido y la superficie del slido tiene un valor comprendido entre 900 y 1800, la tensin superficial del lquido, a, se opone a la entrada
del mismo en el interior del capilar. Para forzar su intrusin, es necesario aplicar suficiente presin
hidrosttica externa. En situacin de equilibrio y para poros cilndricos, la fuerza que se opone a la
entrada del lquido y la fuerza debida a la presin externa aplicada se igualan, obtenindose la siguiente relacin (Smith, 1981) entre el radio de poro, r 0 y la presin ejercida, P:
2 a cosO
[4.4]
De acuerdo con la bibliografa (Rootare y Prenzlow, 1967), el valor ms exacto para la tensin
superficial del mercurio es de 0.485 N m. El ngulo de contacto vara en funcin dcl material y su
98
valor oscila entre 120 y 1500. En el presente trabajo se ha utilizado un valor de 1300 (Alen, 1990).
La aplicacin de este principio fue desarrollada experimental y tcnicamente por Ritter y Drake
(1945). Para realizar experimentalmente este ensayo, se introduce una cantidad conocida del slido
poroso en un recipiente cerrado y se somete a vaco para eliminar el aire ocluido en los poros. Entonces, se aade un volumen conocido de mercurio de forma que cubra la muestra por compLeto. A
continuacin el sistema se somete a presiones progresivamente crecientes, midiendo, para cada valor de presin, la disminucin del nivel de mercurio en la celda calibrada, correspondiente al volumen de
mercurio que ha penetrado en los poros de La muestra. De acuerdo con la ecuacin anterior, se
determina el radio de poro para cada valor de presin externa. La distribucin de tamaos de poro,
AV/Ar0 frente a r0, se obtiene teniendo en cuenta que el volumen de mercurio introducido en los poros,
AY, en el intervalo de presiones P y (P+AP) coincide con el volumen de los poros cuyo radio est
comprendido entre r0 y (r0-Ar0). El volumen total ocupado por los poros viene dado por el valor final del volumen de mercurio que se ha introducido en los poros. El tamao mnimo de poros que puede medirse mediante la tcnica de intrusin de mercurio viene impuesto por la presin mxima a la que el porosmetro es capaz de trabajar. Este valor es de,
aproximadamente, de 350 MPa que se corresponde con un tamao de poro de alrededor de 4 nm. La densidad aparente, Pa, es aquella que tiene en cuenta el volumen ocupado por los poros y se determina midiendo la diferencia, previa a la aplicacin de presin, entre el volumen ocupado por el mercurio en presencia y ausencia del slido poroso. La densidad real, Pr, solo tiene en cuenta el material slido del que estn hechas las partculas: 1
1
Pa
[4.5]
Pr
La porosidad interna de las partculas slidas puede ahora calcularse, a partir de su definicin, mediante los datos experimentales obtenidos:
y
1
1
y
[4.61
Pa
Area superficial
Existen tratamientos matemticos para estimar el rea superficial del slido poroso a partir de los datos obtenidos mediante porosimetra de mercurio basados en modelos que suponen geonietras especficas para describir los poros. El ms sencillo de ellos es el que supone una distribucin de poros
ADSORCIN
99
cilndricos (Men, 1990>, aunque se ha descrito alguna en la que no es necesario considerar ninguna geometra determinada para la forma de los poros (Rootare y Prenslow. 1967). Se considera que el trabajo necesario para forzar la introduccin del mercurio, por la accin de la presin, es proporcional a la superficie cubierta, de la siguiente manera:
dW
a cose dS = P dV
[4.7]
donde W es el trabajo realizado y 5 el rea cubierta tras la aplicacin del trabajo. Integrando en todo el intervalo de presiones se obtiene: j
J
yo
PdV
[4.8]
o bien: [4.9]
macosO yo siendo S~ el rea superficial especfica y m la masa del slido utilizada en el anlisis.
4.2.3.- Absorcin de lquido Uno de los procedimientos ms simples para la determinacin del volumen de poros consiste en poner en contacto al slido poroso con un liquido que lo moje, de tal manera que llene el espacio interno de la partcula formado por los poros (Anderson y Pta11, 1985). El procedimiento operativo
seguido en el presente trabajo para cada uno de los adsorbentes utilizados se describe a continuacin.
Se pesan, exactamente, alrededor de 5 gramos de slido y, en un recipiente adecuado, se recubren con agua destilada en exceso durante 15 minutos. Posteriormente se centrifuga a 2i00 rpm durante 40 minutos, se separa el agua en exceso y se pesa el slido mojado. El volumen de fluido que se ha introducido en los poros se calcula mediante diferencia de peso entre el slido hmedo y el seco,
conocida la densidad del liquido.
4.2.4.- Distribucin del tamao de partcula por dispersin de luz Una de las tcnicas de determinacin de la distribucin de tamaos de partculas ms importante
y habitualmente utilizada es aquella que implica los diferentes mtodos basados en la dispersin de luz. Cuando un haz de radiacin se ve interrumpido por la presencia de una partcula, sufre una
100
partcula y el medio que la rodea (Alen, 1990). En base a estos principios existen dos tipos de analizadores que difieren en cuanto a la disposicin de sus componentes principales; unos con el detector situado en ngulo recto respecto a la direccin del haz de luz incidente y otros con el detector enfrentado al mismo en la misma direccin. El primero de ellos es muy sensible a cambios en el tamao de partcula pero la dispersin, detectada a 90~, depende muy acusadamente del ndice de refraccin de la misma. En el segundo tipo de equipos, este ltimo efecto es muy dbil, aunque el tamao mnimo de las partculas que puede detectar es algo ms elevado que en el primer caso. Otras ventajas que presenta el sistema de deteccin situado en la misma direccin que el haz incidente son
las que a continuacin se indican (Alen, 1990):
-
se puede hacer uso de las teoras establecidas sobre el efecto (Rayleigh-Gans, Fraunhofer).
puede determinarse la dispersin de la distribucin.
La cantidad de luz dispersada por partculas de menor tamao que la longitud de onda de la
radiacin incidente es directanente proporcional a su volumen y para partculas mayores dicha cantidad est relacionada con el rea transversal de la partcula proyectada en el haz de luz. Si la
fuente de emisin es un lser, en lugar de una lmpara de luz blanca, el aumento de la intensidad hace que la determinacin sea mucho ms precisa y permita medir distribuciones de partculas de mucho menor tamao (hasta de 0.05 pm dependiendo del sistema de deteccin). La distribucin de tamaos de partculas mediante dispersin de lser se ha llevado a cabo en un
equipo MasterSizer X 6023 (Malvern Instruments Ltd. Worcestershire, Gran Bretaa).
Adems, esta tcnica ha mostrado ser altamente reproducible y repetitiva. La medida de la actividad
bidroltica de la u-amilasa se ha utilizado para comprobar la variacin de la funcin enzimtica durante el desarrollo de los procesos de adsorcin y determinar la influencia del proceso en la desnaturalizacin, si esta se produjese, de la protena.
ADSORCIN
101
4.3.1.-
Absorbancia en ultravioleta La relacin entre la absorbancia, A, y la concentracin molar, c, viene dada por la ley de
Lambert-Beer:
E
A
=
cd
[4.10]
siendo d el espesor de muestra que tiene que atravesar la luz y e el coeficiente de extincin molar, el
cual es un valor caracterstico de la sustancia que tambin depende de la longitud de onda (Perkampus,
1992). Los espectrofotmetros suelen producir grficos que relacionan la longitud de onda frente a la
log
1
[4.11]
donde h e 1 son la intensidad de la luz monocromtica incidente y transmitida respectivamente. Segn lo descrito en el apartado 4.1.3. las disoluciones de protena absorben en la regin ultravioleta debido, principalmente, a la existencia de grupos aromticos en los residuos de fenilaanina, tirosina y triptfano que forman la cadena polipeptdica. En concreto, la a-amilasa
presenta un mximo de absorbancia a 280 nm por lo que se ha utilizado este valor para realizar el seguimiento y medida de la concentracin de a-amilasa en cada uno de los experimentos que as lo requeran en el presente trabajo de investigacin. En la figura 4.3 se muestra la relacin existente entre la concentracin de a-amilasa y la absorbancia correspondiente a 280 nm.
La ct-anilasa es una enzima aruiloltica que cataliza la hidrlisis de los enlaces a-1,4 entre las subunidades de cx-D-glucosa que forman el almidn, siendo maltosa y dextrinas los productos finales
de la reaccin.
Cuando se planifica y realiza un proceso de purificacin de una protena con actividad enzimtica, un objetivo prioritario junto con la eficacia del proceso y el grado de pureza definido por
las especificaciones del producto final, es el de mantener la actividad cataltica que presenta para una o varias reacciones determinadas.
enzimas pueden describirse diferentes definiciones de actividad con distintos procedimientos para determinara. Las diferencias entre cada uno de los mtodos de determinacin de la actividad
pueden no llegar a deducirse o establecerse. Por otro lado, este tipo de ensayos son de difcil estandarizacin debido a la baja reproducibilidad que existe al realizarla con medios y equipos
diferentes. Por ello, los anlisis de actividad debern servir como herramienta comparativa de la
prdida o no de la actividad cataltica de la enzima objeto de ensayo. De los numerosos ensayos de actividad descritos para la a-ainilasa, en el presente trabajo se ha utilizado un mtodo simple. exacto y rpido (Bernfeld, 1955) en el que la actividad se define de la
siguiente manera: Una unidad libera 1.0 mg de maltosa a partir de almidn en 3 minutos a pH 6.9 y 200C. El procedimiento consiste en aadir un volumen determinado de disolucin de enzima sobre
una disolucin de almidn de concentracin conocida. La mezcla se incuba durante 3 minutos a 200C,
transcurridos los cuales se detiene la reaccin mediante inmersin en agua hirviendo. A continuacin se aade un reactivo que colorea la muestra en funcin de la maltosa producida en el medio y tras enfriamiento del conjunto, se diluye con agua. Para cada ensayo se deber realizar el correspondiente anlisis en blanco (sin enzima), determinando la cantidad de maltosa producida. y por tanto la actividad, por comparacin de la absorbancia medida a 540 nm con los resultados obtenidos para una recta de calibrado realizada con diferentes concentraciones de maltosa conocidas.
4.4.1.-
Canadad de protena
Se ha llevado a cabo la medida de la concentracin de protena total mediante absorcin
PURIFICACIN DE
103
ultravioleta a 260 y 280 nm y por el mtodo de Bradford. Se observa disparidad en los resultados
obtenidos por ambos mtodos para cada una de las protenas ensayadas. Las enzimas comerciales suelen contener sustancias que pueden interferir en ambos mtodos. La pureza de la a-amilasa
partida, obtenindose valores superiores al 100%. Esta circunstancia puede ser debida a que el valor
del coeficiente de extincin molar de la ct-amilasa no tiene necesariamente que ser similar al de las
protenas utilizadas en las correlaciones de absorbancias en la regin ultravioleta ni su respuesta en el mtodo de Bradford igual a la de la seroalbilinina bovina del calibrado correspondiente. Sin embargo,
-
la de la cx-amilasa de partida, son muy prximos para ambos mtodos. Esto puede indicar que, en el
proceso de cristalizacin, la concentracin de a-ainilasa se ha multiplicado por un factor de,
aproximadamente, 2.7.
104
3.0
2.5
2.0
1.5
((.5
2.5
2.0
1.5
I.0
0.5
WC
+0
0.5
.0
1.5
2.0
2.5
Concentracin ln~ml 1
Figura 4.3: Relacin entre la absorbancia a 280 nm y la concentracin de u-amilasa en disolucin de tampn Tris/HCI 0.05M, pH 7.0 y fuerza inica 0.60. A partir de los resultados obtenidos para el espectro de a-amilasa se procedi a realizar un
105
calibrado de la absorbancia a 280 mn frente a la concentracin de enzima en disolucin (figura 4.3). Con el fin de determinar la concentracin de ct-amilasa, puede considerarse que sus disoluciones
siguen la ley de Lambert-Beer hasta una concentracin de, aproximadamente, 1 mg/ml. Por esta razn,
en el presente trabajo, la medida de concentraciones supenores a ese valor se ha realizado mediante dilucin de la muestra original o mediante el uso de la curva de calibrado de la figura 4.3. La
utilizacin del primer procedimiento se encuentra limitada a casos en los que no sea necesaria la recuperacin de la fraccin de disolucin medida y la del segundo no estara aconsejada, en cualquier caso, a concentraciones superiores a 2.2 mg/ml debido al enor que se generara ya que a partir de ese valor la variacin de la absorbancia a 280 nrn es excesivamentepequea.
~4
~
..v2+:tfl*~
44:& ____
e ~
Figura 4.4: Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Las muestras corresponden a las siguientes enzimas: (Al) Rapidase PFP, (A2) Rapidase PS, (A3) Amylase P500, (A4) Grindamyl ASOGO, (AS) Grindamyl 5100, (A6) Grindamyl 5250, (A7) Marcadores de masa molecular; (B1) Fimgamyl 1600 BO, (B2) a-amylase type X-A, (B3) Sanzyme SP300, (B4) Sanzyme SP3500, (BS) Sanzyme A7000, (B) Marcadores de masa molecular.
Mediante anlisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, se ha observado que no hay presencia significativa de otras protenas en Fungamyl 1600 BU (figura 4.4), lo cual tambin ha sido confirmado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en estado nativo. Para determinar la presencia o no de sales acompaando a la enzima liofilizada, procedentes de la formulacin de Fungamyl 1600 BU o del propio proceso de purificacin, se procedi a medir la conductividad de una disolucin de a-amilasa cristalizada. El resultado IXie una variacin
106
prcticamente nula de la conductividad, en cualquier caso correspondiente a una disolucin de fuerza inica menor de 0.001. Esto indicara que la cantidad de sales que acompaan a la cx-amilasa en la muestra cristalizada es un pequeo porcentaje de la masa total.
Adsorcin en fase gaseosa Tras los datos correspondientes a las isotermas de adsorcin (figuras 4.5A y 4.5B) y mediante
las
ecuaciones 4.1 y 4.2 se obtuvo el rea I3ET de los dos adsorbentes estudiados. Los anlisis de las
resinas mediante esta tcnica han dado como resultado un rea BET considerablemente mayor para la resma de intercambio inico frente al determinado para la hidrofbica. Los valores obtenidos han sido, respectivamente, de 27.2 m2/g para la Duolite XAD-761 y 92.8 m~/g para la Duolite A-568. A partir de los datos de adsorcin de nitrgeno se determin la distribucin de tamao de poro,
obteniendo valores cercanos y superiores a 60
resultados obtenidos mediante porosimetra de mercurio. Como puede observarse, ambas isotermas pueden clasificarse dentro del tipo II (Brunauer a a,!., 1940) que se corresponde con isotermas tpicas de slidos meso- y macroporosos, presentando
adsorcin en multicapa sin restricciones sobre un sustrato heterogneo, completndose la monocapa de nitrgeno al alcanzar el punto de inflexin (p/p0 = 0.25) (Emmet y Bmnauer, 1937). Las isotermas de
los dos adsorbentes muestran histresis del tipo -II. correspondiente a Ja existencia de poros tubulares abiertos con secciones transversales de diferentes formas (Anderson y Pratt, 1985).
005
iB)
0.04
AA
-r
0.03
A-
A y-
y002 .7 0.01 a
z
0
2~
0.~.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.0 LO 0.0 0. 0-2 0.3
p/p
PURIFICACIN
DE
t 07
00L5
(IX)
0-ole
A
aA-
yy-
-7
-r-y-
y-e y-
-y0.~5 yA
A
Figura 4.6: Duolite A-568: (A) Isoterma de adsorcin-desorcin de N2, (B) grfica BEl.
En la siguiente tabla se resumen los valores obtenidos tras la caracterizacin de los slidos
adsorbentes por adsorcin de nitrgeno.
Tabla 4.4: Resultados de la adsorcin de nitrgeno. Duolite XAD-761 2/gj rea BET [m C (ecuacin 4.1) 27.2
79.3
poros de tamao entre 20 y 80 mn. La distribucin para la resma hidrofbica, Duolite XAD-761, es
ms abierta, conteniendo poros en un intervalo de tamaos mayor. La fraccin de volumen
correspondiente a los mesoporos es del 41%, conteniendo una cantidad significativa de macroporos de tamao superior a 20() nm
105
~t
(.30
0.25 e
e o A-
a
e e
e
e
L..
e o
o
e
e
e
e
t Radio de
Loo
o
Radio de poro Innil
poro Inm
Figura 4.7: Distribucin volumtrica acumulada de tamafio de poro mediante porosimetra de mercurio:
(A) Duolite XAD-761, (E) Duolite A-568.
las ecuaciones 4.4 y 4.5 a partir de los datos experimentales obtenidos por porosimetra de mercurio. En la tabla 4.5. se resumen los parmetros fsicos obtenidos para cada uno de los adsorbentes
analizados por este mtodo.
Duolite A-568
0.53 0.94 1.89 0.50 28.5
109
Absorcin de lquido
La tcnica de absorcin de lquido (agua) no se ha mostrado adecuada para la determinacin
del
volumen de poros para la resma Duolite XAD-761 ya que una fraccin de la muestra flotaba
parcialmente y se obtuvo un valor excesivamente bajo. Para el otro adsorbente, Duolite
A-568, el
ensayo se pudo realizar con-ectamente, estimndose un valor del volumen de poro especfico de 0.59 cm3/g, prximo al determinado mediante porosimetria de mercuno. Tamao de partcula por dispersin de luz
Se ha determinado la curva de distribucin de tamaos de partcula para las ambas resinas
correspondientes a las fracciones utilizada como relleno de las columnas de HPLC. Para partculas de tamao menor de 100 gm el tamizado mecnico puede verse dificultado por factores tales como la electricidad esttica que acumula el slido. En estos casos, la fraccin de partculas recogida entre dos tamices puede que tenga un tamao de corte inferior que no coincida con el nominal del tamiz de menor tamao de luz de malla. Por otro lado, la existencia de partculas que no se asemejen a una esfera, es decir que tengan una dimensin diferente a las otras dos, puede producir que en la fraccin recogida por tamizado existan partculas mayores que las que le correspondera al tamiz de mayor tamao.
25 lOO 35
loo
30 20
-
80
80
25 60>.
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2
-c
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15 40
es. o
~2
40~
10 20
20
lO
Dhin,etro
0 100
10
0 100
de
parcula h~]
Figura 4.8: Distribucin de tamafio de partcula de la fase estacionaria de las columnas de HPLC:
lo
Ambos efectos no son tan significativos a medida que se aumenta el tamao de las partculas con las que se trabaja. Por ello, en los experimentos de adsorcin en tanque agitado y lecho fijo, en los que se utilizan partculas de mayor tamao, se tomar el valor medio de la luz de malla de los tamices utilizados para cada fraccin como tamao medio de las partculas. La distribucin de tamaos de pancula para las resinas indicadas se muestran en la figura 4.8. En ambos casos el mximo de la distribucin se sita en un valor de 36 m. Sin embargo, la
distribucin correspondiente a la resma de HTC (Duolite XAD-761) es ms abierta, contando con una
fraccin significativa de partculas inferiores a 10 ~m, lo cual dar un empaquetamiento ms compacto
4.5.- BIBLIOGRAFA
-
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113
5. EXPERIMENTAL
En el presente captulo se detallan los materiales y se describen los equipos experimentales utilizados durante la realizacin del trabajo de investigacin para cada uno de los procedimientos estudiados: impulsos de adsorbato en columnas de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), adsorcin en tanque agitado discontinuo y adsorcin en lecho fijo. Tambin se describen los mtodos utilizados para desarrollar cada uno de los experimentos que se han llevado a cabo. Por ltimo se justifica la eleccin de las variables y condiciones de operacin en base a los objetivos que se desean alcanzar y el conocimiento previo de los sistemas que se ha obtenido a partir de los experimentos diseados para tal fin.
5.1.- PREPARACIN DE LOS ADSORBENTES Previamente a la utilizacin de ambos adsorbentes es necesario someterles a un pretratamiento con el fin de eliminar las impurezas y restos del monmero del que estn que estn formados y que hubiese quedado ocluido durante el proceso de sntesis, mejorando as el rendimiento de la adsorcin. A la tesina de intercambio inico se la someti, de forma secuencial y en discontinuo, a
114
EXPERIMENTAL
tratamiento con 5 volmenes de NaOH l.5M, 20 de agua destilada. 5 de 1-ICI 2CM y de nuevo agua
destilada hasta alcanzar un pL! neutro. Para realizar el pretratamiento a la resma hidrofbica se repiti dos veces la secuencia descrita anteriormente, tras la cuai se lav con metanol y, finalmente, con agua destilada. A continuacin cada resma fue sometida a vaco (2 mmHg) en un desecador con objeto de
eliminar todo el agua retenida y adsorbida por ella. A lo largo de toda la experimentacin realizada en el presente trabajo, se han utilizado
diferentes tantalios de pancula, para lo que, en cada caso, se tamiz para obtener la fraccin correspondiente al tamao deseado.
5.2.- CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) La cromatografa lquida de alta eficacia es una tcnica ampliamente utilizada como mtodo analtico dc una multitud de compuestos qumicos de muy diversa naturaleza. Se ha descrito su capacidad como mtodo preparativo (Felinger y Cuiochon, 1994; Compton y Kreilgaard, 1994, Kenney el al.. 1989; Velayudhan y l-forvth, 1988; Gooding ci aL, 1986) o incluso como mtodo de purificacin a escala industrial para la industria farmacutica (Kato tel., 1985; Clonis el al., 1986). Debido a su exactitud, sensibilidad, repetibilidad, facilidad de uso y necesidad de muy pequeas cantidades de muestra, tambin puede ser utilizada como herramienta de la investigacin para conocer las propiedades y caractersticas de adsorbatos y adsorbentes as como para estudiar la interaccin que se produce entre ambos. En el presente trabajo de investigacin, las curvas de respuesta (picos cromatogrticos) obtenidas tras la introduccin de un impulso de wamilasa en las columnas de LIC e ffiC se han obtenido mediante un equipo de HPLC. Los datos experimentales, as obtenidos, se utilizarn para realizar el anlisis mediante el mtodo de los momentos. La experimentacin llevada a cabo con este sistema, cuya descripcin se detalla ms adelante, produce una doble informacin: en primer lugar, nos permitir estudiar la influencia de las variables en base a un anlisis de los parmetros clsicos de la cromatografa (tiempos de retencin, factor de retencin, parmetro de interaccin hidrofbica, carga caracterstica del adsorbato, etc.); en segundo lugar, el anlisis mediante el mtodo de Los momentos (ver apartado 3.2) nos dar estimaciones de la capacidad de los adsorbentes, de los parmetros cinticos (coeficiente de difusin en los poros y de dispersin axial) y termodinmicos (isoterma lineal, entalpa y entropa de adsorcin). A continuacin se describe el equipo experimental de cromatografa lquida junto con los procedimientos utilizados para el desarrollo de cada uno de los experimentos y los ensayos previos llevados a cabo para [a definicin x conocimiento del sistema.
