Mtodos de Calibrado

Dra. Mara Anglica Snchez Palacios

Se presenta una descripcin matemtica y grfica de los mtodos de calibrado utilizados en un anlisis qumico.

Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Mrida - Venezuela

INTRODUCCIN CALIBRACIN SENCILLA CON ESTNDARES EXTERNOS CALIBRACIN CON ADICIN DE ESTNDARES CALIBRACIN DEL BLANCO CALIBRACIN CON ESTNDAR INTERNO PARMETROS DE CALIDAD DE UN MTODO DE ANLISIS BIBLIOGRAFA

2 3 6 13 14 16 18

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Introduccin En la aplicacin de un mtodo de anlisis qumico, se llevan a cabo una serie de pasos consecutivos con la finalidad de obtener la informacin necesaria. Entre estos se tiene: el muestreo con el objetivo de realizar una seleccin adecuada de la muestra de manera que sea representativa del problema planteado, el tratamiento de la muestra (llevar la muestra a un estado adecuado para el anlisis Ejm., disolver un slido), medicin de la seal analtica de la respuesta instrumental debida al analito, tratamiento de los datos experimentales, y por ltimo la obtencin del resultado. Especficamente en esta gua se discuten los diferentes mtodos de calibrado que se utilizan una vez que se tiene la seal analtica, ya que las concentraciones qumicas de especies de inters, se obtienen a travs de medidas indirectas que se basan en mediciones directas con calibracin. El trmino calibracin, se refiere a la determinacin de la relacin entre la concentracin del analito contenido en un estndar y la respuesta debido a la presencia del analito por la tcnica de medida. Por otra parte, los estndares qumicos usados para la calibracin de una metodologa de un anlisis qumico son en general, sustancias puras, mezclas, disoluciones, gases, aleaciones sustancias biolgicas. Estos estndares tambin son utilizados para determinar factores de recuperacin del mtodo. Los mtodos de calibracin se pueden dividir en dos tipos principales: los que utilizan estndares externos y los que utilizan estndares aadidos a la muestra. Un estndar externo se analiza separadamente de la muestra desconocida y una serie de tales estndares, contiene distintas concentraciones conocidas del analito, junto a la matriz la cual es similar idntica a la de la muestra. En cuanto a los estndares aadidos, se requiere agregar una cantidad conocida del estndar a cada muestra que se analiza. Idealmente, la seal analtica debera representar solo la contribucin del analito, sin embargo, cuando los componentes de la matriz afectan por exceso defecto la respuesta instrumental del analito, estamos en presencia de un efecto de matriz. Los resultados de un anlisis qumico, pueden verse afectados por la presencia de efectos de matriz por errores inherentes al mtodo en estos casos, se requiere la utilizacin de mtodos de calibracin que permitan minimizar y/o eliminar estos inconvenientes. Para la realizacin de un anlisis en el que se presente este tipo de problemas, los mtodos de calibracin sugeridos son la adicin de estndar y de estndar interno. A continuacin se discute cada uno de los mtodos de calibracin reportados en la literatura.

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Calibracin sencilla con estndares externos Este mtodo de anlisis se aplica en la determinacin de un analito, en el cual los componentes de la matriz de la muestra como tambin los reactivos usados en la preparacin de la misma no interfieren en el anlisis, es decir no se tiene un efecto de la matriz en la seal medida. Tambin se puede emplear en condiciones tales que la contribucin de los interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se puede realizar la oportuna correccin del error determinado por el interferente. Los estndares de calibrado seleccionados deben aproximarse tanto en la concentracin del analito como en su composicin de los diferentes componentes qumicos, presentes en la matriz de la muestra. Este requerimiento es aplicado en todos los mtodos de calibracin propuestos. Ejemplo 1: Se tienen tres muestras de agua potable A, B y C de 10 mL cada una, en la cual se debe cuantificar la cantidad de cobre presente por absorcin atmica. Para ello, la muestra es filtrada, acidificada con cido ntrico y se diluye a un volumen final de 25 mL. Posteriormente, se mide la respuesta instrumental de cada muestra de agua. Adicionalmente, se prepara una serie de patrones de Cu en agua destilada y deionizada que tambin se acidifica y se mide su respuesta instrumental junto con una solucin blanco (solucin que no contiene analito). Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1. Tabla 1. Resultados obtenidos con una serie de estndares de Cu y la solucin blanco. Cu (mg/L) 0 1 2 3 4 5 6 7 Respuesta instrumental 0,001 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Una vez que se calibra el instrumento, utilizando los estndares y aplicando el mismo procedimiento, se miden las muestras de agua y se registran los resultados que se presentan en la tabla 2.

