L2.

PREPARAREA s1 STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTURA

Mediile de cultura sunt necesare pentru izolarea si identificarea microorganismelor, pentru testarea caracterelor lor morfologice si fiziologice, pentru analiza apei si a produselor alimentare, in microbiologia industriala si alte activitati. Desi toate microorganismele necesita surse de energie, carbon, azot, fosfor, sulf si diferite minerale, compozitia precisa a mediului de cultura utilizat trebuie corelata cu cerintele nutritionale ale speciei ce va fi cultivata. Mediul de cultura reprezinta un suport nutritiv sterilizat, care permite dezvoltarea unui microorganism in afara nisei ecologice naturale. Un mediu de cultura confine un substrat nutritiv complex, care asigura microorganismului cantitatile necesare de apa, surse de carbon, azot, saruri minerale, factori de crestere, necesare in procesele de crestere si multiplicare si alte functii ale celulei. Mediile de cultura pot fi clasificate dupa mai multe criterii. Dupa complexitatea lor, mediile pot fi: - Medii definite sau sintetice, care au o compozitie bine cunoscuta (folosite in special pentru cultivarea microorganismelor fotolitotrofe auxotrofe) si care contin, in general carbonati sau bicarbonati drept surse de carbon si azotati sau saruri de amoniu drept sursa de azot. Microorganismele chemoorganotrofe heterotrofe pot fi cultivate pe astfel de medii ce contin glucoza ca sursa de carbon si saruri cu azot. lucrarile de cercetare. - Medii de cultura c !"le#e, care contin ingrediente a caror compozitie chimica nu este cunoscuta cu exactitate. ceste medii sunt foarte folosite deoarece sunt suficient de bogate si complete pentru a permite dezvoltarea multor microorganisme. Mediile complexe contin componente cu compozitie aproximativa ca peptonele, extractul de carne si extractul de dro!die. "eptonele sunt hidrolizate proteice preparate prin proteoliza partiala a carnii, cazeinei, fainii de soia, gelatinei sau a altor surse proteice. "eptonele servesc drept sursa de carbon, energie si azot. In functie de destinatia lor, mediile pot fi: Medii de cultura $enerate, care sunt utilizate pentru cultivarea unui numar mare de genuri si specii microbiene. #ele mai cunoscute medii folosite in practica de laborator pentru cultivarea bacteriilor sunt bulionul de came lichid sau gelozat (agarul nutritiv) sau mediul ce contine triptona, extract de dro!die, glucoza si agar. $n scopul cresterii fungilor sunt recomandate mediile continand extract de malt sau extract de cartof, glucozasi agar. Medii de cultura selecti%e care favorizeaza cresterea unor microorganisme particulare. %arurile biliare sau colorantii ca fucsina bazica si cristal violet favorizeaza cresterea bacteriilor cest tip de medii de cultura este utilizat indeosebi in