115
5.2.1. Materiales Como fuente de cx-ainilasa de Aspergillus oyzae se utiliz la procedente del producto comercial Fungamyl 1600 BO type WF, lote AF12614, donada por Novo Nordisk (Bagswerd, Dinamarca). La enzima se extrajo, cristaliz y liofiliz segdn se indica en el apartado 4.1.2 del
presente trabajo.
Los adsorbentes utilizados fueron, para los estudios de adsorcin por interaccin hidrofbica (HIC), Duolite XAD-761 y, para los correspondientes a adsorcin por intercambio aninico (IEC), Duolite A-568. Ambos han sido donados por Rohm and Haas Co. (Filadelfia, PA, EE.UU.). Tras ser
sometidos al pretratamiento correspondiente (ver apanado 5.1), fueron tamizados para obtener la fraccin de tamao seleccionada. Las disoluciones reguladoras utilizadas como fase mvil fueron Tris/HCl 0.05M y fosfato 0.OSM en funcin del valor de pH requerido para cada experimento. La fuerza jnica se ajust mediante la adicin de NaC. Para estabilizar la estructura y actividad de la a-amilasa es necesaria la presencia de Ca2~ en el medio (Vallee et al., 1959; Janecek y Balz, 1992), por lo que a cada
experimentos en impulso fueron, NaC 2M y NaNO3 0.25M en el tampn correspondiente para las columnas de intercambio inico e interaccin hidrofbica respectivamente. Todas las disoluciones fueron filtradas a travs de membrana de 0.22 gm Millipore 05WP04700 (Millipore Corp. Bedford, MA, EEUU.). Los reactivos tris(hidroximetiflaminometano (Tris), NaC, NaH1PO4, Na2HPO4 y CaCI2 han sido suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), el cido clorhdrico por Merck (Darmstadt, Alemania) y el NaNO3 por Panreac Qumica (Barcelona, Espaa). El agua utilizada ha
116
EXPERIMENTAL
xenn permite medir la absorbancia, de forma simultnea, a tres valores de longitud de onda en el intervalo 190-600 nm. El volumen muerto del sistema es muy pequeo y se debe, principalmente, al
correspondiente a los tubos por los que circula la fase mvil (80 pi) y al mezclador a la salida de las
bombas (60 pi) ya que la contribucin de la clula de deteccin de ultravioleta (2 III) y de conductividad (1.5 pi) es, en comparacin, despreciable.
(3)
(1) Eluyentes (2) Vlvulas de entrada y Bombas de pistn (3) Mezclador (4) Vlvula dc inyeccin (5) Columna (6) Cbila UY/Vis (7) Clula de Conductividad (8> Colector de fracciones
(9> Ordenador
(5)
-
UNWMI E
CO~4TR&
(6)
(7)
(9)
Las columnas
dimensiones de 2. 1 mm de dimetro interno y 200 mm de longitud. Un programa (Smart Manager), del mismo fabricante, implementado en un ordenador personal (Compaq Deskpro XE 466. Compaq Computer Corp., Houston, TX, EE.UU.) gestiona y controla cada uno de los sistemas mencionados a travs de una tarjeta de adquisicin de datos, as como programa y registra los datos de presin, temperatura, caudal, posicin de la vlvula, absorbancia en ultravioleta y conductividad del efluente que proporcionan los correspondientes sensores y detectores.
5.2.3.- Relleno y preparacin de las columnas de HPLC Las columnas de HPLC se empacaron en el laboratorio de la siguiente manera. Una vez realizado el pretratamiento (ver apartado 5.1) a cada uno de los adsorbentes, se tamizaron y se recogi
117
la fraccin seleccionada para los experimentos (25-38 gm). Posteriormente se suspendieron en una disolucin de cido actico que fue bombeada a travs de la columna de HPLC aplicando una presin aproximada de 45 MPa. La columna se mantuvo a la citada presin hasta que 2 litros de la suspensin pasaron a travs de ella. Para terminar la preparacin, se procedi al lavado de la columna, haciendo
pasar agua destilada a un caudal de 1.0 ml/ma durante 24 horas. Una vez realizado este proceso, se
conecta la columna al equipo para el desarrollo de la experimentacin. La masa de adsorbente en el interior de la columna se determin por diferencia de pesada entre la cantidad inicial utilizada y la resma sobrante del proceso de empacado tras el secado de la misma.
5.2.4.- Desarrollo de un experimento Antes de realizar cualquier experimento en impulso o grupo de ellos en unas condiciones de temperatura, pH y fuerza inica determinada, es necesario que la columna se acondicione adquiriendo los parmetros mencionados. Para el acondicionamiento de la columna, con el tampn de concentracin, pH y fuerza inica seleccionado, se bombea, a un caudal de 0.50 m/mm, la fase mvil adecuada durante 12 horas aproximadamente. Previamente las disoluciones han debido ser filtradas y desgasificadas a vaco (60 mmflg aproximadamente) inmediatamente antes de la experimentacin para evitar el ensuciamiento y posible taponamiento de la parte superior de la columna y obtener cromatogramas sin ruido ni deriva en la lnea base Una vez acondicionada la columna, se fija el caudal de la fase mvil y se realiza el llenado del lazo de la vlvula de inyeccin con la disolucin de a-amilasa o del trazador correspondiente. Posteriormente y mediante el programa de control, se inyecta la muestra en la fase mvil que fluye a travs de la columna. El seguimiento de [a concentracin de -amilasa a la salida de la columna se realiz mediante los datos de absorbancia a 280 nm del detector de ultravioleta. El trazador utilizado en la columna de FC fue NaC 2M, realizndose la medida de la respuesta mediante el detector de conductividad.
Como trazador en la columna de 1-LIC se utiliz NaNO3 0.25M, detectndose mediante absorbancia en ultravioleta a 280 nm. Estos datos se almacenan en el ordenador para su posterior tratamiento
mediante el mtodo de los momentos como se indica en el apartado 3.2.
5.2.5.- Experimentos previos Antes de comenzar la experimentacin para el posterior anlisis matemtico de los momentos cromatogrficos obtenidos en los experimentos en impulso, es necesario determinar los valores o, en
118
EXPERIMENTAL
su caso, los intervalos de operacin de las variables que influyen en la respuesta del sistema.
Adsorbentes Como ya se ha comentado anteriormente, se va a estudiar la adsorcin de a-amilasa sobre dos sistemas con mecanismos de retencin diferente, intercambio inico e interaccin hidrofbica. Se han seleccionado dos adsorbentes que tienen la misma matriz, diferencindose fundamentalmente en los ligandos de que estn recubiertos. As, se podrn estudiar de forma ms independiente el comportamiento en el proceso de adsorcin debido a cada uno de los mecanismos mencionados.
ph La wamilasa muestra una estabilidad extremadamente alta en el intervalo de pH entre 6 y 8. reducindose con el tiempo la actividad enzimtica fuera del mismo (Carsen, 1994), por ello se decidi estudiar la influencia del pH en el proceso de adsorcin entre dichos valores. El punto isoelctrico de la u-amilasa de A. oiyzae es 4.2 (Fischer y de Montmollin, 1951) por lo que la protena presentar, en dicho intervalo, una carga neta negativa, lo que justifica la eleccin de una resma intercambiadora de aniones para el estudio de la adsorcin en sistemas de intercambio inico. Para los experimentos de cromatografa de interaccin hidrofbica, a los valores de pH 6, 7 y 8. se utiliz tampn fosfato C.05M. El tampn utilizado en los experimentos con la columna de intercambio aninico, para pH 7 y 8, fue Tris/HCI 0.05M y fosfato 0.05M para pH 6.
Fuerza jnica
La fuerza inica es un parmetro que tiene gran iniluencia en el mecanismo de adsorcin tanto por interaccin hidrofbica como por intercambio inico (ver apartados 1.2.2.1 y 1.2.2.2). La adsorcin en sistemas hidrofbicos se ve favorecida por un aumento en la fuerza inica de la fase mvil y el efecto contrario ocurre en la adsorcin por intercambio inico. Por esta razn, existe un intervalo de fuerza inica en el que se produce una variacin gradual en la intensidad de la adsorcin. Fuera del mismo, la retencin del adsorbato, o bien no es significativa, o bien es total y queda retenida en el interior de la columna. Se han realizado experimentos en un amplio intervalo de fuerza inica para ambos sistemas estudiados y se ha comprobado que los valores entre los cuales puede estudiarse adecuadamente la respuesta cromatourfica ante un impulso de adsorbato son 0.5
-
119
Concentracin de adsorbato Se realizaron experimentos con impulsos de ct-amnilasa a diferentes concentraciones (0.5, 1.0 y 2.0 gIl) para determinar el valor ms adecuado de esta variable. No se encontraron diferencias entre los tiempos de retencin correspondientes a cada una de las concentraciones ensayadas y a diferentes caudales (figura 5.2).
1300 w 250~ ~ 20015010050-
h
a
[~~rgml
lo
.0 mg/ml
&
E
o.
0.1 0.2 0.3 0.4 Caudal 0.5 0.6 0.7
[nl/minI
Las respuestas cromatogrficas obtenidas para la concentracin de 2.0 gIl presentaban mayor asimetra que las otras dos y las correspondientes a 0.5 gIl eran demasiado dbiles por lo que, en condiciones de alta adsorcin, la exactitud de la medida podra verse comprometida. Por ello, la concentracin de wamilasa seleccionada para la realizacin de los experimentos de impulso en columnas de HPLC fue de 1.0 gIl. Tamao de partcula Cuanto menor sea el tamao de las partculas de adsorbente que rellenan una columna cromatogrfica, mayor ser la resolucin de la misma y mayor simetra presentarn los picos obtenidos. Por otro lado, el menor tamao de partcula tiene asociado una mayor prdida de carga a lo largo de la columna. Tras diferentes experimentos con columnas empacadas con adsorbentes de tamao medio diferente, se determin que el tamao de partcula con el que se obtena un mejor
compromiso entre los efectos mencionados era el de la fraccin tamizada correspondiente al corte 0.25 0.38 gm.
-
120
EXPERIMENTAL
Caudal
El intervalo de caudal de elucin de la fase mvil seleccionado para llevar a cabo la experimentacin ha sido 0.40
-
considerable y para valores superiores, la prdida de presin es elevada para el tamao de partcula seleccionado.
Temperatura
El valor mximo de temperatura a la que se pueden realizar los experimentos viene dado por la estabilidad trmica de la propia enzima. De los datos obtenidos de la bibliografa y debido a que los procesos de adsorcin a nivel industrial pueden durar muchas horas, se ha considerado 30 0C como
Volumen de inyeccin El volumen ptimo del impulso cromatogrfico inyectado en la fase mvil a la entrada de la columna est relacionado con la concentracin de adsorbato en la muestra. Es necesario evitar que la cantidad de wamilasa introducida al sistema llegue a saturar la cabeza de la columna y se est en condiciones de no equilibrio. Por otra parte. un volumen elevado de inyeccin, aun estando en
condiciones de equilibrio, da lugar a respuestas cromatogrficas asimtricas que dificultan el tratamiento de los resultados obtenidos. En base a la experimentacin previa, se ha establecido un volumen de inyeccin de 5 pi de disolucin de a-antlasa para el estudio de la adsorcin mediante cromatografa de impulso en HPLC.
Reversibilidad Con objeto de comprobar que, tras la inyeccin de una disolucin de wamflasa, no queda protena retenida irreversiblemente en la columna, se realizaron una serie de experimentos. Como la respuesta del detector ultravioleta a 280 nm es lineal para el intervalo de concentracin de a-amilasa
utilizado, podemos suponer que el rea de los picos obtenidos es proporcional a la cantidad de protena que se detecta. Para comprobar el grado de reversibilidad se llevaron a cabo dos tipos de experimentos. Por un lado se determin el rea de los picos obtenidos a la salida de la columna tras la inyeccin de pulsos dc ct-amilasa de volumen y concentracin fija para diferentes caudales. Por otro lado, se inyectaron pulsos de a-amilasa en iuuales condiciones de concentracin, volumen y caudal, pero se sustituy la columna cromatogrfica por un tubo capilar. De esta manera, se determina el rea que le correspondera al pulso de entrada en las condiciones indicadas ya que toda la a-amilasa introducida al sistema es detectada. La diferencia entre e] rea del pulso de entrada y el del pico
121
cromatografico registrado en iguales condiciones nos indicar la cantidad de a-amilasa que ha quedado retenida en la columna. Se comprob que en los intervalos experimentales estudiados, la adsorcin es completamente reversible, no existiendo diferencias significativas entre ambas reas salvo a caudales bajos (= 0.2 m/mm) debido, fundamentalmente a que a este caudal, el pico cromatogrfico es muy ancho y achatado, existiendo mayor error en la integracin del mismo. Esto justifica tambin la eleccin de caudales superiores para la experimentacin segn se ha comentado en el apartado correspondiente. En la figura 5.3 se muestra un ejemplo de test de reversibilidad.
35 30 < 25 20 15 10 5 0.1
. . . .
O o
[E~iearada [~orespuesj
2
~
go
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
.9.
0.8 0.9
Caudal lmtfndnl
Figura 5.3: Test de reversibilidad de la adsorcin en experimentos de impulso en HPLC. Columna HIC (Duolite XAD-761): pH 7.0, 20 C, concentracin 1.0 mg/ml y
volumen de inyeccin 5
pi.
SU.- Condiciones de operacin De acuerdo con los experimentos previos realizados y con los objetivos del presente trabajo de investigacin, en la tabla 5.1 se resumen los valores e intervalos utilizados en los experimentos realizados para el anlisis de momentos de las respuestas obtenidas ante los impulsos de cx-amilasa en cromatografa de interaccin hidrofbica y de intercambio inico.
122
Tabla 5.1: Condiciones de operacin para [os experimentos de HPLC. HIC (Duolite XAD-761) Fase mvil Fosfato 0.OSM (pH 6, 7, 8)
EXPERIMENTAL
WC (Duolite A-568) TrisHCI 0.05M (pH 7, 8) Fosfato (pH 6) 6.0, 7.0, 8.0 0.50, 0.60, 0.70, 0.80, 0.90, 1.00, 1.10 1.0 5.0
pH Fuerza inica
Concentracin (mg/m) Volumen inyeccin Qil) rainao partcula (.Lm) Caudal (ml/mm) Temperatura (0C) 25
1.0
5.0
-
38
25 38
-
5.3.- ADSORCION EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO Este tipo de instalaciones se caracteriza por su versatilidad, facilidad de uso y gran
simplicidad de las mismas. Permiten de manera sencilla la variacin de las condiciones de operacin
de cada uno de los experimentos para poder establecer la influencia que tienen sobre el comportamiento del sistema en los procesos de adsorcin. Uno de los parmetros cinticos que caracterizan la adsorcin de un soluto sobre las partculas de un adsorbente es el coeficiente de transferencia de materia externa. Una vez que se ha llegado a establecer un rgimen de mezcla perfecta, puede considerarse que la resistencia a la transferencia de materia que ejerce la capa lmite que rodea las partculas del adsorbente ha sido
eliminada. Esta situacin se consigue mediante la seleccin adecuada de la velocidad de agitacin, del
tamao de las partculas slidas y del diseo del equipo experimental. De esta forma, el seguimiento de la disminucin de la concentracin de u-amilasa en la fase lquida en un experimento de adsorcin en tanque agitado, proporcionar las curvas cinticas de las que se obtendr el valor del coeficiente de difusin en los poros tras el correspondiente ajuste de los datos experimentales al modelo propuesto para este tipo de sistemas. Por otro lado, la realizacin de los expcrimentos de adsorcin en un sistema de tanque agitado discontinuo proporcionar la informacin correspondiente a las isotermas de adsorcin mediante la obtencin de datos de equilibrio.
123
5.3.1.- Materiales
Como adsorbato se ha utilizado a-amilasa de
adsorbentes, Duolite XAD-761 y Duolite A-568 para adsorcin por interaccin hidrofbica e
intercambio inico respectivamente, fueron sometidos al pretratanfiento descrito en el apartado 5.1. Las disoluciones de adsorcin utilizadas para LIC e ffiC han sido: tampn fosfato 0.05M de pH 6.0 y Tris/HCI 0.05 de pH 7.0, con una fuerza inica de 0.35 y 0.60 respectivamente (ver apartado
5.2.1.). Todas las disoluciones fueron filtradas a travs de membrana de 0.80 iim Millipore
5.3.2.- Equipo experimental Los experimentos cinticos y de equilibrio de adsorcin en tanque agitado discontinuo se han llevado a cabo en la instalacin cuyo esquema se muestra en la figura 1, pudindose diferenciar las siguientes partes:
Sistema de adsorcin La adsorcin se realiza en un matraz esfrico de vidrio Pyrex de 50 mm de dimetro con tres bocas cuyas funciones son las siguientes:
-
Introduccin del agitador. Introduccin del tubo de toma de muestras con filtro incorporado. Introduccin del tubo de recirculacin.
Sistema termosttico La temperatura del proceso se controla mediante un bao termosttico de enfriamiento Heto DTI CB-8-30e (Heto-Holten, Aller0d, Dinamarca). El fluido utilizado fue agua o disolucin de etiln glicol para los experimentos realizados a 4 0C, siendo la precisin nominal del controlador de 0.01
0C. El tanque con la disolucin de adsorcin y el adsorbente adecuado se sumerga parcialmente en el
Sistema de agitacin
La agitacin se lleva a cabo mediante un agitador de hlice de tres palas realizado en vidrio. Este se encuentra impulsado por un motor con selector y regulador de velocidad IKA RW-20 (Janke
EXPERIMENTAL
Una bomba peristltica Hewlett-Packard 89052B (Hewlett-Pakard, Avondale, PE, EE.UU.) hace circular continuamente la disolucin de adsorcin a travs de la clula de flujo del
espectrofotmetro Uy/Vis y de medida de pH. En el extremo del tubo de toma de muestra, sumergido en la disolucin de adsorcin, se encuentra un filtro de tefln de 0.8 im para evitar que las partculas de adsorbente salgan del medio. El tiempo muerto del sistema es de 15 segundos y el volumen muerto de 2.3 ml.
Monitor de pH
-1
Espectrofotmnetro 11V/Vis
Bomba
peristltica
Bao termosttico
Figura 5.4: Esquema de la instalacin para los experimentos de adsorcin en tanque agitado discontinuo.
EspectroJbtmetro ultravioleta
El espectrofotmetro Uy/Vis de matriz de diodos Hewlett-Packard 8452A (Hewlett-Pakard.
Avondale, PE, EE.UU.) tiene un intervalo de medida entre 190 y 820 nm. Est dotado con una clula
de flujo de cuarzo de 50 pi. La concentracin de a-amilasa en el tanque se determina mediante absorbancia a 280 nm y se monitoriza y almacena en el ordenador (Hewlett-Packard Vectra
486/33VL) mediante los programas de control Ql IOOA (General Scaning) y Ql lOIA (Quantitication)
del propio fabricante.
Medidor de ph
El seguimiento de la variacin de pH se realiza mediante un electrodo situado en una clula de flujo de 30 pi que se encuentra conectado a un monitor digital, pH Monitor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). De esta manera se determinan las posibles variaciones de pH que puedan producirse
125
5.3.3.- Desarrollo de un experimento Los experimentos cinticos y aquellos realizados para determinar las isotermas del equilibrio
de adsorcin se llevaron a cabo en el mismo equipo experimental pero el procedimiento operativo
tanque agitado discontinuo comienza con el acondicionamiento del adsorbente. Una vez pesada en seco la cantidad seleccionada de este, se le suspende en la disolucin tampn correspondiente al experimento de adsorcin (25 ml aproximadamente) y se mantiene en esas condiciones durante 24 horas. La disolucin de adsorcin con la concentracin adecuada de wanilasa se filtra y, tras medir el
volumen correspondiente al experimento, se echa en el matraz de vidrio. Este se introduce en el bao termosttico a la temperatura de experimentacin y se conecta la agitacin, la recirculacin y el
espectrofotmetro. Se mantiene as durante una hora, tiempo necesario para considerar que el sistema se encuentra termostatizado y estabilizado. A continuacin, la suspensin de adsorbente se filtra a vaco, recogiendo la totalidad del mismo. El experimento comienza cuando se aade el adsorbente al matraz, en ese momento comienza la medida continua de la absorbancia a 280 nm mediante el espectrofotmetro. El final del
experimento se determina cuando la medida de la absorbancia a 280 nm da un valor constante.
El retraso del sistema viene determinado por el tiempo que tarda la disolucin de adsorcin en llegar hasta la clula de medida desde el interior del matraz. Este se ha determinado, obtenindose un
valor de lO segundos.
Los experimentos realizados en tanque agitado discontinuo para la determinacin de las isotermas del equilibrio de adsorcin se ha llevado a cabo de manera anloga, a diferencia que la medida de la concentracin de ct-amilasa mediante absorbancia a 280 nm se realiz solamente para el
valor correspondiente al equilibrio. Para ello se tomaron tres muestras del sobrenadante (1.0 m) y se
midi su concentracin sin necesidad de hacer circular la disolucin por la clula de flujo con la bomba peristltica. Para concentraciones mayores de 1.0 mg/m, debido a que la ley de Beer no se cumple satisfactoriamente, se diluy previamente la muestra obtenida.
