TCNICA DE DIAGNSTICO PRENATAL A. NO INVASIVAS 1. TAMIZAJE BIOQUIMICO DE CROMOSOMOPATIAS. A.TRIPLE MARCADOR Alfa Feto Protena. Gonadotrofina Estriol no conjugado.

B. MARCADORES DE PRIMER TRIMESTRE: SP- 1 Free Beta HCG PAPP-A Inhibina A UGP ( Pptido gonadotrfico urinario ) 2. TAMIZAJE ECOGRAFICO ESTRUCTURALES. A. ECOGRAFIA 10 - 14 SEMANAS Determinacin de la Translucencia Nucal. Valoracin anatmica fetal. ( Defectos mayores ) B. ECOGRAFIA 18 - 22 SEMANAS Marcadores ecogrficos de cromosomopata. Detalle anatmico fetal. C. ECOGRAFIA TRIDIMENSIONAL Evaluacin de la superficie fetal (macizo facial, extremidades, genitales). Evaluacin del esqueleto fetal. Mediacin de volumen (peso fetal, lquido amnitico y placenta). Confirmacin de la presencia de anomalas. Evaluacin de la extensin y severidad de la malformacin presente. 3. DIAGNOSTICO PRENATAL EN CELULAS FETALES CIRCULANTES EN SANGRE MATERNA. DE CROMOSOMOPATIAS Y DEFECTOS Corinica Humana.

B. INVASIVAS 1. BIOPSIA DE VELLOSIDAD CORIAL. 2. EMBRIOFETOSCOPIA. 3. AMNIOCENTESIS PRECOZ CON AMNIOFILTRACION. 4. AMNIOCENTESIS CLASICA. 5. CORDOCENTESIS. 6. CARDIOCENTESIS. 7. BIOPSIA FETAL. 8. CELOCENTESIS. 9. LAVADO TRANSCERVICAL. 10. DIAGNOSTICO PREIMPLANTACION. A. TECNICAS NO INVASIVAS DE DIAGNOSTICO PRENATAL . 1. TAMIZAJE BIOQUIMICO DE CROMOSOMOPATIAS. Hasta hace pocos aos el criterio fundamental para establecer el riesgo de anomala cromosmica fetal en una determinada gestacin, era la edad de la madre ; con base en la relacin existente entre la edad materna y el riesgo de Sndrome de Down y otras trisomas. Se estableci entonces la " edad mgica " de los 35 aos para ofrecer tcnicas invasivas debido a que a esta edad se equilibra el riesgo de prdida fetal secundario al procedimiento y el riesgo de alteracin cromosmica, y el otro factor que influy en establecer la edad de los 35 aos fu el resultado de los estudios costo-beneficio, que establecan esta como la edad por debajo de la cual el " beneficio " es inferior al costo (81,82) .Con esta poltica de accin se logran identificar el 30 % de los fetos con Sndrome de Down con una tasa de falsos positivos del 10 %. Este bajo ndice de deteccin estimul el estudio de otras alternativas de tamizaje. La utilizacin de la alfa fetoprotena en suero materno ( AFPSM ), fu el primer intento que se realiz para incrementar los ndices de deteccin de la trisoma 21, basndose en la observacin de que los niveles en sangre materna de mujeres portadoras de fetos con sndrome de Down eran ms bajos si se comparaban con las mujeres portadoras de fetos cromosmicamente normales (83). La idea de encontrar criterios adicionales para dar una mayor precisin a la estimacin de " riesgo " se hizo inmediatamente atractiva, dada la escasa eficacia obtenida con la aplicacin de la edad como nico criterio de " screening ". Los estudios prospectivos combinando AFSM y edad materna (84), una vez demostrado que ambas se comportaban como variables independientes en gestantes menores de 35 aos y utilizando un " cut - off " de riesgo de 1:270,

mostraron ndices de deteccin comparables a los obtenidos utilizando slo el criterio de la edad. A partir de este hallazgo se investigaron otros "marcadores" sricos maternos, entre ellos la gonadotrofina corinica (HCGSM) que mostraba niveles ms elevados (85) y el estriol no conjugado (uE3SM) niveles ms bajos (8) con capacidad discriminativa en presencia de fetos con sndrome de Down en segundo trimestre. La no dependencia de las variables ( edad,AFPSM,HCGSM y uE3SM ) era importante dado que, de lo contrario, en la prctica se detectaran los mismos casos de sndrome de Down utilizando distintos marcadores. Esto permiti su integracin en un anlisis de regresin multivariado que se difundi como "triple screening o triple marcador " para la estimacin del riesgo individual para el sndrome de Down. La estimacin del riesgo en una determinada gestante se hace multiplicando el riesgo asociado a su edad para la edad gestacional especfica ( conocido por estudios epidemiolgicos ) (87,88), por el ndice de probabilidad derivado de los niveles sricos de cada marcador. Con esta estrategia aplicable a cualquier edad, se logr incrementar el ndice de deteccin al 60 % asumiendo un 5 % de falsos positivos ( amniocentesis realizadas en fetos no afectos de sndrome de Down ) y utilizando un "cut off " de 1:270. La experiencia acumulada para el segundo trimestre demuestra que la adicin de la HCGSM aumenta la sensibilidad del screening para el sndrome de Down cuando se combina con la edad materna. Aunque estudios recientes sugieren (89), que la utilizacin de la fraccin libre de la B-HCG tendra mayor capacidad discriminativa dados los valores medios de los Mltiplos de la Mediana (MoM ) para esta fraccin en presencia de sndrome de Down, comparados a la de la HCG total. Otros estudios indican menor ndice de falsos positivos y mayor deteccin de otras anomalas cromosmicas con la utilizacin de la HCG intacta (90). El papel del uE3SM ha sido puesto en duda en estudios ms recientes (91,92) indicando que no aade sensibilidad y aumenta el costo y los falsos positivos, por lo que se ha tendido a abandonar su utilizacin. Las bases fisiolgicas (96) que motivaron su utilizacin son las siguientes: Alfa Fetoproteina ( AFP ) es una glicoprotena de PM 70.000 D, cuya secuencia de aminocidos presenta una homologa del 40 % con la albmina. Se sintetiza inicialmente en el saco vitelino y posteriormente en el hgado fetal. Su concentracin en sangre fetal aumenta hasta alcanzar un mximo de 300 mg/100ml a las 10-13 semanas de embarazo. A partir de este momento, disminuye progresivamente a menos de 100 mg/100ml a trmino y sigue disminuyendo hasta los 5 mg/100ml a los 2 aos de edad, permaneciendo en estos niveles hasta la vida adulta. La AFP puede migrar de la circulacin fetal a la materna a travs de dos mecanismos: 1. Difusin transplacentaria 2. Difusin transamnitica desde la orina fetal. La concentracin en sangre materna es cinco veces inferior a la fetal y va aumentando durante el segundo trimestre debido al incremento de la permeabilidad placentaria. Podemos encontrar por lo tanto aumento de la AFP srica materna por defectos de la barrera feto-amnitica ( Defectos abiertos del tubo neural , defectos abiertos de la pared abdominal , higroma qustico , teratoma fetal , amputaciones

