REAO DE INIBIO DA HEMAGLUTINAO PARA O VIRUS DA RUBOLA TCNICA SIMPLIFICADA*

J. A. Luca M. L. Nelly

N. Candeias ** Neira *** Rcz** M. F. Candeias ***

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CANDEIAS, J. A. N. et al. Reao de inibio da hemaglatinao para o vrus da rubola Tcnica simplificada. Rev. Sade pbl., S. Paulo, 12: 516-22, 1978. RESUMO : A comparao dos resultados obtidos com uma tcnica simplificada de inibio da hemaglutinao para o vrus da rubola e a tcnica padronizada pelo "Center for Disease Control", permitiu determinar ndices de sensibilidade e especificidade da tcnica simplificada em relao tcnica padro de, respectivamente, 99,4% e 90,0%. Esta tcnica pode facilitar a execuo de levantamentos sorolgicos para a rubola em larga escala. UNITERMOS: Rubola, virus. Hemaglutinao. Anticorpos inibidores.

INTRODUO

O diagnstico sorolgico da rubola pode ser feito mediante o emprego de reaes de inibio da hemaglutinao 2 1 , neutralizao 14,15, fixao do complemento 12,19,20 , imunofluorescncia indireta 1 e, mais recentemente, pela utilizao de tcnicas imunoenzimticas 2 5 e de hemlise radial especfica 8 . Dentre estas, a inibio da hemaglutinao tem sido a reao de uso mais generalizado, tanto no diagnstico clnico, como nos inquritos sorolgicos, dadas sua especificidade, sensibilidade e relativa simplicidade de execuo 2-4,6,17,18,23,24 . No

entanto, no esta reao destituda, de todo, de certos problemas que a tornam de difcil reprodutibilidade e com resultados, por vezes, difceis de interpretar, razes pelas quais o "Center for Disease Control" (CDC) 5 definiu as normas para sua padronizao, tanto em relao titulao do antgeno, quanto em relao ao tipo e concentrao das hemcias a utilizar e tipo de tratamento para remoo de aglutininas naturais e inibidores inespecficos da hemaglutinao. Seguindo, fundamentalmente, estas normas, foram feitas tentativas no

* Pesquisa financiada pelo Departamento de Assistncia Escolar da Secretaria de Educao da Prefeitura Municipal de So Paulo. ** Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Cincias Biomdicas da USP "Setor Sade Pblica" Av. Dr. Arnaldo, 715 01255 So Paulo, SP Brasil. *** Estagiria do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Cincias Biomdicas da USP "Setor Sade Pblica". **** Do Departamento de Prtica de Sade Pblica da Faculdade de Sade Pblica da USP Av. Dr. Arnaldo, 715 01255 So Paulo, SP Brasil.

sentido de tornar a reao mais acessvel a laboratrios que no tenham condies de dispor de aparelhagem dispendiosa e em que o nmero de reaes a realizar, diariamente, seja relativamente elevado. Apresentam-se e discutem-se os resultados obtidos, ao mesmo tempo que se sugere a possibilidade de utilizao da presente tcnica modificada.
MATERIAL E MTODOS

Reao de inibio da hemaglutinao Esta reao foi realizada em triplicata pelo mtodo de microtitulao em placas "V" (Cooke Engineering Co.), com volumes 25 e 50 microlitros, seguindo-se, em paralelo, as operaes estabelecidas pelo CDC e as que fixamos para a reao simp l i f i c a d a , operaes estas que so descritas na Tabela 1. O antgeno utilizado, de origem comercial *, era titulado antes da execuo da reao de inibio da hemaglutinao, de modo a poder ser confirmada a utilizao de 4 unidades de antgeno, em cada reao. Os soros foram testados nas diluies de 1:8 at 1 :256.
RESULTADOS

Soros de prova As 201 amostras de soro, selecionadas para o presente estudo, provieram de um total de 2.153 soros a serem testados, qualitativamente, para determinao do grau de imunidade para a rubola de professoras da rede municipal de ensino de So Paulo. Aquelas amostras foram testadas, quantitativamente, para a pesquisa de anticorpos inibidores da hemaglutinao segundo a tcnica padronizada pelo CDC e, simultaneamente, pela tcnica simplificada, que passamos a identificar como tcnica ICB, iniciais de Instituto de Cincias Biomdicas.