&ram negative, inhiband cresterea bacteriilor &ram pozitive. Un mediu selectiv folosit la deterrninarea bacteriilor coliforme contine bulion nutritiv, saruri biliare, lactoza si verde briliant, in care sarurile biliare inhiba alte bacterii, in timp ce coliformii sunt adaptati. 'acteriile pot fi selectate, de asemenea, in urma incubarii in prezenta de nutrienti pe care ii utilizeaza in mod specific. De exemplu, un mediu continand celuloza drept unica sursa de carbon poate fi utilizat pentru izolarea bacteriilor celulozolitice. Modalitatile de selectionare a unor grupe de microorganisme sunt nenumarate, iar mediile selective de cultura de asemenea. - Medii de cultura de diferentiere care permit separarea diferitelor grupe de microorganisme in functie de anumite caractere biochimice, precum si identificarea lor. garul cu sange permite realizarea distinctiei intre bacteriile hemolitice si cele nehemolitice. 'acteriile hemolitice (streptococi sau stafilococi izolati din caile respiratorii) produc zone clare in !urul coloniilor, datorita distrugerii celulelor rosii din sange. Daca pe un mediu selectiv s-au izolat, de exemplu, bacterii coliforme, acestea pot fi diferentiate in speciile componente ale grupului pe medii de diferentiere. - Medii de i!& $atire 'f rtifiate( care sunt medii utilizate pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor pretentioase din punct de vedere nutritiv si care se afla in numar mic in produsul ce trebuie analizat. Microorganismul este insamantat in aceste medii de imbogatire (se folosesc chiar medii de preimbogatire) unde se multiplica, dupa care este trecut pe medii selective, iar rezultatul se exprima prin prezenta sau absenta lui. cest tip de medii este utilizat la deterrninarea bacteriilor din genul Salmonella in produsele alimentare. Dupa consistenta lor, mediile de cultura pot fi clasificate in medii: lichide, solide si medii solidificate. Mediile lic)ide sunt utilizate la nivel de laborator pentru cultivarea unor microorganisme anaerobe, microaerofile sau facultativ anaerobe si pentru diferite procese de biosinteza in submers, atat in practica de laborator cat si la nivel industrial. Mediile de cultura s lide sunt utilizate pentru cultivarea in general a microorganismelor Mediile de cultura s lidificate (folosite pentru prima oara de microbiologul german (. aerobe (mai ales mucegaiuri) si pot fi felii de legume, boabe de cereale, rumegus, paine etc. )och) au o mare importanta in practica de izolare, numarare si caracterizare a microorganismelor. *a prepararea acestui tip de medii se utilizeaza agenti de solidificare, dintre care cei mai intrebuintati sunt agarul si gelatina. &elidium. garul (geloza) este un polimer sulfatat compus in special din D-galactoza, +,,-anhidro-*-galactoza si acid D-glucuronic, fiind extras din alge rosii din genul garul se adauga in mediile de cultura de obicei in proportie de -,. - /0 si este eel mai garul se utilizat agent de solidificare deoarece nu este atacat de ma!oritatea microorganismelor.

topeste la temperatura de fierbere a mediului si se solidifica prin racire la 1--1/2#. $n mediu acid la

temperatura de sterilizare isi pierde capacitatea de a forma gel, de aceea sterilizarea mediilor si a solutiilor destinate acidifierii se face separat. Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura proteica, extrasa din tesuturile colagenice. &elatina prezinta dezavanta!ul ca este degradata de microorganismele ce produc enzime proteolitice. 3a se adaugain mediu in cantitate de 4/ -4.g0, si, dupa solubilizare prin fierbere, se solidifica lent prin racire la +--/.2#. $n diferite scopuri se mai utilizeaza si alti agenti de solidificare. De exemplu, silicagelul este utilizat pentru cresterea bacteriilor autotrofe pe medii solidificate in absenta substantelor organice si, de asemenea, pentru detenninarea tipului sursei de carbon pentru bacteriile heterotrofe. $n procesele de biosinteza la nivel industrial se utilizeaza medii de cultura continand diferite componente - deseuri si subproduse ale industriei agroalimentare sau altor industrii, cu pret de cost scazut. stfel de medii de cultura contin, ca surse de carbon - melasa, lactoza din zer, maltoza din malt, dextrine, diferite tipuri de fainuri, cereale, tarate, amidon, hidrocarburi. Dintre sursele de azot, cele mai utilizate in procesele de biosinteza sunt sarurile cu azor, ureea, fainurile de soia, de peste, extractul de porumb, autolizatele de dro!die, hidrolizatele proteice. "entru imbogatirea in saruri minerale se adauga in mediile de cultura fosfa5i, sulfati, clomri, azotati etc. Mediile industriale de cultura mai pot fi suplimentate cu factori de crestere, precursori si inductori ai unor produsi de biosinteza, detergenti (cu rol de emulgatori), agenti de antispumare, antiseptice etc. 6u in ultimul rand, calitatea si compozitia apei reprezinta un factor important al mediilor de cultura. Un mediu de cultura reprezinta un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie sa asigure microorganismelor cantitatea necesara de apa, sursa de carbon, de azot, saruri minerale, factori de crestere, deci care sa le furnizeze substantele si energia necesare in procesele de crestere, reproducere si intretinerea functiilor vitale. Mediul de cultura trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: 7 7 7 7 7 sa corespunda din punct de vedere nutritiv, sa aiba o concentrate a substantelor dizolvate care sa nu influenteze negativ schimburile osmotice ale celulei sa nu contina substante toxice sa aiba un anumit pH sa fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel incat sa se dezvolte numai celulele introduse prin inocul. Sterili*area !ediil r de cultura se poate realiza prin metode fluido-dinamice (filtrare, flotatie, centrifugare, termice, chimice si fizice (unde electroamgnetice)). #ea mai utilizata metoda de sterilizare este sterilizarea cu abur pentru ca este usor de realizat si permite obtinerea unui inalt grad de sterilitate. $nconvenientele procedeului sunt generate de reactiile secundare pe care le sufera componentele mediului de cultura (hidrati de carbon,