fetales , muerte fetal , sndrome nefrtico fetal ) o por defectos de la barrera placentaria ( Hemorragia feto-materna , tumores o infartos placentarios, placentas hipertrficas o qusticas ). Cualquier mnimo compromiso de la integridad placentaria produce repercuciones importantes en los niveles maternos de AFP, debido al gran gradiente de concentracin existente entre el suero materno y el fetal. La causa menos frecuente de elevacin de la AFP en suero materno, es la secundaria a la disminucin de la eliminacin renal fetal por patologa obstructiva o displsica. Los valores de AFP en suero materno estn disminuidos en pacientes portadoras de fetos con Sndrome de Down. Existen diversas etiologas acerca de la causa de esta disminucin siendo la ms aceptada la propuesta por Cukcle y colaboradores quienes abogan por una disminucin de la sntesis heptica fetal. La concentracin de AFP en el suero de fetos con trisoma 13, 18 y monosoma X , es ms baja que la de fetos cromosmicamente normales. Los valores bajos de AFP en suero materno no son exclusivos por tanto del Sndrome de Down. La Gonadotrofina corinica humana ( hCG ) es una glicoproteina compuesta por dos subunidades alfa y beta, que pueden circular libres o unidas.La alfa-hCG se sintetiza en el citotrofoblasto y su concentracin aumenta desde las semanas 8-10 de embarazon hasta el final . La sntesis de beta-hCG se produce en el sincitiotrofoblasto alcanzando un pico entre las 8-12 semanas de embarazo para disminuir progresivamente hasta alcanzar un valor estable a las 18 semanas. Se ha visto que los niveles de hCG en madres portadoras de fetos con Sndrome de Down son significativamente ms altos. Probablemente estos fetos sufren un retoceso en su desarrollo entre las 7-8 semanas de embarazo, con un retraso de crecimiento de la placenta con lo que produce hCG equivalente a la sntesis de una placenta de un embarazo normal tres semanas ms joven. Los mtodos biolgicos para reconocer la hCG fueron diseados para identificar partes de la molcula. Parece ser que la deteccin es mayor cuando se emplea betahCG libre o hCG intacta que cuando se emplea hCG total. El estriol no conjugado ( uE3 ) es una hormona esteroidea sintetizada por el sincitiotrofoblasto a partir de precursores fetales. Todo el contenido de uE3 en suero materno procede de la actividad fetal y placentaria a diferencia del estriol total. Los niveles de uE3 se encuentran disminuidos en mujeres portadoras de fetos con Sndrome de Down. El mecanismo fisiolgico ntimo de la disminucin de uE3 en estos embarazos permanece incierto. La sntesis de uE3 depende de la corteza suprarrenal y el hgado fetal por un lado y la placenta por otro. La inmadurez funcional de alguno de los rganos implicados en el circuito de sntesis de uE3 en fetos con sndrome de Down, podra explicar los niveles bajos hallados en suero materno. Para realizar un tamizaje de cromosomopatas, es necesario tener en cuenta el factor de individualizacin del riesgo que variar en cada caso en funcin de una serie de factores fisiolgicos que se han de corregir a la hora de hacer el clculo de riesgo. El factor ms importante es la edad gestacional que debe ser corregida con la edad calculada por ecografa. Los marcadores disminuyen su concentracin srica con el aumento del peso materno y aumentan en la gestacin gemelar.

Para la realizacin del clculo de riesgo se utilizan los mltiplos de la mediana ( MoM ) de los parmetros bioqumicos. El MoM se obtiene dividiendo la cifra srica obtenida, entre la mediana para esa edad gestacional a la que se ha realizado la determinacin. Se indicar la conveniencia de una tcnica invasiva cuando exista un riesgo con una probabilidad igual o mayor a 1 : 270. Es importante tener en cuenta tambin los valores individuales de los marcadores bioqumicos antes de su integracin en el clculo combinado. Existe indicacin de tcnicas invasivas para estudio de cariotipo fetal ante: MoM AFP: < 0.5 MoM hCG: > 3 MoM hCG: < 0.2 ( Riesgo de trisoma 18 ) MoM AFP: > 3 ( Riesgo de defecto del tubo neural ) La aplicacin del tamizaje bioqumico en segundo trimestre permite detectar el 60 a 65 % de los fetos con sndrome de Down con una tasa de falsos positivos del 5 % . En la bsqueda de la precocidad en el tamizaje de las cromosomopatas, han surgido marcadores bioqumicos en el primer trimestre tales como la free Beta HCG (93), la PAPP-A (94) y la inhibina A (95), que han demostrado indices de deteccin variables cuando son utilizados individualmente y en combinacin, tal y como se observa en las tablas 1 y 2. Tabla 1. Indices de deteccin y falsos positivos de marcadores valorados individualmente Indices de deteccin ( Marcador %) F.P. 5 % F.P. 10 % 17 AFP 19 22 B-HCG 23 43 FB-HCG 42 29 PAPP-A 63 Tabla 2. Indice combinacin de marcadores. Marcador de deteccin con la