Para determinar los valores e intervalos de operacin de las variables del sistema, se han llevado a cabo una serie de experimentos previos que proporcionarn la informacin necesaria para tal
126
fin.
EXPERIMENTAL
plly fuerza inica A partir de los resultados obtenidos en los experimentos de adsorcin en HPLC, se han seleccionado las condiciones de pH y fuerza inica a las que se van a desarrollar el estudio de la adsorcin en tanque agitado discontinuo y en lecho fijo. Estos valores son:
-
Adsorcin por interaccin hidrofbica en Duolite XAD-761: pH 6.0, fuerza jnica 0.35,
Adsorcin por intercambio inico en Duolite A-568: pH 7.0, fuerza inica 0.60.
En estas condiciones el factor de capacidad es elevado pero la adsorcin es aun reversible. Si trabajsemos en condiciones extremas que favoreciesen la adsorcin, no slo se uniran fuertemente
las molculas de a-arnilasa sino tambin otros componentes de la mezcla que se desea separar ya que
Velocidad de agitacin
Es necesario determinar la velocidad de agitacin mnima, a partir de la cual el control de la
transferencia de materia externa puede considerarse que no es significativo. Para ello, se realizaron una serie de experimentos en iguales condiciones de operacin pero con diferentes velocidades de
agitacin.
Para velocidades mayores de 600 rpm, no se aprecian diferencias en las curvas cinticas de
adsorcin. A partir de agitaciones superiores a 1200 rpm la aparicin de espumas produce inestabilidades en La medida de la absorbancia a 280 nm, as como una nueva resistencia a la
transferenciade materia. Por ello se ha elegido una velocidad de agitacin de 800 rpm.
concentracin inicial
Se ha elegido un intervalo de concentracin inicial de a-amilasa en la disolucin de adsorcin de 0.10 a 1.00 s/l. A concentraciones mayores, la absorbancia a 280 nm no cumple la ley de Beer, llegando a saturarse el detector ultravio[eta a partir de concentraciones de 2.5 mg/ml.
127
Tamao de partcula A la velocidad de agitacin elegida, se han realizado experimentos con diferentes tamaos de partcula en el intervalo 0.20-0.80 mm. No se han detectado influencias significativas debidas a un
control de la transferencia de materia externa por lo que se ha elegido un tamao de partcula
correspondiente a la fraccin intermedia tamizada entre 0.32-0.50 mm. Volumen de disolucin El volumen de la disolucin de ct-amilasa no iiffluye en el comportamiento cintico ni de
equilibrio en el proceso de adsorcin. Para volmenes excesivamente pequeos (menores de diez
veces el volumen muerto del sistema de recirculacin), aparecen problemas tcnicos y de retraso de
las curvas cinticas de adsorcin. Si el volumen es demasiado grande, el problema que aparece es el de la correcta mezcla y homogeneizacin de la suspensin, haciendo necesaria la utilizacin de sistemas de agitacin ms complejos con la inclusin de tabiques deflectores en el tanque de
adsorcin. Tras diversos experimentos, se seleccion un volumen de disolucin de 50 mL suficiente para evitar los problemas mencionados, permitiendo as una buena homogeneizacin de la suspensin mediante agitacin simple.
Masa de adsorbente La seleccin de la masa de adsorbente utilizado en cada experimento est relacionada con el
volumen de disolucin y con la capacidad de adsorcin de la resma en las condiciones experimentales, que viene dada por la isoterma de equilibrio. Si la concentracin de adsorbente en la suspensin es elevada, aparecern problemas de transpone de materia, y si es demasiado baja, la
disminucin de la concentracin de enzima en la disolucin puede llegar a ser tan pequea que su seguimiento est sujeto a un error experimental intolerable. A partir de estas consideraciones y de los experimentos previos realizados, se ha decidido llevar a cabo los experimentos cinticos con una cantidad de 0.50 g de adsorbente. Para los experimentos de equilibrio en los que la concentracin de a-amilasa fue superior a 1.0 mg/ml se
utilizaron cantidades entre 0.75 y 1.75 g, en funcin de la concentracin inicial de enzima.
5.3.5.- Condiciones de operacin En la siguiente tabla se resumen las condiciones experimentales e intervalos de las variables de operacin estudiadas:
128
EXPERIMENTAL
Tabla 5.2: Condiciones de operacin para los experimentos cinticos en tanque agitado discontinuo.
HIC (Duolite XAD-761) Tampn pH Fuerza inica Concentracin (mg/mi) Masa adsorbente (g) Agitacin (rpm) Volumen (mi) Tamao partcula Qtm) Temperatura (0C) WC (Duolite A-568)
0,1 0.5
-
0.1
1.0
0.50
4, 20, 30
20, 25, 30
La disposicin ms frecuentemente utilizada a nivel industrial en los procesos de purificacin por adsorcin es aquella que utiliza uno o varios lechos fijos. Respecto a la adsorcin en tanque agitado. la llevada a cabo en lecho fijo es ms fcilmente escalable y el control de las variables del sistema es ms sencillo. Sin embargo en el flujo de un fluido a travs de un lecho fijo, aparece el efecto de mezcla a lo largo del eje longitudinal de la columna, denominado dispersin axial, que produce una disminucin de la eficacia de los procesos de adsorcin. La experimentacin en lecho fijo deber minimizar este efecto para mejorar el rendimiento obtenido en el sistema.
Con el fin de disminuir la resistencia a la transferencia de materia externa es necesario seleccionar panculas de adsorbente suficientemente pequeas. Por otro lado, sera deseable el uso de
caudales elevados ya que el caudal de operacin est directamente relacionado con la produccin del proceso. Sin embargo, el aumento del caudal y la disminucin del tamao de partcula conducen ambos a un incremento de la prdida de carga a lo largo de la columna por lo que ser necesario alcanzar una solucin de compromiso entre ambos factores.
Estas variables (caudal y tamao de partcula), junto con otras caractersticas del proceso
(concentracin, temperatura, tamao de lecho, etc.) tendrn que ser optimadas para conseguir los
niveles de pureza del producto requeridos por las especificaciones establecidas para su uso, as como los valores de produccin y rendimiento especificados en el diseo del proceso.
130
EXPERIMENTAL
la inclusin de un eluyente adicional. Sirven para impulsar la disolucin de adsorcin y las de clucin necesarias para cada uno de los experimentos planificados.
Columna
Durante la experimentacin correspondiente a este estudio sc han utilizado dos tipos de columna con dimensiones diferentes. Ambas columnas, marca Amicon, modelo Moduline (Amicon Corp. Danvers, MA. EE.UU.), estn fabricadas en vidrio. Se encuentran provistas de una camisa externa que permite la termost=atizacin de la misma mediante la circulacin de un lquido refrigerante. Constan de cierres mviles en los extremos, haciendo posible la variacin de la altura del lecho, ajustndola a la cantidad de adsorbente introducido en la columna. Las dimensiones de los dos modelos de columna dc adsorcin son las siguientes:
10 16
150 250
Mdulo de anlisis
Como se ha determinado previamente, el seguimiento de la concentracin de wamilasa se lleva a cabo niediante medida de la absorbancia a 280 nm. El sistema experimental consta de una clula de flujo de 2 ml con una lmpara de mercurio conectada al monitor UV-M-II que mide y registra los datos de absorbancia a la longitud de onda mencionada.
Mdulo de pH
Otro de los detectores del sistema consiste en un medidor de pH en continuo que consta de una clula de flujo y un electrodo conectado a la unidad de medida, pH Monitor.
Co lectorde fracciones
Con objeto de recuperar determinadas fracciones del efluente, o de realizar otro tipo dc anlisis paralelos al de absorbancia en ultravioleta para el seguimiento del proceso de adsorcin (medida de la actividad, etc.), se dispone de un colector de fracciones programable, Frac-200, a la
131
Mdulo de control
Est compuesto por un controlador LCC-500 CI y un ordenador personal IBM 330 P100 (IBM Corp. Armonk, NY, EE.UU.) con el programa de control FPLC Director (Pharmacia Biotech. Uppsala, Suecia). Este mdulo controla, programa y registra todas las actividades de cada uno de los diferentes dispositivos de que consta el equipo experimental. Adems, mediante el programa de control, se registran los valores, en continuo, de caudal, pH absorbancia a 280 tun, etc, que permitirn posteriormente su tratamiento numrico en la etapa de modelado matemtico de los experimentos realizados. El equipo dispone tambin de una serie de vlvulas motorizadas (PSV-50, MV-7) que permiten dirigir el flujo de cada una de las bombas a travs de la columna en la etapa de adsorcin y desorcin, as como realizar un cortocircuito a la columna.
5.4.3.- Desarrollo de un experimento Se debern tener preparadas las disoluciones de elucin, de adsorcin y de lavado filtradas y
desgasificadas. La disolucin de elucin es la misma que el tampn en que est disuelta la a-amilasa
en la disolucin de adsorcin. La de lavado es una disolucin que facilita la desorcin de todas las sustancias que hayan podido quedar retenidas en cada uno de los sistemas estudiado: para HIC deber ser una disolucin de muy baja fuerza inica y para IIEC de mayor fuerza inica que la disolucin de adsorcin correspondiente (ver tabla 5.4).
columna y se conecta el sistema de termostatizacin a la camisa que rodea a la misma. Para conocer la
seal de absorbancia a 280 nm correspondiente a la disolucin de elucin y de adsorcin, se realiza un cortocircuito a la columna con cada una de las disoluciones mencionadas. El experimento comienza cuando se cambia la fase mvil que se alimenta al sistema, pasando
132
EXPERIMENTAL
Tabla 5.4: Composicin de las disoluciones de elucin y lavado con las cantidades utilizadas en las etapas de acondicionamiento y lavado respectivamente.
mc
Disolucin de elucin Tampn fosfato 0.05M pH 6.0 fuerza inica 0.60 Acondicionamiento 40 volmenes de lecho (90 mm)
WC
Disolucin de lavado
Agua destilada
Lavado
A continuacin se procede a llevar a cabo el experimento de desorcin mediante un procedimiento experimental anlogo pero, en este caso, la disolucin que se alimenta a la columna
saturada de adsorbato es la de elucin. La desorcin acaba cuando la absorbancia a 280 nm del efluente de la columna es igual a la que le corresponde a la disolucin de elucin.
5.4.4.- Experimentos previos Los experimentos de adsorcin en lecho fijo se han llevado a cabo en las mismas condiciones de pH y fuerza jnica que los desarrollados en tanque agitado discontinuo para cada uno de los mecanismos de adsorcin estudiados, intercambio inico e interaccin hidrofbica.
caudal
Con objeto de estudiar la influencia de la velocidad de la fase mvil en el comportamiento cintico del proceso de adsorcin, se ha seleccionado un amplio intervalo de valores de caudal. Para
133
los experimentos realizados en la columna de 10 mm de dimetro, los valores han sido 0.10
m/mm y para la columna mayor, de 16 mm de dimetro, hasta 5.00 ml/mm.
1.00
Concentracin inicial
Por motivos de comparacin de resultados, los valores de concentracin de adsorcin en lecho lijo, se han elegido en un intervalo similar al correspondiente a los experimentos de adsorcin en tanque agitado, 0.10
-
1.00 mg/mi. Para los experimentos, realizados con fines de escalado del
proceso, llevados a cabo en la columna de mayor tamao, la concentracin de wamilasa en la fase mvil fue de 2.50 mg/mI, de similar orden que la que se puede encontrar en el caldo de fermentacin del cual se obtiene a nivel industrial.
Tamao de partcula
Se ha usado la misma fraccin de tamaos de partcula que en los experimentos en tanque agitado, 0.32 0.50 mm. A diferencia de este sistema, y debido a una menor velocidad superficial del
-
fluido, en el proceso de adsorcin en lecho fijo no se ha eliminado el control a la transferencia de materia externa que ejerce la capa lmite que rodea a las partculas de adsorbente. Por esta razn, se
Temperatura
Los valores de temperatura ensayados han sido los mismos y por las mismas razones que los llevados a cabo en los experimentos de adsorcin en tanque agitado, es decir, para la adsorcin por interaccin hidrofbica sobre Duolite XAD-761, a 4, 20 y 300C y para la adsorcin por intercambio
EXPERIMENTAL
A continuacin se resumen las condiciones experimentales utilizadas en el estudio de la adsorcin de wamilasa en lecho fijo:
Tabla 5.5: Condiciones de operacin para los experimentos de adsorcin en lecho fijo.
HIC Fase mvil pH Fuerza inica Concentracin de entrada (mg/m) Caudal (m/mm) Temperatura (0C) Tamao medio de partcula (mm)
Masa
WC
7.0
0.60 0.25, 0.50, 1.00, 2.50 0.25, 0.50, 1.00, 5.00 20, 25, 30
0.26, 0.41, 0.65 0.5, 1.0, 13.0
0.25. 0.50, 1.00, 2.5 0.25, 0.50,1.00, 5.00 4, 20, 30 0.26, 0.41, 0.65
0.5,1.0
adsorbente (g)
5.5.- BIBLIOGRAFA
-
Clonis, YO.; iones. K. y Lowe. C.R. (1986). Process scaie bigh-performance liquid affinity chromatography, C/irornatogr., 363 (1), 3 1-36.
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PURIFICACIN DE
135
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PURIFICACIN DE ct-AMILASADEAspergilIus
137
6.1.1.- Planificacin de experimentos Para la consecucin de los objetivos generales del presente trabajo de investigacin, se realizar experimentacin mediante cromatografa de impulso sobre los sistemas de IEC y
mc
En primer lugar se pretende determinar la influencia que tienen las variables de operacin pH,
temperatura, fuerza inica y caudal sobre la retencin de a-amilasa en Duolite A-568 y Duolite XAD761. Para ello, se realizarn experimentos en un determinado intervalo de cada una de las variables
mencionadas de acuerdo con los resultados obtenidos en la experimentacin previa llevada a cabo (ver apartado 5.2.5). En segundo lugar, se proceder a estimar los parmetros cinticos y termodinncos mediante el anlisis de los momentos cromatogrficos en cada una de las condiciones ensayadas. Para la aplicacin de esta tcnica, es necesario contar con experimentos realizados a diferentes caudales para cada valor de pl-!, fuerza jnica y temperatura (ver anexo A, apanado A. 1).
0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 1140, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00
0.40, 0.60, 0.80, 1.00
0.01 0.10
20 7.0 0.20
0.40, 0.60, 0.80, 1.00 040,0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00
GAG
15 17 23 25 6.0 0.35
de la carga caracterstica
del sistema de IEC se deber disponer de experimentos llevados a cabo en iguales condiciones de pH,
139
temperatura y caudal para diferentes valores de la fuerza inica de la fase mvil Para cada uno de los experimentos correspondientes a impulsos de a-amilasa se ha realizado otro en iguales condiciones de operacin pero utilizando trazador como soluto. El trazador para la columna de intercambio inico ha sido disolucin de NaC 2M y para la de interaccin hidrofbica,
disolucin de NaNO3 0.25M. En las tablas 6.1 y 6.2 se muestra la planificacin de los experimentos mencionados.
Tabla 6.2: Condiciones experimentales para cromatografa de impulso de aamilasa sobre Duolite A-568.
pH Temperatura 0C] [ Fuerza lnica Caudal [ml/mm]
0.90 6.0 1.00 1.10 0.60 20 7.0 0.70 0.80 0.90 0.50 8.0 0.60 0.70 0.80 15 17 23 25 7.0 0.60
0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40,0.60,0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 GAG, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 GAG, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00
Los resultados de la cromatografa de impulso se han obtenido en forma de pico cromatogrfico que corresponde a la respuesta detectada a la salida de la columna tras un impulso de a-amilasa a la entrada de la misma. En las figuras 6.1 y 6.2 se muestran algunos picos obtenidos en diferentes condiciones de operacin para cada uno de los adsorbentes utilizados.
140
Los picos experimentales obtenidos presentan asimetra, siendo ms acusada para condiciones de operacin en las que la adsorcin es ms fuerte, aprecindose esta tendencia en todos los experimentos realizados con impulsos de a-amilasa. La asimetra de los picos en cromatografa puede deberse a la existencia de grandes volmenes muertos entre el inyector y el detector del cromatgrafo
(Johns, 1989), incluyendo la columna (huecos, empaquetamiento deficiente, etc.). Si esta fuese la causa, debera producirse para todos los solutos inyectados, independientemente de su naturaleza. Sin
embargo el efecto mencionado no se presenta en los experimentos realizados con trazador, los cuales producen picos simtricos, asemejndose con gran precisin a una distribucin gaussiana. La posible causa de la forma de los picos obtenidos para los experimentos de a-amilasa (brusca subida hasta el mximo del pico y una bajada con una tendencia lenta hasta alcanzar de nuevo la lnea de base),
puede ser debida a un equilibrio no lineal de adsorcin tanto para la resma de 1-LIC como para la de
IEC.
500
2000
Figura 6.1: Picos cromatogrficos. (1) Impulsos de a-amilasa sobre Duolite XAD-761 a 20 C, pH 6.0 y 0.60
m/mm a tres valores de fuerza inica: (A) 0.10, (B) 0.20 y (C) 0.35. (11) Impulsos de a-ainilasa sobre Duolite A568 a pH 6.0, fuerza inica 0.60 y 0.60 ml/mm a tres temperaturas: (A) 15 0C, (B) 20 0C y (C) 25 C.
(1) la
141
Ij
ye)
i{
-h
[6.1]
y,
viene determinada
V/e.
200
200
(A)
50150--
(B)
loo-Asri
j.
loo--
50--y
-v
L/V lsl
L/V lsl
Figura 6.2: Representacin grfica del primer momento frente a LP! correspondiente al trazador en: Duolite
De esta forma, de la pendiente de la grtica g frente a L/V figura 6.2 se ha calculado el valor de la porosidad externa de cada una de las dos columnas utilizadas, con lo que ambas columnas quedan caracterizadas (tabla 6.3).
0.57
0.45 L [mi Dimetro interno [m] 0.20
0.56
0.50 0.20
2.1 o-~
2.1
142
necesario conocer la variacin del tactor de retencin, k, en funcin de la concentracin salina de la fase mvil. En la figura 6.3 se representan los resultados obtenidos para dicha variacin correspondiente a los tres valores de pH estudiados. IDe acuerdo con la ecuacin 1.9, la pendiente de cada una de las rectas representa el parmetro de interaccin hidrofbica (?~) y la ordenada en el origen (ln k~) corresponde al factor de retencin extrapolado a concentracin salina nula. Los resultados se muestran en la figura 6.4 y en la tabla 6.4.
3-
o
--
-2
4---
-.4
1---~~
SS-60.1
----A
0.2
((.3
0.4
ni [aol kg~]
ncin de la
concentracin salina de [a fase mvil para tres valores de pH en el sistema u-arnilasa/Duolite XAD-76 1. Como puede observarse, al aumentar el pH la ordenada en el origen no vara
sianificativamente, disminuyendo la pendiente de frma considerable. Ella bibliografa hay muy pocos datos experimentales relacionados con la variacin de estos dos parmetros con el pH, sin embargo, para estudios realizados con lisozima se ha observado que el pH afecta a la ordenada en el origen pero no a la pendiente (Fausnaugh y Regnier. 1986). El primer parmetro, ln(k~), determina la retencin en ausencia de sal, teniendo en cuenta la interaccin neta debida a fuerzas electrostticas y de Van der Waals (Kaui et aL, 1987). Este parmetro tiene un valor muy bajo a los tres valores de pH utilizados, correspondiendo a una retencin prcticamente nula en ausencia de sal. Esta situacin en la que la retencin no es significativa se extiende hasta valores de fuerza inica de 0.1. Por otra parte. Los valores obtenidos de X indican que la adsorcin de wamilasa en Duolite XAD-76 1 depende fuertemente de la concentracin salina del medio. El parmetro de interaccin hidrotk5bica es proporcional a la superticie hidrofbica de contacto entre la protena y el adsorbente (El Rassi y Horvth. 1986) y, en el sistema estudiado, aumenta al disminuir el pH en el intervaLo
143
experimental. La disminucin del rea hidrofbica accesible podra deberse a algn cambio conformacional sufrido por la cz-amilasa al aumentar el pH. Para comprobar y explicar la causa de esta circunstancia, sera necesario realizar estudios adicionales relativos a la estructura y conformacin de la a-amilasa en diferentes medios.
.
o.
-s
~ lo
pH 6.0
-u
-5.9
pH 7.0 pH 8.0
-5.7
-5.6
1
6
pH
Figura 6.4:
poco, slo el grupo imidazol de la histidina puede encontrarse ionizado o no a valores de pH correspondientes a dicho intervalo (pK 6.0 7.0). Debido a que el punto isoelctrico de la a-amilasa
-
es 4.2, presentar carga neta negativa a valores de pH superiores a ese valor. En el intervalo experimental, a medida que el pH de la fase mvil aumenta, la carga neta tambin lo har, siendo la progresiva ionizacin de la histidina la principal contribucin a ese aumento de carga negativa. Como puede observarse, los resultados experimentales muestran (tabla 6.5 y en la figura 6.6) un ligero incremento de la carga caracterstica de unin de la a-amilasa en la resma Duolite A-568 que ira asociado, posiblemente, al incremento de carga neta experimentado por la protena a nedida que aumenta el pH del medio.
144
2.0
In<t/[NaCjI)
.8.4.
3.2
A
3.8
In(A), y carga caracterstica de la a-amitasa 4, calculados por regresin lineal a partir de los datos de la figura 6.5 de acuerdo con la ecuacin 1.10.
