TITULO: EVALUACIN DEL VALOR DIAGNSTICO DE LA DETECCIN DE NS1 EN PACIENTES CON DENGUE AGUDO AUTORES: Jeanette Prada-Arismendy, MD,

, MSc. Instituto de Virologa, Universidad El Bosque. Cra 7B Bis No. 132-11 Jenniffer A Buitrago Cuellar, BLC. Instituto de Virologa, Universidad El Bosque Jessica Beltrn, BLC. Laboratorio de Salud Pblica, Secretara de Salud de Cundinamarca. Olga Luca Chavarro, BLC. Laboratorio de Salud Pblica, Secretara de Salud de Cundinamarca. Jaime E Castellanos, OD, MSc, PhD. Instituto de Virologa, Universidad El Bosque (Correspondencia: castellanosjaime@unbosque.edu.co) TITULO ABREVIADO: VALOR DIAGNSTICO DE LA DETECCIN DE NS1 EN DENGUE Trabajo basado en la tesis para optar por el ttulo de Bacteriloga de la estudiante Jenniffer A Buitrago Cuellar en la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Presentado en el IV Simposio Nacional de Virologa, Medelln (2011)

RESUMEN El dengue es endemo-epidmico en Colombia y gran parte de nuestra poblacin est en riesgo de padecer esta enfermedad. Uno de los principales problemas en el manejo del dengue es la dificultad para diagnosticar tempranamente esta arbovirosis de otras causas de sndrome febril agudo, ya que la enfermedad presenta un cuadro clnico de evolucin variada e inespecfica, por lo cual se hace indispensable contar con herramientas diagnsticas rpidas y efectivas. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar el valor diagnstico de la deteccin de la protena viral NS1 en pacientes con sospecha de dengue agudo, provenientes del departamento de Cundinamarca, a quienes previamente se les haba realizado una prueba de IgM en el laboratorio de Salud Pblica de Cundinamarca; de stos, la mitad de las 88 muestras correspondan a pacientes que tuvieron una prueba IgM positiva y las otras 44 a pacientes con una prueba de IgM negativa para Dengue. A todas las muestras de suero se les proces con el sistema Pan-E Dengue Early ELISA de Panbio para la deteccin del antgeno viral NS1. El anlisis de los datos se realiz con SPSS 19, EpiInfo y Epidat 4.0 para comparar los datos clnicos de pacientes con y sin dengue agudo. Se obtuvo una concordancia moderada entre las dos pruebas diagnsticas (kappa: 0,514). Adems se encontr que el 40% de las muestras positivas para NS1, haban sido previamente reportadas como negativas de acuerdo al resultado de IgM. En cuanto a la clnica se encontr mayor severidad a menor edad y diferencias significativas (p<0,05) en la presencia de rash, ausencia de diarrea, leucocitos <4000 cel/l y plaquetas <180.000/l. Se puede concluir que la determinacin de la protena NS1 es necesaria en los casos sospechosos de dengue agudo, y en conjunto con la determinacin de IgM representan un complemento eficiente para el diagnstico, disminuyendo la proporcin de falsos positivos o negativos y agilizando as la implantacin de una pronta y oportuna respuesta teraputica y de salud pblica. PALABRAS CLAVE: Dengue, ELISA, protena NS1, IgM.