aminoacizi, proteine) in timpul sterilizarii si anume: a) b) c) denaturarea proteinelor si inactivarea enzimatica degradarea partiala a vitaminelor si a anumiti factori de crestere supraincalzirile pot initia reactii de oxidare a fenolilor si a acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidratilor de carbon, brumificarea mediului sau de condensare a gruparilor aldehidice din zaharuri reducatoare cu grupele aminice libere din aminoacizi sau proteine. "rodusii rezultati in urma reactiilor secundare sunt toxici pentru ma!oritatea microorganismelor si trebuie ca formarea lor sa fie evitata in timpul sterilizarii. Din acest motiv se recomanda sterilizarea separata a hidratilor de carbon si a compusilor cu azot si amestecarea ulterioara a lor. Mediile de cultura se folosesc in practica de laborator sau in practica industrials si sunt foarte diferentiate in functie de scopul urmarit. $n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obtinerea de culturi pure, pentru intretinerea culturilor selectionate. $n scopuri industriale, mediile de cultura sunt utilizate pentru obtinere de biomasa sau a unor compusi de natura microbiana. #erintele nutritionale ale celulelor de cultura depind de metabolismul lor. Una din ideile de baza, ale logicii viului general valabila pe "amant este ca biochimia tuturor entitatilor vii are la baza chimia carbonului. 6utrientii ce constituie mediul de cultura sunt cunoscuti sub denumirea consacrata de substrate. Dupa aportul in constituienti celulari se numesc si surse de: #, 8, 6, 9, ", microelemente si altele. 3vident ca un substrat poate fi concomitent sursa de # si 6 si similar. $n ceea ce priveste microorganismele, ma!oritatea celor cu aplicatii industriale obtin carbonul celular din compusi organici (de unde denumirea de heterotrofe). "e langa rolul lui esential de constituent ma!or al materialului celular, carbonul din compusii organici este folosit si ca sursa de energie. #a sursa de material celular, car& nul formeaza. cca .-0 din masa celulara uscata a bacteriilor si fungilor. Domeniul compusilor organici cu carbon care pot fi utilizati este vast, iar versatilitatea lumii microbilor se manifests, prin faptul ca toti compusii cu carbon sintetizati sunt la randul lor biodegradabili. :aharurile si in mod special glucoza sunt sursele de carbon si energie cele mai folosite in mediile de cultura ale microorganismelor, dar in functie de necesitatile nutritionale speciale ale altor celule se mai folosesc derivati de zaharuri, alcooli, acizi grasi, acizi organici, hidrocarburi si compusi organici cu azot. *a randul sau a* tul reprezinta ;-410 din masa moleculara uscata a bacteriilor si fungilor. Ma!oritatea microorganismelor pot utiliza in primul rand ionul de amoniu (63U<) ca sursa de 6.