,
2.8 N
-r
2.6
4,
2.6
2.8 3.2
1.48
0.19 -1.14
0.999
0.982 0.988
2.2 8 7.8
pl
rl-! 8.0
145
7 y muy baja a pH 8. En todos los casos, la retencin experimentada por la protena a valores de fuerza inica cercanos a cero es prcticamente nula. El aumento de la concentracin salina en la fase
nvil, produce interacciones hidrofbicas de intensidad creciente entre la ct-anilasa y el adsorbente. Este hecho est de acuerdo con la teora de retencin de adsorbatos modulada por la concentracin de
sal (Horvth el al., 1976; Melander y Horvth, 1977; Melander et al., 1989) basada en la teora solvofbica (Sinanoglu y Abdulnur, 1965; Sinanoglu, 1982). De acuerdo con esta teora, a medida que aumenta Ja concentracin salina, los iones se solvatan, dejando menos molculas de agua disponibles para hidratar las molculas de protena, por lo que se favorecen las interacciones entre las zonas apolares de esta con los lgandos hidrofbicos del soporte. Esta situacin no ocurre en presencia de determinadas sales que favorecen la hidratacin de las protenas como son las que contienen determinados cationes bivalentes como el Mg2~, Ba2~ o Ca2~ (Arakawa y Timasheff, 1982; Szepesy y Horvth, 1988).
0
4.0 -
EJ
(A)
8
(B)
EJ
pU 6.0
E
3.0
6y
2.1.) -
44
1.0
-
y y
2A
u
y-
Y
-& y
-y
1
-y
0.1 0.2
-- A-
O
0.3 0.4
00
0.5
0.7
0.9
1.I
Fuerza jnica
Fuerza jnica
Figura 6.7: Variacin del factor de retencin con la fuerza inica para diferentes valores de pH en la resma de HIC (A) y de WC (B). Experimentos realizados a un caudal de 0.60 ml/mm y 20 0C. Se observa que la influencia de la fuerza inica sobre el intercambio inico de a-amilasa en
Duolite A-568 es opuesto al comentado para la interaccin hidrofbica (figura 6.7B). Los iones,
aniones Cf en el presente caso, actuaran como competidores de la protena, cargada negativamente, por los sitios de unin de la fase estacionaria. De acuerdo con el intercambio estequiomtrico
146
planteado por la ecuacin 1. 11, la constante del equilibrio del equilibrio vendr dada por:
[] [s] TWuL~v] 3
>j 6<
[6.2]
por lo que un aumento de la concentracin de sal en la disolucin, 5, conducir a una cantidad menor de protena adsorbida a los ligandos inicos de la matriz, lo que explicara los resultados obtenidos
para la influencia de la fuerza inica en el sistema de IEC. El efecto del pH sobre la~ ~adsorcin de ct-amilasa en 1-lIC ha sido parcialmente comentado para valores bajos de fuerza inica (figura 6.7A). El incremento del pH produce una diferencia creciente entre ste y el punto isoelctrico de la a-amilasa (pl = 4.2), aumentando la magnitud de su carga neta negativa. En estas condiciones, las interacciones electrostticas entre la enzima y la fase mvil sern mayores que las interacciones hidrofbicas entre la a-amilasa y el adsorbente, disminuyendo, por tanto, la capacidad de retencin de la fase estacionaria. Como se ha determinado anteriormente para el sistema de intercambio inico, la carga caracterstica de unin de la u-amilasa aumenta al hacerlo el pH. Este efecto no se corresponde con el aumento del factor de retencin al disminuir el valor del pH (figura 6.7B) ni con los modelos que predicen una dependencia exponencialmente creciente de k con el pH (Kopaciewicz
ci
al., 1983;
Velayudhan y Horvth, 1988). Este efecto puede ser debido a que la resma Duolite A-568 es un intercambiador aninico dbil por lo que la disminucin del pH puede resultar en un proaresivo incremento del nmero de grupos amino ionizados, aumentando la capacidad de adsorcin (Bautista et al., 1997). La temperatura tiene una iniluencia positiva importante sobre la adsorcin de wamilasa en IEC. El aumento de la temperatura favorece la retencin de la protena debido a la mayor movilidad de las especies lnicas presentes. En el caso de la adsorcin de a-amilasa en la resma hidrofbica
147
Fr71w1
a
4.5.
4
4.
3.
F
..
15
17
19
21
23
25
Temperatura [C]
adsorcin de a-ainilasa sobre el factor d retencin en los dos adsorbentes utilizados. Condiciones de operacin: pH 6.0, fuerza inica 0.35 (HIC) y pH 7.0, fuerza inica 0.60 (IEC), todos a un caudal de 0.60 ml/mm.
6.1.3.- Anlisis de momentos El anlisis y discusin de resultados mediante el mtodo de momentos se realizar en dos etapas. En la primera se determinarn los parmetros de equilibrio
(KA y
factor de capacidad) y
termodinmicos (AH0 y AS0). En la segunda etapa, con los datos del segundo momento central y los
del primer momento calculado previamente, se estimarn los parmetros cinticos del modelo de
(0L)
148
300
250
200 150
100
50
O 0 10 20 30 40 50 60
L/v [si Figura 6.9: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y 20 C a diferentes valores de fuerza inica para la resma Duolite XAD-761 (HIC).
250
200-
y
4--
150
~4~
y-
100
Ay
50
..-A
-~
o
O 10 20 30 40
50
60
L/v [si Figura 6.10: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y 20 C a
149
125 e
100
-
E
- -,
-,
75
u50
25
10
20
30
L/v [s]
40
50
60
Figura 6.11: Representacin del primer momento frente a Liv a pH 8.0 y 20 0C a diferentes valores de fuerza inica para laresma Duolite XAD-761 (HIC).
4.. e
.-- -
A20C
@25C3
-
Y.
-.
200
- -
--
-Ji
150 -
-e--
~-1
4
100-
- -
3---a
50 o
0
10
20
30
L/v [s]
40
50
60
Figura 6.12: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y fuerza jnica 0.35 a diferentes temperaturas correspondientes a la resma Duolite XAD-761 (HIC).
150
600
uoo
.1001 1 A 110
1
--
u, U
A
400
u-
-
-u
-u-.200 -
---4
--
e-A
---4
A
20
LA [s]
40
<so
Figura 6.13: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y 20 0C a diferentes valores de fuerza inica para la resma Duolite A-568 (WC).
600 ml e 400 u
-
- -
e-u
A-
200
-e.4<
y--
--
e.--
o o
-6~~
20
40
60
L/v [si Figura 6.14: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y 20 C a
151
300
200
-Ji
100
20
40
60
L/v [s] Figura 6.15: Representacin del primer momento frente a L/v a pl-l 8.0 y 20 0C a
5000
4000
3000
z
2000
1000
o
1) 20 40
60
L/v [s
Figura 6.16: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y fuerza inica 0.60 a diferentes temperaturas correspondientes a la mesina Duolite A-568 (WC).
152
A partir de la pendiente de las grficas anteriores, segn el procedimiento descrito en el apartado Al del anexo A, se determina el valor de la constante de adsorcin, KA, en las condiciones experimentales correspondientes a cada uno de los dos adsorbentes. Tambin se determina el factor de capacidad de los adsorbentes a partir de la siguiente definicin: Factor de capacidad 1
traz.
[6.3]
Los resultados se muestran en las tablas 6.6 y 6.7. Ambos parmetros se ven influidos, cualitativamente, por las condiciones de operacin en el mismo sentido que se ha observado para el factor de retencin anteriormente comentado. En este caso, el clculo de la constante de adsorcin permite cuantificar la magnitud de dichas influencias.
Tabla 6.6: Constante de adsorcin y factor de capacidad obtenidos mediante el mtodo de momentos para la adsorcin de a--amilasa en Duolite XAD-761 (HIC) para las diferentes condiciones de operacin.
[ U] pH Fuerza Jnica
KA
Factor de Capacidadt
0.10 6.0 0.20 0.30 0.35 0.02 0.10 20.0 7.0 0.20 0.30 0.40 0.20 8.0 030 0.40 15.0 25.0 6.0 6.0 0.35 0.35
0.83 3.54 8.90 8,86 0.15 0.30 1.39 3.09 5.42 0.61 0.86 1.10 6.22 7.52
0.2 0.9 2.6 2.5 0.0 0.0 0.3 0.8 1.4 0.1 0.2 0.2 12 1.8
Como puede observarse, en el caso del sistema de HIC, la fuerza inica favorece el equilibrio de adsorcin para los tres valores de pH utilizados, Por otro lado, a valores de pH creciente, la
Calculado como el valor medio de los obtenidos para los diferentes caudales ensayados en iguales condiciones de pH. temperatura y tuerza jnica.
153
capacidad de adsorcin de la resma disminuye, siendo a pH 6.0 cuando la resma presenta el valor ms alto. La influencia de la temperatura es pequea y no presenta una tendencia regular en el intervalo experimental (15 25 0C).
-
Tabla 6.7: Constante de adsorcin y factor de capacidad obtenidos mediante el mtodo de momentos para la adsorcin de a-ainilasa en Duolite A-568 (WC) para las diferentes condiciones de operacin.
[ C] pH Fuerza lnica 0.90 6.0 1.00 KA Factor de Capacidad~
21.23
18.72
5.8
5.2
0.70 0.80
0.90
0.50 8.0 0.60 0.70 0.80 15.0 17.0 25.0 7.0 7.0 7.0 0.60 0.60 0.60
Como en el caso anterior, el anlisis de momentos para la resma de IEC da unos valores de la constante de adsorcin que varan de acuerdo con lo previsto a raz del estudio de la influencia de las variables. Los valores del factor de capacidad aumentan a medida que la concentracin salina de la fase mvil disminuye, siendo mayor segn disminuye el pH. La temperatura hace aumentar mucho la constante de adsorcin a partir de valores superiores a 20 0C. En general, los mayores valores del factor de capacidad y de la constante de adsorcin se obtienen para la adsorcin de u-amilasa en la resma de intercambio inico Duolite A-568. A partir de los resultados obtenidos en esta etapa, se ha decidido realizar el estudio de la purificacin de o.amilasa en tanque agitado discontinuo y en lecho fijo. para cada uno de los adsorbentes, en las
Calculado como el valor medio de los obtenidos para los temperatura y fuerza lon,ca.
154
condiciones experimentales que se indican en la tabla 6.8. El criterio utilizado para la eleccin de esas condiciones de operacin ha sido el de contar con un valor elevado de la constante de adsorcin pero sin llegar a trabajar en condiciones de adsorcin irreversibk?. Si esto ocurriese, la retencin de aamilasa sobre el adsorbente sera mayor pero se hara menos especfica. En estas condiciones, no sera posible modular la adsorcin ni la velocidad de migracin del adsorbato en el caso de realizar la purificacin de la a-amilasa a partir de un caldo de fermentacin complejo.
Tabla 6.8: Condiciones de operacin para la purificacin de o.-amilasa en tanque agitado y lecho fijo.
Duolite XAD-761 (HIC) Tampn pH Fuerza inica Duolite A-568 (WC)
Los valores de la entalpa y entropas de adsorcin se han calculado para las condiciones de pH y fuerza jnica seleccionados (ver tabla 6.8) tanto para WC como para IEC. Mediante la aplicacin de la ecuacin de Vant Hoff (ecuacin 3.13) a los valores de constante de adsorcin en funcin de la temperatura, se obtienen AH0 y AS0. El primero de ellos representa la energa necesaria para que se produzca la adsorcin de la a-amilasa a los ligandos unidos a la matriz de la resma.
-25.2
196
103 700
Los resultados (tabla 6.9) muestran, para la adsorcin de a-amilasa, un comportamiento exotrmico en la resma hidrofbica y endotrmico en la de intercambio aninico. Ambas producen aumentos en la entropa global del proceso. Como puede comprobarse mediante la aplicacin del segundo principio de la termodinmica,
El trmino irreversible no hace referencia a su sentido estrictamente termodinrnico. Se refiere a la escala temporal en la que se realiza el experimento y el adsorhato se eluye completa y rpidamente al modificar las condiciones ce la fase mvil en el sentido adecuado.
155
en el intervalo de temperatura experimentado, la variacin de energa libre, AG0, es negativa. Esto se traduce en que, en ambos casos, el proceso de adsorcin se produce de forma espontnea.
Datos cinticos
En primer lugar se ha determinado el valor del coeficiente de dispersin axial, D~, a partir de los resultados de La altura equivalente de un plato terico, AEPT, para los experimentos realizados con trazador. Los trazadores elegidos (NaC para WC y NaNO 3 para HIC) no se adsorben sobre la resma correspondiente y, debido a su pequeo tamao, tampoco experimentan resistencia significativa por difusin a su paso a travs de los poros de las partculas de adsorbente. Por ello, el segundo trmino de la ecuacin 3.10 tendr un valor muy pequeo, simpliticndose dicha expresin a: AEPT~ 2D
y
[6.4]
De esta forma, la contribucin fundamental al valor de la AEPT vendr dada por trmino correspondiente a la dispersin axial, teniendo un valor aproximadamente constante para cada valor de la velocidad intersticial de la fase mvil. En la figura 6.17 se representan los valores de AEPT para cada una de las resinas. Se ha determinado, por tanto, el valor del coeficiente de dispersin axial en funcin de la velocidad de la fase mvil, obteniendo las siguientes expresiones: 0L~80 104v ColumnadeHlC: Columna de IEC: DL = 9.0 04 y donde DL y
y
A continuacin se procedi al clculo del segundo momento central de forma numrica segn la ecuacin 3.2. Debido a la asimetra de los picos y a la excesiva anchura de los mismos, el clculo de
& est sujeto a un error considerable, ya que el desarrollo del mtodo de momentos supone que los
picos son simtricos y en forma de distribucin gaussiana. Se aplic entonces la correccin que suponen el mtodo de los momentos con peso y el de los momentos truncados (ver apartado 3.2.2). Ambos, aunque mejoraron los resultados calculados presentan todava un elevado grado de error en el clculo del segundo momento, no ajustndose correctamente al modelo descrito. Hay que decir que la aplicacin de los dos mtodos correctores mencionados, no vara los resultados derivados del clculo del primer momento, ya que estos dependen inicamente del tiempo de retencin.
156
2. CX)
2.50
(A)
1.75--
(B)
2.25-
1.50-
<2D1. N)
u
3in
=
1.6 10u
S
=
~
2.1)9-
(2D1. A) .8 IO-3m
1.75-
.25--
1.50--
1.10-: 0.0
4.0
y.
6.0
8.0
10.0
103 [ni
s41
10~ [m s1
Figura 6.17: Valores de AEPT frente a la velocidad intersticial para la resma hidrofbica (A) y de intercambio inico (B) usando como trazador NaNO
3 y NaC respectivamente.
10.0
9.0
u
8.0
u-y
7.0
u
y
6.0
-.
1U~ [mis] Figura 6.18: Representacin de la AFFT frente a la velocidad intersticial para
la adsorcin de a-amilasa en Duojite A-568 a 20 C: (1) pI-! 7.0, fuerza inica 0.60 y (II) pH 8.0. fuerza inica 0.80. A modo de ejemplo se han presentado (figura 6.18) los resultados obtenidos de la AEPT por el mtodo de los momentos truncados para la adsorcin en la resma de intercambio inico correspondiernes a dos condiciones de operacin. La primera (1) en la que la adsorcin es elevada y otra (11) en la que la constante de adsorcin tiene el menor valor de los obtenidos experimentalmente. Se han calculado los valores del coeficiente de difusin en los poros mediante la ecuacin A.3, determinando, por regresin lineal, la pendiente ce los puntos que representan la variacin de la
157
y 0.73 para los casos 1 y II respectivamente y los valores de D0 estimados para ambos casos fueron 9.9~ io~ y 1.2. W m2/s.
AEPT con la velocidad. Los coeficientes de correlacin,
Como resumen, puede decirse que el estudio de la adsorcin mediante cromatografa lquida de alta eficacia, HPLC, es una tcnica sencilla, rpida y sensible, adecuada para conocer la iniluencia de las variables de operacin y la caracterizacin de determinados aspectos de la interaccin adsorbato-adsorbente. La aplicacin del mtodo de los momentos permite cuantificar el valor de la constante del equilibrio y conocer as su variacin con factores del medio como el pH, temperatura y fuerza inica. Esto facilita la eleccin de las condiciones de operacin para posteriores estudios de adsorcin de ct-amilasa en los adsorbentes estudiados. El clculo del coeficiente de difusin en los poros a travs de la determinacin del segundo momento central no es adecuado para experimentos en los que los picos presenten alta asimetra, aunque da una idea del orden de magnitud que puede tener este parmetro.
En este apartado se expondrn los resultados experimentales obtenidos para la determinacin de las isotermas de adsorcin a diferentes temperaturas para los adsorbentes de HIC e IEC estudiados. Posteriormente, los datos experimentales se ajustarn a las ecuaciones correspondientes a diversos tipos de sotermas que reproduzcan los resultados adecuadamente.
6.2.1.- Resultados experimentales Se han determinado las isotermas de adsorcin mediante experimentos en tanque agitado de acuerdo con el procedimiento experimental descrito en el apartado 5.3.2. En las grficas se representan las concentraciones en el equilibrio correspondientes a la a-amilasa adsorbida en la superficie de la resma (q [mg/g]) frente a la de a-amilasa en la disolucin (Qq [mg/m]). Esta ltima se determina mediante el anlisis de la absorbancia en ultravioleta a 280 tun a partir de la curva de calibrado. La concentracin superticial se calcula a travs del balance de adsorbato en el sistema (ecuacin 6.5) y est referida a la masa de resma. q= (C0 ~Ca)VL [6.5]
w
siendo C 0 la concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, VL el volumen de la misma y W la nasa de resma utilizada. 0C Las isotermas de equilibrio para el sistema a-amilasaIHIC de han determinado a 4. 20 y 30
158
y las del sistema o.-amilasa/IEC a 20, 25 y 30 0C. El volumen de disolucin utilizado, en todos los casos, ha sido de 50 m, variando la masa de resma entre 0.50 y 1.75 gen los diferentes experimentos realizados. La concentracin de cx-amilasa se midi tras 12 horas, asegurndose as que se haba alcanzado el equilibrio. Las condiciones de pH y fuerza inica. para los experimentos realizados con la resma de HIC han sido 6.0 y 0.35 respectivamente y en los llevados a cabo con la de WC se utiliz un pH de 7.0 y una fuerza inica de 0.60, de acuerdo con lo expuesto en el apartado 5.3.1. ncrementarse la temperatura.
25
remperalur. O 4.0C
20.0 ~C
20
3
o
A
o
A
5
o
A A A
E lo
o
A ~
5
O
A
~
A A
o
o
.3
3
al
[mgmF!
temperaturas. Los resultados experimentales se muestran en las figuras 6.19 y 6.20 para Ja adsorcin sobre La resma de interaccin bidrofbica y de intercambio inico respectivamente. En todos los casos se observa un comportamiento no lineal del equilibrio de adsorcin para cada una de las temperaturas ensayadas en ambas resinas. La curvas resultantes presentan una pendiente decreciente al aumentar la concentracin en la fase lquida siendo, por tanto, cncavas y clasiticndose como isotermas favorables para la adsorcin (figura 2.3). Como se ha observado mediante la experimentacin en HPLC, se comprueba que la capacidad de adsorcin aunena al disminuir la temperatura para la adsorcin de o.-amilasa sobre Duolite XAD76 1 (resma de 1-lIC), es decir, la curva correspondiente a una temperatura menor se encuentra por encima de otra cuya temperatura sea menor. En el caso de la adsorcin en la resma de IEC, Duolite A-
ADSORCIN
159
35
30
a
o
25
a
o
20
o
15
A
o
10-
5 o
o
C
eq
[mgm1-
temperaturas. Comparando las isotermas obtenidas para ambas resinas (figura 6.21) en las condiciones de temperatura en las que Ja adsorcin se ve ms favorecida, se observa que la resma de WC tiene mayor capacidad de adsorcin que la de HJC en el intervalo de temperaturas estudiado ya que la concentracion de a-amilasa en la fase adsorbida en el equilibrio es siempre ms alta para la primera resma.
160
40-
[~E~4c71
~~30C) a a
30
- -
? 20--
a
A
A
10 a
00
C
tq
[mgn*J
Figura 6.21: Isotermas de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite XAD761 a 4 0C y sobre Duolite A-568 a 30 C.
6.2.2.- Ajuste de los resultados a modelos de isotermas Una vez obtenidos los datos experimentales del equilibrio de adsorcin de a-amilasa en cada uno de los adsorbentes para cada temperatura, se ha procedido a ajustarlos a algunas de las ecuaciones de isotermas comentadas en el apartado 2.3.3. Las isotermas de Langmuir y Freundlich (ecuaciones 2.13 y 2.14 respectivamente) son habitualnente utilizadas para describir el comportamiento no lineal del equilibrio de adsorcin de un slo componente. El ajuste de los datos experimentales a cada una de las expresiones se ha llevado a cabo mediante regresin no lineal utilizando el algoritmo de Marquardt. A continuacin se muestran los resultados obtenidos del anlisis de regresin, con los parmetros estadsticos caractersticos, para todas las isotermas determinadas. Los ajustes se han realizado tornando un intervalo de confianza del 95%. Se incluyen como indicadores de la bondad del ajuste, el error medio de los parmetros estimados, el coeficiente de correlacin. r, y el test chicuadrado,
x2
En las tablas 6.10 a 6.15 se resumen dichos parmetros y en las figuras 6.22 a 6.27 se
representan grficamente las curvas correspondientes al ajuste a las isotermas de Freundlich y Langmuir con los parmetros obtenidos. En el anexo B se muestra un estudio ms detallado del ajuste, incluyendo el anlisis de residuos.
161
Error 1.98
xl
Langmuir
28.78
0.9962
0.5064
b = 0.544 Freundlich
= =
9.68
0.530
25
20
15
E lo
.3
[mg~m]
Figura 6.22: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y Freundlicb para la adsorcin de r-amilasa en Duolite XA.D-76 1 a 4 0C.
162
Tabla 6.11: Parmetros de ajuste dc la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite XAD-76 1 a 20 0C. Isoterma Parmetros
q ~, = 26.35
Error
Langmuir
1.00
+
0.9979
0. 1563
0.554
Freundlich
Kf = 9.28
=
0.46
+
0.513
0.038
25
20
15
St
E 10
o 0
1
.3
-<
C e q [mg-mF1 Figura 6.23: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y
163
Tabla 6.12: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 30 0C.
