1 - Biotecnología de Microalgas

Departamento de Ingeniera Qumica - Universidad de Almera
Biotecnologa de Microalgas
Microalgas para la produccin de biocombustibles y otros productos de inters: perspectivas para su aplicacin industrial en Chile
Consorcio Tecnolgico Desert BioenergyS.A
Biotecnologa de Microalgas: de metabolitos 28-30 Octubre 2013 Produccin Universidad de la secundarios Frontera
Emilio Molina Grima Emilio Molina Grima
APPLICATIONS OF MICROALGAE
Pure chemicals: EPA, AA, DHA Astaxanthin Betacarotene Luteine Phycocyanins Phycoerythrins Dino toxins C13 PUFAs Biomass Animal feeding Aquaculture Functional foods Tailored lipids
Biofuels/biofertilizers Biodiesel Bioethanol Biogas Biofertilizers
Bioremediation Flue gases Wastewater Soils
PRODUCTION TECHNOLOGY
FINAL USE OF MICROALGAE
CURRENT SCENARIO
Economics Applications of microalgae and strains
Human and animal nutrition Aquaculture Biofertilizers Depuration and bio-remediation Production of hydrogen and methane
2004
Biofuels from microalgae Bioactive and Novel Chemicals High-value Recombinant Protein Production
2004
2013
Chlorella Arthrospira (Spirulina) Dunaliella Haematococcus Porphyridium
Nannochloropsis
Nostoc
Biotecnologa de Microalgas: Produccin de metabolitos secundarios Emilio Molina Grima
ndice de la exposicin
1) Microalgas: caracterizacin y particularidades
2) Biotecnologa de microalgas 3) Fundamentos del cultivo de microalgas
4) Sistemas de cultivo y produccin a gran escala
Biotecnologa de Microalgas: Produccin de metabolitos secundarios
Emilio Molina Grima
Microorganismos unicelulares fotoautotrficos
Gran capacidad de generacin de biomasa
Biomasa de composicin compleja
Gran plasticidad metablica Diversidad de especies
Emilio Molina Grima
Microorganismos unicelulares fotoautotrficos
Microalgas
LUZ
Nutrientes, agua
Ms microalgas
O2
Metabolitos
CO2
Microorganismos (diferencia con las macroalgas)
Gran velocidad de duplicacin por ser microorganismos

Fottrofos (aunque flexibles) : su fuente de energa es la luz Auttrofos: Su fuente de carbono es el CO2
Emilio Molina Grima
Microalgas
Macroalgas o plantas
Microalgas: tiempo corto de duplicacin = gran velocidad de crecimiento No necesitan suelo Elevada eficiencia fotosinttica (referenciada hasta el 10%)
Emilio Molina Grima

Velocidad especfica de crecimiento
Biomasa
1 dCb Cb dt
Productividad
Cmicroalgas
t
Cotras tiempo
Cb
dCb dt
Emilio Molina Grima
Biomasa de composicin compleja: componentes de inters
Protenas y otros nutrientes: alimentacin humana y piensos para ganado
Capacidad quelante: biorremediacin

cidos grasos poliinsaturados
Clorofilas
Carotenoides
Enzimas antioxidantes (SOD)

Pigmentos fluorescentes
Exopolisacridos
Compuestos bioactivos: antifngicos, antivirales, citotxicos
ACUICULTURA
Componentes de gran inters en comparacin con otras biomasas de origen vegetal (plantas terrestres o macroalgas)
Gran plasticidad metablica

Posibilidad de modificar la composicin mediante las condiciones de cultivo
Temperatura Luminosidad Nitrgeno pH
Salinidad
Edad del cultivo
Composicin controlable. Optimizacin de los procesos de estabilizacin y extraccin
Emilio Molina Grima
Diversidad de especies
Muchas especies catalogadas y disponibles Slo unas pocas estudiadas y aprovechadas comercialmente Gran potencialidad de productos y aplicaciones
Haematococcus pluvialis
Dunaliela salina
Phaeodactylum tricornutum
Emilio Molina Grima
Diversidad de especies
Isochrysis galbana Phorphyridium cruentum Chlorella sp.
Anabaena.
Skeletonema costatum
Tetraselmis suecica
Emilio Molina Grima
2) Biotecnologa de microalgas
Aislamiento y conservacin de cepas

