Proceso analtico general:

1. Plantear el problema
2. Seleccionar los procedimientos analticos
3. Muestreo
4. Preparacin de la muestra
5. Anlisis
6. Informe e interpretacin
7. Sacar conclusiones


1.- Plantear el problema
Convertir las cuestiones generales en cuestiones especficas de modo que
puedan contestarse mediante medidas qumicas.

2.- Seleccionar el procedimiento analtico
Buscar en la bibliografa procedimientos apropiados o, si es necesario, poner a
punto procedimientos originales para llevar a cabo las medidas requeridas.

3.- Muestreo
Obtener una muestra bruta representativa del lote.

4. Preparacin de la muestra

Extraer una muestra homognea de laboratorio a partir de la muestra bruta.

Convertir la muestra de laboratorio en una forma adecuada para el anlisis, lo
que normalmente significa disolver la muestra. Si las muestras tienen una
concentracin baja de analito, puede ser necesario concentrarlas antes del
anlisis.

Enmascarar o eliminar las especies que interfieren en el anlisis.

5.- Anlisis

Medir la concentracin del analito en varias alcuotas. La finalidad de hacer
medidas replicadas (medidas repetidas) es establecer la variabilidad
(incertidumbre) del anlisis, y evitar el riesgo de un error grave si se analizara
una nica alcuota. La incertidumbre de una medida es tan importante como la
medida misma, porque nos dice lo fiable que es la medida. En caso necesario,
hay que aplicar mtodos analticos diferentes a muestras parecidas para
asegurar que todos los mtodos dan el mismo resultado y que la eleccin del
mtodo analtico no afecta al resultado. Tambin se pueden tomar y analizar
varias muestras brutas diferentes para ver que variaciones se presentan en
funcin del procedimiento de muestreo.

6.- Informe e interpretacin

Dar un informe completo de los resultados, indicando las limitaciones concretas
de estos. El informe puede escribirse para que lo lea solo un especialista (como
el director del laboratorio), o puede ser escrito para un destinatario general
(pblico en general). Hay que asegurarse de que el informe es apropiado para el
destinatario previsto.

7.- Sacar conclusiones

Una vez que se ha escrito el informe, el analista puede o no estar implicado en lo
que se vaya a hacer con la informacin, como modificar la materia prima de una
factora o crear nuevas para la regulacin de aditivos en alimentos. Cuanto ms
claro se escriba un informe, menos probable es que sea mal interpretado por los
que lo usen. El analista debe tener al menos la responsabilidad de asegurar que
las conclusiones sacadas de sus datos sean consistentes con ellos.

El Proceso Analtico General en un ejemplo: contenido de cafena en una
tableta de chocolate

El chocolate ha sido la salvacin de muchos estudiantes durante las largas noches que
preceden a los exmenes. Una buena tableta de chocolate, preparada con un 33% de grasa y
un 47% de azcar, nos puede adems suministrar energa para practicar deportes. Por otro
lado, adems de su alto contenido energtico, el chocolate aporta el estimulante cafena y su
precursor bioqumico la teobromina.


Demasiada cafena es perjudicial para muchos y algunos ni siquiera la toleran en pequeas
cantidades. Cunta cafena hay en una tableta de chocolate? Contiene el chocolate ms o
menos cafena que el caf o las bebidas refrescantes?. Es necesario ser capaces de resolver
problemas qumicos como el planteado, que nos sirva de base para abordar otros problemas
que se nos presenten en nuestra prctica diaria en el laboratorio. Por tanto procuraremos dar
respuesta qumica a la pregunta:

Cmo se determina el contenido en cafena de una tableta de chocolate?
Planteamiento general del problema

Para resolver un problema como el que se ha planteado sobre la cafena, se empieza
consultando en la biblioteca los mtodos para analizar cafena en chocolate. Mediante una
bsqueda por ordenador, a travs del Chemical Abstracts, y usando "cafena" y "chocolate"
como palabras clave, se pueden descubrir numerosos artculos en revistas de qumica. Uno
de ellos, titulado "Determinacin de teobromina y cafena en productos del cacao y chocolate
por cromatografa de lquidos de alta presin (HPLC)", describe un proceso analtico que
parece particularmente apropiado para el equipamiento disponible en un laboratorio.