AFP + AFP + B-HCG +

B-HCG PAPP-A PAPP-A

Indices de deteccin ( %) F.P. 5 % F.P. 10 % 26 42 44 55 60

FB-HCG + PAPP-A

50

71 69

Existen distintos factores a tener en cuenta por su influencia en la efectividad de los marcadores sricos maternos y la edad materna aplicados a la deteccin de anomalas cromosmicas fetales (97). Distribucin de la edad materna en la poblacin general de gestantes. El incremento de mujeres embarazadas de edad avanzada en la ltima dcada en la mayora de paises industrializados, resulta en un aumento de la prevalencia del sndrome de Down y otras aneuploidas dependientes de la edad. Este desplazamiento de edad materna permite asumir, en la aplicacin del screening bioqumico, un nmero de falsos positivos en funcin de la mayor prevalencia, modificando el cut-off de riesgo combinado para la prctica de un procedimiento diagnstico. Seleccin del " cut - off ". La seleccin de un determinado punto como corte de riesgo en el resultado del test pretende alcanzar un equilibrio entre ndices de deteccin y de falsos positivos. En situaciones extremas hipotticas, la seleccin de un cut-off muy bajo permitira virtualmente la identificacin del 100 % a expensas de un nmero elevadsimo de falsos positivos ( procedimientos innecesarios). Por el contrario un cut-off elevado tiende a reducir los falsos positivos, con ndices de deteccin ms bajos y mayor nmero de falsos negativos. El decidir el cut-off es pues una decisin de compromiso en la estrategia de aplicacin del programa de screening. En la aplicacin de distintas combinaciones de marcadores, la valoracin de su eficacia para la eleccin del cut-off se hace escencialmente a travs de las dos variables finales, ndice de deteccin ( sensibilidad) y el correspondiente ndice de falsos positivos. Exigencias. La aplicacin de marcadores bioqumicos exige mantener el rigor metodolgico en todo el proceso, incluyendo la informacin a la gestante de lo que significa el test y su aceptacin voluntaria. La determinacin ecogrfica de la edad gestacional en la que se obtiene la muestra, se considera parte importante en la valoracin precisa de los niveles sricos de los marcadores, puesto que los errores pueden conducir a desviasiones en la valoracin de los MoM, y por tanto en la estimacin del ndice de riesgo. Existen factores de " screening no fiable " como hemorragia feto materna con aumento de AFPSM o embarazo gemelar, que pueden obscurecer el resultado y estimacin de riesgo en el clculo integrado. El informe que llega al clnico debe ser explcito mostrando, adems del ndice de riesgo, los valores individuales de los marcadores, expresados en MoM de los de referencia para cada laboratorio y haciendo notar desviaciones anormales tales como elevaciones de AFP mayor de 2,5 MoM o disminucin de HCG menor de 0.2 MoM, que indican estudio ecogrfico detallado ante la posibilidad de otras anomalas como DTN o trisoma 18 respectivamente o, en general, un pronstico perinatal adverso asociado a elevaciones inexplicables de AFP. Limitaciones.

Sin duda,el test ideal de screening ( ndice de deteccin del 100 % sin falsos positivos ) no existe y una de las limitaciones intrnsecas es la existencia de falsos negativos. En la eleccin de alternativas y desde una perspectiva estrctamente tica, parece ms razonable la eleccin de la estrategia que, adems de un menor ndice de falsos negativos, permita una opcin diagnstica a todas las gestantes independientemente de su edad. Otra limitacin, no resuelta todava en la combinacin de los marcadores sricos a la edad, es el de los embarazos gemelares, puesto que la contribucin de dos fetos y dos placentas modifica notblemente los niveles de los marcadores serolgicos. 2. TAMIZAJE ECOGRAFICO SECUENCIAL DE CROMOSOMOPATIAS. A pesar del incremento significativo en los ndices de deteccin logrados mediante la implementacin del tamizaje bioqumico para las diferentes cromosomopatas, surge la evaluacin ecogrfica del feto, en busca de " marcadores " que sugirieran compromiso fetal , como la alternativa que ofrece los ms altos ndices de deteccin. El tamizaje ecogrfico secuencial se realiza entonces en dos etapas del embarazo: A- Entre las 10 - 13 Semanas: Mediante la determinacin sistemtica de la translucencia nucal (98,99,100,101.102,103,104) considerando como patolgico cualquier valor por encima del percentil 95 para el CRL correspondiente. B- Entre las 16 - 22 Semanas: Mediante la bsqueda detallada de " marcadores " de cromosomopata (105,106,107,108,109,110,111,112,113) as: Edema nucal. ( > o = 6 mm ) Braquicefalia. Quiste de plexo coroideo. Golf - balls . ( Corte de cuatro cmaras cardacas) Ectasia pilica. Hiperrefringencia intestinal. Hmero y fmur cortos. Clinodactilia. Sandal - Gap. Defecto estructural fetal. Se aconsejar tcnicas invasivas para cariotipaje fetal ante: Translucencia nucal positiva. ( > P 95 para CRL correspondiente) Edema nucal positivo. ( >= 6 mm )

Presencia de cualquier defecto de tipo estructural. Presencia de marcadores ecogrficos menores que al ser integrados de acuerdo a la tabla ( 3 ), arrojen un riesgo > o = 1: 270. Tabla #3 ANOMALIAS EDAD RIESGO EN HI FC EP 20 1176 63 215 512 784 22 1136 61 207 4945 758 24 1087 58 198 473 725 26 990 53 181 431 660 28 855 46 156 372 570 30 690 37 126 301 460 32 508 28 93 221 339 34 342 19 63 149 228 36 216 12 40 94 144 38 129 8 24 57 86 40 74 5 14 33 50 EN:Edema nucal . HI: Hiperrefringencia corto. EP: Ectasia pilica. NO ANOMALIAS EP+FC 342 1960 330 1893 316 1812 288 1650 249 1425 201 1150 148 847 100 570 63 360 38 215 22 123 intestinal . FC: Femur