Seleccin y mejora Caracterizacin de las condiciones de cultivo Diseo de fotobiorreactores
Cosechado y recuperacin
Procesado y extraccin de productos de inters
Emilio Molina Grima
3) Fundamentos del cultivo de microalgas
Obtencin y preparacin de inculos Necesidades de los cultivos Medio de cultivo
Intercambio de gases
Mantenimiento del pH
Termostatacin
Agitacin y mezcla
Iluminacin
Emilio Molina Grima
Obtencin y preparacin de inculos

Primer paso: aislamiento de la estirpe
Cultivo axnico: slo la microalga deseada, libre de otros microorganismos Cultivo monoalgal: slo la microalga deseada, puede haber otros microorganismos compatibles Mantenimiento de inculos Depsito en colecciones (ej: CCAP, Oban, Scotland, UK)
Necesidades de los cultivos de microalgas

Cultivos: multiplicacin (casi) ilimitada del inculo
Proveer las necesidades de las microalgas para posibilitar el crecimiento
O2
Inculo Agitacin
CO2
Luz
Nutrientes (medio)
Necesidades de los cultivos de microalgas

Ejemplo de un cultivo creciendo en laboratorio
O2
Agitacin
O2
Microalgas reproduciendose
CO2 Luz Luz

Nutrientes (medio)
Nutrientes (medio)
Agitacin
Es prctica comn aunar la agitacin, aporte de CO2 y retirada de O2 usando una corriente de aireacin para las tras cosas
CO2
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (presentacin de los nutrientes mayoritarios)

Suministrar los elementos para que la fotosntesis genere biomasa
Los cuatro elementos mayoritarios de la materia viva

Oxgeno Nitrgeno Hidrgeno Carbono
Otros elementos mayoritarios Fsforo Magnesio Azufre Iones del medio (K+, Na+, Cl-, ):
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (carbono)

Suministrado como CO2
Capturado en el ciclo de Calvin Enzima: RUBISCO
Consume ATP y NADPH de la fotosntesis
Es un paso LIMITANTE: debe haber siempre suficiente CO2

Acumulacin de ATP y NADPH de la fotosntesis: FOTOINHIBICIN
Medio de cultivo (carbono)
CONSECUENCIAS
El CO2 debe ser suministrado en exceso controlado (prevenir bajada del pH) El contenido en CO2 del aire es insuficiente
Es prctica comn suplementar con CO2 por varias tcnicas -Enriquecimiento de la corriente de aireacin - Aporte controlado por el pH - Aporte de bicarbonato y acidificacin
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (oxgeno)
Segundo componente mayoritario de la biomasa seca
Aportado a las celulas en la mayor parte por el CO2 condensado en el ciclo de Calvin (oxgeno fijado)
Aportado al medio de cultivo por el AGUA, H2O, asociado a la liberacin de O2 en el PS II (oxgeno liberado)
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (hidrgeno)
Proviene del agua
Asociado a la liberacin de O2 en el fotosistema 2
Llevado a cabo por un enzima con un ncleo de 4 tomos de manganeso
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (nitrgeno)
Supone un 5% de la biomasa seca Forma parte de las protenas de la biomasa Es aportado como nitrato, a veces como amonio y raramente en otras formas (urea, aminocidos) El nitrgeno del nitrato (N+5) ha de ser fuertemente reducido (N-3). An as es la forma mejor aceptada por las microalgas Algunas cianobacterias pueden FIJAR EL NITRGENO MOLECULAR.
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (nitrgeno)

NO3- (sal sdica, potsica o amnica), 50 mg/L 1 g/L
Observacin: la reduccin del nitrato AUMENTA el pH
NH4+ (cloruro), concentracin inferior al nitrato, ligramente txico

Ventajoso para prevenir contaminaciones cuando la especie cultivada lo tolera
Ocasionalmente como urea (NH2-CO-NH2) o como aminocidos (R-CH2-COOH)
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (otros nutrientes mayoritarios)