INTRODUCCIN Colombia se ha convertido en un pas endmico para dengue, no slo debido a su ubicacin geogrfica, sino tambin por diversos factores socio-demogrficos, lo que se ha visto reflejado en un aumento del nmero de casos notificados en los ltimos aos. Segn el Instituto Nacional de Salud (INS), durante la epidemia de 2010 se presentaron 147.670 casos de dengue y 9.482 casos de dengue grave con una letalidad del 2,28%. Durante el 2011, a pesar de que el nmero de casos fue significativamente menor (31.372 casos de dengue y 1.383 casos de dengue grave), la letalidad estuvo en aumento mostrando un ndice de 3,04%. Y hasta Febrero de 2012 ya haban sido notificados 2.202 casos de dengue, de los cuales 89 eran de dengue grave, y el canal endmico se encuentra en zona de alerta (1-4). La Organizacin Mundial de la Salud (2) ha modificado recientemente la forma de clasificar la enfermedad en dos grandes grupos: el primero denominado Dengue no grave que puede cursar con o sin signos de alarma, y el segundo, conocido como dengue grave, se acompaa de signos de fuga plasmtica, hemorragia grave y/o afeccin orgnica. En todos los casos, el cuadro clnico inicia despus de un periodo de incubacin aproximado de 3 a 10 das, tras lo cual se identifican tres fases: La fase aguda con fiebre de 2 a 7 das, dentro de la cual se observa enrojecimiento facial, eritema cutneo, mialgias, artralgias, cefalea, anorexia, nuseas y vomito. En algunos de estos casos se puede evidenciar un descenso de la fiebre o normalizacin de la temperatura corporal con recuperacin clnica. En otras ocasiones, entre el tercero y sptimo da de evolucin, se presentan signos de alarma como, dolor abdominal intenso, vomito persistente, acumulacin de lquidos, hemorragia activa en mucosas, hepatomegalia, aumento del hematocrito y disminucin del recuento plaquetario, que orientan la enfermedad hacia una fase crtica que puede durar de 24 a 48 horas, y est caracterizada por aumento de la permeabilidad capilar con fuga plasmtica variable, con un consecuente aumento del hematocrito y

disminucin de plaquetas, aunque dependiendo de la disminucin del volumen plasmtico se puede presentar shock, con hipotensin, hipoperfusin, disfuncin orgnica progresiva, acidosis metablica, coagulacin intravascular diseminada, y hemorragia grave. En esta fase se deben implementar una serie de medidas de soporte para tratar de estabilizar al paciente; si ste responde, entra en fase de recuperacin con una reabsorcin progresiva de lquido extravascular, pero si la enfermedad progresa puede ser fatal (2, 5, 6). La clasificacin anterior de fiebre de dengue y fiebre hemorrgica por dengue, fue de gran ayuda para la estratificacin clnica. Sin embargo, se frecuentemente se observan casos que no cumplen estos criterios, presentando sntomas inusuales que dificultan el diagnstico oportuno (7), por lo que se requieren pruebas estandarizadas de diagnstico temprano que permitan un tratamiento adecuado con la consecuente reduccin de morbilidad y mortalidad por dengue. El diagnstico de la enfermedad puede basarse en la deteccin de virus durante la fase aguda que va desde el da cero hasta el cuarto o quinto da de enfermedad, en muestras de suero, plasma, clulas sanguneas y/o tejidos. Esto se hace mediante tcnicas para aislamiento viral, deteccin de ARN viral o antgenos como la protena viral no estructural NS1. Por otro lado, la serologa es el mtodo de eleccin al final de la fase aguda o en la fase de convalecencia, debido a que la produccin de anticuerpos vara dependiendo del sistema inmune del hospedero y de si se trata de una primoinfeccin o de una reinfeccin con un serotipo heterlogo (3, 8). En el caso de una primoinfeccin se desarrolla una respuesta primaria con aparicin lenta de IgM. Estos anticuerpos se detectan aproximadamente en el 50% de los pacientes entre 3-5 das despus del inicio de la enfermedad, aumentando a un 80% hacia el da 5 y en un 99% hacia el da 10 de iniciada la fiebre, para un descenso a niveles indetectables al tercer mes post infeccin. Por otro lado, cuando se trata de una infeccin secundaria o en caso de vacunacin previa contra fiebre amarilla, los niveles de IgM no son tan elevados como en una infeccin primaria, y pueden ser indetectables (9, 10).