De aceea in ma!oritatea mediilor de cultura de laborator sau industriale se folosesc saruri de amoniu ca sursa. de 6. $n functie de nevoile metabolice existente mai pot fi folosite ca surse de 6 nitratii (desi se acumuleaza adesea nitrati toxici) uneori chiar 6 gazos sau produsi organici cu azot (proteine sau peptide). De obicei mediile de cultura contin o sare de amoniu ca sursa de 6 anorganic si un derivat industrial cu continut de 6 organic. %ursele de 6 organic (derivat de soia, extract de dro!die, extract de porumb, sange uscat, extract de seminte de bumbac, fractii solubile de la distilarea alcoolului si altele) aduc si un aport suplimentar in mediul de cultura de factor= de crestere, ce vor fi prezentati ulterior. %ursa de +idr $en, este de obicei concomitenta cu sursa de # in produsele organice. %unt foarte rare cazurile de folosire a 8 gazos. O#i$enul este prezent si el in toti compusii organici celulari si apa celulara. 3l este obfinut din ma!oritatea compusilor organici ai mediului de cultura, dar in cazul metabolismului aerob este absolut necesar oxigenul din aer. "rezenta , sf rului este esentiala pentru cresterea culturii si pentru o serie de alte procese metabolice, sursa consacrata fiind constituita de fosfati si uneori de unii derivati organici. %ulful se obtine de obicei din sulfati, iar P tasiul (principalul cation al celulei) este introdus de asemenea sub forma de sulfati sau de fosfati. %ursa importanta de Ma$ne*iul este sulfatul respectiv. $n mediul de cultura se introduc adesea !icr ele!ente, solutii de saruri minerale care contin ionii metalici de care au nevoie metaloenzimele din celula. #oncentratiile acestor saruri sunt extrem de reduse in mediu. $n functie de cerintele unor microorganisme se mai introduc vitamine si uneori amino acizi. 9data stabilita formula mediului de cultura in functie de cerintele nutritionale ale celulelor, urmatoarea etapa este prepararea acestuia. 3ste numai aparent o operatie simpla, pentru ca cere totusi elaborarea unei proceduri dedicate, astfel ca fiecare cantitate de mediu preparata sa fie identica cu celelalte, deci asigurarea unui inalt grad de reproductibilitate a compozitiei. ceasta inseamna ca trebuie urmarite cu atentie conditiile de conservare si manipulare a componentelor la temperaturi si umiditate control ate. $n special in cazul mediilor pentru instalatia industrials, protocoalele de lucru trebuie sa contina instructiuni cat mai clare, astfel meat sa se evite producerea unor reactii nedorite intre componentele mediului, cand ingredientele sunt introduse intr-o ordine gresita (se poate a!nnge la precipitarea unor componente, care odata scoase din solutie nu mai sunt accesibile celulelor de cultura, sau la eliminarea unor componente volatile, de exemplu amoniacul> se poate realiza complexarea unor saruri sau reactii de condensare intre componentele organice, mai ales in timpul sterilizarii mediului). 3ste important ca mediul sa fie suficient agitat in timpul prepararii, astfel incat sa se

solubilizeze toate componentele iar limitele de solubilitate ale substantelor sa. fie avute in vedere cu gri!a. Dupa scopul utilizarii lor, mediile de cultura se impart in: medii de cultura generale care asigura dezvoltarea unui mare numar de specii medii de cultura selective care permit dezvoltarea unui numar restrans de microorganisme medii de cultura de diferentiere care permit separarea speciilor in functie de anumite caractere biochimice medii de imbogatire destinate separarii si cultivarii unor microorganisme pretentioase din punct de vedere nutritiv sau care se afla in numar redus medii de conservare medii de cultura industriale. Din punct de vedere al compozitiei chimice, mediile de cultura se impart in + categorii: !edii naturale (empirice) de origine animala sau vegetala, cu o compozitie chimica nedefinita. in mod exact> !edii sintetice- acestea sunt solutii de substante chimice pure in apa. distilata, cu o compozitie perfect determinate> !edii se!i.sintetice- sunt constitute din produse chimice bine definite, dar si din produse de origine naturala (cu compozitie cuno scuta). #onstituent principali ai mediilor de cultura sunt: 1. E#tracte de carne si !acerate ceste produse, comercializate in forma concentrata sub denumirea de ?extracte de carne?, contin in principal proteine putin hidrolizate, glucide, saruri minerale, vitamine hidrosolubile. #ompozitia lor variaza in functie de carnea utilizata pentru preparare. 2. E#tracte de dr /die ceste extracte, comercializate sub forma deshidratata, sunt preparate din dro!dia de bere, nind utilizate ca sursa de aminoacizi si de vitamine liidrosoiubile (vitamine din complexul '). 0. Pe"t ne si )idr li*ate "eptonele reprezinta un amestec de compusi solubili in apa care provin in urma actiunii enzimelor asupra materialului proteic. "ot fl: peptona pepsica din carne, peptona tripsica din cazeina (cu continut crescut in triptofan), peptona pancreatica de cazeina, peptona tripsica de carne, peptona papainica de soia, peptone compuse. 8idrolizatele sunt peptone obtinute in urma actiunii compusilor anorganici asupra proteinelor

