Amadeo J avier Bava.

MTODOS DE DIAGNSTICO MICOLGICO NO BASADOS EN EL

EMPLEO DE CULTIVOS.

Las micosis oportunistas

El incremento observado en las ltimas dcadas en la prevalencia de las micosis
oportunistas invasoras o diseminadas, tales como la candidiasis, aspergilosis, la
mucormicosis y la criptococosis, oblig a replantear las estrategias de diagnstico de las
mismas. Estos cuadros de extremada gravedad y evolucin aguda, necesitan de
procedimientos de diagnstico certeros y rpidos, que permitan implementar un
tratamiento antifngico especfico sin demora.

Sin el debido diagnstico y tratamiento el pronstico es desfavorable, debido no slo a
la actividad de los agentes causales de la infeccin mictica sino al estado general de los
pacientes, deteriorado por enfermedades subyacentes (SIDA, hemopatas malignas) y/o
situaciones debilitantes (tratamientos con corticoides, anticancerosos e
inmunodepresoras) que actan como causas favorecedoras.

A pesar de los adelantos logrados en los ltimos aos, la metodologa de diagnstico
disponible contina siendo insuficiente para lograr el reconocimiento certero y
temprano de estas infecciones.

Metodologa de diagnstico tradicional

Tradicionalmente, las micosis invasoras se han diagnosticado mediante la microscopa y
los cultivos. Mientras que la microscopa posee escasas sensibilidad y especificidad, el
desarrollo de ciertos agentes causales en los cultivos puede ser lento o no estar asociado
a la existencia de enfermedad. Esto ltimo se debe a que muchos de los hongos
causantes de estas micosis suelen ser contaminantes o forman parte de la flora habitual
humana.

En ocasiones, la metodologa tradicional requiere de la obtencin de muestras por
procedimientos cruentos e invasores (quirrgicos, endoscpicos u otros), no siempre
factibles de realizar en pacientes sumamente deteriorados. En todos los casos, la
metodologa tradicional requiere de la viabilidad de los agentes causales en las muestras
y su desarrollo in vitro en los cultivos, lo cual no siempre es factible o se logra con la
rapidez necesaria.

Mtodos de diagnstico no basados en cultivos

La administracin temprana de antifngicos especficos evita los efectos txicos del
tratamiento emprico y la seleccin de cepas fngicas resistentes, lo cual justifica el
empleo de mtodos rpidos de diagnstico. En los ltimos 20 aos, varios mtodos que
no emplean cultivos se han incorporado a la metodologa de diagnstico de las micosis
invasoras, encaminados a la deteccin de anticuerpos, metabolitos, antgenos y
secuencias de cidos nucleicos fngicos en los fluidos biolgicos y tejidos. Ellos
poseen, entre otras ventajas, la de no requerir la viabilidad del agente causal en los
materiales clnicos y sus mayores especificidad, sensibilidad y rapidez en la obtencin
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de resultados, respecto de los mtodos tradicionales. Entre sus desventajas se encuentran
su falta de disponibilidad para laboratorios de baja complejidad, la imposibilidad de
reproducirlos fuera del mbito de su creacin y su elevado costo.

Determinacin de anticuerpos

Si bien no requiere de procedimientos invasores para obtener las muestras, no siempre
es de utilidad, ya que los pacientes con micosis invasoras poseen en general grados
variables de incapacidad para producir anticuerpos. Por otro lado, en el caso particular
de la candidiasis diseminada, individuos sanos o enfermos por otras causas pueden
igualmente tener anticuerpos sricos anti-Candida, debido a la eventual colonizacin de
las superficies cutnea y mucosas por especies de este gnero. O sea que, las pruebas
serolgicas pueden ser en ciertos casos, positivas en individuos sin candidiasis, y
negativas en otros probadamente enfermos de candidiasis diseminada. Igualmente, las
pruebas serolgicas pueden originar resultados falso positivos y negativos debido a
reacciones cruzadas ocurridas entre los agentes causales que comparten determinantes
antignicos.

Para corregir esto, actualmente se trabaja en la creacin de nuevas tcnicas serolgicas
con mayor sensibilidad, en la purificacin de las molculas antignicas empleadas en las
reacciones y en la bsqueda de anticuerpos presentes slo en la fase activa de la
enfermedad.

Tradicionalmente varias tcnicas serolgicas se emplearon con xito en el diagnstico
de las micosis sistmicas endmicas clsicas y actualmente de la peniciliosis, provocada
por Penicillium marneffei. Sin embargo, por los motivos antes mencionados, ellas
poseen limitada utilidad cuando se aplican al diagnstico de estas micosis en los
pacientes inmunocomprometidos.