Actualmente el Instituto Nacional de Salud realiza tres pruebas dentro del programa de vigilancia de dengue: aislamiento viral en clulas de mosquito, amplificacin molecular a travs de RT-PCR y deteccin de anticuerpos IgM especficos contra el virus (11). Aunque las dos primeras son altamente especficas y tiles dentro de los primeros cinco das de la infeccin, son dispendiosas, de alto costo, requiere equipo especializado y personal profesional entrenado (12). La deteccin de anticuerpos IgM, es la prueba ms utilizada por su rapidez y economa. Si stos son detectados en una nica muestra entre el quinto y el dcimo da de la enfermedad se considera un caso probable, pero para confirmar el diagnstico es necesario encontrar un aumento de cuatro veces el ttulo de anticuerpos IgM, en una segunda muestra tomada 7-10 das despus de la primera (2, 7, 12). Por estas caractersticas en la evolucin de la enfermedad, la mayora de los casos slo se confirman al final de la fase crtica, momento en que el paciente ya ha sufrido las complicaciones propias de la infeccin, o en que ya ha sido dado de alta. Todo esto ha generado la necesidad de estandarizar una prueba que sea de fcil y rpida realizacin, con resultados sensibles y especficos en los primeros das de la enfermedad, durante la fase febril, cuando los sntomas son inespecficos permitiendo as, un diagnstico diferencial con otras enfermedades que cursan tambin con fiebre temprana, para establecer pautas de manejo que eviten las complicaciones o la muerte (2, 12). La deteccin de la protena viral NS1 podra solucionar parte de la problemtica en el diagnstico de dengue. Esta protena viral es una glicoprotena de 48 kDa sintetizada en el retculo endoplasmtico rugoso de las clulas infectadas, en forma de monmero y que posteriormente se dimeriza para asociarse a balsas lipdicas (rafts) de la membrana plasmtica o estar soluble en el citoplasma y en el espacio extracelular, lo que induce la estimulacin del sistema inmune (13). Sus funciones no estn bien determinadas aunque se cree que est implicada en la replicacin temprana, morfognesis viral y/o en la respuesta inmune especfica de serotipo. Adicionalmente, se ha podido establecer una relacin entre altos niveles de protena NS1 en el suero de pacientes en fase aguda con la evolucin de las formas severas de la enfermedad (8, 13, 14, 15).

En la actualidad existen kits comerciales basados en la tcnica de ELISA para la deteccin de la protena NS1, fciles de realizar, con equipos comunes y resultados rpidos, permitiendo una confirmacin de la infeccin en suero o plasma, incluso durante los 3 primeros das de inicio de la fiebre, periodo en el cual la prueba tiene una sensibilidad que oscila entre el 64 al 100% y una especificidad del 100%. En este mismo periodo de tiempo la prueba de ELISA para IgM especfica tiene una sensibilidad entre 0 a 50% (2, 12, 16). Esto hace que la deteccin de NS1 sea una alternativa que podra confirmar o descartar de manera rpida y oportuna el diagnstico de dengue, y de esa forma ayudar a iniciar un tratamiento ms apropiado para el paciente (17). Esta prueba de ELISA para NS1 ha sido evaluada en diferentes poblaciones de Amrica y el mundo. Por ejemplo en Brasil se encontr una sensibilidad de 95,5% y una especificidad de 81,1%, resultados similares a los reportados por Guzmn y colaboradores (16) en muestras de pacientes provenientes de Tailandia, Filipinas, Vietnam, Malasia, Nicaragua y Venezuela, quienes notificaron una sensibilidad del 66% y una especificidad del 100%, y en la India en diferentes estudios se obtuvieron valores entre 71,4% a 100% (12, 18, 19). Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar el valor diagnstico de la deteccin de la protena viral NS1 en pacientes con diagnstico probable de dengue agudo en comparacin con la determinacin de anticuerpos IgM por MAC-ELISA. Los resultados presentados permiten proponer preliminarmente la tcnica de ELISA para NS1 como una alternativa de diagnstico temprano y moderadamente econmico que brinda la oportunidad de mejorar el diagnstico de dengue en casos de fiebres indiferenciadas. MATERIALES Y METODOS TIPO DE INVESTIGACIN, POBLACIN Y MUESTRA El actual trabajo es un estudio preliminar exploratorio de tipo transversal, que se propone detectar la protena no estructural NS1 del virus del dengue mediante el uso del kit comercial Pan-E (PanBio E-DEN01P) en el suero de pacientes con sospecha de dengue agudo, que cuentan con una prueba previa de ELISA para IgM especfica para

