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Tema 13 Gentica de hongos filamentosos: Neurospora crassa

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Neurospora en la naturaleza

Neurospora crece sobre troncos que han sido quemados

Primera descripcin de Neurospora como el hongo que caus la contaminacin de panaderas francesas en 1843

Shear CL y Dodge BO (1927) Life stories and heterotallism of the red bread mold fungi of the Monilia sitophila group. J. Agric. Res. 34: 1019-1042.

Describi las estructuras sexuales y la segregacin del tipo sexual en varias especies de Neurospora. Bernard O. Dodge (1872-1960)

Ciclos de vida de Neurospora crassa

Especies de Neurospora
Heterotlicas Homotlicas

N. crassa N. discreta N. intermedia N. sitophila


Pseudohomotlica

N. africana N. dodgei N. galapagosensis N. lineolata N. terricola N. pannonica

N. tetrasperma

Ciclo sexual de una especie heterotlica

Ciclo sexual de una especie homotlica

Ciclo sexual de una especie pseudohomotlica

Ciclo vegetativo de Neurospora crassa


germinacin conidios

micelio

conidiforos

Hifas de Neurospora

Conidiacin de Neurospora crassa

Conidios de Neurospora crassa

Macroconidios y microconidios de Neurospora

Un reloj circadiano regula la conidiacin

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Cultivos de Neurospora crassa

Cultivos de Neurospora crassa

Medio con sorbosa

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Mutagnesis
Agentes mutagnicos usados en Neurospora Radiaciones Ultravioleta Rayos X Agentes qumicos cido nitroso Metanosulfonato de etilo (EMS) Metilhidroxiamina ICR170 Nitrosoguanidina

Bsqueda de mutantes auxtrofos


medio completo

medio mnimo

medio con grupos de nutrientes medio con distintos aminocidos el medio con arginina permite el crecimiento

Premio Nobel de Fisiologa o Medicina 1958

George W. Beadle (1903-1989)

Edward L. Tatum (1909-1975)

El aislamiento y la caracterizacin mutantes auxtrofos de Neurospora les permiti formular la hiptesis de que un gen era responsable de una enzima.

Enriquecimiento por filtracin


Los prottrofos se quedan en el filtro

Silvestres prottrofos Mutantes nutricionales (auxtrofos)

Los auxtrofos pasan a travs del filtro

Medio mnimo

Sembrar

Los auxtrofos crecen

Medio con leucina

Ruta de la carotenognesis de Neurospora

Mutante albino

Medio con sorbosa

Mutantes de la carotenognesis de Neurospora

Naranja (silvestre)

Albino

Amarillento

Rojizo

Mutantes morfolgicos de Neurospora

0.5

Frecuencia de los conidios

0.46

0.4

0.3 0.25

0.2 0.15 0.09 0.03 0.01 0 1 2 3 4 5 6 0.01 7

0.1

Ncleos por conidio

Heterocariosis
Los heterocariontes nos dan informacin sobre los mutantes: Permite saber si las mutaciones son dominantes of recesivas Permite identificar grupos de complementacin

El micelio de Neurospora es un cenocito

Complementacin en Neurospora
Clulas arg-1 alteradas en una enzima de la ruta de sntesis de arginina Clulas arg-2 alteradas en una enzima distinta de la ruta de sntesis de arginina

Fusin

El heterocarionte crece sin arginina

1 Grupos de complementacin: grupo I II III IV V mutantes 1, 5 2, 4, 6, 7 3 8, 10 9 2 3 4 5 6 7 8 9 10

o + + + o + + + + +

o + o + o o + + +

o + + + + + + +

o + o o + + +

o + + + + +

o o + + +

o + o + + o + o + o

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ciclo sexual de Neurospora

Ciclo sexual de Neurospora

Niveles bajos de C y N

Peritecio

Formacin de protoperitecios

Ciclo sexual de Neurospora


Meiosis

Ascosporas

Las octadas ordenadas permiten detectar el ligamiento al centrmero

El reparto de los cromosomas en la octada permite observar varios patrones de segregacin

Productos de la meiosis en Neurospora

Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto de un cruzamiento entre dos mutantes de la coloracin de la ascospora. Se observa la segregacin en la primera y segunda divisin meitica.

Durante la recombinacin se producen molculas de ADN heterodplices

Deteccin de la conversin gnica

Estimacin de la distancia gentica por recombinacin

cyhR: resistente a cicloheximida hom: auxrofo de homoserina nic : auxrofo de nicotico al : albino cyhR + 1 cyhR al hom nic cyhR + cyhR al + + + + + + + + + + + + + al + 2 +

cyhR al hom nic


hom + 3 parentales rec en 1 rec en 2 rec en 3 rec en 1 y 2 rec en 1 y 3 rec en 2 y 3 nic +

silvestre

99 22 4 22 1 0 3

106 22 8 17 1 0 5

al hom nic + hom nic + al + + nic +

cyhR al hom + cyhR + hom nic cyhR + cyhR al + + nic nic

al hom + + hom +

Estimacin de la distancia gentica por recombinacin


cyhR + 1 al + 2 hom + 3 nic +

17.4 % cyhR 17.4

4.5 % al hom 4.5

15.2 % nic 15.2

Grupo de ligamiento I

Existen unos 1000 marcadores genticos localizados en siete grupos de ligamiento

Deteccin de mutaciones en el ADN mitocondrial

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Ingeniera gentica en Neurospora


Introduccin de ADN: Transformacin de esferoplastos Electroporacin de conidios Plsmidos integrativos Resistencia a benomilo e higromicina Otras herramientas: Promotores regulables: qa-2 Fusiones con lacZ, GFP y luciferasa para medir transcripcin y detectar protenas. Inactivacin gnica.

Integracin del ADN en hongos


Vector Receptor de la transformacin Cromosoma I Cromosoma II

Reemplazamiento gnico

Duplicacin Integracin ectpica Vector

Receptor

vector

Integracin ectpica

Integracin ectpica mltiple

Integracin homloga

Reemplazamiento

Transformacin en Neurospora
La competencia es una propiedad del ncleo (co-transformacin). Cuando ocurre integracin homloga no suele ocurrir integracin ectpica en el mismo ncleo. El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinacin homloga (si es posible). 10% de transformantes ectpicos han sufrido alteraciones cromosmicas con frecuencia. 100% de transformantes por recombinacin homloga en estirpes con una mutacin en el gen mus-51 o mus-52 responsables de la recombinacin no homloga.

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Csmidos para construir genotecas en Neurospora

Clonacin en Neurospora por seleccin de grupos (sib selection)

Ncleos de Neurospora marcados con H1-GFP

Microtbulos de Neurospora marcados con tubulina-GFP

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

Gentica Molecular de Neurospora crassa


Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Gentica de Neurospora Gentica molecular de Neurospora Transformacin Herramientas disponibles Inactivacin gnica El genoma de Neurospora

El genoma de Neurospora
Tamao: 42 Mb Genoma secuenciado: 39.225.835 bp (rel. 7) Cromosoma Tamao (Mb)
I II III IV V VI VII 10.3 9.2 5.7 5.1 4.6 4.0 4.0

Contenido G+C Total: 50% ADN codificante: 44% ADN no codificante: 56% Intrones Presentes en el 80% de los genes Longitud promedio: 134 pb Promedio de 1,7 intrones por gen
Un transposn activo, Tad, muchas copias de transposones inactivos (RIP),

Tamao (Mb) Haemophilus Saccharomyces C. elegans Drosophila Homo 1,8 12 100 165 3000 42

Genes 1.709 6.144 18.266 13.338 20.000

Neurospora

? 10.620

Fin

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