Fsforo (como fosfatos): ubcuo (ATP, protenas, lpidos de membrana) Magnesio (Mg+2): componente de las clorofilas
Azufre (sulfatos)
Calcio
Potasio
Otros iones comunes en agua (ver ejemplo)

Medio de cultivo (micronutrientes)

Componentes que aparecen a nivel de trazas Cofactores, ncleos de enzimas (rotura del agua), etc
Minerales Hierro Manganeso
Vitaminas Variable
Cobalto
Molibdeno Cobre Zinc
Medio de cultivo (ejemplo: Mann&Myers)
Componente Macronutrientes MgSO4.7H2O NaNO3 CaCl2 K2HPO4 Micronutrientes Na2EDTA H3BO3 FeSO4.7H2O MnCl2 ZnSO4. 7H2O Co(NO3)2. 6H2O CuSO4. 5H2O
Concentracin (g/L)
1,2 1,0 0,30 0,10
0,030 0,0060 0,002 0,00140 0,00033 0,000007 0,000002
Emilio Molina Grima
Medio de cultivo (mixotrfico y heterotrfico)

Algunas microalgas pueden obtener carbono de fuentes diferentes del CO2
Algunas microalgas pueden obtener energa de fuentes qumicas (sin fotosntesis)
MIXOTRFICO: capaces de asimilar carbono de fuentes orgnicas aunque la fotosntesis es imprescindible
HETEROTRFICO: capaces de asimilar carbono de fuentes orgnicas y de usar la energa qumica de estas fuentes. Pueden crecer sin luz.
Emilio Molina Grima
Aporte de CO2 y retirada del O2 fotosinttico
Aporte de CO2 : imprescindible un aporte correcto (explicado antes)
Retirada de O2 : evitar la acumulacin (fotooxidacin, prdida de rendimiento de la RUBISCO, estress oxidativo)
Intercambio a travs de la SUPERFICIE del cultivo INSUFICIENTE
Uso de CORRIENTE DE AIREACIN (aprox. 0,5 L aire cn/ (Lmin))
Emilio Molina Grima
Intercambio de gases (corriente de aireacin)
Burbujeo de gas (aire enriquecido en CO2) en la base del cultivo o en puerto dedicado
Suficiente pero no excesivo porque: Coste de bombeo Estrs hidrodinmico
Evaporacin de agua Ineficiencia
Emilio Molina Grima
Necesario pH ptimo para una velocidad de crecimiento elevada
pH propio de cada especie Oscila entre 7-8, aunque hay casos extremos entre 3 y 10
Factores que hacen variar el pH: Equilibrio de especies del carbono inorgnico
CO2
H 2O
H 2CO3
HCO3
CO3
Reduccin del nitrato
NO3
6e
4 H 2O
NH 4
7OH
Emilio Molina Grima
Uso de tampones (tris- hidroximetil aminometano)
Adicin controlada de cido
Aireacin enriquecida en CO2 (1-5%)

Inyeccin de CO2 a la demanda
pH controller
P
CO2
Corriente Aireacin
Emilio Molina Grima
Agitacin y mezcla
Imprescindible para Evitar deposiciones
Evitar gradientes de nutrientes y luz Homogeneizar los cultivos Favorecer la tranferencia de calor y de materia
La tecnologa apropiada depende de la configuracin del sistema de cultivo Corriente de aireacin (burbujeo) Agitadores Paletas Bombeo
Emilio Molina Grima
Iluminacin
La luz es imprescindible para el cultivo fototrfico de microalgas
Es ENERGA RADIANTE que se propaga en el vaco y medios transparentes Llega al cultivo y es absorbida segn va penetrando en el interior
Medida de la Intensidad de la luz

Moles de fotones por m2 y segundo 1 mol de fotones = Einstein (E) Sol a mediodia : 2000-3000 E/m2/s ()
LUZ
La luz absorbida por la microalga es convertida en biomasa
Luz atenuada
Emilio Molina Grima
Iluminacin: atenuacin de la luz

En el seno del cultivo, la intensidad de la luz se va atenuando al ser absorbida
Baja concentracin Intensidad Alta concentracin
Profundidad en el cultivo
Iluminacin: cultivos densos y gradientes de iluminacin