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Tabla 2. Resultados del anlisis de las muestras de agua. Muestra A B C Respuesta instrumental 0,39 0,45 0,41

Tanto los resultados obtenidos de las seales medidas correspondientes a las soluciones estndares como a las muestras, deben corregirse utilizando la medida del blanco. Luego se procede a realizar el anlisis estadstico de la data experimental y la grfica correspondiente. A partir de la grfica 1, se observa que la relacin entre la respuesta instrumental y la concentracin de los estndares de cobre, muestran una relacin lineal indicativo de que la respuesta instrumental es directamente proporcional a la concentracin. Por ello, es posible relacionar la respuesta del instrumento con el contenido de Cu en las muestras de agua, y la cual puede expresarse por la ecuacin (1) : Seal analtica (y) = constante x concentracinestndares + SealBlanco (Ec.1) Por mnimos cuadrados se obtiene: Constante = 0,1 seal analtica/concentracin Intercepto=5,5 E-17 seal analtica Sustituyendo estos valores en la Ec.1 se obtiene Seal (y) = 0,1 x concentracin de Cu (mg/L) + 5,5E-17, la cual se utiliza para determinar las concentraciones de Cu en las muestras de agua potable analizadas, y que se presentan en la tabla 3.

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0.8
y = 0,1x + 5,5E-17 R = 1

Seal Analtica

0.6

0.4

0.2

0 0 1 2 3 4 5 6 7

Concentracin de Cu (mg/L) Figura 1. Curva de calibracin sencilla para cobre.

Tabla 3. Resultados del anlisis de las muestras de agua en concentracin**. Nmero muestra A B C Cu (mg/L) 9,75 11,25 10,25

**Obtenidos aplicando el factor de dilucin, al cual se someti inicialmente las muestras de agua.

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Calibracin con adicin de estndares La preparacin de estndares que reproduzcan la composicin de la muestra es muy complicada cuando se trata del anlisis de muestras complejas (suelos, minerales, sangre completa, orina, etc.) ya que en este tipo de muestras, usualmente, los componentes de la matriz afectan las medidas de la seal analtica ya sea por exceso o por defecto. Por ello, es imposible compensar un blanco distinto de cero. Con el objetivo de minimizar los efectos de la matriz, se utiliza el mtodo de adicin de estndar el cual consiste en la adicin de un volumen fijo de la muestra, a las soluciones estndares diluyendo a un volumen final constante. Posteriormente, se procede a determinar la seal de los estndares as como de una muestra preparada de la misma forma, en ausencia de estndar aadido. En cada solucin, las seales son afectadas de manera similar por los interferentes de la matriz. En general, con este mtodo se obtienen intervalos lineales de concentracin de trabajo muy estrechos (menos de un orden de magnitud) originados por los complicados efectos qumicos de los componentes de la matriz. Este mtodo no elimina las interferencias, solo las compensa ya que se obtienen todas las seales analticas bajo las mismas condiciones. El procedimiento que se lleva a cabo para la aplicacin de este mtodo, consiste en la seleccin de alcuotas de un volumen fijo de muestra (VM) a las cuales se les aaden volmenes variables de un estndar (V S) de concentracin conocida (CS) diluyendo a un volumen final fijo (VT). Existen varios procedimientos matemticos, que pueden aplicarse para el tratamiento de los resultados obtenidos cuando se aplica el mtodo de adicin de estndar y que se describirn a continuacin.