dengue, realizada en el Laboratorio de Salud Pblica de Cundinamarca entre los meses de enero y agosto de 2010. Las muestras pertenecen a 88 pacientes 50% hombres y 50% mujeres, 44 de ellas tienen una IgM positiva y 44 una IgM negativa, con edades que oscilan entre los 6 meses y los 97 aos de edad, procedentes de los municipios de Apulo, Caparrap, Facatativ, Girardot, Guaduas, La Vega, Quebrada Negra, Sibat, Tocaima y Villeta del departamento de Cundinamarca. RECOLECCIN Y ANLISIS DE DATOS Se realiz una base de datos en Excel 2007 con la informacin de las fichas clnicas de todos los pacientes. Las muestras fueron pareadas por edad y lugar de procedencia, con el fin de realizar una comparacin clnica. Como criterio de inclusin se buscaron las fichas clnicas con mayor cantidad de datos: edad, gnero, fecha de consulta, condicin final, sntomas clnicos, recuento de blancos, hematocrito y plaquetas. Para el anlisis estadstico se emple el programa estadstico SPSS versin 19 para el procesamiento de los datos, en el cual se realiz una prueba t de Student para muestras independientes, comparando el recuento leucocitario, recuento plaquetario y porcentaje de hematocrito. Las muestras se agruparon segn el resultado negativo o positivo para dengue por cada una de las tcnicas. Adicionalmente se determin la relacin o independencia entre los signos y sntomas respecto al diagnostico positivo o negativo en cada prueba diagnstica (Chi2, usando EpiInfo). Finalmente, se utiliz el programa Epidat 4.0 con el fin de establecer el ndice Kappa para determinar la concordancia entre las dos pruebas. ELISA para NS1: El sistema empleado fue el Pan-E Dengue Early ELISA (Panbio), que es un inmunoensayo enzimtico tipo sndwich sobre microplaca sensibilizada con anti-NS1. Las muestras de suero fueron diluidas a la mitad, y se pusieron simultneamente con los controles negativos y positivos por triplicado; se incub por 1 hora a 37C y pasado este tiempo se realizaron los lavados correspondientes. Despus de esto se adicionaron 100 l de anticuerpo monoclonal anti-NS1 conjugado con peroxidasa de rbano en cada pocillo, se incub por 1 hora a 37C, tras lo cual se realizaron los respectivos lavados y

se adicionaron 100 l de tetrametilbencidina por 10 minutos y posteriormente se adicionaron 100l de solucin de parada. Finalmente se realiz una lectura de absorbancias a una longitud de onda de 450 nm con un filtro de referencia de 630 nm. Con el promedio del valor de absorbancia de los calibradores se calcul el punto de corte y el valor ndice (absorbancia de la muestra/punto de corte) que indicaron reaccin positiva o negativa para NS1. Deteccin de IgM: Se emple el kit Dengue IgM capture Elisa (MAC-ELISA) de Panbio Cat N E-DEN01M/EDEN01M05, que es un ensayo de inmunoadsorcin ligado a enzimas donde se emple una microplaca sensibilizada con un anticuerpo especfico anti-IgM humano que reacciona con los anticuerpos tipo IgM presentes en el suero del paciente y posteriormente con un antgeno de dengue recombinante obtenido a partir de clulas de mosquito. Este complejo anticuerpo anti-IgM, IgM del paciente y antgeno recombinante reaccionan con un anticuerpo monoclonal anti-antgeno viral marcado con peroxidasa que oxida al sustrato y el cromgeno, lo cual se evidencia con el cambio de color. RESULTADOS De acuerdo a los resultados obtenidos por ambas tcnicas, se dividieron las muestras en tres grupos: En el primero se encuentran 38 pacientes, cuyos sueros resultaron positivos para la prueba de ELISA para NS1, los cuales se consideran casos confirmados de dengue agudo. Cabe resaltar que 15 de estos 38 sueros, haban resultado previamente negativos en la prueba de ELISA para IgM. En este primer grupo se logr determinar que 14 de estos 15 pacientes que resultaron falsos negativos en la prueba de IgM, haban consultado antes del cuarto da de inicio de la fiebre, periodo en el cual la inmunoglobulina an no es detectada en el suero de pacientes con dengue agudo (Ver Tabla 1). En el segundo grupo, se encuentran 28 pacientes con sndrome febril agudo de etiologa desconocida, en los que se descart el diagnstico de dengue, ya que obtuvieron resultados negativos tanto en la prueba de ELISA para NS1 como en la ELISA para IgM.