Un cultivo eficiente DEBE absorber la mayor parte de la luz Se producen zonas oscuras en el seno del cultivo
0.05 Respiration
Photosynthesis rate, mmolO2/Ls
Saturation
Photoinhibition
0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 -0.01 -0.02 0 50 100 150 200 250 300
Irradiancia promedio Iav
Irradiance, mE/m2s
Iav
Io 1 exp Ka p Cb
Ka p Cb
Gran parte de las microalgas reciben menos luz de la que pueden asimilar El aporte de luz es el factor que limita el crecimiento. Es la situacin ms favorable La luz disponible a la poblacin se cuantifica como un promedio
Iluminacin: fotolimitacin
En la situacin anterior, el cultivo est fotolimitado Tiene suficiente de todo, menos de luz
Nos aseguramos de que todos los electrones producidos en la fase luminosa puedan ser asimilados en el ciclo de Calvin Existe una relacin entre la velocidad de crecimiento (especfica) y la luz disponible
Iav
max K I I av
Emilio Molina Grima
Iluminacin y mezcla: evitar la fotoinhibicin

Zona sobreiluminada Zona obscura
En las zonas externas, el cultivo puede estar SOBRESATURADO DE LUZ La sobresaturacin provoca un desacoplamiento del flujo de electrones fotosintticos El mecanismo no est an claro : Dao al fotosistema II un mecanismo de defensa?
En las zonas internas, el cultivo puede estar DESPROVISTO DE LUZ La falta de luz detiene la produccin de ATP y NADPH y con ello la fijacin de carbono
El ciclo de Calvin se detiene
Emilio Molina Grima
Iluminacin y mezcla: evitar la fotoinhibicin

El movimiento frecuente entre zonas oscuras e iluminadas proporciona una exposicin ptima La mezcla es imprescindible para un adecuado rgimen de luz
Zona sobreiluminada
Zona oscura
Fotoinhibida
Muy limitada
Emilio Molina Grima
Resumen: fundamentos del cultivo

Las microalgas necesitan ciertas condiciones para proliferar y generar grandes cantidades de biomasa y/o productos de inters
Las necesidades son Entorno axnico o monoalgal Medio de cultivo Termostatacin Agitacin y mezcla
Iluminacin
Los sistemas de cultivo que se presentan a continuacin intentan mantener estas condiciones para producir al menor costo
Emilio Molina Grima
Relationship among parameters that influence biomass productivity

Design and orientation Geographic and climatic localization Day of the year Fluid-dynamic
Geometry
Incident solar radiation
Temperature
Mass transfer
Light profile, average irradiance Biomass concentration Biomass Productivity Growth rate
Light regime
E. Molina Grima 1999, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, biocalysis and Bioseparations. 1753-1769, John Wiley and Sons Inc.
Departamento de Ingeniera Qumica Biotecnologa de Microalgas: Produccin de metabolitos secundarios Universidad de Almera Emilio
Molina Grima
MASS PRODUCTION OF MICROALGAE

Influence of photobioreactor location and orientation
E. Sierra et al. / Chemical Engineering Journal 138 (2008) 136147
Emilio Molina Grima

Solar radiation availability
Solar radiation availability range from zero to a maximum of 350 W/m2 In template zones the mean solar radiation availability is 250 W/m2, equivalent to 21.6 MJ/m2day and 2160 kWh/m2year
Considering a photosynthetic yield of 5%, and a biomass heat combustion of 20 MJ/kg, an energy balance demonstrate that the maximum productivity achievable is 272 Tn/Hayear, reducing to 194 Tn/Hayear in template climates
Emilio Molina Grima

Maximum productivity
The energy balance demonstrate that in template climates the maximum mean productivity along the year is 54 g/m2day
Volumetric productivity is a function of V/S ratio of the reactor

In reactors with V/S ratio of 200 L/m2 the maximum productivity is 0.27 g/Lday In reactors with V/S ratio of 25L/m2 the maximum productivity is 1.69 g/Lday
Pbvol
g m3day
Pbarea V
g m2day
m3 S m2
These values can be only obtained under optimal operation conditions and using optimally designed and operated photobioreactors
Emilio Molina Grima