Si se cumple una relacin lineal entre la seal analtica y el volumen del estndar aadido (VS), se tiene para la muestra (SM) sin adicin de estndar que: (Ec.2) Donde: k corresponde a una constante de la curva de calibrado y CM a la concentracin del analito en la muestra. Por otra parte, para una alcuota de muestra con adicin de estndar la seal total (SM+S) viene dada por la siguiente expresin:
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(Ec.3) A partir de la Ec.3 una grfica de la SealM+S en funcin de VS es una lnea recta con pendiente e intercepto igual a:

Al dividir la expresin del intercepto entre la expresin de la pendiente, se obtiene la ecuacin 4, a partir de la cual se determina la concentracin del analito en la muestra. Para la deduccin de esta expresin ya se considero el factor de dilucin. As que C M corresponde en este caso a la concentracin de la muestra directamente. (Ec.4)

Tambin se puede graficar la seal analtica en funcin de la concentracin del estndar aadido para el cual la relacin matemtica, para una alcuota de la muestra sin adicin de estndar es: (Ec. 5) Mientras que para una alcuota de la muestra con estndar aadido la relacin matemtica que se cumple es: (Ec.6) En este caso de la Ec. 6 se tiene que:

A partir del cociente del intercepto entre la pendiente se obtiene la Ec.7 y de la que se puede determinar la concentracin de la muestra: (Ec.7) En este caso la CM que se obtiene con la Ec.7 corresponde a la muestra diluida, ya que todos los estndares con lo que se realiza la curva de calibrado fueron medidos en el volumen final de dilucin. Siendo necesario considerar el factor de dilucin para obtener el valor real de CM.

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(Ec. 8)

Adicionalmente, cuando se tiene un gran nmero de muestras para analizar, es posible realizar la determinacin usando solo dos soluciones, una que corresponde a la muestra sin adicin de estndar y otra con adicin de estndar. Es necesario indicar que previo a la aplicacin de este tipo de calibrado, se debe investigar el intervalo de linealidad del mtodo de anlisis de tal manera, que los resultados estn dentro del rango de linealidad. En este caso se pueden seguir dos procedimientos experimentales, en el primero la muestra problema a la cual se le mide la respuesta instrumental en ausencia de estndar esta en un volumen total que solo corresponde al volumen de muestra (VM). Luego se le agrega a la solucin de la muestra un volumen de solucin estndar (V S) de concentracin conocida (Cs) de tal forma que el volumen final (V f) en la muestra con adicin de estndar corresponde a la suma de Vs+ VM. Las expresiones matemticas en este caso vienen dadas por las ecuaciones siguientes: (Ec. 9) Para muestra (Ec. 10) Para la muestra en presencia del estndar aadido Donde CMf=CMi*VM/Vf y Csf=Cs*Vs/Vf Dividiendo la ecuacin 9 entre la ecuacin 10, reordenando, multiplicando y dividiendo por ST, finalmente se obtiene: (Ec. 11)

Un segundo procedimiento que ser puede llevar a cabo, implica la dilucin de la muestra en ausencia de estndar y la muestra en presencia del estndar a un volumen final constante (VT). Las expresiones matemticas que relacionan la seal con la concentracin vienen dadas en este caso por las Ec. 2 y 3. Dividiendo la ecuacin 3 entre la ecuacin 2, reordenando, multiplicando y dividiendo por S M, finalmente se obtiene: (Ec.12)

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Por otra parte, se puede graficar la respuesta instrumental en funcin de la concentracin del salpicado, para el cual la relacin matemtica para una alcuota de la muestra con adicin de estndar viene dada por la Ec. 3, multiplicando y dividiendo esta ecuacin por el volumen de muestra (VM) se obtiene:

(Ec. 13)

Donde,

, sustituyendo esta expresin en la Ec. 13 se tiene:

(Ec. 14) A partir de la Ec. 14 se obtiene que:

A partir del cociente del intercepto entre la pendiente se obtiene la Ec.15 y de la que se determina directamente, la concentracin de la muestra: (Ec.15) Ejemplo 2: Para la determinacin de aluminio en muestras de agua de ro, se utiliz el mtodo de adicin de estndar. En todos los casos se empleo un volumen de muestra de 10 mL a las cuales se les adiciono una solucin patrn (S) de aluminio 0,15 mM. Por ltimo, todas las soluciones se diluyeron a un volumen final de 25 mL, y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 4.