3. DIAGNOSTICO PRENATAL EN CELULAS FETALES CIRCULANTES EN SANGRE MATERNA . La obtencin no invasiva de clulas fetales a partir de la circulacin materna, y el posterior diagnstico a travs de las mismas de anomalas genticas, constituye uno de los principales retos de la medicina fetal actual. Las investigaciones se centran en el aislamiento de las clulas fetales que atraviesan la barrera placentaria y circulan en sangre materna. Dichas clulas al ser nucleadas constituyen una fuente de cromosomas y de DNA fetal para diagnstico gentico prenatal. En los ltimos cuarenta aos se han publicado mltiples trabajos sugiriendo primero y confirmando despus, la presencia de clulas nucleadas procedentes del feto en la circulacin perifrica de mujeres embarazadas. Sin embargo, los resultados publicados durante los primeros aos de investigacin fueron pocos alentadores. Actualmente, gracias a los avances realizados en las reas de la inmunologa ( anticuerpos monoclonales ), de la separacin celular ( fluorescence activated cell shorter o FACS, magnetic activated cell shorter o MACS ) y de la biologa y citogentica molecular ( reaccin en cadena de la polimerasa o PCR, hibridacin insitu fluorescente o FISH ), resulta posible estudiar y caracterizar las diferentes poblaciones celulares fetales presentes en la circulacin perifrica de la mujer embarazada. Los principales tipos celulares estudiados son : linfocitos, clulas trofoblsticas y eritroblastos (114, 115, 116, 117, 118, 119, 120)

Linfocitos Fetales. La deteccin ms temprana de linfocitos fetales en sangre materna, es referida por Faust y cols. En 1.976 a las 7-8 semanas de embarazo. La proporcin de linfocitos fetales en sangre materna oscila entre 0.01 % y 3.7 % estimndose que la relacin entre linfocitos fetales y maternos vara entre 1/800 y 1/60.000. Sin embargo el aislamiento de los linfocitos fetales a partir de sangre perifrica materna mediante anticuerpos monoclonales anti HLA, presenta tres grandes dificultades. Por un lado, el gran polimorfismo de los loci HLA hace que la seleccin del anticuerpo sea especialmente difcil . Por otro lado, la necesidad de identificar los antgenos celulares parentales previamente al aislamiento de las clulas fetales, convierte al mtodo en demasiado largo y costoso para la prctica clnica. Por ltimo la falsa paternidad es un punto importante a tener en cuenta, si el aislamiento de clulas fetales se realiza nicamente con base a los loci HLA paternos. De todas formas el curioso fenmeno de la persistencia de linfocitos fetales en la circulacin materna durante un perodo de tiempo superior a cinco aos postparto, hace que esta poblacin celular fetal no sea la ms idnea para el diagnstico prenatal no invasivo. Clulas trofoblsticas. Las clulas trofoblsticas son clulas fetales multinucleadas procedentes de las vellosidades coriales, que estn en ntimo contacto con la circulacin materna. En 1.982, Goodfellow y Taylor publican el aislamiento de clulas trofoblsticas en sangre perifrica materna usando un anticuerpo microvellositario antitrofoblstico. Se cree que a partir del segundo mes de embarazo, la tasa por da de clulas trofoblsticas que migran desde las vellosidades coriales a la circulacin materna es de 100.000, estimndose que su dilucin en la poblacin de leucocitos maternos es de 1:10. A pesar de que las clulas trofoblsticas son la poblacin celular fetal que ms tempranamente se pone en contacto con la circulacin materna, y probablemente tambin es el grupo celular fetal con mayor representacin en el torrente sanguneo materno, su utilizacin en el diagnstico prenatal no invasivo presenta varios problemas : la posibilidad de una discrepancia gentica entre el trofoblasto y el feto, y el aspecto multinucleado de las mismas, que puede representar un problema a la hora de la interpretacin y anlisis gentico de dichas clulas. Eritroblastos fetales . Una de las primeras publicaciones en documentar el paso de eritroblastos fetales a la circulacin materna es la de Creger y Steele en 1.957. se ha estimado que la proporcin de eritroblastos fetales en la circulacin materna es de ms de una clula fetal por 50.000 clulas maternas. Aproximadamente 0.7cc de sangre fetal se encuentra diluida en la circulacin materna. Los eritroblastos representan una poblacin celular diana ideal para los experimentos de aislamiento y deteccin de clulas fetales a partir de la circulacin materna, dado que en muy raras ocasiones circulan en sangre perifrica de adultos normales, estando presentes en cantidades considerables en la circulacin fetal. Dado que los eritroblastos tienen una vida media de tres meses, aquellos que se aislen de la circulacin perifrica materna durante el embarazo, seguramente habrn derivado del mismo.

B. TECNICAS INVASIVAS DE DIAGNOSTICO PRENATAL 1. BIOPSIA DE VELLOSIDAD CORIAL. Las vellosidades coriales derivan del trofoectodermo , poseen la misma constitucin gentica que el feto reflejando por tanto la situacin cromosmica , bioqumica y gnetica del mismo. La biopsia de vellosidad corial ( BVC ) fu primero realizada al final de la dcada de los 60 mediante histeroscopia ( Hahnemann y cols 1.968 ) , pero esta tcnica se asoci con bajo xito en la obtencin de adecuado material para la realizacin del cariotipo y fu abandonada en favor de la amniocentesis. En los aos 70 el deseo de un diagnstico precoz hizo que se reviviera la BVC , la cual fu inicialmente realizada mediante aspiracin a travs de una cnula que era introducida " a ciegas " dentro de la cavidad uterina por va transcervical ( Grupo Tietung 1.975 ). Posteriormente fu introducida la gua ecogrfica para la toma de la muestra transcervical ( Kazy y cols 1.982 ) o transabdominal ( Smidt - Jensen & Hahnemann 1.984 )utilizando diferentes tipos de cnulas y agujas. (121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131). Indicaciones Riesgo de cromosomopata. Riesgo de enfermedad monognica. Riesgo de infeccin intrauterina. Diagnstico mediante tcnicas de biologa molecular. Determinaciones bioqumicas y enzimticas. Tcnica Se realiza entre las 10 y las 13 semanas. Existen fundamentalmente dos tipos de tcnicas: Va transcervical. Va transabdominal. BVC Transabdominal - Paciente en decbito supino. - Grado de deplecin vesical variable. - Eleccin por ecografa del punto idneo para puncin. - Asepsia de pared abdominal con soluciones yodadas. - Puncin con aguja de 20 G y 9 cm hasta la placenta.

