Deteccin de Toxoplasmosis en suero o plasma humano mediante prueba de ELISA

Claudio Angel Zepeda del Valle | Diagnstico Molecular | 11 de diciembre de 2013

Introduccin
El Toxoplasma gondii es un protozoo que produce patologa por su obligado carcter parasitario intracelular. Con la relacin al hombre el reservorio principal lo constituyen los animales de compaa pero es principalmente el gato el animal intermediario ya que es capaz de soportar el ciclo sexual del parasito. Otros huspedes intermediarios se conocen ms de 200 especies de aves y mamferos. La Toxoplasmosis describe la enfermedad clnica o tisular causada por Toxoplasma y es diferente de la infeccin por Toxoplasma que es asintomtica en la mayora de los pacientes inmunocompetentes. La infeccin congnita es consecuencia de la infeccin aguda materna durante el embarazo. Se puede encontrar de tres formas al paracito: Ooquiste (producto del ciclo sexual en el intestino delgado del gato. Contiene spotozoitos.). Taquizoitos (forma asexual invasiva) y Quiste tisular (contiene Bradizoitos y es capaz de persistir en los tejidos). Las formas de infeccin humana son por ingestin de los Ooquistes o por transmisin vertical.

Principios del ensayo

La determinacin inmunoenzimatica cuantitativa de anticuerpos IgG especfico contra Toxoplasma gondii se basa en la tcnica del ELISA. Las tiras de micropocillos que se usan como fase solida estn recubiertas con antgenos. Los anticuerpos existentes en la muestra unen a los antgenos inmovilizados de la placa de microtitulacin. El conjunto de anticuerpos IgG anti humano con peroxidasa de rbano, se une con los complejos antgeno-anticuerpo en muestras positivas. Estos complejos inmunolgicos desarrollan una coloracin azul despus de incubarlos con sustrato de tetrametilbenzidina (TMB). Finalmente se aade cido sulfrico para detener la reaccin, causando un cambio de coloracin de azul a amarillo. La densidad ptica se mide con lector de ELISA a 450 nm.

Materiales
REACTIVOS
Microtiras (IgG) recubiertas de antgeno de Toxoplasma gondii: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antgenos de Toxoplasma gondii en bolsa de aluminio.

Diluyente para IgG de la muestra (a): 1 botella de 100ml de solucin de tampn para diluir la muestra; pH 7.2 + 0.2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca.

Solucin de parada: 1 botella de 15 ml de cido sulfrico, 0.2 mol/l, listo para ser utilizado; tapa roja.

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Solucin de lavado (20x conc.) (b): 1 botella de 50 ml de una solucin de tampn 20x concentrado para lavar los pocillos; pH 7.2 + 0.2; tapa blanca.

Conjugado IgG anti-humano (Toxoplasma gondii) (***): 1 botella de 20 ml de conjugado de anticuerpos IgG anti-humano con peroxidasa; color azul; tapa negra.

Solucin de sustrato de TMB: 1 botella de 15 ml 3,3, 5,5-tetrametilbenzindina (TMB); listo para ser utilizado; tapa amarilla.

Solucin IgG de estndar (Toxoplasma gondii) (c): 4 botellas de 2 ml, listas para ser utilizadas.

ESTANDAR A: 0 ESTANDAR B: 50 ESTANDAR C: 100 ESTANDAR D: 200 NOTAS: a) Contiene 0.1% Catn.

IU/ml; tapa azul IU/ml; tapa verde IU/ml; tapa amarilla IU/ml; tapa roja

b) Contiene 0.1% de Bronidox L. despus de diluir c) Contiene 0.2% de Bronidox L.

ACCESORIOS
1 lamina autoadhesiva 1 soporte 1 hoja de instrucciones

MATERIALES E INSTRUMENTOS
Fotmetro con filtros de 450/620 nm Incubadora/cmara hmeda con termostato Dispositivo de lavado manual o automtico Micropipetas con jeringuillas desechables (10, 100, 200, 1000 m) Mezcladora Vortex Tubos de plstico desechables Gradilla para los tubos Agua destilada Cronometro

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Estabilidad y almacenaje
El test tiene que estar almacenado de 2-8C. No usar los reactivos despus de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de las botellas y en el exterior.

Preparacin de los reactivos

NOTA: Todos los reactivos, muestras y los controles tienen que estar a la temperatura ambiente (2025C) antes de ser utilizados.

TIRAS REACTIVAS
Las tiras reactivas con antgeno de T. gondii estn selladas al vaco. Los pocillos listos para ser utilizados tienen que estar almacenados de 2-8C. Mantener los pocillos no utilizados en la bolsa de aluminio junto con el desecante y conservar de 2-8C. NOTA: El producto se conserva hasta la fecha de caducidad indicada.