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Tabla 4. Resultados obtenidos para la determinacin de aluminio en agua de rio. Solucin Muestra Muestra + 2 mL de S Muestra + 4 mL de S Muestra + 6 mL de S Seal analtica 5,0 10,1 15,1 20,0 Cs x10-5, M 0 1,2 2,2 3,6 Csalpicadox10-5, M 0 3 6 9

Determine la concentracin de Al en la muestra a partir de: a) Una grfica de la seal, en funcin de la concentracin del estndar. b) Una grfica de la seal, en funcin del volumen del estndar aadido. c) Una grafica de la seal, en funcin de la concentracin del salpicado.

Tabla 5. Resultados estadsticos de la regresin lineal para cada tipo de grfico. Tipo Grfica Seal f(Cs) Seal f(Vs) Seal f(Csalpicado) pendiente 416.666 Seal/M 2,5 Seal/M 166.666 Seal/M intercepto 5,05 Seal 5,05 Seal 5,05 Seal Coeficiente de correlacin (R2) 0,999 0,999 0,999

Solucin: a) Aplicando la Ec.(8) se obtiene que C M=3,03E-5 M. b) A partir de la Ec. (4) se obtiene que C M=3,03E-5 M. c) Empleando la Ec. (13) se obtiene que C M=3,03E-5 M.

En la figura 2 se muestra la curva de calibracin con adicin de estndar, donde se grfica la seal analtica respuesta instrumental en funcin de la concentracin del estndar aadido de aluminio. A partir de esta grfica, se observa que extrapolando hasta el punto en el cual la lnea de tendencia corta en el eje x, se obtiene la concentracin del analito en la muestra problema. En este caso CM es 1,21E-5 M y aplicando el factor de dilucin se obtiene que CM=3,03E-5 M.

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10

20

15 Seal Analtica y=416.666x +5,05 R2=0,999

10

5 CM -1.3

0 -0.3 0.7 1.7 2.7 3.7 Concentracin del estndar aadido de Al xE-5,M Figura 2. Curva de calibracin con adicin de estndar para aluminio.

Tambin se puede realizar la curva de calibrado con adicin de estndar sobre una nica alcuota de muestra, a la cual se van aadiendo progresivamente, volmenes variables del estndar, y luego de cada adicin de estndar se realiza la medida de la seal. En este caso para la muestra sin adicin de estndar, la relacin de la seal analtica con la concentracin puede expresarse por la Ec.5, mientras que para la muestra con adicin de estndar: (Ec.16)

Donde, V0 es el volumen inicial de la muestra y V es el volumen final luego de cada adicin de estndar. Despejando k en la Ec.5 sustituyndola en la Ec.16 y multiplicando a ambos lados de la ecuacin resultante por V/V0 finalmente se obtiene:

(Ec.17)

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A partir de una grfica de la SealM+S* V/Vo versus Cs(Vs/V0) se obtiene una lnea recta con:

Ejemplo 3: Al reaccionar el perxido de hidrgeno con el luminol, se observa que la intensidad de quimioluminiscencia del luminol es proporcional a su concentracin inicial. Para determinar la concentracin del luminol en una muestra, se preparo una curva de adicin de estndar a volumen variable, con un volumen inicial de muestra de 25 mL, y utilizando una solucin patrn de luminol 0,525 M se obtuvieron los resultados presentados a continuacin: Vs, L 0 100 200 300 400 Seal analtica 102 185 250 325 415 Cs, M (Si V=cte) 0,0000 0,0021 0,0042 0,0062 0,0083 Seal*V/V0 102,00 185,74 252,00 328,90 421,64 Cs*Vs/V0 0,0000 0,0021 0,0042 0,0063 0,0084

Determine la concentracin de luminol en la muestra problema asumiendo: a) Volumen constante e igual a 25 mL. b) Volumen variable.

Tabla 6. Resultados estadsticos de la regresin lineal para cada tipo de grfico. Tipo Grfica Seal f(Cs) Seal*V/V0 f(Cs*Vs/V0) pendiente 36.476,19 Seal/M 37.259,05 Seal/M intercepto 102,2 Seal 101,6 Seal Coeficiente de correlacin (R2) 0,999 0,999

Solucin: a) Aplicando la Ec. 7 se obtiene que C M=0,00280 M. b) Usando la definicin de pendiente de la Ec. 17 se obtiene que CM=0,00274 M.