(acid clorhidric de ex.). #el mai des intrebuintat este hidrolizatul acid de cazeina, continand aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte. 1. A$ar.a$arul sau $el *a gar-agarul denumit si geloza este un extract de alge rosii ((hodoph@ceae) din genul &elidium si &racilaria, recoltate in marile Aaponiei sau ale 6oii :eelande. %e dizolva in apa la o temperatura in !ur de B-2# si se solidifica sub 1.2#, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultura. 6u este degradat de microorganismele obisnuite. 3ste comercializat in forma sa initiala deshidratata, numit ?agar fibre? (foarte impur), sub forma de paiete (mai putin impur), sau sub forma de pulbere. 6umeroase firme sunt specializate in producerea si comercializarea mediilor de cultura de laborator (firma Difco, MercC, 'ioCar, 9xoid). Mediile fermentative sunt medii de cultura industriale destinate producerii unor cantitati mari de celule sau produsi de metabolism. $n compozitia acestor medii intra ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zaharului si care contine 1. - ..0 zaharoza, diferite tipuri de fainuri, cereale boabe, zer bogat in lactoza, tarate etc. Dintre sursele de azot eel mai des folosite sunt: fainurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ingrasamantul complex. #a saruri minerale se adauga fosfati, sulfati, cloruri etc. "entru cultivarea microorgamsmelor care necesita factori de crestere, se adauga extract de porumb (obtinut prin concentrarea apelor rezultate la inmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de dro!die, extract din radicele de malt si germeni de grau si porumb. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA PE2TRU I2TRETI2EREA 3ACTER+LOR, DRO4DIILOR s1 MUCE5AIURILOR Materiale utili*ate- balanta cu precizie de -,4 g> - pahare 'erzelius> - sita azbest> - agar nutritiv pulbere> - mediu de cultura extract de malt - agar pulbere> - mediu extract de cartof-dextroza-agar pulbere> - eprubete cu dop, sterile> - pipetede l- m*> - flacoane 3rlenme@er> - bec de gaz si autoclav cu gaze.

M d de lucru#onform indicatiilor de pe flacoanele continand mediile de cultura pulverulente, se vor cantari cantitatile necesare pentru a obtine cate 4 litru din fiecare tip de mediu de cultura pentru eprubete si cate +-- m* mediu pentru baloanele 3rlenme@er. $n cazul in care nu exista medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cantarirea componentelor pentru volumul final dorit. Mediul de cultura se aduce la fierbere in paharele 'erzelius de 4 *, pana la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaza cate 4- m* in < eprubete sterile, prevazute cu dop de vata, care se aseaza in cosuri de sarma si se acopera cu hartie. $n mediu se determina p8-ul si, daca este necesar, se a!usteaza la valoarea dorita. Mediile cu agar nu trebuie sa fie aduse la un p8 mai mic de ,, deoarece agarul este partial hidrolizat in timpul sterilizarii la p8 acid si nu se mai solidifica la racire. #and sunt necesare astfel de medii, p8-ul trebuie a!ustat dupa sterilizare. 'aloanele 3rlenme@er se astupa cu dop de vata invelit in tifon, se leaga la gura cu hartie si sfoara. #osurile si baloanele 3rlenme@er se introduc in autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conform instructiunilor afisate langa aparat. %e include capacul autoclavului, se verifica nivelul apei in vasul de nivel, se aprinde gazul si se asteapta aparitia !etului de abur viu care este eliminat prin pur!a. Dupa 4--4. minute de pur!are se inchide robinetul pur!ei, iar presiunea indicata de manometru va urea pana la valoarea 4, unde va fi mentinuta timp de /- min. prin micsorarea flacarii. $ntre presiune si temperatura din autoclav exista o corelatie, asa cum se prezinta in tabelul urmator: Ta&el 2. C relatie intre "resiunea si te!"eratura din aut cla%