CONJUGADO DE IgG ANTI-HUMANO

La botella contiene 20ml de una solucin de IgG anti-humano conjugada con peroxidasa de rbano, tampn, estabilizadores, conservantes y un colorante azul inerte. La solucin est lista para ser utilizada y tiene que estar almacenada de 2-8C. NOTA: Despus de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si est almacenado de 2-8C.

ESTANDAR
Las botellas contienen 2 ml de solucin estndar lista para ser utilizada. Las concentraciones de las soluciones estndar segn el tercer estndar internacional de la OMS son: ESTANDAR A: 0 ESTANDAR B: 50 ESTANDAR C: 100 ESTANDAR D: 200 IU/ml; tapa azul IU/ml; tapa verde IU/ml; tapa amarilla IU/ml; tapa roja

Las soluciones tienen que estar almacenadas de 2-8C y contienen 0.1% de Catn. NOTA: Despus de la primera apertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si est almacenado de 2-8C.

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TAPON DE DISOLUCIN DE IgG PARA LA MUESTRA

La botella contiene 100 ml de tampn de fosfato, estabilizadores, conservantes y un colorante amarillo inerte. La solucin lista para ser utilizada ha de ser almacenarse entre 2-8C. La solucin se usa para diluir las muestras. NOTA: Despus de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si est almacenado de 2-8C.

SOLUCIN PARA LAVAR (20X CONC.)

La botella contiene 50 ml de tampn concentrado, detergentes y conservantes. El contenido se diluye con un litro de agua destilada. La solucin diluida es estable 5 das a temperatura ambiente. NOTA: La cristalizacin en el concentrado desaparece al calentarla a 37C y mezclarla bien antes de usarla. Despus de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si est almacenado de 2-8C.

SOLUCIN DE TMB
La botella contiene 15 ml de una mezcla de tetrametilbenzidina con perxido de hidrgeno. La solucin lista para ser utilizada se tiene que almacenar entre 2-8C protegida de la luz. NOTA: La solucin es levemente azulada. En caso de contaminacin cambia a una coloracin azul ms intensa, no pudiendo ser utilizada en el ensayo.

SOLUCIN PARADA
La botella contiene 15 ml de cido sulfrico 0.2M. La solucin lista para ser utilizada se tiene que almacenar entre 2.8C. NOTA: Despus de la primera abertura, el producto se conserva hasta la fecha de caducidad si est almacenado de 2-8C.

Toma y preparacin de la muestra

Usar muestras de suero o plasma humano. Si el ensayo se realiza dentro de 5 das despus de la toma de sangre, las muestras pueden ser almacenadas de 2-8C, en caso contrario hay que congelarlas (-70 a -20C). Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. No se recomienda la inactivacin por calor de las muestras.

DISOLUCIN DE LA MUESTRA
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relacin 1:100 con el tampn de dilucin para la muestra de IgG, mezclar bien con la mezcladora Vortex. Muestras donde se espera una concentracin de antitoxinas ms alta de la concentracin del estndar D (200 IU/ml) se tendr que diluir como se describe arriba 1+10, en general 20 l de la muestra diluida + 200l de diluente IgG para la muestra (factor de dilucin: 11).
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Procedimiento
PREPARACIN DEL ENSAYO
El siguiente procedimiento es vlido para el mtodo manual. Para excluir efectos de lavado en caso de utilizar los automticos ELISA elevas el nmero de lavado de 3 a 5 veces y el volumen de solucin de lavado de 300 l a 350 l. Antes de comenzar, especificar exactamente la reparticin y posicin de las muestras y de los controles en la hoja de resultados suministrada. Usar la cantidad necesaria de tiras o pocillos en el soporte. En este caso por lo menos: 1 pocillo (A1) para el blanco, 4 pocillos (B1, C1, etc.) para los estndares A, B, C y D.

NOTA: Para mayor seguridad es necesario hacer doble ensayo de controles y muestras del paciente. Se recomienda de llevar pruebas de control positivo o negativo con cada ensayo. Realizar el ensayo en el orden indicado y sin retraso. Para cada paso de pipeteado en los estndares y en las muestras, usar siempre puntas de pipeta de un solo uso. Graduar la incubadora a 37 1C 1. Pipetear 100 l de estndares y muestras en los pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el blanco. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.

2.

3.

Incubar 1 h 5 min a 37C.

4.