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Calibracin del blanco Se ha propuesto en la literatura que cuando se utiliza la curva de calibrado con adicin de estndar, es conveniente la realizacin de una curva de calibrado para el blanco, en la cual estn incluidos todos los reactivos y la solucin patrn a diferentes concentraciones, excepto la muestra. La finalidad de este tipo de calibrado es comprobar la contribucin real de los reactivos a la seal del analito. En este caso el intercepto en el eje x, corresponde al contenido de analito en los reactivos. Posteriormente, se deben comparar los parmetros estadsticos de la curva de regresin de calibrado del blanco, con los obtenidos de la curva de regresin de adicin de estndar y corregir la concentracin del analito en la muestra, usando el blanco medido.

14 Respuesta Instrumental 12 10 8

y= 1,07 x + 0,40 CM=b/m=0,37 Curva blanco Curva adicin estndar y=1,77 x + 1,29 C =b/m=0,73 M

6
4 2 0 -1.5 -0.5 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 Concentracin analito
CM=0,36 unidades concentracin

Figura 3. Comparacin de la curva de calibracin con adicin de estndar y la curva para el blanco.

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Calibracin con estndar interno La calibracin con estndar patrn interno se utiliza para compensar errores aleatorios y sistemticos como interferencias no espectrales de componentes de la matriz, fluctuaciones debidas del mtodo y errores instrumentales .Entre estas se tiene; variacin de la velocidad de nebulizacin, del tamao de gota, fluctuaciones de las presiones gaseosas, de la viscosidad y tensin superficial. Se aplica este mtodo en tcnicas instrumentales que permitan la determinacin multielemental. Se selecciona como estndar interno, una sustancia diferente del analito que presente propiedades similares a las del analito, tal que ambos sean afectados similarmente durante el anlisis. Tambin puede seleccionarse un componente mayoritario que este presente en la muestra, y el cual se adiciona a los patrones a elevada concentracin para considerarse constante. La matriz debe estar libre de estndar interno. El paso ms importante en este mtodo, es la seleccin adecuada del estndar interno. Considerando que se determina la intensidad de emisin de una analito (I A) y un patrn interno (IP) a concentraciones determinadas (CA y CP) y conocidos los valores de energa necesaria para que transcurra la transicin electrnica respectiva ( EA y EP) al medir la relacin de intensidades IA/IP; s se cumple que EPEA el segundo trmino de la Ec. 18 tiende a uno y la relacin de intensidades es independiente de la temperatura. (Ec.18) = constante de proporcionalidad.

La aplicacin de este mtodo consiste en realizar medidas simultneas de la respuesta del instrumento al analito y al estndar interno. El estndar interno, se aade en una cantidad conocida y constante a la muestra, y a los estndares del analito. En la grfica de calibrado se representa la relacin Seal analito/Seal de estndar interno en funcin de la concentracin del analito en los estndares. De esta manera la respuesta del instrumento o la seal analtica es independiente, de la fluctuacin debida al mtodo de anlisis. Para la muestra la relacin entre la seal (SealM) y la concentracin (CM) viene dada por: (Ec. 19) Similarmente, para el estndar interno se tiene: (Ec. 20) Dividiendo la Ec.19 entre la Ec 20 se obtiene:
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(Ec. 21) Donde, f corresponde al factor de respuesta f=kM/kEI este debe ser constante en un determinado intervalo de concentracin. Adems, f tambin viene dado por el producto de la pendiente de la curva de calibrado por la concentracin del patrn interno, cuando se grfica la relacin de las seales versus la concentracin del estndar. Mientras que si se grfica la relacin de las seales versus la relacin de las concentraciones, la pendiente es directamente el factor de respuesta. Re-escribiendo la Ec. 21 en trminos de los estndares del analito (CS, SealS), se tiene la expresin que describe la curva de calibrado, dada por: (Ec. 22)

Ejemplo 4: En la determinacin de benceno (C6H6) por cromatografa usando como detector la espectroscopia de masa, se utilizo el benceno deuterado (C6D6) como patrn interno, ambos salen casi al mismo tiempo y se obtuvieron los resultados siguientes: Solucin 1 2 3 (C6H6), ppm 1,0 5,0 10,0 (C6D6), ppm 10,0 10,0 10,0 Seal (C6H6) 304 3520 3025 Seal (C6D6) 2992 6145 2819

a) Determine el factor de respuesta del mtodo. Solucin: Utilizando la Ec. 21 se obtiene que el factor de respuesta promedio f=1,08. Tambin aplicando mnimos cuadrados se obtiene que la pendiente de la figura 4, es 0,108 y multiplicando por la concentracin del patrn interno se tiene que el factor de respuesta es 1,08.