Preparacin de la muestra

El primer paso del procedimiento consiste en pesar una cantidad de chocolate y eliminar la
grasa extrayndola en un disolvente hidrocarbonado. Es preciso eliminar la grasa porque
interfiere en un paso ulterior del anlisis (la cromatografa). Desgraciadamente, si se agita un
trozo de chocolate con un disolvente, la extraccin no es muy efectiva porque el disolvente no
penetra en el interior del chocolate. Por eso, lo razonable es trocear el chocolate en pequeos
trozos y colocarlos en un mortero provisto de maza (Figura 1) para triturar el slido en
pequeos fragmentos.

Ahora bien, este slido es demasiado blando y pastoso para que pueda ser triturado. Una
alternativa es introducir el mortero y su maza junto con los trozos de chocolate en un
congelador. Una vez congelado, el chocolate se vuelve quebradizo y puede triturarse en el
mortero fro. A continuacin se colocan las partculas de chocolate en un tubo de centrfuga,
previamente tarado, de 15 mililitros (ml) y se pesa.

La Figura 2 describe la sucesin de pasos del procedimiento experimental. Se aade al tubo
una porcin de 10 ml de disolvente orgnico (ter de petrleo), y se cierra el tubo con un
tapn. Se agita el tubo vigorosamente para disolver la grasa del chocolate. La cafena y
teobromina son insolubles en este disolvente. Al hacer girar la suspensin en la centrfuga las
pequeas partculas de chocolate se depositan en el fondo del tubo. El lquido clarificado que
contiene la grasa disuelta puede decantarse (verterse) y desecharse. La extraccin con
nuevas porciones de disolvente se repite dos veces ms para asegurar la eliminacin
completa de la grasa en el chocolate. El disolvente residual en el chocolate se elimina
finalmente calentando el tubo de centrfuga en un vaso con agua hirviendo. Pesando el tubo
de centrfuga ms su contenido del residuo de chocolate desengrasado, se puede calcular la
masa del residuo de chocolate por diferencia con la masa conocida del tubo vaco.



Figura 2. Extraccin de la grasa del chocolate para obtener un residuo slido desengrasado para el anlisis posterior

Las sustancias que se determinan cafena y teobromina en este caso se denominan
analitos. El siguiente paso en el procedimiento de preparacin de la muestra es la
transferencia cuantitativa (completa) del chocolate desengrasado a un matraz erlenmeyer, y
disolver los analitos en agua para proceder al anlisis qumico. Si no se transfiriese todo el
residuo del tubo al matraz, el anlisis final sera errneo porque no estara presente todo el
analito. Para lograr una transferencia cuantitativa se aaden unos pocos mililitros de agua
pura al tubo de centrfuga y se agita, y se calienta para disolver o suspender todo el chocolate
posible. La suspensin del slido en el lquido se pasa del tubo a un matraz de 50 ml. Este
procedimiento se repite varias veces, con nuevas porciones de agua pura, para asegurar que
hasta la ltima partcula de chocolate pase del tubo de centrfuga al matraz.
Para completar la disolucin en agua de los analitos presentes en el residuo de chocolate, se
aade agua hasta un volumen de aproximadamente 30 ml. El matraz y su contenido se
calientan en un bao de agua hirviendo para extraer toda la cafena y teobromina del
chocolate. Para calcular despus la cantidad de analito es preciso conocer exactamente la
masa total de disolvente (agua). Para ello, puesto que se conoce la masa del residuo de
chocolate que haba en el tubo de centrfuga, basta haber medido previamente la masa del
matraz erlenmeyer vaco y aadir el agua al matraz una vez fro gota a gota hasta una masa
exactamente medida (p. ej. 33,3 g). Ms tarde, se compara la disolucin desconocida as
preparada con disoluciones de concentracin conocida de analito.