Harvest and culture volume
The typical value of maximum specific growth rate of microalgae species is 1 day-1
Optimal dilution rate for continuous operation is in the range of 40-60% of maximum specific growth rate Actually, optimal dilution rate for operation of microalgae cultures is close to 0.4 1/day. Considering the optimal value of dilution rate it is possible to determine the biomass concentration achievable inside the culture under optimal conditions, in addition to volume of the reactor and harvest volume to produce 1 kg of biomass, as a function of V/S ratio
Cbvol
g m3
Pbvol
g m day 1 D day
3
Mday Vculture m3 Pbvol
g day g 3 m day
Vharvest
m3 day
Vculture m3 D
1 day
The higher the V/S ratio of the reactor, the higher the volume of culture and the volume of harvest to manage to produce a mass unit of biomass
Emilio Molina Grima

Etapas en la produccin de microalgas
Modos de cultivo Discontinuo Continuo Semicontinuo
Sistemas abiertos y cerrados Open ponds y raceways Breve visin de la tecnooga de fotobiorreactores cerrados Cosechado de la biomasa
Almacenamiento y conservacin
Desarrollos actuales
Reduccin de emisiones de CO2 Produccin de biocombustibles Produccin de biomasa Obtencin de biomolculas de alto valor Depuracin deaguas residuales
Etapas en la produccin de microalgas

Preparacin de inculos
Preparacin y esterilizacin de medios (segn sistema)

Trmico Filtracin esterilizante Esterilizacin del fotobiorreactor (sistema de cultivo) (segn sistema o especie)
Trmica Qumica
Cultivo Cosechado de la biomasa Centrifugacin Filtracin Decantacin
Nos centraremos en el sistema de cultivo fotobiorreactor

Modos de cultivo
Discontinuo
Carga (inculo + medio) Crecimiento Cosechado total Nuevo ciclo Continuo
Diferentes formas de hacer funcionar el fotobiorreactor
Medio
Medio
Carga Crecimiento inicial (arranque) Adicin continua de medio fresco Cosechado por rebose
Adicin contnua de medio
Semicontinuo Carga Crecimiento inicial (arranque) Adicin peridica de medio fresco Cosechado por rebose
Medio
Adicin peridica de medio
Emilio Molina Grima
Sistemas abiertos y cerrados

Dos clases de sistemas de cultivo muy diferentes Abiertos: cultivo en contacto con el medio ambiente Sistemas grandes Baja-media concentracin de biomasa Instalacin barata Pbremente controlados Poco control sobre la biomasa Slo apropiados para especies resistentes
Cerrados: cultivo aislado del medio ambiente

Instalacin cara Alta concentracin de biomasa Sin contaminacin (monoalgales e incluso axnicos) Control eficiente Eficaces con especies poco resistentes Composicin de la biomasa conocida y reproducible Los diferentes diseos solucionan con diferentes tcnicas el suministro de gases, nutrientes, correcta mezcla y manejo del cultivo Biotecnologa de Microalgas: Produccin de metabolitos secundarios
Emilio Molina Grima
Sistemas abiertos: open ponds y raceways
Paddle wheel
Paddle wheel
Typical biomass productivity 0.015 kg m 2 day 1 ( 45 tons ha 1 year 1) Maximum biomass concentration 0.5 kg m 3 (0.25 kg m 3 typical) Volume to surface ratio 0.2-0.4 m3 m-2
First commercial algae production in world, for Chlorella, for human consumption, Japan ~1960
Designs by Prof. Tamiya


inyeccin CO2 Pared
Emilio Molina Grima

Cultivo de Spirulina Biomasa rica en protena Crece a pH muy alto Resistente a condiciones agresivas
Cultivo de Dunaliella salina
Produccin de -caroteno Halotolerante Luminosidad y salinidad favorecen el proceso
D. salina en open ponds

D. salina en raceways
Emilio Molina Grima
Cyanotech Co., Hawaii, USA Open, raceway ponds. Red for Haematococcus for astaxanthin, ($>1million/ton) others Spirulina
Spirulina
Haematococcus
Courtesy Gerald Cyseswki