A distribuio dos ttulos de anticorpos inibidores da hemaglutinao obtidos com as tcnicas CDC e ICB apresentado na Tabela 2. Na dosagem de anticorpos inibidores da hemaglutinao pela tcnica CDC, conforme pode calcular-se, pelos resultados apresentados nessa Tabela, 90,1%

das amostras testadas apresentaram ttulos iguais ou superiores a 8, enquanto pela tcnica ICB esta percentagem foi de 90,5%. Na Tabela 3, faz-se a associao dos resul-

tados obtidos com as duas tcnicas j mencionadas, sendo possvel avaliar a percentagem de eventos concordantes das mesmas, que para as reaes positivas

( 8) de 99,4% e para as reaes negativas (<8) de 90,0%. Estes valores percentuais expressam a sensibilidade e a especificidade da tcnica ICB em relao tcnica CDC 2 2 .
DISCUSSO E CONCLUSO

O fato da rubola poder desencadear o aparecimento de malformaes congnitas tem forado o desenvolvimento de extensos programas de vacinao, tanto em crianas de idade superior a um ano, quanto em mulheres adultas, respeitadas, neste ltimo caso, trs normas fundamentais: determinao do grau de imunidade do indivduo a vacinar, proibio da vacinao nos casos de gravidez e recomendao de que a mulher vacinada no engravide, durante o trs meses que se seguem ao processo vacinai. De um modo geral, estas normas de vacinao diminuem os riscos de ocorrncias de malformaes congnitas ocasionadas pelo vrus da rubola; persistem, no entanto, situaes particulares que requerem uma discusso mais pormenorizada deste problema 11,16,26 . Sempre que est presente uma situao de gravidez, considerando-se a freqncia com que ocorrem as formas sub-clnicas de rubola e o fato de que mesmo as formas clnicas tpicas, muitas vezes, no possuem caractersticas patognomnicas, o diagnstico sorolgico torna-se obrigatrio 2 7 . Alguns autores chegam mesmo a considerar que a pesquisa de anticorpos contra a rubola deve constituir-se em prtica rotineira, numa tentativa de contornar situaes que, invariavelmente, levam a "crises emocionais", por suspeita de contato da paciente grvida com casos de rubola, quer em ambiente familiar ou no 6,18. Dentro deste contexto, pode mesmo sugerir-se que da prtica de assistncia, durante o perodo interconcepcional, faa parte um contedo educativo visando ao esclarecimento da me sobre a problemtica da rubola. Poder-se- orientar a me no sentido de averiguar o nvel de imunidade

que possui, o que ditar a necessidade ou no de ser vacinada; haver oportunidade para esclarec-la das vantagens em informar o mdico sobre sintomas que simulem um quadro de rubola e que se tenham manifestado em qualquer membro da famlia; com relativa freqncia ser possvel minorar estados de profunda ansiedade em mulheres grvidas, com a informao de que o caso com que houve suspeita de contato pode no ter sido de rubola. Deste modo, abre-se campo para a Educao em Sade colaborar em programas que venham a reduzir as trgicas conseqncias da infeco do feto pelo vrus da rubola, programas estes que configurem a proteo global da me, da criana e da prpria famlia. So oportunas as palavras de Chute 7 quando diz que " . . . a participao entusistica da comunidade em programas flexveis e de mltipla natureza que se desenvolvam com vistas imunizao contra a rubola, de nfase prioritria na criana, mas suplementados com a proteo direta das mulheres suscetveis adultas, poder vir a eliminar o problema da rubola, em futuro prximo". Dada a precariedade do diagnstico clnico, os pacientes com quadros suspeitos de rubola devem ser submetidos, com urgncia, a um diagnstico preciso. O diagnstico laboratorial da rubola ampara-se, fundamentalmente, nas provas sorolgicas, das quais a inibio da hemaglutinao a preferida, pela relativa rapidez com que pode ser executada e pela segurana dos dados que fornece, desde que as amostras de sangue das fases aguda e convalescente sejam obtidas respectivamente, dentro de 48h e 15 dias. Assim, muitas das aes tomadas pelo mdico frente a um caso de rubola numa gestante, vo depender dos resultados fornecidos pela reao de inibio da hemaglutinao. A pesquisa de anticorpos inibidores da hemaglutinao para o vrus da rubola, alm de amparar a deciso do mdico, vai ainda permitir avaliar o grau de imunidade e a eficincia do processo vacinal. Todas estas razes obrigam a que os resultados