- Retirada del mandril y conexin de aguja de 20 cc con medio de cultivo realizando el vaco. - Movimiento de vaivn bajo presin negativa. - Retirada de la aguja sin presin negativa. - Recogida de la muestra en medio de cultivo separndo las vellosidades de los cogulos sanguneos. Contraindicaciones - Presencia de miomas. - Interposicin de asas intestinales. - Utero en posicin de marcada retroflexin. BVC Transcervical - Posicin de litotoma. - Introduccin del cateter a travs del canal endocervical. - Puede realizarse a travs de aspiracin con cateter de 17 G y 21 -26 cm o a travs de Pinza de Storz de 2 mm y 20 cm. Una vez localizado el cateter en la placenta no difiere en nada de la realizada por va transabdominal. Contraindicaciones: - Infeccin cervico vaginal activa. La va a utilizar depende fundamentalmente de tres factores: - Localizacin placentaria. - Existencia de una contraindicacin. - Experiencia del operador en una u otra tcnica. Seguridad: - Los niveles de obtencin de la muestra alcanzan el 98 % ( directamente relacionado con la experiencia del operador ) - La tasa de fallos del cultivo es del 1-2 %. Complicaciones: * Aborto: Aumento del riesgo de 0.8% con respecto a la amniocentesis. Relacionado con : - Experiencia del operador. - Nmero de punciones necesarias. - Va utilizada. Descritas mayores prdidas por va transcervical.

* Hemorragia: Suele ser de poca importancia. < 1 % Va transabdominal. 15-25 % Va transcervical. * Prdida de Lquido amnitico: 0.4 % * Infeccin: Poco frecuente 0.3 %. * Sensibilizacin Rh. * Sndrome de anomala reduccional: Se ha descrito en biopsias de vellosidad corial realizadas antes de las 9 semanas. * Fiabilidad. Existen a este respecto dos situaciones inconvenientes: 1. Contaminacin con clulas maternas Caracterstica de muestras escasas y precoces ya que en estas el punto de toma se situa en ntimo contacto con la decidua. 2. Mosaicismos Los mosaicismos confinados a la placenta tienen una incidencia del 1 % y su origen corresponde a una mutacin del trofoblasto o de las clulas del mesodermo extraembrionario. Ha sido descrito un aumento en la morbi-mortalidad perinatal en estos embarazos asociada a aparicin de retraso de crecimiento intrauterino y prdida fetal. En cualquier caso ante la presencia de un mosaico es mandatorio la confirmacin en lquido amnitico. 2. EMBRIOSCOPIA Y FETOSCOPIA. En el mbito del diagnstico prenatal temprano, el diagnstico por ultrasonidos llega con frecuencia a sus lmites especialmente cuando se trata de la precisa evaluacin del feto durante el primer y segundo trimestre del embarazo. Mediante la embriofetoscopia es posible realizar una valoracin ms precisa de posibles malformaciones fetales (132,133,134,135) . La embrioscopia se realizaba inicialmente por va transcervical, utilizando diferentes tipos de histeroscopios, con dimetros que variaban de 6 a 22 mm. El sistema ptico se introduca a la cavidad extracelmica bajo gua ecogrfica, sin comprometer el amnios, por lo que esta tcnica deba aplicarse entre las 7.5 y las 11 semanas de embarazo, estando limitada al diagnstico de sndromes genticos graves con alto riesgo de recidiva, que pueden ser diagnsticados con base a defectos estructurales externos antes de alcanzar las 11 semanas de embarazo. No es posible su aplicacin despus de las 11 semanas de embarazo, debido a que el espacio extracelmico ha desaparecido presentndose un alto riesgo de trauma del amnios. Durante el primer trimestre del embarazo es preferible , sin embargo , efectuar el examen del feto mediante ultrasonidos hacia las 11-12 semanas; el cual se aplica actualmente a embarazadas de bajo riesgo con la finalidad de datar el embarazo as como para realizar una valoracin gruesa de la anatoma fetal, siendo las

malformaciones fetales ms frecuentemente diagnosticadas en este estado la excencefalia, malformaciones de la zona de la nuca ( higroma qustico , translucencia nucal), onfalocele, hendiduras faciales, anomalas reduccionales de las extremidades e hidropesa fetal. Resulta poco probable sin embargo , que pueda efectuarse un diagnstico completo del feto mediante ultrasonidos a las 12 semanas y en el caso de fuertes sospechas de defectos estructurales concretos que puedan ir acompaados de anomalas adicionales no detectables mediante ultrasonidos; se presenta la fetoscopia transabdominal como una alternativa adicional. Antes del desarrollo de los equipos de ultrasonido de alta resolucin, se efectuaba la fetoscopia transabdominal utilizando endoscopios de 6 y 22 mm para el examen del feto humano y para la obtencin de muestras de sangre o tejidos fetales, con una tasa de prdida fetal del 4 - 8 %. El perfeccionamiento y desarrollo posterior de esta tcnica, ha permitido una visin directa del feto mediante un endoscopio de fibra ptica que puede conducirse hasta la cavidad amnitica a travs de una aguja de 2021 G durante la amniocentesis. Los endoscopios actuales permiten una mejor visualizacin con una elevada profundidad de campo ( desde 2 mm hasta ms de 5 cm )y un ngulo visual de 70 ( 2 cm de dimetro a una distancia de 1 cm ), suministrando la luz transmitida por la fuente de luz una clara imagen del feto. Existen varios puntos problemticos en cuanto a la aplicacin de esta tcnica: * Se recomienda suma prudencia al diagnosticar una anomala fetal en el primer trimestre del embarazo, ya que una precisa exploracin por ultrasonidos solamente es posible normalmente en el segundo trimestre. Esto es especialmente importante si tenemos en cuenta que la fetoscopia permite nicamente una valoracin incompleta de la anatoma externa del feto y con la exploracin por ultrasonidos en este estado del embarazo pueden pasarse por alto anomalas internas asociadas. * Los riesgos existentes para la retina fetal en formacin siguen siendo objeto de discusin. Con gallinas y ovejas no se ha podido probar que hayan sufrido lesiones en la retina al ser sometidas a la luz fra en procesos embrioscpicos y fetoscpicos. Actualmente se dispone slo en forma limitada de datos concernientes a seres humanos, pero los nios sometidos a embrioscopia transcervical durante el primer trimestre no han mostrado anomalas visuales. * El riesgo de prdida fetal inherente al procedimiento parece situarse al mismo nivel del riesgo asociado a la amniocentesis realizada a la misma edad gestacional. Sin embargo tadava deben aportarse ms pruebas al respecto, por lo que las pacientes deben ser asesoradas en consecuencia. 3. AMNIOCENTESIS PRECOZ CON AMNIOFILTRACION. La amniocentesis precoz hasta ahora se vena practicando antes de las 15 semanas de embarazo , por la facilidad tcnica de la puncin y por que la cantidad de clulas vibles obtenidas son suficientes para un cultivo celular satisfactorio. Publicaciones recientes demuestran que es posible practicar la amniocentesis antes de las 15 semanas (amniocentesis precoz) obteniendo prcticamente los mismos resultados que con la amniocentesis convencional de las 15 semanas (136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 ). Cuando la amniocentesis se practica en el primer trimestre del embarazo (antes de las 12 semanas) pueden presentarse varios inconvenientes. En primer lugar dificultades en el cultivo celular ,debido a que el nmero de clulas viables obtenido