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1.2

Seal C10H8/Seal C10D8

0.9

y=0,108x + 0,009

0.6

0.3

0 0 3 6 9 12

Naftaleno, ppm Figura 4. Curva de calibracin de estndar interno.

Parmetros de calidad de un mtodo de anlisis

Precisin: indica la concordancia o reproducibilidad entre datos obtenidos de la misma forma, mide el error aleatorio o indeterminado de un anlisis. Estadsticamente, la precisin de un mtodo se describe mediante trminos como; la desviacin estndar absoluta (s), desviacin estndar relativa (RSD) y la varianza (s2). Exactitud: describe la veracidad de un resultado experimental y requiere el anlisis de un material estndar de referencia para comprobar la exactitud de un mtodo. De esta forma se cuantifica el error sistemtico o determinado. Se mide estadsticamente mediante el error absoluto o el error relativo. Sensibilidad del mtodo (m): indica la capacidad de un mtodo de anlisis para discriminar entre pequeas variaciones de concentracin del analito. Para la evaluacin de este parmetro, se determina la pendiente de la curva de calibracin siendo muy importante la precisin del mtodo. Entre dos mtodos de anlisis que presenten igual pendiente, el ms sensible es aquel que presente la mayor precisin de los datos obtenidos. Lmite de deteccin (LOD): se refiere a la mnima concentracin de analito que se puede detectar para un nivel de confianza dado, mediante la aplicacin de un mtodo de anlisis.
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Matemticamente, se define como el cociente de tres veces la desviacin estndar de la medida del blanco ( b) entre la pendiente (m) de la curva de calibracin.

Lmite de cuantificacin (LOQ): indica la mnima concentracin de analito con que se puede realizar medidas precisas. Matemticamente, se define como el cociente de diez veces la desviacin estndar de la medida del blanco ( b) entre la pendiente (m) de la curva de calibracin.

Lmite de respuesta lineal (LOL): se refiere a la concentracin de analito a partir de la cual la curva de calibracin no presenta un comportamiento lineal con respecto a la seal analtica. Intervalo de linealidad: seala el intervalo til de trabajo de un mtodo analtico y el cual va desde el lmite de cuantificacin al lmite de respuesta lineal. Masa caracterstica (m0): corresponde a la masa o concentracin de analito que presenta una absorcin del 1% lo que equivale a una absorbancia de 0,0044. Este parmetro permite comparar la sensibilidad para un elemento medido bajo determinadas condiciones. Selectividad: muestra el grado de ausencia de interferencias debido a otras especies presentes en la matriz de la muestra. Se cuantifica mediante la obtencin de la sensibilidad del mtodo frente al analito (mA) y al interferente (mB). La seal total (S) viene dada por la expresin:

Donde, CA y CB corresponde a la concentracin del analito y del interferente, respectivamente y Sbl es la seal del blanco. De esta manera se define el coeficiente de selectividad de B con respecto a A como:

El coeficiente de selectividad es una medida de la respuesta relativa del mtodo para la especie B cuando se compara con A.

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Bibliografa D. A. Skoog y J. L. Leary, "Anlisis Instrumental", 4ta Edicin, McGraw-Hill, Espaa 1993. D. Skoog, D. West, J. Holler y S. Crouch, Fundamentos de Qumica Analtica, 8ta Edicin, Thomson Mxico, 2005. B. Welz, Atomic Absorption Spectrometry, 2da Edicin, VCH, Alemania, 1985. D. C. Harris, Anlisis qumico cuantitativo, 6ta Edicin, Reverte, Espaa 2007. Galen W. Ewing, Instrumental methods of chemical analysis , 2da Edicin, McGrawHill, New York, 1960.

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