obtidos na reao de inibio da hemaglutinao possam ser aceitos com elevado grau de confiana. As fontes de erro que, normalmente, se encontram associadas dosagem de anticorpos inibidores da hemaglutinao, resultam da ocorrncia, no soro humano, de inibidores inespecficos da hemaglutinao e as tcnicas utilizadas para sua remoo, nem sempre, atuam de modo eficiente. Em geral recorre-se remoo pelo caolin 2 1 , pela mistura heparina-MnCl 2 10 , ou pelo sulfato de dextrano e cloreto de clcio 13. O mtodo que utiliza a heparina e o MnCl 2 foi selecionado pelo CDC para remoo dos inibidores na tcnica padronizada da reao de inibio da hemaglutinao para o vrus da rubola e foi o utilizado em nossa tcnica modificada. As diferenas entre a tcnica simplificada ICB, e a tcnica padro CDC so, como pode ver-se na Tabela 1, de ordem operacional, respeitando-se a proporo e natureza dos reagentes utilizados nesta ltima. Enquanto na tcnica CDC existem 6 operaes, na tcnica ICB o nmero de operaes reduzido para 3, sem prejuzo dos resultados e com a vantagem de poder aumentar-se o nmero de reaes a executar, uma vez que pode usar-se uma centrfuga no-refrigerada Modelo V, Internacional, Rotor 250, com capacidade para 128 amostras, por vez; o nmero de amostras que pode ser processado, de cada vez, na centrfuga refrigerada Modelo RC2, Sorvall, Rotor SM24, de 24. Na tcnica CDC a absoro das aglutininas naturais para hemcias de pinto, existentes no soro humano, feita com uma suspenso de hemcias a 50% e, freqentemente, os controles de soro mostram, na leitura final da reao, aglutinao inespecfica, que tem de ser eliminada com nova absoro; na tcnica ICB, o uso de papa de hemcias levou a resultados em que no era necessria absoro posterior. A distribuio dos ttulos de anticorpos inibidores da hemaglutinao, apresentada na Tabela 2, permite calcular as percenta-

gens de positividade ( 8) obtidas com ambas as tcnicas, sendo os valores de 90,1% para a tcnica CDC e 90,5% para a tcnica ICB, bastante prximos. Foi verificada uma associao (X 2 obs = 55,49) a um nvel de significncia de 5% ( X - c r i t . a 5%, g.1. = 36). Utilizando o mtodo Kappa, proposto por Cohen e col. 9 , a concordncia entre os dois mtodos foi de 0,5199 = 0,52, significantemente diferente de 0 (zero), mostrando que a concordncia no simplesmente casual. Verifica-se ainda, nessa Tabela, que dois casos, dados como negativos, pela tcnica CDC, surgem com ttulos de 16 e 32, quando testados pela tcnica ICB e que um caso negativo por esta ltima tcnica, tem ttulo 8, na tcnica CDC. Considerando estes resultados como decisrios quanto necessidade de se fazer a vacinao, s os casos que pela tcnica ICB tm ttulos de 16 e 32, no seriam vacinados. Se analisarmos na Tabela 3 o nmero de eventos concordantes por ambas as tcnicas pode calcular-se tanto a sensibilidade, como a especificidade da tcnica ICB em relao tcnica CDC, obtendo-se respectivamente os valores de 99,4% e 90,0%. No presente estudo, sensibilidade a capacidade da tcnica usada dar um resultado positivo, quando o indivduo estudado tem realmente imunidade para a rubola pela tcnica padro; especificidade a capacidade da tcnica usada dar um resultado negativo quando o indivduo estudado no possui imunidade. No que respeita especificidade, nossos resultados acusam 2 casos que, pela tcnica ICB no seriam vacinados, por terem sido dados como possuidores de imunidade. Considerando que, nas populaes continentais, em mdia, 75% das mulheres no perodo da puberdade, possuem anticorpos inibidores da hemaglutinao para a rubola, um levantamento sorolgico em ampla escala feito pela tcnica ICB deixaria de detectar a ausncia de imunidade e, portanto, a necessidade de vacinao de 2 mulheres (2,5) em cada 100 mulheres examinadas.

Das observaes feitas parece razovel sugerir a utilizao da tcnica simplificada em levantamentos sorolgicos para a rubola em larga escala, uma vez que, pela

reduo do nmero de operaes, existe uma pondervel economia material e de tempo dispendido na execuo da reao.

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CANDEIAS, J. A. N. et al. [Rubella hemagglutination-inhibition test A technique.] Rev. Sade pbl., S. Paulo, 12:516-22, 1978.

simplified

ABSTRACT: A hemagglutination-inhibition test for rubella is described. In comparing the results obtained using this technique and the CDC standard rubella hemagglutination-inhibition test, the sensitivity and specificity indexes were, respectively, 99.4% and 90.0%. This technique should simplify mass screening of populations for immunity to rubella. UNITERMS: Rubella virus. Hemagglutination-inhibition test.

REFERNCIAS

BIBLIOGRFICAS 8. CLARKE, M. et al. The use of singleradial-haemolysys for rubella antibody studies, J. Hyg., Camb., 79:355-64, 1977. COHEN, J. A. A coefficient of agreement for nominal scalas. Educ. Psych. measur., 20:37-46, 1960.