es menor, lo que puede ocasionar fallas en el cultivo o un crecimiento celular ms lento. En segundo lugar, una disminucin importante del volumen total del lquido amnitico, debido a que la cantidad de lquido amnitico extrado representa un porcentaje mayor. La cantidad de lquido amnitico que se extrae son tantos centmetros como semanas de embarazo. Si tenemos en cuenta que el volumen total de lquido amnitico calculado a las 10 semanas es de 29,7 ml con un rango de 1833 ml, de 124 ml a las 14 semanas con un rango de 95-218 ml , y de 252 ml a las 17 semanas con un rango de 140-573ml, el volumen extrado a las 10 semanas equivale a 1/3 del volumen total. Como consecuencia de la disminucin del volumen del lquido amnitico, se han publicado malformaciones embrionarias, y un incremento de la prematuridad asociado a problemas respiratorios neonatales. Con el fn de obtener un mayor nmero de clulas vibles para lograr un acortamiento en el tiempo del cultivo citogentico sin modificar significativamente el volumen total de lquido amnitico, varios autores han puesto en marcha la amniocentesis con filtracin celular y reintroduccin del lquido a la cavidad amnitica. Esta tcnica permite practicar la amniocentesis en el primer trimestre sin modificar prcticamente el volumen de lquido amnitico. Tcnica. - Asepsia de la piel con solucin bactericida de amplio espectro. - Puncin ecoguiada hasta alcanzar la cavidad amnitica. - Aspiracin de la primera fraccin ( 1 ml ). - Conexin del circuito de amniofiltracin. - Aspiracin de 10 cc de lquido amnitico a travs de la conexin sin filtro (conexin libre ), para purgar el circuito y realizar cultivos de control en paralelo. - Aspiracin de 10 cc de LA a travs del primer filtro ( F1 ) y reinyeccin mediante la conexin libre. - Aspiracin de 10 cc de LA a travs del segundo filtro ( F2 ) y reinyeccin mediante la conexin libre. - Desconexin del circuito y marcaje de los filtros. El circuito se remite al laboratorio en bloque. Ventajas. La amniofiltracin permite la obtencin de un nmero de clulas muy superior al que se obtiene habitualmente mediante la amniocentesis clsica, logrando as acortar el tiempo de obtencin del cariotipo. Inconvenientes. Es una tcnica lenta, dura aproximadamente 10-12 minutos frente a 3-5 minutos de la amniocentesis convencional, lo que la hace molesta para la paciente.

Es costosa, el circuito de amniofiltracin tiene un costo aproximado de 200.000 pesos frente a los 20.000 pesos del material empleado en una amniocentesis convencional. Para su realizacin se precisa de dos especialistas calificados trabajando conjuntamente. Para obtener los mejores resultados se precisa combinar la amniofiltracin con tcnicas de cultivo forzado lo que implica unos medios de laboratorio importantes. Es por esto que a pesar de su buen rendimiento diagnstico, todava no queda claro que el costo - beneficio permita la aplicacin rutinaria de esta tcnica. 4. AMNIOCENTESIS CLASICA.

La amniocentesis es la tcnica invasiva ms comn en el diagnstico prenatal. Practicada entre las 15 y las 17 semanas de embarazo, se ha convertido en el modelo de referencia para comparar tcnicas dirigidas a la obtencin de tejido fetal (141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, ).

Las indicaciones para la realizacin de la amniocentesis son :

* Riesgo de cromosomopata . - Edad materna superior a los 35 aos. - Hijo anterior con cromosomopata. - Progenitor portador de anomala cromosmica. - Tamizaje bioqumico sugestivo. - Sospecha ecogrfica de cromosomopata. - Diagnstico ecogrfico de malformacin fetal. * Riesgo de enfermedad ligada al sexo. * Riesgo de enfermedad monognica. * Antecedente de hijo anterior portador de defecto congnito. * Riesgo de infeccin intrauterina ( cultivo de bacterias y virus, tcnicas de PCR ). * Determinaciones bioqumicas y enzimticas.

Tcnica.

En la historia de la amniocentesis se distinguen claramente dos etapas separadas por la introduccin de la ecografa. Antes de la misma la tcnica se realizaba "a ciegas ", localizando por palpacin el fondo uterino e intentando evitar la puncin en la zona fndica en donde se inserta la placenta con mayor frecuencia.

Las tcnicas ecoguiadas empiezan a utilizarse a partir de 1.970. En un primer tiempo se realizaba la ecografa inmediatamente antes de la amniocentesis para localizar la placenta y el lugar terico de puncin; posteriormente se introdujo el control ecogrfico continuo. En la actualidad la tcnica se halla completamente estandarizada, y los pasos que hay que seguir bien definidos por el European Study Group on Prenatal Diagnosis: Exploracin ecogrfica previa evaluando las caractersticas del tero, nmero de fetos, insercin placentaria y del cordn umbilical, caractersticas del lquido amnitico y morfologa fetal. Identificacin del punto idneo de puncin, evitando al mximo atravesar la placenta. Asepsia de la pared abdominal con una solucin antibacteriana de amplio espectro. Puncin con una aguja de 20-22 G y 7 a 12 cms de largo, provista de estilete para minimizar el riesgo de contaminacin materna. Con la punta de la aguja correctamente situada en la cavidad amnitica , se retira el mandril y el lquido debe fluir lentamente gota a gota. Aspiracin del primer ml de lquido amnitico con la finalidad de disminuir el riesgo de contaminacin materna, el cual se desecha. Aspiracin del volumen requerido de lquido procurando no extraer ms de 20 ml en total. Desconexin y retirada de la jeringa, retirando la aguja bajo visin ecogrfica. Confirmacin de vitalidad fetal mediante ecografa. Amniocentesis en el embarazo gemelar.