Determinacin de antgenos

Aplicada en fluidos biolgicos por diferentes tcnicas (aglutinacin de partculas de
ltex [AL], radioinmunoensayo [RIE], ELISA, etc.) se ha mostrado til en el
diagnstico de la candidiasis diseminada, criptococosis, histoplasmosis y aspergilosis
invasora. El estudio cuantitativo de los antgenos posee valor pronstico en el memento
del diagnstico (malo ante la presencia de ttulos elevados y viceversa) y practicado en
forma seriada durante el tratamiento permite el seguimiento de la respuesta teraputica.

La determinacin del (1-3)-D-glicano (presente en la mayora de los hongos, excepto
los Zygomycetes) en fluidos biolgicos, establece la etiologa fngica de la infeccin,
sin discriminar acerca del agente causal de la misma.

La enolasa, antgenos lbiles al calor y los mananos parietales han sido los blancos
elegidos para el diagnstico de la candidiasis diseminada, mientras que el
galactomanano parietal fue el escogido en la aspergilosis invasora. Sin embargo, no
todas las determinaciones son igualmente sensibles, debido entre otras causas, a la
formacin de complejos inmunes que son rpidamente removidos de la circulacin, a la
presencia transitoria de los antgenos en la sangre, a la activacin policlonal de la
inmunidad humoral y a la falta de sensibilidad de las tcnicas disponibles. Muchos
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veces, una prueba positiva no indica la especie fngica involucrada en la infeccin, dato
que actualmente suele tener relevancia debido a la emergencia de especies resistentes.

A la fecha, slo la determinacin del antgeno capsular del C. neoformans es
ampliamente empleada con fines de diagnstico. Si bien existen en el comercio equipos
de AL y ELISA, el primero ha ganado mayor popularidad. Su realizacin y lectura son
sencillas, su sensibilidad y especificidad elevadas y los resultados son obtenidos
rpidamente, a partir de muestras de suero, LCR y orina.

La deteccin del galactomanano de Aspergillus por AL y ELISA, cuya determinacin ha
mostrado correlacin con los hallazgos clnicos en la aspergilosis invasora, se
encuentran disponibles en Europa. Igualmente, los resultados positivos debern ser
confirmados, en lo posible, por otros estudios clnicos y microbiolgicos.

Para el diagnstico de la candidiasis diseminada se encuentran disponibles equipos
comerciales para la determinacin de antgenos por AL y ELISA. Sin embargo, ellos
carecen de la suficiente sensibilidad y pueden dar lugar a resultados falso negativos en
pacientes probadamente enfermos, debido al carcter transitorio que posee la presencia
de los antgenos detectados por ellos en los fluidos biolgicos. Esta rpida depuracin
de los antgenos obliga a la toma de varias muestras en forma seriada en pacientes
altamente sospechosos, a pesar de los resultados negativos.

El RIE ha sido empleado en forma eficaz para la deteccin del antgeno parietal del H.
capsulatum en sangre, LCR y orina. Permite el diagnstico de la histoplasmosis en
pacientes inmunocomprometidos (pe: SIDA) y, cuando se realiza en forma seriada y
cuantitativa, es de utilidad para el seguimiento del tratamiento antifngico. No obstante,
la prueba no se encuentra disponible comercialmente ni, como es de suponer, es
accesible para laboratorios de baja complejidad. El desarrollo reciente de una prueba de
inhibicin de ELISA, con sensibilidad y especificidad comparables con las del RIE,
para la deteccin de antgeno de H. capsulatum, puede solucionar el problema.

En suma, la disociacin de los complejos inmunes previo a la determinacin de
mananos y galactomananos, la capacidad de reproducir la prueba en todos los
laboratorios, la exhibicin de una sensibilidad acorde con las necesidades, la facilidad
de realizacin de la tcnica y la prctica de estudios clnicos prospectivos, son criterios
a tener en cuenta a la hora de incorporar un mtodo de diagnstico basado en la
deteccin de antgenos fngicos.

Determinacin de metabolitos fngicos

Respecto al estudio de los metabolitos fngicos en fluidos biolgicos, la determinacin
del D-arabinitol ha sido propuesta como marcador diagnstico para la candidiasis
diseminada. No obstante, la falta de una metodologa simple para su determinacin cuali
y cuantitativa ha impedido su empleo en forma rutinaria. El desarrollo reciente de un
mtodo para determinar la proporcin de D-/L-arabinitol mediante una tcnica
automatizada, favorecen su empleo en la prctica.