Isoterma Parmetros
=
Error
1.35 +
2
0. 1096
Langmuir b Freundlich 3
24.09
0.398
0.9987
0.045
0.9927
6.51
0.45 0.056
0.6254
0.602
25
20
15 SL eL
E lo
o
0 1 2 3 4
eq
[mgmI-]
164
Tabla 6.13: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de u-amilasa en Duolite A-568 a 20 0C. Isoterma Parmetros
=
Error 2.64
0.084
Langmuir
45.46
0.9923
1.4690
0.28 0.019
0.9953
0.9096
3 = 0.532
40
30
SL,o
eL
10
o
o
-3
ec
[mgmL]
165
Tabla 6.14: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C.
Isoterma Parmetros
=
Error
Langmuir
45.40
1.49
+
0.9988
0.37 10
b = 0.840
Freundlich
Kf= 19.19
0.56
+
3 = 0.539
0.035
40
30
SL 20
eL
lo
o
(1 1 2 3
C eq
1] [mgmF
166
Tabla 6.15: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite A-568 a 30 C. Isoterma Parmetros
q 01
Error
Langmuir
0,9988
0,9947
3 = 0.530
0.028
40
30
SL20
eL
E LO
O 0
eq
jugmnI1l
Figura 6.27: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas 0C. de Langmuir y
167
En base a los resultados del anlisis de regresin realizado, se observa que los valores de r y son mejores para el ajuste de los datos experimentales a la ecuacin de Langmuir excepto en el caso de la isoterma de adsorcin de a-amilasa sobre la resma de WC realizada a 20 0C para el que el ajuste a la ecuacin de Freundlich es ligeramente mejor considerando el intervalo completo de experimentacin. A partir del anlisis de residuos (ver anexo B) de los ajustes se han confirmado errores elevados (>10%) de forma sistemtica para los valores de q calculados mediante la isoterma de Langmuir correspondientes a concentraciones menores de 0.20 mg/mi en el caso de ambos adsorbentes. Para concentraciones de ct-amilasa inferiores a la comentada, la isoterma de Langmuir predice resultados considerablemente inferiores a los obtenidos experimentalmente, situndose la mayora de los puntos correspondientes a estos valores en el intervalo de error de -15 a -30%, debido a que para concentraciones bajas, el comportamiento de la isotenna puede considerarse lineal. Para valores de concentracin superiores al indicado, los residuos se distribuyen sin apreciarse tendencia alguna y se sitan en el entorno de error de 5%. En todos los casos, en el ajuste de los datos experimentales a la isoterma de Freundlich, se observa cierta tendencia en el anlisis de los residuos (ve anexo B). Para valores de concentracin baja, la utilizacin de la ecuacin de ajuste de Freundlich produce errores, por exceso, muy elevados (hasta del 40%) por la tendencia lineal que presenta la isoterma a valores bajos de concentracin. En el intervalo de concentraciones de 1 a 3 mg/mi, aproximadamente, los, residuos correspondientes a este ajuste se sitan en valores negativos, para pasar a magnitudes positivas y en rpido aumento para concentraciones superiores. Esto ltimo se debe a que la expresin de la isoterma de Freundlich no predice la saturacin del adsorbente, comportndose de forma montonamente creciente. Como resumen, pueden realizarse los siguientes comentarios: Se han obtenido experimentalmente las isotermas de adsorcin de a-ainilasa sobre las resinas de HIC e IEC a diferentes temperaturas. Se observa un comportamiento no lineal en todos los casos estudiados y que, en el intervalo experimental de temperatura, la resma de intercambio inico, Duolite A-568. tiene una capacidad de adsorcin mayor que la de interaccin hidrofbica, Duolite XAD-761. Esta circunstancia no invalida ni reduce, en absoluto, la utilidad de esta ltima ya que al operar ambas en condiciones diferentes de fuerza inica y temperatura, podrn ser adecuadas en determinadas etapas del proceso de purificacin, en funcin de la composicin y caractersticas del medio. Por ejemplo, el uso de una etapa de purificacin por HIC podra ser aconsejada en situaciones en las que la protena est en un medio de alta concentracin salina y esta quiera reducirse, ya que la adsorcin en HIC se ve favorecida a alta fuerza inica y la elucin del adsorbato se produce con medios en los que la concentracin salina es pequea.
168
Por otro lado se han ajustado los datos experimentales de las isotermas de adsorcin a las ecuaciones de Langmuir y Freundlich determinando los parmetros de regresin no lineal. Se ha comprobado que el uso de la ecuacin de Langmuir reproduce, con errores inferiores al 5%, los resultados experimentales para valores de concentracin en la fase lquida mayores de 0.2 mg/ml. El ajuste a la ecuacin de Freundiich genera errores sistemticos que no la hacen apropiada para el sistema experimental estudiado. Como solucin a este ltimo problema se propone realizar un ajuste lineal a bajas concentraciones para ser utilizado en los casos en los que se necesite predecir la cantidad adsorbida en el equilibrio con concentraciones inferiores a 0.2 mg/ml. Los valores de la constante de adsorcin para la isoterma lineal con validez en el intervalo de concentraciones se presentan en el anexo B.
6.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO En el presente apartado se exponen los resultados obtenidos en los experimentos cinticos de adsorcin de o.-arnilasa sobre las resma de HIC y de WC en un sistema de tanque agitado discontinuo. Estos resultados se utilizarn posteriormente para obtener los valores del coeficiente de difusin en los poros para cada uno de los experimentos, mediante el ajuste de los datos experimentales al modelo matemtico propuesto para dicho sistema.
6.3.1.- Planificacin de experimentos Mediante la realizacin de experimentos de adsorcin en un sistema de tanque agitado en operacin discontinua se pretende obtener el valor del coeficiente de difusin efectivo en los poros, D13. para cada una de las condiciones de operacin ensayadas con los adsorbentes de HIC e IEC estudiados en el presente trabajo. Dicho parmetro se determinar mediante el ajuste y optimacin de los datos cinticos experimentales al modelo de adsorcin propuesto para este sistema (ver apartado 3.3.2). De esta manera, se estudiar la influencia de las variables de operacin sobre el valor de D~. Las condiciones generales de experimentacin (pH, fuerza inica, masa de resma, volumen de disolucin. tamao de partcula y velocidad de agitacin) son las mostradas en la tabla 5.2. A continuacin (tablas 6.16 y 6.17) se expone la planificacin de experimentos para cada resma en funcin de las variables cuya influencia se va a estudiar: temperatura y concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, C~.
PURIFICACIN DE
a-AMWsA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN Tabla 6.16: Experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre resma de HIC realizados en tanque agitado discontinuo.
Temperatura [0C] C~ [mg/mi]
169
0.10 4.0
0.25
0.50
Tabla 6.17: Experimentos de adsorcin de o.-amilasa sobre resma de IEC realizados en tanque agitado discontinuo.
Temperatura [OCI C 0 [mg/mi]
0.10 20.0
0.25
1.00
6.3.2.- Resultados Se ha medido, de forma continua, la evo[cin de la concentracin de a-amilasa en la disolucin de adsorcin en cada uno de los experimentos. Los resultados se muestran en forma grfica representando la concentracin adimensional, C/C0, frente al tiempo. Como se ha verificado anteriormente, el efecto de la temperatura sobre la adsorcin de a-
170
amilasa en las resinas de HIC e WC estudiadas es opuesto. Como se observa en la figura 6.28 y en la tabla 6.18, la disminucin de la temperatura aumenta la cantidad de a-arnilasa adsorbida sobre la resma de HIC, ya que la curva experimental correspondiente a 4 0C est por debajo de la de 20 0C, quedando por encima de estas la curva de mayor temperatura, 30 0C (esto es as debido a que el resto de las variables de operacin son comunes a los tres experimentos).
1.00
0.95
u u
0.90
0.85
0 50 100 150 200 250
Tiempo [mini
761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.50 mg/ml. Para la resma de WC, la adsorcin de la enzima est favorecida por el aumento de la temperatura (figura 6.29 y tabla 6.20), mostrndose de esta manera en todo el intervalo experimental de concentraciones. En cl apartado Cl (anexo C) se representan el resto de los resultados experimentales en los que se compara el efecto de la temperatura en la cintica de adsorcin correspondientes a otras concentraciones iniciales para la resma de HIC (figuras C.l y 2) y para la de WC (figuras C.3 y C.4). El tiempo al que se alcanza el equilibrio es menor para los experimentos realizados a lemperaturas ms elevadas, debido a una mayor velocidad de transferencia de materia, lavorecida por temperaturas crecientes. Este efecto es comn a los dos adsorbentes en todo el intervalo experimental.
171
1.00
0.95
090
0.85
0.80
0
50
lOO
150
Tiempo [mm]
200
250
diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 1.00 mg/ml. La concentracin inicial de adsorbato tambin intluye significativamente en las curvas cinticas de adsorcin. En este caso, el comportamiento de las dos resinas es, cualitativamente, anlono (figuras 6.30 y 6.31). Al disminuir la concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, el nivel de desaparicin de adsorbato en el seno de dicha disolucin es mayor (tablas 6.19 y 6.21), es decir, el valor final que alcanza la concentracin adimensional es menor. Sin embargo, la capacidad de la resma por unidad de masa aumenta para concentraciones iniciales crecientes, de acuerdo con lo predicho por la isoterma de equilibrio. Las figuras C.5 a C.8 (anexo C) muestran el resto de los resultados experimentales en los que se compara el efecto de la concentracin inicial en la adsorcin de u-amilasa sobre las dos resinas estudiadas. La utilizacin del proceso de adsorcin en condiciones de alta dilucin, a pesar de aprovechar slamente una pequea fraccin de la capacidad total de la resma, podra tener inters en la eliminacin de determinados contaminantes que se encuentren en concentraciones muy bajas. De esta manera, se podra reducir el nivel de dichos contaminantes hasta los mrgenes tolerados por las especificaciones legales, tcnicas o comerciales.
172
1.0
0.9
0.8
0.7
Tiempo [mini Figura 6.30: Comparacin de la cintica de adsorcin de ~-amilasaen Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 4 C.
[.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
100
200
300
400
500
600
Tiempo [mini
173
Tambin puede observarse que el equilibrio se alcanza antes en los experimentos en los que la concentracin inicial de a-amilasa es ms elevada. El flujo que atraviesa la capa lmite externa que rodea a las partculas es directamente proporcional a la diferencia de concentracin de a-amilasa entre los extremos de dicha pelcula (ecuacin 2.1), aunque los experimentos realizados en el presente trabajo se han diseado de forma que la velocidad de transferencia de materia externa no controle la velocidad global del proceso. Sin embargo, el flujo por difusin en el interior de los poros viene descrito por una expresin basada en la ley de Fick, siendo el gradiente radial de concentracin la fuerza impulsora que rige el flujo (ecuacin 2.8), el cual es mayor en el caso de que la concentracin tambin lo sea. A modo comparativo, en las tablas 6.18 y 6.19 se muestran los resultados para la resma de
1-LIC de la cantidad de ct-amilasa adsorbida por unidad de masa de adsorbente y de la fraccin de a-
amilasa eliminado de la disolucin, C4Co, respectivamente y en las tablas 6.20 y 6.21 las correspondientes para la resma de WC. Tabla 6.19: Fraccin de a-amilasa eliminada de la disolucin de adsorcin con la resma de HIC.
Co [mg/mi] 0.50
0.25
0.50
2.87
2fl9 1.70
3.81
3.28 3.01
5.81
5.11 3.15
0.71 0.79
0.83
0.84 0.86
0.87
0.88 0.89
0.93
Fabla 6.20: Cntidad de a-aruilasa adsorbida por unidad de masa de adsorbente con la resma de IEC.
Co [mg/mi] 0.10 20.0 0C 25.0 0C 30.0 OC 0.25 1.00
Tabla 6.21: Fraccin de a-amilasa eliminada de la disolucin de adsorcin con la resma de IIEC.
C 0 [mg/mi] 0.10 0.25 1.00 0.90
20.0 0C
3.82
4.35 4.62
6.56
6.99
7.24
25.0
0C
0.56 0.53
0.61
0.73
0.72 0.71
0.89 0.85
30.0 0c
174
Tabla 6.22: Experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite XAD-761 en lecho fijo (dimetro interno de la columna: 10.0 mm).
T [tI C~ [ng/m] Caudal [ml/mini 0.25 R [mm] W [g] L [mml
0.50
20.0
1.00
0.50
1.00
0.25
41.0
1.00
25.5
2.50
4.0 30.0
20.0
26.0
65.0
20.0 20.0
0.50
26.0
Uno de los objetivos del presente trabajo de investigacin es la determinacin de la inluencia de las diferentes variables de operacin (temperatura, concentracin de entrada y caudal) y
175
caractersticas fsicas de cada sistema experimental (radio medio de partcula, masa de adsorbente y longitud de lecho) en el proceso de adsorcin as como, posteriormente, en los parmetros cinticos de transferencia de materia que caracterizan la adsorcin de la a-amilasa en un lecho fijo. Con este fin, se han realizado los experimentos que se muestran en las tablas 6.22 y 6.23 para las resinas de HIC e IEC respectivamente.
Tabla 6.23: Experimentos de adsorcin de ui-amilasa sobre Duolite A-568 en lecho fijo (dimetro interno de la columna: 10.0 mm). T [OC] C0 [mg/m] Caudal [ml/mm] 0.25 0.50 0.50 1.00 0.25 25.0 1.00 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 20.0 30.0 25.0 25.0 25.0 0.50 0.50 1.00 1.00 1.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 26.0 65.0 26.0 1.00 1.00 0.50 32.0 30.0 19.0 41.0 1.00 31.0 R [mm] W [g] L [mmj
Adems, se ha estudiado [a estabilidad de los dos adsorbentes para conocer la prdida de capacidad de cada uno de ellos debida a la reutilizacin de la columna. Para ello se realizaron ciclos de adsorcin-desorcin en las condiciones de operacin que se detallan en la tabla 6.24.
1.76
Tabla 6.24: Condiciones de operacin de los ciclos de adsorcin-desorcin. [ OC] Duolite XAD-761 DnoliteA-568 20.0 25.0 C~ [mg/mi] 1.00 1.00 Caudal [ml/mm] 0.50 0.50 [ mm] 41.0 41.0 [ g] 1.00 1.00 [ mm] 25.5 31.0
(Q) y
del volumen de la
Los experimentos muestran unas curvas de ruptura cori la forma sigmoidal tpica de los procesos de adsorcin, en los que transcurrido un tiempo determinado, sucede la ruptura, aumentando la concentracin de u-amilasa en el elluente de la columna. A tiempos suficientemente elevados, la columna alcanza la saturacin y la concentracin a la salida de la misma se iguala a la concentracin de alimentacin a la entrada del lecho. La forma de dichas curvas esta determinada por una combinacin compleja de mecanismos correspondientes a procesos de equilibrio y de no equilibrio (Johnston et al., 1991). Una vez alcanzada la saturacin, la cantidad de a-amilasa adsorbida en la superficie interna de la resma viene dada por el siguiente balance de materia: q.WQ.C}.J[1(C/CO)].dtCO.VL.[E+E0.(lE)]
o
[6.7]
donde el valor de la integral corresponde al rea que hay por encima de la curva de ruptura y corresponde a la definicin del momento cero (go) de la misma (Martnez et al., 1991). As, la capacidad de la resma es proporcional al producto del momento cero, el caudal y la concentracin de entrada. Por ello definimos el factor de capacidad como:
177
F.C.
~.t0
.
[6.8]
Los valores del factor de capacidad calculados para los experimentos de adsorcin en las resinas de interaccin hidrofbica e intercambio iitco se muestran en las tablas 6.25 y 6.26 respectivamente.
Tabla 6.25: Factores de capacidad para los experimentos en lecho fijo con la resma de HIC. C0 [mg/mi] 0.5
0.5 0.5
Q [ml/mm]
0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.0 0.25 0.50 1.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
T [OC] 20 20 20 20 20 20 20 20 20 3 30 20 20 20
L [mm]
25.5
dp [mm] 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.65 0.26 0.41
F.C. [mg]
25.5
25.5
25.5 25.5
178
Tabla 6.26: Factores de capacidad para los experimentos en lecho fijo con la resma de IEC,
C0 [mg/inI] 0.5
0.5
Q [nl/minI 0.25
0.50
0C1 T[ 25
25
L [mm] 31.0
31.0
dp [mm] 0.41
0,41
25 25 25 25
25
25 25 20 30 25 25 20
Efecto del caudal De acuerdo con los resultados experimentales obtenidos (figuras 6.32 y 6.33), se observa que la pendiente de las curvas experimentales, tras la ruptura del lecho, es mayor a medida que aumenta el caudal de alimentacin a la columna. En el caso de la adsorcin de a-antilasa sobre la resma de WC, esta situacin se presenta ms acusada que en el caso de la adsorcin sobre la resma de HIC. Debido a
-r r...-. ..~x.,:
1
~ -. ~
nr
ir
flor,
tic
tU
que el vuiuiwu tic ia~e uuvu llcUcMuta fa oaum U IULIItJ n1nn~ a utilizados, a igualdad del resto de las condiciones de operacin, el tiempo de saturacin de la columna disminuye al aumentar el caudal. De esta forma, para cada valor de la concentracin de entrada, el factor de capacidad disminuye segn aumenta cl caudal (tablas 6.25 y 6.26). Este fenmeno puede deberse a que la cintica de adsorcin est controlada por los procesos de difusin de la a-amilasa desde el seno de la fase mvil hasta el interior de las partculas. En esta situacin, la utilizacin de caudales crecientes puede conducir a que, en una seccin transversal de la colunna. no todas las molculas de adsorbato tengan el tiempo de residencia suficiente como para permitir que se difundan hacia el interior de las (ti ir 1cnrh~n1 ti ji ini, v~ncin 1 a trw a y la ca nac-i dad del nrr3cesn de. adsorcin. fJWL1Ltutac~ wu, ~
iC t~UtttOflI)~.~ItU ~
PURIFICACIN DE 0I-AMILASADEASpergII/US
179
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
1.0
3.0
7.0
8.0
Figura 6.32: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para una concentracin de entrada de 1.00 mg/ml a 20.0 C.
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0 2 4 6 8 10 24 26
Volmenes de lecho
Figura 6.33: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para una concentracin de entrada de 1.00 mg/ml a 25.0 0C.
180
Los dos comportamientos comentados (mayor capacidad a caudales bajos y menor tiempo necesario para la adsorcin a caudales altos) debern tenerse en cuenta a la hora de la optimacin del proceso con el fin de elegir el caudal ms adecuado para el sistema utilizado. Para ello se debern considerar los costes de operacin derivados del tiempo consumido por el proceso, el valor del producto purificado as como la estabilidad en funcin del tiempo que presente la enzima en las condiciones en las que se lleve a cabo la purificacin
Efecto de la concentracin
Como puede observarse en las figuras 6.34 y 6.35, el aumento de la concentracin de aamilasa en la disolucin de alimentacin a la columna afecta a la forma de las curvas de ruptura experimentales. Para ambos adsorbentes, se comprueba que las curvas correspondientes a los experimentos de mayor concentracin tienen una pendiente ms acusada, alcanzando la saturacin del lecho a tiempos inferiores que los correspondientes a experimentos de concentracin interior.
t,0
0.8
0.6 u u 0.4
0.2
0.0
0-o
1.0
2.0
3.0
9.0
10.0
Volmenes de echo Figura 6.34: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de fflC para un caudal de 0.50 m/mm a 20.0 C.
Estos efectos, relacionados entre si se deben a que la diferencia entre la concentracin de aamilasa en la fase mvil y la concentracin de dicha enzima en el interior de los poros no saturados es mayor cuanto mayor sea la primera. Esto produce un aumento en el flujo de a-amilasa en direccin al interior de los poros de las partculas de adsorbente hasta ms sitios de adsorcin, alcanzndose ms
181
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
24.0 26.0
Volmenes de lecho Figura 6.35: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columin de WC para un caudal de 0.50 mi/mm a 25.0 0C. Se ha determinado que, para cada uno de los adsorbentes, el factor de capacidad aumenta (tablas 6.25 y 6.26) a medida que lo hace la concentracin a la entrada de la columna. De acuerdo con la isoterma de adsorcin, en el equilibrio, la cantidad de -amilasa retenida en la resma aumenta (hasta alcanzar el valor de saturacin) con la concentracin de la enzima en la fase fluida del interior de los poros.
Efecto de la temperatura
La influencia de la temperatura en el equilibrio de adsorcin de cz-amilasa en las resinas de
HIC e IEC se ha establecido mediante la determinacin de las isotermas de adsorcin. Segn estas,
para la resma de intercambio inico, la cantidad de a-ainilasa adsorbida en equilibrio con una determinada concentracin de la misma en la fase fluida aumenta con la temperatura. Esta situacin se corresponde con los resultados experimentales obtenidos a diferentes temperaturas para la resma de
IEC (figura 6.36) donde el factor de capacidad (tabla 6.26) aumenta con la temperatura.
182
1.0
0.5
0.6
0 O
0.4
0.2
0.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
24.0 26.0
Volmenes de lecho
columnade WC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 0.50 mg/ml a 25.0 0C.
1.0
0.5
0.6
o
O O
0.4
0.2
0.0
0.0
1.0
3.0
6.0
7.0
Figura 6.37: Efecto de la temperatura sohre las curvas de ruptura correspondientes a la columna dc HIC para un caudal de 0.50 nl/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a 20.0 C.
183
En el caso del equilibrio de adsorcin de ct-amilasa sobre la resma de HIC, la temperatura tiene el efecto contrario, es decir, la cantidad de enzima adsorbida aumenta al disminuir la temperatura. A partir de los experimentos correspondientes a diferentes temperaturas (figura 6.37), se determina el factor de capacidad (tabla 6.25) para cada uno de ellos, observando que el mayor valor se obtiene para el experimento desarrollado a una temperatura mayor. Esto se debe a la existencia de efectos negativos para la cintica de adsorcin a medida que la temperatura disminuye. Al reducir la temperatura, la viscosidad de la fase mvil aumenta, por lo que el coeficiente de transferencia de materia externo disminuye (Wilson y Ceankoplis, 1966), reducindose el flujo de c-amilasa que pasa al interior de las partculas de adsorbente a travs de la capa lmite externa que rodea a las mismas. Por otro lado, el coeficiente de difusividad molecular, definido por la ecuacin de Polson (ecuacin 2.4), es directamente proporcional a la temperatura e inversamente proporcional a la viscosidad de la fase fluida, lo cual conduce a valores decrecientes de D,~ al disminuir la temperatura.