Se ha demostrado una mayor incidencia de defectos congnitos en los embarazos gemelares, tanto cromosmicos como no cromosmicos, considerndose as que la edad crtica materna para proceder al estudio del cariotipo son los 33 aos; en este momento el riesgo para sndrome de Down en el segundo trimestre en uno y otro gemelo es de 1: 234.

La importancia de la monitorizacin ecogrfica continua es mxima cuando la amniocentesis debe realizarse en un embarazo gemelar. En estos casos es imprescindible una cuidadosa identificacin de cada muestra por obvias razones. Sin embargo la identificacin correcta de la muestra pasa por el diagnstico de corionicidad. En general, puede aceptarse que en los embarazos monocorinicos es suficiente obtener la muestra de uno de los dos sacos. No debemos olvidar primero que los gemelos monocorinicos pueden tener cariotipos diferentes y segundo que la determinacin ecogrfica de la corionicidad tiene una sensibilidad del 80 al 97 %, lo cual obliga a obtener muestras de ambos sacos.

Se han descrito distintos mtodos para asegurar que las muestras no procedan del mismo compartimento; desde la inyeccin de un colorante vital ( ndigo carmin o azul de evans ) hasta la de aire para dibujar la membrana. Sin embargo en la mayora de los casos, con la resolucin de los equipos ecogrficos actuales, es posible visualizar la membrana sin dificultades, asegurando as la procedencia de la muestra (151,152,153,154) .

En cuanto a la tcnica en s, se adapta en general a la normativa del European Study Group on Prenatal Diagnosis, sin embargo por las caractersticas propias del embarazo gemelar , se emplean distintas variaciones tcnicas.

Clsicamente la puncin se realiza con dos agujas distintas, una para cada saco. En la primera puncin se obtiene la muestra del primer saco y se inyecta el colorante vital o el aire. Se realiza luego la segunda puncin, y en el caso del colorante el color claro del lquido asegurar la procedencia del mismo.

Recientemente Jeanty ha descrito una tcnica en la que se obtiene la muestra de ambos compartimentos mediante una insercin nica de la aguja. Bajo visualizacin directa de la membrana se introduce la aguja en el primer compartimento, tras obtener la muestra se atraviesa la membrana y se aspira 1 ml que se desecha, posteriormente se aspira la cantidad precisa de lquido amnitico del segundo compartimento.

5. CORDOCENTESIS.

Desde 1.982 es posible obtener sangre fetal durante el embarazo. Antes la obtencin de sangre fetal se realizaba mediante fetoscopia, tcnica bastante compleja con un alto riesgo de prdida fetal. Estaba limitada por esto a centros altamente especializados y se realizaba slo para el diagnstico prenatal de ciertos desrdenes hereditarios ( hemoglobinopatas, hemofilia ).

La introduccin de la obtencin de sangre fetal mediante puncin transabdominal ecoguiada del cordn umbilical ( cordocentesis ) por el grupo de Daffos en 1.982, revolucion el concepto del diagnstico fetal y ampli los lmites de la medicina fetal ( 155,156,157,158,159,160,161).

Sus principales indicaciones son:

* Determinacin rpida del cariotipo . * Sustratos bioqumicos, enzimticos y hormonales. * Estudio del estado hematolgico fetal. * Estudio de la infeccin fetal. * Estudio del equilibrio cido - bsico fetal.

Previamente se deben determinar el grupo sanguneo y Rh maternos, as como la edad fetal por ecografa. Tcnica.

- Identificacin de la base de insercin del cordn en la placenta y determinacin del punto de acceso a la base del cordn sin interposicin de partes fetales ( punto ptimo de puncin ).

- Asepsia de la piel con solucin bactericida de amplio espectro.

- Puncin ecoguiada hasta la base del cordn con aguja 20 G. En las placentas de insercin anterior la puncin es transplacentaria intentando no acceder hasta la cavidad amnitica. En las placentas de insercin posterior, la puncin se realiza aproximadamente a 1 cm de la insercin.

- Extraccin del mandril. Si la punta de la aguja se halla en la localizacin precisa, fluir sangre lentamente; en caso contrario deber aspirarse con jeringa de insulina. La sensacin de vaco caracterstica indicar que la punta de la aguja se halla situada en la gelatina de Wharton. Imprimiendo un movimiento de avance y rotacin a la aguja se conseguir el acceso a los vasos fetales. El vaco realizado en la jeringa permitir identificar el momento preciso de entrada en el vaso ya que se llenar de sangre.

- Aspiracin con jeringa de insulina, heparinizada o no dependiendo del destino de la muestra, en la cantidad precisa. Inyeccin lenta de 2-3 ml de suero fisiolgico con el objetivo de identificar el vaso puncionado y reponer en parte la volemia.

- Extraccin de la aguja mediante control ecogrfico. No se reintroduce el mandril para minimizar las posibilidades de infeccin. Control posterior.

- Control ecogrfico del tiempo de sangrado en el punto de puncin.

- Acreditacin de la procedencia fetal de la muestra realizando un coulter ( VCM ).

- Confirmacin de latido cardaco y movimientos fetales, prestando especial atencin a la presencia de desprendimientos, hemorragias y hematomas placentarios y del cordn. Precauciones.

Los riesgos inherentes a la prctica de la cordocentesis se minimizan si se tienen en cuenta los siguientes puntos:

* No aspirar ms de 4 ml en el segundo trimestre. * No aspirar ms de 6 ml en el tercer trimestre. * Tiempo limitado a 5 minutos por puncin. * No realizar ms de 2 punciones por sesin. * Administracin de gamaglobulina anti D en caso de paciente Rh negativa.

* Control ecogrfico una semana despus. Complicaciones.

- Bradicardia fetal. - Sangrado del punto de puncin. - Hematoma umbilical. - Corioamnionitis. - Aborto ( 1-2 % ). 6. CARDIOCENTESIS.

La cardiocentesis ( 162 ) es una tcnica invasiva dirigida a la obtencin de una muestra de sangre fetal pura y que actualmente ha visto restringidas sus indicaciones a dos:

1- Obtencin de sangre fetal con fines diagnsticos ante condiciones extremas que imposibiliten la obtencin por otros medios ( insercin placentaria de cordn, porcin intraheptica o asa libre ), como en el caso de oligoamnios severo.