De manera similar, la valoracin cuali y cuantitativa de las concentraciones de manitol
en fluidos biolgicos de animales con la criptococosis y aspergilosis producida por A.
fumigatus, ambas experimentales, ha mostrado utilidad en el diagnstico y el estudio de
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la respuesta teraputica. En todos estos casos, futuros estudios deben realizarse para
lograr la universal aceptacin de estas determinaciones para el diagnstico de las
correspondientes micosis.

Determinacin de secuencias especficas de cidos nucleicos

Las pruebas de diagnstico micolgico basadas en tcnicas moleculares pueden
emplearse para la deteccin de secuencias de cidos nucleicos fngicos (tanto ADN
como ARN) presentes en los materiales clnicos y para obtener la identificacin precisa
de los aislamientos obtenidos por cultivo. Tienen la ventaja potencial de reducir el
tiempo empleado por el laboratorio para la identificacin de aquellos patgenos
fngicos que no desarrollan in vitro o bien lo hacen en forma dificultosa o lenta.

El estudio del polimorfismo de los fragmentos de cidos nucleicos obtenidos con el
empleo de enzimas de restriccin (RFLP) o del obtenido tras la amplificacin con
primers o cebadores arbitrarios (RAPD), la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), el Southern Blot, etc., constituyen algunas de las tcnicas moleculares
empleadas a la fecha en micologa. La mayor parte de ellas no se hallan por el momento
al alcance de los laboratorios de diagnstico, debido a su complejidad y costo operativo.
An se encuentran inconvenientes en la extraccin de los cidos nucleicos fngicos
presentes en la muestra o dentro de las clulas y problemas tcnicos asociados a las al
riesgo de contaminacin, a la imposibilidad de diferenciar la colonizacin de la
infeccin fngica verdadera y de determinar la viabilidad del hongo cuyo cido nucleico
se ha determinado.

El empleo de sondas (oligonucletidos de cadena simple, complementarios de las
porciones especficas de los cidos nucleicos investigados), brinda una gran
especificidad a estas pruebas, ya que permite la identificacin precisa de un aislamiento
a nivel de cepa. No obstante su enorme valor epidemiolgico, el empleo en forma
directa de sondas sobre materiales clnicos carece por lo general de la suficiente
sensibilidad para su empleo como mtodo de diagnstico directo. Por el contrario, la
amplificacin millones de veces de secuencias especficas fngicas eventualmente
presentes en las muestras, mediante la PCR, posibilita su aplicacin. La sensibilidad de
la PCR puede mejorarse an ms con el empleo de la nested PCR, que consiste en la
realizacin de una nueva PCR sobre los productos obtenidos durante la primera.

El uso de primers o cebadores que poseen su sitio de accin en genes de copias
mltiples provee a estas pruebas de un alto grado de sensibilidad, indispensable para el
diagnstico temprano de las micosis en pacientes graves. No es claro si los mtodos que
investigan la presencia de secuencias presentes en muchas especies fngicas o aquellos
especficos para una o unas pocas especies sern de mayor utilidad en la prctica clnica.
La hibridacin in situ, efectuada sobre tejidos, inclusive aquellos fijados con formol,
permite reconocer la presencia de secuencias especficas fngicas mediante sondas
marcadas. Sin embargo, un inconveniente de esta tcnica es su baja sensibilidad, debido
a que no se efecta la amplificacin de los cidos nucleicos investigados en los tejidos.

Conclusin

La rpida instalacin de un tratamiento especfico da mayores posibilidades de xito en
la resolucin de las micosis en huspedes severamente inmunocomprometidos. Los
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mtodos que no requieren de cultivos son ideales para obtener un diagnstico etiolgico
rpido, certero y en etapas tempranas de las enfermedades fngicas invasoras.

La identificacin de los agentes causales a nivel de cepa, difcil de obtener con la
metodologa tradicional, es epidemiolgicamente relevante, ya que posibilita encontrar
el origen de una infeccin o brote epidmico y aumenta las posibilidades de controlarlo.
Mientras que la determinacin de antgenos y metabolitos fngicos en fluidos
biolgicos es, en las micosis invasoras directamente proporcionales a la carga fngica,
la PCR posibilita la amplificacin in vitro millones de veces de unas pocas secuencias
presentes en los materiales clnicos en un breve lapso.

Es probable que muy pronto, mediante la observacin de un preparado al microscopio,
podamos en forma rpida, determinar el gnero y la especie del microorganismo
visualizado, as como su sensibilidad a determinados antibiticos.

A pesar de lo atractivo que suele ser el empleo de todos estos cabe destacar que los
mismos no desplazan o invalidan el uso de las tcnicas tradicionales, sino que la
complementan. Ellos deben cumplir con los requisitos mencionados en prrafos
anteriores antes de ser incorporados a la batera de pruebas diagnsticas.




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