1. BROWN, G. C. et al. Rubella antibodies in human serum: detection by the indirect fluorescent antibody technique. Science, 145:943-4, 1964. 2. CANDEIAS, J. A. N. & ROSENBURG, C. P. Inqurito sorolgico para rubola em professoras do Municpio de So Paulo, Brasil. Rev. Sade pbl., S. Paulo, 8:391-8, 1974.

9.

3. CANDEIAS, J. A. N. et al. Resposta sorolgica de adultos vacinao contra a rubola. Rev. Sade pbl., S. Paulo, 11:345-52, 1977. 4. CARVALHO, R. P. de S. et al. Anticorpos para os vrus da rubola, do sarampo e da caxumba em crianas de So Paulo, Brasil. Rev. Sade pbl., S. Paulo, 10:279-84, 1976.

10. COOPER, L. Z. et al. Experience with a modified rubella hemagglutination inhibition antibody test. J. Amer. med. Ass., 207:89-93, 1969. 11. KLOCK, L. E. & RACHELEFSKY, G. S. Failure of rubella herd immunity during an epidemic. New Engl. J. Med., 288:69-72, 1973. 12. LENNETTE, E. et al. The hemagglutination inhibition test for rubella: a comparison of its sensitivity to that of neutralization, complement fixation and fluorescent antibody tests for diagnosis of infection and determination of immunity status. J. Immunol., 99: 785-93, 1967. 13. LIEBHABER, H. Measurement of rubella antibody by hemagglutination inhibition. II. Characteristics of an improved HAI test employing a new method for the removal of non-immunoglobulin HA inhibitors from serum, J. Immunol., 104:826-34, 1970.

5. CENTER FOR DISEASES CONTROL. Standard rubella hemagglutination inhibition test. Atlanta. GA, 1970. 6. CHIN, J. et al. The need for routine rubella antibody testing of women. Calif. Med., 116:9-13, 1972. 7. CHUTE, A. L. Foreword of International Rubella Conference on Protection for the Postpubertal Female, Toronto, 1971. Canad. J. publ Hlth, 62 (monogr. suppl,): v-vi, Sept. 1971.

14. PARKMAN, P. D, et al. Recovery of rubella virus from army recruits. Proc. Soc. eoop. Biol., New York, 111: 225-9, 1962. 15. PARKMAN, P. D. et al. Studies of rubella. II. Neutralization of the virus J. Immunol., 93:608-17, 1964. 16. RACHELEFSKY, G. S. & HERRMAN, K. L. Congenital rubella surveillance following epidemic rubella in a partially vaccinated community. J. Pediatr., 84:474-8, 1974.

21. STEWART, G. C. et al. Rubella-virus hemagglutination-inhibition test. New Engl. J. Med., 276:554-7, 1967. 22. VECHIO, T. J. Predictive value of a single diagnostic test in unselected populations. New Engl. J. Med., 274 : 1171-3, 1966. VERONESI, R. et al. Resultados do primeiro inqurito sorolgico da rubola entre 100 crianas de uma creche de So Paulo. Bol. epidem., Rio de Janeiro, 1:89-93, 1969. VERONESI, R. et al. Rubola em So Paulo: inqurito sorolgico em 349 indivduos. Avaliao clnico-sorolgica de dois tipos de vacinas de vrus atenuados. Rev. Hosp. Cln. Fac. Med. S. Paulo, 26:65-8, 1971. VOLLER, A. & BIDWELL, D. E. A simple method for detecting antibodies to rubella. Brit. J. exp. Path., 56 : 338-9, 1975. WEIBEL, R. E. et al. Influence of age on clinical response to HPV-77 duck rubella vaccine. J. Amer. med. Ass., 222:805-7, 1972. ZIRING, P. et al. The diagnostic of rubella. Pediat. Clin. N. Amer., 18: 87-97, 1971. Recebido para publicao em 04/08/1978 Aprovado para publicao em 09/08/1978

23.

17. RIZZATO, A. B. P. Inqurito sorolgico para rubola em escolares do sexo feminino do distrito sede de Botucat (SP) em 1973. Botucat, 1973. [Tese Faculdade de Cincias Mdicas e Biolgicas de Botucat] 18. SAYLOR, L. F. Laboratory diagnostic services for rubella in public health in California. Calif. Med., 111:62-4, 1969. 19. SCHMID, N. J. & LENNETTE, E. H. Rubella complement-fixing antigens derived from the fluid and cellulas phases of infected BHK-21 cells: extraction of cell associated antigen with alkaline buffers. J. Immunol., 97 : 815-21, 1966. 20. SEVER, J. L. et al. Rubella complement fixation test. Science, 148:385-8, 1965.

24.

25.

26.

27.