A.
de poro para la ambas resinas, obteniendo los valores que se muestran en la tabla 6.27.
184
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
23.0 24.0
Volmenes de lecho
Figura 6.38: Efecto del tamao de partcula sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a 20.0 C.
LO
1,
Ir
0.8
0.6
e
0.4
0.2
Tamao de partcula
h
0.0
o-o
6 mm 0.65 mo rl,
1~
.
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
22.0 24.0
Volmenes de lecho
Figura 6.39: Efecto del tamaflo de partcula sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 0.10 m/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a25.0C.
185
Estos valores, relativamente elevados, aumentan en gran medida para la fraccin significativa de poros cuyo dimetro es inferior al tamao medio determinado (ver apartado 4.4.2) para cada uno de los adsorbentes. Por ello, las molculas de c-amilasa que queden adsorbidas en las zonas de un poro ms cercanas al exterior, podrn bloquear el paso, de forma que en el caso de utilizar tamaos de partcula mayor, el volumen de poro inaccesible ser tambin mayor debido a que la longitud de los poros tambin lo es.
Tabla 6.27: Relacin entre el tamao de la a-amilasa ~ y el tamao medio de poro (~).
4~ [nml
fflC WC 23.0 28.5
tN.aI4~ptt
0.15 - 0.35 0.12 - 0.28
Efecto de la altura de lecho En los dos sistemas de adsorcin estudiados, a medida que la longitud de lecho disminuye, la pendiente de la curva de ruptura aumenta ligeramente, saturndose antes el lecho. En la figura 6.40 se muestra la influencia de la altura de lecho en la adsorcin de wamilasa en resma de intercambio inieo para columnas de igual dimetro interno y tamao de partcula. Este efecto est causado porque las pequeas irregularidades existentes en el
empaquetamiento de ambas resinas, suman una mayor cantidad en la columna de mayor longitud, aumentando el efecto de mezcla y desvindose ms del flujo pistn ideal. Por ello, la curva de ruptura correspondiente al lecho de mayor longitud se ensancha, aumentando el tiempo total de saturacin y disminuyendo la capacidad de la resma en el punto de ruptura (Johnston eta!., 1991). Sin embargo, el factor de capacidad por unidad de masa de resma en el equilibrio es similar para ambas columnas (tablas 6.25 y 6.26), no alterndose el equilibrio por la variacin de la longitud de la columna.
186
1.0
0.8
0.6 Q Q
e
0.4
0.2
0.0
10
20
30
Tiempo [mm]
40
50
110
120
Figura 6.40: Efecto de la longitud de lecho sobre las curvas de ruptura correspondientes a la
columna de IEC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 0.50 mg/ml a 20.0 C.
Generalmente, en los procesos de purificacin a escala industrial se cuenta con dos o ms columnas operando en paralelo. De esta manera, una de las columnas se encontrar en operacin de adsorcin hasta que el adsorbente haya alcanzado el nivel de saturacin fijado como ptimo. En ese momento, la corriente de entrada pasa a alimentar a la otra columna, comenzando en la primera la operacin de desorcin para recoger la protena purificada. Con el objetivo de conocer el comportamiento a largo plazo de cada uno de los adsorbentes, se han realizado ciclos de adsorcindesorcin simulando el comportamiento real de una operacin continuada. Posteriormente, se ha evaluado el factor de capacidad para cada uno de los ciclos con el fin de cuantificar la variacin de la cantidad adsorbida en cada uno de ellos. Las condiciones de operacin de los experimentos realizados se muestran en la tabla 6.23. En las figuras 6.41 y 6.42 se representan las curvas de adsorcin y desorcin para las columnas de 1-lIC e IEC respectivamente. En la etapa de desorcin se ha utilizado como eluyente el tampn usado en la disolucin de adsorcin correspondiente.
187
1.0
II
It
0.8 .
(2 (2 (2(2 2
~ 1 1
(4
0.6
e
1~) O 0.4
1
3
fi
0.2 -
0.0
0123456789
.1.1.1.1.1 i
.11 lA
3 1
4041424344454647484950
Ciclo
Figura 6.41: Ciclos de adsorcin-desorcin realizados con la resma de HIC en las siguientes condiciones de operacin: C0 = 1.0 mg/mI, Q = 0.50 ml/mm, T = 20 0C.
1.0
0.8
0.6
o
0 O 0.4
0.2
0.0
o
Ciclo
0C.
En ambos casos, la cantidad retenida en el primer ciclo es mayor que en los sucesivos ciclos
188
debido a que se parte de una columna estabilizada y con ausencia de wamilasa adsorbida a su superficie. La operacin de adsorcin-desorcin se ha programado de forma que los ciclos tengan la misma duracin, alcanzando niveles de saturacin de u-amilasa del 90-95% en la adsorcin y disminuyendo al 3-5% en la desorcin. A partir del segundo ciclo se observa que las curvas obtenidas coinciden con bastante fidelidad. Para cuantificar la semejanza y el comportamiento de ambas columnas se ha calculado el factor de capacidad para cada una de las etapas de adsorcin. Los valores calculados no muestran tendencia a disminuir (o aumentar) con el tiempo de operacin y el uso, variando entorno al valor medio con una desviacin estndar relativamente baja (tabla 6.28). La utilizacin de las mismas condiciones de pH y fuerza inica en las etapas de adsorcin y desorcin ha mostrado un comportamiento reversible del proceso. La eficacia de la desorcin, sin embargo, aumenta cuando se modifican las condiciones de operacin (por ejemplo, aumento de la fuerza inica en IEC o disminucin en HIC) como se ha demostrado en el presente trabajo.
Tabla 6.28: Valor medio del factor de capacidad y desviacin estndar para los ciclos de adsorcindesorcin.
F.C. lIC WC 0.98 1.82 a 0.08 0.14
A partir de estos resultados puede concluirse que ambos adsorbentes son adecuados para ser utilizados a escala industrial por la estabilidad que presentan y por la reversibilidad mostrada tras la aplicacin de numerosos ciclos de operacin sin que las columnas presenten sntomas de prdida parcial de capacidad para la adsorcin de wamilasa en las condiciones de operacin estudiadas.
6.5.- BIBLIOGRAFA
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191
7. MODELADO MATEMTICO
Una vez que se han obtenido experimentalmente las curvas cinticas de adsorcin, correspondientes a los sistemas wanilasa/HIC y a-amilasa/IEC, los datos de aquella se ajustan al modelo matemtico propuesto en el apartado 3.3.2. Los resultados del ajuste para cada uno de los experimentos se muestran en las tablas 7.1 y 7.2, en las que se incluyen, junto con las variables de operacin, los valores del coeficiente de difusin en los poros (De), del factor de tortuosidad (t) calculado mediante la ecuacin 2.7 y de la funcin objetivo utilizada en la optimacin del ajuste (Q) y descrita en la ecuacin A. 16 del anexo A. A la vista de los resultados, se observa que la temperatura influye en el valor de D0, aumentando para valores crecientes de aquella, para el caso de ambos adsorbentes, de acuerdo con lo previsto por la teora de Stokes.Einstein para la difusin molecular (lvarez et al., 1982). Por otra parte, se observa que existe variabilidad en los valores de D0 calculados para cada concentracin inicial a una temperatura determinada. Esta es mayor en el caso de la adsorcin sobre la
192
MODELADO MATEMTICO
resma de IEC. Los valores del coeficiente de difusin en los poros correspondientes a la concentracin inferior (0.10 ng/m) se alejan de los obtenidos para las otras dos concentraciones. Esto puede ser debido al error en la estimacin de la isoterma de adsorcin a bajas concentraciones, segn se ha comentado en el apartado 6.3.2. Tabla 7.1: Resultados del modelado matemtico de la adsorcin de a-amilasa en la resma de HIC (Duolite XAD-761) en tanque agitado discontinuo. T [0C] 4
C 0 [mg/m] 0.10 2/s] Dp [m 2.32~ 10
t
1.9
3.0
2.72 io-3
1.29
0.25
0.5<)
1.50 . 10.11
1.32 10
itt
3.4
1.29
0.10
20 0,25
3.72 10<
1.76 10<
2.0
4.2
l.22~ 0<~
315 .
l0~
0.50
1.52 10<
4.8
3.85
jo5
04
30
0.25 0.50
4.4 4.5
1.21
[.24 t
labIa 7.2: Resultados del modelado matemtico de la adsorcin de ~-amilasaen la resma de FC (Duolite A-
-r [0C]
20
Co [mg/m]
0.10 0.25 1.00 0.10
Dp [m2/s]
<D
5.20 10
2.21 .
10<
25
0.25
10<
10.11
Para todas las temperaturas estudiadas, la diftsividad de la cx-amilasa en la resma de IEC es nayor que en la resma hidrotbbica. Este hecho podra explicarse en trminos de las caractersticas porosas de ambos adsorbentes. El tamao medio de poro en las partculas de la resma de intercambio
193
inico (28.5 nm) es mayor que el de la hidrofbica (23.0 nn), facilitando as el transporte de las molculas de a-amilasa a travs de los poros. Adems, la mayor resistencia a la transferencia de materia (de u-amilasa) en el interior de la resma de HIC puede estar de acuerdo con una mayor complejidad de la estructura porosa de la misma, caracterizada por el factor de tortuosidad, t, segn se ndica en las tablas 7.1 y 7.2. Lo anteriormente comentado, se ve apoyado por los datos de la caracterizacin de ambas resinas mediante porosimetra de mercurio (ver apartado 4.4.2), en los que se detecta una fraccin significativa del volumen de poro de la resma de HIC que corresponde a tamaos inferiores a 20 nm. En las tablas 7.3 y 7.4 se resumen los valores mediost del coeficiente de difusin en los poros y del factor de tortuosidad. Estos sern los utilizados en la simulacin de los procesos de adsorcin de ct-amilasa en las resinas de 1-nC e IEC y se usarn como valores iniciales en la estimacin de los parmetros cinticos durante la etapa de modelado en lecho fijo.
4 20 30
Tabla 7.4: Valores medios resultado del modelado matemtico para la adsorcin de a-amilasa en la resma de ffiC en tanque agitado.
T [0C] D~ [m2/s]
20
25
2.1 10
2.5 io-~
30
2.8 10
Estos valores del coeficiente de difusin en los poros son del mismo orden que los obtenidos para la difusin de protenas en resinas macroporosas, pese a la escasez de datos experimentales sobre la materia. Se ha descrito unos valores de la diisividad efectiva de la insulina en el interior de los poros de resinas sintticas hidrofbicas dc 2.6 - 3.4 . O1 m2/s (Firouztale et al., 1992) y. para el caso de seroalbmina bovina en resinas de intercambio inico. de 1.0 1994)
-
2.7
j~- mWs
(Yoshida et al..
No se han utilizado los valores correspondientes a los experimentos de concentracin inicial ms baja. 0.10 mg/ml.
194
MODELADO MATEMTICO
1.00
<1.95
0.90
0.85
Tiempo [mm]
= 1.50 10.11 m2/s), de la adsorcin de u-amilasa en Duolite XAD-76 1 a 4 C y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
1.00
0,95
0.90
0.85
0.80
0 50 100 Tiempo [mini 150 200
Figura 7.2: Curvas, experimental y terica ~D 0= 225 . ItT mis), de la adsorcin de 0C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.
PURIFICACIN DE ~-AMlLASA DE
195
La bondad del ajuste puede comprobarse en las figuras 7.1 y 7.2, en las que se muestran la curva predicha por el modelo junto con la correspondiente al experimento realizado en las mismas condiciones de operacin para las resinas de HIC e IEC respectivamente. El resto de las curvas de ajuste al modelo cintico se encuentran en el anexo C (figuras C.9 a C.24). En la figura C.33 (Anexo A) se muestra, como ejemplo, la representacin grfica de la optimacin (miimizacin) de la funcin objetivo respecto al valor de D~ utilizado.
7.2.- ADSORCIN EN LECHO FIJO Cada una de las curvas de ruptura obtenidas en los experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre las resinas de 1-lIC e IEC en lecho fijo se han ajustado al modelo matemtico, para esta operacin, propuesto en el apartado 3.3.3. Los valores del coefieciente de difusin en los poros (D1) y de transferencia de materia externo (lcD se han determinado mediante optimacin de dichos parmetros a partir de la metodologa descrita en el apartado A.3 del anexo A.
TabLa 7.5: Parmetros cinticos y condiciones experimentales para la adsorcin de amilasa en un lecho tito sobre resma de WC.
C0 [ng/mi] Q [nl/mi] 0.5 T [TI
~-
~, [m
2/s]
Error tk]
[
0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.50 0.50
20 20 20 20 20 20 20 20 20
4
1.3 10 1.8~ 10 1.8 10< 1.8 10< 2.0~ 10~ 1.9 10 2.0 10< 2.0~ 10< 2.8 10<
1.5 10
5.6
8.9 tt 1.3 o-~ 2.7 0.6 9.0 itt 1.7 o-~ 2.8 106 8.1 . 10.6 1.8 o-~ 7.1 1& 9.2 10.6
5.8 9.8
4.4
3.6
5.3
1.7
-1.7
-2.7 2.4
~.s
30
2.4~ 10~
En las tablas 7.5 y 7.6 se muestran los resultados obtenidos de D~ y k 1 correspondientes a cada uno de los experimentos desarrollados en las condiciones de operacin que figuran en dichas tablas, con un tamao medio de partcula de 0.41 mm para ambos adsorbentes. Los resultados mostrados en las tablas 7.5 y. 7.6 sealan, para ambos adsorbentes, una
196
MODELADO MATEMTICO
tendencia en la que el coeficiente de transferencia de materia externo aumenta con el caudal de la fase mvil. La resistencia al transporte de materia a travs de la pelcula externa que rodea a las partcula est caracterizada por el nmero adimensiona.l de Sherwood, pudiendo correlacionarse este en funcin de los nmeros de Reynolds y Schmit (Wilson y Geankoplis, 1966; Wakao y Funazkri, 1978>. A partir de estas correlaciones se deduce un aumento del nmero de Sherwood con la velocidad de la fase mvil en un lecho fijo y por tanto, una disminucin de la resistencia a la transferencia de materia externa, lo cual se observa en los resultados experimentales obtenidos (ver tabla 7.7).
Tabla 7.6: Parmetros cinticos y condiciones experimentales para la adsorcin de aamilasa en un lecho mo sobre resma de IEC. Co lmg/ml] 0.5 0.5 <5.5 1.0 1.0 1.0 2.5 2.5
2.5
Q [ml/minJ
T [0C]
D~ [m2/sJ
k< [m/s]
Error
25 25 25 25 25 25 25 25
25
[.6 . 10< 2.0 10 1.8 10< 2.5 10< 2.6 10 3.1 . 10< 1.6 o~ 1.9 10<
1.8 10
5.2
5.6 8.5
-2.2
0.5 0.5
0.50 0.50
20 30
3.1 2.5
IIIC kr[m/sl
y [mA]
WC kr[m/sl
El valor del coeficiente de difusin en los poros aumenta con [a temperatura de acuerdo con los modelos hasados en la teora de Stokes-Einstein que predicen un incremento del coeficiente de diltsividad molecular con la temperatura. En las tablas 7.8 y 7.9 se muestran los valores del coeficiente de difusin en los poros y del factor de tortuosidad correspondientes a las temperaturas
197
estudiadas. El valor medio del factor de tortuosidad para la resma de HIC es 3.6 y para la resma de IEC, 4.0. Los valores de 1$ calculados son del mismo orden que los obtenidos para la difusin de otras protenas (Firouztale et al., 1992; Sridhar el al., 1994; Yoshida el aL, 1994) en resinas macroporosas tanto de intercambio inico como hidrofbicas.
Tabla 7.8: Valores medios resultado del modelado matemtico para la adsorcin de a-amilasa en la resma de lIC en lecho fijo.
T [0C] D~ [m2/s] t
4 20 30
20
25
l.7~ 10<
2.1 . l0~~
4.3
4.0
30
2.5~ 10<
3.8
Con el objetivo de cuantificar la desviacin de la curva que predice el modelo respecto a la obtenida experimentalmente se ha calculado el error a partir de los factores de capacidad para la curva de ruptura experimental (F.C.eXP) y terica obtenida mediante el modelo (F.C.oeo), de acuerdo con la siguiente expresin:
Error[%]=
loo.
[7.1]
Los valores de este parmetro se muestran en la tabla 7.5 para la adsorcin de ct-amilasa en la tesina de lIC y en la tabla 7.6 para la resma de IEC. Se comprueba que los errores son siempre inferiores al 10%, teniendo un valor absoluto medio de 4.1% para el modelado de la adsorcin sobre la resma hidrofbica y del 4.4% para el correspondiente a la de intercambio inico.
198
MDELADO MATEM-rCo
1.0
0.8
0.6
o
Q 0.4
0.2
0.0 0 5 10 15 20 25
tiempo [mm]
Figura 7.3: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el
1.00 mg/mI; Q
0.50
1.0
0.8
0.6
e
(14
0.0 0 5 10 15 20 25 30 75 80
tiempo [mm]
Figura 7.4: Comparacin de la corva dc ruptura experimental y calculada mediante el
2.50 mg/m;
0.25
Para comprobar la bondad de los ajustes de las curvas de ruptura experimentales al modelo
199
matemtico, a continuacin se muestran dos de las grficas (figuras 7.3 y 7.4) en las que se comparan los datos obtenidos experimentalemente con la curva terica predicha por el modelo a partir de los valores de 114 y k~ que producen un mejor ajuste. El ajuste se ha realizado mediante la optimacin de la funcin objetivo (4)) respecto de los dos coeficientes cinticos mencionados de acuerdo al procedimiento expuesto en el anexo A. El resto de las grficas comparativas se muestran en el apartado C4 del anexo C (figuras C.34 a C.5 1). Los resultados del modelado matemtico de la adsorcin de ct-amilasa sobre las resinas de HIC e WC para los sistemas de tanque agitado discontinuo y de lecho fijo (tablas 7.3, 7.4, 7.8 y 7.9) muestran un acuerdo satisfactorio. Las diferencias obtenidas, para cada temperatura, son ligeramente ms elevadas para el caso de la adsorcin sobre la resma de intercambio inico, siendo del 16% la diferencia mayor entre los valores obtenidos por ambas tcnicas y del 6% la menor.
7.3.- BIBLIOGRAFA
-
lvarez, R.; Bueno, J.L. y Andrs, L.J. (1982). Coeficientes de difusin molecular en fase lquida. 1 . Ecuaciones de prediccin y de correlacin en sistemas binarios, Ingeniera Qumica, 154, 137-155
Firouztale, E.: Scott, A.P.; Dalvie S.K. y Von Blohn, G.M. (1992). Experimental and theoretical study of key parameters of adsorption on reverse phase macroporous resin, AIChE Symp. Ser., 88 (290), 25-33 Sridhar, P.; Sastri, N.V.S.; Modak, J.M. y Mukherjee. A.K. (1994). Mathematical simulation of bioseparation in an affinity packed column, Chem. ng. Technol., 17, 422-429
Wakao, N. y Funazksi, T. (1978). Effect of fluid dispersion coefflcients on particle-to-fluid mass transfer coefficients in packed beds, Chem. Eng. Sci., 33, 1375-1384
Wilson, E.J. y Geankoplis, C.J. (1966). Liquid mass transfer at very 10w Reynolds numbers in packed beds, bid. ng Chem., Fundam., 5 (1), 9-14
Yoshida, H.; Yoshikawa, M. y Kataoka, T. (1994). Parallel transport of BSA by surface aud pore diffusion in strongly basic chitosan, AIChE .1., 40(12), 2034-2044
201
8.1.- ESCALADO DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO En el captulo anterior se ha realizado el modelado matemtico de la adsorcin de c&ainilasa en lecho fijo, esto es, la obtencin de los parmetros cinticos caractersticos del modelo propuesto mediante el ajuste y optimacin de las curvas tericas a los resultados experimentales. A partir de ellos se han obtenido unos ajustes cuya bondad se ha comprobado y se ha considerado adecuada. A continuacin, con el propsito de verificar que los parmetros obtenidos (Dr, lc<, isoterma) reproducen el comportamiento de otros sistemas experimentales de dimensiones distintas y funcionando en condiciones de operacin diferentes, se ha procedido a simular un proceso de adsorcin en una columna cuyo tamao es ms de diez veces mayor que los utilizados en la etapa de
202
modelado y comparar los resultados con los obtenidos en un experimento realizado en las mismas condiciones. La concentracin elegida ha sido de 2.5 mg/m, mayor que en los experimentos utilizados en el modelado con el fin de comprobar la validez del modelo fuera del intervalo en el que se han obtenido los parmetros. Adems este valor de la concentracin es del orden en el que la a-ainilasa se produce en los fermentadores a escala industrial y de planta piloto por lo que el funcionamiento de la columna se encontrar en unas condiciones ms cercanas a las utilizadas industrialmente. Las condiciones de operacin y caractersticas fsicas del sistema utilizado se recogen en la tabla 8.1. y los parmetros cinticos y termodinmicos usados en la simulacin figuran en la tabla 8.2, los cuales corresponden a los obtenidos en el apartado 6.2 (parmetros de la isoterma de Langmuir) y 7.2 (coeficientes de difusin externa y en el interior de los poros).
(A. oryzae)
16.3 1.60
0.41
R[mm]
E
0.58
2.50
C0[mg/ml]
Q [ml/minJ 0C1 r [
5.00
25.0
2.10 10 8.2 W
45.40
0.84
En la figura 8. 1 se muestra el resultado de la comparacin entre la simulacin realizada y el experimento desarrollado en las misnas condiciones.