Al tercer grupo corresponden los pacientes con diagnstico indefinido, equivalente a 22 muestras que resultaron negativas para NS1 pero positivas por ELISA para IgM; este resultado no permite hacer una confirmacin del diagnstico de dengue, ya que para ello se requerira el resultado de una muestra de fase convaleciente que corroborara una posible seroconversin (Figura 1). ALGUNOS SIGNOS Y SNTOMAS SE CORRELACIONAN CON EL DIAGNOSTICO DE DENGUE Se encontr una correlacin significativa entre los signos de extravasacin y la aparicin de erupcin, con la prueba positiva para IgM (Chi2, p<0.05). La ausencia de diarrea se correlacion con el resultado positivo en la prueba para NS1 (p<0,045). Los dems signos y sntomas reportados por los pacientes no se correlacionaron con el resultado de ninguna de las dos pruebas diagnsticas, demostrando as que es imposible establecer el diagnstico nicamente por la clnica debido al amplio nmero de entidades febriles con sintomatologa similar (Tabla 2). Es de resaltar que en el grupo de 0 a 10 aos se observaron signos de hemorragia en el 50% de los pacientes y emesis en el 40%. En los dems grupos de pacientes (mayores de 11 aos), ms del 50% presentaron mialgias, artralgias, cefalea y dolor retro-orbital. Especficamente en los grupos de 11 a 20 aos y de 20 a 30 aos, se present dolor abdominal en un 57,1% y en el grupo mayor a 30 aos emesis en un 50%. En resumen, la mayora de los pacientes menores de 10 aos presentaron signos de alarma y los casos de 11 a 30 aos presentaros signos y sntomas de un caso probable de dengue sin signos de alarma, evidencindose mayor severidad a menor edad (Tabla 3). Se estableci que los pacientes positivos para NS1 presentaron leucopenia ligera, comparados con los pacientes que fueron NS1 negativos (p<0.05). De igual forma los pacientes que resultaron positivos en la prueba de ELISA para IgM especfica de dengue presentan trombocitopenia comparados con los pacientes que tuvieron una IgM negativa (Tabla 4).

DISCUSIN Dentro de los criterios de laboratorio para la confirmacin de un caso probable de dengue se contemplan dos opciones: las pruebas virolgicas o la identificacin de anticuerpos especficos. La deteccin de IgM se debe realizar, de acuerdo a las recomendaciones del Instituto Nacional de Salud por dos mtodos alternativos: la primera es la determinacin de anticuerpos IgM a travs de una ELISA de captura (MAC-ELISA, PanBio) o por un ensayo de Ultra Micro ELISA (UM-ELISA, Tecnosuma) en una nica muestra de suero tomada despus del quinto da de inicio de sntomas. La segunda opcin es realizar la tcnica de inhibicin de la hemaglutinacin para detectar anticuerpos IgM o IgG, comparando los ttulos de una muestra tomada en fase aguda y otra en convalecencia (11, 20), aunque esta tcnica es ms costosa y de difcil ejecucin. Este protocolo gua la tarea de diagnstico y vigilancia realizada por los laboratorios de salud pblica colombianos en el control del dengue, permitiendo la utilizacin de la deteccin de anticuerpos IgM por la tcnica de MAC-ELISA como mtodo principal de diagnstico, teniendo en cuenta su bajo costo y la simplicidad de su realizacin. Sin embargo, hay que considerar las limitaciones que sta presenta, como la baja sensibilidad en la deteccin de anticuerpos entre el primero y cuarto da de enfermedad. Si bien es cierto que despus del quinto da de haberse iniciado la fiebre, se logran detectar las IgM en la mayora de los pacientes, hay que tener en cuenta que slo es 100% sensible al final de la fase febril y durante la fase de crtica, retardando as el inicio del manejo de la enfermedad y por ende aumentando la tasa de morbimortalidad. El principal problema de usar la deteccin de IgM en el diagnstico de dengue es que la deteccin de anticuerpos en una nica muestra slo permite definir un caso de infeccin reciente, pero no un caso de dengue agudo (2, 5, 8, 21). En este trabajo se encontr que de 38 muestras positivas por ELISA para NS1, 15 haban resultado previamente negativas para IgM, lo que corresponde a un 40% de falsos negativos por la tcnica de