Antes de inyectar la disolucin desconocida en un cromatgrafo para hacer el anlisis
qumico, se tiene que purificar an ms la muestra (Figura 3).


Figura 3 Centrifugacin y filtracin para separar el residuo slido interferente de la disolucin de analitos

La suspensin de chocolate en agua contiene pequeas partculas slidas que obturaran la
columna cromatogrfica, que tiene un coste elevado, y la estropearan. Por tanto, se pasa una
porcin de la suspensin a un tubo de centrfuga, y se centrifuga la mezcla para depositar en
el fondo del tubo la mayor parte del slido. El lquido sobrenadante (el lquido sobre el slido
depositado), que an es turbio y oscuro, se filtra a travs de una membrana de tamao de
poro 0,45 micrmetros (0,45 10-6 metros, m) con objeto de eliminar las partculas ms
diminutas del slido. Es muy importante evitar que se inyecten slidos en la columna de
cromatografa. Por ello, si el lquido queda an turbio, es preciso repetir la centrifugacin y
filtracin varias veces ms. En cada ciclo el lquido sobrenadante se filtra y centrifuga,
hacindose cada vez un poco ms claro. Pero puede darse el caso de que nunca acabe de
quedar completamente claro, y que al dejarlo en reposo, vuelva a formarse algo de precipitado
en la disolucin filtrada. En ocasiones habr que ser realista y, dado el tiempo disponible,
emprender el anlisis.

Figura 4. Fundamento de la cromatografa lquida (a) Cromatografa con un detector ultravioleta (UV) para detectar
los analitos a la salida de la columna. (b) Separacin de la cafena y teobromina por cromatografa. La cafena es ms
soluble que la teobromina en la capa de hidrocarburos depositada sobre las partculas de la columna. Por tanto la
cafena se retiene ms fuertemente y pasa a travs de la columna ms lentamente que la teobromina.

Los analitos se detectan a la salida de la columna por su capacidad de absorber radiacin UV.
A medida que cada compuesto sale de la columna, absorbe la radiacin emitida por la
lmpara de la figura 4a, disminuyendo as la radiacin que llega al detector. La grfica de la
respuesta del detector frente al tiempo se denomina cromatograma (Figura 5). Los picos
mayores del cromatograma son de teobromina y de cafena; los picos pequeos corresponden
a otros componentes del extracto acuoso del chocolate.

El cromatograma solo nos informa sobre los compuestos que hay en la muestra. Si no
conociramos de antemano lo que esperamos, necesitaramos un gran esfuerzo para
identificar los picos del cromatograma. Una manera de identificar cada uno de los picos es
medir las caractersticas espectrales a medida que emergen de la columna. Otra manera es
aadir cantidad conocida de cafena o teobromina a la muestra desconocida y ver si alguno
de los picos aumenta de tamao.








Figura 5. Cromatograma de 20 microlitros de un extracto de chocolate negro.
La columna de 4,6 mm de dimetro por 150 mm de longitud, y rellena con partculas de ODS de 5 micras, se eluye (se
lava) con una mezcla agua:metanol:cido actico (79:20:1 en volumen) a una velocidad de 1 ml/min.

La identificacin de una muestra desconocida se llama anlisis cualitativo. Y la
determinacin de cunto hay presente, anlisis cuantitativo. La mayor parte de los anlisis
corresponden al anlisis cuantitativo.

En la Figura 5, el rea debajo de un pico es proporcional a la cantidad del componente que
pasa por el detector. La mejor manera de medir el rea (integracin) es con un ordenador que
recibe la salida del detector durante el proceso cromatogrfico. Cuando no se dispone de
ordenador en el cromatgrafo, en su lugar se puede medir la altura de cada pico.