203
[.0
0.8
0.6 Q
e
0.4
0.2
Tiempo [mm]
Fgnra 8.1: Comparacin de la curva de ruptura experimental con la obtenida por simulacin. La concordancia entre ambas curvas es buena, por lo que para cuantificar el grado de ajuste, se ha procedido a calcular el factor de capacidad correspondiente tanto a la curva de ruptura experimental como a la obtenida por simulacin. Como puede observarse, el error es inferior al 10% s se considera el proceso de adsorcin hasta la saturacin completa de la columna. Sin embargo, en operacin industrial no se alcanza ese grado de saturacin, ya que esto supondra una importante prdida de arisorbato en el elluente, lo que hara disminuir la rentabilidad econmica del proceso hasta hacerlo inviable. Si se calcula el error entre la a-amilasa adsorbida experimentalmente y la que predice el modelo al 95% de la saturacin, el error se reduce drsticamente hasta un valor de 0.08%, siendo aun inferior para niveles inferiores de saturacin. La diferencia entre ambas curvas se localiza en la zona cercana a la asintota correspondiente a la saturacin de la capacidad de adsorcin de la resma. Para valores de concentracin adimensional (C/C)) superiores a <).97, la curva experimental se acerca muy lentamente a 1.0 mientras que la correspondiente a la simulacin alcanza ese valor ms rpidamente. Esto podra estar causado por la lenta velocidad de transporte de materia por difusin en el interior de los poros cuando estos se encuentran prcticamente cubiertos de adsorbato sobre su superficie. De acuerdo con estos resultados, puede concluirse que el modelo matemtico propuesto para describir cl comportamiento de los procesos de adsorcin de a-amilasa en lecho fijo es adecuado y
204
FiJo
reproduce los resultados experimentales con un grado de aproximacin elevado, pudiendo ser utilizado como herramienta para el diseo y escalado de estas operaciones a nivel industrial.
al 99.9% de la saturacin
al 95.<)% de la saturacin
190.7
164.1
173,1
164.3
9.2
-0.08
Como se ha comprobado y expuesto previamente en el presente trabajo, el modelo matemtico que describe el proceso de adsorcin de u-amilasa en un lecho fijo mediante los mecanismos de interaccin hidrofbica e intercambio inico, describe adecuadamente los resultados experimentales obtenidos. En el modelo matemtico se han incluido las etapas de transporte de materia por difusin externa e interna as como la existencia de flujo no ideal debida a efectos de dispersin axial, encontrndose, cada uno de los procesos anteriores, caracterizado por un parmetro cintico (k<, D~ y Dj. La experimentacin llevada a cabo ha permitido la obtencin de los mismos as como de los parmetros termodinmcos correspondientes a la isoterma de equilibrio, que en el caso de la adsorcin de wamilasa en las resinas estudiadas ha mostrado un comportamiento no ideal. Para desarrollar la simulacin y diseo de procesos de adsorcin en lecho fijo a partir del modelo matemtico propuesto, es necesario conocer las caractersticas fsicas del adsorbente (porosidad, densidad, tamao de poro y de partcula>, del adsorbato (difusividad molecular) y del sistema experimental (dimensiones y porosidad del lecho) as como las condiciones de operacin definidas para la realizacin de los experimentos (caudal, temperatura y concentracin de alimentacin). Los ensayos de caracterizacin del adsorbente son los comnmente utilizados para tal fin (ver captulo 4), mientras que la difusividad molecular del adsorbaio ped&obtnerse a partir de diversas correlaciones (lvarez el al., 1982). Los mecanismos de adsorcin estudiados, interaccin hidrofbica e intercambio jnico, son de aplicacin general y no suponen unin bioespectica entre la u-amilasa y el adsorbente
205
correspondiente. Todas las protenas contienen zonas hidrofbicas y residuos con grupos funcionales cargados elctricamente en su superficie que permiten, en funcin de las condiciones de operacin, la adsorcin a los ligandos unidos a la matriz de la fase estacionaria. Por ello, es de esperar que el modelo propuesto pueda aplicarse a la adsorcin de otras protenas a resinas de LIC e IEC. Tras la etapa de modelado, la simulacin de un proceso permite determinar que variables y de que forma influyen en el mismo, conduciendo, de esta fonna, a un mejor y ms completo conocimiento del proceso de adsorcin de un soluto en un lecho fijo. La simulacin matemtica, por otro lado, permitir el diseo de nuevos procesos as como la optimacin de otros ya existentes. En el presente apartado se realiza un estudio terico de la influencia de las variables que intervienen en el proceso en base al modelo matemtico desarrollado y cuya validez se ha comprobado. En la tabla 8.3 se indican los valores utilizados para la simulacin en el estudio terico realizado. En cada caso, se mantendrn constantes todos los parmetros excepto aqul cuya influencia se est estudiando.
p [kg/m31
sI 3
En la figura 8.2 se muestra la variacin de las curvas de ruptura con el valor del coeficiente de difusin en los poros. A medida que este aumenta, el punto de ruptura se retrasa, obtenindose curvas ms estilizadas cuya pendiente es mayor. a[canzando la saturacin de la columna ms rpidamente. Para valores pequeos de Dp, la forma sigmoidal de la curva de ruptura se hace ms ancha, perdiendo la simetra que presenta, respecto del punto de inflexin, a valores superiores. Para adsorbatos de elevada masa molecular (MA). como es el caso de las protenas, la difusividad molecular es proporcional a MA<J (ecuacin 2.4), por lo que su valor se encuentra, a temperatura ambiente, dentro del orden de 10< m2/s para protenas de pequeo tamao, hasta 3
.
206
protenas. Por esta razn, las curvas de ruptura de la wamilasa en las resinas de HIC e IEC obtenidas en el presente trabajo, presentan este comportamiento caracterizado por la baja simetra de las mismas. Las molculas de protena, tras atravesar la capa lmite externa que rodea a las partculas, sufren una lenta difusin en el interior de los poros hasta los sitios de adsorcin debido a su gran tamano y, por tanto, al pequeo valor de D~. La variacin del coeficiente de transferencia de materia externa (figura 8.3) modifica el comportamiento del sistema de manera que para valores bajos del mismo, las molculas de soluto no tienen el tiempo de residencia suficiente como para atravesar la capa lmite y entrar en el interior de los poros de las partculas. As, se produce un aumento rpido de la concentracin de salida debido a las molculas que no se han difundido hacia los poros. disminuyendo la eficacia de la operacin. A medida que aumenta el valor de kf, la ruptura se retrasa, permitiendo un mayor flujo de adsorbato a travs de Ja capa limite. La capacidad de adsorcin de la resma viene dada por el valor de qm correspondiente a la ecuacin de la isoterma de Langmuir (ecuacin 2.13). Como puede observarse en la figura 8.4. un mayor nmero de sitios de adsorcin accesibles requiere mayor tiempo para que el adsorbato llegue a saturar los centros de adsorcin del adsorbente. En la figura 8.5 se examina el efecto de la porosidad del lecho. En ella se advierte que un aumento de e desplaza la curva de ruptura hacia la izquierda, reduciendo la utilizacin de la capacidad de la resma, la cual est relacionada con el rea por encima de la curva de ruptura (segn figura en el apanado 6.5.2). Manteniendo constante el valor de la densidad del adsorbente y la distribucin de tamaos de partcula, un aumento de la porosidad de la columna estar causado por un empaquetamiento defectuoso, lo cual genera un aumento de las zonas de mezcla en el interior de la columna, disminuyendo la eficacia de la operacin de adsorcin. La porosidad de las partculas tiene un efecto importante en el comportamiento de la adsorcin y. por tanto, en la forma de las curvas de ruptura. El factor de tortuosidad, t, caracteriza, en parte, la estructura porosa de las partculas de adsorbente, dependiendo de la porosidad interna de las mismas. Adems, el coeficiente de diflisividad efectivo es directamente proporcional al valor de r <ecuacin 2.7). Por otro lado, manteniendo constantes el resto de las caractersticas de la resma, el aumento de e~ conduce a una menor masa de resma en la columna y de capacidad. El efecto global de estas iniluencias se representa en la figura 8.6, observndose un aumento de la eficacia de la adsorcin con la disminucin de la porosidad interna. En la ligura 8.7 se muestra el efecto del caudal de alimentacin en las curvas de ruptura. Para una nisma columna, el caudal es directamente proporcional a La velocidad del fluido por lo que. al aumentar aquel. tambin lo hace el coeficiente de transferencia de materia externo (l-lidajat u al..
207
aumentando la anchura de la curva y la eficacia de la adsorcin a medida que disminuye el caudal, ya que, de esta manera, se aumenta el tiempo de contacto entre las fases permitiendo que se alcance una situacin ms cercana al equilibrio local. Respecto a la concentracin de adsorbato en la fase mvil, se observa (figura 8.8) que afecta considerablemente a la forma y posicin de las curvas de ruptura. A medida que aumenta el valor de C0, se alcanza antes la saturacin del lecho. El clculo de los factores de capacidad (ecuacin 6.8) para cada una de las curvas obtenidas por simulacin indica que, al aumentar la concentracin, el factor de capacidad tambin aumenta. La influencia de Las dimensiones del lecho en el proceso de adsorcin en lecho fijo puede observarse en las figuras 8.9 y 8.10. En la primera de ellas se observa el comportamiento de las curvas de ruptura en funcin de la altura de lecho. Segn se aumenta L, la pendiente de la curva, tras la ruptura, va disminuyendo hasta alcanzar un valor constante. A partir de ese valor, la forma de las curvas de ruptura no vara, desplazndose estas progresivamente hacia la derecha. Este desplazamiento est causado nicamente por la mayor cantidad de adsorbente que habr en la columna de mayor tamao por lo que la cantidad de adsorbato que se une ser proporcional al aumento de longitud ya que el resto de los parmetros del proceso permanecen constantes. Para columnas de menor tamao, la curva de ruptura se muestra asimtrica, debido a que las resistencias difusionales del sistema permiten que existan molculas de adsorbato que atraviesen la columna sin haberse difundido hasta el interior de las partculas. Este efecto llega a ser poco significativo a partir de determinada altura de columna, en la que las molculas tienen el suficiente tiempo de residencia en el interior del lecho como para terminar difundindose hasta los sitios de adsorcin de la resma. La variacin del dimetro de la columna, 4)~, a caudal constante (figura 8.10), produce una variacin de la velocidad intersticial del fluido en sentido contrario que es proporcional a (ccV o, lo que es lo mismo, al rea transversal de la columna. Como se ha comentado anteriormente, la velocidad de la fase mvil afecta positivamente el valor de k~ y un aumento del dimetro, manteniendo constante el caudal, har disminuir la velocidad, permitiendo un mayor tiempo de contacto del adsorbato con la fase estacionaria y. por ello, una nayor eficacia del proceso de adsorcin, aunque el tiempo de operacin aumenta considerablemente. La variacin del tamao de las partculas del adsorbente (figura 8.11) tambin afecta al valor 4~ (Hidajat et al., 1995). La disminucin del tamao de partcula de k1, siendo este proporcional a R~ aumenta la eficacia del proceso y retrasa el punto de ruptura, haciendo las curvas ms estilizadas.
-
Junto a esto, para el escalado de este proceso se deber tener en cuenta que tamaos de partculas decrecientes harn aumentar la prdida de carga a lo l~rgo del lecho, de acuerdo a la ecuacin de
208
209
1.0
0.8
0.6
o
Q 0.4
0.2
0.0
0 50 100 150
2(X)
Tiempo [mini
Fgura 8.2: Influencia del coeficiente de difusin en los poros.
1.0
0.8
0.6
o
Q 0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.3: lntluencia del coeficiente de transferencia de materia externa.
210
1.0
0.8
0.6
o
0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.4: Influencia de la capacidad del adsorbente.
1.0
0.8
0.6 Q) 0.4
0.2
Tiempo [mm]
Figura 8.5: Influencia de ta porosidad dcl lecho.
211
1.0
0.8
o u
0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.6: Influencia de la porosidad de partcula.
1.0
(.1.8
0.6
o
0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.7: Influencia del caudal.
2t2
1.0
0.8
0.6
u
0.4
0.2
Tiempo [mm]
Figura
1.0
0.8
0.6
o
0.4
0.2
0.0
100
200
300
400
Tiempo [mini
Figura 8.9: Influencia de la longitud de columna.
213
1.0
0.8
0.6 Q
o
0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.10: Influencia del dimetro de lacolumna.
1.0
0.8
0.6
Q 0.4
0.2
Tiempo [mini
Figura 8.11: Influencia del dimetro de partcula.
214
8.3.- PREDICCIN TERICA DEL CAMBIO DE ESCALA En los apartados anteriores se ha comprobado que eJ modelo matemtico planteado reproduce los resultados experimentales dentro y fuera del intervalo de condiciones de operacin en el cual se determinaron los parmetros caractersticos del mismo; posteriormente se ha estudiado la influencia de las condiciones de operacin (concentracin, temperatura, caudal), caractersticas tsicas del sistema (dimensiones de la columna, porosidad del lecho y del adsorbente) y parmetros cinticos (coeficiente de transferencia de materia externa y de difusin en los poros) y termodinmicos <isoterma) en el comportamiento del proceso de adsorcin en un lecho fijo.
L [ml
p 1 kg/m3]
gp
Una vez completadas las etapas del presente estudio, descritas anteriormente, se ha realizado la simulacin de una columna de adsorcin con la resma de intercambio inico (Duolite A-568), a escala industrial, con las caractersticas que se indican en la tabla 8.5. Las condiciones de operacin elegidas han sido las que se indican en la tabla 8.6. Los parmetros del modelo (ver tabla 8.7) han sido los determinados en la etapa de modelado matemtico a partir de los resultados experimentales.
Tabla 8.6: Condiciones de operacin para a smmulacin a escala industrial, Parmetro C 0 [mg/cm T Id 3] Valor 5.00
1.0
-
rabIa 8.7: Parmetros dcl modelo para la simulacin a escala industrial. Parmetro q,, [mg/g] D~ [mn2/s] k<lm/s] Valor 45.40 2.1
2.0
Caudal [m3/sj
10<
10<
10
25.0
En la figura 8.12 se muestra el resultado de la simulacin. Se observa que las curvas de ruptura correspondientes a las dos columnas de diferente longitud presentan una forma y una pendiente similar, aunque desplazadas en el tiempo ya que al contener diferente cantidad de
215
adsorbente, el tiempo necesario para la ruptura tambin, varia. Estos resultados se corresponden con los estudios tericos llevados a cabo en el apartado anterior.
1.0
0.8
0.6 Q
o
0.4
0.2
Tiempo [mm]
Figura 8.12: Simulacin del comportamiento de dos columnas de adsorcin de
diferente altura, a escala industrial, para el sistema wamilasa/Duolite A-568. En operacin a escala industrial no se llega a alcanzar la saturacin completa de la capacidad del adsorbente (C/C0
=
del efluente que sale de la columna. En funcin de la optimacin tcnica (estabilidad del producto de inters, rendimientos, etc.) y econmica (costes de produccin, costes de materias primas y productos, etc.) se deber determinar el tiempo de operacin y el porcentaje de saturacin adecuado para realizar la purificacin de cada producto. A partir de las simulaciones realizadas, se han calculado el tiempo de operacin y la cantidad de a-amilasa adsorbida por cada una de las columnas correspondientes a la saturacin completa y al 20% de la misma (C/C0 = 0.2). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8.8. Como puede comprobarse, para la columna de 5 metros, con un aumento del tiempo de operacin del 30% (desde el 20% al 100% de la capacidad mxima), se consigue un incremento de la cantidad de wamilasa adsorbida de slo el 7.6%. Para la columna de 10 metros de altura, el aumento del 20% en el tiempo de operacin supone un 5.2% de aumento de la cantidad de a-amilasa adsorbida.
216
20
8.8
158 12.7 171
18.0
322.3
22.5
340
Por lo anteriormente comentado, junto al hecho de que el aumento del nivel de saturacin al final de la operacin de adsorcin supone un aumento de las prdidas de producto, sera aconsejable, en operacin real, detener el proceso de adsorcin (comenzando la operacin de desorcin) a valores reducidos de la concentracin del adsorbato en el efluente de la columna.
8.4.- BIBLIOGRAFA
-
lvarez, R.; Bueno, iL. y Andrs, L.J. (1982). Coeficientes de difusin molecular en fase lquida. 1
-
154. 137-155.
-
l-lidajat, K.; Aracil, J.: Carberry, J.J. y Kenney, C.N. (1987). Laboratory catalytic studies: the role of transport phenomena, .Lfltal.. 105, 245-248.
Hidajat, K.; Aracil, J.; Carberry, J.J. y Kenney, C.N. (1995). lnterphase fluid-particle mass transport at 10w Reynolds numbers, Catal. Leurers, 30, 213-217.
PURIFICACtN DE rL-AMtLASA DE
217
Se ha desarrollado una metodologa que permite un acercamiento y conocimiento progresivo de los mecanismos y parmetros que intervienen en el proceso de purificacin por adsorcin de a-amilasa sobre resinas de interaccin hidrofbica e intercambio mediante experimentacin en HPLC, tanque agitado discontinuo y lecho fijo.
Mediante experimentacin en HPLC, se han identificado y cuantificado los factores que influyen en el proceso de adsorcin de waniilasa sobre la resma de interaccin hidrofbica Duolite XAD-761 y la de intercambio inico Duolite A-568. Se ha determinado que dichos parmetros son pH, temperatura fterza inica y los propios de las condiciones de operacin de cada uno de los sistemas experimentales utilizados (concentracin, caudal, dimetro de partcula del adsorbente, dimensiones del lecho).
218
Se ha aplicado el mtodo de momentos al estudio de la adsorcin mediante cromatografa de impuiso en un sistema de HPLC. Se han obtenido los parmetros cinticos (coeficiente de difusin en los poros) y termodinmicos (constante de adsorcin, factor de capacidad, altura equivalente de un plato terico, entalpias y entropas de adsorcin).
Se han determinado las isotermas de adsorcin de a-amilasa sobre ambas resinas, observando un comportamiento no lineal. Los resultados experimentales se han ajustado a la ecuacin de Langmuir, obteniendo los parmetros caractersticos por optimacin.
Se ha propuesto un modelo matemtico que describe de forma adecuada el proceso de adsorcin en tanque agitado discontinuo, teniendo como parmetro el coeficiente de difusin en los poros, determinndose su valor en funcin de la temperatura.
Se ha propuesto un modelo matemtico que describe de forma adecuada el proceso de adsorcin en lecho fijo, teniendo como parmetros el coeficiente de difusin en los poros y el de transferencia de materia externa. Ambos se han determinado para el sistema experimental estudiado.
El modelo de adsorcin en lecho fijo ha demostrado su capacidad para predecir el comportamiento de la adsorcin de a-amilasa, por lo que puede ser utilizado como herramienta en el diseo y escalado de la operacin de adsorcin en lecho fijo.
Se ha realizado un estudio terico utilizando el modelo anterior para conocer en profundidad la influencia de las variables de operacin, las caractersticas fsicas del sistema y los parmetros cinticos y termodininicos que intervienen en el proceso.
.
.
El nmero de productos obtenidos a travs de procesos biotecnolgicos se encuentra en constante aumento. Adems, las especificaciones de pureza a las que se encuentran sujetos dichos productos son, cada vez, ms exigentes. Por ello y a partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo, se propone la continuacin de la investigacin a travs de las siguientes lineas:
-
Estudiar y modelar la adsorcin de otras protenas y sustancias que, tpicamente, acompaan a la u-auulasu
cli us t4uts ue euie,Lduju,
UUI3UQ
Q~ta
pi~UU~.
L~OLa ~.tapa
deber comprender el estudio de la adsorcin de cada uno de ellos, tanto de forma individual como conjunta.
-
A partir de la etapa anterior, desarrollar un modelo matemtico que describa el comportamiento de cada uno de los adsorbatos en los procesos de adsorcin tnulticomponente.
219
Con objeto de generalizar el uso de los modelos matemticos propuestos para el diseo de procesos de purificacin en biotecnologa, se deber verificar que describen,
satisfactoriamente, los procesos de adsorcin en los que intervienen protenas y biomolculas con diferentes caractersticas y adsorbentes de diversa naturaleza.
-
La purificacin por adsorcin mediante la operacin en lecho expandido permite eliminar etapas primarias de separacin con el consiguiente aumento de la eficacia global y reduccin de costes de proceso. Esta operacin, de reciente aplicacin a la biotecnologa, se encuentra en un estado de desarrollo emprico por lo que sera de gran inters desarrollar modelos matemticos que describan dicha operacin, en base al modelo propuesto en el presente trabajo de investigacin para la adsorcin en lecho fijo.
221
A.1.- ANLISIS DE MOMENTOS A continuacin se muestra la secuencia de clculo para la determinacin, mediante el anlisis de momentos, de los parmetros cinticos y termodinmicos caractersticos del modelo. En primer lugar, a partir de las curvas de respuesta experimentales, se calcula el primer y segundo momento central mediante las ecuaciones 3.1 y 3.2 La integracin se realiza numricamente utilizando el mtodo de Gil y Miller (1972). A continuacin se ajustan linealmente, por mnimos cuadrados, los datos del primer momento frente a L/v para los experimentos realizados en iguales condiciones de pH, fuerza jnica y temperatura. A partir de la ecuacin 3.3. la pendiente de dicha regresin vendr dada por:
222
pendiente
1 +
E) k
[A.]]
calculando directamente la constante de equilibrio aparente, k, y con la ecuacin 3.4, la constante de equilibrio,
KA.
Estimando la altura equivalente de un plato terico mediante la ecuacin 3.9 y de acuerdo con la expresin 3.10, la regresin lineal de los valores de AEPT frente a la velocidad intersticial, y, generar una recta cuya ordenada en el origen y pendiente correspondern a las siguientes relaciones: ordenada en origen
E
2DL
y
[A.2]
pendiente
1E
15% D
jC 1
(1
E) k
0L
[A.3] y de difusin
a partir de las cuales puede determinarse el valor del coeficiente de dispersin axial, en los poros, D,,, respectivamente.