Despus de la incubacin, retirar el autoadhesivo, aspirar el lquido de la tira y lavarla tres veces con 300l de la solucin de lavado. Evita el rebosamiento de los pocillos. El tiempo entre cada lavado y cada aspiracin tiene que ser por lo menos de 5 segundos. Para sacar el resto del lquido de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente. Ojo: El lavado es muy importante. Un mal lavado provoca una mala precisin y resultados errneamente argumentados.

5.

Pipetear 100l de conjugado anti-IgG (Toxoplasma gondii) en cada pocillo con excepcin del blanco. Cubrir con una lmina adhesiva.

6.

Incubar 30 min a 37C.

PGINA 5

7.

Repetir el lavado como en el paso nmero 4.

8.

Pipetear 100l de sustrato de TMB en todos los pocillos.

9.

Incubar exactamente 30 min en oscuridad a temperatura ambiente (20-25C).

10. Pipetear en todos los pocillos 100l de la solucin de parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como con el sustrato de TMB. Toda coloracin azul formada durante la incubacin se convierte en amarilla. Nota: Muestras que son altamente positivas pueden causar precipitados negros del cromgeno. Estos precipitados influyen en los valores de las mediciones. Se recomienda diluir las muestras del paciente con solucin salina 1+1. Despus, preparar la muestra diluida con el tampn de dilucin para la prueba de IgG 1:100. En este caso, el resultado se multiplica por 2. 11. Medir la extincin de la solucin en cada pocillo con 450/620nm en un periodo de 30 min despus de aadir la solucin de parada

MEDICION
Efectuar con ayuda del blanco en el pocillo A1 la calibracin al cero del fotmetro (lector de ELISA). Para obtener resultados correctos, si la calibracin no es posible por causas tcnicas, hay que sustraer el valor de la extincin de la posicin A1 del resto de los valores de extincin. Medir la extincin de todos los pocillos con 450nm y anotar los resultados de los controles y de las muestras en la hoja de resultados. NOTA: Es aconsejable la medicin bicromtica a una longitud de onda de referencia de 620nm. Si se efectuaron anlisis en duplicado o mltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extincin de los pocillos correspondientes.

Clculos de los resultados

CRITERIOS DE VALIDEZ DEL ENSAYO
El ensayo es vlido si se cumplen los siguientes criterios: Blanco en A1 extincin < 0.100 Estndar A en B1 extincin < 0.200 Estndar B en C1 extincin > 0.300 Estndar C en D1 extincin > 0.500
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Estndar D en E1 extincin > 1.000

Estndar A < Estndar B < Estndar C < Estndar D Si estos criterios no se cumplen, la prueba no es vlida y deber repetirse.

CLCULO DEL VALOR DE LA MEDICIN

Para obtener resultados cuantitativos en IU/ml se tiene que establecer una curva estndar con los valores de extincin (eje y) de los 4 estndars A, B, C y D contra sus respectivas concentraciones (0, 50, 100, 200 IU/ml) (eje x). Con esta curva estndar se pueden ver los resultados por el promedio de las extinciones de las pruebas de los pacientes. Comentario: Los resultados adicionales (por ejemplo 1:10) de muestras diluidas tienen que ser multiplicados con el factor de dilucin (dilucin 1:10; factor de dilucin: 11) Existen programas comercializados que posibilitan un clculo automtico de curvas estndar y de los resultados. Para calcular la curva estndar se puede elegir las regresiones lineales o las funciones de punto a punto.

Curva estndar tpica

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Las normas para los resultados del ELISA tienen que estar establecidas con el colectivo respectivo de los pacientes en el rea del laboratorio. Estos son los datos normativos: Reactivo: >35 IU/ml Zona intermedia: 30 35 IU/ml No-reactivo: <30 IU/ml

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Bibliografa
A. Balsari et al. ELISA for Toxoplasma antibody detection: a comparision with other serodiagnostic tests. J. Clin. Pathol., 33: 640 (1980) M.H. Beaman, R.E. McCabe, S-Y. Wong, J.S. Remington, Toxoplasma gondii, Inc: Principles and Practice of Infectious Diseases, G.L. Mandell, J.E. Bennet, R. Dolin, eds., Churchill Livingstone Publ., Fourth edition, p. 2455-2475 (1995) A. Bondiolo et al. ELISA for Toxoplasma antibodies. Inc: Immunoenzyme Assay Techniques, R. Malvano ed. M. Nijhoff Publ. (1980) M.E. Camargo et. al. Immunoglobine G and immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assay and defined toxoplasmosis serological patterns. Inf. Immun., 21:55 (1978) Y. Carlier et al. Evaluation of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and other serological tests for the diagnosis of toxoplasmosis. Bull. World Health Organization, 58 (1): 99 (1980)

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