Dupa acest interval se opreste gazul, se asteapta scaderea presiunii pe manometru, se deschide pur!a si dupa . minute se poate deschide capacul autoclavei. $n general, mediile de cultura trebuie sa ofere o suprafata de dezvoltare suficienta pentru microorganisme. De aceea, dupa sterilizare tuburile cu mediu se inclina pentru ca sa ramana cu o suprafata mare de crestere. $nclinarea se face prin spri!inirea eprubetelor pe o bagheta suflcient de groasa, tinand seama ca mediul negelificat sa nu ude dopul de vata, ci sa se opreasca la / - + cm de acesta. "rin racire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaza pe peretii mai reci ai eprubetelor si cad sub forma de picaturi pe mediu, adunandu-se pe fundul eprubetei. Din aceasta cauza, eprubetele cu mediul racit nu se aseaza in pozitie orizontala, ci verticals, in cosuri de sarma. cestea se acopera apoi cu o hartie si se leaga cu sfoara. "entru a nu prepara in fiecare zi medii, sau, daca este nevoie de mai multe feluri de medii in acelasi timp, acestea se pregatesc o data si apoi se depoziteaza pentru pastrare. %ticlele cu medii se eticheteaza, notandu-se tipul mediului si data prepararii. "entru evitarea uscarii se recomanda pastrarea mediilor nutritive in frigider. %terilizarea mediului de cultura are ca scop indepartarea organismelor nedorite care pot avea un efect daunator asupra productivitatii. #resterea rapida a contaminantilor poate reduce substantial concentratia nutrientilor disponibili pentru celulele de cultura. Dezvoltarea unor organisme straine poate conduce la consumul masiv al sursei de # si de 6, al unor precursori esentiali, poate limita cantitatea de oxigen solubil in mediu disponibil in cazul bioproceselor aerobe, poate induce si alte modificari daunatoare -modificarea p8-ului, excretia de substante toxice. $n aceste conditii se poate a!unge fie la inhibitia cresterii celulelor de cultura fie la contaminarea si chiar descompunerea metabolitului de interes. numite mucegaiuri contaminante pot produce chiar importante cresteri ale vascozitatii mediului in detrimentul eficientei amestecarii. %terilizarea mediilor se realizeaza in mod uzual prin tratament termic, filtrare, folosirea unor radiatii, tratament chimic sau diverse combinatii ale acestora. Utilizarea radiatiilor si tratamentelor chimice este rara in cazul mediilor industriale. "entru unele componente ale mediilor labile la temperatura, filtrarea sterilizanta prin membrane este cea mai recomandabila. Metoda cea mai folosita pentru sterilizarea mediilor industriale complexe este sterilizarea cu abur sub presiune. Durata acestei sterilizari, ceea ce implica perioada de incalzire treptata si de mentinere a temperaturii de sterilizare sunt de asemenea probleme care trebuie studiate cu gri!a inaintea procedeului industrial, astfel incat sa se asigure atat gradul avansat de sterilizare, cat si conservarea calitatii mediului de cultura. $ncalzirea unor amestecuri complexe de substante chimice, anorganice sau organice la temperaturi mai man de 4/- 2# si pentru perioade mai lungi de /- de minute poate cauza distrugerea unor componente de mediu fie prin degradare termica directa, fie prin producerea unor

reactii nedorite intre componente, disparand eel putin partial unele substraturi si aparand in schimb produse toxice pentru cultura. #onditiile in care are loc sterilizarea pot afecta nu numai stabilitatea componentelor dar de asemenea disponibilitatea lor pentru organismul de cultura. Microelementele de exemplu pot exercita o influenta asupra solubilitatii nutrientilor ma!ori. De asemenea temperatura si durata sterilizarii pot afecta solubilitatea unor componente ale mediului.