4.2.- MODELO DE ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO Con objeto de simplificar la resolucin del modelo, en primer lugar, las variables de operacin correspondientes al modelo planteado se transforman en las siguientes variables adimensionales:
e (0=
[A.4]
As, el balance de materia en una seccin radial de la partcula, queda de la siguiente manera:
a
it
L+C~Eoj~1] C-~~
[AS]
___
JE 0
(u
ct~)
Sh
Li~&jsr (u
[MS]
223
z=O
[A.7]
__
Sh
[A.8]
q=0 U=1
t=0 t=0
0=z=l
[A.9]
La solucin del modelo matemtico planteado para la adsorcin en tanque agitado no es posible de forma analtica, salvo para el caso de que el equilibrio cumpla la ley de Henry y, por tanto, la isoterma sea lineal. Por ello, se procede a resolver numricamente las ecuaciones de balances de materia mediante la aplicacin de incrementos finitos. De esta forma, el sistema de ecuaciones diferenciales parablicas se convierte en un sistema de ecuaciones ordinarias muediante la aplicacin de los incrementos finitos. A continuacin, este sistema se resuelve mediante integracin numrica llevada a cabo a travs de un programa de ordenador realizado en lenguaje Fortran, utilizando el paquete de subrutinas de anlisis matemtico NAG Fortran Library (Numerical Algorithms Group Inc., Downers Grove, IL, EE.UU.). La obtencin del valor del coeficiente de difusin en los poros D1 se realiz mediante optimacin uniparamtrica de una funcin objetivo utilizando el algoritmo de Coggins (Kuester y Mize, 1973). La funcin objetivo mencionada que hay que minimizar es la siguiente:
=
i~N
I~I
C1)
[A.l0]
A.3.- MODELO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO De igual forma que en el caso anterior, es necesaria la resolucin por mtodos numricos del sistema de ecuaciones diferenciales que forman la descripcin del modelo matemtico de la ~adsorcin en un lecho fijo. Transformando en adimensionales las variables del modelo, se obtiene:
224 C
C0=
Dt
1
[Ah]
Sustituyendo estas variables en las ecuaciones del balance de materia en una seccin radial de la partcula. se tiene:
ico
it
=
[A.12]
Las condiciones de contorno para el balance de materia anterior, quedan de la siguiente forma:
En el centro de la partcula:
Dc
Dx
,=~
=0
[A.13]
k1R1
p
(u
[A.14]
p~
La transformacin de la ecuacin de] balance de materia en una seccin transversa] en el lecho y sus con-espondientes condiciones de contorno, con las variables adimensionales, produce: 2 uR i2(0 DR iu L p p (u-o~~) [Ab] it L2D~ iz2 LD ~e) D~
_
A la entrada de la columna:
iu
2= e
uL
DL
(1 uI~~)
-
[A 16]
A la salida de la columna:
DU
~Z
[A.17]
Z=L
225
Al igual que en el caso de la adsorcin en tanque agitado, la resolucin del modelo planteado
para lecho fijo deber realizarse de forma numrica para el caso de que la isoterma de equilibrio no
sea lineal. El sistema de ecuaciones diferenciales planteado se resuelve mediante el mtodo de colocacin ortogonal (Carey y Finlayson, 1975; Villadsen y Stewart, 1967). En este caso, tambin se procede a la determinacin de los valores ptimos del coeficiente de transferencia de materia externa, k1 y del coeficiente de difusin en los poros, D~. Se utiliza el mtodo del simplex con 3 puntos (2N+l, siendo N=2, el nmero de variables independientes, en este caso k~ y D1). La funcin objetivo elegida es la A.16 y los valores ptimos de los parmetros corresponden a la situacin en la que se cumple la siguiente condicin:
< 10rn
[A.251
N+1 siendo, para cada tanteo, ~ cada uno de los valores de la funcin objetivo en los vrtices del simplex y ~Dm el valor medio de los mismos. La resolucin numrica de los modelos, as como el ajuste de los datos experimentales y la optiniacin de los parmetros de cada uno de los modelos se ha realizado a travs de un programa de ordenador escrito en lenguaje Fortran, utilizando el paquete de subrutinas NAG Fortran Library.
AA.- BIBLIOGRAFIA
-
Carey, OF. y Finlayson, BA. (1975). Orthogonal collocation of finite elements, Chem. Eng. S., 30, 587-596.
Gil, PE. y Miller, GE. (1972). An algorithm for the integration of unequally spaced data, Comp.
Kuester, J.L. y Mize, J.H. (1973), en: Oprimization tecl-zniques witl Fortran, McGraw-Hill, Nueva York.
Villadsen, J.V. y Stewart, W.E. (1967). Solution of boundary-value problems by orthogonai collocation, Clzem. Eng. Sci., 22, 1483-1501.
227
ER
[B]
q erp donde qexp es el valor, determinado experimentalmente, de la concentracin de -amilasa adsorbida en la resma y qie, es el valor calculado mediante la ecuacin de la isoterma correspondiente. En las tablas B.l a 8.6 se indican, en porcentaje, los valores del residuo medio y de la desviacin estndar de los residuos para cada uno de los ajustes. Los nmeros entre parntesis
228
corresponden a los errores calculados para los puntos de concentracin de equilibrio mayor de 0.20 mg/ml. Como se ha indicado en el apartado 6.3.1, para valores de concentracin inferiores a la anterior, se utilizar un ajuste lineal de la isoterma utilizando slamente los valores de baja concentracin, que tienen una tendencial lineal. Los resultados de la constante de adsorcin (constante de Henry), as obtenidos, se muestran en las tabla B.7 y B.8.
229
Tabla 8.1: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en
bR
Langmuir Freundlich
25 0.3 20
(8)
0.2 o.m
..~
.~
mS
0.0~
0 (experimentam)
10
15
20 [n,~/gl
25
Concentraeinadsorbida
Figura
11.1: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de HIC a 4 0C: (A) Valores de y (B) anlisis de residuos.
q predichos
por el
q (experimental)
Concentraeinadsorbida
Figura
11.2: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HLC a 4 0C: (A) Valores de q predichos y (B) anlisis de residuos.
por el
230
Tabla 11.2: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite XAD-761 a 20 C.
Isoterma
bR
medio [%]
Langmuir Freundlich
(3) 0.3
(B)
e e
ci-
-0.4
15
20
c (experimental>
Concentracin adsorbida
lmg/gl
25 13
0.2
01
(11)
-e e
e 0.0a
~ o
e
0.
-0.2
-0.3 -0.4-
mo
20
25
cm (exmerin,eiital)
Figura 11.4: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HIC a 20 0C: (A) Valores de q predichos por cl ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (E) anlisis de residuos.
231
Tabla B.3: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite XAD-761 a 30 0C.
Isoterma
bR
mnedio [%]
e [%]
Langmuir Freundlich
20
0.4 0.3
(B)
u
ms
e
O lo
0.2 -
E
O
0.m 0.0
os
o-
q (experimental)
20
Figura 11.5: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de HIC a 30 0C: (A) Valores de q predichos por el
20
0/ 0.3-
(B)
5 -e
!
-e
O
0.2 -
o 0.1 o
O
0.0 -0.1
-
5
5
q (experinitittal)
Figura 11.6: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HIC a 30 0C: (A) Valores de q predichos por el ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.
232
rabIa B.4: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en
Duolite A-568 a 20 C.
Isoterma
tR
Langmuir Freundlich
35 30 25 20
os os
os
(B)
((402--
a
o
u 0.0
.c
.4
a a
a -0.2 -
-z
-04-
-o. 3 0 5 20 25 30 35 0 5 lO 15 20 25 .3(3
35
ci texperirnental)
Figura 11.7: Ajuste a la isoterma de L-ngmuir para la resma de WC a 20 0C: (A) Valores de q predichos por el ajuste frente a los obtenidos cxperimentalmente y (E) anlisis de residuos.
35 30 25
-~
0.~-
(11)
0.4 0.2 -
20
15
-a e
0.0
A
A
At A
A.
o mO
o ~0.2e
-04-
0.,, (5 20 35 0 5 lO 15 20 25 30 35
cl texpCriU1Cnt~I)
IEC
233
Tabla 11.5: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite A-568 a 25 0C.
Isoterma
~it medio
[%]
Langmuir Freundlich
35 30 25
a-
(B)
a~2o-
os 0.1
0.0
...~ u u
tu
u u
os
.4
15
o- o
e
5
-0.1
~ -0.2
u
-0.3 0.4
II
5 q (experimental>
10
20
25
30
35
Figura 11.9: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de WC a 25 C: (A) Valores de q predichos por el Qiuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.
35 30 25 ~
-~
O
(B)
u u
u
20 5
e
o
u u
e
O
O
a-0.3 -0.4 0 5 0 15 20 25 30 35
<1 (experiniental)
Figura 11.10: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de WC a 25 C: (A) Valores de q predichos por el
234
Tabla 11.6: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en
Duolite A-568 a 30 C.
Isoterma Rmediol%]
Langmuir Freundlich
-44(1.8) 4.9
O...,
(B)
0.3 0.2 -
o u
os
E os
.4 0.0
O
e e
e .4 o-
u
~02-0.3 -
15
20
25
30
35
-O.., O
20
25
30
35
q <experimental)
(B)
anlisis de residuos.
o
0
-o
15
20
25
3(2
35
25
35
q (experimental)
Concentracin adsorbida
lu/gl
Figura 11.12: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de IEC a 30 C: (A) Valores de q predichos por el aiuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.
235
Tabla 11.8: Constantes de equilibrio de Henry vlidas para baja concentracin en el sistema a-amilasa/LEC.
Temperatura [0C] KA
237
ANEXO C. FIGURAS
238
ANEXO C: FIGURAs
1.0
0.9
=
Y
0.8
0.7
Tiempo [mm] Figura C.1: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilas-a en Duolite XAD761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
1.0<>
0.95
090
0.85
Figura C.2: Comp-oracin de la dntica de adsorcin dc ~-amilasaen Duolite XAD761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
239
1.0
0.9
0.8
=
Q Q
0.7
0.6
0.5
Figura C.3: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
1.0
0.9
Q u
0.8
0.7
0.6
tOO
200
300
400
500
600
Tiempo [mm]
Fgura C.4: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a
240
ANEXO C: FIGURAS
1-o
0.9
u u
0.8
0.7
100
200
300
400
500
600
Tiempo [mm]
Figura C.5: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 20 0C.
1,0<)
0,9 5
Y
u
090
085
[mini
Figura C.6: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorhato llevadas a cabo a 30 C.
241
LO
0.9
0.8
Ql
0.7
0.6
0.5
0.4
lOO
200
300
400
500
600
Tiempo [mio]
Figura C.7: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 20 tt.
1.0
0.9
0.8
c
Ql Ql
0.7
0.6
0.5
Tiempo (mio]
Figura C.8: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 25 C.
242
ANEXO C: FICTIJI1AS
1.0
0.8
0.6
Ql Ql
0.4
0.2
O-O O-O
i,O 2.0 3.0 [1.0 12.0
Volmenes de Lecho Figura C.9: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna
243
1.0
0.8
0.6
=
Ql Ql 0.4
0.2
Figura CAO: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para una concentracin de entrada de 2.50 mg/ml a 20.0 0C.
t .0
0.8
0.6 Ql Ql
0.4
0.2
0.0
o-O
2.0
4.0
6.0
23.0 24.0
Volmenes de lecho Figura C.l1: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la
244
ANEXOC: FIGURAs
t .0
0.8
0.6
Ql Ql 0.4
0.2
0.0 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
14.0
16.0
Volmenes de lecho
Figura C.12: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la
1.0
0.8
0.6 Ql Ql 0.4
0.2
Volmenes de lecho Figura C.13: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura
245
1.0
0.8
0.6
Ql Ql
0.4
0.2
O-o
o-o
1.0
3.0
11.0 12.0
1.0
0.8
0.6
Ql
Ql
0.4
0.2
o-o
0.0 2.0 4.0
6,0
24.0 26.0
Volmenes de lecho Figura C.15: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 0.25 mI/mm a 25.0 C.
246
ANEXO C:
FIou&~s
1.0
0.8
0.6
Ql Ql 0.4
0.2
0.0
o-o
1.0
2.0
3.0
4.0
16.0 18.0
Volmenes de lecho Figura C.16: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 1(X) ml/mm a 25.0 C.
247
1.00
0.95
0.90
=
Ql 0.85 Ql
0.80
0.75
0.70
100
200
300
400
500
600
Tiempo [mm]
Figura C.17: Curvas, experimental y terica (D~ 2.32 lO m de a-antilasa en DuoliteXAD-761 a 4 ~Cy una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=
2/s), de la adsorcin
1.00
0.95
Y Ql
0,90
Tiempo [mini Figura C.18: Curvas, experimental y terica (D~ 1.32 10 m2/s), de la adsorcin de a-amnilasa en Duolite XAD-761 a 4 0C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
=
248
ANEXOC:
FIC,uRAs
t .00
0.95
0.90
Ql Ql
0,85
0.80
0.-ls
100
200
300
400
500
600
Tiempo [mninJ
Figura C.19: Curvas, experimental y terica (D~ 3.72 . l0~ m/s), de la adsorcin de ci-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=
1.00
0.95
Ql
0.90
0.85
(1 100 200 300 400
500
~liempo [mm]
Figura C.20: Curvas, cxperiment-al y terica (D 2/s), de la adsorcin de 0 1.76 iW m de 0.25 mg/ml. u-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 C y una concentracin inicial
=
249
1.00
Ql = Ql
0.90
0.85
200
300
1.52 10.11 m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
Figura (2.21: Curvas, experimental y terica (D~
=
1.00
095
Ql
0.90
085
Tiempo [mini Figura (2.22: Curvas, experimental y terica (D 2/s), de la adsorcin de 0 1.10 10 m de 0.10 mg/ml. rpamil-asa en Duolite XAD-761 a 30 0C y una concentracin inicial
=
250
ANEXO C:
ROU&xs
1.00
095
Ql Ql
0,90
0,85
100
200
300
400
2.15 10 n/s), de la adsorcin de u-amlasa en DuoliteXAD-761 a 30 t y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
=
1,00
Y
Ql
095
0,90 0
200
2/s), de la adsorcin de Figura (2.24: Curvas, experimental y terica (D~ 2.11 10. m ry-amilasa en Duolite XAD-761 a 30 0C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
=
251
1.0
0.9
0.8
Y Ql
0.7
0.6
0.5
lOO
200
300
400
Tiempo [mm]
Figura (2.25: Curvas, experimental y terica (D~ 5.20 . 1041 m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a 20 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=
I.0
0.9 Ql Ql 0.8
2/s), de la adsorcin 2 2.21 . 10 m de 0.25 mg/ml. de a-amilasa en Duolite A-568 a 20 C y una concentracin inicial
Figura (2.26: Curvas, experimental y terica (D
252
ANEXO C: FIGURAS
1.00
0.95
Y Ql
0.90
0,85
50
100
150
200
Tiempo [mnJ
Figura (2.27: Curvas, experimental y terica (D~ = 2.08 . ~ m2/s), de la adsorcin de a-arnilasa en Duolite A-568 a 20 C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.
t .0
0.9
0.8
e
Ql Ql
0.7
0.6
0.5
400
500
600
Figura (2.28: Curvas, experimental y terica (D~ = 6.02 10 m2/s), de la adsorcin de cx-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
-
oryzae
POR ADSORCIN
253
1.0
0.9
Ql Ql
0.8
0.7
0.6
100
200
300
400
500
600
Tiempo [mm]
2.41 lo m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
Figura C.29: Curvas, experimental y terica (D~
=
1.00
0.95
e
Ql
Ql 0.90
150
200
254
ANEXO C: FIGURAS
1.0
0.9
0.8 Ql
Ql
0.7
0.6
0.5
0.4 0
100
200
400
500
600
Figura (2.31: Curvas, experimental y terica (D~ = 7.41 l0~~ m2/s), de la adsorcin de cx-amilasaen Duolite A-568 a300C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
0.9
Ql
Ql
0.8
t).7
400
500
600
&/s), de la adsorcin dc ctamilasa en Duolite A-568 a 30 C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.
-
2.75
255
7.0 -
3.0 e -
2.0 1.0
.4.
0.0
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
D p x 1011 [m2/s] Figura (2.33: Optimacin del valor de D~, por minimizacin de la funcin objetivo
para un experimento de adsorcin de a-amilasa en tanque agitado a 25 0C y concentracin inicial 0.25 mg/ml sobre la resma de intercambio inico.
LECHO FIJO
En el presente apartado se comparan las curvas de ruptura experimentales con las tericas
derivadas del modelo matemtico. Los parmetros cinticos utilizados para el modelado figuran en el apartado 7.2 y se han obtenido mediante optimacin del ajuste de ambas curvas.
-
256
ANEXO C: FIcwRs
1.0
(LS
0.6
0.4
0.2
0.0
20
40
60
80
tiempo (mm]
Figura (2.34: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/m; Q = 0.25 m/mm; 1 = 20 0C.
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0 10 20 30 40
tiempo [mini
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: ~
Figura (2.35: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo = 0.50 mg/m; Q = 0.50 m/mm; T = 20 U.
257
1.0
0.8
0.6
Q 0.4
0.2
0.0
10
25
tiempo [mm]
Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de fflC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/m; Q = 1.00 ml/mln; T = 20 ~C.
Figura (2.36:
1.0
0.8
0.6
o
0.4
0.2
0.0 0
20
40
tiempo [mm]
60
Figura C.37: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo 0C. para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C~ 1.00 mg/m; Q = 0.25 ml/mm; T = 20
258
ANEXO C:
FIGURAs
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0 5 10
15
tiempo [mini
Figura (2.38: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/m; Q = 1.00 m/mm; T
20(2.
1 .0
0.8
Q) Q
0.6
0.4
0.2
0.0 0 5 lo 15 20 25
tiempo [mm]
Figura (2.39: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma dc HIC en las siguientes condicioncs: (2, 2.50 mg/m; Q = 0.25 m/mm; T = 200(2,
259
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0 5 10 15
tiempo [mm]
Figura (2.40: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: Co = 2.50 mg/m; Q = 0.50 m/mm; T = 20 C.
1.0
0.8
0.6 Q) 0.4
0.2
0.0 0 2 4 6 8 10
tiempo [mm]
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: ~
Figura (2.41: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo = 2.50 mg/m; Q = 1.00 ml/mm; T = 20
O(2
260
1.0
0.8
0.6 Q
(a)
0.4
0.2
0.0 0
2<)
40
60
80
lOO
240
250
tiempo [mini
Figura (2.42: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
1.0
0.8
0.6
o
0.4
0.2
0.0 0 10 20 30 40
50
110 120
tiempo [mm]
Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para 1-a resma de IEC en las siguientes condiciones: C~ 0.50 mg/mi; Q = 0.50 ml/ruin; T = 250(2
Figura (2.43:
261
1.0
0.8
(a)
0.6
0.4
0.2
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 45 60
tiempo [mini
Figura (2.44: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de WC en las siguientes condiciones: C~ = 0.50 mg/m; Q = 1.00 m/mm; T = 25 O(2~
1.0
0.8
0.6
o
u u
0.4
0.2
tiempo [mm]
Figura (2.45: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de [ECen las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/ml; Q = 0.25 m/mm; T = 25 C.
262
1.0
0.8
0.2
0.0 0 10 20 30
40
110 120
tiempo [mini
Figura (2.46: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
para la resma de IEC en las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/mI; Q = 0.50 m/mm; T
25
~(2.
1.0
<18
0.6 Qe 0.4
0.2
0.0 (9 5 lO 15
20 38 40
tiempo [mini
Figura (2.47: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de WC eo las siguientes condiciones: ~ = 1.00 mg/mI; Q = 1.00 ml/mio; T = 25 C.
oryzae
POR ADSORCIN
263
1.0
0.8
0.6
o
0.4
0.2
0.0 0 5 10 15 20 25 30 65 70
tiempo [mini
y calculada mediante el modelo para la resma de WC en las siguientes condiciones: (2~ = 2.50 mg/mi; Q = 0.50 m/mm; T = 25(2
Figura (2.48: Comparacin de la curva de ruptura experimental
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0 2 4 6 8 10 18 20
tiempo [mm]
Figura (2.49: Comparaci de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
264
ANEXO C: FIGURAS
1.0
0.8
(a) (a)
0.4
0.2
0.0 0 5 10 15 20 25 3<) 75 80
tiempo [minI
Figura (2.50: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo
20 C.
1.0
0.8
0.4
0.0
lO
20
30
tiempo [mini
40
50
110 120
oryzae
POR ADSORCIN
265
NOMENCLATURA
A,80:
ABEl-:
Area BET.
Area molecular de contacto ligando-adsorbato en HIC.
AA5:
b:
Parmetro de la isoterma de Langmuir. Concentracin de adsorbato en la fase fluida en el interior de los poros.
C: D~: O~:
DL: OK:
Concentracin de adsorbato en el seno de la fase fluida fuera de las partculas. Difusividad molecular del adsorbato A en la disolucin B. Coeficiente de difusin intracristalino.
dp: Dp:
Coeficiente de difusin en los poros. Aceleracin de la gravedad. Variacin de la energa libre de adsorcin. Variacin de la entropa de adsorcin.
Flujo de adsorbato que atraviesa la capa lmite externa.
0: A0 AH0:
J~.
266
Constante aparente de adsorcin (Ec. 3.4)
NOMENCLATURA
k:
KA:
k1:
K~:
k0:
L:
m:
MA:
MB:
-
concentracin molal. Masa molecular del adsorbato. Masa molecular del disolvente. Presin-Concentracin de adsorbato adsorbida por unidad de masa de adsorbente.
Q:
Caudal. Capacidad mxima del adsorbente. Constante de los gases. Radio de partcula.
0: Variacin de la entropa de adsorcin.
<-ln<
AS
1R~
Tiempo Tiempo de retencin del adsorbato. Tiempo de retencin del trazador. Temperatura. Velocidad intersticial de un fluido.
V:
VA:
y,,.
W: Z 1>:
Z5:
Letras griegas
Parmetro de la isoterma de Freundlich.
e: El,: Porosidad de columna.
Porosidad de partcula. Funcin objetivo (Fc. A.l0). Dimetro interno del lecho.
CF:
CFC.
267
e: e2:
Factor de tortuosidad.
e:
Acrnimos HPLC: Cromatografa lquida de alta eficacia. HIC: IEC: GH: GP: Cromatografa de interaccin hidrofbica. Cromatografa de intercambio inico. Grado de hidrlisis o equivalente de dextrosa. Grado de polimerizacin.