ELISA para IgM. De estos pacientes, el 93,3% haba consultado entre el primero y el cuarto da de inicio de la fiebre, lo que podra explicar este alto porcentaje de falsos negativos, y que demuestra que no se est cumpliendo con las recomendaciones establecidas para el manejo y diagnstico del dengue, pues se recomienda hacer la prueba en muestras de los casos que presenten cuadro febril con ms de cinco das de evolucin (20). Previamente se report en un estudio realizado en la India (12) un 65,4% de falsos negativos en la prueba de ELISA para IgM especfica de dengue, los cuales s fueron detectados por ELISA para NS1 dentro de los primeros 3 das de inicio de la fiebre. Se estableci que para esta fase de la enfermedad la sensibilidad de la prueba para NS1 estaba entre el 71 al 100%, mientras que para la prueba de ELISA para IgM fue del 0 al 50%, razones que justifican la implantacin de ambas tcnicas como mtodos de complementariedad diagnstica. Esto fue corroborado en el presente trabajo, con la determinacin del ndice Kappa, el cual arroj un valor de 0,514 expresando una concordancia moderada, que oscila entre 0.41 y 0.61 segn la clasificacin de Landis y Koch, lo que establece no slo la posibilidad de emplear la deteccin de NS1 como alternativa diagnstica a la actual prueba de ELISA para IgM especfica de dengue, sino tambin permite recomendar la utilizacin simultnea de estas dos tcnicas como un complemento eficiente para el diagnstico de dengue agudo disminuyendo la probabilidad de resultados falsos positivos o negativos. En el trabajo de Castro-Jorge en Brasil (18), se detect de NS1 entre los das 1-8 de enfermedad, es decir durante toda la fase aguda. Mientras que el aislamiento viral result positivo solamente entre el primero y el tercer da, lo que hace de la ELISA para NS1 una prueba alternativa de fcil ejecucin, econmica y con un periodo de deteccin superior a otras pruebas virolgicas (18). Hay que recordar que existe la posibilidad de una reaccin cruzada en las pruebas de IgM especficas para los flavivirus como fiebre amarilla y dengue, debido a la presencia de eptopes comunes de la protena de envoltura (E), lo cual representa una dificultad

mayor para el diagnstico en un pas endmico como lo es Colombia con co-circulacin de estos dos virus y con una alta proporcin de vacunados para fiebre amarilla (12, 22, 23). En un trabajo previo de este grupo de investigacin se evidenci que los ensayos de ELISA para IgM contra dengue tienen una reactividad cruzada en el 46,2% de los pacientes con fiebre amarilla y en el 42% de los vacunados (22). Al no poder contar con una segunda muestra para determinacin de IgM que corrobore el aumento en el ttulo de anticuerpos no es posible hablar de un caso agudo, sino de casos de infeccin recientes por virus dengue (menos de tres meses), que podra estar asociada o no al evento de infeccin aguda motivo de consulta actual. En contraposicin, es importante aclarar que la protena NS1 no es detectada en pacientes con infeccin por otros flavivirus como fiebre amarilla (23), como fue reportado en Brasil donde se emplearon muestras negativas para dengue pero con diagnstico positivo para sarampin, rubeola, fiebre amarilla o vacunados para fiebre amarilla, todos los cuales resultaron negativos para NS1 (19). En ese mismo sentido, en otro trabajo (12) se emplearon muestras negativas para dengue pero positivas para encefalitis japonesa, las cuales resultaron en su totalidad negativas para NS1, por lo que se puede concluir que esta prueba de NS1 es especfica para dengue. Por otro lado, es claro que la caracterizacin clnica en los casos probables de dengue es una herramienta de apoyo pero resulta de baja especificidad y sensibilidad. Se requiere de pruebas diagnsticas que permitan confirmar un mayor nmero de casos, ya que es necesario descartar otras patologas que cursan con sintomatologa similar como influenza, infecciones eruptivas como rubeola y sarampin, enfermedad diarreica aguda por rotavirus, y otras enfermedades febriles como leptospirosis y malaria (3, 17, 24). En este trabajo slo el 43,18% de los pacientes con sospecha de dengue, tuvo una confirmacin diagnstica, resultado similar a los obtenidos en estudios previos (17, 18, 24).