2- Embrioreduccin.

Se estima que el riesgo de prdida fetal asociado a la cardiocentesis es mucho mayor que en el caso de la cordocentesis, estimndose alrededor del 5 %. 7. BIOPSIA FETAL.

Se realiza bajo control ecogrfico y sus indicaciones estn limitadas a enfermedades metablicas y cutneas (163, 164, 165, 166, 167) . * Biopsia de piel. ( Genodermatosis ) * Biopsia renal. * Biopsia heptica. * Biopsia pulmonar. 8. CELOCENTESIS.

Durante el primer trimestre del embarazo el saco amnitico est rodeado por la cavidad exocelmica la cual se deriva del mesodermo extra embrionario.

La tcnica consiste en la obtencin de lquido celmico mediante la insercin transvaginal de una aguja 20 G ; este lquido es analizado como material gentico mediante tcnicas de hibridacin in situ ( FISH ) y reaccin en cadena de la polimerasa ( PCR ), estando el diagnstico restringido a aneuploidas que comprometen los cromosomas X, Y, 13,18 y 21 que representan entre el 66 y 88 % de los defectos cromosmicos.

La seguridad y fiabilidad de la celocentesis es an desconocida y por el momento esta tcnica continua como experimental ( 168 ). 9. LAVADO TRANSCERVICAL.

Tcnica experimental que obtiene clulas exfoliadas placentarias mediante lavado del canal cervical ( 169,170,171).

La seguridad y fiabilidad de esta tcnica permanece an incierta. 10. DIAGNOSTICO PREIMPLANTACION.

La relativa facilidad con que se logra el acceso a los gametos y embriones humanos ha hecho del diagnstico preimplantacin una realidad. Han sido descritas tcnicas invasivas como la biopsia embrionaria , del blastocisto y del cuerpo polar; as como mtodos no invasivos como la hibridacin in situ ( FISH ) y la replicacin del DNA mediante reaccin en cadena de la polimerasa ( PCR).

El diagnstico preimplantacin (172,173,174,175,176,177,178,179 ) ( DPI ) es una forma muy precoz de DPN, que posibilita el estudio gentico de gametos o/y embriones con la subsiguiente seleccin de aquellos no afectos para ser transferidos. Por lo tanto la finalidad del DPI es lograr embarazos de fetos no afectos en parejas con alto riesgo de transmitir enfermedades genticas a su descendencia. En este sentido entonces, el DPI debe interpretarse como una alternativa al DPN en el primer trimestre del embarazo, y como una opcin diagnstica de la que pueden beneficiarse determinadas parejas de alto riesgo gentico.

La pricipal desventaja del DPI es la necesidad de someterse a una fecundacin in vitro( FIV ), procedimiento que presenta tasas de xito del 25-30 % y la incertidumbre y desesperanza que conlleva la espera para la confirmacin o no del embarazo. Es necesario que la pareja sea plenamente informada de la fiabilidad y limitaciones del DPI antes de embarcarse en un programa de reproduccin asistida.

El DPI permite el estudio citogentico de gametos y embriones. Frente al DPI de enfermedades monognicas, el diagnstico citogentico presenta la ventaja de ser aplicable a un mayor nmero de parejas con un riesgo gentico uniforme, bsicamente, parejas con un alto riesgo de presentar en la descendencia: aneuploidas, anomalas cromosmicas estructurales desequilibradas, y enfermedades genticas ligadas al cromosoma X ( recesivas o dominantes ).

Dado que el DPI es una forma muy precoz de DPN, en teora las indicaciones del DPI debieran ser las mismas que las del DPN. Pero debido a la limitacin del material disponible para DPI (un gameto, una o dos clulas de un embrin) y las caractersticas de dicho material (la dificultad del cultivo celular del mismo), no toda indicacin citogentica de DPN es en la actualidad indicacin de DPI. As pues, aquellas parejas que pueden beneficiarse del DPI citogentico, son aquellas en que la anomala puede ser detectada de forma fcil y fiable mediante FISH.

Teniendo en cuenta que para llevar a cabo un DPI es necesario realizar tcnicas de reproduccin asistida, el DPI est especialmente indicado en aquellas parejas con problemas de infertilidad/esterilidad que ya estn participando en un programa de FIV y que presentan un riesgo gentico alto.

Igualmente, el DPI puede ser especialmente til en aquellas parejas con elevado riesgo de transmitir anomalas genticas a su descendencia y que tienen una historia reproductiva pobre (abortos a repeticin, fetos malformados , etc). En este grupo de parejas el DPI y la transferencia a la cavidad uterina de embriones sanos puede significar la nica manera de conseguir embarazos evolutivos de fetos no afectos.

Otro grupo de parejas que pueden beneficiarse de un DPI es aquel en que uno de los progenitores se ha sometido en el pasado a tcnicas de esterilizacin como

consecuencia del elevado riesgo de transmisin de anomalas genticas a la descendencia y la no disponibilidad de diagnstico prenatal aceptable en aquel momento, siendo posible este en la actualidad.

Finalmente, aquellas parejas con un elevado riesgo gentico y para las cuales no existe por el momento un DPN especfico, pueden tambin beneficiarse del DPI. As aquellas pacientes portadoras de una enfermedad recesiva ligada al X para la cual no exista un diagnstico molecular especfico pueden optar por la seleccin preimplantacional de embriones femeninos para la transferencia de los mismos a la cavidad uterina.

La utilizacin de la tcinca de FISH en DPI permite la realizacin de diversos tipos de estudios citogenticos, dependiendo del tipo de anomala a riesgo de ser heredada por la descendencia. Entre los estudios estn : Determinacin del sexo cromosmico. Parejas con abortos espontneos a repeticin. Pacientes con alteraciones de la meiosis. Pacientes en FIV de edad avanzada. Pacientes FIV con fallos de implantacin Pacientes con anomalas cromosmicas estructurales. Es importante recordar que el xito de un programa de DPI, depende de la estrecha colaboracin entre los especialistas y profesionales implicados en el mismo (clnicos, ecografistas, embrilogos, psiclogos, genetista clnicos, citogenetistas y bilogos moleculares). Los avances en cada una de estas especialidades permitir un mayor desarrollo a esta nueva alternativa en diagnstico prenatal.