Pilot plant of raceway reactors (Cajamar Foundation, Almera)
Emilio Molina Grima
Fotobiorreactores cerrados
Crecimiento de microalgas aisladas del medio ambiente Control riguroso Contaminacin reducida mplia gama de especies Muchos modelos Clasificacin Verticales Planos Columnas de burbujeo
Sin/con recirculacin interna
Horizontales (lazo externo + desgasificador) Lazo simple Doble lazo Manifold Empalizada Otros diseos
Columnas de burbujeo: Cilindros verticales con burbujeo en la base

Ventajas
Diseo sencillo Aireacin: transferencia y agitacin Ocupan poco suelo Buena desgasificacin Inconvenientes Difciles de escalar Poca penetracin de luz Poca intercepcin de luz solar a mediodia Tranferencia de CO2 ineficiente Sistemas con recirculacin interna Patrn de flujo ordenado Mejora del rgimen de luz
Emilio Molina Grima
Columnas de burbujeo: Cilindros verticales con burbujeo en la base
Emilio Molina Grima
PRODUCTION TECHNOLOGIES
Closed photobioreactors: Bubble columns
Emilio Molina Grima
RWE, Germany, hanging bags PBR to capture CO2 from a coalfired power plant - would need 100 million such bags!
Emilio Molina Grima
Fotobiorreactores planos
Ventajas
Mejor penetracin de la luz Orientables Alta concentracin de biomasa
Emilio Molina Grima
Closed photobioreactors: Flat panel photobioreactors
Typical biomass productivity 0.035 kg m 2 day 1 ( 80 tons ha Maximum biomass concentration 2.0 kg m 3 (1.0 kg m 3 typical) Volume to surface ratio 0.07-0.1 m3 m-2
year 1)
Emilio Molina Grima
Fotobiorreactores planos
Emilio Molina Grima
ENDESA Flat panel photobioreactors for CO2 capture at UPT Litoral. Carboneras, Spain
Emilio Molina Grima
Closed photobioreactors: Tubular photobioreactors
Typical biomass productivity 0.050 kg m 2 day 1 ( 100 tons ha Maximum biomass concentration 3.0 kg m 3 (1.5 kg m 3 typical) Volume to surface ratio 0.04-0.08 m3 m-2
year 1)
Emilio Molina Grima
Sistemas tubulares horizontales

Particularidades del diseo
Separan el dispositivo desgasificador y el lazo externo Desgasificador: bombeo e intercambio de gases Lazo externo: captacin de luz Diversidad de diseos del lazo Ventajas Buena captacin de luz Condiciones ptimas en ambos subsistemas Aprovechamiento de CO2 (inyeccin en el lazo) Alta concentracin de biomasa Elevada productividad Inconvenientes Diseo ms caro Limpieza difcil Necesidad de control Acumulacin de O2 en el lazo
TUBULAR PHOTOBIOREACTORS
Design of tubular photobioreactors
External
loop: Optimized to maximize the light capture Optimized to minimize the occupied surface
Bubble
column/airlift system: Optimized for the right circulation of liquid Optimized to satisfy gases exchange requirements (O2 y CO2)
Emilio Molina Grima

Gases de salida Agua de enfriamiento Medio
ESQUEMA DEL REACTOR
Cosechado
Bomba
Sondas CO2
AIRE
Emilio Molina Grima
Chlorella produced in Photobioreactors (Kloetze, Germany,]
Courtesy Otto
Emilio Molina Grima
Emilio Molina Grima
Emilio Molina Grima
Sistemas tubulares
Emilio Molina Grima
Sistemas tubulares
Emilio Molina Grima
Emilio Molina Grima
START-UP OF AN INDUSTRIAL FACILITY

Final scheme of tubular photobioreactors
Loop: Tube lenght = 400 m Tube diameter = 9 cm n tubes = 22 Volume = 500 L Fluid circulation: centrifugal pump Temperature control: heat exchanger
Medium inlet Culture outlet (to recovery)
Degasser Reactor:
pH & DO2 probes

Instrumentation & actuators Inlet (from loop)
Degasser
Cooling water Heat exchanger Air injection Degasser outlet Pumpp (to Loop) CO2 injection Sample withdrawal
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Emilio Molina Grima Emilio Molina Grima

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