En este estudio, la mayora de los pacientes con resultado positivo para dengue es menor de 10 aos, y en este mismo grupo etario se presentaron con mayor frecuencia signos de hemorragia y tmesis. Mientras tanto, los adultos presentaron ms frecuentemente mialgias, artralgias, cefalea y dolor retroorbital. En general y con gran relevancia se observ que los ms afectados independientemente del diagnstico fueron los menores de 10 aos lo que relaciona edades extremas como un factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad y sus posibles complicaciones (3), diferente a lo ocurrido en Apartad (Colombia) donde los ms afectados estuvieron entre los 15 y 24 aos (25), o en India, donde los ms afectados estuvieron entre los 21 y 30 aos de edad (12) o en Cuba donde los ms afectados estuvieron entre los 36 y 45 aos (26). Cerca del 90% del total de pacientes consultaron entre el primero al sexto da de inicio de los sntomas, periodo durante el cual los sntomas de la enfermedad son ms incapacitantes para el paciente, similar a lo descrito para Colombia por Diaz et al (2006) quienes reportaron un promedio de horas de evolucion hasta la consulta de 72,2 horas en los pacientes confirmados para dengue y 67,2 horas en los pacientes negativos (17). En Malasia, los pacientes confirmados para dengue, consultaron al dia 5,1 en promedio (27). En el grupo de pacientes analizados en este trabajo, los pacientes con dengue confirmado y que consultaron despus del sexto da de enfermedad, tuvieron mayor porcentaje de complicaciones (signos de hemorragia y de extravasacin) comparados con aquellos pacientes que resultaron negativos para NS1. En cuanto a los exmenes paraclnicos, se encontr una leucopenia ligera (promedio 4.578 clulas/l) en los casos positivos para NS1, comparado con un promedio de 6.127 clulas/l en los casos negativos por la tcnica para NS1 (p<0,05). Datos similares se reportaron en el estudio de Malasia, en el que los pacientes con dengue mostraron un promedio de 3980 clulas/l (28) y en el estudio en Santander (Colombia) en el que los casos positivos tuvieron un promedio de 3.694 clulas/l, comparado con el promedio de los casos no dengue (promedio 4.138 clulas/l) (17). Respecto al recuento de plaquetas en general se evidenci que los pacientes con una IgM positiva presentaron

un promedio de 96.773 clulas/l, lo que clasificara como trombocitopenia, mientras que los negativos tenan en promedio 164.147 clulas/l, diferencia que fue estadsticamente significativa. Estos datos contrastan con estudios previos en los que se report un promedio de 48.688 clulas/l (25) y 90.640 clulas/l (28) en casos de dengue o en el estudio colombiano en el que se hall un promedio de 150.000 clulas/l en pacientes positivos y 201.000 clulas/l en pacientes negativos (17). Por ltimo al evaluar los valores de hematocrito no se encontraron deferencias significativas, coincidiendo con la afirmacin de Mndez y Gonzlez (29) de que el aumento en el hematocrito es el hallazgo clnico ms difcil de encontrar. Se establecieron diferencias significativas en la presencia de erupcin, ausencia de diarrea y recuento leucocitario <4000c/l con un mayor porcentaje en los casos positivos confirmados por la prueba de NS1 respecto de los negativos (p<0,05). No se logr determinar la asociacin de dolor abdominal con la severidad de la enfermedad como si se present en estudios previos (25, 26, 28). Resumiendo, se demostr una complementariedad diagnstica para la determinacin de la protena no estructural NS1 en pacientes con dengue agudo y la tcnica de MACELISA, lo que asegurara un diagnstico mas acertado que podra conducir a un manejo medico ms oportuno y eficaz, que disminuya la posibilidad de complicaciones. Adems los hallazgos clnicos reportados indican una alta inespecificidad de signos y sntomas, que hacen imposible la definicin de un caso positivo o negativo para dengue, solo por la evaluacin clnica.

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