Curvas de calibrado

En cromatografa, dos analitos de igual concentracin suele dar diferentes respuestas del
detector. Por consiguiente, la respuesta del detector debe medirse frente a concentraciones
conocidas de cada analito. La grfica que representa la respuesta del detector en funcin de
la concentracin del analito se llama curva de calibrado o curva estndar. Para construir una
curva de calibrado se preparan disoluciones estndar, de concentraciones conocidas de
teobromina o cafena puras, se inyectan en la columna, y se miden las alturas de los picos que
resultan. La Figura 6 es un cromatograma de una de las disoluciones estndar, y la Figura 7
muestra las curvas de calibrado cuando se inyectan disoluciones que contienen 10,0, 25,0,
50,0 100,0 microgramos de cada analito por g de disolucin.



Las rectas trazadas a travs de los puntos experimentales del calibrado pueden usarse luego
para hallar las concentraciones de teobromina y cafena en una muestra desconocida. Por
ejemplo, la Figura 7 muestra que si la altura del pico observado de teobromina en una
disolucin desconocida es 15,0 cm, la concentracin de la disolucin es 36,9 microgramos por
gramo (ppm).


Interpretacin de los resultados

Una vez conocido el contenido de analito en el extracto acuoso del chocolate se puede
calcular la cantidad de teobromina y cafena que hay en el chocolate de partida.
En la Tabla 1 se muestran los contenidos de cafena y teobromina en chocolate negro y
blanco. Las cantidades encontradas en chocolates blancos son slo de alrededor de un 2% de
las encontradas en los negros.

La tabla proporciona tambin la desviacin estndar de 3 medidas replicadas por cada
muestra. La desviacin estndar, es una medida de la reproducibilidad de los resultados. La
desviacin estndar debe compararse con el valor medio al que se aplica.
Si tres muestras tienen resultados idnticos, la desviacin estndar sera 0. Si la desviacin
estndar fuera muy grande, entonces los resultados no seran muy reproducibles. Para la
teobromina en el chocolate negro, la desviacin estndar (0,002) es menor que el 1% de la
media (0,392), y por tanto decimos que la medida es muy reproducible. Para la teobromina en
el chocolate blanco, la desviacin estndar (0,007) es casi tan grande como la media (0,010),
y por tanto la medida no es muy reproducible.


El arduo camino seguido para obtener resultados analticos fiables no constituye todava el
final del proceso. El cometido de un anlisis siempre es llegar a cierta interpretacin o tomar
una decisin. La Tabla 1 nos dice que hay mucha ms teobromina que cafena en el chocolate
negro. Tambin nos dice que el chocolate blanco contiene muy poca cantidad de ambas
sustancias. El chocolate negro se hace a partir de granos de cacao, en los que se sabe que
hay teobromina y cafena. El chocolate blanco se hace con algarrobas. Se podran dar varias
explicaciones a los pequeos picos cromatogrficos, que adems son poco reproducibles, de
cafena y teobromina que aparecen en el chocolate blanco:
1. Los chocolates negro y blanco proceden de una misma empresa que los fabrica.Es posible
que residuos de chocolate negro en los utensilios hayan contaminado el chocolate blanco.
2. Es posible que el extracto del chocolate blanco se contaminase con el de chocolate negro
en algn punto del procedimiento analtico.
3. Es posible que los pequeos picos del cromatograma del chocolate blanco no sean de
teobromina o cafena. Si se duda, es necesario identificar los picos midiendo las
caractersticas espectrales.


Tabla 1 Anlisis de chocolate negro y blanco


La pregunta inicial, puesta al principio de este captulo era: "Cunta cafena hay en una
tableta de chocolate?" y "Contiene el chocolate ms o menos cafena que el caf o las
bebidas refrescantes?" Sera necesario analizar muchas tabletas de chocolate de un mismo
tipo y de diferentes tipos de chocolate, para tener una idea ms ajustada del contenido de
cafena en el chocolate en general. La Tabla 2 presenta de forma comparativa los resultados
de muchos tipos de anlisis de diferentes muestras que contienen cafena. Un bote de bebida
refrescante o una taza de t contienen aproximadamente la cuarta parte o la mitad de la
cafena que hay en una tacita de caf, respectivamente. El chocolate contiene an menos
cafena.



Contenido
de cafena en bebidas y alimentos